CN108753862A - 一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法 - Google Patents

一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸的方法，本发明的技术方案如下：以重组大肠杆菌作为出发菌株发酵制备5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸，在发酵过程中，需要进行连续补料，与此同时，生成的产物5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸通过0.45μm滤膜移出发酵罐，而大肠杆菌被滤膜截留在发酵罐中继续进行发酵制备产物，发酵结束之后，发酵液先后通过超滤浓缩、阳离子交换树脂进行分离纯化，随后利用有机溶剂萃取可获得总收率在90％以上，纯度在99.5％以上的5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸白色固体。该方法工艺简单，无需使用有毒溶剂或诱导剂，成本低廉，产品纯度高、产量高，适合工业化生产。

Description

一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的 方法
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，具体是一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法。
背景技术
5-甲基吡嗪-2-羧酸是药品格列吡嗪、乐脂平以及降血脂药阿昔莫司的关键中间体，在市场上越来越受关注。生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法主要是化学合成法和生物合成法，大多数生产厂家采用化学合成法，它是利用高锰酸钾或者过氧化氢氧化2,5-二甲基吡嗪来制备5-甲基吡嗪-2-羧酸，但该方法生产收率低，且污染较严重。目前，国内生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的生物合成方法还停留在研究阶段，仅有少量的文献公开了利用微生物合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法。
专利文献CN 102533599 B公开了一种利用恶臭假单胞菌生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其步骤如下：(1)利用二甲苯蒸汽作为唯一的碳源和能源来培养恶臭假单胞菌产酶，获得含酶菌体细胞；(2)以2,5-二甲基吡嗪为底物，在28-32℃、pH为 7.0-8.0下进行转化反应24-48h，即可获得5-甲基吡嗪-2-羧酸，按照此方法，可在摇瓶中积累产物的质量浓度为1.4g/L，产率为40％。
专利文献CN 107541532 A公开了一种Arthrobacter woluwensis HW-1菌株作为催化剂发酵转化获得5-甲基吡嗪-2- 羧酸的发酵液的方法，其步骤如下：(1)制备种子液；(2) 种子液以1-8％的接种量接到10L发酵罐中，通过压缩空气带入二甲苯蒸汽，在搅拌转速为200-650rpm、温度为20-40℃、pH 为6.0-8.0下培养4-10h，加入原料2,5-二甲基吡嗪；(3)用离心机去除菌体后，加入乙醇除去蛋白质，随后浓缩到质量浓度为100-300mg/L的产物溶液作为析晶母液，加入浓盐酸调节pH 为0.5-3.0，析晶0-6h，打浆后烘干，即可得5-甲基吡嗪-2-羧酸固体，按照此种方法制备5-甲基吡嗪-2-羧酸，生物摩尔转化率为87.2％，产物积累浓度为30.1g/L。
专利文献CN 107974428 A公开了一种利用重组大肠杆菌转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，该方法主要利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的重组大肠杆菌表达二甲苯单加氧酶以及苯甲醇脱氢酶，然后全细胞转化底物2,5-二甲基吡嗪，产量为2.5g/L，摩尔转化率为96.2％。
以现有的生物合成方法来看，需要以二甲苯这一有毒溶剂作为碳源，或者需要异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导，并且还无法做到连续化生产，生产时间较长，同时这些方法收率低，能耗较大，成本较高，限制了其工业化的应用。因此，研究新型的无污染的、可连续生产的、能耗小、成本低、产率较高、提取纯度较高的5-甲基吡嗪-2-羧酸生物制备方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，以解决现有技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，该方法包括以下步骤：
