KR101740031B1 - 테레프탈산 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 테레프탈산의 제조방법 - Google Patents

테레프탈산 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 테레프탈산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 테레프탈산 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 테레프탈산의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 xlMA , xylC , tsaMB , tsaC 및 tsaD가 도입되어 있는 파라자일렌으로부터 테레프탈산 생산용 재조합 미생물 및 tsaMB , tsaC 및 tsaD가 도입되어 있는 파라톨루엔산으로부터 테레프탈산 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 테레프탈산의 제조방법에 관한 것이다. 테레프탈산 생성능이 전혀 없던 미생물을 대사공학적인 방법을 이용하여 제조한, 본 발명에 따른 테레프탈산 생성용 재조합 미생물은 재생가능한 탄소순환형 바이오매스로부터 화학적 촉매 반응 없이 순수한 생물학적 공정만으로 테레프탈산을 제조할 수 있으므로, 테레프탈산의 산업적 생성 미생물로 유용하다.

Description

테레프탈산 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 테레프탈산의 제조방법 {Recombinant Microorganism Producing Terephthalic Acid and Method for Producing Terephthalic Acid Using the Same}
본 발명은 테레프탈산 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 테레프탈산의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 xlMA , xylC , tsaMB , tsaC 및 tsaD가 도입되어 있는 파라자일렌으로부터 테레프탈산 생산용 재조합 미생물 또는 tsaMB , tsaC 및 tsaD가 도입되어 있는 파라톨루엔산으로부터 테레프탈산 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 테레프탈산의 제조방법에 관한 것이다.
최근 불안정한 유가의 상승과 기후의 급격한 변화로 인해 한정된 석유자원의 고갈과 남용에 대한 우려가 증가하고 있다. 이를 해결하기 위한 대안으로 석유화학 기반 화학산업을 탈피하기 위한 다양한 대체 기술에 대한 수요가 증가하고 있으며, 미생물을 이용한 바이오매스 같이 재생 가능한 원료로부터 유용한 화합물을 얻기 위한 연구가 이러한 문제를 해결할 수 있는 유용한 기술 중 하나로 주목받고 있다.
테레프탈산(terephthalic acid)은 범용 방향족 화합물로서 액체 용기, 필름, 의류용 섬유 등으로 광범위하게 사용하는 폴리에틸렌테레프탈산(polyethylene terephthalate, PET) 합성에 단량체로 사용되고 있다. 현재 테레프탈산의 생산은 자일렌(p-xylene)을 산화시키는 석유화학 공정을 이용하여 생산되고 있으며(Smith K, et al., Chemical Economics Handbook, September 2013), 거의 모든 테레프탈산은 아모코(액상 산화) 공정을 통해 생산되고 있다. 아모코 공정에 의한 파라자일렌(p-xylene)의 변환 수율이 98% 이상이며 테레프탈산의 생산 수율은 95% 이상이나, 폴리에틸렌테레프탈레이트 등의 고분자 생산에 사용하기 위해서는 추가적인 정제 과정이 요구된다. 이 공정은 촉진재로 사용되는 브롬 화합물의 부식성으로 인해 티타늄 같은 고가의 귀금속으로 반응기를 제작하여야 하는 단점이 있다(Dimitris IC et al., Industrial Biotechnology, 10(2): 91-103, 2014).
이러한 석유화학 기반 원료에 대한 의존성을 줄이고 친환경적인 공정을 통한 테레프탈산을 제조하기 위해 다양한 생물학적 경로를 이용한 공정이 개발되고 있다. Virent사는 바이오매스로 부터 얻어질 수 있는 오탄당/육탄당(C5/C6 sugar)으로부터 화학적 촉매반응을 이용하여 파라자일렌을 얻을 수 있는 공정(BioForming)을 개발하여 상업화하기 위한 연구를 진행하고 있다.
미생물을 이용한 방법으로는, 미생물 발효공정을 통해 바이오매스 유래 오탄당/육탄당으로부터 테레프탈산을 생산하는 공정(Michigan State University와 Amyris), 바이오매스 유래 과당(fructose)을 연속적인 촉매반응을 통하여 테레프탈산을 생산하는 공정(BP, British Petroleum), 파라자일렌을 테레프탈산으로 산화시킬 수 있는 토양 미생물을 이용한 공정(Wang J et al., Wei Sheng Wu Xue Tong Bao, 2006, 33(5); Bramucci MG et al.,Appled Microbiology and Biotechnology, 2002, 58(2), 255-259), 파라자일렌 모노옥시게나아제(xylene monooxygenase) 재조합 단백질을 발현하는 대장균을 이용하여 파라자일렌을 하이드록시메틸벤조산(4-hydroxymethylbenzoic acid)으로 변환 후 이를 화학적으로 테레프탈산으로 변환하는 공정(US Patent 2003/0073206) 및 Rhodococcus ruber DSM 8316 미생물을 이용하여 5- 또는 6-탄소 방향족 화합물을 파라톨루엔산으로 변환하고 이를 테레프탈산으로 변환시키는 공정(US Patent 5,753,471) 등이 보고된 바 있다.
이러한 공정들은 재생가능한 탄소순환형 바이오매스를 그 원료로 사용하며 파라자일렌이나 테레프탈산으로 변환될 수 있는 중간체의 생산을 위해 생물학적 공정을 이용하지만, 여전히 복잡한 과정의 화학적 촉매 반응과 종종 고온 고압의 반응 조건을 요구하는 단점 및 생산성이 낮은 문제가 있다.
