CN110527656A - 高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌及其构建方法及应用 - Google Patents

高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌及其构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效合成5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸的工程菌及其构建方法及应用，属于生物工程技术领域。本发明的重组大肠杆菌是通过在大肠杆菌BL21(DE3)中组合优化二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因的表达，并强化表达二甲苯单加氧酶的电子转移蛋白基因得到，通过改造获得了高效合成5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸的大肠杆菌，其产量达到10.2g/L，且摩尔转化率提高到67％。在底物浓度提高的同时，摩尔转化率也有所提高。本发明重组大肠杆菌的构建方法简单，便于使用，具有很好应用前景。

Description

高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌及其构建方法及应用
技术领域
本发明涉及一种高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌及其构建方法及应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
5-甲基吡嗪-2-羧酸(5-Methylpyrazine-2-carboxylic acid，MPCA)是用于合成格列吡嗪、阿昔莫司及5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯等药物的重要中间体以及作为金属配合物用于制备催化剂。目前其合成主要采用化学合成法，可分为分子间环合法、吡嗪侧链多步合成法、直接氧化法和电化学法。但化学合成法存在反应条件要求高，使用大量氧化剂，生产成本高，对环境污染较大的问题。生物转化法则具有合成工艺简单，底物选择性好，催化效率高，杂质少，对环境污染小的优点，极具发展前景。
在恶臭假单胞杆菌中发现MPCA合成途径，以2,5-二甲基吡嗪(2,5-Dimethylpyrazine)为起始底物，由二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶、苯甲醛脱氢酶三步催化后，生成MPCA。其中二甲苯单加氧酶由xylM和xylA编码，苯甲醇脱氢酶由xylB编码，苯甲醛脱氢酶由xylC编码。在恶臭假单胞菌中，二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶、苯甲醛脱氢酶三个酶的表达需要使用甲苯或二甲苯先与xylR编码的阻遏蛋白先结合，解除阻遏作用，从而激活基因前的Pu启动子，继而使上述的酶得以表达，所以需要在培养基中添加甲苯或二甲苯作为碳源及诱导剂。而甲苯和二甲苯均属于致癌物，对人体及环境具有严重危害，同时其易燃且不易溶于水，对工业上生产5-甲基吡嗪-2-羧酸造成不便。
大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)是一种可用于高效表达含T7启动子的表达载体的菌株，其遗传背景清晰，分子手段多样，是一种被广泛用作异源表达重要化学品合成途径的生产宿主。
专利CN201711325652中公开了一种采用大肠杆菌异源表达了来源于恶臭假单胞杆菌ATCC33015的二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶、苯甲醛脱氢酶，但是该重组菌在提高底物浓度后，转化率会下降，在底物浓度达到12g/L之后，摩尔转化率下降至36％。而底物浓度低，虽然摩尔转化率高，但会造成产量低，不利于工业化生产。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，构建的重组大肠杆菌可以高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸。
本发明的第一个目的是提供一种高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌，所述的工程菌以大肠杆菌为宿主，重组表达了二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶，编码所述的二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶的基因分别位于三个基因载体上。
进一步地，所述的二甲苯单加氧酶以pETDuet-1为基因载体，所述的苯甲醇脱氢酶以pCDFDuet-1为基因载体，所述的苯甲醛脱氢酶以pRSFDuet-1为基因载体。
进一步地，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
进一步地，编码所述的二甲苯单加氧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述的苯甲醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述的苯甲醛脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述的工程菌还强化表达了二甲苯单加氧酶的电子转移蛋白基因。
进一步地，所述的强化表达二甲苯单加氧酶的电子转移蛋白基因是通过将连接二甲苯单加氧酶基因的重组质粒的核糖体结合位点(RBS)由SEQ ID NO.9所述的序列替换为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的序列。
本发明的第二个目的是提供一种构建所述的高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌的方法，包括如下步骤：
(1)以pETDuet-1、pCDFDuet-1、pRSFDuet-1为基因载体，分别构建包含二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因的重组质粒；
(2)将分别包含二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因的重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述的工程菌。
进一步地，所述的方法还包括将连接二甲苯单加氧酶基因的重组质粒的核糖体结合位点由SEQ ID NO.9所述的序列替换为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQID NO.7所示的序列的步骤。
本发明的第三个目的是提供一种所述的高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌的应用，具体是应用所述的工程菌催化2,5-二甲基吡嗪合成5-甲基吡嗪-2-羧酸。