(1)种子液制备：种子液制备用培养基包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖5-20g/L、硫酸铵1-10g/L、磷酸二氢钾 2-30g/L、硫酸镁0.1-5g/L和水，水为溶剂，种子液制备用培养基的pH为6.0-7.0，将大肠杆菌接种到种子液制备用培养基中，培养方法为：温度为20-37℃、搅拌转速为50-250rpm；
(2)上罐发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸：发酵用培养基包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖10-30g/L、硫酸铵3-30g/L、磷酸二氢钾1-20g/L、硫酸镁0.1-5g/L、硫酸锌0.5-5g/L、硫酸铜0.01-0.5g/L、硫酸锰0.5-5g/L、氯化钴0.1-2g/L、亚硒酸钠 0.01-1g/L、维生素B1 0.005-0.5g/L、维生素B2 0.005-0.1g/L、维生素B6 0.005-0.3g/L和水，水为溶剂，发酵用培养基的pH 为6.0-7.0，将步骤(1)所制得的种子液接种到发酵用培养基中，接种量为1-4％，发酵罐装液量为发酵罐容积的60-75％，培养方法为：温度为25-37℃，搅拌转速为180-600rpm，发酵开始1-3h 后进行连续补料，补料速度为10ml/min，直至发酵结束，补料溶液总量为培养基总体积的10-30％，补料4-6h后，发酵液通过 0.45μm滤膜连续移出发酵罐，移出速度为5ml/min，直至发酵结束，此过程持续6-12h，此过程结束后，发酵罐中剩余的发酵液通过离心机去除菌体，离心机的转速为3000-9000rpm，随后合并上述过程中所有的发酵液，利用高效液相色谱法检测发酵液中5-甲基吡嗪-2-羧酸的浓度为10-42g/L；
(3)超滤浓缩：将步骤(2)合并后的发酵液进行超滤浓缩，所选用的超滤膜分子量大小为1000-5000Da，收集超滤膜透过液，超滤浓缩的收率为98-100％；
(4)阳离子交换树脂分离纯化：采用阳离子交换树脂从步骤(3)中得到的超滤液中分离出含有5-甲基吡嗪-2-羧酸的料液，料液吸附速率为0.05-0.5wt％/min、吸附温度为20-40℃，等料液吸附完毕后，用纯水洗去未吸附物，然后用50％的浓硫酸或浓盐酸将料液从阳离子交换树脂中洗脱下来，料液洗脱速率为 0.05-0.5wt％/min、洗脱温度为20-40℃，本步骤的收率为98-99％；
(5)萃取、浓缩和固体烘干过程：用萃取剂萃取步骤(4) 所得的洗脱液中的5-甲基吡嗪-2-羧酸，萃取方法为：萃取温度为20-30℃，萃取次数为2-5次，萃取剂的用量为洗脱液质量的 0.5-3倍，萃取结束后，将含有5-甲基吡嗪-2-羧酸的萃取剂在 77℃下进行蒸馏，除去萃取剂，析出的固体放入鼓风干燥箱中烘干即得5-甲基吡嗪-2-羧酸固体，利用高效液相色谱法检测5- 甲基吡嗪-2-羧酸固体的纯度为99.5-100％，整个制备过程的总收率为90-96％。
步骤(2)中的补料溶液包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖50-200g/L、2,5-二甲基吡嗪50-200g/L、阿拉伯糖1-10g/L 和山梨糖醇0.5-10g/L。
作为优化，步骤(4)中的阳离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂或弱酸性阳离子交换树脂，所述阳离子交换树脂的平均粒径为0.4-0.6mm、含水量为50-75wt％。
作为优化，步骤(5)中的萃取剂选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、正丁醇、异丁醇、正辛醇、异辛醇、2-丁酮、戊酮、正己烷、环己烷或甲苯中的一种。
作为优化，步骤(5)中的萃取剂为乙酸乙酯。
作为优化，步骤(2)中发酵罐中剩余发酵液采用过滤的方式去除菌体。
作为优化，步骤(2)中的滤膜为有机滤膜。
作为优化，步骤(4)中的阳离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂。
作为优化，步骤(4)中的阳离子交换树脂为带磺酸基团的阳离子交换树脂。
本发明所使用的高效液相色谱仪为岛津高效液相色谱仪，检测条件为：检测器：SPD-10A紫外检测器，柱温：30℃，流动相：0.1％三氟乙酸水溶液︰乙腈＝85︰15。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法是以重组大肠杆菌作为出发菌株，在制备过程中无需添加IPTG等诱导剂，在补料末期，将产物连续流出，这在很大的程度上解除了产物5-甲基吡嗪-2-羧酸对大肠杆菌的毒害抑制作用，可以源源不断的收集5-甲基吡嗪-2-羧酸，摩尔转化率得以提高，更加有利于工业化生产。