이에, 본 발명자들은 파라자일렌으로부터 테레프탈산을 생산할 수 있는 재조합 미생물을 개발하여 생산성을 향상시키고자 예의 노력한 결과, Pseudomonas putida 유래의 자일렌 모노옥시게나제(xylene monooxygenase;xylMA), 4-메틸벤질알데하이드 디하이드로게나제(4-methylbenzylaldehyde dehydrogenase;xylC) 및 Comamonas testosteroni 유래의 톨루에이트 메틸모노옥시게나제(toluatemethylmonooxygenase;tsaMB), 4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제(4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase;tsaC), 4-카복시벤질알데하이드 디하이드로게나제(4-carboxybenzylaldehyde deghydrogenase;tsaD)를 발현하는 재조합 미생물 및 Comamonas testosteroni 유래의 톨루에이트 메틸모노옥시게나제(toluatemethylmonooxygenase;tsaMB), 4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제(4-carboxybenzyl alcohol dehydrogenase;tsaC), 4-카복시벤질알데하이드 디하이드로게나제(4-carboxybenzylaldehyde deghydrogenase;tsaD)를 발현하는 재조합 미생물을 제작하여, 상기 재조합 미생물이 파라자일렌 외에도 다양한 바이오매스 유래 탄화수소로부터 테레프탈산을 생산할 수 있음을 확인하였으며 파라자일렌의 미생물에 대한 독성을 최소화 할 수 있는 이상발효공정(biphasic fermentation)을 통해 우수한 생산성을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 테레프탈산 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 재조합 미생물을 이용한 테레프탈산의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 xylMA(자일렌 모노옥시게나제 코딩 유전자), xylC(4-메틸벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자), tsaMB(톨루에이트 메틸모노옥시게나제 코딩 유전자), tsaC(4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제 코딩 유전자) 및 tsaD(4-카복시벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자)가 도입되어 있는 테레프탈산 생산능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 tsaMB(톨루에이트 메틸모노옥시게나제 코딩 유전자), tsaC(4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제 코딩 유전자) 및 tsaD(4-카복시벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자)가 도입되어 있는 테레프탈산 생산능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 미생물에 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 xylMA(자일렌 모노옥시게나제 코딩 유전자), xylC(4-메틸벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자), tsaMB(톨루에이트 메틸모노옥시게나제 코딩 유전자), tsaC(4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제 코딩 유전자) 및 tsaD(4-카복시벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자)를 도입하는 것을 특징으로 하는 테레프탈산 생산능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 미생물에 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 tsaMB(톨루에이트 메틸모노옥시게나제 코딩 유전자), tsaC(4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제 코딩 유전자) 및 tsaD(4-카복시벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자)를 도입하는 것을 특징으로 하는 테레프탈산 생산능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 테레프탈산을 생성시키는 단계: 및 (b) 상기 생성된 테레프탈산을 회수하는 단계를 포함하는 테레프탈산의 제조방법을 제공한다.
테레프탈산 생성능이 전혀 없던 미생물을 대사공학적인 방법을 이용하여 제조한, 본 발명에 따른 테레프탈산 생성용 재조합 미생물은 재생가능한 탄소순환형 바이오매스로부터 화학적 촉매 반응 없이 순수한 생물학적 공정만으로 테레프탈산을 제조할 수 있으므로, 테레프탈산의 산업적 생성 미생물로 유용하다.
도 1은 파라자일렌을 테레프탈산으로 전환하는 대사회로의 개략도이다.
도 2는 파라자일렌을 테레프탈산으로 전환하는 대사회로 구축을 위해 제작된 플라스미드의 개략도이다. (A) 파라자일렌을 파라톨루엔산으로 전환하기 위해 제작된 Pseudomonas putida F1 유래 xylMA와 Pseudomonas putida KT2440 유래 xylC 유전자를 발현하는 플라스미드의 개략도 및 (B) 파라톨루엔산을 테레프탈산으로 전환하기 위해 제작된 Comamonas testosteroni 유래 tsaMB , tsaC , tsaD 유전자를 발현하는 플라스미드의 개략도이다.
도 3은 각각의 대사반응을 담당하는 효소의 활성에 의한 전구체의 전환을 보여주는 그래프이다. (A) xylMA가 도입된 재조합 대장균 균주에 의한 파라자일렌의 4-methylbenzyl alcohol(-◆-)과 4-methylbenzaldehyde(-■-)로의 변환, (B)xylC가 도입된 재조합 대장균 균주에 의한 4-methylbenzaldehyde(-■-)의 4-methylbenzyl alcohol(-◆-)과 파라톨루엔산(-▲-)으로의 전환, (C) xylMA와 xylC가 도입된 재조합 대장균에 의한 파라자일렌의 4-methylbenzaldehyde(-■-), 4-methylbenzyl alcohol(-◆-), 파라톨루엔산(-▲-)으로의 전환, (D) tsaMB가 도입된 재조합 대장균에 의한 파라톨루엔산(-▲-)의 4-carboxybenzyl alcohol(-●-)로의 전환, (E)tsaCD가 도입된 재조합 대장균에 의한 4-carboxybenzyl alcohol(-●-)의 테레트탈산(-△-)으로의 전환, (F)tsaMB와 tsaCD가 도입된 재조합 균주에 의한 파라톨루엔산(-▲-)의 4-carboxybenzyl alcohol(-●-)과 테레프탈산(-△-)으로의 전환을 보여준다.
도 4는 재조합 대장균의 테레프탈산 생산능을 높이기 위해 제작된 다양한 유전자들과 전사조절인자, 플라스미드의 조합을 보여주는 도식이다.
