CN114634945B - 一种MccY重组整合工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种MccY重组整合工程菌及其构建方法与应用。该MccY重组整合工程菌的构建方法包括如下步骤：(1)将sgRNA片段(SEQ ID NO.2)与T载体连接，得到pHsgRNA质粒；(2)将pCas9质粒转化大肠杆菌，并制成感受态细胞；然后将优化后的MccY的修复片段(SEQ ID NO.1)和pHsgRNA质粒转入感受态细胞中，经鉴定、培养、连续传代筛选消除双质粒的菌株，得到所述的MccY重组整合工程菌。本发明中构建得到的MccY重组整合工程菌无质粒无抗性基因，无需诱导剂，能够持续高效地分泌表达MccY，对鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、宋内志贺氏菌、痢疾志贺氏菌等有明显的抑制效果。

Description

一种MccY重组整合工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种MccY重组整合工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
近年来，抗生素的过度使用引发了很多问题，抗生素的耐药和多重耐药现象愈发受到关注。而在提出的替代方法中，天然抗菌剂有着极大的潜力，是下一代药物的有效材料。
小菌素(Microcin，Mcc)是低分子量、核糖体产生的、高度稳定的细菌抑制分子，是一种抗菌肽，参与肠道中肠杆菌科之间的竞争，具有热稳定性、耐酸性、以及对蛋白酶具有一定的抗性等显著优点。现已鉴定出大约15种小菌素，共分为两类，Ⅰ类小菌素小于5kDa，由质粒编码，Ⅱ类小菌素约5～10kDa，可分为质粒编码和染色体编码。不同的小菌素具有不同的抗菌机制，通过阻断靶细胞的重要功能从而达到抗菌的作用。与抗生素不同，它们通常在纳摩尔浓度下就具有活性。
目前对于小菌素的应用尚不普遍，研究较多的小菌素，如小MccJ25等，抗菌谱较窄。最新发现的MccY拓宽了小菌素的抗菌谱，包括几种代表性的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌菌株，有着极大的替抗潜力。但是，目前MccY的研究尚停留在质粒表达的层面，如何实现微生态制剂，如何安全地利用并高效、持续地放大生产MccY还需要进一步探索。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种MccY重组整合工程菌的构建方法。
本发明的另一目的在于提供所述方法构建得到的MccY重组整合工程菌。
本发明的再一目的在于提供所述MccY重组整合工程菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种MccY重组整合工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)将sgRNA片段与T载体连接，得到pHsgRNA质粒；其中，sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)将pCas9质粒转化大肠杆菌，并制成感受态细胞；然后将优化后的MccY的修复片段和步骤(1)中得到的pHsgRNA质粒转入感受态细胞中，经培养、连续传代筛选消除双质粒(pHsgRNA质粒、pCas9质粒)的菌株，得到所述的MccY重组整合工程菌；其中，优化后的MccY的修复片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
步骤(2)中所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌MG1655。
步骤(2)中所述的感受态细胞通过本领域的常规方法制备得到，优选为通过如下方法制备得到：将pCas9质粒通过热激的方式转化大肠杆菌感受态细胞，然后加入培养基进行培养，培养后进行鉴定；再将鉴定正确的菌株接入培养基中，放大培养，取菌体，于冰上用体积分数15％的甘油洗菌3～5次，制得感受态细胞。
步骤(2)中所述的培养基为LB培养基。
步骤(2)中所述的连续传代筛选消除双质粒通过如下方法实现：将转化后获得的重组菌株连续传代，挑取单菌落分别在含有30μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄青霉素的抗性平板、以及无抗生素的平板中进行穿刺筛选，找到对氯霉素和氨苄青霉素敏感的菌株，然后通过PCR 检测确认质粒丢失状态，筛选得到无质粒、无抗性基因的MccY重组整合工程菌。
所述的PCR检测所需的引物序列如下：
pCas9丢失检测引物：
上游引物：5’-GAGCTGGTGATATGGGATAG-3’；
下游引物：5’-CATTCATCCGCTTATTATCAC-3’；
pHsgRNA丢失检测引物：
上游引物：5’-GAGTGAGCTGATACCGCTCG-3’；
下游引物：5’-CTTCGCTATTACGCCAGCTG-3’。
所述的平板为LB固体平板。
所述的MccY重组整合工程菌的构建方法，还包括进一步将步骤(2)中得到的MccY重组整合工程菌利用引物进行PCR鉴定的步骤。
所述的PCR鉴定所需的引物序列如下所示：
hsds text-F：5’-gccgaagagacggaagttgc-3’；
hsds text-R：5’-ctcgcaggttacggtaagac-3’。
一种MccY重组整合工程菌，通过上述任一项所述的方法构建得到。
所述的MccY重组整合工程菌在制备小菌素MccY中的应用。
所述的MccY重组整合工程菌在制备小菌素MccY中的应用，为将上述MccY重组整合工程菌接种到培养基中进行培养，离心，取上清，得到小菌素MccY。
所述的培养的转速为150～300rpm/min；优选为200rpm/min。
所述的培养的温度优选为37±2℃。
所述的培养的时间为4小时以上；优选为4～24小时。
所述的MccY重组整合工程菌和/或通过所述的MccY重组整合工程菌表达的小菌素MccY在制备抗菌剂方面的应用。
所述的菌为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中的至少一种；优选为鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、宋内志贺氏菌和痢疾志贺氏菌中的至少一种；更优选为对鼠伤寒沙门氏菌。
所述的大肠杆菌为大肠杆菌MG1655和大肠杆菌BL21中的至少一种。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明以大肠杆菌MG1655为基础菌株，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在基因组hsds处进行MccY的重组整合，具体步骤为：(1)参考NCBI基因库中MccY全基因序列，将mcyA表达方向与mcyBCD基因表达方向调整一致，并在前面插入启动子基因，整合进 pet28a(+)载体上，构建出有表达活性的MccY质粒；然后以此质粒为模板，通过PCR扩增构建出MccY修复片段；(2)通过PCR扩增得到sgRNA片段，将sgRNA片段与T载体无缝连接，构建出质粒pHsgRNA；(3)将pCas9质粒转入大肠杆菌，并制成感受态，将MccY修复片段和pHsgRNA质粒同时转入制备好的感受态，鉴定，得到含有质粒的MccY重组整合工程菌；(4)优化mcyA，重复上述构建步骤，并更换sgRNA的启动子，得到含有质粒的优化后的MccY重组整合工程菌，最后找到活性最高的重组菌株，在含有抗生素和无抗生素的LB 培养基中连续传代筛选消除双质粒的菌株，得到无质粒的MccY重组整合工程菌，该菌株重组整合了优化后的MccY序列，能够持续高效地分泌表达MccY，对鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌BL21、宋内志贺氏菌、痢疾志贺氏菌等有明显的抑制效果。
2、本发明构建得到的MccY重组整合工程菌无任何外源质粒，避免了质粒横向转移的风险，且无任何抗性基因，不会对环境产生污染。
3、本发明构建得到的MccY重组整合工程菌表达MccY无需任何诱导剂的参与，可稳定持续地表达MccY，制备简单，成本低，可用于放大生产，有用于微生态制剂的潜在价值。
附图说明
图1是MccY重组整合工程菌的菌落PCR鉴定结果图(图中，泳道M：marker DL10000；泳道1～10以及12～18：MG1655空菌株；泳道11：MccY重组整合工程菌)。
图2是MccY重组整合工程菌对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果图。
