CN102604983A - 一种无质粒、无抗生素抗性筛选标记的基因工程菌的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无质粒、无抗生素抗性筛选标记的基因工程菌的构建方法，该方法以pXKF3T5b质粒为载体，将目的基因转化到宿主细胞中，然后依次通过表达整合酶辅助质粒的去除、整合载体中的卡那霉素抗性基因的去除、三氯生诱导染色体进化和进化菌的发酵筛选等步骤，得到一种无质粒、目的基因拷贝数高的基因工程菌，且由于pXKF3T5b质粒的筛选标记是大肠杆菌本身的fabI基因(编码烯酰-乙酰基载体蛋白还原酶)，是三氯生抗性基因，因此所得到的工程菌无抗生素抗性筛选标记，不会引起环境中抗生素耐药菌泛滥，适合于工业化生产。另外，所构建的工程菌因目的基因整合到染色体上，传代过程中不会丢失，遗传稳定性高，生产性能稳定。

Description

一种无质粒、无抗生素抗性筛选标记的基因工程菌的构建方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种无质粒、无抗生素筛选标记的基因工程菌的构建方法。

背景技术

利用基因工程微生物生产有用物质已成为物质制造的新的模式。目前，通常采用含目的基因的质粒表达系统来构建工程微生物。但是这种质粒表达系统往往存在质粒易丢失、不稳定、且质粒的存在又将增加宿主菌的代谢负担。更为严重的是质粒往往又含有抗生素抗性筛选标记，这将严重影响环境污染问题，导致环境中抗生素耐药菌泛滥，从而限制了含质粒的基因工程菌的工业化进程。

为了解决质粒表达系统的上述缺陷，将目的基因整合到微生物染色体上是一个非常有效的方法。为此，许多科学家研发了许多质粒来整合基因到染色体上。美国普渡大学Haldimann and Wanner(2001)开发了一系列条件复制整合调节(CRIM)质粒，利用该质粒可将事先连接到质粒上的目的基因，通过简单的质粒转化，单拷贝地整合到大肠杆菌染色体上特定的噬菌体整合位点上(Haldimann，A.，Wanner，B.L.Journal of Bacteriology.2001，183：6384-6393)。但是，利用这些质粒整合基因到大肠杆菌的染色体上后，质粒上的抗生素抗性筛选标记和复制子仍然保留在染色体上。所构建的工程菌仍然存在抗生素抗性筛选标记导致环境中耐药菌泛滥的问题。为克服他们的缺陷，台湾Chiang et al.在他们工作的基础上有开发了一系列用于基因整合的质粒，应用这些质粒同样可将事先连接到质粒上的目的基因，通过简单的质粒转化，单拷贝地整合到大肠杆菌染色体上特定的噬菌体整合位点上，而且所得到的工程菌不含抗生素抗性筛选标记和复制子，可用于工业化生产(Chiang，C.-J.，Chen，P.T.，Chao，Y.P.Biotechnology Bioengineering 2008，101：985-995)。但是，应用上述2个团队的质粒都只能将目的基因单拷贝地整合到大肠杆菌的染色体上，而实际工作中往往需要整合多拷贝的基因以提高基因的表达水平，从而提高微生物的生产能力。为此，美国麻省理工学院Tyod et al.开发了一种可提高整合基因拷贝数的质粒pTGD，利用λInCh基因组整合技术，将质粒上的目的基因整合到大肠杆菌染色体上后，因质粒上携带了抗生素抗性基因(与目的基因串列在一起)，可利用所谓的化学诱导染色体进化技术，提高目的基因在染色体上的拷贝数(Tyo，K.E.J.，Ajikumar，P.K.，Stephanopoulos，G.Nature Biotechnology 2009，27：760-765)。他们所得到的工程菌虽然基因的拷贝数因化学诱导染色体进化得到了增加，但是他们使用的基因整合技术是λInCh基因组整合技术，需要4个步骤，比较复杂，整合效率低，而且工程菌仍然含有抗生素抗性筛选标记，不适合于工业化生产。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种无质粒、无抗生素抗性筛选标记的生物工程菌的构建方法，以及由上述方法构建得到的基因工程菌。

