CN113502305B - 一种利用重组酰亚胺酶合成(r)-异丁基戊二酸单酰胺的方法 - Google Patents
一种利用重组酰亚胺酶合成(r)-异丁基戊二酸单酰胺的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种利用重组酰亚胺酶合成(R)‑异丁基戊二酸单酰胺的方法，属于药物中间体合成技术领域。为了解决现在的反应不佳的问题，提供一种利用重组酰亚胺酶合成(R)‑异丁基戊二酸单酰胺的方法，该方法包括使底物异丁基戊二酰亚胺在重组酰亚胺酶的催化作用下，转化反应生成产物(R)‑异丁基戊二酸单酰胺；重组酰亚胺酶的基因序列如SEQ ID NO.1所示，重组酰亚胺酶的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过采用酶法催化，实现具有高活性和反应位点的高选择性，能够优先催化环状亚胺结构的基团水解形成二羧基单酰胺的结构，且形成的产物具有高手性R型选择性和去对称化反应，从而也能够达到高手性产物收率的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用重组酰亚胺酶合成(R)-异丁基戊二酸单酰胺的方法，属于药物中间体合成技术领域。
背景技术
(S)-普瑞巴林((S)-3-氨甲基-5-甲基己酸)是由辉瑞开发的一种亲脂性氨基丁酸类似物，具有良好的抗焦虑和治疗神经痛的效果。普瑞巴林早期合成方法以化学拆分为主，生产成本相对较高。近十年来以酶法代替化学法进行拆分的研究较多。与化学法拆分相比，酶法拆分具有合成路线短，生产成本低，三废较少等优势。相关的拆分用酶主要为脂肪酶和腈水解酶等。拆分法一次理论收率只有50％，近年来出现的基于酶催化的去对称法，在理论上具有100％的一次收率，受到生产企业的密切关注。
现有的有以非对称水解异丁基戊二酸二酰胺，得到的产物R- 异丁基戊二酸单酰胺ee值也较高。相比于异丁基戊二酸二酰胺，异丁基戊二酰亚胺更易于合成，更适于作为酶法工艺的起始化合物。
专利文献CN 112368262 A中以异丁基戊二酰亚胺为原料，酶法去对称化水解得到(R)-异丁基戊二酸单酰胺，其主要是采用的生物酶是脂肪酶或酯酶。但是根据普遍规律，脂肪酶和酯酶难以催化酰亚胺类化合物的开环反应，相关技术应用至今也没有相关学术文章给予报道或重复。原料异丁基戊二酰亚胺在水溶液中溶解度较低，该专利采用1:1-1:2的水：有机溶剂比例来提高原料的溶解度，而这么高浓度的乙醇、丙酮等有机溶剂中，酶的活性是很难保存。
2015年有学者报道了利用酰亚胺酶催化水解异丁基戊二酰亚胺得到(R)-异丁基戊二酸单酰胺(Applied Microbiology and Biotechnology,2015,99(23):9961-9969)，但反应的效率非常低，产物浓度只有约3.5g/L，反应转化率也只有64.6％，并且反应液并未提取得到目标产品。该反应浓度和转化率低下，产物导致利用酶法去对称化催化异丁基戊二酰亚胺制备(R)-异丁基戊二酸单酰胺的路线优势彻底丧失。
发明内容
本发明针对以上现有技术中存在的问题，提供一种利用重组酰亚胺酶合成(R)-异丁基戊二酸单酰胺的方法，解决的问题是如何提高酰亚胺酶的活性，提高转化率和反应后产物的浓度，得到高手性纯度的产物。
本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的，一种利用重组酰亚胺酶合成(R)-异丁基戊二酸单酰胺的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
使底物式Ⅰ化合物异丁基戊二酰亚胺在重组酰亚胺酶的催化作用下，转化反应生成产物式Ⅱ化合物(R)-异丁基戊二酸单酰胺；
所述重组酰亚胺酶的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组酰亚胺酶的序列如SEQ ID NO.2所示。
通过采用上述重组酰亚胺酶对底物进行酶法催化，具有如 SEQ ID NO.2所示和基因序列如SEQ ID NO.1所示的酶对底物具有高活性和反应位点的高选择性，能够优先催化环状亚胺结构的基团水解形成二羧基单酰胺的结构，且形成的产物具有高手性R 型的选择性，具有去对称化反应，从而也能够达到高手性产物收率的效果；同时，由于具有高手性R型选择性的优点，能够使得到的产物ee值较高，无需拆分，更适用于作为普瑞巴林合成的中间体，也有利于普瑞巴林合成的收率和纯度的提升。采用本基因序列如SEQ ID NO.1所示的酰亚胺酶，能够使培养表述的重组酰亚胺酶具有较高的可溶性蛋白的比例，这样能够更有利于重组酰亚胺酶的表达，实现具有高反应活性的效果。与文献报道相比，本发明反应产物浓度能提高10倍以上，从而具有工业化应用价值。