图3是优化MccY基因序列后的MccY重组整合工程菌的菌落PCR鉴定结果图(图中，泳道M：marker DL10000；泳道1、2、4、5、7、8、9为疑似MccY重组整合工程菌)。
图4是优化MccY基因序列后的MccY重组整合工程菌再次进行菌落PCR的鉴定结果图 (图中，泳道M：marker DL10000；泳道1、2、4、5、7、8、9为MccY重组整合工程菌)。
图5是MccY重组整合工程菌的抑菌情况图(按逆时针，分别为1、2、4、8、16、32倍稀释上清)。
图6是目标产物MccY的质谱分析结果图。
图7是MccY重组整合工程菌的表达产物的抑菌效果图(按顺时针，分别为第4、8、12、 16、20、24h上清)。
图8是MccY重组整合工程菌分泌的MccY对鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌BL21、宋内志贺氏菌、福氏志贺氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌的抑制效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和生物材料(如菌株等)均可通过市售获得。
实施例1
1、MccY重组整合工程菌的构建
以大肠杆菌MG1655(菌种编号ATCC700926)为基础菌株，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在基因组hsds处进行MccY的重组整合，构建MccY重组整合工程菌。
1.1质粒构建
参考NCBI基因库中MccY全基因序列(NCBI序列号：AAFXLL010000013.1)，将mcyA表达方向与mcyBCD表达方向调整一致，并在前面插入启动子基因，其序列如SEQ ID NO.3所示，mcyA在SEQ ID NO.3第50bp～211bp，mcyBCD在SEQ ID NO.3第227bp～4163bp，然后委托通用生物(安徽)股份有限公司将MccY序列整合进pet28a(+)载体上。构建出具有 MccY表达活性的质粒pet28a-MccY。
1.2扩增修复片段
以步骤1.1构建的质粒pet28a-MccY为模板，用表1中引物MccY扩增出带有MccY全基因的片段一；再以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，用表1中上臂引物(上臂F、R)扩增出片段二，下臂引物(下臂F、R)扩增出片段三；然后以片段一、片段二、片段三为模板，以上臂F和下臂R为引物，扩增出MccY的修复片段。表2和表3分别为PCR反应体系和反应程序。
表1
表2PCR反应体系(25μL)
成分 用量(μL)
2×Master Mix酶 12.5
H2O 9.5
上游引物 1
下游引物 1
模板 1
表3PCR反应程序
1.3构建pHsgRNA质粒
以表4为引物(表4中的引物F/R有重复序列，即为引物也为模板)，表5为反应体系，表6 为PCR反应程序，扩增出sgRNA片段。以表7为连接反应体系，将sgRNA片段与T载体连接(T 载体购自宝日医生物技术有限公司)，得到带有sgRNA的质粒pHsgRNA。将质粒热激转化进 DH5α菌株中，抽质粒得到高浓度pHsgRNA质粒。其中，sgRNA片段的序列(SEQ ID NO.4)如下所示：
5’-ccctgatggctagctcagtcctagggattatgctagcatcttaactgaattacgtaagttttagagctagaaatagcaagttaaaataag gctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc-3’。
表4
引物名称 序列
sgRNA-F 5’-ccctgatggctagctcagtcctagggattatgctagcatcttaactgaattacgtaagttttagagctagaaatagcaagtta-3’
sgRNA-R 5’-gcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctc-3’
表5sgRNA的PCR反应体系(25μL)
成分 用量(μL)
2×Taq酶 12.5
H2O 10.5
上游引物 1
下游引物 1
表6sgRNA的PCR反应程序
表7连接体系
1.4MccY重组整合工程菌的构建及鉴定
通过热激转化将pCas9质粒(购自addgene)导入大肠杆菌MG1655感受态中：将5μL的pCas9 质粒加入MG1655感受态中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴90秒，冰浴2分钟，加入1mLLB培养基放入200rpm/min的37℃摇床复苏两小时，涂板，鉴定。
制备感受态：将鉴定正确的菌株接入100mL培养基中，37℃、200rpm/min摇床培养至 OD600为0.8左右。取菌体，在冰上用15％(v/v)甘油洗菌3～5次，分装成10管，每管100μL，置于冰上备用。
转化：分别加入5μL步骤1.2、1.3中构建出的MccY修复片段和pHsgRNA质粒到上述制备的感受态中，轻轻吹打混匀，将全部液体转移至电转杯中，电转。电转参数：电压1800V，电容25μF，电阻200Ω，电转完立刻加入1mL LB培养基，混匀，转移至1.5mL离心管内，置于200rpm/min的37℃摇床复苏2小时。涂板。置于37℃培养箱培养24小时。
鉴定菌株：用表8引物进行PCR检测，扩增出大肠杆菌MG1655空菌株的大小为2500bp左右，MccY重组整合工程菌大小为7000bp左右，结果如图1所示：阳性转化板上随机挑取18个单菌落PCR，有1个为重组菌株，大小在7000bp左右。
表8检测引物
引物名称 序列
hsds text-F 5’-gccgaagagacggaagttgc-3’
hsds text-R 5’-ctcgcaggttacggtaagac-3’
1.5检测鉴定正确的MccY重组整合工程菌活性
1.5.1将鉴定正确的MccY重组整合工程菌接种于25mL LB培养基中，置于200rpm/min 的37℃摇床摇24小时，取1mL菌液，离心，去菌体保留上清，并用0.22μm过滤器过滤除菌，按2倍倍比稀释至32倍。
1.5.2接种一环鼠伤寒沙门氏菌(菌种编号ATCC 14028)到25mL LB液体培养基中，200rpm/min的37℃摇床培养至OD600为3左右。
1.5.3融化琼脂的质量分数为1.5％的硬琼脂LB培养基，倒平板，约10mL/皿，开盖静置 15min至凝固。融化琼脂的质量分数为0.5％的软琼脂LB培养基，待软琼脂培养基冷却至45℃左右，往瓶中加入体积分数1％的鼠伤寒沙门氏菌菌液(1.5.2制备)，混匀后立刻倒入已倒好的硬琼脂上层，每皿约15mL，铺平，开盖静置15min至凝固。待凝固后，将平皿划分为6 等分的区域，分别在每等分表面点6μL上述1.5.1中倍比稀释后的上清，晾10min后倒置放入37℃恒温培养箱培养过夜，观察抑菌效果。
1.5.4结果如图2所示，按照顺时针分别为1、2、4、8、16、32倍稀释上清的抑菌情况，到4倍稀释仍有微弱抑菌效果。
1.6优化MccY基因序列
优化MccY中mcyA基因密码子，其序列如SEQ ID NO.5所示，然后委托通用生物(安徽)股份有限公司将优化后的序列整合进pet28a(+)载体上，构建得到质粒pet28a-MccYˊ。
以上述优化后的质粒pet28a-MccYˊ为模板，重复步骤1.2～1.4，优化后的获得的扩增修复片段如SEQ ID NO.1所示；其中，构建pHsgRNA质粒时，以表9引物为模板，更改了sgRNA 启动子，减少假阳性，更改后的sgRNA片段的序列(SEQ ID NO.2)如下所示：
5’-ccttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagcatcttaactgaattacgtaagttttagagctagaaatagcaagttaaaataag gctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc-3’。
表9
引物名称 序列
sgRNA-F 5’-ccttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagcatcttaactgaattacgtaagttttagagctagaaatagcaagtta-3’
sgRNA-R 5’-gcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctc-3’