도 5는 xylMA , xylC , tsaMB , tsaC 및 tsaD를 포함하는 다양한 조합의 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균들에 의해 파라자일렌의 테레프탈산으로의 전환을 보여주는 그래프이다. 다양한 조합의 플라스미드로 형질 전환된 재조합 미생물인 LZW16(-◆-), LZW17(-■-), LZW18(-●-) 및 LZW19(-▲-)의 시간에 따른 바이오매스(A), 배양액 내 테레프탈산의 농도(B) 및 배양액 내 파라톨루엔산의 농도(C)를 보여준다.
도 6은 pTrc99a-xylMAC-rbstsaMB-rbstsaCD 와 pTac15k-tsaCDtrctsaMB 플라스미드로 형질전환된 재조합 미생물(LZW18)의 이상발효를 통한 파라자일렌의 테레프탈산으로의 전환을 보여주는 그래프이다. 파라자일렌이 20g/L(A) 및 40g/L(B)의 농도로 500ml의 올레일알콜에 용해되어 있는 이상발효에서 바이오매스(-●-), 포도당(-■-), 파라톨루엔산(-▲-), 테레프탈산(-◆-) 농도의 시간에 따른 변화를 보여준다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 그 자체로는 테레프탈산 생성능을 가지고 있지 않은 미생물에 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소, 즉 방향족 화합물의 산화 활성을 지니는 효소를 코딩하는 유전자를 도입하여 발현시킴으로써, 재생 가능한 탄소순환형 바이오매스로부터 테레프탈산을 제조할 수 있는 테레프탈산 생산용 재조합 미생물을 제조하고, 이를 이용한 테레프탈산의 생성을 확인하였다. 아직까지 재조합 미생물을 이용하여 파라자일렌으로부터 테레프탈산을 생산하는 생물학적 공정은 보고된 바가 없다.
본 발명의 테레프탈산 대사경로는 자일렌 모노옥시게나제, 4-메틸벤질알데하이드 디하이드로게나제, 톨루에이트 메틸모노옥시게나제, 4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제로 구성된다. 상기 자일렌 모노옥시게나제는 파라자일렌을 4-메틸벤질알콜로 전환시키며, 4-메틸벤질알데하이드 디하이드로게나제는 4-메틸벤질알데하이드를 파라톨루엔산으로 전환시키며, 톨루에이트 메틸모노옥시게나제는 파라톨루엔산을 4-카복시벤질알콜로 전환시키며, 4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제는 4-카복시벤질알콜을 테레프탈산으로 전환시키는 효소이다.
본 발명은 일 관점에서, 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 xylMA(자일렌 모노옥시게나제 코딩 유전자), xylC(4-메틸벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자), tsaMB(톨루에이트 메틸모노옥시게나제 코딩 유전자), tsaC(4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제 코딩 유전자) 및 tsaD(4-카복시벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자)가 도입되어 있는 테레프탈산 생산능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 tsaMB(톨루에이트 메틸모노옥시게나제 코딩 유전자), tsaC(4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제 코딩 유전자) 및 tsaD(4-카복시벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자)가 도입되어 있는 테레프탈산 생산능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 미생물에 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 xylMA(자일렌 모노옥시게나제 코딩 유전자), xylC(4-메틸벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자), tsaMB(톨루에이트 메틸모노옥시게나제 코딩 유전자), tsaC(4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제 코딩 유전자) 및 tsaD(4-카복시벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자)를 도입하는 것을 특징으로 하는 테레프탈산 생산능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 미생물에 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 tsaMB(톨루에이트 메틸모노옥시게나제 코딩 유전자), tsaC(4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제 코딩 유전자) 및 tsaD(4-카복시벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자)를 도입하는 것을 특징으로 하는 테레프탈산 생산능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 사용할 수 있는 테레프탈산 생산용 미생물로는 에스케리치아 속, 바실러스 속, 코리네박테리움 속, 피치아 속, 슈도모나스 속, 사카로마이세스 속 또는 루게리아 속 등을 예시할 수 있고, 바람직하게는 에스케리치아 속 미생물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 대장균일 수 있다. 특히, 대장균은 산업적으로 많이 사용되고 있는 균주로 유전정보 및 배양조건이 알려져 있어 쉽게 산업화할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 재조합 미생물에는 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있으며, xylMA(자일렌 모노옥시게나제 코딩 유전자), xylC(4-메틸벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자), tsaMB(톨루에이트 메틸모노옥시게나제 코딩 유전자), tsaC(4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제 코딩 유전자) 및 tsaD(4-카복시벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자)를 도입하여 제조할 수 있다.
상기 재조합 미생물은 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인, xylMA(자일렌 모노옥시게나제 코딩 유전자), xylC(4-메틸벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자), tsaMB(톨루에이트 메틸모노옥시게나제 코딩 유전자), tsaC(4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제 코딩 유전자) 및 tsaD(4-카복시벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 도입하여 제조할 수 있으며, 추가로 xylB 유전자가 도입될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 xylMA 및 xylC가 하나의 벡터에 삽입된 형태 및 tsaMB , tsaC , tsaD가 또 다른 하나의 벡터에 삽입된 형태로 도입되었으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 중 어느 하나 이상 또는 모두가 숙주 미생물의 염색체상에 직접 도입될 수도 있으며, 상기 유전자 중 어느 하나 이상 또는 모두를 발현 벡터에 삽입하여 제조된 재조합 벡터의 형태로 숙주 미생물에 도입될 수 있다.
