CN110684705A - 一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌 - Google Patents

一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明本发明涉及一种产5‑甲基吡嗪‑2羧酸的重组大肠杆菌，具体涉及调节二甲苯单加氧酶双亚基比例提高5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸的方法。所述调节二甲苯单加氧酶双亚基比例是指以大肠杆菌（E.coli BL21(DE3)）作为出发菌株，通过利用CRISPR/cas9同源重组整合二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因，构建5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸合成途径。本发明所述菌株能够提高重组大肠杆菌中5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸的产量至15.6 g/L，为工业化生产5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸奠定了基础。

Description

一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌
技术领域
本发明涉及一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，还涉及调节二甲苯单加氧酶双亚基比例提高5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，属于遗传工程技术领域。
背景技术
5-甲基吡嗪-2-羧酸（5-Methylpyrazine-2-carboxylic acid，MPCA）是用于合成格列吡嗪、阿昔莫司及5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯等药物的重要中间体以及作为金属配合物用于制备催化剂。目前其合成主要采用化学合成法，可分为分子间环合法、吡嗪侧链多步合成法、直接氧化法和电化学法。但化学合成法存在反应条件要求高，使用大量氧化剂，生产成本高，对环境污染较大的问题。生物转化法则具有合成工艺简单，底物选择性好，催化效率高，杂质少，对环境污染小的优点，极具发展前景。
国内浙江工业大学（郑裕国等,化学与生物工程,2012 ,29(9):19~25）筛选获得一株含二甲苯单加氧酶的恶臭假单胞菌，并利用该菌株进行5-甲基吡嗪-2-羧酸的生物制备，经过补料发酵产率可达到75.6%，产物浓度达到20.41g/L，周期达到了22天。专利CN106434434 B利用一株产二甲苯单加氧酶的Arthrobacter woluwensis HW-1菌株，经过补料转化产物浓度可以达到34.19g/L，产率81.4%，周期为15.5天。相对来说，产品的发酵周期较长，不利于工业化大量生产。国外则是利用恶臭假单胞菌Pseudomonas putida ATCC33015进行生产，但以上方法均需要在培养基中添加芳烃类物质，如甲苯，二甲苯等等，激活XylR蛋白，从而调节内源性质粒的上游途径的Pu启动子，从而诱导相关酶的表达，而该类物质通常具有毒性，对环境也不友好。
专利文献CN 107974428 A公开了一种利用重组大肠杆菌转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，该方法主要是以来源于Pseudomonas putida ATCC 33015所携带的内源性质粒pWWO为模板，构建重组质粒，利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的重组大肠杆菌表达二甲苯单加氧酶以及苯甲醇脱氢酶，然后全细胞转化底物2,5-二甲基吡嗪，产量为2.5g/L，摩尔转化率为96.2%。该法转化用时较短，且摩尔转化率高，但是该法产量相对较低，且重组质粒在工业生产上不稳定，还有IPTG、抗生素等造成的环境污染问题。
目前报道的MPCA的生物合成途径，是以2,5-二甲基吡嗪(2,5-Dimethylpyrazine，DMP) 为起始底物，由二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶、苯甲醛脱氢酶三步催化后，生成MPCA。
大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)遗传背景清晰，分子手段多样，是一种被广泛用作异源表达重要化学品合成途径的生产宿主。二甲苯单加氧酶作为第一步的关键酶，其表达对于反应过程尤为重要。因此可以整合代谢途径至大肠杆菌基因组，并提高二甲苯单加氧酶催化能力，从而提高5-甲基吡嗪-2-羧酸的产量。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是：构建一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，及用于生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法。目的是缩短反应时间，提高生产转化率和生产效率。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
