CN107974428A - 一种重组大肠杆菌及用于转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法 - Google Patents

一种重组大肠杆菌及用于转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107974428A
CN107974428A CN201711325652.2A CN201711325652A CN107974428A CN 107974428 A CN107974428 A CN 107974428A CN 201711325652 A CN201711325652 A CN 201711325652A CN 107974428 A CN107974428 A CN 107974428A
Authority
CN
China
Prior art keywords
methylpyrazine
gene
recombination bacillus
dehydrogenase
bacillus coli
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711325652.2A
Other languages
English (en)
Inventor
李广生
刘龙
顾刘燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Disha Pharmaceutical Group Co Ltd
Weihai Disu Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Jiangnan University
Disha Pharmaceutical Group Co Ltd
Weihai Disu Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University, Disha Pharmaceutical Group Co Ltd, Weihai Disu Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201711325652.2A priority Critical patent/CN107974428A/zh
Publication of CN107974428A publication Critical patent/CN107974428A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/0109—Aryl-alcohol dehydrogenase (1.1.1.90)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)

Abstract

本发明涉及一种涉重组大肠杆菌及其用于转化生产5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸的方法，属于发酵工程领域。本发明技术方案是：一株表达了来源于恶臭假单胞菌（pseudomonas putida）ATCC 33015所携带的内源性质粒pWWO上的二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因的大肠杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC NO.14930。本发明成功实现了p. putida中的二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶在大肠杆菌中的异源表达，并以此重组细胞进一步转化2,5‑二甲基吡嗪生产5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸。

Description

一种重组大肠杆菌及用于转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的 方法
技术领域
本发明涉及一种重组大肠杆菌及其用于转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，属于发酵工程领域。
背景技术
5-甲基吡嗪-2-羧酸(5-Methylpyrazine-2-carboxylic acid，MPCA)是一种米白色固体结晶，分子式为 C6H6N2O2，分子量为138.12，熔点166-169，℃是带有一个羧基和一个甲基的含氮杂环化合物。具有刺激性气味，当其暴露在空气中会被缓慢氧化，从棕色油状物变成棕黑色粘稠状固体，需要真空密封保存。是用于合成格列吡嗪、阿昔莫司及5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯等药物的重要中间体以及作为金属配合物用于制备催化剂。随着经济的发展，尤其是医药行业对其需求越来越大，因此采用人工提取的方法不能够满足需求。
5-甲基吡嗪-2-羧酸的化学合成主要有以下工艺(陈炳和等，化学试剂，2008，30(11)：869-870；董阳阳等，化学试剂，2013，35(6)：505-509)：
(1)分子间环合法。以丙酮醛和二氨基马来腈为基本原料，在水、乙醇和乙酸体系中，两者环合得到2,3- 二氰基-5-甲基吡嗪，然后在硫酸催化下氰基水解、脱羧得到目标化合物2-甲基吡嗪-5-羧酸；或是在催化剂焦亚硫酸钠的存在下，以丙酮醛和邻苯二胺为基本原料环合得到2-甲基苯并吡嗪，然后用高锰酸钾氧化得到5- 甲基吡嗪-2,3-羧酸钾，再用硫酸进行酸化和脱羧得到目标化合物2-甲基吡嗪-5-羧酸。前者工艺路线简单，转化率较高，但是原料剧毒，工艺条件苛刻，未见工业化，后者原料易得，但是工艺合成路线较长，生产效率低，产品成本高。
(2)吡嗪侧链多步合成法。以2,5-二甲基吡嗪为基本原料，合成路线分为：氯化、酰化、水解、氧化或者氧化、酰化、水解、氧化，较长的合成路线制约目标产物的收率，过程中有部分中间体易被氧化，使其工业化生产条件更为苛刻。
(3)直接氧化法。以2,5-二甲基吡嗪为基本原料，把高锰酸钾溶于90℃的热水，然后缓慢滴加到2,5-二甲基吡嗪体系中，得到5-甲基吡嗪-2-羧酸的钾盐。最后，在0-5℃的冰水浴中，用浓盐酸酸析至pH值约为2.0，过滤得到目标化合物，粗产物收率40.08％。气相催化氧化法，则是将经氧化银改性的钒-钼氧化物为催化剂，气相催化氧化2,5-二甲基吡嗪为5-甲基吡嗪-2-羧酸和吡嗪-2,5-二羧酸。催化剂选择性较差，产生大量副产物，生产效率下降，成本增加。