结果如图3所示，阳性转化板上随机挑取9个单菌落PCR，有7颗疑似为重组菌，大小在7000bp左右，但因为本底的影响，2500bp左右也有条带，无法确认。将这七颗单菌落转接，再次PCR，结果如图4所示，7颗单菌落均为重组菌。
重复步骤1.5，检测鉴定正确的7颗重组菌的抑菌活性，挑出抑菌活性最高的菌株。活性最高的重组菌株抑菌情况如图5所示，按照逆时针分别为1、2、4、8、16、32倍稀释上清的抑菌情况，可见稀释到16倍仍有微弱抑制。
1.7消除双质粒
1.7.1把步骤1.6鉴定出的活性最高的重组菌株在无抗生素的LB培养基中连续传代，挑取单菌落分别在含有抗生素(30μg/mL氯霉素、100μg/mL氨苄青霉素)和无抗生素的平板(LB 固体平板)中穿刺筛选，最终找到对氯霉素和氨苄青霉素敏感的菌株，通过PCR确认质粒丢失状态。pCas9丢失检测引物：上游引物5’-GAGCTGGTGATATGGGATAG-3’，下游引物5’-CATTCATCCGCTTATTATCAC-3’。pHsgRNA丢失检测引物：上游引物5’-GAGTGAGCTGATACCGCTCG-3’，下游引物5’-CTTCGCTATTACGCCAGCTG-3’。最终得到无质粒、无抗性基因的MccY重组整合工程菌。
1.7.2表达MccY
将鉴定出的活性最高的MccY重组整合工程菌接种于100mL LB培养基中，不需要加抗生素和诱导剂，置于200rpm/min的37℃摇床摇24小时，分别在第4、8、12、16、20、24 小时各取2mL菌液，离心，去菌体保留上清，并用0.22μm过滤器过滤除菌，-20℃保存。
1.7.3高压液相色谱法分析
取1mL表达了24小时的MccY重组整合工程菌的上清，用超高压液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱联用仪(美国Agilent公司，型号：UPLC1290-6540BQ-TOF)检测上清中的MccY 的浓度。流动相A：100％乙腈，起始浓度5％(v/v)；流动相B：100％水加0.2％(v/v)甲酸，起始浓度95％(v/v)；柱温25℃；检测波长214nm；流速0.5mL/min；按照表10进行梯度洗脱。
表10
时间(min) A(％) B(％)
20 50 50
30 90 10
35 10 90
结果如图6所示，质谱分析出现目标物质相一致的特征离子峰742.82，MccY成功在工程菌中表达并分泌，蛋白浓度为3.6mg/L。
1.7.4检测不同表达时间的MccY重组整合工程菌的抗菌活性
接种一环鼠伤寒沙门氏菌(菌种编号ATCC 14028)到25mL LB液体培养基中，200rpm/min 的37℃摇床培养至OD600为3左右。
融化琼脂的质量分数为1.5％的硬琼脂LB培养基，倒平板，约10mL/皿，开盖静置15min 至凝固。融化琼脂的质量分数为0.5％的软琼脂LB培养基，待软琼脂培养基冷却至45℃左右，往瓶中加入体积分数1％的鼠伤寒沙门氏菌菌液，混匀后立刻倒入已倒好的硬琼脂上层，每皿约15mL，铺平，开盖静置15min至凝固。待凝固后，将平皿划分为6等分的区域，按照顺时针方向分别在每等分表面点6μL MccY重组整合工程菌所表达的第4、8、12、16、20、24h上清(1.7.2制得)，晾10min后倒置放入37℃恒温培养箱培养过夜，观察抑菌效果。
结果如图7所示，表达了4小时到24小时的上清均有抑菌圈，且随着时间的增加，抑菌效果越明显。
1.7.5定殖抑菌
融化琼脂的质量分数为1.5％的硬琼脂LB培养基，在生物安全柜中倒平板，约10mL/皿，开盖静置15min至凝固，刮取一环1.7.1中筛选得到的MccY重组整合工程菌融于1mL无菌水中，混匀，吸取10μL戳进平皿中间的琼脂并缓缓打出，晾10min，放进37℃培养箱培养 24h后，取出，正置于生物安全柜中，开盖，紫外照射1h，杀死细菌，盖盖备用。
融化琼脂的质量分数为0.5％的软琼脂LB培养基，待软琼脂培养基冷却至45℃左右，往瓶中按体积分数1％加入不同的指示菌，包括鼠伤寒沙门氏菌(菌种编号ATCC14028)、大肠杆菌MG1655(菌种编号ATCC700926)、大肠杆菌BL21(购自NEB)、宋内志贺氏菌(菌种编号ATCC 25931)、痢疾志贺氏菌(菌种编号CMCC(B)51252)、福氏志贺氏菌(菌种编号ATCC 12022)、枯草芽孢杆菌(菌种编号ATCC 6633)、金黄色葡萄球菌(菌种编号ATCC29213)，混匀后立刻倒入上述紫外照射1h后的菌板上层，每皿约15mL，铺平，开盖静置15mins 至凝固，放进37℃培养箱培养24h。
结果如图8所示，MccY重组整合工程菌定殖培养24h后，分泌出了大量MccY，能够抑制鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌BL21、宋内志贺氏菌、痢疾志贺氏菌的生长，形成了大小不一的抑菌圈。但对福氏志贺氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果不明显。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种MccY重组整合工程菌及其构建方法与应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5456
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 优化后的MccY的修复片段
<400> 1
gtttggtggg gtgaaggaat gagtgcgggg aaattgccgg aggggtgggt tatcgcccca 60
gtatctacgg tcacaactct aatccgagga gtaacgtata aaaaagagca ggcaataaat 120
tatctaaaag atgattattt gcctcttatc cgtgcgaaca atattcagaa tggcaagttt 180
gatactacgg acttggtttt tgttcctaaa aatcttgtta aagaaagtca aaaaatatct 240
cctgaagata ttgttattgc aatgtcatca gggagcaaat ccgtagttgg taaatccgca 300
catcagcatc taccatttga atgtagtttc ggcgcatttt gcggtgtatt acgtcctgaa 360
aaacttatat tttctggttt tattgctcat ttcacaaaat cttctcttta tcgaaacaaa 420
atttcatcac tttctgctgg tgcaaatatt aataatatta agccggcaag ctttgatttg 480
ataaatatac caatcccacc acttgccgaa caaaaaatca tcgctgaaaa actcgatacg 540
ctgctggcgc aggtagacag caccaaagca cgttttgagc aaatcccaca aatcctgaaa 600
cgttttcgtc aagcggtatt ggggggcgca gttaatggaa aattgacagt tgacagctag 660
ctcagtccta ggtataatgc tagcctaagg aagctaaaat gtttaagaaa ttattcagca 720
gcagcaaagg tcatgccgtt aagaaaatac caggggtggt acgaatacaa acccctgcct 780
ctcaacttac aaagggtgga cgtgggcaca ttgctgaata tttcagtggt ccaattaccc 840
aagtaagttt ttatggatga agcagggaga acattatgac tcgttatggc ttcacccggt 900
acaaaaccga tctagtgata cttgatgctg ttaaagatga attctacctg ctgcctggcg 960
caggtcagtt tctggaagac agggctgaat tgctcaagcg gtacccacaa ctgtgtgagt 1020
atctggatag tgagcattat atcggaagta cagcggagaa taaaaacctc tcttttctcg 1080
aagaacgttg gttgatgcct gaacctgtaa acgtatcaac cctcccctcc ttttttcagc 1140
gaatgatgct actggcaaaa atactgtatt acagtaaaag catagaaaaa aaggggatgg 1200
gatggattta taataaaaac aaaagagacg caaaacctgc cgctatgtct gcaaatcagg 1260