一种产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌，其特征是将恶臭假单胞杆菌pseudomonas putidaATCC 33015中二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因克隆到大肠杆菌，同时调节二甲苯单加氧酶双亚基基因xylM和xylA在基因组的拷贝数比例。
本发明所述重组大肠杆菌，其中，二甲苯单加氧酶双亚基基因xylM与xylA在基因组的拷贝数比例范围为xylM：xylA=1-3:1-3。
本发明所述产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌，其中，所述的二甲苯单加氧酶基因如NCBI上Gene ID: 1218754和Gene ID: 1218743，苯甲醇脱氢酶基因如Gene ID:9121238所示，苯甲醛脱氢酶基因如Gene ID: 1218745所示。
本发明所述产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌，其中，利用CRISPR/cas9将二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因整合flhD位点。
本发明所述产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌，其中，利用CRISPR/cas9将二甲苯单加氧酶终端羟化酶基因（xylM）、电子传递蛋白基因（xylA）和二甲苯单加氧酶基因（xylM-xylA）整合至motA、cheW、cheY位点。
本发明所述产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌，其中，所述大肠杆菌为Escherichia coliBL21(DE3)。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建上述重组大肠杆菌的方法。
本发明所述重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
步骤1. 构建产5-甲基吡嗪-2-羧酸重组大肠杆菌：
先构建二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因整合框，通过同源重组将整合框代替大肠杆菌（Escherichia coli BL21(DE3)）基因组中鞭毛区基因flhD，得到产5-甲基吡嗪-2-羧酸重组大肠杆菌E. coli MPCA1。
所述产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌E. coli MPCA1，其中，二甲苯单加氧酶双亚基基因xylM与xylA拷贝数比例为1:1。
步骤2. 构建其他不同二甲苯单加氧酶双亚基基因xylM和xylA拷贝数比例的产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌。
其中，xylM：xylA=2：1与xylM：xylA=1：2重组大肠杆菌的制备：
在重组大肠杆菌E. coli MPCA1（xylM：xylA=1：1）的基础上，将xylM整合到鞭毛区基因motA位点，构建得到产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌E. coli MPCA2（xylM：xylA=2：1）。
其中，xylM：xylA=1：2产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌的制备：
在重组大肠杆菌E. coli MPCA1（xylM：xylA=1：1）的基础上，将xylA整合到鞭毛区基因motA位点，构建得到产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌E. coli MPCA3（M：A=1：2）。
其中，xylM：xylA=2：2重组大肠杆菌的制备：
在产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌E. coli MPCA1（xylM：xylA=1：1）的基础上，将xylM-xylA整合到motA位点，构建得到产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌E. coli MPCA4（xylM：xylA=2：2）。
其中，xylM：xylA =3：1产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌的制备：
在产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌E. coli MPCA2（xylM：xylA=2：1）的基础上，将xylM整合到鞭毛区基因cheW位点，构建得到产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌E. coliMPCA5（xylM：xylA=3：1）。
其中，xylM：xylA =1：3产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌的制备：
在产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌E. coli MPCA3（xylM：xylA=1：2）的基础上，将xylA整合到鞭毛区基因cheW位点，构建得到产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌E. coliMPCA6（xylM：xylA=1：3）。
其中，xylM：xylA =3：2产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌的制备：