(2)发酵用培养基中的组分有葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化钴、亚硒酸钠、维生素B1、维生素B2、维生素B6和溶剂水，这些原料组分简单易得，成本低，无须使用二甲苯这一有毒溶剂，对环境无污染，且后处理过程损耗能源少，用酸量少，利用高效液相色谱法检测5-甲基吡嗪-2-羧酸固体的纯度为99.5-100％，纯度高，整个制备过程的总收率为90-96％，收率高，有利于规模化工业生产。
附图说明
图1为本发明5-甲基吡嗪-2-羧酸浓度随发酵时间的变化曲线图；
图2为本发明实施例3制备的5-甲基吡嗪-2-羧酸的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，该方法包括以下步骤：
(1)种子液制备：种子液制备用培养基包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖5g/L、硫酸铵1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.1g/L和水，水为溶剂，种子液制备用培养基的pH为 6.0，将大肠杆菌接种到种子液制备用培养基中，培养方法为：温度为20℃、搅拌转速为50rpm；
(2)上罐发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸：发酵用培养基包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖10g/L、硫酸铵3g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锌0.5g/L、硫酸铜0.01g/L、硫酸锰0.5g/L、氯化钴0.1g/L、亚硒酸钠0.01g/L、维生素B1 0.005g/L、维生素B20.005g/L、维生素B6 0.005g/L和水，水为溶剂，发酵用培养基的pH为6.0，将步骤(1)所制得的种子液接种到发酵用培养基中，接种量为1％，50L发酵罐装液量为 30L，培养方法为：温度为25℃，搅拌转速为180rpm，发酵开始1h后进行连续补料，补料速度为10ml/min，直至发酵结束，补料溶液总量为3L，补料4h后，发酵液通过0.45μm有机滤膜连续移出发酵罐，移出速度为5ml/min，直至发酵结束，此过程持续6h，此过程结束后，发酵罐中剩余的发酵液通过离心机去除菌体，离心机的转速为3000rpm，随后合并上述过程中所有的发酵液，利用高效液相色谱法检测发酵液中5-甲基吡嗪-2-羧酸的浓度为10g/L；补料溶液包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖50g/L、2,5-二甲基吡嗪50g/L、阿拉伯糖1g/L和山梨糖醇0.5g/L；
(3)超滤浓缩：将步骤(2)合并后的发酵液进行超滤浓缩，所选用的超滤膜分子量大小为1000Da，收集超滤膜透过液，超滤浓缩的收率为98％；
(4)阳离子交换树脂分离纯化：采用强酸性阳离子交换树脂从步骤(3)中得到的超滤液中分离出含有5-甲基吡嗪-2-羧酸的料液，料液吸附速率为0.05wt％/min、吸附温度为20℃，等料液吸附完毕后，用纯水洗去未吸附物，然后用50％的浓硫酸将料液从强酸性阳离子交换树脂中洗脱下来，料液洗脱速率为 0.05wt％/min、洗脱温度为20℃，本步骤的收率为98％；
(5)萃取、浓缩和固体烘干过程：用正己烷萃取步骤(4) 所得的洗脱液中的5-甲基吡嗪-2-羧酸，萃取方法为：萃取温度为20℃，萃取次数为2次，正己烷的用量为洗脱液质量的0.5 倍，萃取结束后，将含有5-甲基吡嗪-2-羧酸的萃取剂在77℃下进行蒸馏，除去正己烷，析出的固体放入鼓风干燥箱中烘干即得5-甲基吡嗪-2-羧酸固体，利用高效液相色谱法检测5-甲基吡嗪-2-羧酸固体的纯度为99.5％，整个制备过程的总收率为90％。
实施例2：
一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，该方法包括以下步骤：
(1)种子液制备：种子液制备用培养基包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖18g/L、硫酸铵8g/L、磷酸二氢钾25g/L、硫酸镁4g/L和水，水为溶剂，种子液制备用培养基的pH为6.6，将大肠杆菌接种到种子液制备用培养基中，培养方法为：温度为32℃、搅拌转速为240rpm；
