CN111321101A

CN111321101A - 一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用

Info

Publication number: CN111321101A
Application number: CN202010150058.XA
Authority: CN
Inventors: 王昕�; 王静; 陈可泉; 马琛; 秦航; 欧阳平凯
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2020-03-06
Publication date: 2020-06-23

Abstract

本发明公开了一种利用CRISPR‑Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用。包括以下步骤：1制作含有Cas9质粒的大肠杆菌BL21（DE3）感受态；2、设计合成突变sgRNA；3、构建Donor DNA；4、将sgRNA质粒与Donor DNA采用电转化法转化至携带Cas9质粒的大肠杆菌感受态中，敲除cdd基因；5、将目标质粒pET28a‑UCK导入敲除菌株生产胞苷酸；本发明具有操作简便、cdd基因敲除成功率高且敲除菌株对底物转化率提高，适合工业化生产胞苷酸等优点。敲除菌株生产胞苷酸相较于未敲除菌株，其对底物胞苷以及ATP的转化率提高了15%，达到99%。

Description

一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因 cdd的方法及应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用。

背景技术

CRISPR-Cas系统是一种细菌的免疫防御系统，由细菌在长期抵御外源DNA的过程中进化而形成，能够降解入侵的外源DNA(病毒或噬菌体等)，广泛存在于细菌和古细菌中。CRISPR-Cas系统划分为三种类型：I型、II型和III型，其核心蛋白分别是Cas3、Cas9和Cas10。相对于I型和III型系统需要多种Cas蛋白参与反应，并且构成比较复杂的复合体，II型系统研究最为彻底，只需一个Cas9蛋白即能切割目的基因DNA。II型CRISPR-Cas9系统在目前基因编辑方面应用最为广泛。该系统主要由三部分组成：起靶向目的序列的crRNA、能够和crRNA配对连接的tracrRNA以及酶切目的序列的Cas9蛋白。CRISPR序列转录成熟的crRNA与tracrRNA通过碱基互补配对，形成部分具有双链的RNA结构，进而和Cas9蛋白形成复合体，剪切外源DNA。研究者将crRNA和tracrRNA整合在同一条单链中，设计出了长度为20bp左右的单链引导RNA(single guide RNA，sgRNA)，sgRNA有两个功能，即可以与目的DNA序列互补配对，同时引导Cas9蛋白，实现基因的敲除等功能。近年来，CRISPR-Cas9技术已经广泛应用于微生物的基因组编辑和功能研究，尤其在细菌的基因编辑方面，取得了很大的进展。

5’-胞苷酸（Cytidine 5’-Monophosphate）别名：阿糖胞苷 5`-单磷酸盐；单磷酸阿糖胞苷等，其多为白色或类白色结晶粉末，溶于水，不溶于乙醇。5’-胞苷酸为生物细胞内重要的生化物质，参与多种生理生化反应。工业上，5’-胞苷酸主要用于制造胞二磷胆碱、胞苷三磷酸、阿糖胞苷、聚肌胞等药物。近年来，亦可与其它核苷酸配合添加奶粉中，以增强婴儿的免疫力。5’-胞苷酸主要有两种生产方式，1）从RNA（核糖核酸）降解，然后经分离得到；2）从胞苷出发，用化学法在其5’位接上磷酸集团，形成5’-胞苷酸。第一种方法虽然一次可以得到四种产物，但除了胞苷酸之外，其它三种均成为副产物，再者RNA来源所受限制较多，且生产工艺中分离操作复杂，收率低；目前工业上合成5’-胞苷酸主要使用化学法，该方法主要缺点在于三废较多，腐蚀设备且不利于人员身体健康及工业化生产。

