CN115838680A - 一种d-对羟基苯甘氨酸高产菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种D‑对羟基苯甘氨酸高产菌株及其应用，本发明通过将D‑海因酶和D‑氨甲酰水解酶的突变体连接在双表达质粒pETduet‑1上，提高了D‑氨甲酰水解酶的表达，该菌株转化12h生产30g/L D‑对羟基苯甘氨酸的产量达到24.9g/L，摩尔转化率达到95.4％，转化12h生产40g/L D‑对羟基苯甘氨酸的产量达到30.4g/L，摩尔转化率达到87.4％；转化12h生产50g/L D‑对羟基苯甘氨酸的产量达到29.8g/L，转化24h产量达到33.0g/L，摩尔转化率75.9％。本发明方法在工业上用于提高D‑对羟基苯甘氨酸的产量具有极大的潜力和广泛的价值。

Description

一种D-对羟基苯甘氨酸高产菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种D-对羟基苯甘氨酸高产菌株及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

D-对羟基苯甘氨酸是一种重要的药物和食品添加剂，在半合成抗生素，多肽，激素，拟除虫菊脂，杀虫剂，甜味剂等的工业生产方面有广泛的应用，主要用于半合成羟氨苄青霉素、头孢羟氨苄和头孢哌酮等抗生素，D-对羟基苯甘氨酸是目前需求量最大的D-型氨基酸，其产量每年在世界范围内达上千吨。

D-对羟基苯甘氨酸的制备方法主要分为化学合成法和海因酶转化法，目前，化学合成法是D-对羟基苯甘氨酸的主要生产方法，主要包括:不对称转化法，诱导结晶法以及化学拆分法。虽然目前合成D-对羟基苯甘氨酸的化学法较多，但是这些方法在不同程度上都存在反应条件苛刻、环境污染大、生产效率低以及生产成本高的问题。因此，越来越多的研究人员寻求利用酶转化法来合成D-对羟基苯甘氨酸。目前的酶转化法主要是海因酶法:以D,L对羟基苯海因(D,LHPH)为底物，在D-海因酶(D-hydantoinase,DHase)和D-氨甲酰水解酶(D-carbamoylase,DCase)催化下，经中间物N-氨甲酰基D-对羟基苯甘氨酸(D-CpHPG)，生成光学纯的D-HPG的反应,被称为生产D-HPG的海因酶法。

然而，在海因酶法生产过程中，D-氨甲酰水解酶由于表达量和稳定性等问题制约着其工业化生产。因此，也有用生物转化法来生产D-对羟基苯甘氨酸的，目前生物转化法主要包括大肠杆菌转化和枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌并不能解决N-氨甲酰水解酶的表达量低、稳定性以及其可溶性表达的问题，且因其为革兰氏阳性菌，厚的细胞壁也成为其在催化过程中的限制性因素之一，而现有用于D-对羟基苯甘氨酸生产的大肠杆菌在表达N-氨甲酰水解酶时表达量低，导致D-对羟基苯甘氨酸的产量无法进一步提升。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种表达了D-海因酶(GsDH)和D-氨甲酰水解酶突变体(AkDC_A273T)的重组大肠杆菌，能够实现提高D-对羟基苯甘氨酸产量的目的。

本发明的第一个目的是提供一种D-对羟基苯甘氨酸高产菌株，所述的菌株是以质粒pETduet-1为载体，在大肠杆菌宿主中表达D-海因酶(GsDH)和D-氨甲酰水解酶突变体(AkDC_A273T)。

进一步地，所述的D-氨甲酰水解酶突变体和D-海因酶均以T7启动子启动表达，其中，D-氨甲酰水解酶突变体构建在第一个启动子之后，D-海因酶构建在第二个启动子之后。

进一步地，以质粒pETduet-1为载体构建的重组质粒的序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明的D-海因酶(GsDH)来源于Geobacillus stearothermophilus，本发明的D-氨甲酰水解酶(AkDC)来源于Agrobacterium sp.(strain KNK712)。

进一步地，所述的D-海因酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，所述的D-氨甲酰水解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步地，所述的大肠杆菌宿主为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

本发明的第二个目的是提供所述的D-对羟基苯甘氨酸高产菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)获得编码D-氨甲酰水解酶突变体和D-海因酶的基因片段(AkDC_A273T和GsDH)；

(2)将编码D-氨甲酰水解酶基因片段(AkDC_A273T)连接到pETduet-1载体上,其中，D-氨甲酰水解酶基因片段(AkDC_A273T)位于酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ之间。所得到的重组质粒为pETduet-1-AkDC_A273T；