본 발명의 xylMA는 슈도모나스 푸티다 F1, xylC는 슈도모나스 푸티다 KT2440 유래인 것이 바람직하며, tsaMB, tsaC 및 tsaD는 코마모나스 테스토스테로니 T-2 유래인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 여러 다른 미생물 유래의 유전자라 할지라도 숙주 미생물에 도입, 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 제한이 없다.
본 발명의 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 강한 프로모터를 함유하는 플라스미드 벡터 형태로 도입할 수 있고, 상기 강한 프로모터는 trc 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 락토스 프로모터 및 trp 프로모터인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 벡터는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 플라스미드 및 벡터는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션할 수 있다.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환 되어야 한다. 형질전환은 Sambrook , et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합 벡터 내에 포함되게 된다.
상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 형질전환은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는, xylMA(자일렌 모노옥시게나제 코딩 유전자), xylC(4-메틸벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자), tsaMB(톨루에이트 메틸모노옥시게나제 코딩 유전자), tsaC(4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제 코딩 유전자) 및 tsaD(4-카복시벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자)가 도입되어 있는 재조합 미생물 및 tsaMB(톨루에이트 메틸모노옥시게나제 코딩 유전자), tsaC(4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제 코딩 유전자) 및 tsaD(4-카복시벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자)가 도입되어 있는 재조합 미생물을 각각 파라자일렌 및 파라톨루엔이 함유된 배지에서 배양한 결과, 테레프탈산이 생산되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 테레프탈산을 생성시키는 단계: 및 (b) 상기 생성된 테레프탈산을 회수하는 단계를 포함하는 테레프탈산의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 파라자일렌 또는 파라톨루엔을 함유하는 배지에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 재조합 미생물의 성장과 생산이 이루어지는 배지와 파라자일렌이 용해된 올레일알콜을 함유하는 이상발효공정으로 보다 효율적인 기질(파라자일렌)의 공급을 통해 향상된 테라프탈산의 생산을 확인하였다.
실시예
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명 할 것이다.
실시예 1: xylMA 및 xylC 유전자를 함유하는 벡터의 제작
Pseudomonas putida F1 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1과 2의 프라이머로 PCR을 수행하여, xylMA 유전자 절편을 제작하였다.
서열번호 1 : 5'-CGGACGGCCGGAACTCCTAAGGAATTCGAGCTCGGTACCC-3'
서열번호 2 : 5'-TACTTGATGTATTCCCACATATGGTCTGTTTCCTGTGTGA-3'
또한, Pseudomonas putida KT2440 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 3과 4의 프라이머로 PCR을 수행하여, xylC 유전자 절편을 제작하였다.
서열번호 3 : 5'-CGACCATCATCCGCATTTGAGGAATTCGAGCTCGGTACCC-3'
서열번호 4 : 5'-TCACTGGCAAATACCGCCATATGGTCTGTTTCCTGTGTGA-3'
다음으로, 상기 제조된 xylMA 및 xylC 유전자 절편은 trc 프로모터의 강한 유전자 발현을 진행하는 pTrc99a 플라스미드(Pharmacia, Biotech, Uppsala, Sweden)에 깁슨 방법(Daniel G et al, Nature Methods, 2014, 6(5),343-345)으로 삽입하여, pTrc99a-xylMA와 pTrc99a-xylC를 제작하였다.
상기 제작된 pTrc99a-xylMA 플라스미드를 주형으로 하여, 서열번호 5와 6의 프라이머로 PCR을 수행하고, xylMB 절편을 제작하였다.
서열번호 5 : 5'-TCACACAGGAAACAGACCATATGTGGGAATACATCAAGTACTAC-3'
서열번호 6 : 5'-GGGTACCGAGCTCGAATTCCTTAGGAGTTCCGGCCGTCCG-3'
또한, 상기 제작된 pTrc99a-xylC 플라스미드를 대장균에 형질전환시킨 후, 서열번호 7과 8의 프라이머로 PCR을 수행하여, xylC 절편을 제작하였다.
서열번호 7 : 5'-GAACTCCTAAGGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGATGGCGGTATTTGCCAG-3'
서열번호 8 :
5'-CAGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGTCAAATGCGGATGATGGTC-3'
마지막으로, 상기 제작된 두 개의 유전자 카세트(xylMA 및 xylC 카세트)를 pTrc99a 플라스미드에 삽입하여, 파라자일렌으로부터 파라톨루엔산을 생성할 수 있는 xylMA 및 xylC 유전자가 코딩하는 효소가 발현되는 pTrc99a-xylMAC 플라스미드를 제작하였다(도 2).
실시예 2: tsaMB , tsaC 및 tsaD 유전자를 함유하는 벡터의 제작
Comamonas testosteroni T-2 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 9와 10의 프라이머로 PCR을 수행하여 tsaMB 유전자 절편을 제작하였으며, 서열번호 11과 12의 프라이머로 PCR을 수행하여 tsaCD 유전자 절편을 제작하였다.
서열번호 9 : 5'-AGACAGGAATTCATGTTCATCCGCAATTGCTGG-3'
서열번호 10 : 5'-AGACAGGGATCCTCAGATGTCCAGGACCAGC-3'
서열번호 11 : 5'-AGACAGGAATTCATGAACCTGAACAAACAAGTGG-3'
서열번호 12 : 5'-AGACAGCTGCAGTCAGGCCACGTAGTGCATGAAC-3'
상기 제조된 tsaMB 유전자 절편은 실시예 1에서 사용한 trc 프로모터의 강한 유전자 발현을 진행하는 pTrc99a 플라스미드(Pharmacia, Biotech, Uppsala, Sweden)에 깁슨 방법으로 삽입하여, pTrc99a-tsaMB를 제조하였다. 또한, 상기 제조된 tsaCD유전자 절편은 tac 프로모터의 강한 유전자 발현을 진행하는 pTac15k 플라스미드(Pharmacia, Biotech, Uppsala, Sweden)에 동일한 깁슨 방법으로 삽입하여, pTac15k-tsaCD를 제작하였다.