agattataat tcaggagacg gtaagtacag tttcatcact tttctgtatt aatatgttca 1320
aatcagattg cctgacatac tcattcactt taaaaaatgc actatattcc cgaggagttg 1380
atgccagact ggtaattgga gtccggactc aaccatttta cagtcatgca tgggttgaga 1440
tcgaaggtaa catcatcaat gatgaccctg acctgagaga taagttgtct gtcattgcag 1500
agatataaat atgagaaatt ccttcataca gtttaaagaa aaaaaaatca cactgaactt 1560
ttgtgatgcg ttaacagtgt ttcggaatga tcatgttaca gttatgctta aaggtaaggc 1620
atatttaaaa aacaaaggcc taacagttga aggtatagcc agagaagttg tttcaagagg 1680
cgtatataac gtaattaatg aattaactgg cattttctgt gcttttatat tccatgaaaa 1740
ttatatctat atgggcagga gcatgcattc cggccctcag ttgttttatc atattaatgg 1800
ggatgcgcta tacatcgcag ataaaataag tgaattaatt aaattacctg gttttacagg 1860
cagcctaaat ttgcgtgtgg cgcagaaata tcttaatgga tgccgtaata atgacaatga 1920
ttcttttatt accggagttc ataaaattaa caacggtgaa tttgtaaaat ttgattatca 1980
actttcctct acttctgtca tcgatgagtt ctgtattaag aaaaaaaacg actctgtcat 2040
tgataatgtc atatctaata tcgaaatgac acatgaaaac agagatataa cattgctttt 2100
ctcaggaggg tttgattcct cactggtttt tcatgccctc aaagaattgg gatttatgtt 2160
cagatcttgt tattatgttt ctgagtattc tgatgacagc gaaatggaat ttgcccgtag 2220
gtattgctta aagtatggcg tggaattcgc ggctataaat aaaaaaattg atttcaatga 2280
agagcattat tatgaattaa atcctgacgt cccggatgag atcccattag ctcctgagtt 2340
atcatgtgag tcagaggaat cttatgggtt gaagagtgaa aatggttttt taatctgtgg 2400
tcatggcggg gatcatattt ttggtcagaa tccatctgta ctgtttgggc ttgatgccct 2460
tcgtaagcat ggtataaaaa ccatgcataa aaaaatggtt gaatattcct gccttaaggg 2520
attgaagtac aaggatattt ttattaaaaa catggctgcg ttaagacaaa aaccggcaat 2580
gtatacactg gcaaaagatg aacacatctc tactatgagg ctggcatccg ctcagttctt 2640
ttctgttgat atacgcaata aagtaaacat attcacacca ttcttattta aaaatattgt 2700
acagcaccat gtttcactgc ctgtttatga gttatttaac caacaatatg accggtatcc 2760
catgcgattt gaggcattca gtcgttacgg gtcagatatc ttctggaaga aatcaaagag 2820
gtcttcttca cagcttattt tcagaatcct ttctgaaaaa tgtgaaaata tagccaatgc 2880
gattgaacaa tctggccttg ctgatgccat gaatattaat cattctgaat taagtaaaga 2940
tttgtatgaa aacactagag ttctattgac agatcgatta ccttatctca ttagtctgta 3000
ccaactggca aaatacatgc agattcacag aatcaatatt tgaaggtgtt tatgtcaaat 3060
tatatcaaga cttcgcttcc agcttacata tactcactaa tggatagcaa agggagggtt 3120
ttatttttcg gcatgctttt tgttacatct ctttcatcca ttataatatc agtttcacct 3180
ttcttgcttg caaaaattac cgatttatta gtgggttacc agtctagccg gggtagtgat 3240
ttcagtatta actatcttat tatattatca tgcttgtata tgttctgtgt gatatacaat 3300
aaaaccagtt cgtttctatt tatggtactc cagagcaatc ttcgcataag aatttcgaaa 3360
aaaatgtccc tacgctacct ggaggcactt tataaggaag atattaataa gcttgataaa 3420
aacaatgcag gatttacaac acaacgtctc aatcaggctt ctaacgacat ttatatcctt 3480
gtaaggaatg ttgctcaaaa tatactctca cctgcaattc aacttatatc ggcagttttt 3540
gttgtgttat caactcgtga ctggttctca gccagtgtat ttttagtata catcgttatt 3600
tttattatat tcaatgtgag gctaactgat tcattagcct ccctgcgtaa gaacagtatg 3660
gatatcaccc ttcagtcata tagtttgtta tctgataccg ttgacaacat gattggggca 3720
aagaaaaata atgctctcaa gcaagtttca gatcgttatg aacaagctct aacgaccgaa 3780
agtaaagcac agcaaaaatt ctggaatttt agtgcctggg ttctcttatt aaattccgca 3840
cttgctgtta ttttatttgg tgcagttttt tcttataatc tttcgggcgt tattaatgga 3900
agtgcatcca ttggccattt catcatgatc acctcctata ttatacttct ttctacgcca 3960
gtagagaata taggttctct tctcagtgaa atacgacaat caatattcag tcttgagggt 4020
tttctcgctc atcataaaga tgccgataac tgttctaatg ctaataataa tgttttaact 4080
aagtcgaatg gtaaaacaaa catatccatc aaagaacttt catttggata cgttacaggg 4140
aagcagatcc ttaaaaatat aaatataaaa cttacagcag gtaaaatata ttctttgaca 4200
ggccctagtg gctcaggaaa atcaacgctt gttaagctta tttcagggta ctacagtaat 4260
tattcgggtg ggatttacct taatgatgtt tcgctgcagg atctctgtga tgaggaactt 4320
aacgaaacca tttatcatct tacccaggat gattatattt tcatggatac ccttcgcttt 4380
aatcttcgcc tggcccggta cgatgcatca gagaaggaga tgcttgatgt gctcagtctt 4440
