KR20230083821A

KR20230083821A - D형 젖산 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용한 d형 젖산의 생산 방법

Info

Publication number: KR20230083821A
Application number: KR1020210172175A
Authority: KR
Inventors: 김가희; 이정연; 성민경; 김재형
Original assignee: 주식회사 엘지화학
Priority date: 2021-12-03
Filing date: 2021-12-03
Publication date: 2023-06-12

Abstract

D-젖산 생산능이 향상되도록 유전자 조작된 피키아 쿠드리압즈비(Pichia kudriavzevii) 균주 및 이를 이용하여 D-젖산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

D형 젖산 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용한 D형 젖산의 생산 방법 {Strain with enhanced D-lactate productivity and method for producing D-lactate using the same}

젖산은 식품, 화장품, 화학, 금속, 전자, 직물, 염색, 및 제약 등 다양한 분야에서 광범위하게 이용되며, 특히 생분해성 플라스틱의 일종인 폴리락트산(PLA)의 원료 물질로도 사용되는, 산업적으로 유용한 유기산이다.

현재까지 젖산의 용도는 식음료 산업을 위주로 발전되었기 때문에 대부분의 연구가 L-젖산 생산에 집중되어 있었으나, 내열성의 입체복합체 PLA (폴리 L-젖산 및 폴리 D-젖산의 입체복합체)의 원료물질로서 D-젖산이 사용됨에 따라 D-젖산에 대한 수요가 급격하게 증가하고 있다.

D-젖산 발효는 L-젖산 발효와는 달리 응용 범위가 PLA 로 한정되어 있기 때문에 경제성 확보가 매우 중요하다. 따라서, 경제적인 젖산 발효법의 개발과 산성 조건에서도 고농도 및 고수율로 D-젖산 생산이 가능한 산업 균주의 개발이 요구된다.

국내특허공개 제10-2009-0027536호 (2009.03.17)

일 예로, 락토바실러스 플란타룸(Lactobasillus plantarum)의 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제 (D-lactate dehydrogenase) 유전자가 도입된, D-젖산 생산능을 가진 피키아 쿠드리압즈비(Pichia kudriavzevii) 균주로서, 상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 코돈 최적화된 것인, 균주를 제공한다.

다른 예로, 상기 유전자 조작 균주를 이용하여 D-젖산을 생산하는 방법을 제공한다.

다른 예로, 서열번호 2의 핵산 서열로 구성되는, D-락테이트 디하이드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 한 측면에 따라, 락토바실러스 플란타룸(Lactobasillus plantarum)의 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제 (D-lactate dehydrogenase) 유전자가 도입된, D-젖산 생산능을 가진 피키아 쿠드리압즈비(Pichia kudriavzevii) 균주를 제공하며, 상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 코돈 최적화된 것이다.

일 구현예로, 상기 균주는 내인성 피루베이트 디카르복실라제(pyruvate decarboxylase; PDC) 유전자가 결실 또는 불활성화되거나; 또는 내인성 피루베이트 디카르복실라제 유전자 위치에 상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입됨으로써 피루베이트 디카르복실라제 유전자가 파괴된 균주일 수 있다.

다른 구현예로, 상기 코돈 최적화된 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자는 서열번호 2의 핵산 서열을 가지는 것일 수 있다.

다른 구현예로, 상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자의 도입 대상인(즉, D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입되는) 피키아 쿠드리압즈비 균주는 내산성을 가진 균주일 수 있다.

다른 구현예로, 상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자의 도입 대상인 피키아 쿠드리압즈비 균주는 수탁번호 KCTC18933P 로 기탁된 피키아 쿠드리압즈비 LG1 균주일 수 있다.

다른 구현예로, 상기 D-젖산 생산능을 가진 균주는 글루코스 이용량 대비 D-젖산의 생산 수율이 80% 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는, D-젖산의 생산 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 서열번호 2의 핵산 서열로 구성되는, D-락테이트 디하이드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 제공된다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본원의 일 실시예에서는, 포도를 과육과 껍질의 분리 없이 그대로 밀링(milling) 하여 증류수로 추출한 추출 원액으로부터 4%(w/v), 6%(w/v) 및 7%(w/v) 젖산 함유 배지에서 성장하는 균주를 선별하고, 이를 신규한 피키아 쿠드리압즈비(Pichia kudriavzevii) 균주로 동정하였다. 이에, 상기 균주를 피키아 쿠드리압즈비 LG1으로 명명하고, 2021년 10월 18일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 수탁번호 KCTC18933P 를 부여받았다.

또한, 상기 LG1 균주에, CRISPR 시스템을 이용하여 락토바실러스 플란타룸(Lactobasillus plantarum)의 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제 (D-lactate dehydrogenase) 유전자로서 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 코돈 최적화된 유전자를 도입한 변이 균주를 수득하였으며, 상기 변이 균주로부터 D-젖산 생산이, LG1 균주에 효모 범용 코돈에 맞춰 최적화된 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자를 도입한 균주에 비하여, 현저하게 증진됨을 확인하였다.