다음으로, 상기 제조된 pTrc99a-tsaMB 플라스미드를 대장균에 형질전환시킨 후, 서열번호 13과 14의 프라이머로 PCR을 수행하여, 프로모터와 터미네이터를 포함하는 tsaMB 카세트 절편을 제작하였다. 제작된 tsaMB 카세트를 상기 제조된 pTac15k-tsaCD 플라스미드에 깁슨 방법으로 삽입하여, 파라톨루엔산으로부터 테레프탈산을 생성할 수 있는 tsaMB, tsaC 및 tsaD 유전자가 발현되는 pTac15k-tsaCDtrctsaMB 플라스미드를 제작하였다(도 2).
서열번호 13 : 5'-GGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGTTGACAATTAATCATCC-3'
서열번호 14 :
5'-GAAGCATTGGTGCACCGTGCAGTCGATAAGCTCCGAAGAGTTTGTAGAAACG-3'
실시예 3: pTrc99a - xylMAC - rbstsaMB - rbstsaCD 벡터의 제작
실시예 2에서 제작된 pTrc99a-tsaMB 주형으로 하고, 서열번호 15와 16의 프라이머로 PCR을 수행하여 rbstsaMB 유전자 절편을 제작하였으며, 실시예 2에서 제작된 pTac15k-tsaCD 플라스미드를 주형으로 하고 서열번호 17과 18의 프라이머로 PCR을 수행하여 rbstsaCD 유전자 절편을 제작하였다.
서열번호 15 : 5'-CATCATCCGCATTTGACTCTAGAGTCGACCTGCATCACACAGGAAACAGAC-3'
서열번호 16 : 5'-GAATTCTGTTTCCTGTGTGATCAGATGTCCAGGACCAGCC-3’
서열번호 17 : 5'-GGCTGGTCCTGGACATCTGATCACACAGGAAACAGAATTC-3'
서열번호 18 : 5'-GCCAAAACAGCCAAGCTTGCATGCCTGCATCAGGCCACGTAGTGCA-3’
다음으로, 상기 제조된 rbstsaMB, rbstsaCD 절편을 PstI 제한효소로 처리된 pTrc99a-xylMAC 플라스미드(실시예1)에 깁슨 방법으로 삽입하여, pTrc99a-xylMAC-rbstsaMB-rbstsaCD 플라스미드를 제조하였다.
실시예 4: pTac15k - xylMAC 벡터의 제작
실시예 1에서 제작된 pTrc99a-xylMAC 플라스미드를 주형으로 하고, 서열번호 19와 20의 프라이머로 PCR을 수행하여 xylMAC 유전자 절편을 제작하였으며, EcoRI 제한효소로 처리된 pTac15k 플라스미드에 깁슨 방법으로 삽입하여, pTac15k-xylMAC 플라스미드를 제조하였다.
서열번호 19 : 5'-TGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCCATATGTGGGAATAC-3'
서열번호 20 : 5'-ACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGTCAAATGCGGATGATG-3’
실시예 5: pTrc99a - xylMA , pTrc99a - xylC , pTrc99a - xylMAC 플라스미드를 함유하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 파라자일렌으로부터 파라톨루엔산의 생산
실시예 1에서 제작한 pTrc99a-xylMA, pTrc99a-xylC, pTrc99a-xylMAC 플라스미드를 전기천공법 (electroporation, 2.5 kV, 25 F, 200 ohms)으로 대장균(DH5α)에 도입하여, 파라자일렌으로부터 톨루엔산을 생산할 수 있는 균주를 제작하였다.
제조된 균주를 10ml의 LB 배지에서 12~16시간 동안 배양 후, 50ml의 동일 배지를 포함하는 250ml 플라스크 (baffled flask)에 OD600=0.1~0.2(600nm 파장에서 세포 배양액의 흡광도)의 세포 농도로 접종하였다. 세포 농도가 OD600=0.6에 도달하면 1mM의 IPTG(Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside)로 tsaMB와 tsaCD 유전자의 발현을 유도한 후, OD600=2.0에 이를 때까지(3~3.5 시간) 37℃, 220rpm에서 배양 하였다. 그 다음, 대장균 세포를 원심분리기를 이용하여 수확하고 7ml의 1%의 포도당을 포함하는 pH7.4 염화칼륨 버퍼 (potassium phosphate buffer, 50mM)에 재분산시켜 1ml씩 분주하고, 30℃에서 5분간 보관 후 파라자일렌이 30mM로 용해되어 있는 파라자일렌-에탄올 용액을 첨가하였다. xylMA와 xylC에 의해 발현되는 xylene monooxygenase 및 4-methylbenzylaldehyde dehydrogenase에 의한 파라자일렌의 변환을 확인하기 위해, 상등액을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, pTrc99a-xylMB 플라스미드(실시예1)로 형질전환된 재조합 미생물 배양액에 파라자일렌을 첨가한 경우 4-methylbenzylalcohol과 4-methylbenzylaldehyde이 생산되는 것을 확인하였으며 (도 3A), pTrc99a-xylC(실시예1)로 형질전환된 재조합 미생물 배양액에 4-methylbenzylaldehyde를 첨가한 경우 파라톨루엔산이 생성됨을 확인하였다 (도 3B). 다음으로 pTrc99a-xylMAC(실시예1)로 형질전환된 재조합 미생물 배양액에 파라자일렌을 500mg/L의 농도로 첨가한 경우 127.5mg/L의 파라톨루엔산이 생산됨을 확인하였다 (도 3C). 이상의 결과는 Pseudomonas putida F1 유래 xylMB와 Pseudomonas putida KT2440 유래 xylC에 의해 발현되는 xylene monooxygenase 및 4-methylbenzylaldehyde dehydrogenase가 대장균에서 성공적으로 발현하여 활성을 나타낸다는 것을 의미한다.