gctaacctat ctaagatagg taatgaaccc gttagtctgg atacatctct tacgagtaaa 4500
ggtaataact attctggagg gcagaaacaa aggctctctc ttgcacgact atttttacgc 4560
tctccgtctg taattatcat cgatgaggca acatcagctc ttgattacat taatgaatct 4620
gaaataatga cctcaataaa aaaatatttt cctgatgcgc tgataataaa tattagtcac 4680
cgcgtaagcc ttcttgagtg ctctgactat gtttatgttc tcgacgatgg gcagattgtc 4740
gcttcaggtc aattccatga actgaaggcc agcaactgtt atattaacgg cctggcatca 4800
gctacagaat aaccaatact acgcattagt tctgtacgtg ctggccatgt agatcaaaac 4860
gatattcggt ttctagaatg ttcagaaagt gaactaaacc gccacaaatt acaagatgga 4920
gatcttttat ttactcgcta taacggaagt ttagaatttg ttggtgtttg tgggttattg 4980
aaaaaattac aacatcaaaa tttgctatat cctgataaac ttattcgagc tcgattaacc 5040
aaagatgctt taccagaata tatcgaaata tttttttcat ccccctcagc acgaaatgca 5100
atgatgaact gcgtgaaaac aacttctggt caaaaaggta tttcaggaaa agatatcaaa 5160
tcccaagttg ttttattacc tccagtaaaa gaacaagccg aaatcgttcg ccgcgtcgag 5220
caactcttcg cctacgccga caccatagaa aaacaggtca acaacgcctt agcccgcgtc 5280
aacaacctga cgcaatccat cctggcaaaa gcgttccgtg gtgaacttac cgcccagtgg 5340
cgggccgaaa acccggattt gatcagcgga gaaaacagcg ccgccgcgtt gctggaaaaa 5400
atcaaagctg aacgcgcagc tagcgggggt aaaaaagcct cacgtaaaaa atcctg 5456
<210> 2
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 更改后的sgRNA片段
<400> 2
ccttgacagc tagctcagtc ctaggtataa tgctagcatc ttaactgaat tacgtaagtt 60
ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc 120
accgagtcgg tgc 133
<210> 3
<211> 4163
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 优化前MccY序列
<400> 3
ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagcctaag gaagctaaaa tgtttaaaaa 60
attattttcc agctctaaag gtcatgcagt aaaaaaaatt ccaggtgttg ttagaattca 120
gacaccagcc tcacaattaa ctaaaggagg acgtggtcac attgcggagt attttagtgg 180
ccctatcaca caagtcagct tttatggctg aagcagggag aacattatga ctcgttatgg 240
cttcacccgg tacaaaaccg atctagtgat acttgatgct gttaaagatg aattctacct 300
gctgcctggc gcaggtcagt ttctggaaga cagggctgaa ttgctcaagc ggtacccaca 360
actgtgtgag tatctggata gtgagcatta tatcggaagt acagcggaga ataaaaacct 420
ctcttttctc gaagaacgtt ggttgatgcc tgaacctgta aacgtatcaa ccctcccctc 480
cttttttcag cgaatgatgc tactggcaaa aatactgtat tacagtaaaa gcatagaaaa 540
aaaggggatg ggatggattt ataataaaaa caaaagagac gcaaaacctg ccgctatgtc 600
tgcaaatcag gagattataa ttcaggagac ggtaagtaca gtttcatcac ttttctgtat 660
taatatgttc aaatcagatt gcctgacata ctcattcact ttaaaaaatg cactatattc 720
ccgaggagtt gatgccagac tggtaattgg agtccggact caaccatttt acagtcatgc 780
atgggttgag atcgaaggta acatcatcaa tgatgaccct gacctgagag ataagttgtc 840
tgtcattgca gagatataaa tatgagaaat tccttcatac agtttaaaga aaaaaaaatc 900
acactgaact tttgtgatgc gttaacagtg tttcggaatg atcatgttac agttatgctt 960
aaaggtaagg catatttaaa aaacaaaggc ctaacagttg aaggtatagc cagagaagtt 1020
gtttcaagag gcgtatataa cgtaattaat gaattaactg gcattttctg tgcttttata 1080
ttccatgaaa attatatcta tatgggcagg agcatgcatt ccggccctca gttgttttat 1140
catattaatg gggatgcgct atacatcgca gataaaataa gtgaattaat taaattacct 1200
ggttttacag gcagcctaaa tttgcgtgtg gcgcagaaat atcttaatgg atgccgtaat 1260
aatgacaatg attcttttat taccggagtt cataaaatta acaacggtga atttgtaaaa 1320
tttgattatc aactttcctc tacttctgtc atcgatgagt tctgtattaa gaaaaaaaac 1380
gactctgtca ttgataatgt catatctaat atcgaaatga cacatgaaaa cagagatata 1440
acattgcttt tctcaggagg gtttgattcc tcactggttt ttcatgccct caaagaattg 1500
ggatttatgt tcagatcttg ttattatgtt tctgagtatt ctgatgacag cgaaatggaa 1560
tttgcccgta ggtattgctt aaagtatggc gtggaattcg cggctataaa taaaaaaatt 1620
gatttcaatg aagagcatta ttatgaatta aatcctgacg tcccggatga gatcccatta 1680
gctcctgagt tatcatgtga gtcagaggaa tcttatgggt tgaagagtga aaatggtttt 1740
ttaatctgtg gtcatggcgg ggatcatatt tttggtcaga atccatctgt actgtttggg 1800
cttgatgccc ttcgtaagca tggtataaaa accatgcata aaaaaatggt tgaatattcc 1860
tgccttaagg gattgaagta caaggatatt tttattaaaa acatggctgc gttaagacaa 1920