本发明所采用的技术方案是：

一种无质粒、无抗生素抗性筛选标记的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1)将表达整合酶的辅助质粒转化到宿主细胞中，得到含有辅助质粒的宿主细胞，所述辅助质粒带有一个抗生素a抗性筛选基因；

2)将目的基因连接到pXKF3T5b载体中，得到含有目的基因的pXKF3T5b载体；

3)基因整合：将含有目的基因的pXKF3T5b载体转化入含有辅助质粒的宿主细胞中，培养过夜；

4)辅助质粒的去除：挑选目的菌落，接入含三氯生的培养基中，培养过夜，取少量上述培养过夜的细胞，在含三氯生的LB的平板上划线分离，培养过夜，将长出的单菌落同时点种到含三氯生、抗生素a的LB的平板上，培养过夜，挑选只在含三氯生的平板上生长的菌落；

5)抗性筛选基因β的去除：挑选只在含三氯生的平板上生长的红色菌落，制备化学感受态细胞，然后将质粒pCP20转化到制备的化学感受态细胞中，涂布在三氯生+氨苄青霉素的LB平板上，培养过夜，挑取目标菌落，接入含三氯生的培养基中，培养过夜，取少量上述培养过夜的细胞，在含三氯生的LB的平板上划线分离，培养过夜，将长出的目标单菌落同时点种到含三氯生、抗生素β、氨苄青霉素的LB的平板上，培养过夜，只在含三氯生的平板上生长的红色菌落就是整合菌；

6)三氯生诱导染色体进化：通过不断增加培养基中三氯生的浓度，诱导整合菌染色体进化；

7)进化菌的发酵筛选：将上述耐受不同浓度三氯生的菌种分别接到相应浓度的三氯生培养基中扩大培养后，转接到发酵培养基中进行发酵，筛选目标产物含量最高的工程菌即为无质粒、无抗生素抗性筛选基因的生物工程菌。

所述pXKF3T5b载体中含有含有2个FRT位点、抗生素β抗性筛选基因、复制子(ori)、噬菌体整合位点(attP)、启动子(P)及其后面的多克隆位点(MCS)和终止子、连接在多克隆位点后的用于诱导染色体进化的三氯生抗性基因(fabI)、连接在启动子和三氯生抗性基因(fabI)两侧的2个核苷酸序列相同的外源片段A1和A2；抗生素a抗性筛选基因与抗生素β抗性筛选基因为不同的抗性基因，且不是三氯生抗性基因(fabI)。

优选的，步骤1)所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

优选的，所述辅助质粒能表达噬菌体HK022、P21、P22、λ或φ80整合酶(Int)中任一种。

优选的，所述辅助质粒为pAH121、pAH69、pAH123、pAH130和pINT-ts中任一种。

优选的，所述辅助质粒中的抗生素a抗性筛选基因为氨苄青霉素抗性筛选基因，抗生素a为氨苄青霉素。

优选的，所述pXKF3T5b载体的结构为：在两个FRT位点之间的一侧依次含有片段A1、启动子(P)及其后面的多克隆位点(MCS)、终止子(TTR)、用于诱导染色体进化的三氯生抗性基因(fabI)、片段A2、噬菌体整合位点(attP)，在两个FRT位点的另一侧则依次含有抗生素β抗性筛选基因和复制子(如图1所示)。

优选的，所述pXKF3T5b载体中的抗生素β抗性筛选基因为卡那霉素抗性基因(kan)，所述抗生素β为卡那霉素。

优选的，所述pXKF3T5b载体中的复制子为大肠杆菌的条件复制子(ori Rγ)。

优选的，所述pXKF3T5b载体中的噬菌体整合位点(attP)为attP_HK、attP_P21、attP_λ、attP_φ80和attP_P22中的任一种。

优选的，所述pXKF3T5b载体中的启动子为P_T5、P_T7、P_tac、P_trc、P_lac、P_BAD、P_Ltet、P_Llac等启动子中的任一种。

优选的，步骤3)的具体操作为：将5μl含有目的基因的pXKF3T5b载体加入到100μl含有pAH121的宿主细胞中，冰上放置30～50分钟；42℃热击90秒，马上放到冰上3～5分钟；补加LB培养液600μl，37℃225rpm摇床培养约45～60分钟，然后于42℃水浴摇床中继续培养30分钟；离心，弃上清液至剩约200μl，灭菌枪头吹打菌体至均匀；涂布棒涂布到LB平板(含1μM三氯生和卡那霉素25μg/ml)，37℃倒置培养过夜。