在上述利用重组酰亚胺酶合成(R)-异丁基戊二酸单酰胺的方法中，所述转化反应在水中进行。无需采用有机类溶剂，更环保；同时，采用水作为溶剂，使式Ⅰ化合物异丁基戊二酰亚胺(IBI) 在反应体系中呈非均相状态，更有利于提高反应的底物转化率，提高产物的收率和纯度质量效果。在以水作为溶剂时，最好使所述式Ⅰ化合物异丁基戊二酰亚胺的浓度在30-40g/L。同时，采用水作为溶剂还具有对环境友好的优点，更利于减少对环境污染的影响。
在上述利用重组酰亚胺酶合成(R)-异丁基戊二酸单酰胺的方法中，作为优选，所述转化反应的体系pH值控制在6.0-9.0。通过对反应体系的pH值的控制，能够更有利于保持上述的重组酰亚胺酶的活性，提高反应的效率和转化率。如果pH值过高反而会造成底物的分解，造成不必要的浪费，因此，最好是在上述范围内进行反应，能够更利于底物的转化，减少因底物分解等造成不必要的杂质影响。
在上述利用重组酰亚胺酶合成(R)-异丁基戊二酸单酰胺的方法中，作为优选，所述转化反应的温度为20℃-50℃。通过采用上述重组酰亚胺酶进行催化反应，具有反应温度温和的优点，且在上述温度范围内更利于保证酰亚胺酶的活性，保证反应对手性的高选择性和高转化率的效果。作为进一步的优选，所述转化反应的温度为35℃-45℃。
在上述利用重组酰亚胺酶合成(R)-异丁基戊二酸单酰胺的方法中，重组酰亚胺酶基因可采用本领域熟知的技术合成得到，如 PCR扩增、基因合成等手段。如将含有重组酰亚胺酶克隆到表达载体后转化宿主细胞得到基因工程菌。对于表达体系优化原核表达体系和酵母表达体系，优选采用PET表述，宿主细胞采用大肠杆菌。作为优选，所述重组酰亚胺酶的宿主菌为BL21(DE3)。上述基因工程菌发酵后能够使可溶性蛋白占总目标蛋白的50％以上，更利于基因的表达，实现酶液中具有高活性的酰亚胺酶，从而达到更有利于使酶液对上述底物的R-型生性高选择性酶催化形成相应的R型的高手性纯度产物的优点。
在上述利用重组酰亚胺酶合成(R)-异丁基戊二酸单酰胺的方法中，作为优选，所述重组酰亚胺酶选自含有酰亚胺酶的菌体或酶液。
本发明的上述利用重组酰亚胺酶合成(R)-异丁基戊二酸单酰胺的方法的反应方程可通过以下方式表示：
本发明的上述利用重组酰亚胺酶合成(R)-异丁基戊二酸单酰胺的方法中的原料异丁基戊二酰亚胺(IBI)还可采用以IBA为原料合成后，再采用本发明的酶法催化合成IBM，再合成相应的(S)- 普瑞巴林((S)-3-氨甲基-5-甲基己酸)。可通过以下反应方程式表示：
综上所述，与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.通过采用酶法并采用上述的重组酰亚胺酶进行酶法催化，实现具有高活性和反应位点的高选择性，能够优先催化环状亚胺结构的基团水解形成二羧基单酰胺的结构，且形成的产物具有高手性R型选择性和去对称化反应，从而也能够达到高手性产物收率的效果。
2.通过采用本发明的重组酰亚胺酶进行酶法催化具有高手性选择性和转化率，产物ee值达到99％以上，转化率能达到90％以上；在作为普瑞巴林合成的中间体具有更有利于提高产品的质量。
附图说明
图1是本发明实施例1中的酰亚胺酶工程菌表达SDS-PAGE 分析图。
图2是本发明实施例2中的酰亚胺酶工程菌在TB培养基中表达的SDS-PAGE分析图。
图3是本发明实施例4中对应酰亚胺酶催化的IBI转化为IBM 反应过程反应时间-体系产物浓度变化分析图。
图4是本发明实施例5中得到的(R)-IBM产物的HPLC(A)及光学纯度(B)分析图。
图5是本发明(R)-IBM标准品(A)及酰亚胺酶催化反应液提取产物(B)的质谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。
实施例1
这里的重组酰亚胺酶工程菌是由金斯瑞公司通过将酰亚胺酶基因BpIH合成并克隆到PET30a NdeI和HindIII位点中，转化后得到的重组酰亚胺酶工程菌pT67/BL21(DE3)。
对于具体的克隆方式是采用本领域常规的克隆方法，优选采用PET表述，宿主细胞采用大肠杆菌，这里的重组酰亚胺酶工程菌(pT67/BL21(DE3)的重组酰亚胺酶的基因序列如SEQ ID NO.1 所示，重组酰亚胺酶的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。
