CN108753673A - 一种重组恶臭假单胞菌及应用 - Google Patents

一种重组恶臭假单胞菌及应用 Download PDF

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李广生
刘龙
高永吉
刘炳朋
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Disha Pharmaceutical Group Co Ltd
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Disha Pharmaceutical Group Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种重组恶臭假单胞菌及其用于生产5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸的方法，属于发酵工程领域。本发明的技术方案是：一株重组恶臭假单胞菌Pseudomonas putida JN‑18，其菌种保藏编号为：CGMCC No.15734，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。发明成功实现了来源于自身内源性质粒上的二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶在恶臭假单胞菌P.putida ATCC33015中过表达，并以此重组菌P.putidaJN‑18全细胞催化2,5‑二甲基吡嗪生产5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸。

Description

一种重组恶臭假单胞菌及应用
技术领域
本发明涉及一种重组恶臭假单胞菌及其用于生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，属于发酵工程领域。
背景技术
5-甲基吡嗪-2-羧酸（5-Methylpyrazine-2-carboxylic acid，MPCA）是一种米白色固体结晶，分子式为C6H6N2O2，分子量为138.12，熔点166-169℃，是带有一个羧基和一个甲基的含氮杂环化合物。具有刺激性气味，当其暴露在空气中会被缓慢氧化，从棕色油状物变成棕黑色粘稠状固体，需要真空密封保存。是用于合成格列吡嗪、阿昔莫司及5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯等药物的重要中间体以及作为金属配合物用于制备催化剂。
5-甲基吡嗪-2-羧酸的结构式
目前，5-甲基吡嗪-2-羧酸的合成主要依赖化学合成，如下（陈炳和等，化学试剂，2008，30（11）：869-870；董阳阳等，化学试剂，2013，35（6）：505-509）：
（1）分子间环合法。以丙酮醛和二氨基马来腈为基本原料，在水、乙醇和乙酸体系中，两者环合得到2,3-二氰基-5-甲基吡嗪，然后在硫酸催化下氰基水解、脱羧得到目标化合物2-甲基吡嗪-5-羧酸；或是在催化剂焦亚硫酸钠的存在下，以丙酮醛和邻苯二胺为基本原料环合得到2-甲基苯并吡嗪，然后用高锰酸钾氧化得到5-甲基吡嗪-2,3-羧酸钾，再用硫酸进行酸化和脱羧得到目标化合物2-甲基吡嗪-5-羧酸。前者工艺路线简单，转化率较高，但是原料剧毒，工艺条件苛刻，未见工业化，后者原料易得，但是工艺合成路线较长，生产效率低，产品成本高。
（2）吡嗪侧链多步合成法。以2,5-二甲基吡嗪为基本原料，合成路线分为：氯化、酰化、水解、氧化或者氧化、酰化、水解、氧化，较长的合成路线制约目标产物的收率，过程中有部分中间体易被氧化，使其工业化生产条件更为苛刻。
（3）直接氧化法。以2,5-二甲基吡嗪为基本原料，把高锰酸钾溶于90℃的热水，然后缓慢滴加到2,5-二甲基吡嗪体系中，得到5-甲基吡嗪-2-羧酸的钾盐。最后，在0-5℃的冰水浴中，用浓盐酸酸析至pH值约为2.0，过滤得到目标化合物，粗产物收率40.08%。气相催化氧化法，则是将经氧化银改性的钒-钼氧化物为催化剂，气相催化氧化2,5-二甲基吡嗪为5-甲基吡嗪-2-羧酸和吡嗪-2,5-二羧酸。催化剂选择性较差，产生大量副产物，生产效率下降，成本增加。
还存在着电化学合成法，它一般先采用化学合成法中的吡嗪侧链多步合成法得到一系列2,5-二甲基吡嗪的R基取代物，然后再电解氧化得到目标化合物。但是这些化学方法，需要高温高压，反应条件要求高，使用大量氧化剂，生产成本高，对环境污染较大。
生物转化法制备5-甲基吡嗪-2-羧酸也有相关报导，其具有合成工艺简单，催化效率高，杂质少，对环境污染小等优点。目前国内主要是利用从土壤中筛选获得的菌株生物发酵进行生产，浙江工业大学（郑裕国等，化学与生物工程，2012，29（9）：19-25）筛选获得一株含二甲苯单加氧酶的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida ZJB-LLJ，李广生等人（CN106434434 B）在土壤中筛选出一新菌株HW-1。国外则是利用恶臭假单胞菌P.putida ATCC 33015进行生产，但需要在培养基中添加芳烃类物质，如甲苯，二甲苯等等，激活XylR蛋白，从而调节内源性质粒的上游途径的Pu启动子，从而诱导相关酶的表达，而该类物质通常具有毒性，对环境也不友好。相关酶为甲苯单加氧酶(XO)、苯甲醇脱氢酶(BZDH)和苯甲醛脱氢酶(BADH)，在这三个酶的作用下，2,5-二甲基吡嗪先转化为5-甲基吡嗪-2-甲醇，再转化为5-甲基吡嗪-2-甲醛，最后变为5-甲基吡嗪-2-羧酸。