优选的，步骤6)的具体操作为：挑选只在含三氯生的平板上生长的菌落，接种到含1μM三氯生的LB液体培养基的试管中，37℃培养24h，然后转接到含2μM三氯生LB液体培养基的试管中，37℃培养24h，剩余菌种制备甘油种于-80℃保存，将耐2μM三氯生的菌种继续转接到含4μM三氯生LB液体培养基的试管中，37℃培养24h，剩余菌种制备甘油种于-80℃保存，重复上述步骤，直至三氯生浓度为16μM为止。

本发明的有益效果在于：

1)本发明方法通过简单的质粒转化，将目的基因整合到宿主菌的染色体上，然后利用化学诱导染色体进化技术，将整合基因的拷贝数进化到所需要的拷贝数，所得到的基因工程菌的筛选标记是大肠杆菌本身的fabI基因(编码烯酰-乙酰基载体蛋白还原酶)，是三氯生抗性基因，因此所得到工程菌不会引起环境中抗生素耐药菌泛滥，适合于工业化生产；

2)所构建的工程菌因目的基因整合到染色体上，传代过程中不会丢失，遗传稳定性高，生产性能稳定。

附图说明

图1是本发明pXKF3T5b质粒的物理图谱；

图2是实施例1用于基因整合、三氯生诱导染色体进化的质粒pXKF3T5b的物理图谱；

图3是本发明的基因工程菌的构建流程。

具体实施方式

下面以构建无质粒、无抗生素抗性筛选标记产番茄红素的工程大肠杆菌为例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等都采用常规的方法，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J，Russell DW，Janssen K，Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)。

以下实施例中所用到的引物见表1。

表1

以下实施例中所用到的pXKF3T5b载体的结构与构建方法如下：

质粒pXKF3T5b中的X表示含有不同的噬菌体整合位点，包括针对HK022噬菌体的HK(attP_HK)、针对P21噬菌体的P21(attP_P21)、针对φ80噬菌体的φ80(attP_φ80)、针对λ噬菌体的λ(attP_λ)、针对P22噬菌体的P22(attP_P22)。

如图2所示，质粒pXKF3T5b含有2个FRT位点(可被FLP重组酶识别)、卡那霉素抗性基因(kan)、大肠杆菌的条件复制子(ori Rγ)、噬菌体整合位点(attP)、T5启动子及其后面的多克隆位点(MCS)和终此子(TTR)、连接在多克隆位点后的用于诱导染色体进化的三氯生抗性基因(大肠杆菌fabI基因，编码烯酰-乙酰基载体蛋白还原酶)、连接在启动子和三氯生抗性基因(fabI)两侧的2个来自于谷氨酸棒杆菌cgl1740基因的核苷酸序列相同片段A1和A2，该片段是异源的核苷酸片段、在大肠杆菌中同源性低，且不会表达。当然，A1和A2除了是来自于谷氨酸帮杆菌cg1740基因外，还可以是来自任何生物，只要在大肠杆菌中同源性低且不表达、大小1kbp左右即可。

其构建方法如下：

(1)构建pHK-Kan

首先参考台湾Chiang et al.方法(Chiang，C.-J.，Chen，P.T.，Chao，Y.P.Biotechnology Bioengineering 2008，101：985-995)构建pHK-Kan。用引物对RCWF(SEQ ID NO：3)、RCWR(SEQ ID NO：4)从pAH144(美国普渡大学Wanner教授惠赠，参见Haldimann，A.，Wanner，B.L.Journal of Bacteriology.2001，183：6384-6393)上扩增其多克隆位点(MCS)及attP_HK位点，引物对RCNF(SEQ IDNO：5)、RCNR(SEQ ID NO：6)扩增pKD3(美国普渡大学Wanner教授惠赠，参见Datsenko，K.A.，Wanner，B.L.PNAS.2000，97：6640-6645)上不包含cat基因的其余部分。两者的PCR产物用Pst I+Xho I酶切后彼此连接，便构建得到pHK-Amp。再将pAH120上Sph I-Not I酶切位点间的kan基因切下，替换pHK-Amp上Sph I-Not I酶切位点间的bla基因(Ampr)，则构建得到pHK-Kan。