피키아 쿠드리압즈비(Pichia kudriavzevii)는 피키아세아 (Pichiaceae) 과의 피키아(Pichia) 속에 속하는 효모이다. 피키아 속에는 다양한 생리적 특성을 나타내는 100 여종이 포함되는 것으로 알려져 있으며, 또한 동종이라 하더라도 균주마다 균학적 성질이 상이할 수 있다.

본 발명의 피키아 쿠드리압즈비 LG1 균주는 산성 환경, 특히 젖산에 대해 내성을 가지는 특징이 있다. 본원에서 "내산성"은 pH 7.0 미만의 환경에서 배양하는 경우 지속된 생육을 나타내는 배양학적 특성을 의미한다. 일 구현예로, 상기 균주는 4%(w/v) 내지 7%(w/v), 예를 들어, 4%(w/v), 6%(w/v) 및/또는 7%(w/v) 젖산의 존재 하에서 성장이 가능하다.

따라서, 본원의 피키아 쿠드리압즈비 LG1 균주는 젖산을 생산하도록 유전자 조작될 경우, 배양 과정에서 생산된 젖산의 축적으로 인해 배지 내 환경이 산성화되더라도, 성장 및 젖산의 생산을 유지할 수 있어, 젖산을 효율적으로 생산할 수 있다.

이에, 본 발명은 피키아 쿠드리압즈비 LG1 균주에 락토바실러스 플란타룸(Lactobasillus plantarum)의 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제 (D-lactate dehydrogenase) 유전자로서 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 대해 코돈 최적화된 유전자를 도입한, D-젖산 생산 균주를 제공한다.

용어 "락테이트 디하이드로게나제"는 NAD+를 이용하여 L-젖산 혹은 D-젖산에서 수소를 이탈시켜 피루브산을 생성하거나, 이의 역반응으로서 NADH 를 이용하여 피루브산을 환원하여 L-젖산 혹은 D-젖산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 락테이트 디하이드로게나제는 L-락테이트 디하이드로게나제 (L-LDH) 또는 D-락테이트 디하이드로게나제(D-LDH)일 수 있으며, 이에 따라 L-젖산을 생성하거나 D-젖산을 생성하는 반응을 촉매할 수 있다.

락토바실러스 플란타룸의 유래의 락테이트 디하이드로게나제 유전자는 공지의 데이터베이스에서 유전자 서열을 확인할 수 있다. 예를 들어, GenBank 등록번호 CP055123.1는 공지의 락토바실러스 플란타룸 균주의 게놈 서열을 나타내며, 이중 733726-734724 번째 서열 (서열번호 1)이 D-락테이트 디하이드로게나제(D-LDH) 유전자에 해당한다.

바람직하게, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸의 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자의 서열을 피키아 파스토리스에 코돈 최적화하여 사용한다. 용어, "코돈 최적화 (codon optimized)"는 표적 염기서열(핵산서열)로 형질전환시키는 숙주 세포 내에서 표적 핵산 서열이 제대로 발현되며 나아가 더욱 높은 수준으로 발현시키기 위해 표적 핵산 서열을 선택된 숙주 세포의 코돈 선호도를 반영하도록 변형시키는 것을 말한다. "코돈 선호도"란 유기체에 따라 각 아미노산을 코딩하는데 자주 사용하는 핵산 서열을 의미한다. 소정의 숙주 미생물의 코돈 중 가장 많이 사용되는 코돈을 사용하면, 일반적으로 번역 가능성이 증가하게 되므로 원하는 서열의 발현 수준도 증가할 수 있다. 본원의 일실시예에서 사용한, 피키아 파스토리스에 대해 코돈 최적화된 서열을 서열번호 2에 나타내었고, 비교군으로 사용한, 효모 범용 코돈에 맞춰 코돈 최적화한 서열을 서열번호 3에 나타내었다.

따라서, 본 발명은 또한 서열번호 2의 핵산 서열로 구성되는, D-락테이트 디하이드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본원에서 제공하는 핵산 분자는, 서열번호 2 의 핵산 서열과 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 이상의 동일성을 가지면서 서열번호 2에 의해 발현되는 효소와 실질적으로 동등한 효소 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 2에 의해 코딩되는 D-락테이트 디하이드로게나제의 생물학적 활성을 변경하지 않으면서 폴리펩티드 서열 내의 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환을 야기하는 핵산 서열의 변경도 본 발명에 포함된다.

본 출원에서, 서열의 "% 동일성"은 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열이 최대한 일치되도록을 정렬한 후 서열을 비교하였을 때 염기가 동일한 정도를 의미할 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 두 서열 모두에서 동일한 염기가 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된(matched) 위치의 갯수를 수득하고, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누고, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.