进一步地，所述的应用是以所述的工程菌在28-30℃下，以0.05-0.5mM的IPTG进行诱导8-12h，离心收集细胞，加入4-12g/L底物2,5-二甲基吡嗪，催化36-48h合成5-甲基吡嗪-2-羧酸。
本发明的有益效果是：
本发明的重组大肠杆菌是通过在大肠杆菌BL21(DE3)中组合优化二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因的表达，并强化表达二甲苯单加氧酶的电子转移蛋白基因得到，通过改造获得了高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的大肠杆菌，其产量达到10.2g/L，且摩尔转化率提高到67％。在底物浓度提高的同时，摩尔转化率也有所提高。本发明重组大肠杆菌的构建方法简单，便于使用，具有很好应用前景。
附图说明
图1为本发明中高中低三种质粒的特性；
图2为本发明中菌株构建示意图；
图3为本发明中设计的RBS序列的翻译起始速率；
图4为本发明实施例1中不同拷贝数质粒组合的菌株的5-甲基吡嗪-2-羧酸产量的比较；
图5为本发明实施例2中不同浓度下菌株CGMCC NO.14930、MABC1和MABC5中5-甲基吡嗪-2-羧酸产量的比较；
图6为本发明实施例2中不同浓度下菌株CGMCC NO.14930、MABC1和MABC5中摩尔转化率的比较；
图7为本发明实施例3中替换电子转移蛋白前的RBS序列菌株的5-甲基吡嗪-2-羧酸产量的比较。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
5-甲基吡嗪-2-羧酸的测定方法：
高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1200，UV检测器，C18柱(250×4.6mm，5μm)，流动相比例：水：三氟乙酸：乙腈＝95.5：0.5:4，流速0.8mL/min，柱温25℃，进样体积为10μL。
实施例1：
优化二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因表达的组合
根据NCBI上公布的恶臭假单胞杆菌Pseudomonas putida ATCC33015(美国典型微生物保藏中心，ATCC No.33015)的二甲苯单加氧酶xylMA、苯甲醇脱氢酶xylB和苯甲醛脱氢酶xylC的序列，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，通过基因xylMA、xylB、xylC和质粒pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1的PCR线性扩增以及使用ClonExpress IIOne Step Cloning Kit(Vazyme)一步克隆连接，构建9种重组质粒。
将构建好的质粒根据质粒共存需要不同抗性，不同复制子的原则，进行6种组合，将6种组合的质粒电转化大肠杆菌BL21(DE3)，每种质粒添加量为800-1000ng，电转化条件：电压1800v，电容25F。然后37℃复苏2h涂布终浓度为100μg/mL Ampicillin，50μg/mLKanamycin及30μg/mL Streptomycin的LB平板，37℃培养12h，平板上长出的单克隆，得到带有三个质粒的菌株MABC1，MABC2，MABC3，MABC4，MABC5，MABC6。
将上述菌株MABC1，MABC2，MABC3，MABC4，MABC5，MABC6制成种子液，同时将专利CN201711325652中构建的重组菌CGMCC NO.14930也制备成种子液。种子培养基为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养8-12h。
将种子液以OD值为0.05-0.1的接种量接入发酵培养基中，发酵培养基的配方为：蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油4g/L，磷酸氢二钾2.31g/L，三水磷酸氢二钾16.42g/L。当OD值达到0.6时，在28-30℃下，以0.05-0.5mM的IPTG进行诱导8-12h，离心收集细胞在加入4g/L的底物DMP的pH8的缓冲液中催化36h，缓冲液的配方为：1.6g/L二水磷酸二氢钠，67.8g/L十二水磷酸氢二钠。
催化结束时，使用高效液相色谱测定上清中5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量，结果如图4所示，其中MABC1菌株的产量最高达到5g/L，其次为MABC5菌株，产量为4.3g/L，重组菌CGMCC NO.14930的产量为3.6g/L。
实施例2：
设置底物浓度为4g/L，6g/L，8g/L,10g/L，12g/L，然后用实施例1中产量较高的CGMCC NO.14930、MABC1和MABC5三株菌，分别在相应的底物浓度下进行转化，催化结束时，使用高效液相色谱测定上清中5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量，结果如图5和图6所示，随着底物浓度的提高，三株菌的产量有一定的提高，MABC1的产量始终高于CGMCC NO.14930和MABC5，但在三株菌中，摩尔转化率均呈现下降的趋势。
当底物浓度在4g/L到8g/L的范围时，MABC1的摩尔转化率降低幅度相对小，由97％下降至88％，而MABC5和CGMCC NO.14930摩尔转化率下降幅度较大，分别由84％下降至66％和由70％下降至55％；当底物浓度大于8g/L时，MABC1的摩尔转化率也开始下降幅度较大，从88％下降至53％，MABC5和CGMCC NO.14930摩尔转化率则分别下降至44％和36％。
实施例:3：
强化表达二甲苯单加氧酶的电子转移蛋白基因
通过在线RBS计算器对二甲苯单加氧酶的电子转移蛋白基因前的初始RBS，如SEQID NO.9的翻译起始速率进行预测，起始速率为817.8au，并以此为标准设计不同翻译起始速率的RBS序列，如图3所示，具体序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8所示。对上述MABC1菌株中的pETDuet-1-xylMA质粒前的RBS区进行替换，构建菌株ARBS1、ARBS2、ARBS3、ARBS4、ARBS5。
将种子液以OD值为0.05-0.1的接种量接入发酵培养基中，发酵培养基的配方为：蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油4g/L，磷酸氢二钾2.31g/L，三水磷酸氢二钾16.42g/L。当OD值达到0.6时，在28-30℃下，以0.05-0.5mM的IPTG进行诱导8-12h，离心收集细胞在加入12g/L的底物DMP的pH8的缓冲液中催化48h，缓冲液的配方为：1.6g/L二水磷酸二氢钠，67.8g/L十二水磷酸氢二钠。
催化结束时，使用高效液相色谱测定上清中5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量，结果如图7所示，其中MABC1的产量为8.1g/L，在ARBS3菌株中，产量最高，提高到了10.2g/L，摩尔转化率从53％提高到67％，提高了14％。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学；威海迪沙药业有限公司