(2)构建pHKKC3T5b

用引物对CG1F(SEQ ID NO：7)、CGlR(SEQ ID NO：8)从C.glutamicum基因组中cgl1740基因扩增上游同源臂序列A1，并用EcoT22 I+Pst I酶切该片段(EcoT22 I与Pst I为同尾酶)，正向插入pHK-Kan的Pst I位点，构建得到pHK-KanA1。用引物对CG2F(SEQ ID NO：9)、CG2R(SEQ ID NO：10)从C.glutamicum基因组中同样位置扩增下游同源臂序列A2(除了末端额外添加的酶切位点，A2序列与A1完全一致)，并用EcoR I+Mun I酶切该片段(EcoR I与Mun I为同尾酶)，正向插入pHK-KanA1的EcoR I位点，构建得到pHK-KanA2。

用引物对Cm1(SEQ ID NO：11)、Cm3(SEQ ID NO：12)从pKD3中扩增不带FRT位点的cat基因，并用内切酶EcoR I+Mun I酶切PCR得到的cat基因，正向插入pHK-KanA2的EcoR I位点，构建得到pHK-KanC3。pHK-KanC3用Sph I酶切，Primestar DNA聚合酶补平末端自连，消除Sph I，得到质粒pHK-KanC3b。再将p18S-Q3Fb中的T5启动子及终止子用Mlu I+ApaL I切下，替换pHK-KanC3b中Mlu I-ApaL I位点间的序列，即得到pHKKC3T5b(SEQ IDNO：1)。

(3)构建含其他噬菌体整合位点的质粒

用引物AH1(SEQ ID NO：13)、AH2(SEQ ID NO：14)分别从pAH81、pAH120、pAH153和pAH154中扩增噬菌体位点attP_P21、attP_λ、attP_φ80和attP_P22，并连入T载体中。测序无误后，再用Sac I+Xho I将它们切下，替换pHKKC3T5b上的attP_HK，则对应得到含相应整合位点的质粒pP21KC3T5b、pP22KC3T5b、pλKC3T5b、pφ80KC3T5b。

(4)用引物FabF(SEQ ID NO：15)和FabR(SEQ ID NO：16)从大肠杆菌基因组中PCR扩增基因fabI片段，连接到pMD18-T simple中得到pMD-fabI。用引物CG1F(SEQ ID NO：7)和CG2R(SEQ ID NO：11)从谷氨酸棒杆菌基因组中重新PCR扩增下游同源臂序列A2(前后分别含有EcoT22 I、Mun I和SacII酶切位点)，连接到pMD18-T载体上，得到pMD-A2。

(5)用Pst I/EcoT22 I酶切pMD-A2，凝胶回收含A2片段，连接到EcoT22I酶切pMD-fabI得到的线性化载体，得到pMD-A2-FabI。用ApaL I/SacII酶切pMD-A2-FabI，回收含A2-FabI片段，连接到用同样酶切处理的pXKC3T5b上，便可分别得到pHKKF3T5b、pP21KF3T5b(SEQ ID NO：2)、pP22KF3T5b、pλKF3T5b、pφ80KF3T5b。

实施例1

以大肠杆菌E.coli BW25113为出发菌的产番茄红素工程菌的构建

1)将表达整合酶的辅助质粒pAH121(美国普渡大学Wanner教授惠赠，参见Haldimann，A.，Wanner，B.L.Journal of Bacteriology.2001，183：6384-6393)转化到大肠杆菌E.coli BW25113中得到大肠杆菌E.coli BW25113(pAH121)。

2)Hind III酶切pB-crtEIBipi(中山大学刘建忠教授惠赠，含番茄红素合成基因的表达载体)并补平，然后再用EcoR I酶切，凝胶回收4329bp的番茄红素合成基因crtEIBipi片段，连接到EcoR I/BamH III酶切后的pP21KF3T5b载体(SEQ ID NO：2)上，得到pP21KF3T5b-crtEIBipi。