目前5-甲基吡嗪-2-羧酸的合成以上面的化学合成法为主。还存在着电化学合成法，它一般先采用化学合成法中的吡嗪侧链多步合成法得到一系列2,5-二甲基吡嗪的R基取代物，然后再电解氧化得到目标化合物。但是这些化学方法，需要高温高压，反应条件要求高，使用大量氧化剂，生产成本高，对环境污染较大。
生物转化法制备5-甲基吡嗪-2-羧酸，合成工艺简单，底物选择性好，催化效率高，杂质少，对环境污染小，是一条比较有前景的发展路线。国内主要是利用从土壤中筛选获得的菌株生物发酵进行生产，浙江工业大学(郑裕国等，化学与生物工程，2012，29(9)：19-25)筛选获得一株含二甲苯单加氧酶的恶臭假单胞菌ZJB-LLJ，李广生等人在土壤中筛选出一新菌株HW-1。国外则是利用一株名为ATCC 33015的恶臭假单胞菌发酵生产， Hoeks和Kiener等人分别报道了用该菌株来制备5-甲基吡嗪-2-羧酸。
发明内容
发明目的：克服目前制备5-甲基吡嗪-2-羧酸方法上的不足，通过构建一株基因工程菌，使转化过程中的关键酶得到表达，进而通过全细胞转化2,5-二甲基吡嗪生产5-甲基吡嗪-2-羧酸。
本发明技术方案是：
本发明的技术方案是构建了一株以2,5-二甲基吡嗪为底物转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的基因工程菌，表达了来源于恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)ATCC 33015的二甲苯单加氧酶编码基因xylM和xylA，苯甲醇脱氢酶编码基因xylB和苯甲醛脱氢酶基因xylC。其菌种保藏编号为：CGMCC NO.14930，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2017年11月20日。本发明生物材料的分类命名的拉丁文名称为：Escherichiecoli。
所述二甲苯单加氧酶编码(来源于恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)ATCC33015所携带的内源性质粒 pWWO上的二甲苯单加氧酶)基因序列如NCBI-Gene ID:1218754和NCBI-Gene ID:1218743所示，苯甲醇脱氢酶编码基因序列如NCBI-Gene ID:9121238所示，苯甲醛脱氢酶编码基因序列如NCBI-Gene ID:1218745所示。
所述的基因工程菌是以E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET28a(+)为表达载体。
所述的基因工程菌的构建方法是以p.putida ATCC 33015所携带的内源性质粒pWWO为模板，PCR 扩增获得带有二甲苯单加氧酶编码基因xylM和xylA，苯甲醇脱氢酶编码基因xylB和苯甲醛脱氢酶基因xylC 的基因簇，连接到表达载体pET28a(+)上，将重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中，筛选得到阳性转化子。
应用所述基因工程菌全细胞转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法：过夜培养的种子液按照1％的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养至OD600＝0.6，添加终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)， 37℃诱导10h，收集细胞，以OD600＝50的细胞，使用pH 8.0的磷酸盐缓冲液为反应介质，2g/L底物2,5- 二甲基吡嗪，在28℃条件下，转化28h。
所述的种子培养基(/L)：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 1g，蒸馏水定容。
所述的发酵培养基(/L)：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，各组分溶解于培养基体积9/10的水后高压灭菌，冷却到60℃，再加培养基体积1/10灭过菌的含有17mmol/LKH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液。
本发明的有益效果：本发明成功实现了p.putida中的二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶在大肠杆菌中的异源表达，并以此重组细胞进一步转化2,5-二甲基吡嗪生产5-甲基吡嗪-2-羧酸。与现有的方法相比，本发明首次通过基因工程菌全细胞转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸，反应条件温和，对环境污染小，底物选择性高，反应速率快，本技术发明有利于解决化学合成法中污染严重，成本高及先前生物转化法需要利用有毒的二甲苯诱导的问题，其工艺简单，易于推广。
附图说明
图1为重组质粒的构建图。
图2为转化液HPLC检测图谱。
图3为转化液LC-MS检测图谱。
具体实施方式
材料与方法
种子培养基(/L)：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 1g，蒸馏水定容。
发酵培养基(/L)：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，各组分溶解于900mL的水后，进行高压
灭菌，冷却到60℃，再加100mL灭过菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液。
样品制备：取1mL的转化液，在14,000rpm下离心10min，取上清液进行稀释后，再经过0.45μm滤膜过滤，滤液供HPLC及LC-MS分析。
5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量测定：Agilent 1200高效液相色谱仪(配紫外可见检测器)，采用Agilent ZORBAX Eclipse plus C18(250×4.6mm，5μm)，水：乙腈：三氟乙酸＝97：3：0.25(v/v)，柱温25℃，流速1mL/min，在紫外检测波长为277nm下检测。
实施例1重组质粒的构建
根据NCBI上公布的恶臭假单胞菌(p.putida ATCC 33105，购自日本微生物菌种保藏中心，编号JCM 6156)的内源性质粒pWWO序列(NCBI accession NC_003350.1)。设计引物，扩增pWWO上的基因簇。以5'CATGCCATGGGCATGCGGGAAACAAAAGAGCAG 3'为正向引物， 5'ATAAGAATGCGGCCGCTCAACCAATCCGGAGTACCG 3'为反向引物(划线部分分别为NcoI和NotI酶切位点)，扩增获得目的基因。PCR产物经过纯化、酶切后，与载体pET28a(+)连接，构建重组质粒 pET28a(+)-pWWO基因簇(如图1)。