aaaccggcaa tgtatacact ggcaaaagat gaacacatct ctactatgag gctggcatcc 1980
gctcagttct tttctgttga tatacgcaat aaagtaaaca tattcacacc attcttattt 2040
aaaaatattg tacagcacca tgtttcactg cctgtttatg agttatttaa ccaacaatat 2100
gaccggtatc ccatgcgatt tgaggcattc agtcgttacg ggtcagatat cttctggaag 2160
aaatcaaaga ggtcttcttc acagcttatt ttcagaatcc tttctgaaaa atgtgaaaat 2220
atagccaatg cgattgaaca atctggcctt gctgatgcca tgaatattaa tcattctgaa 2280
ttaagtaaag atttgtatga aaacactaga gttctattga cagatcgatt accttatctc 2340
attagtctgt accaactggc aaaatacatg cagattcaca gaatcaatat ttgaaggtgt 2400
ttatgtcaaa ttatatcaag acttcgcttc cagcttacat atactcacta atggatagca 2460
aagggagggt tttatttttc ggcatgcttt ttgttacatc tctttcatcc attataatat 2520
cagtttcacc tttcttgctt gcaaaaatta ccgatttatt agtgggttac cagtctagcc 2580
ggggtagtga tttcagtatt aactatctta ttatattatc atgcttgtat atgttctgtg 2640
tgatatacaa taaaaccagt tcgtttctat ttatggtact ccagagcaat cttcgcataa 2700
gaatttcgaa aaaaatgtcc ctacgctacc tggaggcact ttataaggaa gatattaata 2760
agcttgataa aaacaatgca ggatttacaa cacaacgtct caatcaggct tctaacgaca 2820
tttatatcct tgtaaggaat gttgctcaaa atatactctc acctgcaatt caacttatat 2880
cggcagtttt tgttgtgtta tcaactcgtg actggttctc agccagtgta tttttagtat 2940
acatcgttat ttttattata ttcaatgtga ggctaactga ttcattagcc tccctgcgta 3000
agaacagtat ggatatcacc cttcagtcat atagtttgtt atctgatacc gttgacaaca 3060
tgattggggc aaagaaaaat aatgctctca agcaagtttc agatcgttat gaacaagctc 3120
taacgaccga aagtaaagca cagcaaaaat tctggaattt tagtgcctgg gttctcttat 3180
taaattccgc acttgctgtt attttatttg gtgcagtttt ttcttataat ctttcgggcg 3240
ttattaatgg aagtgcatcc attggccatt tcatcatgat cacctcctat attatacttc 3300
tttctacgcc agtagagaat ataggttctc ttctcagtga aatacgacaa tcaatattca 3360
gtcttgaggg ttttctcgct catcataaag atgccgataa ctgttctaat gctaataata 3420
atgttttaac taagtcgaat ggtaaaacaa acatatccat caaagaactt tcatttggat 3480
acgttacagg gaagcagatc cttaaaaata taaatataaa acttacagca ggtaaaatat 3540
attctttgac aggccctagt ggctcaggaa aatcaacgct tgttaagctt atttcagggt 3600
actacagtaa ttattcgggt gggatttacc ttaatgatgt ttcgctgcag gatctctgtg 3660
atgaggaact taacgaaacc atttatcatc ttacccagga tgattatatt ttcatggata 3720
cccttcgctt taatcttcgc ctggcccggt acgatgcatc agagaaggag atgcttgatg 3780
tgctcagtct tgctaaccta tctaagatag gtaatgaacc cgttagtctg gatacatctc 3840
ttacgagtaa aggtaataac tattctggag ggcagaaaca aaggctctct cttgcacgac 3900
tatttttacg ctctccgtct gtaattatca tcgatgaggc aacatcagct cttgattaca 3960
ttaatgaatc tgaaataatg acctcaataa aaaaatattt tcctgatgcg ctgataataa 4020
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ggcagattgt cgcttcaggt caattccatg aactgaaggc cagcaactgt tatattaacg 4140
gcctggcatc agctacagaa taa 4163
<210> 4
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA片段
<400> 4
ccctgatggc tagctcagtc ctagggatta tgctagcatc ttaactgaat tacgtaagtt 60
ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc 120
accgagtcgg tgc 133
<210> 5
<211> 4163
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 优化后MccY序列
<400> 5
ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagcctaag gaagctaaaa tgtttaagaa 60
attattcagc agcagcaaag gtcatgccgt taagaaaata ccaggggtgg tacgaataca 120
aacccctgcc tctcaactta caaagggtgg acgtgggcac attgctgaat atttcagtgg 180
tccaattacc caagtaagtt tttatggatg aagcagggag aacattatga ctcgttatgg 240
cttcacccgg tacaaaaccg atctagtgat acttgatgct gttaaagatg aattctacct 300
gctgcctggc gcaggtcagt ttctggaaga cagggctgaa ttgctcaagc ggtacccaca 360
actgtgtgag tatctggata gtgagcatta tatcggaagt acagcggaga ataaaaacct 420
ctcttttctc gaagaacgtt ggttgatgcc tgaacctgta aacgtatcaa ccctcccctc 480
cttttttcag cgaatgatgc tactggcaaa aatactgtat tacagtaaaa gcatagaaaa 540
aaaggggatg ggatggattt ataataaaaa caaaagagac gcaaaacctg ccgctatgtc 600
tgcaaatcag gagattataa ttcaggagac ggtaagtaca gtttcatcac ttttctgtat 660
taatatgttc aaatcagatt gcctgacata ctcattcact ttaaaaaatg cactatattc 720