3)基因整合：将pP21KF3T5b-crtEIBipi转化到大肠杆菌E.coli BW25113(pAH121)：将5μl pP21KF3T5b-crtEIBipi加入到100μl的E.coli BW25113(pAH121)感受态细胞中，冰上放置30～50分钟；42℃热击90秒，马上放到冰上3～5分钟；补加LB培养液(含0.5％KAc)600μl，37℃225rpm摇床培养约45～60分钟，然后于42℃水浴摇床中继续培养30分钟；离心，弃上清液至剩约200μl，灭菌枪头吹打菌体至均匀；涂布棒涂布到LB平板(含1μM三氯生和卡那霉素25μg/ml)，37℃倒置培养过夜。

4)辅助质粒pAH121的去除：挑选红色菌落，接入含1μM三氯生的LB液体培养基的试管中，42℃培养过夜。用接种环蘸取少量上述培养过夜的细胞，在含1μM三氯生的LB的平板上划线分离，于37℃培养过夜。将长出的红色单菌落同时点种到含1μM三氯生、100mg/mL氨苄青霉素的LB的平板上，于37℃培养过夜。

5)卡那霉素抗性基因的去除：挑选只在含三氯生的平板上生长的红色菌落，制备化学感受态细胞，然后将质粒pCP20(美国普渡大学Wanner教授惠赠，参见Datsenko，K.A.，Wanner，B.L.PNAS.2000，97：6640-6645)转化到制备的化学感受态细胞中，涂布在1μM三氯生+100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，于30℃培养过夜。挑取红色菌落，接入含1μM三氯生的LB液体培养基的试管中，于30℃摇床培养6h，然后在42℃继续培养过夜。用接种环蘸取少量上述培养过夜的细胞，在含1μM三氯生的LB的平板上划线分离，于37℃培养过夜。将长出的红色单菌落同时点种到含1μM三氯生、25μg/mL卡那霉素、100μg/mL氨苄青霉素的LB的平板上，于37℃培养过夜。只在含三氯生的平板上生长的红色菌落就是整合菌。

6)三氯生诱导染色体进化：挑选只在含三氯生的平板上生长的红色菌落，接种到含1μM三氯生的LB液体培养基的试管中，37℃培养24h。然后转接到含2μM三氯生LB液体培养基的试管中，37℃培养24h，剩余菌种制备甘油种于-80℃保存。将耐2μM三氯生的菌种继续转接到含4μM三氯生LB液体培养基的试管中，37℃培养24h，剩余菌种制备甘油种于-80℃保存。重复上述步骤，直至三氯生浓度为16μM为止。

7)进化菌的发酵筛选：将上述耐受不同浓度三氯生的菌种，分别接到相应浓度三氯生的LB液体培养基的试管中，37℃培养12h。然后转接到装有50mL发酵培养基(g/L：蛋白胨12.0，酵母抽提物24.0，K₂HPO₄11.4，KH₂PO₄1.7，KAc 5.0，MgSO₄·7H₂O 1.0，蔗糖5.0，草酸铵10mM，吐温-80 2.0，pH 7.0)中，于37℃、250转/分摇床发酵48h。发酵结束时取样测定细胞浓度OD₆₀₀。取少量菌液(约500μL，记为v₁)，于室温下10000rpm离心5min，去上清，加500μL蒸馏水洗涤，于室温下10000rpm离心5min，去上清，沉淀重悬于～1mL丙酮中，反复用枪头吹打，抽提液于55℃水浴中保温15min后，于室温下10000rpm离心5min，取上清液、并用丙酮定容到一定体积V₂。以丙酮为对照，利用分光光度计测量抽提液在472nm下的吸光值，按下式计算番茄红素的浓度：

发酵液中番茄红素浓度(mg/L)＝OD₄₇₂×4.418×v₂/v₁

菌体中番茄红素的含量(mg/g干菌体)＝OD₄₇₂×4.418×v₂/(v₁×c)