(2)上罐发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸：发酵用培养基包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖25g/L、硫酸铵25g/L、磷酸二氢钾18g/L、硫酸镁4g/L、硫酸锌3g/L、硫酸铜0.3g/L、硫酸锰3g/L、氯化钴1.5g/L、亚硒酸钠0.8g/L、维生素B1 0.1g/L、维生素B2 0.05g/L、维生素B6 0.05g/L和水，水为溶剂，发酵用培养基的pH为6.2，将步骤(1)所制得的种子液接种到发酵用培养基中，接种量为3％，50L发酵罐装液量为32L，培养方法为：温度为34℃，搅拌转速为400rpm，发酵开始2.5h后进行连续补料，补料速度为10ml/min，直至发酵结束，补料溶液总量为5L，补料5h后，发酵液通过0.45μm无机滤膜连续移出发酵罐，移出速度为5ml/min，直至发酵结束，此过程持续10h，此过程结束后，发酵罐中剩余的发酵液通过离心机去除菌体，离心机的转速为5000rpm，随后合并上述过程中所有的发酵液，利用高效液相色谱法检测发酵液中5-甲基吡嗪-2-羧酸的浓度为 38g/L；补料溶液包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖150g/L、 2,5-二甲基吡嗪150g/L、阿拉伯糖8g/L和山梨糖醇8g/L；
(3)超滤浓缩：将步骤(2)合并后的发酵液进行超滤浓缩，所选用的超滤膜分子量大小为4000Da，收集超滤膜透过液，超滤浓缩的收率为99％；
(4)阳离子交换树脂分离纯化：采用弱酸性阳离子交换树脂从步骤(3)中得到的超滤液中分离出含有5-甲基吡嗪-2-羧酸的料液，料液吸附速率为0.3wt％/min、吸附温度为32℃，等料液吸附完毕后，用纯水洗去未吸附物，然后用50％的浓盐酸将料液从弱酸性阳离子交换树脂中洗脱下来，料液洗脱速率为 0.4wt％/min、洗脱温度为36℃，本步骤的收率为98％；
(5)萃取、浓缩和固体烘干过程：用正辛醇萃取步骤(4) 所得的洗脱液中的5-甲基吡嗪-2-羧酸，萃取方法为：萃取温度为28℃，萃取次数为4次，正辛醇的用量为洗脱液质量的2.4 倍，萃取结束后，将含有5-甲基吡嗪-2-羧酸的萃取剂在77℃下进行蒸馏，除去萃取剂，析出的固体放入鼓风干燥箱中烘干即得5-甲基吡嗪-2-羧酸固体，利用高效液相色谱法检测5-甲基吡嗪-2-羧酸固体的纯度为99.7％，整个制备过程的总收率为94％。
实施例3：
一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，该方法包括以下步骤：
(1)种子液制备：种子液制备用培养基包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖10g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸镁1g/L和水，水为溶剂，种子液制备用培养基的pH为6.8，将大肠杆菌接种到种子液制备用培养基中，培养方法为：温度为28℃、搅拌转速为150rpm；
(2)上罐发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸：发酵用培养基包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖30g/L、硫酸铵15g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸镁1g/L、硫酸锌2g/L、硫酸铜0.1g/L、硫酸锰0.5g/L、氯化钴2g/L、亚硒酸钠0.5g/L、维生素B1 0.5g/L、维生素B2 0.1g/L、维生素B6 0.2g/L和水，水为溶剂，发酵用培养基的pH为6.5，将步骤(1)所制得的种子液接种到发酵用培养基中，接种量为4％，50L发酵罐装液量为35L，培养方法为：温度为30℃，搅拌转速为300rpm，发酵开始2h后进行连续补料，补料速度为10ml/min，直至发酵结束，补料溶液总量为7.0L，补料4h后，发酵液通过0.45μm有机滤膜连续移出发酵罐，移出速度为5ml/min，直至发酵结束，此过程持续12h，此过程结束后，发酵罐中剩余的发酵液通过离心机去除菌体，离心机的转速为6000rpm，随后合并上述过程中所有的发酵液，利用高效液相色谱法检测发酵液中5-甲基吡嗪-2-羧酸的浓度为 40.5g/L；补料溶液包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖 200g/L、2,5-二甲基吡嗪200g/L、阿拉伯糖10g/L和山梨糖醇 3g/L；
(3)超滤浓缩：将步骤(2)合并后的发酵液进行超滤浓缩，所选用的超滤膜分子量大小为2000Da，收集超滤膜透过液，超滤浓缩的收率为99％；
(4)阳离子交换树脂分离纯化：采用带磺酸基团的阳离子交换树脂从步骤(3)中得到的超滤液中分离出含有5-甲基吡嗪 -2-羧酸的料液，料液吸附速率为0.1wt％/min、吸附温度为25℃，等料液吸附完毕后，用纯水洗去未吸附物，然后用50％的浓硫酸将料液从带磺酸基团的阳离子交换树脂中洗脱下来，料液洗脱速率为0.2wt％/min、洗脱温度为30℃，本步骤的收率为99％；
(5)萃取、浓缩和固体烘干过程：用乙酸乙酯萃取步骤(4) 所得的洗脱液中的5-甲基吡嗪-2-羧酸，萃取方法为：萃取温度为25℃，萃取次数为3次，乙酸乙酯的用量为洗脱液质量的1.2 倍，萃取结束后，将含有5-甲基吡嗪-2-羧酸的萃取剂在77℃下进行蒸馏，除去乙酸乙酯，析出的固体放入鼓风干燥箱中烘干即得5-甲基吡嗪-2-羧酸固体，利用高效液相色谱法检测5-甲基吡嗪-2-羧酸固体的纯度为99.9％，整个制备过程的总收率为 91.2％。