균주에의 도입은 목적 유전자를 숙주 세포로 도입하여 상기 핵산이 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자는 벡터 내에 클로닝되어 세포에 도입될 수 있다. 여기에서, 벡터는 세포 내에서 목적 단백질을 코딩하는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 플라스미드, 바이러스 벡터, 박테리오파지 벡터, 코즈미드 벡터 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다.

벡터 내로 삽입되어 전달된 유전자가 숙주세포의 게놈 내로 비가역적으로 융합되어 세포 내에서 유전자 발현이 장기간 안정적으로 지속되도록 하는 벡터가 바람직하다. 이러한 벡터는, 해당 유전자가 선택된 숙주 내에서 발현될 수 있도록 하는 전사 및 해독 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 발현 조절 서열로는, 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및/또는 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 그 외에, 인핸서, 목적하는 유전자의 3' 말단의 비번역영역, 선별 마커(예컨대, 항생제 내성 마커), 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 게놈 DNA에 통합될 수 있다.

벡터 내의 각 구성요소는 서로 작동 가능하게 연결되어야 하며, 이들 구성요소 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행될 수 있고, 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하여 수행될 수 있다.

유전자를 균주로 도입하는 것은, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술, 예들 들어, 전기천공법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), 미세주입법(microinjection), 인산칼슘공동-침전법(calcium phosphate co-precipitation), 염화캄슘/염화루비듐법, 레트로바이러스 감염(retroviral infection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome)법, 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), 유전자총(gene gun) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 때 원형의 벡터를 적절한 제한효소로 절단하여 선형의 벡터 형태로 도입할 수 있다.

다른 바람직한 구현예로, 상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 균주는, 추가적으로 내인성 피루베이트 디카르복실라제(pyruvate decarboxylase; PDC) 유전자가 일부 또는 전부 결실 또는 불활성화되거나; 또는 내인성 피루베이트 디카르복실라제 유전자 위치에 상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입됨으로써 피루베이트 디카르복실라제 유전자가 파괴된 균주일 수 있다.

용어 "피루베이트 디카르복실라제"는 피루브산에서 카르복시기를 이산화탄소(CO₂)의 형태로 제거하여 아세트 알데히드를 생성하는 반응을 촉매하는 효소로서, 에탄올 생합성 경로에 핵심적으로 작용하는 효소이다. 따라서, 본 발명의 변이 균주는 내인성 피루베이트 디카르복실라제 유전자가 결실, 불활성화 내지 파괴되어 있으므로, 에탄올 생성이 생합성 경로가 차단되어, 피루브산을 젖산으로 전환시키는데 유리하다.

유전자의 결실, 불활성화 또는 파괴는 당업계 통상적인 기법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 유전자의 결실, 불활성화 또는 파괴는 미생물 유전체 상에서 상기 유전자 부위의 전부 또는 일부를 결실(제거)시키거나, 상동 재조합, 부위-특이적 재조합, 트랜스포존-매개 유전자 도입, 유전자 편집 기법 (예를 들어, CRISPR 시스템) 등을 이용하여 특정 유전자 서열을 삽입하여 단백질 서열을 변형시킴으로서 수행될 수 있다. 또한, 유전자의 불활성화는 유전자의 프로모터 부위 및 5'-UTR 부위의 염기 서열을 변형시킴으로써 단백질의 발현을 약화시키거나 또는 해당 유전자의 ORF 부위에 변이를 도입하여 단백질의 활성을 약화시키는 등의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직한 구현예로, 본원의 젖산 생산 균주는 내인성 피루베이트 디카르복실라제 유전자 위치에 상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입됨으로써 피루베이트 디카르복실라제 유전자가 파괴된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 본원에서 제공하는 젖산 생산 균주는 글루코스 이용량 대비 D-젖산의 생산 수율이 80% 이상, 예를 들어 80% 이상, 81% 이상 또는 82% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본원의 용어 "생산 수율"은 글루코스 이용량(즉, 탄소원 및 에너지원으로 사용된 글루코스의 양)에 대한 젖산의 생산량(중량/중량)의 비율(%)을 의미한다. 본원의 대표적인 일 실시예에서는, 본원에서 피키아 쿠드리압즈비 LG1 균주에 서열번호 2의 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자를 도입했을 때 글루코스 이용량 대비 D-젖산 생산 수율이 약 82% 였다. 이는 서열번호 3의 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자를 도입한 경우의 D-젖산 생산 수율인 약 76%에 비하여 현저히 증진된 것이다.