在重组大肠杆菌E. coli MPCA5的基础上，将xylA整合到鞭毛区基因cheY位点，构建得到产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌E. coli MPCA7（xylM：xylA=3：2）。
其中，xylM：xylA=2：3产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌的制备：
在产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌E. coli MPCA6的基础上，将xylM整合到鞭毛区基因cheY位点，构建得到产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌E. coli MPCA8（xylM：xylA=2：3）。
其中，xylM：xylA =3：3重组大肠杆菌的制备：
在产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌E. coli MPCA4的基础上，将xylM-xylA整合到cheW位点，构建得到产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌E. coli MPCA9（xylM：xylA=3：3）。
产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌培养及发酵：
种子培养基（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母粉 5，氯化钠 10。
发酵培养基（g/L）：蛋白胨12 g/L，酵母提取物24 g/L，甘油4 g/L，磷酸氢二钾2.31g/L，三水磷酸氢二钾16.42g/L。
培养和催化条件：将37℃，220rpm下培养12h的产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌以1%的接种量转入发酵培养基于37℃，220rpm发酵12h，离心收集细胞在加入12g/L底物DMP的pH 8的缓冲液中进行催化36h。
5-甲基吡嗪-2-羧酸的测定方法：
Agilent 1200，UV检测器，C18柱(250×4.6mm，5μm)，流动相比例：水：三氟乙酸：乙腈=95.5：0.5:4，流速 0.8 mL/min，柱温25℃，进样体积为10μL。
有益效果：本发明构建的产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌，是将二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因整合至大肠杆菌的基因组中，同时优化调节了二甲苯单加氧酶双亚基基因xylM和xylA在基因组的拷贝数比例，提高了转化效率。提供的产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌可以催化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸，产物浓度至15.6g/L，摩尔转化率达到100%，催化用时仅36h，大大缩短了生物法生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的周期。
而且整个生产工艺中不使用二甲苯、IPTG和抗生素等有毒有害物质，更为环保。与目前公开的技术比较，是摩尔转化率最高、转化时效最高的生物制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法。
本发明提供的产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌构建方法简单，便于使用，无需诱导剂和抗生素，具有很好的工业化前景。
附图说明
图1为本发明中不同拷贝数比例菌株的构建示意图。
图2为本发明中不同拷贝数比例菌株产量的比较。
具体实施方式
实施例1. 构建产5-甲基吡嗪-2-羧酸重组大肠杆菌
根据NCBI上公布大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)的基因组序列设计flhD位点上下游同源臂扩增引物，左臂上下游引物分别为：
up-flhD-F:5’-CGTCTTTTTACTGCCCGGGATG-3’
up-flhD-R:5’-ATCTTAAGGGTCTGATCACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAAAGCAAATTCATACCGGCATCATGC-3’
右臂上下游引物分别为：
B-down-flhD-F:5’-CGGTACTCCGGATTGGTTGAGTGTTTCAGCAACTCGGAGGTATGC-3’
down-flhD-R:5’-CTGATTCTCCGCATTGAACAAGTGG-3’
运用上述引物从大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)基因组中扩增整合框所包含的左臂和右臂。
根据二甲苯单加氧酶基因Gene ID: 1218754和Gene ID: 1218743，苯甲醇脱氢酶基因Gene ID: 9121238，苯甲醛脱氢酶基因Gene ID: 1218745序列，设计整合框扩增基因簇引物，并通过引物引入Tac启动子，上下游引物为：
C-crispr-F:5’-TTAATCATCGGCTCGTATAATGTGATCAGACCCTTAAGATTAACTCACACAAGGAGATATACCATGCGGGAAACAAAAGAGCAGC-3’