实施例4：
一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，该方法包括以下步骤：
(1)种子液制备：种子液制备用培养基包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖20g/L、硫酸铵10g/L、磷酸二氢钾30g/L、硫酸镁5g/L和水，水为溶剂，种子液制备用培养基的pH为7.0，将大肠杆菌接种到种子液制备用培养基中，培养方法为：温度为37℃、搅拌转速为250rpm；
(2)上罐发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸：发酵用培养基包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖30g/L、硫酸铵30g/L、磷酸二氢钾20g/L、硫酸镁5g/L、硫酸锌5g/L、硫酸铜0.5g/L、硫酸锰5g/L、氯化钴2g/L、亚硒酸钠1g/L、维生素B10.5g/L、维生素B20.1g/L、维生素B60.3g/L和水，水为溶剂，发酵用培养基的pH为7.0，将步骤(1)所制得的种子液接种到发酵用培养基中，接种量为4％，50L发酵罐装液量为37L，培养方法为：温度为37℃，搅拌转速为600rpm，发酵开始3h后进行连续补料，补料速度为10ml/min，直至发酵结束，补料溶液总量为11L，补料6h后，发酵液通过0.45μm无机滤膜连续移出发酵罐，移出速度为5ml/min，直至发酵结束，此过程持续12h，此过程结束后，发酵罐中剩余发酵液采用过滤的方式去除菌体，随后合并上述过程中所有的发酵液，利用高效液相色谱法检测发酵液中5-甲基吡嗪-2-羧酸的浓度为42g/L；补料溶液包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖200g/L、2,5-二甲基吡嗪200g/L、阿拉伯糖10g/L和山梨糖醇10g/L；
(3)超滤浓缩：将步骤(2)合并后的发酵液进行超滤浓缩，所选用的超滤膜分子量大小为5000Da，收集超滤膜透过液，超滤浓缩的收率为100％；
(4)阳离子交换树脂分离纯化：采用带有磺酸基团的阳离子交换树脂从步骤(3)中得到的超滤液中分离出含有5-甲基吡嗪-2-羧酸的料液，料液吸附速率为0.05wt％-0.5wt％/min、吸附温度为20-40℃，等料液吸附完毕后，用纯水洗去未吸附物，然后用50％的浓盐酸将料液从带有磺酸基团的阳离子交换树脂中洗脱下来，料液洗脱速率为0.5wt％/min、洗脱温度为40℃，本步骤的收率为99％；
(5)萃取、浓缩和固体烘干过程：用正丁醇萃取步骤(4) 所得的洗脱液中的5-甲基吡嗪-2-羧酸，萃取方法为：萃取温度为20-30℃，萃取次数为2-5次，正丁醇的用量为洗脱液质量的 3倍，萃取结束后，将含有5-甲基吡嗪-2-羧酸的萃取剂在77℃下进行蒸馏，除去正丁醇，析出的固体放入鼓风干燥箱中烘干即得5-甲基吡嗪-2-羧酸固体，利用高效液相色谱法检测5-甲基吡嗪-2-羧酸固体的纯度为100％，整个制备过程的总收率为 96％。
图1为本发明实施例3制备5-甲基吡嗪-2-羧酸浓度随发酵时间的变化曲线图，图中横坐标为时间(h)，纵坐标为5-甲基吡嗪-2-羧酸的浓度(g/L)，从图中可以看出，随着发酵时间的增长，5-甲基吡嗪-2-羧酸的量不断增多，最后5-甲基吡嗪-2-羧酸的量基本保持不变。
图2为本发明实施例3制备的5-甲基吡嗪-2-羧酸的高效液相色谱图，色谱分析数据如表1所示。
表1 5-甲基吡嗪-2-羧酸的色谱分析数据
峰号 保留时间 面积 高度 面积％ 高度％
1 2.566 468 60 0.015 0.012
2 2.970 3148224 577890 99.965 99.969
3 3.992 634 111 0.020 0.019
总计 3149326 578070 100.000 100.000
由图2和表1可知，5-甲基吡嗪-2-羧酸几乎不含杂质，纯度为 99.9％，产品5-甲基吡嗪-2-羧酸的纯度非常高。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (9)

1.一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)种子液制备：种子液制备用培养基包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖5-20g/L、硫酸铵1-10g/L、磷酸二氢钾2-30g/L、硫酸镁0.1-5g/L和水，所述水为溶剂，所述种子液制备用培养基的pH为6.0-7.0，将大肠杆菌接种到所述种子液制备用培养基中，培养方法为：温度为20-37℃、搅拌转速为50-250rpm；