因此，生产工艺简单，绿色环保且高效的5-甲基吡嗪-2-羧酸生产方法亟待开发。
发明内容
本发明旨在克服目前利用恶臭假单胞菌P.putida ATCC 33015制备5-甲基吡嗪-2-羧酸方法上的不足，避免引入环境不友好的芳烃类物质，提供一种反应条件温和，环境友好的重组恶臭假单胞菌及其用于生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法。
本发明的技术方案是：一种重组恶臭假单胞菌Pseudomonas putida JN-18，其菌种保藏编号为：CGMCC No.15734 ，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年05月07日。
本发明所述重组恶臭假单胞菌，包含编码二甲苯单加氧酶(XO)、苯甲醇脱氢酶(BZDH)和苯甲醛脱氢酶(BADH)的基因簇。所述编码二甲苯单加氧酶的基因xylM和xylA序列，分别对应NCBI-Gene ID: 1218754和NCBI-Gene ID: 1218743，所述苯甲醇脱氢酶的基因xylB序列对应NCBI-Gene ID: 9121238，所述苯甲醛脱氢酶的基因xylC序列对应NCBI-Gene ID: 1218745。
本发明所述恶臭假单胞菌，以P.putida ATCC33015为宿主，以pRSFDuet-1为表达载体，并且将表达载体pRSFDuet-1的T7启动子替换成Tac启动子。
本发明所述重组恶臭假单胞菌的制备方法，是以P.putida ATCC 33015本身携带的内源性质粒为模板，PCR扩增获得二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因簇，与表达载体相连，再转化至恶臭假单胞菌中。
本发明所述重组恶臭假单胞菌，能够以2,5-二甲基吡嗪为底物转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸。
本发明所述重组恶臭假单胞菌用于生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，以过表达二甲苯单加氧酶(XO)、苯甲醇脱氢酶(BZDH)和苯甲醛脱氢酶(BADH)的重组细胞为催化剂催化底物2,5-二甲基吡嗪生产5-甲基吡嗪-2-羧酸，无需利用芳烃类物质诱导。
本发明所述重组恶臭假单胞菌用于生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，以5-30g/L的2,5-二甲基吡嗪为底物，在20-40℃，pH6.0-8.5的条件下，转化12-60h。
本发明的有益效果：本发明成功实现了来源于自身内源性质粒上的二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶在恶臭假单胞菌P.putida ATCC 33015中过表达，并以此重组菌P.putidaJN-18全细胞催化2,5-二甲基吡嗪生产5-甲基吡嗪-2-羧酸。与野生型恶臭假单胞菌P.putida ATCC33015相比，本发明无需在培养基中添加芳烃类物质诱导，这类物质通常具有毒性，如甲苯、二甲苯等，野生菌则需要利用这些物质来激活XylR蛋白，从而调节内源性质粒的上游途径的Pu启动子，诱导相关酶的表达。且反应条件温和，对环境污染小，底物选择性高，本技术发明也有利于解决化学合成法中污染严重，成本高的问题，其工艺简单，易于推广。
附图说明
图1为重组质粒的构建图；
图2 pH对全细胞转化的影响；
图3温度对全细胞转化的影响；
图4细胞量对全细胞转化的影响；
图5底物2,5-二甲基吡嗪浓度对全细胞转化的影响；
图6 转化时间对全细胞转化的影响。
具体实施方式
菌株和质粒：
质粒的复制采用大肠杆菌(Escherichia coli JM109)为宿主，二甲苯单加氧酶(XO)、苯甲醇脱氢酶(BZDH)和苯甲醛脱氢酶(BADH)的表达和菌株发酵采用恶臭假单胞菌(P.putida ATCC 33015)，恶臭假单胞菌（P. putida ATCC 33105）购自日本微生物菌种保藏中心，编号JCM 6156。实验使用的质粒pRSFDuet-1由本实验室保藏。
试剂、酶及相关试剂盒：
硫酸卡那霉素、质粒小量抽提试剂盒购自于生工生物工程股份有限公司。各种化学试剂均为分析纯，购自于上海国药集团。无缝克隆试剂盒购自诺维赞生物科技有限公司。胶回收试剂盒购自于Fermentas 公司。
材料与方法：
LB种子培养基（/L）：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 1 g，蒸馏水定容。
TB发酵培养基（/L）：蛋白胨12 g，酵母提取物24 g，甘油4 mL，各组分溶解于900mL的水后，进行高压灭菌，冷却到60 ℃，再加100 mL灭过菌的17 mmol/L KH2PO4和72 mmol/L K2HPO4的溶液。
样品制备：取1 mL的转化液，在14,000 rpm下离心10 min，取上清液进行稀释后，再经过0.22 μm滤膜过滤，滤液供HPLC分析。