实施例2重组大肠杆菌的构建
将实施例1重组质粒pET28a(+)-pWWO基因簇转化至克隆宿主E.coli JM109，挑取在卡那霉素抗性的LB 平板上生长的单菌落，PCR扩增，挑选阳性转化子提取质粒，双酶切验证，条带正确的进行测序，序列正确的转化表达宿主E.coli BL21(DE3)。
实施例3全细胞转化2,5-二甲基吡嗪生产5-甲基吡嗪-2-羧酸
将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)从平板上挑取单菌落，接种到种子培养基中，将37℃、220rpm下培养 12h的种子液以1％(v/v)的接种量接种到50mL发酵培养基，于37℃、220rpm条件下培养至至OD600＝0.6，添加终浓度为0.5mM的IPTG，37℃诱导10h，离心收集菌体进行全细胞催化，以OD600＝50的细胞，使用 pH 8.0的磷酸盐缓冲液为反应介质，2g/L底物2,5-二甲基吡嗪，在28℃条件下，转化28h，产量达到2.5g/L，摩尔转化率达到96.2％。
序列表
<110> 迪沙药业集团有限公司江南大学威海迪素制药有限公司
<120> 一种重组大肠杆菌及用于转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法
<130> 3
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5099
<212> DNA
<213> p. putida ATCC 33015
<400> 1
atgcgggaaa caaaagagca gcctatctgg tacgggaagg tgtttagttc taattgggta 60
gaggcgcggg gaggtgttgc caatgttgtc gatccgtcca atggagacat tcttggcatt 120
acgggtgttg ctaacggcga agatgtcgat gctgctgtga acgcagctaa gagagcgcaa 180
aaggaatggg ccgcaatacc atttagtgaa agagccgcca ttgtccgcaa ggctgccgaa 240
aaactaaagg agcgcgagta tgaattcgcc gattggaacg tacgggaatg cggcgcaatt 300
cgtccgaagg gcttatggga ggccggaatt gcgtatgagc aaatgcatca agctgcgggt 360
ctagcttctt tgcctaacgg tacattgttt ccatcggcag ttccagggcg catgaatctt 420
tgtcagcgcg ttccagttgg cgtggtcggc gtaattgcac cttggaattt cccgttgttt 480
ctagcaatgc gttcggtagc accagcctta gcgttgggta atgcggtgat cttaaagccc 540
gaccttcaga ctgctgtcac cgggggggcg ctcattgccg aaatcttttc cgacgctggc 600
atgccggacg gtgttcttca cgttcttcct ggtggagcgg acgtaggaga gtcaatggtt 660
gcgaactccg gaattaacat gatttctttt accgggtcca cacaggtggg ccggttgatc 720
ggagagaaat gcgggagaat gctgaaaaag gttgcgcttg aactgggtgg taataatgtc 780
cacatcgtgt tgcctgacgc cgatttagaa ggggctgtca gctgcgctgc ttggggtacg 840
tttttgcatc agggccaagt gtgcatggcc gccggacgtc atttagtaca tagggacgtt 900
gctcagcaat atgcagagaa actggcgcta cgtgccaaga acttagtggt gggggatcca 960
aactcggatc aagtgcatct cggcccgctt atcaatgaga aacaggtagt tcgcgtccac 1020
gcgctcgttg aatctgcgca aagggccggt gctcaggttt tggcgggagg tacgtatcaa 1080
gatcgctact accaagctac cgtaatcatg gatgtgaagc cggagatgga ggttttcaaa 1140
tctgaaattt tcggcccggt ggctccgatc actgtatttg acagtattga agaggcgatt 1200
gaattggcaa actgttcgga gtatgggttg gccgcatcta tccatactag ggcgttggcg 1260
actggtctag acatcgcaaa gcgtctaaat accggtatgg tccatattaa tgaccagcca 1320
attaactgtg agccgcatgt tcccttcgga ggaatgggtg cctcgggtag cggaggccgg 1380
tttggcggac ctgcaagtat tgaagaattt actcaatctc aatggattag tatggttgag 1440
aagccagcta attacccatt ttgagtcgac aataataaag taggtggata tatggacacg 1500
cttcgttatt acctgattcc tgttgttact gcttgcgggc tgatcggatt ttactatggt 1560
ggctattggg tttggcttgg ggcggcaaca ttccctgcac tgatggtgct tgatgtcatt 1620
ttaccgaagg atttttcggc cagaaaggta agtccctttt tcgcagacct tacccagtat 1680
ttgcagttac cattaatgat cggtctatat gggctccttg tcttcggagt tgaaaacggg 1740
cgtatcgaac ttagtgagcc gttacaagtg gcagggtgca ttctttcttt ggcttggctt 1800