(3)将步骤(2)所述重组质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，培养并提取质粒，以验证与富集重组质粒pETduet-1-AkDC_A273T；

(4)将编码D-海因酶的基因片段(GsDH)连接到步骤(3)所述的重组质粒pETduet-1-AkDC_A273T上，其中，D-海因酶的基因片段(GsDH)位于酶切位点XhoⅠ处。所得到的重组质粒为pETduet-1-AkDC_A273T-GsDH；

(5)将步骤(4)所得的重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中，得到所述的D-对羟基苯甘氨酸高产菌株。

进一步地，重组质粒pETduet-1-AkDC_A273T-GsDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明的第三个目的是提供所述的D-对羟基苯甘氨酸高产菌株在生产D-对羟基苯甘氨酸中的应用。

进一步地，所述的应用是将D-对羟基苯甘氨酸高产菌株发酵后的全细胞作为催化剂，催化DL-对羟基苯甘氨酸生成D-对羟基苯甘氨酸。

进一步地，D-对羟基苯甘氨酸高产菌株发酵是将D-对羟基苯甘氨酸高产菌株接种至种子液培养基中培养得到种子液，再将种子液接种至发酵培养基中培养。

进一步地，种子液培养基包括：胰蛋白胨8～12g/L，酵母粉4～6g/L，NaCl 8～12g/L；发酵培养基包括：胰蛋白胨10～14g/L，安琪酵母粉22～26g/L，磷酸二氢钾KH₂PO₄2.2～2.4g/L，磷酸氢二钾K₂HPO₄ 3H₂O 16～17g/L，甘油3～5g/L。

进一步地，发酵培养的条件是：温度35～38℃，转速200～250rpm，培养2～3h，添加0.3～0.5mmol/L的IPTG进行诱导，诱导温度为22～26℃，时间10～20h转速200～250rpm。

在本发明中，菌株生产的蛋白验证方法是取上述湿菌体加入EP管中，缓冲液洗涤后再加入缓冲液混匀，超声破碎。离心后分别取上清和沉淀，进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳。所述的超声破碎的条件具体可为：超声功率27％，超声10min，超声3s，间隔3s。所述离心的条件具体可为：12000rpm 5min。

进一步地，催化反应的条件是在38～42℃、180～250rpm反应，反应pH为7.5～8.0。

本发明的有益效果是：

本发明通过将来源于Geobacillus stearothermophilus的D-海因酶和来源于Agrobacteriumsp.(strain KNK712)的D-氨甲酰水解酶的突变体连接在双表达质粒pETduet-1上，提高了N-氨甲酰水解酶的表达量。该菌株在摇瓶水平下转化12h生产30g/LD-对羟基苯甘氨酸的产量达到24.9g/L，摩尔转化率达到95.4％,转化24h产量达到25.4g/L,摩尔转化率97.3％；转化12h生产40g/L D-对羟基苯甘氨酸的产量达到30.4g/L，摩尔转化率达到87.4％,转化24h产量达到30.8g/L,摩尔转化率88.5％；转化12h生产50g/L D-对羟基苯甘氨酸的产量达到29.8g/L,摩尔转化率达到68.5％,转化24h产量达到33.0g/L,摩尔转化率75.9％。本发明方法在工业上用于提高D-对羟基苯甘氨酸的产量具有极大的潜力和广泛的价值。

附图说明

图1所示为质粒构建示意图；

图2所示为不同载体D-海因酶和D-氨甲酰水解酶的蛋白胶图，pACYCduet-GsDH-AkDC代表GsDH在第一个启动子后，AkDC在第二个启动子后，其他类推；

图3所示为不同载体20g/L底物的转化效果；

图4所示为各标准品的HPLC图谱；

图5所示为不同时间段D-对羟基苯甘氨酸的产量；

图6所示为30g/L、40g/L和50g/L底物浓度下转化12h和24h生成D-对羟基苯甘氨酸的产量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取自平均值。

来源于嗜热脂肪地衣芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的D-海因酶如SEQ IDNO.1所示，其编码基因如SEQ ID NO.2所示。来源于根癌农杆菌(Agrobacteriumsp.(strain KNK712))的D-氨甲酰水解酶如SEQ ID NO.3所示，其编码基因如SEQ ID NO.4所示，D-氨甲酰水解酶突变体如SEQ ID NO.5所示，其编码基因如SEQ ID NO.6所示。