针对现有技术不足，我们发明了一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-UCK，该方法催化合成周期短，成本低。然而发酵生产经液相检测有副产物尿苷酸生产，通过查阅我们得知为胞苷脱氨酶基因cdd使底物胞苷转化为尿苷，经胞苷激酶转化为尿苷酸。从5’-胞苷酸行业的需求来看，虽然产量稳定增加，但是其副产物得产生影响了底物的高效利用。因此基因工程菌高产胞苷酸的改造成为生产应用中的重中之重。

发明内容

针对现有不足，本发明的目的在于一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用。

为了解决上述技术问题，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法，包括以下步骤：

步骤1，制作含有Cas9质粒的大肠杆菌BL21（DE3）感受态；

步骤2，设计合成突变sgRNA；

步骤3，构建Donor DNA；

步骤4，将sgRNA质粒与Donor DNA采用电转化法转化至携带Cas9质粒的大肠杆菌感受态中，敲除cdd基因，即得敲除cdd基因的大肠杆菌。

作为改进的是，步骤2中设计合成突变sgRNA时，选用的N20靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1。

作为改进的是，步骤2 中设计合成突变sgRNA的两条引物序列如SEQ ID NO .2和SEQ ID NO .3所示。

作为改进的是，步骤3中Donor DNA的序列为SEQ ID NO.4。

上述敲除cdd基因的大肠杆菌在产胞苷酸上的应用，包括以下步骤：

第一步，将目标质粒pET28a-UCK导入敲除菌株得到重组菌株BL21(DE3)-1-pET28a-UCK；

第二步，培养重组菌株BL21(DE3)-1-pET28a-UCK至OD₆₀₀至0.5~0.7时，加入IPTG 至终浓度0.5‰~1‰，20~30℃下诱导表达13~15h后破碎，收集上清液即粗酶液，并测蛋白浓度；

第三步，向蛋白浓度为6~8g/L的胞苷激酶粗酶液中加入浓度为30~35 mM 胞苷、30~35mM 的三磷酸腺苷、8~10mM MgCl₂、磷酸钾缓冲液，搅拌均匀后在pH7.5~8.0、35~37℃条件下反应7~9 h，完成酶促反应合成胞苷酸。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用的优势如下：

1、本发明敲除大肠杆菌基因的方法简单，效率高，成本低。

2、通过chop chop网站选择了胞苷脱氨酶基因cdd PAM区在第399位作为

N20靶位点，其识别效率最高，能够更好的帮助pCas9质粒进行切割，提高敲除效率。

3、敲除cdd基因，使大肠杆菌高效的利用胞苷产胞苷酸，提高了重组菌株对底物的利用率。敲除菌株生产胞苷酸相较于未敲除菌株，其对底物胞苷以及ATP的转化率提高了15%，达到99%。

附图说明

图1为重组菌株BL21(DE3)-pCas9的平板形态；

图2为突变sgRNA电泳图，其中泳道1为Marker，泳道2～3为sgRNA突变图；

图3为构建Donor DNA上下同源臂电泳图，其中泳道1为Marker，泳道2～3下同源臂，4~5为上同源臂；

图4为Donor DNA电泳图，其中泳道1为Marker，泳道2～3为Donor DNA；

图5为敲除后菌落PCR验证电泳图，其中泳道1为Marker，泳道2～9为敲除对应基因后片段大小。

图6为敲除后菌株与未敲除菌株生产胞苷酸的对比。

图7为检测到产物液相色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本实验中大肠杆菌Trans1-T1，大肠杆菌BL21(DE3)，质粒pCas9、sgRNA均为商业化物品，可以常规购买。

实施例1 制作含有Cas9质粒目的菌株且含有cdd基因的大肠杆菌感受态

1、将质粒pCas9电转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，用卡那抗性筛选出目的菌株

将2~5μg实验室库存的质粒pCas9加入到20~30 μL实验室库存大肠杆菌BL21(DE3)感受态，冰上预冷2~5 min；加入预冷的电转杯，条件为：200Ω、2.0kv电击；电击完成立即加入800-1000 μL LB培养基（LB培养基的配方为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L），30℃，2h培养；取100μL中的菌液涂LB抗性平板(卡那霉素)，30℃过夜培养；挑取单菌落，菌落PCR验证大肠杆菌BL21(DE3)是否含有pCas9质粒，构建成功的菌株命名为BL21(DE3)-cas9，其平板形态如图1所示。