agtggtgtgc caactcttcc ggtttcgcat gagttgatgc atcgtcgcca ctggttgcct 1860
cggaaaatgg cgcagctatt ggctatgttt tatggtgatc cgaaccgaga cattgcccat 1920
gtcaacacgc atcaccttta cttagatacg cctctcgata gcgatactcc gtaccgtggt 1980
cagacaattt acagtttcgt gatcagtgcg acagttggtt ccgtcaaaga tgcgataaag 2040
attgaggctg aaactttacg tagaaaagga cagtcaccgt ggaatttgtc caacaaaaca 2100
tatcaatatg tcgcacttct gctcgctctg cctggcttgg tttcttatct gggcgggcca 2160
gcattagggt tggttacgat tgcttcgatg attattgcga aagggatagt cgagggtttt 2220
aattactttc agcactatgg tttagtacgc gatttagatc agcctatcct cctgcaccac 2280
gcgtggaatc atatgggaac aattgtgcgc ccgctgggtt gcgaaattac taaccatatc 2340
aatcatcata ttgacggcta tacacggttc tatgagttgc gtccggaaaa agaagccccg 2400
cagatgcctt cgctctttgt gtgtttcctt ctagggctta ttccgcctct ttggttcgct 2460
ctcattgcaa aaccaaagtt gagagactgg gaccagcggt acgcaactcc aggtgagcgc 2520
gaactggcta tggctgcaaa taaaaaagcg ggatggccac tgtggtgtga aagtgaactg 2580
ggtcgggtgg ctagcatttg ataatacagg cagtctaaac cgtttcgact gagaccgtag 2640
ataagcgaag agcgaacgaa ctctacggtc tctttttgaa aaaaacgttc caaatgggac 2700
aaagtttccg ttttttctaa ttaacgggcg tctaactgag cgatgggttt atgaatgagt 2760
tttttaagaa aatctctggt ttatttgtgc cgcctccgga atctaccgtt tcagtcagag 2820
ggcaggggtt tcagtttaag gtgccacgcg ggcaaaccat tctggaaagc gctctgcatc 2880
aaggaattgc ctttccgcat gattgcaaag tcggatcttg tgggacatgt aaatataaac 2940
tgatatctgg cagggtcaat gagttgacct cttctgctat gggtctgagt ggcgatctgt 3000
atcagtccgg ctatcgtttg ggttgtcaat gcataccaaa agaagatctc gagatagagc 3060
tagacacagt gctcgggcag gcgttagttc caatagaaac gagtgccttg attagtaagc 3120
agaaacggct ggcgcacgat atagtcgaga tggaagtagt gcccgataag cagatagcct 3180
tctaccccgg ccagtatgca gatgtagaat gtgcagaatg ctctgctgta aggagttatt 3240
ctttttccgc tccgccccaa cctgacggct ccctgagctt ccatgttcgc cttgtcccag 3300
gtggagtttt cagtggttgg ctatttggtg gcgatcgtac aggagcgaca ctaaccctgc 3360
gagcgcctta tggacagttc gggctccatg agagcaatgc cacgatggtc tgcgtagccg 3420
gcggaacggg gcttgctcca attaaatgtg ttttgcagag catgacccag gcccagcgag 3480
agcgtgatgt gttgttgttc tttggagctc gtcaacaacg tgacctatat tgcctcgacg 3540
aaatagaagc gctgcaactc gattggggtg ggcgcttcga gcttattcca gttttgtccg 3600
aagagtcttc tacgtcgtca tggaaaggga aacgtggcat ggtaaccgag tattttaagg 3660
agtacctcac tgggcagcct tatgaaggat acctttgcgg gccgccccct atggtggacg 3720
ctgccgagac cgagctcgtt cgacttggtg ttgcgcggga attagtgttt gcggaccgtt 3780
tttataatag acctccttgc tagcagtagc agaagcttac aagtttaact gtggttcgat 3840
gcatagtcta gcttacggta ttcgagctaa tcggtgagtt aatgattgga atcgtcttgc 3900
ggccaaaaat tgatggcagt gagataaata ggttgttgtc caaaaggttg gtaaagatcg 3960
gtttataact ttagtctaaa ataaagaggg agatggaaat ggaaatcaaa gcagcaatag 4020
ttcgccaaaa aaatggcccg ttcttacttg agcatgtagc tcttaatgag ccagctgaag 4080
atcaggttct cgttagattg gttgcaaccg ggctgtgtca tacggatctg gtttgtcgcg 4140
atcagcatta tccggttcca ctaccgatgg tatttgggca tgaaggggct ggtgtggttg 4200
agcgggttgg gtccgcggtc aaaaaggttc agccgggcga ccatgttgtt ttgacatttt 4260