다른 구체예에서, 본원에서 제공하는 젖산 생산 균주는 D-젖산 생산성이 0.80 g/L/h 이상일 수 있다. 본원의 용어 "생산성" 은 시간 당 생성되는 젖산의 양(g/L)을 의미한다. 예를 들어, D-젖산 생산성은 0.80 g/L/h 이상, 0.90 g/L/h 이상 또는 1.00 g/L/h 이상일 수 있고, 더 구체적으로는 0.80 - 1.50 g/L/h, 0.80 - 1.40 g/L/h, 0.80 - 1.30 g/L/h, 0.80 - 1.20 g/L/h, 0.80 - 1.10 g/L/h, 0.90 - 1.50 g/L/h, 0.90 - 1.40 g/L/h, 0.90 - 1.30 g/L/h, 0.90 - 1.20 g/L/h, 0.90 - 1.10 g/L/h, 1.00 - 1.50 g/L/h, 1.00 - 1.40 g/L/h, 1.00 - 1.30 g/L/h, 1.00 - 1.20 g/L/h, 또는 1.00 - 1.10 g/L/h 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본원의 대표적인 일 실시예에서는, 본원에서 피키아 쿠드리압즈비 LG1 균주에 서열번호 2의 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자를 도입했을 때 D-젖산 생산성이 약 1.07 g/L/h 였다. 이는 서열번호 3의 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자를 도입한 경우의 D-젖산 생산 수율인 약 0.75 g/L/h 에 비하여 현저히 증진된 것이다. 특히 본원에 따른 젖산 생산 균주는 최대 D-젖산 농도 도달 시점이 서열번호 3을 도입한 비교 균주 대비 약 24시간 빨랐다.

본원 발명은 또한, 상기 정의된 D-젖산 생산 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 젖산 생산 방법을 제공한다.

균주의 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원, 인원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 구체적인 배지의 종류는 LB(Luria Bertani) broth, SD(Sabouraud Dextrose) broth 또는 YM(Yeast medium) broth 와 같은 배지를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배지 내 탄소원으로는 포도당(글루코스) 또는 글리세롤을 포함할 수 있다. 그 외에, 단당류, 올리고당류, 다당류, 단일탄소기질, 또는 그의 혼합물을 예시할 수 있다. 예를 들어 글루코즈와 프럭토즈와 같은 단당류; 수크로즈, 말토즈 또는 락토즈와 같은 올리고당류; 녹말 또는 셀룰로오스와 같은 다당류; 메탄올, 포름알데히드 또는 포르메이트와 같은 단일탄소기질을 예시할 수 있다. 또한, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

배지 내 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다.

배지 내 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함하거나, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기된 원료들은 배양 과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 필요에 따라, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.

배양(발효)는 재조합 미생물의 따라 배치, 유가식, 또는 연속식 방식을 선택할 수 있다. 발효 조건은 호기, 마이크로 호기, 혐기 조건에서 배양할 수 있으며 바람직하게는 마이크로 혐기 조건에서 배치 방식으로 수행할 수 있다. 배양 온도 및 배양 시간은 사용하는 숙주세포의 특성을 고려하여 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있으며, 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃ 일 수 있다. 배양은 젖산의 생산량이 최대로 얻어질 때까지 계속될 수 있다.

발효 배지로부터 젖산을 회수하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 젖산은 원심분리, 크로마토그래피, 추출, 여과, 침전, 또는 이들의 조합을 수행함으로써 세포 배지로부터 얻을 수 있다. 미생물에 의한 젖산의 생산은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있는 적당한 기술들에 의해 확인되고 또한 정량화될 수 있다. 예로서, HPLC 기술들인 선택된 클론에 의해 생산된 젖산의 양을 측정하는 데 사용될 수 있다. 상기 HPLC 기술은 또한 미생물에 의해 생산된 젖산의 순도를 결정하는 데에도 도움을 준다.

본원의 균주를 이용하여 산성 환경에서 균주의 활성 저하 없이 D-젖산을 고농도로 발효 생산할 수 있다.

도 1은 본원의 일 실시예에 따른 내산성 균주의 선별 과정을 나타낸다. (a)는 1차 선별 결과를 나타내고, (b)는 4%(w/v) 젖산 조건에서의 선별 결과를 나타내고, (c)는 6%(w/v) 젖산 조건에서의 선별 결과를 나타낸다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 내산성 균주의 선별에 있어서, 6%(w/v) 젖산 및 7%(w/v) 젖산 조건에서의 선별 결과를 나타낸다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 CRISPR-Cas9 벡터(pCAS-gRNA-PDC)의 개열지도를 나타낸다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 피키아 파스토리스에 대해 코돈 최적화된 D-LDH 유전자를 LG1 균주의 PDC 유전자 위치에 도입한 균주의 젖산 생산능을 나타낸다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 효모 범용 코돈에 맞춰 코돈 최적화된 D-LDH 유전자를 LG1 균주의 PDC 유전자 위치에 도입한 균주의 젖산 생산능을 나타낸다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.