挑取在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上生长的上述重组酰亚胺酶工程菌pT67/BL21(DE3)的单菌落，接种到4mL含 50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，控制温度37℃，转速200 rpm的条件下进行培养到OD600约为0.6～0.8，再加入终浓度 0.5mmol/L的IPTG后，分别在15℃继续培养16h，或者在37℃培养4h，各取450μl培养液分别离心收集相应的菌体，并分别加入300μl裂解缓冲液(50mM Tris,150mM NaCl,5％glycerol pH8.0)后超声破壁1分钟，分别收集相应的裂解液。
各取200μl裂解液在15000rpm下离心10min，沉淀以150μl 5x loading buffer重悬，分别取裂解液、裂解液上清及裂解液离心沉淀重悬液进行SDS-PAGE分析。
其中图1中，M-蛋白质标记；PC1-BSA(1μg)；PC2-BSA(1μg)； NC1-无诱导细胞裂解液；1-细胞裂解液，15℃诱导16小时；2-细胞裂解液，37℃诱导4小时；NC2-无诱导细胞裂解液的上清液；3-细胞裂解液的上清液，15℃诱导16小时；4-细胞裂解液上清， 37℃诱导4小时；NC3：未诱导的细胞裂解物碎片；5-15℃诱导 16h的细胞裂解物碎片；6-细胞裂解物碎片，在37℃下诱导4 小时。
分析结果如图1所示：
从图1可以看出，对比泳道NC1、1、2，可见目标蛋白得到了表达，其分子量在35-40kDa之间，与理论值37.29kD相符；目标蛋白在37℃诱导4h表达量显著高于15℃诱导16h，约为10 mg/L。对比图1中的泳道1-6，可见目标蛋白可溶性相对较差，在37℃诱导4h，可溶性蛋白约占总目标蛋白的20％左右。
实施例2
这里的重组酰亚胺酶工程菌是由金斯瑞公司通过将酰亚胺酶基因BpIH合成并克隆到PET30a NdeI和HindIII位点中，转化后得到的重组酰亚胺酶工程菌pT67/BL21(DE3)。
对于具体的克隆方式是采用本领域常规的克隆方法，优选采用PET表述，宿主细胞采用大肠杆菌，这里的重组酰亚胺酶工程菌pT67/BL21(DE3)的重组酰亚胺酶的基因序列如SEQ ID NO.1所示，重组酰亚胺酶的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。
挑取在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上生长的上述重组酰亚胺酶工程菌(pT67/BL21(DE3))的单菌落，接种于4ml含 50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，控制温度在37℃，转速200rpm的条件下培养过夜，再取0.5ml得到的培养液接种到装有50ml TB培养基的250ml三角瓶中，控制温度在37℃，转速为200rpm的条件下培养4h后，加入0.5mmol/L IPTG诱导，分别在16℃、25℃和37℃继续培养12h，分别收集相应的菌体进行SDS-PAGE检测。
其中图2中，M-蛋白质标记；1、2、3-细胞裂解液、细胞裂解液的上清液、细胞裂解液的碎片，16℃诱导12小时；4、5、6- 细胞裂解液、细胞裂解液的上清液、细胞裂解液的碎片，25℃诱导12小时；7、8、9-细胞裂解液、细胞裂解液的上清液、细胞裂解液的碎片，37℃诱导12小时。
具体测试结果如图2所示：
从图2可知，相比于LB培养基，在TB培养基中表达，目标蛋白占总蛋白的比例及目标蛋白中可溶性的比例都有提高。以 25℃0.5mmol/L IPTG诱导时可溶性蛋白含量最高，约占总目标蛋白的75％，表达量约为100mg/L。
实施例3
取是上述实施例2中过夜培养后得到的LB培养液1mL接种到 50ml TB培养基中，37℃200rpm培养4h，取25ml接种到2.0 L TB培养基中，250rpm37℃培养4h后加入0.5mmol/LIPTG继续培养12h，发酵过程中调节搅拌转速维持DO>20％。发酵结束后离心收集菌体；菌体-20℃冻存备用，或者以4倍重量去离子水重悬后900bar均质破壁得到相应的酶液，酶液于-20℃储存备用。
实施例4