atacctgcgg gagttgtgat gcttgtcttt ccggagaccc taccagttgt gcaaactcat 4320
ttggccctaa ctttatgggg cgctcggtaa ccggggagtg caccatccac gatcaccaag 4380
gggcagaggt gggagcaagc ttttttgggc agtcctcctt tgcgacatat gcgctatctt 4440
atgaacgtaa cactgtgaag gttacaaaag acgtaccgct tgagttgctt gggcctcttg 4500
gttgtggcat tcaaactggc gcagggtctg ttctgaatgc gcttaatccg ccagcgggtt 4560
ctgctatcgc aatttttggt gctggggcag ttggtctttc ggccgtgatg gctgccgttg 4620
tagcaggttg taccaccatc atcgctgtcg acgttaagga aaaccggctg gaactagcca 4680
gtgaacttgg ggcgacgcac attattaacc cggccgctaa cgatcccatt gaggcgatca 4740
aagagatatt cgctgacggt gttccgtatg tattggagac tagcggtttg cccgccgtgc 4800
ttacgcaggc gatcctcagc tctgctatag gcggtgagat cggtattgta ggggcgccac 4860
ctatgggggc cacggtgccc gttgacatta acttcctgct attcaatcgt aagcttcgtg 4920
gaatcgttga gggtcagtcg atctcggata ttttcattcc caggctggtg gagctttatc 4980
gccaggggaa gtttccgttt gacaagctga ttaagtttta tccttttgat gaaatcaatc 5040
gagccgccga agattcggaa aaaggcgtga cgcttaagcc ggtactccgg attggttga 5099

Claims (7)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，一株表达了来源于恶臭假单胞菌（pseudomonas putida）ATCC 33015所携带的内源性质粒pWWO上的二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因的大肠杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC NO. 14930。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，来源于恶臭假单胞菌（pseudomonas putida）ATCC 33015所携带的内源性质粒pWWO上的二甲苯单加氧酶的基因xylM和xylA，序列分别如NCBI-Gene ID: 1218754和NCBI-Gene ID: 1218743所示；苯甲醇脱氢酶的基因xylB序列如NCBI-Gene ID: 9121238所示，苯甲醛脱氢酶的基因xylC序列如NCBI-Gene ID: 1218745所示。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌是以E.coliBL21(DE3)为宿主，以pET28a(+)为表达载体。
4.一种构建权利要求1所述的重组大肠杆菌的方法，其特征在于，是以恶臭假单胞菌所携带的内源性质粒为模板，PCR扩增获得二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因簇，酶切连接到表达载体pET28a(+)中，将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)中，筛选获得阳性转化子。
5.一种应用权利要求1所述重组大肠杆菌转化2,5-二甲基吡嗪生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于，首先培养制备游离的活性细胞，再利用所得活性细胞进行全细胞催化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸。
6.根据权利要求5所述重组大肠杆菌转化2,5-二甲基吡嗪生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于，将过夜培养的种子液按照1%的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养至OD600=0.6，添加终浓度为0.5mM的IPTG，37 ℃诱导10 h，收集细胞，以OD600=50的细胞，2 g/L底物2,5-二甲基吡嗪，在28 ℃条件下，转化28 h。
7.根据权利要求6所述重组大肠杆菌转化2,5-二甲基吡嗪生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为蛋白胨12 g/L，酵母提取物24 g/L，甘油4 mL/L，各组分溶解于培养基体积9/10的水后高压灭菌，冷却到60 ℃，再加入培养基体积1/10灭过菌的含有17 mmol/L KH2PO4和72 mmol/L K2HPO4的溶液。
CN201711325652.2A 2017-12-13 2017-12-13 一种重组大肠杆菌及用于转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法 Pending CN107974428A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711325652.2A CN107974428A (zh) 2017-12-13 2017-12-13 一种重组大肠杆菌及用于转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711325652.2A CN107974428A (zh) 2017-12-13 2017-12-13 一种重组大肠杆菌及用于转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107974428A true CN107974428A (zh) 2018-05-01

Family