2、制备经过L-阿拉伯糖诱导的带有pCas9质粒的感受态细胞

从BL21(DE3)-cas9菌株挑取单菌落接种于5mL~10mL含体积2‰的卡那霉素的LB液体培养基，30℃，200rpm，过夜培养；过夜培养后的菌液按照1%接种量接种于50mL含2‰卡那霉素的LB液体培养基，30℃，200rpm培养至OD₆₀₀约为0.2时，加入终浓度为30mM的L-阿拉伯糖（灭菌）诱导继续培养至OD₆₀₀约为0.4~0.6。

将培养液转移至50mL离心管中，冰浴25~30 min，4℃下4000~5000 rpm离心8~10min，弃上清，收集细胞；用40~50 mL预冷的无菌水将细胞吹吸混匀4℃下4000~5000 rpm离心8~10 min,(重复两次)，弃上清，收集细胞；用20~30 mL预冷的8~10 %(V/V)甘油吹吸混匀4℃下4000~5000 rpm离心8~10 min，弃上清，收集细胞，用初始菌液体积的预冷的8~10%(V/V)甘油将细胞吹吸混匀，以每管50~100 μL分装于预冷的1.5 mL离心管中，-80 ℃保存。

实施例2 设计合成突变sgRNA

1、cdd胞苷脱氨酶基因N20靶位点的选择

利用chop chop网站选择出胞苷脱氨酶基因cdd PAM区在第399位作为N20靶位点，所述的N20靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、设计合成突变sgRNA

使用snap gene软件打开实验室购买的sgRNA质粒图谱，用选择的N20序列代替原始的N20序列，设计两条引物序列cdd-F1（SEQ ID NO .2）和cdd-R1（SEQ ID NO .3）送予擎科公司合成；以sgRNA质粒为模板，引物cdd-F1和cdd-R1，进行PCR扩增。

PCR体系为：引物cdd-F1（10μM） 2 μL，cdd-R1（10μM） 2μL，5×Buffer 10μL，dNTPs（2.5mM）5μL，Fastpfu聚合酶：1μL，sgRNA质粒（100ng/μL）2μL，ddH₂O补足至50μL。

反应条件为：95℃ 2min ，95℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 15s，共30个循环；72℃5min。使用1％(1 g/100mL)琼脂糖凝胶对上述PCR产物行电泳，结果见图2，并使用天根胶回收试剂盒对琼脂糖凝胶电泳回收相应片段；将回收后的产物用DPN I酶进行37℃消化2h，

消化反应体系为：DPN I酶1μL，10×Buffer 1μL，胶回收产物8μL。将产物转化大肠杆菌Trans1-T1，PCR 筛选阳性菌株Trans1-T1-sgRNA并进行DNA测序，验证突变质粒构建正确。

实施例3 构建胞苷脱氨酶基因cdd Donor DNA片段

1、上下同源臂的构建

利用NCBI网站查出使用胞苷脱氨酶基因cdd 具体的碱基序列，并使用snap gene软件导入。选取该基因前314bp作为上同源臂，后394bp作为下同源臂，分别设计引物cdd-f-f(SEQ ID NO .5)、cdd-f-r(SEQ ID NO .6)、cdd-r-f(SEQ ID NO .7)、cdd-r-r(SEQ ID NO.8) 送予擎科公司合成，以大肠杆菌K12系列基因组为模板，引物cdd-f-f与cdd-f-r、cdd-r-f与cdd-r-r分别PCR扩增上下同源臂M1、M2。