(2)上罐发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸：发酵用培养基包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖10-30g/L、硫酸铵3-30g/L、磷酸二氢钾1-20g/L、硫酸镁0.1-5g/L、硫酸锌0.5-5g/L、硫酸铜0.01-0.5g/L、硫酸锰0.5-5g/L、氯化钴0.1-2g/L、亚硒酸钠0.01-1g/L、维生素B10.005-0.5g/L、维生素B20.005-0.1g/L、维生素B60.005-0.3g/L和水，所述水为溶剂，所述发酵用培养基的pH为6.0-7.0，将步骤(1)所制得的种子液接种到发酵用培养基中，接种量为1-4％，发酵罐装液量为发酵罐容积的60-75％，培养方法为：温度为25-37℃，搅拌转速为180-600rpm，发酵开始1-3h后进行连续补料，补料速度为10ml/min，直至发酵结束，所述补料溶液总量为培养基总体积的10-30％，补料4-6h后，发酵液通过0.45μm滤膜连续移出发酵罐，移出速度为5ml/min，直至发酵结束，此过程持续6-12h，此过程结束后，发酵罐中剩余的发酵液通过离心机去除菌体，所述离心机的转速为3000-9000rpm，随后合并上述过程中所有的发酵液，利用高效液相色谱法检测所述发酵液中5-甲基吡嗪-2-羧酸的浓度为10-42g/L；
(3)超滤浓缩：将步骤(2)合并后的发酵液进行超滤浓缩，所选用的超滤膜分子量大小为1000-5000Da，收集超滤膜透过液，超滤浓缩的收率为98-100％；
(4)阳离子交换树脂分离纯化：采用阳离子交换树脂从步骤(3)中得到的超滤液中分离出含有5-甲基吡嗪-2-羧酸的料液，所述料液吸附速率为0.05-0.5wt％/min、吸附温度为20-40℃，等料液吸附完毕后，用纯水洗去未吸附物，然后用50％的浓硫酸或浓盐酸将料液从阳离子交换树脂中洗脱下来，料液洗脱速率为0.05-0.5wt％/min、洗脱温度为20-40℃，本步骤的收率为98-99％；
(5)萃取、浓缩和固体烘干过程：用萃取剂萃取步骤(4)所得的洗脱液中的5-甲基吡嗪-2-羧酸，萃取方法为：萃取温度为20-30℃，萃取次数为2-5次，萃取剂的用量为洗脱液质量的0.5-3倍，萃取结束后，将含有5-甲基吡嗪-2-羧酸的萃取剂在77℃下进行蒸馏，除去萃取剂，析出的固体放入鼓风干燥箱中烘干即得5-甲基吡嗪-2-羧酸固体，利用高效液相色谱法检测所述5-甲基吡嗪-2-羧酸固体的纯度为99.5-100％，整个制备过程的总收率为90-96％。
2.根据权利要求1所述的一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的补料溶液包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖50-200g/L、2,5-二甲基吡嗪50-200g/L、阿拉伯糖1-10g/L和山梨糖醇0.5-10g/L。
3.根据权利要求2所述的一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的阳离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂或弱酸性阳离子交换树脂，所述阳离子交换树脂的平均粒径为0.4-0.6mm、含水量为50-75wt％。
4.根据权利要求3所述的一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于：所述步骤(5)中的萃取剂选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、正丁醇、异丁醇、正辛醇、异辛醇、2-丁酮、戊酮、正己烷、环己烷或甲苯中的一种。
5.根据权利要求4所述的一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于：所述步骤(5)中的萃取剂为乙酸乙酯。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于：所述步骤(2)中发酵罐中剩余发酵液采用过滤的方式去除菌体。
7.根据权利要求6所述的一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的滤膜为有机滤膜。
8.根据权利要求7所述的一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的阳离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂。
9.根据权利要求7所述的一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的阳离子交换树脂为带磺酸基团的阳离子交换树脂。
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