5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量测定：Agilent 1200高效液相色谱仪（配紫外可见检测器），采用Agilent ZORBAX Eclipse plus C18（250×4.6 mm，5 μm），水：乙腈：三氟乙酸 =88：12：0. 5（v/v），柱温25 ℃，流速1 mL/min，在紫外检测波长为270 nm下检测。
实施例1 .重组质粒的构建
根据NCBI上公布的恶臭假单胞菌P. putida ATCC 33105的内源性质粒pWWO序列(NCBIaccession NC_003350.1)。扩增pWWO上的编码二甲苯单加氧酶(XO)、苯甲醇脱氢酶(BZDH)和苯甲醛脱氢酶(BADH)基因簇，以5'ATGCGGGAAACAAAAGAGCAG 3'为上游引物，5'TCAACCAATCCGGAGTACCGGCTTAAGC 3'为下游引物进行PCR扩增获得目的基因。将pRSFDuet-1原本的T7启动子替换成Tac启动子，因为恶臭假单胞菌无法表达T7 RNA聚合酶，无法识别T7启动子。以改造后的pRSFDuet-1质粒为模板，以5'CGGTACTCCGGATTGGTTGAGCATAATGCTTAAGTCGAACAG3' 为上游引物，5'TGCTCTTTTGTTTCCCGCATGCCCATGGTATATCTCCTTATT3'为下游引物(下划线为在载体引物上添加的与目的基因簇同源的20bp同源序列)，进行反向PCR扩增获得线性化载体。利用无缝克隆试剂盒进行连接，构建重组质粒pRSFDuet-1-pWWO基因簇（如图1）。
实施例2 .重组恶臭假单胞菌的构建
将实施例1构建的重组质粒pRSFDuet-1-pWWO基因簇转化至克隆宿主E.coli JM109，挑取在卡那霉素抗性的LB平板上生长的单菌落，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳确认后，挑选阳性克隆提取质粒，然后进行测序，序列正确的转化表达宿主P. putida ATCC 33105，构建重组菌P.putidaJN-18。
实施例3 .编码二甲苯单加氧酶(XO)、苯甲醇脱氢酶(BZDH)和苯甲醛脱氢酶(BADH)的基因簇在P.putidaJN-18中的表达
将实施例2中所得到的重组恶臭假单胞菌P.putidaJN-18从含卡那霉素抗生素的平板上挑取单菌落，接种到含卡那霉素抗生素的LB种子培养基中，在30 ℃、220 rpm下培养12 h作为种子液，将种子液以2%（v/v）的接种量接种到含卡那霉素抗生素的TB发酵培养基，于30℃、220 rpm条件下培养至至OD600=0.6，添加终浓度为0.2 mM的IPTG，28℃诱导10 h，离心收集菌体进行全细胞催化。
实施例4. pH对全细胞转化的影响
以10g/L的2,5-二甲基吡嗪作为底物，以实施例3培养所得的细胞作为催化剂，使用pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的200mM磷酸盐缓冲液重悬细胞至终OD600为100，反应体系的体积为10 mL，反应温度为30℃，反应时间36h。结果如图2所示，当pH偏碱性条件下，产量高于pH偏酸性条件下，其中pH8.0时产量相对其他pH达到最高，产量达到10.24g/L。因为最终产物为酸，所以缓冲液维持在碱性范围，比较有利于酶的催化作用，继而利于产物的生成。
实施例5. 温度对全细胞转化的影响
以10g/L的2,5-二甲基吡嗪作为底物，以实施例3培养所得的细胞作为催化剂，反应pH为8.0，细胞终OD600为100，反应体系的体积为10 mL，反应温度分别为20℃、30℃、40℃、50℃，反应时间36h。结果如图3所示，发现50℃时产量极低，温度太高可能会导致酶失活，而温度低则可能导致催化作用缓慢，所以选择中间的30℃作为催化温度。
实施例6. 细胞量对全细胞转化的影响
以10g/L的2,5-二甲基吡嗪作为底物，以实施例3培养所得的细胞作为催化剂，反应pH为8.0，反应体系的体积为10 mL，反应温度为30℃，反应时间36h， 添加的细胞终OD600分别为20，40，60，80，100，120进行转化反应。结果如图4所示，细胞终OD600小于100 时，产量与细胞量呈正相关，而细胞OD600为120时，产量相较于OD600为100低，所以选择产量相对较高的OD600为100的细胞量用于催化。
实施例7 . 底物2,5-二甲基吡嗪浓度对全细胞转化的影响
以实施例3培养所得全细胞为催化剂，反应pH 为8.0，细胞终OD600为100，反应温度为30℃，反应体系的体积为10 mL，反应时间36h，在底物2,5-二甲基吡嗪浓度分别为5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L下进行转化反应。结果如图5所示，当底物浓度为10 g/L时产量最高，5-甲基吡嗪-2-羧酸浓度为10.3g/L，摩尔转化率为80.6%。
实施例8 . 转化时间对全细胞转化的影响
以实施例3培养所得全细胞为催化剂，反应pH 为8.0，细胞终OD600为100，反应温度为30℃，反应体系的体积为10 mL，在底物2,5-二甲基吡嗪浓度为10g/L下进行转化反应，在上述基础上研究转化时间：12h，24h，36h，48h，60h对产量的影响，结果如图6所示，发现转化时间到36h后，产量基本保持不变，出于经济的考虑，选择转化时间为36h。