실시예 1. 피키아 쿠드리압즈비 LG1 균주의 선별 및 동정

안면도에서 채취한 포도를 포도 과육과 껍질의 분리 없이 그대로 밀링(milling)하여 증류수에 현탁하였다. 추출 원액부터 10배씩 연속 희석(serial dilution)한 샘플을 항생제 미포함/포함된 고체 YPD (Yeast extract 1%, Peptone 2%, Dextrose 2%)배지에 50 μL씩 시딩(spreading)하였다. 단일 콜로니(Single colony)들을 동일한 고체 YPD 배지에 획선도말(streaking)하여 성장을 확인하여 1차 선별 균주를 완료하였다 (도 1a). 선별된 균주들 가운데 내산성 균주를 선별하기 위해 해당 균주들을 액체 YPD 배지에서 하루동안 성장시키고 4%(w/v) 젖산(lactic acid)이 포함된 고체 YPD 배지에 점적(spotting)하였다. 대부분의 균주들은 성장하지 못하였지만 콜로니가 형성된 8종의 내산성 균주들을 선별하였다 (균주 #23, #29, #30, #33, #37, #39, #40 및 #43) (도 1b). 추가적으로 내산성이 높은 균주들을 선별하기 위해 6%(w/v) 젖산이 포함된 고체 YPD 배지에 상기와 같은 방법으로 점적하였을 때, #40 균주를 제외한 나머지 7종의 균주들은 6%(w/v) 젖산에서도 성장하는 것을 확인하였다(도 1c). 추가적으로 내산성 정도를 확인하기 위해 7%(w/v) 젖산이 포함된 고체 YPD 배지에 상기와 같은 방법으로 spotting하였을 때, #23 균주는 7%(w/v) 조건에서도 성장하는 것을 확인하였다(도 2). 대조군으로 사카로마이세스 세레비지애(S.cerevisiae) BY4741와 피키아 쿠드리압즈비 (P.kudriavzevii) KCTC 27762 균주를 사용하였다.

선별된 미생물들의 동정을 위해 16S rRNA 염기서열분석을 진행하였다. 이를 위해 AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, K-3032)를 제조사 매뉴얼에 따라 분리한 해당 미생물의 genomic DNA, 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' (서열번호 16), 5'-GGTCCGTGTTTCAAGAC-3' 프라이머(서열번호 17)를 Q5® High-Fidelity 2X Master Mix (NEB, M0492L)와 섞어주어 PCR을 진행하였다. 증폭된 DNA는 Macrogen 서열분석을 통해 서열을 확인하였다. 서열을 이용하여 BLAST nucleotide (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용하여 유사서열을 찾아본 결과 #40 균주는 칸디다 쿠에르시투사(Candida quercitusa)로, 나머지 7종은 모두 피키아 쿠드리압즈비(Pichia kudriavzevii) 로 확인되었다 (표 1).

선별균주#	유전적 거리가 가장 가까운 균주(closest relative)	GenBank 등록번호	유사성(%)
23	P. kudriavzevii	MH545928.1	98.94%
29	P. kudriavzevii	MH545928.1	99.23%
30	P. kudriavzevii	MH593830.1	95.26%
33	P. kudriavzevii	MH545928.1	99.23%
37	P. kudriavzevii	MH545928.1	99.23%
39	P. kudriavzevii	MH545928.1	98.83%
40	C. quercitusa	MK394107.1	98.02%
43	P. kudriavzevii	MH545928.1	99.32%

결과적으로, 상기 선별된 균주 중 #23 균주를 피키아 쿠드리압즈비 LG1 균주로 명명하고, 2021년 10월 18일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 수탁번호 KCTC18933P 를 부여받았다.

실시예 2. D-락테이트 디하이드로게나제 (D-LDH) 유전자 도입 균주의 제조

(주) 코스모진텍을 통해 락토바실러스 플란타룸의 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제(D-LDH) 유전자 서열(GenBank 등록번호 CP055123.1의 733726-734724번째 서열: 서열번호 1)을 피키아 파스토리스에 맞춰 코돈 최적화한 후 (서열번호 2) 유전자 합성을 진행하였다. 비교 실험군으로, Optimizer (Puigbo et al., 2007) 프로그램 상에서 D-LDH 유전자 서열 (서열번호 1)을 효모 범용 코돈에 맞춰 최적화한 후 (서열번호 3), (주) 마크로젠을 통해 유전자 합성을 진행하였다. 또한, CRISPR 시스템 및 열충격 형질전환(Heat-shock Transform) 방법을 이용하여 피키아 쿠드리압즈비 LG1 균주의 PDC 유전자 위치에 상기 코돈 최적화된 D-LDH 유전자를 삽입하였다.