实施例1：重组质粒pETduet-1-AkDC_A273T-GsDH的构建

1、合成序列表的序列6所示的双链DNA分子。

2、以步骤1合成的DNA分子为模板，用P1和P2组成的引物对PCR扩增出AkDC_A273T片段,胶回收PCR产物；

用于扩增编码D-氨甲酰水解酶(AkDC)的基因的PCR引物为P1和P2：

P1:5’-TCATCACCACAGCCAGGATCCGATGACCCGTCAGATGATTCTGG-3’

P2:5’-AGGCGCGCCGAGCTCGAATTCTTACAGTTCCGCAATCAGGCC-3’

3、使用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切载体pETduet-1，对酶切产物进行胶回收；

4、使用同源重组酶ExnaseⅡ对步骤2和步骤3的胶回收产物进行连接，得到重组质粒pETduet-1-AkDC_A273T；

5、将步骤4得到的重组质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，培养并提取质粒，以验证与富集重组质粒pETduet-1-AkDC_A273T；；

6、用限制性内切酶XhoⅠ对步骤5富集得到的重组质粒进行单酶切，对酶切产物进行胶回收；

7、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

8、以步骤7合成的DNA分子为模板，用P3和P4组成的引物对PCR扩增出GsDH片段,胶回收PCR产物；

用于扩增编码D-海因酶的基因(GsDH)的PCR引物为P3和P4：

P3:5’-GCTGACGTCGGTACCCTCGAGatgaccaaaattattaaaaatggtacca-3’

P4:5’-GGTTTCTTTACCAGACTCGAGttaaatggtcagttcttcgctctg-3’

9、使用同源重组酶ExnaseⅡ对步骤6和步骤8的胶回收产物进行连接，得到重组质粒pETduet-1-AkDC_A273T-GsDH。

测序正确的pETduet-1-AkDC-GsDH的结果为：以pETduet-1为载体，在BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列6所示的D-氨甲酰水解酶的基因(AkDC_A273T)，在XhoⅠ酶切位点处插入了序列表的序列2所示D-海因酶的基因(GsDH)。质粒构建图谱如图1。

将获得的pETduet-1-AkDC_A273T-GsDH质粒转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli 01。

实施例2：重组菌株E.coli 01摇瓶发酵与菌体收集

挑取E.coli 01重组菌株进行摇瓶发酵。单克隆接种于30mL(100mL摇瓶)含有10mg/mL Amp的LB培养基作为摇瓶发酵的种子液，于37℃，200rpm培养7h。种子液培养基LB为：胰蛋白胨(TRYPTONE)10g/L,酵母粉(YEAST EXTRACT)5g/L,NaCl 10g/L,摇瓶发酵的接种量为2％,发酵条件为，温度37℃，转速220rpm，初始pH控制在7.0左右。发酵培养基为：胰蛋白胨12g/L,安琪酵母粉24g/L，磷酸二氢钾KH₂PO₄ 2.31g/L，磷酸氢二钾K₂HPO₄3H₂O,甘油4g/L。培养2.5h添加终浓度0.42mmol/L的IPTG进行诱导，诱导温度为25℃，诱导时间为16h,转速220rpm；诱导结束后6000rpm 12min收集湿菌体，于-40℃冷藏。

实施例3：重组菌株目的蛋白的表达

取0.05g上述湿菌体于1.5mL EP管中，加入1mL的pH7.8的Tris-HCl缓冲液混匀，12000rpm 1min，弃去上清，再加入1mL的pH 7.8的Tris-HCl缓冲液混匀，超声破碎(超声功率27％，超声10min，超声3s，间隔2s)，之后12000rpm 5min离心，取30uL上清液加10uL 4Xprotein loading buffer,混匀后，进行SDS-PAGE电泳上样，同时弃去1.5mL EP管中中的上清，加入1mLpH 7.8的Tris-HCl缓冲液混匀沉淀后，取30uL混悬液加10uL 4Xproteinloading buffer，混匀后，进行SDS-PAGE电泳上样，之后进行SDS-PAGE跑胶。

聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果见图2中的13和14，D-海因酶(GsDH)的分子量为54kDa,D-氨甲酰水解酶(AkDC_A273T)的分子量为34kDa。

实施例4：全细胞制备D-对羟基苯甘氨酸

在20mL小棕瓶中分别加入0.08g诱导培养后的全细胞E.coli 01、0.12g(30g/L)、0.16g(40g/L)和0.20g(50g/L)DL-对羟基苯海因(DL-HPH)、4mL pH7.8的Tris-HCl缓冲液，于40℃、220rpm恒温摇床中反应24h，反应pH为7.8。转化后的反应液样品于12000rpm条件下离心5～10min，上清用超纯水稀释，过0.22μm水膜后，进行高相液相色谱法HPLC分析。

HPLC检测采用色谱柱(ZORBAX SB-C18，5um,4.6x 250mm),流动相pH 1.5高氯酸：乙腈＝9:1,流速0.5mL/min,紫外检测波长210nm.