在洁净的反应瓶中加入180ml去离子水和25g异丁基戊二酰亚胺(IBI)，搅拌均匀后以1mol/L的NaOH水溶液调节体系的 pH至8.0，并加入320mL实施例3得到的酶液，然后，控制温度在35℃，转速250rpm的条件下反应，反应期间以1mol/L的NaOH 水溶液维持反应体系的pH为8.0左右，充分反应至结束后得到相应的反应液，产物(R)-异丁基戊二酸单酰胺(IBM)的浓度达到 49.11g/L，转化率达到了90.9％，未检测到IBM水解产物IBA的形成。
实施例5
取利用上述实施例4的方法得到的反应液400mL，共含有产物IBM 19.64g，将反应液经10000rpm离心15min，清液以1mol/L 浓度的HCl调节pH至3.0，再过滤得到IBM湿粗品25g，得到的粗品以200mL无水乙醇溶解，加入2.0g活性炭，过滤后，减压浓缩，析出固体，过滤后得到的固体产品，将得到的固体产品于 40℃热风干燥4h得到成品(R)-异丁基戊二酸单酰胺13.5g。经 HPLC测定，产物(R)-异丁基戊二酸单酰胺(IBM)色谱纯度为 98.27％，含量为99.96％(图5A)；光学纯度为99.98％，ee值为 99.96％(图5B)，提取收率为68.74％。
产物和标准品的质谱图如图5所示，两者具有相同的分子质量，且碎片离子峰吻合，证明产物即为(R)-异丁基戊二酸单酰胺 (IBM)。
实施例6
在洁净的反应瓶中加入180ml去离子水和25g异丁基戊二酰亚胺(IBI)，搅拌均匀后以1mol/L的NaOH水溶液调节体系的 pH至8.5，并加入320mL实施例3得到的破壁后的酶液，然后，控制温度在35℃，转速250rpm的条件下反应，反应期间以1mol/L 的NaOH水溶液维持反应体系的pH为8.5左右，HPLC跟踪检测至反应充分，反应结束后得到相应的反应液，产物(R)-异丁基戊二酸单酰胺(IBM)的浓度达到49.85g/L，未检测到IBM水解产物IBA 的形成。
实施例7
取利用上述实施例6的方法得到的反应液400mL，以反应液 (IBM的浓度为49.85g/L)中共含有产物IBM 19.94g，将反应液经 10000rpm离心15min，清液以1mol/L浓度的HCl调节pH至3.0，再过滤得到IBM湿粗品，得到的湿粗品以200mL无水乙醇溶解，加入2.0g活性炭，过滤后，减压浓缩，析出固体，过滤后得到的固体产品，将得到的固体产品于40℃热风干燥4h得到成品 (R)-异丁基戊二酸单酰胺(IBM)14.3g。经HPLC测定，产物(R)- 异丁基戊二酸单酰胺(IBM)色谱纯度为98.85％，含量为99.96％；光学纯度为99.98％，ee值为99.95％，提取收率为71.7％。
得到的产物和标准品的质谱图与图5所示的相一致，两者具有相同的分子质量，且碎片离子峰吻合，表明产物得到高手性纯度的即为IBM。
实施例8
在洁净的反应瓶中加入180ml去离子水和25g异丁基戊二酰亚胺(IBI)，搅拌均匀后以1mol/L的NaOH水溶液调节体系的 pH至7.5，并加入320mL实施例3得到的破壁后的酶液，然后，控制温度在45℃，转速250rpm的条件下反应，反应期间以1mol/L 的NaOH水溶液维持反应体系的pH为7.5左右，HPLC跟踪检测至反应充分，反应结束后得到相应的反应液，产物(R)-异丁基戊二酸单酰胺(IBM)的浓度达到49.23g/L，未检测到IBM水解产物IBA 的形成。
实施例9
取利用上述实施例8的方法得到的反应液400mL，以反应液 (IBM的浓度为49.23g/L)中共含有产物(R)-异丁基戊二酸单酰胺 (IBM)19.69g，将反应液经10000rpm离心15min，清液以1mol/L 浓度的HCl调节pH至3.0，再过滤得到IBM湿粗品，得到的湿粗品以200mL无水乙醇溶解，加入2.0g活性炭，过滤后，减压浓缩，析出固体，过滤后得到的固体产品，将得到的固体产品于40℃热风干燥4h得到成品(R)-异丁基戊二酸单酰胺(IBM)14.1g。经 HPLC测定，产物IBM色谱纯度为98.88％，含量为99.97％；光学纯度为99.98％，ee值为99.96％，提取收率为71.61％。
得到的产物和标准品的质谱图与图5所示的相一致，两者具有相同的分子质量，且碎片离子峰吻合，表明产物得到高手性纯度的即为IBM。
实施例10
在洁净的反应瓶中加入180ml去离子水和25g异丁基戊二酰亚胺(IBI)，搅拌均匀后以1mol/L的NaOH水溶液调节体系的pH至6-9，并加入320mL实施例3得到的破壁后的酶液，然后，控制温度在20-50℃，转速250rpm的条件下反应，反应期间以 1mol/L的NaOH水溶液维持反应体系的pH为6-9范围，HPLC跟踪检测至反应充分，反应结束后得到相应的反应液，产物(R)-异丁基戊二酸单酰胺(IBM)的浓度均能达到49g/L以上，未检测到IBM 水解产物IBA的形成。