이를 위하여, 본 연구팀이 기 개발한 피키아 쿠드리압즈비 전용 CRISPR-Cas9 벡터를 주형으로 하여, 피키아 쿠드리압즈비 LG1의 PDC 유전자를 타겟하는 CRISPR-Cas9 벡터(pCAS-gRNA-PDC, 도 3)를 제작하였다. 구체적으로, CRISPR RGEN Tool (http://www.rgenome.net/cas-designer/)를 이용하여 PDC 유전자 타겟의 gRNA 서열(5'-TCTGCAAAGGTTGCTCCAGA-3')을 선정한 후, 해당 서열을 기반으로 pCAS-gRNA-PDC 제작용 프라이머 세트 (pdc-tg-F/ pdc-tg-R, 표 2)를 디자인하였다. Pfu 계열 폴리머라제를 사용하여 각 유전자에 대해 표 3 및 표 4에 따른 PCR을 수행하였으며, 제한 효소 DpnI (NEB) 1 μL 처리(37℃, 2 hr)를 통해 주형 DNA (pCAS-gRNA)를 제거하였다. 이어 해당 반응액을 0.8% 아가로스 겔 하에서 전기영동하여 약 10 kb의 DNA 밴드를 정제하였으며, T4 PNK (NEB, 37℃, 30 분) 및 T4 DNA 리가아제 (NEB, 37℃, 30 분) 반응을 통해 선형화된 플라스미드 DNA를 환형(Circular) 형태로 만드는 작업을 진행하였다. Ligation 반응액 10 μL을 제조사의 매뉴얼에 따라 DH5α chemically competent E. coli (100 μL, RBC)에 도입 후(Ice, 20 분 → 42℃, 1 분 → Ice, 20 분), 50 μg/mL의 하이그로마이신 (Hyg)이 첨가된 LB 고체배지에 Spreading하여 밤새 배양하였다(37℃). 이어 PDC 유전자의 gRNA 서열로 이루어진 Check PCR 프라이머로 클로닝 성공 여부를 확인 후, 플라스미드 DNA를 추출한 후, 피키아 쿠드리압즈비 LG1 형질전환에 활용하였다.

프라이머	서열 (5'→ 3)	서열번호
pdc-tg-F	GTTGCTCCAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAG	3
pdc-tg-R	CTTTGCAGATGCATAAGACAGGGTTCGAAC	4

구성성분	부피
Deionized water	Up to 50 μL
Q5 High-Fidelity 2X master mix (NEB)	25 μL
pdc-tg-F (표 1,50 μM)	1 μL
pdc-tg-R (표 1,50 μM)	1 μL
주형 (pCAS-gRNA)	0.5 μL
총	50 μL

반응	온도	시간	주기
예비변성(Pre-denaturation)	98℃	30 초	1
변성(Denaturation)	98℃	10 초	30
결합(Annealing)	55℃	20 초
증폭(Extension)	72℃	5 분 (30 초 /kb)
최종 증폭(Final extension)	72℃	2 분	1

PDC 유전자 결실 및 D-LDH 유전자 도입을 위한 Donor DNA는 세 개의 DNA 단편을 overlap PCR을 통해 연결하여 제작하였다. 구체적으로 피키아 쿠드리압즈비 LG1의 genomic DNA를 주형으로 하여 PDC 유전자의 업스트림 500bp (F1/R1 프라이머 세트) 및 다운스트림 500bp (F3/R3 프라이머 세트, 표 4)를 증폭하였고, 합성 DNA 를 주형으로 하여 효모 범용 코돈 및 피키아 파스토리스에 코돈에 최적화된 D-LDH 유전자를 각각 증폭하였다(효모 범용 코돈 최적화 D-LDH 증폭: F2-1/R2-1 프라이머 세트; 피키아 파스토리스 코돈 최적화 D-LDH 증폭: F2-2/R2-2 프라이머 세트, 표 5). 증폭된 각 단편을 PDC 업스트림 500 bp - D-LDH 유전자 - PDC 다운스트림 500 bp 순으로 overlap PCR (F3/R3 프라이머 세트, 표 5)하여 연결하였고, 해당 overlap PCR 산물을 별도의 정제 없이 LG1 형질전환에 사용하였다. Overlap PCR 증폭을 위한 반응액 조성 및 반응 조건은 표 6 및 표 7에 기재하였다.

프라이머	서열 (5'→ 3)	서열번호
F1 프라이머	ATTTTAATTTCTATTGCTATAATGTCCTTATTAGTTGCCACT	4
R1 프라이머	ATTTTTGTGTTTTGCTGTGTTTTG	5
F2-1 프라이머	CCCAATAAAACAAAATAAAACAAAACACAGCAAAACACAAAAATATGAAGATTATTGCTTACGCTGTTCGTGATGA	6
R2-1 프라이머	CATTTTAATGTTCATTTTACATTCAGATGTCATTAATCGAACTTAACTTGAGTAT	7
F2-2 프라이머	CCCAATAAAACAAAATAAAACAAAACACAGCAAAACACAAAAATATGAAGATTATAGCCTACGCTGTCAGAGAT	8
R2-2 프라이머	CATTTTAATGTTCATTTTACATTCAGATGTCATTAGTCGAATTTTACTTGAGTGTCT	9
F3 프라이머	TGACATCTGAATGTAAAATGAAC	10
R3 프라이머	CCATGATCCAACATTGAAAGGTGTTCCA	11