基因序列表
<110> 迪沙药业集团有限公司 江南大学 威海迪素制药有限公司
<120> 一种重组恶臭假单胞菌及其用途
<130> 3
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5099bp
<212> DNA
<213> p. putida ATCC 33105
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ttgcagttac cattaatgat cggtctatat gggctccttg tcttcggagt tgaaaacggg 1740
cgtatcgaac ttagtgagcc gttacaagtg gcagggtgca ttctttcttt ggcttggctt 1800
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cggaaaatgg cgcagctatt ggctatgttt tatggtgatc cgaaccgaga cattgcccat 1920
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cagacaattt acagtttcgt gatcagtgcg acagttggtt ccgtcaaaga tgcgataaag 2040
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gagccgccga agattcggaa aaaggcgtga cgcttaagcc ggtactccgg attggttga 5099
序列表
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atgcgggaaa caaaagagca gcctatctgg tacgggaagg tgtttagttc taattgggta 60
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ttgcagttac cattaatgat cggtctatat gggctccttg tcttcggagt tgaaaacggg 1740
cgtatcgaac ttagtgagcc gttacaagtg gcagggtgca ttctttcttt ggcttggctt 1800
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gagccgccga agattcggaa aaaggcgtga cgcttaagcc ggtactccgg attggttga 5099

Claims (7)

1.一株重组恶臭假单胞菌Pseudomonas putida JN-18，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.15734。
2.根据权利要求1所述重组恶臭假单胞菌Pseudomonas putida JN-18，其特征是，包含编码二甲苯单加氧酶(XO)、苯甲醇脱氢酶(BZDH)和苯甲醛脱氢酶(BADH)的基因簇，所述编码二甲苯单加氧酶的基因xylM和xylA序列，分别对应NCBI-Gene ID: 1218754和NCBI-GeneID: 1218743，所述苯甲醇脱氢酶的基因xylB序列对应NCBI-Gene ID: 9121238，所述苯甲醛脱氢酶的基因xylC序列对应NCBI-Gene ID: 1218745。
3.根据权利要求1所述重组恶臭假单胞菌Pseudomonas putida JN-18，其特征是，以P.putidaATCC33015为宿主，以pRSFDuet-1为表达载体，并且将表达载体pRSFDuet-1的T7启动子替换成Tac启动子。
4.根据权利要求1所述重组恶臭假单胞菌Pseudomonas putida JN-18，其特征是，以P.putida ATCC33015本身携带的内源性质粒为模板，PCR扩增获得二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因簇，与表达载体相连，再转化至恶臭假单胞菌中。
5.根据权利要求1所述重组恶臭假单胞菌Pseudomonas putida JN-18在制备5-甲基吡嗪-2-羧酸中的应用。
6.根据权利要求5所述重组恶臭假单胞菌Pseudomonas putida JN-18在制备5-甲基吡嗪-2-羧酸中的应用，其特征是，以过表达二甲苯单加氧酶(XO)、苯甲醇脱氢酶(BZDH)和苯甲醛脱氢酶(BADH)的重组细胞为催化剂催化底物2,5-二甲基吡嗪生产5-甲基吡嗪-2-羧酸，无需再利用芳烃类物质诱导。
7.根据权利要求5所述重组恶臭假单胞菌Pseudomonas putida JN-18在制备5-甲基吡嗪-2-羧酸中的应用，其特征是，以5-30g/L的2,5-二甲基吡嗪为底物，在20-40℃，pH6.0-8.5的条件下，转化12-60h。
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