底物DL-对羟基苯甘氨酸(DL-HPH),中间产物N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(CpHPG)以及产物D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)的液相图谱如图4所示。

对得到的E.coli 01进行全细胞(20g/L湿菌体)制备D-对羟基苯甘氨酸，其结果为：转化12h生产30g/L D-对羟基苯甘氨酸的产量达到24.9g/L，摩尔转化率达到95.4％，转化24h产量达到25.4g/L,摩尔转化率97.3％；转化12h生产40g/L D-对羟基苯甘氨酸的产量达到30.4g/L,摩尔转化率达到87.4％,转化24h产量达到30.8g/L,摩尔转化率88.5％；转化12h生产50g/L D-对羟基苯甘氨酸的产量达到29.8g/L,摩尔转化率达到68.5％,转化24h产量达到33.0g/L,摩尔转化率75.9％。30g/L底物不同时间段D-对羟基苯甘氨酸的产量见图5；30g/L、40g/L和50g/L底物浓度下转化12h和24h生成D-对羟基苯甘氨酸的产量见图6。

实施例5：

本发明在得到E.coli 01之前，设计过多种表达方式：

分别按照实施例1类似的方法构建了8种质粒：pACYCduet-1-GsDH-AkDC，pCDFduet-1-GsDH-AkDC，pETduet-1-GsDH-AkDC，pRSFduet-1-GsDH-AkDC，pACYCduet-1-AkDC–GsDH，pCDFduet-1-AkDC–GsDH，pETduet-1-AkDC–GsDH，pRSFduet-1-AkDC–GsDH，随后将其分别导入大肠杆菌BL21(DE3)中，进行实施例2和3的方法，进行SDS-PAGE实验观察其中的蛋白表达效果。以实施例4的方式考察它们的转化效果。

表达结果如图2、转化效果如图3所示，由图2可以看出在不同的双片段表达质粒中，将AkDC放在第一个启动子后，其上清表达量明显升高。由图3可以看出20g/L的反应中，pETduet-1的效果最好，因此采用pETduet-1载体。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种D-对羟基苯甘氨酸高产菌株，其特征在于，所述的菌株是以质粒pETduet-1为载体，在大肠杆菌宿主中表达D-海因酶和D-氨甲酰水解酶突变体。

2.根据权利要求1所述的D-对羟基苯甘氨酸高产菌株，其特征在于，所述的D-海因酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的D-对羟基苯甘氨酸高产菌株，其特征在于，所述的D-氨甲酰水解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求1所述的D-对羟基苯甘氨酸高产菌株，其特征在于，所述的大肠杆菌宿主为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

5.一种权利要求1～4任一项所述的D-对羟基苯甘氨酸高产菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获得编码D-氨甲酰水解酶突变体和D-海因酶的基因片段；

(2)将编码D-氨甲酰水解酶突变体基因片段连接到pETduet-1载体上，其中，D-氨甲酰水解酶突变体基因片段位于酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ之间，所得到的重组质粒为pETduet-1-AkDC_A273T；

(3)将步骤(2)所述重组质粒导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，培养并提取质粒，以验证与富集重组质粒pETduet-1-AkDC_A273T；

(4)将编码D-海因酶的基因片段连接到步骤(3)所述的重组质粒pETduet-1-AkDC_A273T上，其中，D-海因酶的基因片段位于酶切位点XhoⅠ处，所得到的重组质粒为pETduet-1-AkDC_A273T-GsDH；

(5)将步骤(4)所得的重组质粒转化到E.coliBL21(DE3)中，得到所述的D-对羟基苯甘氨酸高产菌株。

6.权利要求1～4任一项所述的D-对羟基苯甘氨酸高产菌株在生产D-对羟基苯甘氨酸中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用是将D-对羟基苯甘氨酸高产菌株发酵后的全细胞作为催化剂，催化DL-对羟基苯甘氨酸生成D-对羟基苯甘氨酸。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，D-对羟基苯甘氨酸高产菌株发酵是将D-对羟基苯甘氨酸高产菌株接种至种子液培养基中培养得到种子液，再将种子液接种至发酵培养基中培养。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，发酵培养的条件是：温度35～38℃，转速200～250rpm，培养2～3h，添加0.3～0.5mmol/L的IPTG进行诱导，诱导温度为22～26℃，时间10～20h转速200～250rpm。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，催化反应的条件是在38～42℃、180～250rpm反应，反应pH为7.5～8.0。

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