또한, xylMA와 xylC 유전자 외에, 4-methylbenzylalcohol를 4-methylbenzylaldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 xylB 유전자가 함께 도입된 재조합 미생물을 제작하였고, 이를 이용하여 파라톨루엔산의 생산 효과를 분석하였다. 하지만, xylB 유전자의 도입 여부는 파라자일렌으로부터 파라톨루엔산의 생산에 큰 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
실시예 6: pTrc99a - tsaMB , pTac15k - tsaCD , pTac15k - tsaCDtrctsaMB 플라스미드를 함유하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 파라자일렌으로부터 파라톨루엔산의 생산
실시예 2에서 제작한 pTrc99a-tsaMB, pTac15k-tsaCD, pTak15k-tsaCDtrctsaMB 플라스미드를 전기천공법 (electroporation, 2.5 kV, 25 F, 200 ohms)으로 대장균(DH5α)에 도입하여, 파라자일렌으로부터 톨루엔산을 생산할 수 있는 균주를 제작하였다.
제조된 균주를 10ml의 LB 배지에서 12~16시간 동안 배양 후, 50ml의 동일 배지를 포함하는 250ml 플라스크 (baffled flask)에 OD600=0.1~0.2(600nm 파장에서 세포 배양액의 흡광도)의 세포 농도로 접종하였다. 세포 농도가 OD600=0.6에 도달하면 1mM의 IPTG(Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside)로 tsaMB와 tsaCD 유전자의 발현을 유도한 후, OD600=2.0에 이를 때까지(3~3.5 시간) 37℃, 220rpm에서 배양 하였다. 그 다음, 대장균 세포를 원심분리기를 이용하여 수확하고 7ml의 1%의 포도당을 포함하는 pH7.4 염화칼륨 버퍼 (potassium phosphate buffer, 50mM)에 재분산시켜 1ml씩 분주하고, 30℃에서 5분간 보관 후 파라톨루엔산과 4-카르복시벤질알콜(4-carboxybenzyl alcohol)을 추가하였다. tsaMB와 tsaC에 의해 발현되는 toluate methylmonooxygenase 및 4-carboxybenzylalcohol dehydrogenase에 의한 파라톨루엔산과 4-carboxybenzyl alcohol의 변환을 확인하기 위해, 상등액을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, pTrc99a-tsaMB 플라스미드(실시예2)로 형질전환된 재조합 미생물 배양액에 파라톨루엔산을 첨가한 경우 시간에 따라 파라톨루엔산의 감소와 4-carboxybenzyl alcohol이 생산되는 것을 확인하였으며 (도 3D), pTac15k-tsaCD(실시예2)로 형질전환된 재조합 미생물 배양액에 4-carboxylbenzyl alcohol을 첨가한 경우 4-carboxylbenzyl alcohol의 감소와 테레프탈산이 생성됨을 확인하였다 (도 3E). 다음으로 pTac15k-tsaCDtrctsaMB(실시예2)로 형질전환된 재조합 미생물 배양액에 톨루엔산을 250 mg/L로 첨가한 경우 19.5mg/L의 테레프탈산이 생성됨을 확인할 수 있었다 (도 3F). 이상의 결과는 pTrc99a-tsaMB, pTac15k-tsaCD, pTac15k-tsaCDtrctsaMB 플라스미드에 의해 toluate methylmonooxygenase 및 4-carboxybenzylalcohol dehydrogenase 효소가 대장균 내에서 성공적으로 발현되어 정상적인 활성을 가지고 작동한다는 것을 의미한다.
실시예 7: pTrc99a-xylMAC 및 pTac15k-tsaCDtrctsaMB 플라스미드를 함유하는 재조합 미생물 (LZW16), pTrc99a-xylMAC-rbstsaMB-rbstsaCD 플라스미드를 함유하는 재조합 미생물 (LZW17), pTrc99a-xylMAC-rbstsaMB-rbstsaCD 및 pTac15k-tsaCDtrctsaMB 플라스미드를 함유하는 재조합 미생물 (LZW18), pTac15k-xylMAC 및 pTrc99a - tsaCDtrctsaMB 플라스미드를 함유하는 재조합 미생물 ( LZW19 )의 제조 및 이를 이용한 파라자일렌으로부터 테레프탈산의 생산
Trc99a-xylMAC (실시예1) 및 pTac15k-tsaCDtrctsaMB (실시예2) 플라스미드, pTrc99a-xylMAC-rbstsaMB-rbstsaCD 플라스미드(실시예3), pTrc99a-xylMAC-rbstsaMB-rbstsaCD (실시예3) 및 pTac15k-tsaCDtrctsaMB (실시예1) 플라스미드, pTac15k-xylMAC (실시예4) 및 pTrc99a-tsaCDtrctsaMB (실시예1) 플라스미드를 전기천공법 (electroporation, 2.5 kV, 25 F, 200 ohms)으로 대장균(DH5α)에 동시에 도입하여 균주 LZW16, LZW17, LZW18, LZW19를 각각 제작하였다. LZW18 (pTrc99a-xylMAC-rbstsaMB-rbstsaCD 및 pTac15k-tsaCDtrctsaMB)과 LZW19(pTac15k-xylMAC 및 pTrc99a-tsaCDtrctsaMB)에 사용되어진 플라스미드 조합은 toluate methylmonooxygenase 및 4-carboxybenzylalcohol dehydrogenase 의 발현량을 증가시킴으로써 도 3에서 확인된 중간대사체인 파라톨루엔산의 축적을 최소화함으로써 테레프탈산의 생산성을 향상시키기 위해 고안되었다. 도 4에 4가지 재조합 미생물 LZW16, LZW17, LZW18, LZW19의 플라스미드 조합을 나타냈다.