8)选取菌体中番茄红素含量最高的工程菌即为无质粒、无抗生素抗性筛选标记产番茄红素的工程大肠杆菌。

以上构建流程见图3。

实施例2

以大肠杆菌E.coli BW25113(ΔgdhAΔaceF，P_T5-dxs)为出发菌的产番茄红素工程菌的构建

将实施例1中的大肠杆菌E.coli BW25113改为可促进番茄红素合成的大肠杆菌E.coli BW25113(ΔgdhAΔaceF，P_T5-dxs)(中山大学刘建忠教授惠赠)，番茄红素合成基因crtEIBipi连接在染色体进化质粒pHKKF3T5b上，得到pHKKF3T5b-crtEIBipi，用于表达整合酶的辅助质粒采用pAH69，其他步骤与实施例1相同。最后的得了耐受8μM三氯生的染色体进化菌E.coli CIChE-crtEIBipi，摇床发酵可产番茄红素30.5mg/g干菌体。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。例如：将辅助质粒pAH121替换成其他能表达噬菌体HK022、P21、P22、λ或φ80整合酶(Int)的质粒，如pAH69、pAH123、pAH130和pINT-ts中的任一种，同样可以实现本发明的目的，均落在本发明的保护范围内；将pP21KF3T5b载体替换为pHKKF3T5b、pP22KF3T5b、p_λKF3T5b、p_φ80KF3T5b中的任一种，同样可以实现本发明的目的，均落在本发明的保护范围内；除了大肠杆菌E.coli BW25113、大肠杆菌E.coli BW25113(ΔgdhAΔaceF，P_T5-dxs)外，以上方法适用于其它的埃希氏杆菌属(Escherichia)工程菌，尤其是大肠杆菌(Escherichia coli)，均落在本发明的保护范围内。

<110>  紫琦, 刘

<120>  一种无质粒、无抗生素抗性筛选标记的基因工程菌的构建方法

<130> 

<160>  16   

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  7171

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

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<210>  2

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<212>  DNA

<213>  人工序列

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agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat     6840

gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact     6900

ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc     6960

agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc     7020

gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcttggagtt cattcagggc accggacagg     7080

tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca     7140

gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc     7200

ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct     7260

tgatccacta gattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt     7320

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc     7380

acctgcatcg atggcccccg atggtagtgt ggggtctccc catgcgagag tagggaactg     7440

ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt     7500

gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc gggagcggat ttgaacgttg     7560

cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa     7620

ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtg gccagtgcca agcttgc        7677

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  3

cttgcatgcc tgcaggtcga ct                                                22

 

<210>  4

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  4

gaactcgaga cggctgacat gggaattag                                         29

 

<210>  5

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  5

cgcctgcagt aaatgaagtt cctattccg                                         29

 

<210>  6

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  6

gtcctcgagt tctgcgaagt gatcttccgt c                                      31

 

<210>  7

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  7

cttatgcatc ctgtacttcg caatgttgac ct                                     32

 

<210>  8

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  8

atactgcaga ctacgcgtgc gcttgctcac agcagcgact                             40

 

<210>  9

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  9

cttgaattcc ctgtacttcg caatgttgac ct                                     32

 

<210>  10

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  10

atacaattgg gtccgcgggc gcttgctcac agcagcgact                             40

 

<210>  11

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  11

tcacaattgc ccgccctgcc actcatcgc                                         29

 

<210>  12

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  12

actgaattcg cagtgcaccg cctacctgtg acggaaga                               38

 

<210>  13

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  13

ttaccgcggt ggcgatgacg catcctcac                                         29

 

<210>  14

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  14

gaactcgaga cggctgacat gggaattag                                         29

 

<210>  15

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  15

ccggtgcacg tgctggagaa tattcg                                            26

 

<210>  16

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  16

gcgatgcatt tatttcagtt cgagttcgtt                                        30

Claims (10)

1.一种无质粒、无抗生素抗性筛选标记的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1）将表达整合酶的辅助质粒转化到宿主细胞中，得到含有辅助质粒的宿主细胞，所述辅助质粒带有一个抗生素a抗性筛选基因；

2）将目的基因连接到pXKF3T5b载体中，得到含有目的基因的pXKF3T5b载体；

3）基因整合：将含有目的基因的pXKF3T5b载体转化入含有辅助质粒的宿主细胞中，培养过夜；

4）辅助质粒的去除：挑选目的菌落，接入含三氯生的LB培养基中，培养过夜，取少量上述培养过夜的细胞，在含三氯生的LB的平板上划线分离，培养过夜，将长出的单菌落同时点种到含三氯生、抗生素a的LB的平板上，培养过夜，挑选只在含三氯生的平板上生长的菌落； 