PCR体系为引物 cdd-f-f/cdd-r-f（10μM） 2μL，cdd-f-r/cdd-r-r（10μM） 2μL，5×Buffer 10μL，dNTPs（2.5mM）5μL，Fastpfu聚合酶：1μL，大肠杆菌K12系列基因组（100ng/μL）2μL，ddH₂O补足至50μL。

反应条件为：95℃ 2min ，95℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 7s，共30个循环；72℃ 5min。使用1％(1 g/100mL)琼脂糖凝胶对上述PCR产物行电泳，结果见图3，并使用天根胶回收试剂盒对琼脂糖凝胶电泳回收上下同源臂M1、M2。

2、Donor DNA的合成

以M1、M2为模板，引物cdd-f-f(SEQ ID NO.5)、cdd-r-r(SEQ ID NO.8)通过overlap合成Donor DNA。

PCR体系为引物cdd-f-f（10μM） 2μL、cdd-r-r（10μM）2μL，5×Buffer 10μL，dNTPs（2.5mM）5μL，Fastpfu聚合酶：1μL，M1 15μL,M2 15μL,

反应条件为：95℃ 2min ，95℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 15s，共30个循环；72℃ 5min。

使用1％(1 g/100mL)琼脂糖凝胶对上述PCR产物行电泳，结果见图4，并使用天根胶回收试剂盒对琼脂糖凝胶电泳回收Donor DNA。

实施例4 胞苷脱氨酶基因cdd的敲除与验证

1、胞苷脱氨酶基因cdd的敲除

（1）取一管制作好的带有pCas9质粒的感受态细胞置于冰上融化2~5min；

（2）取10~15μL质粒加到上述融化好的感受态细胞中，轻轻混匀，置于冰上1min（DonorDNA：sgRNA=5：1，sgRNA≈100ng/μL）；

（3）将上述样品加入到预冷的2mm电转杯中，置于冰上5min；

（4）将电转仪电压设定为2.5kv，电击5~6ms，迅速加入1mL LB培养基，在

30℃、200rpm条件下复苏2h后，涂布至含50mg/mL卡那霉素和40mg/mL链霉素的固体LB平板于30℃过夜培养。

2、胞苷脱氨酶基因cdd的敲除验证

利用snap gene软件设计敲除的检测引物，分别在cdd-f-f以及cdd-r-r上下60bp左右，设计引物为检测上引cdd-JC-f （SEQ ID NO .9），检测下引cdd-JC-r（SEQ ID NO .10）送予擎科公司合成，从过夜培养的LB固体平板上挑取多个单菌落，进行PCR验证，单个PCR体系为：引物cdd-JC-f（10μM）0.4μL、cdd-JC-r（10μM）0.4μL、10×Buffer 1μL、dNTPs (2.5mM)0.8μL、Fast Taq聚合酶0.1μL、ddH₂O补足至10μL。

PCR反应条件为：94℃ 3min ，94℃ 5s，55℃ 15s，72℃ 10s，共30个循环；72℃10min。使用1％(1 g/100mL)琼脂糖凝胶对上述PCR产物行电泳，结果见图5所示。PCR产物条带大小和Donor DNA大小一样，送测PCR产物，测序结果显示碱基序列与Donor DNA一致，即敲除成功。

实施例5 敲除菌株生产胞苷酸

将目标质粒pET28a-UCK导入敲除菌株得到重组菌株BL21(DE3)-1-pET28a-UCK。培养重组大肠杆菌至OD₆₀₀至0.5~0.7时，加入IPTG 至终浓度0.5‰~1‰，20~30℃下诱导表达13~15h后破碎，收集上清液，即粗酶液并测蛋白浓度（采用的检测蛋白浓度方法为常见的考马斯亮蓝检测蛋白方法）；