B-crispr-flhD-R:5’- ACCTCCGAGTTGCTGAAACACTCAACCAATCCGGAGTACCGG-3’
通过融合PCR方法，将整合框左右臂及基因簇融合为整合框，通过测序确认整合框构建成功。同时根据flhD位点，设计sgRNA:5’-TATGCCGAGACGAAACATAG-3’，获得pTarget-flhD。
将pCas9转化至大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)，再将构建好的整合框及pTarget-flhD转化至包含pCas9的大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)中。通过卡那霉素及壮观霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认基因整合成功，得到重组大肠杆菌E. coli MPCA1。
实施例2 . 构建不同二甲苯单加氧酶双亚基基因xylM和xylA拷贝数比例的产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌
为了构建E. coli MPCA2（xylM：xylA=2：1）、E. coli MPCA3（xylM：xylA=1：2）和E. coli MPCA4（xylM：xylA=2：2）根据NCBI上公布大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)的基因组序列设计motA位点上下游同源臂扩增引物，左臂引物均一致，左臂上下游引物分别为：
up-motA-F:5’- CGATGTTCGGCTGCTTATTCACTTC-3’
up-motA-R:5’-ATCTTAAGGGTCTGATCACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAAACTTTCCTCGGCATTTTATTGGCTTAC-3’
E. coli MPCA2（xylM：xylA=2：1）的右臂引物为：
M-down-motA-F: 5’-GGTGGCTAGCATTTGAGATTTCGCCATCAACCGAT-3’
down-motA-R:5’- TTCCAGCTGCAACTGCTGC-3’
E. coli MPCA3（xylM：xylA=1：2）和E. coli MPCA4（xylM：xylA=2：2）的右臂引物为：
A-down-motA-F:5’-ATAATAGACCTCCTTGCTAGGATTTCGCCATCAACCGATAAAGCAG 3’
down-motA-R:5’- TTCCAGCTGCAACTGCTGC-3’
扩增目的基因的引物为：
E. coli MPCA2（xylM：xylA=2：1）:
M-crispr-F:5’-TTAATCATCGGCTCGTATAATGTGATCAGACCCTTAAGATTAACTCACACAAGGAGATATACCATGGACACGCT -3’
M-crispr-motA-R:5’-TTGATGGCGAAATCTCAAATGCTAGCCACCCG-3’
E. coli MPCA3（xylM：xylA=1：2）:
A-cripsr-F:5’-AATCATCGGCTCGTATAATGTGATCAGACCCTTAAGATTAACTCACACAAGGAGATATACCATGAATGAGTTTTTTAAGAAAATCTCTGG 3’
A-crispr-motA-R:5’-TATCGGTTGATGGCGAAATCCTAGCAAGGAGGTCTATTATAAAAACGGTCC-3’
E. coli MPCA4（xylM：xylA=2：2）:
M-crispr-F:5’-TTAATCATCGGCTCGTATAATGTGATCAGACCCTTAAGATTAACTCACACAAGGAGATATACCATGGACACGCT -3’
A-crispr-motA-R:5’-TATCGGTTGATGGCGAAATCCTAGCAAGGAGGTCTATTATAAAAACGGTCC-3’
通过融合PCR方法，将整合框左右臂及基因簇融合为整合框，通过测序确认整合框构建成功。同时根据motA位点，设计sgRNA: 5’-GCCGCAACAATACCAAACGC-3’，获得pTarget-motA。
将pCas9转化至大肠杆菌MPCA1，再将构建好的整合框及pTarget-motA转化至包含pCas9的大肠杆菌MPCA1中。通过卡那霉素及壮观霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认基因整合成功，得到产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌MAPC2，MPCA3，MPCA4。
为了构建E. coli MPCA5（xylM：xylA=3：1）、E. coli MPCA6（xylM：xylA=1：3）和E. coli MPCA9（xylM：xylA=3：3）根据NCBI上公布大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)的基因组序列设计cheW位点上下游同源臂扩增引物，左臂引物均一致，左臂上下游引物分别为：
up-cheW-F:5’- CATCAATATTACGACTGGTAGCG -3’
up-cheW-R:5’-ATCTTAAGGGTCTGATCACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAAACCGGATGTTGATTCTGGT-3’
E. coli MPCA5（xylM：xylA=3：1）的右臂引物为：