제조된 재조합 균주를 LB 배양액에서 12~16시간 배양 후 1ml의 LB 세포배양액을 50ml의 최소 R 배지를 포함하는 250ml 플라스크(baffled flask)에 접종한 후, 37℃, 220rpm에서 OD600이 0.6이 될 때까지 배양하였다. OD600이 0.6에 이르렀을 때 IPTG로 효소의 발현을 유도하였고 OD600이 2.0에 도달한 후 200μl의 파라자일렌을 플라스크에 가는 관으로 연결되어 있는 바이알에 추가하여 증발을 통해 플라스크내의 세포 배양액에 공급되도록 하였다. IPTG의 추가 이후에는 30℃, 220rpm에서 세포의 성장과 테레프탈산의 생산 및 중간대사체인 파라톨루엔산의 생산을 관찰하였다.
이에, 시간에 따른 바이오매스 (OD600)(도 5A), 배양액내 테레프탈산의 농도(도 5B), 중간대사체인 파라톨루엔산의 배양액 중 농도(도 5C)를 확인한 결과, LZW16 (-◆-), LZW17(-■-), LZW18(-●-) 및 LZW19(-▲-) 균주는 각각 50, 117.5, 176.3, 51.6 mg/L의 테레프탈산을 생산하였다. LZW16과 17균주에서는 각각 211.9과 205.8 mg/L의 파라톨루엔산이 생산되었으나 LZW18과 19 균주에서는 파라톨루엔산의 축적이 관찰되지 않았으며 이는 파라톨루엔산을 테레프탈산으로 전환하는 tsaMBCD 유전자의 발현을 강화함으로써 중간대사체(톨루엔산)의 축적을 최소화하고 테레프탈산으로의 전환을 촉진함으로써 균주의 생산능이 향상될 수 있음을 보여준다.
상기 최소 R 배지는 4g/L (NH4)2HPO4 , 13.5g/L KH2PO4, 1.7g/L citric acid, 0.7g/L MgSO47H2O, 0.5%(v/v) 미량원소 용액으로 구성되었으며 (Lee, S.Y. & Chang, H.N., Biotechnol. Lett., 15:971, 1993), 미량원소 용액은 1 리터당 5M HCl, 10g FeSO47H2O, 2.25g ZnSO47H2O, 1g CuSO45H2O, 0.5g MnSO45H2O, 0.23g Na2B4O710H2O, 2g CaCl22H2O 및 0.1g (NH4)6Mo7O24을 포함한다. 또한, 포도당(500g/L) 저장 용액은 별도로 멸균시켰고, 최종 농도가 10g/L 되도록 멸균된 배지에 추가하였다.
실시예 8: pTrc99a - xylMAC - rbstsaMB - rbstsaCD과 pTac15k - tsaCDtrctsaMB 플라스미드를 동시에 함유하는 LZW18 재조합 미생물의 이상발효를 통한 테레프탈산의 제조
실시예 7에서 제조된 재조합 균주 LZW18을 LB 배양액에서 12~16시간 배양 후 1ml의 LB 세포배양액을 네 개의 50ml의 최소 R 배지를 포함하는 250ml 플라스크(baffled flask)에 접종한 후, 12~16시간 배양하여 1.8L의 최소 R 배지(20 g/L 의 포도당)를 함유하는 발효기 (6.6L jar fermentor, Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에 접종하였다. 접종 후 발효기 내 초기 OD600는 0.2였으며 OD600이 5 정도에 이르렀을 때 IPTG를 추가(최종농도 1mM)하여 효소의 발현을 유도하였다. 발효기의 온도는 30℃, pH는 7.0로, 용존산소 농도는 40%로 설정, 유지되었다. pH는 50% 암모니아수 (NH4OH)로 조절 되었으며 용존 산소는 교반속도의 변화와 공기를 2 L/min으로 유입시킴으로써 조절하였다. 파라자일렌은 500ml의 올레일알콜(oleyl alcohol)에 20, 40g/L의 농도로 용해되었으며 OD600이 10 부근에 이르렀을 때 펌프를 이용하여 파라자일렌이 용해되어 있는 500ml의 올레일알콜을 점차적으로 발효기내로 도입하였다. 초기 배양액의 부피를 고려한 경우 파라자일렌의 최종 농도는 각각, 4, 8 g/L이다. 상기 발효공정에서는 파라자일렌의 수용액에 대한 낮은 용해도로 인해 야기되는 파라자일렌 공급 문제와 미생물에 대한 독성문제를 올레일알콜에 고농도로 용해되어진 파라자일렌이 점차적으로 배양액으로 확산되게 함으로써 독성을 최소화 할 수 있는 농도로 파라자일렌이 지속적으로 공급되어질 수 있도록 고안되었다.