구성성분	부피
Deionized water	Up to 50 μL
Q5 High-Fidelity 2X master mix (NEB)	25 μL
F3 프라이머 (표 4, 50 μM)	1 μL
R3 프라이머 (표 4, 50 μM)	1 μL
단편 1	몰 동량 (Equimolar Amount)
단편 2
단편 3
총	50 μL

반응	온도	시간	주기
예비변성(Pre-denaturation)	98℃	30 초	1
변성(Denaturation)	98℃	10 초	30
결합(Annealing)	55℃	20 초
증폭(Extension)	72℃	1 분 (1kb/30초)
최종 증폭(Final extension)	72℃	1 분	1

피키아 쿠드리압즈비 LG1의 형질전환은 상기 제작한 pCAS-gRNA-pdc 벡터 및 Donor DNA를 사용하여 LiAc/Heat-shock 방법을 이용해 수행하였다 (Tran et al., 2019). 형질전환용 모균주 Stock을 YPD-2% 글루코스 3 mL에 1% (v/v) 비율로 접종 후, 30℃, 250 rpm에서 약 24시간 배양하였다. 250 mL 플라스크 하에서 상기 Seed culture를 YPD-2% 글루코스 (Yeast extract 10 g/L, peptone 20 g/L, D-glucose 20 g/L) 3 mL에 OD600 (Optical density at 600nm) 값이 0.3이 되도록 접종 후, OD600값이 0.8~1.0이 될 때까지 30℃, 200 rpm에서 약 4시간 배양하였다. 각 배양액을 멸균수로 2회 세척 후, 최종 세포 펠렛을 표 8의 반응액에 현탁하였다. 42℃, 1000 rpm에서 1시간 동안 열충격(Heat-shock)을 가한 후, 원심분리를 통해 상층액을 제거하였고, 1 mL의 YPD-2% 글루코스를 추가하여 30℃, 250 rpm에서 2시간 회수하였다. 회수 후 세포 펠렛 전량을 하이그로마이신 (500 μg/mL)이 포함된 YPD-2% Glucose- 고체배지에 Spreading 하여 30℃에서 48 시간 동안 정치 배양하였다. 형질전환 여부를 확인하기 위해 각 형질전환 Construct 당 1~8개의 콜로니를 임의 선정 후, 콜로니 Check PCR을 수행하였다. Check PCR 수행 전, 각 콜로니를 20 mM NaOH 용액 10 μL에 현탁 후, 95℃에서 5분 반응시켜 Cell Lysis를 진행하였고, 이를 표 10의 반응액에 첨가하여 표 11에 따른 PCR을 수행하였다. 표 9의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 PDC 유전자가 결실되고 D-LDH 유전자만이 검출되는 형질전환체를 선별하였다.

구성성분	부피
Deionized water	Up to 360 μL
50% Polyethylene glycol (PEG)	240 μL
1M Lithium acetate (LiAc)	36 μL
10 mg/mL Salmon sperm DNA (Invitrogen)	10 μL
pCAS-gRNA (200 ng/μL)	5 μL
Donor DNA (500 ng/μL)	25 μL
총	360 μL

프라이머	서열 (5'→ 3)	서열번호
pdc-5-F	ATTTTAATTTCTATTGCTATAATGTCCTTATTAGTTGCCACT	12
pdc-in-R	CCCTTCATCATCAAGTTTTCATAAGTTGCA	13
d-ldh(1)-in-R	AATGCACCATATGCTGTAGCT	14
d-ldh(2)-in-R	CCTAGCGAAATTAAGAATGTATGCTCCGT	15

구성성분	부피
Deionized water	Up to 20 μL
SolgTM 2X Taq PCR Smart mix (Solgent)	10 μL
Forward (F) 프라이머 (50 μM)	1 μL
Reverse (R) 프라이머(50 μM)	1 μL
주형 (Lysed colony)	0.5 μL
총	20 μL

반응	온도	시간	주기
예비변성(Pre-denaturation)	95℃	5 분	1
변성(Denaturation)	95℃	20 초	30
결합(Annealing)	55℃	40 초
증폭(Extension)	72℃	1 분/kb
최종 증폭(Final extension)	72℃	2 분	1

실시예 3. D-젖산 생산의 확인

실시예 2에서 제조한 유전자 조작 균주에 대한 플라스크 테스트 결과 D-젖산을 선별적으로 생산할 수 있음을 확인하였다.