ccgaggagtt gatgccagac tggtaattgg agtccggact caaccatttt acagtcatgc 780
atgggttgag atcgaaggta acatcatcaa tgatgaccct gacctgagag ataagttgtc 840
tgtcattgca gagatataaa tatgagaaat tccttcatac agtttaaaga aaaaaaaatc 900
acactgaact tttgtgatgc gttaacagtg tttcggaatg atcatgttac agttatgctt 960
aaaggtaagg catatttaaa aaacaaaggc ctaacagttg aaggtatagc cagagaagtt 1020
gtttcaagag gcgtatataa cgtaattaat gaattaactg gcattttctg tgcttttata 1080
ttccatgaaa attatatcta tatgggcagg agcatgcatt ccggccctca gttgttttat 1140
catattaatg gggatgcgct atacatcgca gataaaataa gtgaattaat taaattacct 1200
ggttttacag gcagcctaaa tttgcgtgtg gcgcagaaat atcttaatgg atgccgtaat 1260
aatgacaatg attcttttat taccggagtt cataaaatta acaacggtga atttgtaaaa 1320
tttgattatc aactttcctc tacttctgtc atcgatgagt tctgtattaa gaaaaaaaac 1380
gactctgtca ttgataatgt catatctaat atcgaaatga cacatgaaaa cagagatata 1440
acattgcttt tctcaggagg gtttgattcc tcactggttt ttcatgccct caaagaattg 1500
ggatttatgt tcagatcttg ttattatgtt tctgagtatt ctgatgacag cgaaatggaa 1560
tttgcccgta ggtattgctt aaagtatggc gtggaattcg cggctataaa taaaaaaatt 1620
gatttcaatg aagagcatta ttatgaatta aatcctgacg tcccggatga gatcccatta 1680
gctcctgagt tatcatgtga gtcagaggaa tcttatgggt tgaagagtga aaatggtttt 1740
ttaatctgtg gtcatggcgg ggatcatatt tttggtcaga atccatctgt actgtttggg 1800
cttgatgccc ttcgtaagca tggtataaaa accatgcata aaaaaatggt tgaatattcc 1860
tgccttaagg gattgaagta caaggatatt tttattaaaa acatggctgc gttaagacaa 1920
aaaccggcaa tgtatacact ggcaaaagat gaacacatct ctactatgag gctggcatcc 1980
gctcagttct tttctgttga tatacgcaat aaagtaaaca tattcacacc attcttattt 2040
aaaaatattg tacagcacca tgtttcactg cctgtttatg agttatttaa ccaacaatat 2100
gaccggtatc ccatgcgatt tgaggcattc agtcgttacg ggtcagatat cttctggaag 2160
aaatcaaaga ggtcttcttc acagcttatt ttcagaatcc tttctgaaaa atgtgaaaat 2220
atagccaatg cgattgaaca atctggcctt gctgatgcca tgaatattaa tcattctgaa 2280
ttaagtaaag atttgtatga aaacactaga gttctattga cagatcgatt accttatctc 2340
attagtctgt accaactggc aaaatacatg cagattcaca gaatcaatat ttgaaggtgt 2400
ttatgtcaaa ttatatcaag acttcgcttc cagcttacat atactcacta atggatagca 2460
aagggagggt tttatttttc ggcatgcttt ttgttacatc tctttcatcc attataatat 2520
cagtttcacc tttcttgctt gcaaaaatta ccgatttatt agtgggttac cagtctagcc 2580
ggggtagtga tttcagtatt aactatctta ttatattatc atgcttgtat atgttctgtg 2640
tgatatacaa taaaaccagt tcgtttctat ttatggtact ccagagcaat cttcgcataa 2700
gaatttcgaa aaaaatgtcc ctacgctacc tggaggcact ttataaggaa gatattaata 2760
agcttgataa aaacaatgca ggatttacaa cacaacgtct caatcaggct tctaacgaca 2820
tttatatcct tgtaaggaat gttgctcaaa atatactctc acctgcaatt caacttatat 2880
cggcagtttt tgttgtgtta tcaactcgtg actggttctc agccagtgta tttttagtat 2940
acatcgttat ttttattata ttcaatgtga ggctaactga ttcattagcc tccctgcgta 3000
agaacagtat ggatatcacc cttcagtcat atagtttgtt atctgatacc gttgacaaca 3060
tgattggggc aaagaaaaat aatgctctca agcaagtttc agatcgttat gaacaagctc 3120
taacgaccga aagtaaagca cagcaaaaat tctggaattt tagtgcctgg gttctcttat 3180
taaattccgc acttgctgtt attttatttg gtgcagtttt ttcttataat ctttcgggcg 3240
ttattaatgg aagtgcatcc attggccatt tcatcatgat cacctcctat attatacttc 3300
tttctacgcc agtagagaat ataggttctc ttctcagtga aatacgacaa tcaatattca 3360
gtcttgaggg ttttctcgct catcataaag atgccgataa ctgttctaat gctaataata 3420
atgttttaac taagtcgaat ggtaaaacaa acatatccat caaagaactt tcatttggat 3480
acgttacagg gaagcagatc cttaaaaata taaatataaa acttacagca ggtaaaatat 3540
attctttgac aggccctagt ggctcaggaa aatcaacgct tgttaagctt atttcagggt 3600
actacagtaa ttattcgggt gggatttacc ttaatgatgt ttcgctgcag gatctctgtg 3660
atgaggaact taacgaaacc atttatcatc ttacccagga tgattatatt ttcatggata 3720
cccttcgctt taatcttcgc ctggcccggt acgatgcatc agagaaggag atgcttgatg 3780
tgctcagtct tgctaaccta tctaagatag gtaatgaacc cgttagtctg gatacatctc 3840
ttacgagtaa aggtaataac tattctggag ggcagaaaca aaggctctct cttgcacgac 3900