<120> 高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌及其构建方法及应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2312
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
atggacacgc ttcgttatta cctgattcct gttgttactg cttgcgggct gatcggattt 60
tactatggtg gctattgggt ttggcttggg gcggcaacat tccctgcact gatggtgctt 120
gatgtcattt taccgaagga tttttcggcc agaaaggtaa gtcccttttt cgcagacctt 180
acccagtatt tgcagttacc attaatgatc ggtctatatg ggctccttgt cttcggagtt 240
gaaaacgggc gtatcgaact tagtgagccg ttacaagtgg cagggtgcat tctttctttg 300
gcttggctta gtggtgtgcc aactcttccg gtttcgcatg agttgatgca tcgtcgccac 360
tggttgcctc ggaaaatggc gcagctattg gctatgtttt atggtgatcc gaaccgagac 420
attgcccatg tcaacacgca tcacctttac ttagatacgc ctctcgatag cgatactccg 480
taccgtggtc agacaattta cagtttcgtg atcagtgcga cagttggttc cgtcaaagat 540
gcgataaaga ttgaggctga aactttacgt agaaaaggac agtcaccgtg gaatttgtcc 600
aacaaaacat atcaatatgt cgcacttctg ctcgctctgc ctggcttggt ttcttatctg 660
ggcgggccag cattagggtt ggttacgatt gcttcgatga ttattgcgaa agggatagtc 720
gagggtttta attactttca gcactatggt ttagtacgcg atttagatca gcctatcctc 780
ctgcaccacg cgtggaatca tatgggaaca attgtgcgcc cgctgggttg cgaaattact 840
aaccatatca atcatcatat tgacggctat acacggttct atgagttgcg tccggaaaaa 900
gaagccccgc agatgccttc gctctttgtg tgtttccttc tagggcttat tccgcctctt 960
tggttcgctc tcattgcaaa accaaagttg agagactggg accagcggta cgcaactcca 1020
ggtgagcgcg aactggctat ggctgcaaat aaaaaagcgg gatggccact gtggtgtgaa 1080
agtgaactgg gtcgggtggc tagcatttga taatacaggc agtctaaacc gtttcgactg 1140
agaccgtaga taagcgaaga gcgaacgaac tctacggtct ctttttgaaa aaaacgttcc 1200
aaatgggaca aagtttccgt tttttctaat taacgggcgt ctaactgagc gatgggttta 1260
tgaatgagtt ttttaagaaa atctctggtt tatttgtgcc gcctccggaa tctaccgttt 1320
cagtcagagg gcaggggttt cagtttaagg tgccacgcgg gcaaaccatt ctggaaagcg 1380
ctctgcatca aggaattgcc tttccgcatg attgcaaagt cggatcttgt gggacatgta 1440
aatataaact gatatctggc agggtcaatg agttgacctc ttctgctatg ggtctgagtg 1500
gcgatctgta tcagtccggc tatcgtttgg gttgtcaatg cataccaaaa gaagatctcg 1560
agatagagct agacacagtg ctcgggcagg cgttagttcc aatagaaacg agtgccttga 1620
ttagtaagca gaaacggctg gcgcacgata tagtcgagat ggaagtagtg cccgataagc 1680
agatagcctt ctaccccggc cagtatgcag atgtagaatg tgcagaatgc tctgctgtaa 1740
ggagttattc tttttccgct ccgccccaac ctgacggctc cctgagcttc catgttcgcc 1800
ttgtcccagg tggagttttc agtggttggc tatttggtgg cgatcgtaca ggagcgacac 1860
taaccctgcg agcgccttat ggacagttcg ggctccatga gagcaatgcc acgatggtct 1920
gcgtagccgg cggaacgggg cttgctccaa ttaaatgtgt tttgcagagc atgacccagg 1980
cccagcgaga gcgtgatgtg ttgttgttct ttggagctcg tcaacaacgt gacctatatt 2040
gcctcgacga aatagaagcg ctgcaactcg attggggtgg gcgcttcgag cttattccag 2100
ttttgtccga agagtcttct acgtcgtcat ggaaagggaa acgtggcatg gtaaccgagt 2160
attttaagga gtacctcact gggcagcctt atgaaggata cctttgcggg ccgcccccta 2220
tggtggacgc tgccgagacc gagctcgttc gacttggtgt tgcgcgggaa ttagtgtttg 2280
cggaccgttt ttataataga cctccttgct ag 2312
<210> 2
<211> 1101
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
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gaaaaccggc tggaactagc cagtgaactt ggggcgacgc acattattaa cccggccgct 720
aacgatccca ttgaggcgat caaagagata ttcgctgacg gtgttccgta tgtattggag 780