그 결과, 발효기 내 시간에 따른 바이오매스(-●-), 포도당(-■-), 파라톨루엔산(-▲-), 테레프탈산(-◆-)의 변화를 도 6에 나타냈다. 파라자일렌이 4g/L(도 6A)와 8g/L(도 6B)의 농도로 공급되어진 경우 1.8, 2.7g/L의 파라톨루엔산과 함께 2.9와 2.1g/L의 테레프탈산이 생산되었다. 이는 기존 플라스크 배양에 비해 16배 이상의 생산량 증가이며 바이오매스의 지속적인 증가는 올레일알콜을 이용한 이상발효를 통해 파라자일렌의 재조합 대장균의 성장에 미치는 부정적인 영향을 최소화하며 올레일알콜에 용해된 파라자일렌의 확산에 의한 지속적인 파라자일렌의 공급방식을 통해 재조합 균주를 이용한 테레프탈산을 생산성을 향상시킬 수 있음을 보여준다.
상기 최소 R 배지는 4g/L (NH4)2HPO4 , 13.5g/L KH2PO4, 1.7g/L citric acid, 0.7g/L MgSO47H2O, 0.5%(v/v) 미량원소 용액으로 구성되었으며 (Lee, S.Y. & Chang, H.N., Biotechnol. Lett., 15:971, 1993), 미량원소 용액은 1 리터당 5M HCl, 10g FeSO47H2O, 2.25g ZnSO47H2O, 1g CuSO45H2O, 0.5g MnSO45H2O, 0.23g Na2B4O710H2O, 2g CaCl22H2O 및 0.1g (NH4)6Mo7O24을 포함한다. 또한, 포도당(500g/L) 저장 용액은 별도로 멸균시켰고, 최종 농도가 10g/L 되도록 멸균된 배지에 추가하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Recombinant Microorganism Producing Terephthalic Acid and Method for Producing Terephthalic Acid Using the Same <130> P15-B136 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p1 <400> 1 cggacggccg gaactcctaa ggaattcgag ctcggtaccc 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p2 <400> 2 tacttgatgt attcccacat atggtctgtt tcctgtgtga 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p3 <400> 3 cgaccatcat ccgcatttga ggaattcgag ctcggtaccc 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p4 <400> 4 tcactggcaa ataccgccat atggtctgtt tcctgtgtga 40 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p5 <400> 5 tcacacagga aacagaccat atgtgggaat acatcaagta ctac 44 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p6 <400> 6 gggtaccgag ctcgaattcc ttaggagttc cggccgtccg 40 <210> 7 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p7 <400> 7 gaactcctaa ggaattcgag ctcggtaccc gggatggcgg tatttgccag 50 <210> 8 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p8 <400> 8 cagccaagct tgcatgcctg caggtcgact ctagagtcaa atgcggatga tggtc 55 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p9 <400> 9 agacaggaat tcatgttcat ccgcaattgc tgg 33 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p10 <400> 10 agacagggat cctcagatgt ccaggaccag c 31 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p11 <400> 11 agacaggaat tcatgaacct gaacaaacaa gtgg 34 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p12 <400> 12 agacagctgc agtcaggcca cgtagtgcat gaac 34 <210> 13 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p13 <400> 13 ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta gagttgacaa ttaatcatcc 50 <210> 14 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p14 <400> 14 gaagcattgg tgcaccgtgc agtcgataag ctccgaagag tttgtagaaa cg 52 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 15 <400> 15 catcatccgc atttgactct agagtcgacc tgcatcacac aggaaacaga c 51 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16 <400> 16 gaattctgtt tcctgtgtga tcagatgtcc aggaccagcc 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 17 <400> 17 ggctggtcct ggacatctga tcacacagga aacagaattc 40 <210> 18 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18 <400> 18 gccaaaacag ccaagcttgc atgcctgcat caggccacgt agtgca 46 <210> 19 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 19 <400> 19 tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gccatatgtg ggaatac 47 <210> 20 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 20 <400> 20 actctagagg atccccgggt accgagctcg tcaaatgcgg atgatg 46

Claims (17)

  1. (a) 테레프탈산 대사경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 xylMA(자일렌 모노옥시게나제 코딩 유전자), xylC(4-메틸벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자), tsaMB(톨루에이트 메틸모노옥시게나제 코딩 유전자), tsaC(4-카복시벤질알콜 디하이드로게나제 코딩 유전자) 및 tsaD(4-카복시벤질알데하이드 디하이드로게나제 코딩 유전자)가 도입되어 있는 테레프탈산 생산능을 가지는 재조합 대장균을 배양하여 테레프탈산을 생성시키는 단계: 및
    (b) 상기 생성된 테레프탈산을 회수하는 단계;를 포함하되,
    상기 배양은 파라자일렌이 용해된 올레일알콜(oleyl alchol)을 공급하는 이상발효 공정을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 테레프탈산 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 xylMA 및 xylC는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 유래인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 tsaMB, tsaC 및 tsaD는 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni) 유래인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 xylMA 및 xylC는 하나의 벡터에 삽입된 형태로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 벡터는 trc 프로모터를 함유하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 tsaMB, tsaC 및 tsaD는 하나의 벡터에 삽입된 형태로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 벡터는 trc 또는 tac 프로모터를 함유하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 삭제
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  13. 삭제
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  16. 삭제
  17. 삭제
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