CN111269870A - 一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌及其应用。本发明从胞苷酸生产菌株中克隆得到的胞苷激酶基因，重组菌经破碎后得到的粗酶液有着良好的催化活性和稳定性，加入胞苷、三磷酸腺苷（ATP）以及Mg2+，反应体系简单、条件温和、周期短、副产物少，而且清洁无污染，是一条简单、快速、高效的生产途径，其对底物胞苷以及ATP的转化率达到85％以上。
Description
技术领域
本发明属于胞苷酸制备领域，具体涉及一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌及其应用。
背景技术
5’-胞苷酸（Cytidine 5’-Monophosphate）别名：阿糖胞苷 5`-单磷酸盐; 单磷酸阿糖胞苷等，其多为白色或类白色结晶粉末，溶于水，不溶于乙醇。5’-胞苷酸为生物细胞内重要的生化物质，参与多种生理生化反应。工业上，5’-胞苷酸主要用于制造胞二磷胆碱、胞苷三磷酸、阿糖胞苷、聚肌胞等药物。近年来，亦可与其它 核苷酸配合添加奶粉中，以增强婴儿的免疫力。
5’-胞苷酸主要有两种生产方式，1）从RNA（核糖核酸）降解，然后经分离得到；2）从胞苷出发，用化学法在其5’位接上磷酸集团，形成5’-胞苷酸。第一种方法虽然一次可以得到四种产物，但除了胞苷酸之外，其它三种均成为副产物 ,再者RNA来源所受限制较多，且生产工艺中分离操作复杂，收率低；目前工业上合成5’-胞苷酸主要使用化学法，该方法主要缺点在于三废较多，腐蚀设备且不利于人员身体健康及工业化生产。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌及其应用，该方法催化合成周期短，成本低，适合大规模生产胞苷酸。
一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌，以大肠杆菌MG1655为来源，复制胞苷激酶基因，并构建到大肠杆菌BL21（DE3）中，即得重组大肠杆菌UCK；所述胞苷激酶基因的核苷酸序列如SCN NO.1所示。
作为改进的是，选取引物，通过PCR复制大肠杆菌MG1655上的胞苷激酶基因，再与载体pET28a连接，并转入克隆载体Trans1-T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序。
作为改进的是，所述引物中上游引物带有NcoI 酶切位点，下游引物带有EcoR I酶切位点。此选择的两个位点均为MG1655基因及载体pET28a中单一酶切位点，且价格便宜。有助于产业化降低成本。
上述一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌在合成胞苷酸上的应用。
上述应用的步骤如下，培养重组大肠杆菌至OD600至0.5~0.7时，加入IPTG 至终浓度0.5‰~1‰，20~30℃下诱导表达13~15h后破碎，收集上清液即粗酶液并测蛋白浓度；向蛋白浓度为6~8g/L的胞苷激酶粗酶液中加入浓度为30~35 mM 胞苷、30~35 mM 的三磷酸腺苷、8~10 mM MgCl2、磷酸钾缓冲液，搅拌均匀后在pH7.5~8.0、35~37℃条件下反应7~9h，完成酶促反应合成胞苷酸。
作为改进的是，挑选重组大肠杆菌至 LB/KanR 培养基中，在37℃、200rpm 条件下振荡至OD600≈1，然后转接至新鲜LB/KanR 培养基中继续培养至OD600≈0.5~0.7。
有益效果：
与先有技术相比，本发明一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌及其应用的优势在于：
1、采用此方法生产胞苷酸对底物胞苷以及ATP的转化率达到85％以上，可满足大规模工业生产要求。
2、重组表达菌株经破碎后分离上清，采用表达上清液直接进行催化反应，减少了酶的纯化、分离等操作步骤，极大地简化了工艺，节约成本。
3、酶催化反应反应过程较为温和，对环境、设备及操作人员均无害。
附图说明
图1为本发明中HPLC检测催化胞苷酸的生成，其中，（a）为ATP标准品；（b）为胞苷标准品，（c）为胞苷酸标准品，（d）为实施例胞苷酸；
图2为重组菌株BL21(DE3)-PET28a-UCK的平板形态；
图3为不同温度下诱导的蛋白表达情况。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例中未提及到的技术均为本领域常规技术，另外，使用的大肠杆菌Trans1-T1、pET28a等材料都是商业化产品，可直接购买。
实施例1 BL21(DE3)-PET28a-UCK表达菌株的构建
以大肠杆菌MG1655全基因组为模板，通过常规PCR扩增胞苷激酶蛋白的核苷酸编码序列。
所用上游引物带有Nco I 酶切位点，序列为：CATGCCATGGCAatgactgatcagtctcatcagt。
下游引物带有EcoR I 酶切位点，序列为CCGGAATTCttaGTGGTGGTGGTGGTGGTGttcaaagaactgacttattttcgct。
反应条件为：95℃ 2min ，95℃ 20s，50℃ 20s，72℃ 10s，共30个循环；72℃5min。得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将该序列与表达载体pET28a 用Takara 公司的Nco I 和EcoR I酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1 μL，Nco I 1 μL，EcoR I 1 μL，基因片段或pET28a 载体7 μL。酶切体系于37℃条件下反应2小时。将酶切产物连接，反应体系为：10×Ligase buffer 1 μL，T4 DNA Ligase(Takara) 1 μL，基因片段7μL，载体1 μL。连接于25℃下反应3小时。将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。PCR 筛选阳性菌株Trans1-T1-PET28a-UCK并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。
将阳性菌株接种至5ml LB/KanR 液体培养基，LB/KanR 液体培养基组成为蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠5 g/L，于37 ℃、200 rpm 条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pET28a-UCK。取2μL pET28a-UCK质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。PCR 筛选阳性菌株BL21(DE3)-PET28a-UCK。菌株平板形态如图2所示。