5）抗性筛选基因β的去除：挑选只在含三氯生的平板上生长的菌落，制备化学感受态细胞，然后将质粒pCP20转化到制备的化学感受态细胞中，涂布在三氯生+氨苄青霉素的LB平板上，培养过夜，挑取目标菌落，接入含三氯生的LB培养基中，培养过夜，取少量上述培养过夜的细胞，在含三氯生的LB的平板上划线分离，培养过夜，将长出的目标单菌落同时点种到含三氯生、抗生素β、氨苄青霉素的LB的平板上，培养过夜，只在含三氯生的平板上生长的菌落就是整合菌；

6）三氯生诱导染色体进化：通过不断增加培养基中三氯生的浓度，诱导整合菌染色体进化；

7）进化菌的发酵筛选：将上述耐受不同浓度三氯生的菌种分别接到相应浓度的三氯生培养基中扩大培养后，转接到发酵培养基中进行发酵，筛选目标产物含量最高的工程菌即为无质粒、无抗生素抗性筛选基因的生物工程菌；

所述pXKF3T5b载体中含有含有2个FRT位点、抗生素β抗性筛选基因、复制子(ori )、噬菌体整合位点(attP)、启动子（P）及其后面的多克隆位点(MCS)和终止子、连接在多克隆位点后的用于诱导染色体进化的三氯生抗性基因(fabI)、连接在启动子和三氯生抗性基因(fabI)两侧的2个核苷酸序列相同的外源片段 A1和A2；抗生素a抗性筛选基因与抗生素β抗性筛选基因为不同的抗性基因，且不是三氯生抗性基因(fabI)。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤1）所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述辅助质粒能表达噬菌体HK022、P21、P22、λ或φ80整合酶(Int)中任一种，辅助质粒上的抗生素a抗性筛选基因为氨苄青霉素抗性筛选基因，抗生素a为氨苄青霉素。

4.根据权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述pXKF3T5b载体的结构为：两个FRT位点的一侧按顺时针方向依次含有片段A1、启动子（P）及其后面的多克隆位点（MCS）、终止子（TTR）、用于诱导染色体进化的三氯生抗性基因(fabI)、片段A2、噬菌体整合位点(attP)，在两个FRT位点的另一侧则含有抗生素β抗性筛选基因和复制子。

5.根据权利要求1或4所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述pXKF3T5b载体中的抗生素β抗性筛选基因为卡那霉素抗性基因（kan），所述抗生素β为卡那霉素。

6.根据权利要求1或4所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述pXKF3T5b载体中的复制子为大肠杆菌的条件复制子(oriRγ)。

7.根据权利要求1或4所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述pXKF3T5b载体中的噬菌体整合位点(attP)为 attP _HK、attP _P21、attP _λ、attPφ₈₀和attP _P22中的任一种。

8.根据权利要求1或4所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述pXKF3T5b载体中的启动子为P _T5 、P _T7 、P _tac 、P _trc 、P_lac、P _BAD 、P_Ltet、P_Llac等启动子中的任一种。

9.根据权利要求1所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，步骤3）的具体操作为：将5μl含有目的基因的pXKF3T5b载体加入到100μl含有pAH121的宿主细胞中，冰上放置30～50分钟；42℃热击90秒，马上放到冰上3～5分钟；补加LB培养液600μl，37℃ 225rpm摇床培养约45～60分钟，然后于42⁰C水浴摇床中继续培养30分钟；离心，弃上清液至剩约200μl，灭菌枪头吹打菌体至均匀；涂布棒涂布到LB平板（含1μM 三氯生和卡那霉素 25 μg/ml），37℃倒置培养过夜。

10.根据权利要求1所述的生物工程菌的构建方法，其特征在于，步骤6）的具体操作为：挑选只在含三氯生的平板上生长的菌落，接种到含1μM 三氯生的LB  液体培养基的试管中，37℃培养24h，然后转接到含2μM 三氯生LB  液体培养基的试管中，37℃培养24h，剩余菌种制备甘油种于－80℃保存，将耐2μM 三氯生的菌种继续转接到含4μM 三氯生LB液体培养基的试管中，37℃培养24h，剩余菌种制备甘油种于-80℃保存，重复上述步骤，直至三氯生浓度为16μM为止。

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