tatttttacg ctctccgtct gtaattatca tcgatgaggc aacatcagct cttgattaca 3960
ttaatgaatc tgaaataatg acctcaataa aaaaatattt tcctgatgcg ctgataataa 4020
atattagtca ccgcgtaagc cttcttgagt gctctgacta tgtttatgtt ctcgacgatg 4080
ggcagattgt cgcttcaggt caattccatg aactgaaggc cagcaactgt tatattaacg 4140
gcctggcatc agctacagaa taa 4163
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pCas9丢失检测引物(上游引物)
<400> 6
gagctggtga tatgggatag 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pCas9丢失检测引物(下游引物)
<400> 7
cattcatccg cttattatca c 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pHsgRNA丢失检测引物(上游引物)
<400> 8
gagtgagctg ataccgctcg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pHsgRNA丢失检测引物(下游引物)
<400> 9
cttcgctatt acgccagctg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hsds text-F
<400> 10
gccgaagaga cggaagttgc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hsds text-R
<400> 11
ctcgcaggtt acggtaagac 20
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 上臂-F
<400> 12
gtttggtggg gtgaaggaat gagtgcgggg aaattgccgg 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 上臂-R
<400> 13
ctgtcaattt tccattaact gcgcccccca ataccgcttg 40
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MccY-F
<400> 14
cagttaatgg aaaattgaca gttgacagct agctcagtcc tag 43
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MccY-R
<400> 15
gaactaatgc gtagtattgg ttattctgta gctgatgcca gg 42
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 下臂-F
<400> 16
ccaatactac gcattagttc tgtacgtgct ggccatgtag 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 下臂-R
<400> 17
caggattttt tacgtgaggc ttttttaccc ccgctagctg 40
<210> 18
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA-F
<400> 18
ccctgatggc tagctcagtc ctagggatta tgctagcatc ttaactgaat tacgtaagtt 60
ttagagctag aaatagcaag tta 83
<210> 19
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA-R
<400> 19
gcaccgactc ggtgccactt tttcaagttg ataacggact agccttattt taacttgcta 60
tttctagctc 70
<210> 20
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA-F
<400> 20
ccttgacagc tagctcagtc ctaggtataa tgctagcatc ttaactgaat tacgtaagtt 60
ttagagctag aaatagcaag tta 83
<210> 21
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgRNA-R
<400> 21
gcaccgactc ggtgccactt tttcaagttg ataacggact agccttattt taacttgcta 60
tttctagctc 70

Claims (9)

1.一种MccY重组整合工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将sgRNA片段与T载体连接，得到带有sgRNA的质粒；其中，sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
（2）将pCas9质粒转化大肠杆菌，并制成感受态细胞；然后将优化后的MccY的修复片段和步骤（1）中得到的带有sgRNA的质粒转入感受态细胞中，经培养、连续传代筛选消除双质粒的菌株，得到所述的MccY重组整合工程菌；其中，优化后的MccY的修复片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的MccY重组整合工程菌的构建方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的连续传代筛选消除双质粒通过如下方法实现：将转化后获得的重组菌株连续传代，挑取单菌落分别在含有30μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄青霉素的抗性平板、以及无抗生素的平板中进行穿刺筛选，找到对氯霉素和氨苄青霉素敏感的菌株，然后通过PCR检测确认质粒丢失状态，筛选得到无质粒、无抗性基因的MccY重组整合工程菌；
所述的PCR检测所需的引物序列如下：
pCas9丢失检测引物：
上游引物：5’- GAGCTGGTGATATGGGATAG-3’；
下游引物：5’- CATTCATCCGCTTATTATCAC-3’；
带有sgRNA的质粒的丢失检测引物：
上游引物：5’- GAGTGAGCTGATACCGCTCG-3’；
下游引物：5’- CTTCGCTATTACGCCAGCTG-3’。
3.根据权利要求1所述的MccY重组整合工程菌的构建方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。
4.根据权利要求1所述的MccY重组整合工程菌的构建方法，其特征在于：还包括进一步将步骤（2）中得到的MccY重组整合工程菌利用引物进行PCR鉴定的步骤；
所述的PCR鉴定所需的引物序列如下所示：
hsds text-F：5’- gccgaagagacggaagttgc -3’；
hsds text-R：5’- ctcgcaggttacggtaagac -3’。
5.一种MccY重组整合工程菌，其特征在于：通过权利要求1～4任一项所述的方法构建得到。
6.权利要求5所述的MccY重组整合工程菌在制备小菌素MccY中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：将权利要求5所述的MccY重组整合工程菌接种到培养基中进行培养，离心，取上清，得到小菌素MccY。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述的培养的转速为150～300 rpm/min；
所述的培养的温度为37±2℃；
所述的培养的时间为4小时以上。
9.权利要求5所述的MccY重组整合工程菌在制备抗菌剂中的应用，其特征在于：所述的菌为鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、宋内志贺氏菌和痢疾志贺氏菌中的至少一种。
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