M-down-cheW-F:5’- TCGGGTGGCTAGCATTTGATGATCGTAGCCACGGATCT-3’
down-cheW-R:5’- TCATTCTGCCGCTGAATGC-3’
E. coli MPCA6（xylM：xylA=1：3）和E. coli MPCA9（xylM：xylA=3：3）的右臂引物：
A-down-cheW-F:5’- TAGACCTCCTTGCTAGTGATCGTAGCCACGGATCT -3’
down-cheW-R:5’- TCATTCTGCCGCTGAATGC-3’
扩增目的基因的引物为：
E. coli MPCA5（xylM：xylA=3：1）:
M-crispr-F:5’-TTAATCATCGGCTCGTATAATGTGATCAGACCCTTAAGATTAACTCACACAAGGAGATATACCATGGACACGCT -3’
M-crispr-cheW-R:5’- GGCTACGATCATCAAATGCTAGCCACCCGA -3’
E. coli MPCA6（xylM：xylA=1：3）:
A-cripsr-F:5’-AATCATCGGCTCGTATAATGTGATCAGACCCTTAAGATTAACTCACACAAGGAGATATACCATGAATGAGTTTTTTAAGAAAATCTCTGG 3’
A-cripsr-cheW-R:5’- CGTGGCTACGATCACTAGCAAGGAGGTCTATTATAAAAACG -3’
E. coli MPCA9（xylM：xylA=3：3）:
M-crispr-F:5’-TTAATCATCGGCTCGTATAATGTGATCAGACCCTTAAGATTAACTCACACAAGGAGATATACCATGGACACGCT -3’
A-cripsr-cheW-R:5’- CGTGGCTACGATCACTAGCAAGGAGGTCTATTATAAAAACG -3’
通过融合PCR方法，将整合框左右臂及基因簇融合为整合框，通过测序确认整合框构建成功。同时根据cheW位点，设计sgRNA: 5’-AGACGTGCTTTCATTGACGG-3’，获得pTarget-cheW。
将pCas9分别转化至大肠杆菌MAPC2，MPCA3，MPCA4，再将构建好的整合框及pTarget-cheW转化至包含pCas9的大肠杆菌MAPC2，MPCA3，MPCA4中。通过卡那霉素及壮观霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认基因整合成功，得到产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌MAPC5，MPCA6，MPCA9。
为了构建E. coli MPCA7（xylM：xylA=3：2）和E. coli MPCA8（xylM：xylA=2：3）根据NCBI上公布大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)的基因组序列设计cheY位点上下游同源臂扩增引物，左臂引物均一致，左臂上下游引物分别为：
up-cheY-F:5’- TCCAACAGCACCATCAGC -3’
up-cheY-R:5’-ATCTTAAGGGTCTGATCACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAAGGATGCGACTATGATGCAAC -3’
E. coli MPCA7（xylM：xylA=3：2）的右臂引物为：
A-down-cheY-F:5’- TAGACCTCCTTGCTAGCACTCCTGATTTAAATACGTATCGC -3’
down-cheY-R:5’- GGCACTGTTAATTACCCAGC -3’
E. coli MPCA8（xylM：xylA=2：3）的右臂引物为：
M-down-cheY-F:5’- CGGGTGGCTAGCATTTGACACTCCTGATTTAAATACGTATCGC -3’
down-cheY-R:5’- GGCACTGTTAATTACCCAGC -3’
扩增目的基因的引物为：
E. coli MPCA7（xylM：xylA=3：2）：
A-cripsr-F:5’-AATCATCGGCTCGTATAATGTGATCAGACCCTTAAGATTAACTCACACAAGGAGATATACCATGAATGAGTTTTTTAAGAAAATCTCTGG 3’
A-crispr-cheY-R:5’-CGTATTTAAATCAGGAGTGCTAGCAAGGAGGTCTATTATAAAAACG -3’
E. coli MPCA8（xylM：xylA=2：3）：
M-crispr-F:5’-TTAATCATCGGCTCGTATAATGTGATCAGACCCTTAAGATTAACTCACACAAGGAGATATACCATGGACACGCT -3’
M-crispr-cheY-R:5’-TTAAATCAGGAGTGTCAAATGCTAGCCACCCG-3’
通过融合PCR方法，将整合框左右臂及基因簇融合为整合框，通过测序确认整合框构建成功。同时根据cheY位点，设计sgRNA: 5’-TCTGCAGTCACCATTAACAC-3’，获得pTarget-cheY。
将pCas9分别转化至大肠杆菌MAPC5和MPCA6，再将构建好的整合框及pTarget-cheY转化至包含pCas9的大肠杆菌MAPC5和MPCA6中。通过卡那霉素及壮观霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认基因整合成功，得到产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌MAPC7和MPCA8。构建示意图如图1所示。