ID=62010006

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711325652.2A Pending CN107974428A (zh) 2017-12-13 2017-12-13 一种重组大肠杆菌及用于转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107974428A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753673A (zh) * 2018-06-14 2018-11-06 迪沙药业集团有限公司 一种重组恶臭假单胞菌及应用
CN108753862A (zh) * 2018-06-27 2018-11-06 泰州市惠利生物科技有限公司 一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法
CN110527656A (zh) * 2019-09-04 2019-12-03 江南大学 高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌及其构建方法及应用
CN110684705A (zh) * 2019-10-31 2020-01-14 迪嘉药业集团有限公司 一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌
CN113897322A (zh) * 2021-06-29 2022-01-07 迪嘉药业集团有限公司 一种3-甲基-4-硝基苯甲酸的工程菌及其制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5217884A (en) * 1990-09-24 1993-06-08 Lonza Ltd. Hydroxylation of methyl groups in aromatic heterocycles by microorganisms
CN1415018A (zh) * 1999-10-27 2003-04-30 Basf公司 制备芳香醛和/或羧酸的微生物方法
CN102533599A (zh) * 2011-12-29 2012-07-04 浙江工业大学 一株产二甲苯单加氧酶的恶臭假单胞菌及其应用
CN106434434A (zh) * 2016-09-12 2017-02-22 迪沙药业集团有限公司 一株产二甲苯单加氧酶的菌株Arthrobacter woluwensis及其应用
CN107312806A (zh) * 2017-08-01 2017-11-03 中国科学院微生物研究所 一种酶法生产5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5217884A (en) * 1990-09-24 1993-06-08 Lonza Ltd. Hydroxylation of methyl groups in aromatic heterocycles by microorganisms
CN1415018A (zh) * 1999-10-27 2003-04-30 Basf公司 制备芳香醛和/或羧酸的微生物方法
CN102533599A (zh) * 2011-12-29 2012-07-04 浙江工业大学 一株产二甲苯单加氧酶的恶臭假单胞菌及其应用
CN106434434A (zh) * 2016-09-12 2017-02-22 迪沙药业集团有限公司 一株产二甲苯单加氧酶的菌株Arthrobacter woluwensis及其应用
CN107312806A (zh) * 2017-08-01 2017-11-03 中国科学院微生物研究所 一种酶法生产5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. SCHMID ET AL.: "Industrial biocatalysis today and tomorrow", 《NATURE》 *
BRUNO BUHLER ET AL.: "Xylene Monooxygenase Catalyzes the Multistep Oxygenation of Toluene and Pseudocumene to Corresponding Alcohols,Aldehydes, and Acids in Escherichia coli JM101*", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753673A (zh) * 2018-06-14 2018-11-06 迪沙药业集团有限公司 一种重组恶臭假单胞菌及应用
CN108753862A (zh) * 2018-06-27 2018-11-06 泰州市惠利生物科技有限公司 一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法
CN110527656A (zh) * 2019-09-04 2019-12-03 江南大学 高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌及其构建方法及应用
CN110527656B (zh) * 2019-09-04 2021-07-20 江南大学 高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌及其构建方法及应用
CN110684705A (zh) * 2019-10-31 2020-01-14 迪嘉药业集团有限公司 一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌
CN110684705B (zh) * 2019-10-31 2022-02-08 迪嘉药业集团有限公司 一种产5-甲基吡嗪-2羧酸的重组大肠杆菌
CN113897322A (zh) * 2021-06-29 2022-01-07 迪嘉药业集团有限公司 一种3-甲基-4-硝基苯甲酸的工程菌及其制备方法
CN113897322B (zh) * 2021-06-29 2023-01-17 迪嘉药业集团股份有限公司 一种3-甲基-4-硝基苯甲酸的工程菌及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107974428A (zh) 一种重组大肠杆菌及用于转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法