구체적으로, 각 균주 Stock을 YPD-10% 글루코스 배지(Yeast extract 10 g/L, peptone 20 g/L, D-glucose 100 g/L) 5 mL에 1% (v/v) 비율로 접종 후, 30℃, 250 rpm에서 약 60 시간 배양하였다. YPD-10% 글루코스를 희석 배지로 하여 포화된 각 균주 배양액의 OD600을 동일 값으로 조정 후, CaCO₃ 2 g이 포함된 YPD-10% 글루코스 50 mL에 1% (v/v) 비율로 접종하였다. 해당 배양은 250 mL Erlenmeyer Flask 하에서 진행되었으며, 96 시간 동안 30℃, 210 rpm 조건으로 배양하며 24시간 간격으로 샘플을 채취, HPLC 분석을 진행하였다.

표 12 및 도 4는, 피키아 파스토리스에 대해 코돈 최적화된 D-LDH 유전자를 LG1 균주의 PDC 유전자 위치에 도입한 균주의 젖산 생산능을 나타낸다.

소모당(g/L)	젖산(g/L)	수율(g/g)	생산성(g/L/h)
93.62	77.17	0.82	1.07

표 13 및 도 5은, 효모 범용 코돈에 맞춰 코돈 최적화된 D-LDH 유전자를 LG1 균주의 PDC 유전자 위치에 도입한 균주의 젖산 생산능을 나타낸다.

소모당(g/L)	젖산(g/L)	수율(g/g)	생산성(g/L/h)
93.41	72.03	0.76	0.75

결과적으로, 피키아 파스토리스에 대해 코돈 최적화된 D-LDH 유전자가 도입된 균주의 경우, 효모 범용 코돈에 최적화된 D-LDH 유전자가 도입된 균주에 비해, D-젖산 생산량, 수율 및 생산성이 우수하였고, 특히 최대 D-젖산 농도 도달 시점이 비교 균주 대비 약 24시간 빨랐다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원

KCTC18933P

20211018

<110> LG CHEM, LTD. <120> Strain with enhanced D-lactate productivity and method for producing D-lactate using the same <130> DPP20212306KR <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 999 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <221> gene <222> (1)..(999) <223> D-LDH gene <400> 1 atgaaaatta ttgcatatgc tgtacgtgat gacgaacgtc cattcttcga tacttggatg 60 aaagaaaacc cagatgttga agttaaatta gttccagaat tacttactga agacaacgtt 120 gacttagcta aaggcttcga cggtgccgat gtataccaac aaaaggacta tactgctgaa 180 gtattgaaca agttagccga cgaaggggtt aagaacatct ctcttcgtaa cgttggtgtt 240 gataacttgg acgttcctac tgttaaagca cgtggcttaa acatttctaa cgtacctgca 300 tactcaccaa atgcgattgc tgaattatca gtaacgcaat tgatgcaatt attacgtcaa 360 accccattgt tcaataagaa gttagctaag caagacttcc gttgggcacc agatattgcc 420 aaggaattaa acaccatgac tgttggtgtt atcggtactg gtcggattgg ccgtgctgcc 480 atcgatattt tcaaaggctt cggcgctaag gttatcggtt acgatgttta ccggaatgct 540 gaacttgaaa aggaaggcat gtacgttgac accttggacg aattatacgc ccaagctgat 600 gttatcacgt 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Claims

락토바실러스 플란타룸(Lactobasillus plantarum)의 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제 (D-lactate dehydrogenase) 유전자가 도입된,
D-젖산 생산능을 가진 피키아 쿠드리압즈비(Pichia kudriavzevii) 균주로서,
상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 대해 코돈 최적화된 것인, 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는
내인성 피루베이트 디카르복실라제(pyruvate decarboxylase; PDC) 유전자가 결실 또는 불활성화되거나; 또는
내인성 피루베이트 디카르복실라제 유전자 위치에 상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입됨으로써 피루베이트 디카르복실라제 유전자가 파괴된, 균주.
제1항에 있어서,
상기 코돈 최적화된 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자는 서열번호 2의 핵산 서열을 가지는 것인, 균주.
제1항에 있어서,
상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자의 도입 대상인 균주는 내산성을 가진 피키아 쿠드리압즈비 균주인, 균주.
제1항에 있어서,
상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자의 도입 대상인 균주는 4%(w/v) 내지 7%(w/v) 젖산의 존재 하에서 성장 가능한 피키아 쿠드리압즈비 균주인, 균주.
제1항에 있어서,
상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자의 도입 대상인 균주는 수탁번호 KCTC18933P 로 기탁된 피키아 쿠드리압즈비 LG1 균주인, 균주.
제1항에 있어서,
상기 D-젖산 생산능을 가진 균주는 글루코스 이용량 대비 D-젖산의 생산 수율이 80% 이상인, 균주.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는,
D-젖산의 생산 방법.
서열번호 2의 핵산 서열로 구성되는, D-락테이트 디하이드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자.