再取利用上述方法得到的反应液400mL，以反应液(IBM的浓度为49g/L计算)中共含有产物(R)-异丁基戊二酸单酰胺(IBM) 19.6g，将反应液经10000rpm离心15min，清液以1mol/L浓度的HCl调节pH至3.0，再过滤得到IBM湿粗品，得到的湿粗品以 200mL无水乙醇溶解，加入2.0g活性炭，过滤后，减压浓缩，析出固体，过滤后得到的固体产品，将得到的固体产品于40℃热风干燥4h得到成品(R)-异丁基戊二酸单酰胺(IBM)14.1g。经HPLC 测定，产物IBM色谱纯度为98.85％以上，含量为99.95％以上；光学纯度为99.97％以上，ee值为99.95％以上，提取收率为71.94％。
本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
序列表
<110> 台州学院
台州达辰药业有限公司
<120> 一种利用重组酰亚胺酶合成(R)-异丁基戊二酸单酰胺的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 977
<212> DNA
<213> 重组酰亚胺酶(人工序列)
<400> 1
atgcaccacc accaccacca tcctctagat ccaaattatc ccagggatct gattggctat 60
ggccgtcatc cggttcaagc gaactggccg ggtcgtgcgc gtgtggcggt tcagttcgtg 120
ctgaactacg aggaaggtgg cgaaaactgc gttctgcacg gtgacccggg cagcgaacaa 180
ttcctgagcg aaattgtggg tgcggcgagc tttccggcgc gtcacatgag catggaaagc 240
atctacgagt atggtagccg tgcgggcgtt tggcgtattc tgcgtgatgg cgaaaagcgt 300
aaactgccgc tgaccgtgtt tggtgttggc atggcggtgg aacgtcaccc ggagctggcg 360
cgtgcgtttg ttgaactggg tcacgagatc gcgtgccacg gctaccgttg gattcactat 420
caggacatgg cgccggagaa ggaagcggag cacatgcgtc tgggtatgga agcgattgag 480
cgtgtgaccg gtgaacgtcc gctgggttgg tacaccggcc gtgatagccc gaacacccgt 540
cgtctggttg cggagacggt ggcttcctgt atgacagcga ttactatggt gacgatctgc 600
cgttttggat ggacgtggat gttaccggtg gcgcgaaggt gccgcagctg attgttccgt 660
ataccctgga caccaacgat atgcgtttcg cgagcccgca aggttttaac accgcggacc 720
acttctttac ctacctgcgt gacgcgttcg atgtgctgta tgaggaaggt gatgaagcgc 780
cgaaaatgct gagcatcggc atgcattgcc gtctgctggg tcgtccgggc cgtttccgtg 840
cgctgcagcg ttttctggac cacattgagc aacacgatcg tgtgtgggtt acccgtcgtg 900
ttgatattgc gcgtcattgg cgtgaacatc atccgtatca acagaataat cgtggtgcgg 960
cggcgtaatg aaagctt 977
<210> 2
<211> 322
<212> PRT
<213> 重组酰亚胺酶(人工序列)
<400> 2
Met His His His His His His Pro Leu Asp Pro Asn Tyr Pro Arg Asp
1 5 10 15
Leu Ile Gly Tyr Gly Arg His Pro Val Gln Ala Asn Trp Pro Gly Arg