实施例2 BL21(DE3)-PET28a-UCK的诱导表达和菌体破碎
1、BL21(DE3)-PET28a-UCK的诱导表达
阳性菌株BL21(DE3)-PET28a-UCK接种至100 mL LB/KanR液体培养基，37 ℃、200 rpm条件下振荡培养至OD600≈1。按10:100 的比例接种于500 mL新鲜的LB/KanR 液体培养基，37℃、200 rpm 条件下振荡培养至OD600≈0.5~0.7，加入IPTG 至终浓度0.5‰~1‰，在20~30℃（如图3所示，25~30℃之间可溶性表达较多，30℃最佳）、200rpm条件下振荡培养13~15h。6000rpm 离心10min，收集菌体。
2、菌体破碎
将菌体用100 mM TrisHcl8.0 的缓冲液重悬，用高压匀质机破碎，条件为12000 psi，4℃，四个循环。6000 rpm 离心10 min 收集上清即粗酶液，Bradford 法测定蛋白浓度。
实施例3 催化合成CAMP
在试管中混合如下反应体系：向蛋白浓度为6~8g/L的胞苷激酶粗酶液中加入浓度为30~35 mM 胞苷、30~35 mM 的三磷酸腺苷、8~10mM MgCl2、磷酸钾缓冲液，搅拌均匀后在pH7.5~8.0、35~37℃条件下反应7~9h，完成酶促反应合成胞苷酸（胞苷酸通过液相检测图如1（d）所示，其对底物胞苷以及ATP的转化率达到85％以上）。用Agilent HC-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm,5μm），流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾; 流速0.8 ml·min-1; 检测波长为260 nm。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 642
<212> DNA
<213> 基因序列(Gene Sequence)
<400> 1
atgactgatc agtctcatca gtgcgtcatt atcggtatcg ctggcgcatc ggcttccggc 60
aagagtctta ttgccagtac cctttatcgt gaattgcgtg agcaagtcgg tgatgaacac 120
atcggcgtaa ttcccgaaga ctgctattac aaagatcaaa gccatctgtc gatggaagaa 180
cgcgttaaga ccaactacga ccatcccagc gcgatggatc acagtctgct gcttgagcat 240
ttacaagcgt tgaaacgcgg ctcggcaatt gacctgccgg tttacagcta tgttgaacat 300
acgcgtatga aagaaacggt gacggttgag ccgaagaagg tcatcattct cgaaggcatt 360
ttgttgctga cggatgcgcg tttgcgtgac gaacttaact tctccatttt cgttgatacc 420
ccgctggata tctgcctgat gcgccgcatc aagcgtgacg ttaacgagcg tgggcgttca 480
atggattcag tgatggcgca atatcaaaaa accgtgcgcc cgatgttcct gcaattcatt 540
gagccttcta aacaatatgc ggacattatc gtgccgcgcg gcgggaaaaa ccgcatcgcg 600
atcgatatat tgaaagcgaa aataagtcag ttctttgaat aa 642
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catgccatgg caatgactga tcagtctcat cagt 34
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccggaattct tagtggtggt ggtggtggtg ttcaaagaac tgacttattt tcgct 55
Claims (6)
1.一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌MG1655为来源，复制胞苷激酶基因，并构建到大肠杆菌BL21（DE3）中，即得重组大肠杆菌UCK；所述胞苷激酶基因的核苷酸序列如SCN NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌，其特征在于：选取引物，通过PCR复制大肠杆菌MG1655上的腺苷酸环化酶基因，再与载体pET28a连接，并转入克隆载体Trans1-T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序。
3.根据权利要求2所述的一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌，其特征在于：所述引物中上游引物带有Nco I 酶切位点，下游引物带有EcoR I 酶切位。
4.一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌在合成环磷酸腺苷上的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，培养重组大肠杆菌UCK至OD600至0.5~0.7时，加入IPTG 至终浓度0.5‰~1‰，20~30℃下诱导表达13~15h后破碎，收集上清液即粗酶液并测蛋白浓度；向蛋白浓度为6~8g/L的胞苷激酶粗酶液中加入浓度为30~35 mM 胞苷、30~35 mM 的三磷酸腺苷、8~10mM MgCl2、磷酸钾缓冲液，搅拌均匀后在pH7.5~8.0、35~37℃条件下反应7~9 h，完成酶促反应合成胞苷酸。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，挑选重组大肠杆菌UCK至 LB/KanR 培养基中，在37℃、200rpm 条件下振荡至OD600≈1，然后转接至新鲜LB/KanR 培养基中继续培养至OD600≈0.5~0.7。
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