实施例3. 发酵重组大肠杆菌生产5-甲基吡嗪-2-羧酸
将获得的9株产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌 MPCA1-9，以种子培养基分别在37℃，220rpm下培养12h，然后以1%的接种量转入发酵培养基于37℃，220rpm发酵12h，离心收集细胞，再加入12g/L底物DMP的pH 8的缓冲液中进行催化36h。缓冲液的配方为：1.6 g/L二水磷酸二氢钠，67.8g/L十二水磷酸氢二钠。对上述构建的9株菌进行发酵产量比较，催化结束时，使用高效液相色谱测定发酵液中5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量，结果如图2所示。其中E. Coli MPCA8（xylM：xylA=2：3）的产量最高，可达到15.6g/L，摩尔转化率达到100%，相比初始菌株E. coliMPCA1（xylM：xylA=1：1）6.9g/L的产量，产量提高了2.26倍。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，其特征在于，将恶臭假单胞杆菌（pseudomonas putida）ATCC 33015中二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因克隆到大肠杆菌，同时调节二甲苯单加氧酶双亚基基因xylM与xylA在基因组的拷贝数比例为1:1～3:3，从而构建不同的产5-甲基吡嗪-2羧酸重组大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的二甲苯单加氧酶基因如NCBI上Gene ID: 1218754和Gene ID: 1218743，苯甲醇脱氢酶基因如Gene ID: 9121238所示，苯甲醛脱氢酶基因如Gene ID: 1218745所示。
3.根据权利要求1所述产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，其特征在于，利用CRISPR/cas9将二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因整合flhD位点。
4.根据权利要求1所述产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，其特征在于，利用CRISPR/cas9将二甲苯单加氧酶终端羟化酶基因（xylM）、电子传递蛋白基因（xylA）和二甲苯单加氧酶基因（xylM-xylA）整合至motA、cheW、cheY位点。
5.根据权利要求1-4任一所述产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为Escherichia coliBL21(DE3)。
6.权利要求1所述产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1 构建产5-甲基吡嗪-2-羧酸重组大肠杆菌：
先构建二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因整合框，通过同源重组将整合框代替大肠杆菌（Escherichia coli BL21(DE3)）基因组中鞭毛区基因flhD，得到产5-甲基吡嗪-2-羧酸重组大肠杆菌E. coli MPCA1，其中；xylM与xylA在基因组的拷贝数比例为1:1；
步骤2 构建不同二甲苯单加氧酶双亚基基因xylM和xylA拷贝数比例的重组大肠杆菌，xylM与xylA在基因组的拷贝数比例为1:1～3:3范围。
7.应用权利要求1-4任一所述产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌发酵生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于，将37℃，220rpm下培养12h的重组大肠杆菌以1%的接种量转入发酵培养基于37℃，220rpm发酵12h，离心收集细胞在加入12g/L底物DMP的pH 8的缓冲液中进行催化36h。
8.根据权利要求6所述产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤2为在重组大肠杆菌E. coli MPCA1的基础上，将xylM或xylA分别整合到鞭毛区基因motA位点，构建xylM：xylA=2:1的E. coli MPCA2或xylM：xylA=1:2的E. coli MPCA3，或；
在重组大肠杆菌E. coli MPCA1的基础上，将xylM-xylA整合到motA位点，构建xylM：xylA=2：2的E. coli MPCA4，或；
在E. coli MPCA2的基础上，将xylM整合到鞭毛区基因cheW位点，构建xylM：xylA=3：1的E. coli MPCA5，或；
在E. coli MPCA3的基础上，将xylA整合到鞭毛区基因cheW位点，构建xylM：xylA=1：3的E. coli MPCA6，或；
在E. coli MPCA5的基础上，将xylA整合到鞭毛区基因cheY位点，构建E. coli MPCA7（M：A=3：2），或；在E. coli MPCA6的基础上，将xylM整合到鞭毛区基因cheY位点，构建xylM：xylA=2：3的E. coli MPCA8，或；
在E. coli MPCA4的基础上，将xylM-xylA整合到cheW位点，构建xylM：xylA=3：3的E. coli MPCA9。
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