Guarnieri et al. Conversion and assimilation of furfural and 5-(hydroxymethyl) furfural by Pseudomonas putida KT2440
Asada et al. Hydrogen production by co-cultures of Lactobacillus and a photosynthetic bacterium, Rhodobacter sphaeroides RV
Rajagopalan et al. Formation of ethanol from carbon monoxide via a new microbial catalyst
Sun et al. Efficient production of lactic acid from sugarcane molasses by a newly microbial consortium CEE-DL15
Yang et al. Fermentation of 1, 3-propanediol by a lactate deficient mutant of Klebsiella oxytoca under microaerobic conditions
Trchounian et al. Hydrogen production from glycerol by Escherichia coli and other bacteria: an overview and perspectives
Hu et al. An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol
Arslan et al. Solventogenesis in Clostridium aceticum producing high concentrations of ethanol from syngas
Liu et al. Efficient production of dihydroxyacetone from biodiesel-derived crude glycerol by newly isolated Gluconobacter frateurii
Sargsyan et al. Novel approach of ethanol waste utilization: biohydrogen production by mixed cultures of dark-and photo-fermentative bacteria using distillers grains
Orozco et al. Towards an integrated system for bio-energy: hydrogen production by Escherichia coli and use of palladium-coated waste cells for electricity generation in a fuel cell
Liang et al. Repetitive succinic acid production from lignocellulose hydrolysates by enhancement of ATP supply in metabolically engineered Escherichia coli
CN107254429B (zh) 一种高产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌及其应用方法
Rui et al. High-efficiency and low-cost production of cadaverine from a permeabilized-cell bioconversion by a Lysine-induced engineered Escherichia coli
Sree et al. High alcohol production by repeated batch fermentation using an immobilized osmotolerant Saccharomyces cerevisiae
Wang et al. Developing E. coli-E. coli co-cultures to overcome barriers of heterologous tryptamine biosynthesis
Suo et al. Enhanced butyric acid production in Clostridium tyrobutyricum by overexpression of rate-limiting enzymes in the Embden-Meyerhof-Parnas pathway
Mirzoyan et al. Evidence for hydrogenase-4 catalyzed biohydrogen production in Escherichia coli
Wu et al. A comparison of hydrogen production among three photosynthetic bacterial strains
CN106434434B (zh) 一株产二甲苯单加氧酶的菌株Arthrobacter woluwensis及其应用
Subudhi et al. Impact of regulated pH on proto scale hydrogen production from xylose by an alkaline tolerant novel bacterial strain, Enterobacter cloacae DT-1
Amulya et al. Augmenting succinic acid production by bioelectrochemical synthesis: Influence of applied potential and CO2 availability
Kobayashi et al. Efficient hydrogen production from acetate through isolated Rhodobacter sphaeroides
CN102099477A (zh) 产脱氧紫色杆菌素的重组菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180501

RJ01 Rejection of invention patent application after publication