20 25 30
Ala Arg Val Ala Val Gln Phe Val Leu Asn Tyr Glu Glu Gly Gly Glu
35 40 45
Asn Cys Val Leu His Gly Asp Pro Gly Ser Glu Gln Phe Leu Ser Glu
50 55 60
Ile Val Gly Ala Ala Ser Phe Pro Ala Arg His Met Ser Met Glu Ser
65 70 75 80
Ile Tyr Glu Tyr Gly Ser Arg Ala Gly Val Trp Arg Ile Leu Arg Glu
85 90 95
Phe Glu Lys Arg Lys Leu Pro Leu Thr Val Phe Gly Val Gly Met Ala
100 105 110
Val Glu Arg His Pro Glu Leu Ala Arg Ala Phe Val Glu Leu Gly His
115 120 125
Glu Ile Ala Cys His Gly Tyr Arg Trp Ile His Tyr Gln Asp Met Ala
130 135 140
Pro Glu Lys Glu Ala Glu His Met Arg Leu Gly Met Glu Ala Ile Glu
145 150 155 160
Arg Val Thr Gly Glu Arg Pro Leu Gly Trp Tyr Thr Gly Arg Asp Ser
165 170 175
Pro Asn Thr Arg Arg Leu Val Ala Glu Tyr Gly Gly Phe Leu Tyr Asp
180 185 190
Ser Asp Tyr Tyr Gly Asp Asp Leu Pro Phe Trp Met Asp Val Asp Val
195 200 205
Thr Gly Gly Ala Lys Val Pro Gln Leu Ile Val Pro Tyr Thr Leu Asp
210 215 220
Thr Asn Asp Met Arg Phe Ala Ser Pro Gln Gly Phe Asn Thr Ala Asp
225 230 235 240
His Phe Phe Thr Tyr Leu Arg Asp Ala Phe Asp Val Leu Tyr Glu Glu
245 250 255
Gly Asp Glu Ala Pro Lys Met Leu Ser Ile Gly Met His Cys Arg Leu
260 265 270
Leu Gly Arg Pro Gly Arg Phe Arg Ala Leu Gln Arg Phe Leu Asp His
275 280 285
Ile Glu Gln His Asp Arg Val Trp Val Thr Arg Arg Val Asp Ile Ala
290 295 300
Arg His Trp Arg Glu His His Pro Tyr Gln Gln Asn Asn Arg Gly Ala
305 310 315 320
Ala Ala
Claims (1)
1.一种利用重组酰亚胺酶合成(R)-异丁基戊二酸单酰胺的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
使底物式Ⅰ化合物异丁基戊二酰亚胺在重组酰亚胺酶的催化作用下，转化反应生成产物式Ⅱ化合物(R)-异丁基戊二酸单酰胺；该产物式Ⅱ化合物(R)-异丁基戊二酸单酰胺具有99%以上ee值；
所述重组酰亚胺酶的基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述重组酰亚胺酶的序列如SEQID NO.2所示；所述转化反应在水中进行；所述式Ⅰ化合物异丁基戊二酰亚胺的浓度在30-40g/L；所述转化反应的体系pH值控制在7.5-9.0；所述转化反应的温度为35℃-45℃；所述重组酰亚胺酶的宿主菌为BL21(DE3)；所述重组酰亚胺酶选自含有重组酰亚胺酶的酶液，将培养液接种到装有TB培养基培养，以16-37℃、0.5mmol/L IPTG的条件进行诱导培养，基因工程菌发酵后可溶性蛋白占总目标蛋白的50％以上。
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