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atcggtattg taggggcgcc acctatgggg gccacggtgc ccgttgacat taacttcctg 900
ctattcaatc gtaagcttcg tggaatcgtt gagggtcagt cgatctcgga tattttcatt 960
cccaggctgg tggagcttta tcgccagggg aagtttccgt ttgacaagct gattaagttt 1020
tatccttttg atgaaatcaa tcgagccgcc gaagattcgg aaaaaggcgt gacgcttaag 1080
ccggtactcc ggattggttg a 1101
<210> 3
<211> 1464
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
atgcgggaaa caaaagagca gcctatctgg tacgggaagg tgtttagttc taattgggta 60
gaggcgcggg gaggtgttgc caatgttgtc gatccgtcca atggagacat tcttggcatt 120
acgggtgttg ctaacggcga agatgtcgat gctgctgtga acgcagctaa gagagcgcaa 180
aaggaatggg ccgcaatacc atttagtgaa agagccgcca ttgtccgcaa ggctgccgaa 240
aaactaaagg agcgcgagta tgaattcgcc gattggaacg tacgggaatg cggcgcaatt 300
cgtccgaagg gcttatggga ggccggaatt gcgtatgagc aaatgcatca agctgcgggt 360
ctagcttctt tgcctaacgg tacattgttt ccatcggcag ttccagggcg catgaatctt 420
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gaccttcaga ctgctgtcac cgggggggcg ctcattgccg aaatcttttc cgacgctggc 600
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aagccagcta attacccatt ttga 1464
<210> 4
<211> 6
<212> DNA
<213> （人工序列）
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gcaata 6
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<213> （人工序列）
<400> 9
tgagcg 6

Claims (10)

1.一种高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌，其特征在于，所述的工程菌以大肠杆菌为宿主，重组表达了二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶，编码所述的二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶的基因分别位于三个基因载体上。
2.根据权利要求1所述的高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌，其特征在于，所述的二甲苯单加氧酶以pETDuet-1为基因载体，所述的苯甲醇脱氢酶以pCDFDuet-1为基因载体，所述的苯甲醛脱氢酶以pRSFDuet-1为基因载体。
3.根据权利要求1所述的高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌，其特征在于，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
4.根据权利要求1所述的高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌，其特征在于，编码所述的二甲苯单加氧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述的苯甲醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述的苯甲醛脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求1所述的高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌，其特征在于，所述的工程菌还强化表达了二甲苯单加氧酶的电子转移蛋白基因。
6.根据权利要求5所述的高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌，其特征在于，所述的强化表达二甲苯单加氧酶的电子转移蛋白基因是通过将连接二甲苯单加氧酶基因的重组质粒的核糖体结合位点(RBS)由SEQ ID NO.9所述的序列替换为SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的序列。
7.一种构建权利要求1-6任一项所述的高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以pETDuet-1、pCDFDuet-1、pRSFDuet-1为基因载体，分别构建包含二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因的重组质粒；
(2)将分别包含二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因的重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述的工程菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括将连接二甲苯单加氧酶基因的重组质粒的核糖体结合位点由SEQ ID NO.9所述的序列替换为SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的序列的步骤。
9.一种权利要求1-6任一项所述的高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌的应用，其特征在于，应用所述的工程菌催化2,5-二甲基吡嗪合成5-甲基吡嗪-2-羧酸。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用具体是将所述的工程菌在28-30℃下，以0.05-0.5mM的IPTG进行诱导8-12h，离心收集细胞，加入4-12g/L底物2,5-二甲基吡嗪，催化36-48h合成5-甲基吡嗪-2-羧酸。
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