向蛋白浓度为6~8g/L的胞苷激酶粗酶液中加入浓度为30~35 mM 胞苷、30~35 mM的三磷酸腺苷、8~10mM MgCl₂、磷酸钾缓冲液，搅拌均匀后在pH7.5~8.0、35~37℃条件下反应7~9h，完成酶促反应合成胞苷酸（通过液相检测，胞苷酸在4.6min出峰，其产物出峰色谱图如图7所示）。敲除菌株生产胞苷酸相较于未敲除菌株，其对底物胞苷以及ATP的转化率提高了15%，达到99%。（敲除后菌株与未敲除菌株生产胞苷酸对底物的利用率如图6所示）。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 基因序列(Gene sequence)

<400> 1

tttatgaatg aactgaacag 20

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttatgaatg aactgaacag gttttagagc tagaaatagc aagt 44

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgttcagtt cattcataaa actagtatta tacctaggac tgagc 45

<210> 4

<211> 708

<212> DNA

<213> 基因序列(Gene Sequence)

<400> 4

atgcatccac gttttcaaac cgcttttgcc caacttgcgg ataacttgca atctgcactg 60

gaacctattc tggcagacaa gtacttcccc gctttgttga ccggggagca agtctcatcg 120

ctgaagagcg caacggggct ggacgaagac gcgctggcat tcgcactact tccgctggcg 180

gcggcctgtg cgcgtacgcc attgtcgaat tttaatgttg gcgcaattgc gcgcggtgtg 240

agcggaacct ggtatttcgg tgccaatatg gaatttattg gtgcgacaat gcagcaaacc 300

gttcatgccg aacactttgg gccgaaagat ctggagatta aaacgctgct gatggacgaa 360

caggatcacg gctatgcgct gacgggtgat gcgctttctc aggcagcgat tgcggcggca 420

aaccgttcgc acatgcctta cagtaagtcg ccaagcggtg tcgcgctgga atgtaaagac 480

ggtcgtattt tcagtggcag ctacgctgaa aacgccgcat tcaacccgac tctgccaccg 540

ttgcagggag cgttaattct gttgaatctc aagggttatg attacccgga tatccagcgc 600

gcggttctgg cagaaaaagc cgatgcgccg ttgattcagt gggatgccac ctccgcaacg 660

ctgaaagctc tcggctgtca cagtatcgac cgagtgcttc tcgcttaa 708

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcatccac gttttcaaac cg 22

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggcccaaagt gttcggcatg aacggtttgc t 31

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgccgaacac tttgggccga aagatctgga g 31

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttaagcgaga agcactcggt cg 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggtctggca atggggactg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcaacagcag caagccgatc 20

Claims

1.一种利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，制作含有Cas9质粒的大肠杆菌BL21（DE3）感受态；

步骤2，设计合成突变sgRNA；

步骤3，构建Donor DNA；

2.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法，其特征在于，步骤2中设计合成突变sgRNA时，选用的N20靶位点的核苷酸序列如SEQID NO.1。

3.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法，其特征在于，步骤2 中设计合成突变sgRNA的两条引物序列如SEQ ID NO .2和SEQ IDNO .3所示。

4.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9技术敲除大肠杆菌中胞苷脱氨酶基因cdd的方法，其特征在于，步骤3中Donor DNA的序列为SEQ ID NO.4。

5.基于权利要求1所得敲除cdd基因的大肠杆菌在产胞苷酸上的应用，其特征在于，包括以下步骤：

第二步，培养重组菌株BL21(DE3)-1-pET28a-UCK至OD₆₀₀至0.5~0.7时，加入IPTG 至终浓度0.5‰~1‰，20~30℃下诱导表达13~15h后破碎，收集上清液即胞苷激酶粗酶液，测蛋白浓度；

第三步，向蛋白浓度为6~8g/L的胞苷激酶粗酶液中加入浓度为30~35 mM胞苷、30~35mM的三磷酸腺苷、8~10mM MgCl₂、磷酸钾缓冲液，搅拌均匀后在pH7.5~8.0、35~37℃条件下反应7~9 h，完成酶促反应合成胞苷酸。