CN110551668B - 一种肠毒素基因lt敲除的大肠杆菌及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肠毒素基因LT敲除的大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：1)构建LT基因同源重组供体LT donar，LT donar的碱基序列依次包括L‑arm、cat promoter、CmR、sgCommon、PAM、L‑short、R‑arm多核苷酸片段；以及2)制备含pCas‑Red质粒的感受态细胞，加入步骤1)的LT donar进行转化，然后筛选阳性克隆，即得无痕敲除了热不稳定肠毒素基因LT的大肠杆菌。本发明将Crispr/Cas9与λ‑Red同源重组系统结合，成功地对产肠毒大肠杆菌K88的LT基因进行无痕敲除，突变菌株丧失溶血能力，减缓生长；利用本发明的方法可快速、便捷的对产肠毒大肠杆菌K88基因进行无痕敲除，为研究LT功能提供了坚实的研究基础。

Description

一种肠毒素基因LT敲除的大肠杆菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及基因敲除技术领域，尤其是一种肠毒素基因LT敲除的大肠杆菌及其构建方法。
背景技术
肠毒素是ETEC分泌的一种毒性蛋白，常见的有热不稳定肠毒素(heat-labiletoxin,LT)与热稳定性肠毒素(stable toxin,ST)两类，它们是此类导致腹泻的主要因子。由于猪感染产肠毒大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)后的发病率和死亡率极高，尤其是在断奶后仔猪中，给养殖业带来巨大损失。LT对热较为敏感，65℃以上温度加热30min可使其失活。但是，LT具有较强的免疫原性，可提高产肠毒大肠杆菌和其他病原体与肠上皮胞的粘附性，因此毒性很强[1]。产肠毒大肠杆菌的LT有两个亚基，A亚基和B亚基，每个亚基单独存在是没有活性，但是结合起来则形成毒性蛋白。A亚基是毒性中心，B亚基具有免疫原性。 LT通过B亚基与肠上皮细胞表面的GM-1神经节苷脂结合，产生毒素，并释放有生物活性的A亚基从而发挥其毒性[2]。鉴于肠毒素基因的重要作用，研究其致病机制，减少畜禽腹泻的发生，构建其突变菌株有着重要意义。
目前，常见的基因敲除体统有Red和Crispr/Cas9系统。Red系统能够促进有限同源区(约50bp)的线性DNA与大肠杆菌染色体的重组。Red重组系统属于λ-噬菌体重组体系，其编码基因包括exo、bet和gam以及控制他们的PL操纵子。 exo基因编码的λ核酸外切酶负责将dsDNA 5’端切开、产生3’端缺口，bet基因编码的β蛋白与RecA等其他因子一起引导断裂DNA入侵dsDNA，gam编码的 Gam蛋白主要起到稳定DNA的作用，抑制宿主的RecBCD蛋白的核酸外切酶活性，保证用于重组的外源的线性DNA的稳定性。Crispr/Cas9系统发现于细菌的免疫系统，它有助于菌体抵抗外源DNA的侵染，对其进行精准、有效的切除[3,4]。 CRISPR/Cas9使用单个DNA内切酶Cas9来识别dsDNA底物，并利用不同的核酸酶结构域(HNH或RuvC)对每条链进行裂解，HNH切割向导RNA(sgRNA) 识别的靶DNA的互补链，RuvC切割靶DNA上不与sgRNA作用的非互补部分。其基因敲除的基本过程为：(1)反式激活crRNA(tracrRNA)的非编码小RNA 与crRNA中的重复序列碱基配对，形成双RNA杂合结构。(2)由双RNA杂合结构指导Cas9切割与crRNA上sgRNA互补的目标DNA，产生位点特异性的平末端双链断裂(DSB)。(3)通过非同源末端连接修复，导致切割位点上小的随机插入和/或缺失(indels)，或通过同源重组修复，使用同源修复模板在DSB位点上进行精确的基因组修饰[5,6]。目前Crispr/Cas9系统已经在动、植物及微生物中已得到广泛地应用[7-9]。
细菌的基因组敲除，特别是大肠杆菌通常使用λ-Red系统，其优点是对细菌敲除效率较高，缺点是实现无痕敲除步骤较为繁琐，会留下FRT的标记。 Crispr/Cas9的优点是易于实现无痕敲除，但是对前间区序列邻近基序(PAM序列) 依赖程度较高，而且对一些细菌的敲除效率不高。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种肠毒素基因LT敲除的大肠杆菌的构建方法，该方法实现对热不稳定肠毒素基因 LT无痕敲除，步骤更简便、高效，不会留下FRT的标记。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：
在第一个方面，本发明提供了一种肠毒素基因LT敲除的大肠杆菌，所述大肠杆菌相比野生型，无痕敲除了热不稳定肠毒素基因LT。需要说明的是，其中“无痕敲除”是指仅敲除大肠杆菌中热不稳定肠毒素基因LT的DNA序列，不会有残留任何标记或多余的核苷酸序列，也不会敲除热不稳定肠毒素基因LT相邻的核苷酸序列。
在第二个方面，本发明提供了一种肠毒素基因LT敲除的大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
1)构建LT基因同源重组供体LT donar，LT donar的碱基序列依次包括L-arm、 catpromoter、CmR、sgCommon、PAM、L-short、R-arm多核苷酸片段；以及
2)制备含pCas-Red质粒的感受态细胞，加入步骤1)的LT donar进行转化，然后筛选阳性克隆，即得无痕敲除了热不稳定肠毒素基因LT的大肠杆菌。
优选地，所述L-arm的碱基序列如SEQ ID NO.10所示，L-short的碱基序列如SEQID NO.13所示，R-arm的碱基序列如SEQ ID NO.14所示。
优选地，所述cat promoter的碱基序列如SEQ ID NO.11所示。
优选地，所述sgCommon的碱基序列如SEQ ID NO.12所示。
优选地，所述PAM序列为AGG。
优选地，所述LT donar的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述pCas-Red质粒的图谱如图2所示。
优选地，所述细胞为ETEC K88。
优选地，所述筛选步骤包括：已插入LT donar基因的正确克隆子接种于含 Amp、IPTG和L-阿拉伯糖的LB培养基中，诱导CRISPR/Cas9系统和λ-RED蛋白表达。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明将Crispr/Cas9与λ-Red同源重组系统结合，成功地对产肠毒大肠杆菌 K88的LT基因进行无痕敲除，突变菌株丧失溶血能力，减缓生长；利用本发明的方法可快速、便捷的对产肠毒大肠杆菌K88基因进行无痕敲除，为研究LT功能提供了坚实的研究基础。
附图说明
图1为Crispr/Cas9和λ-Red级联的ETEC K88LT基因敲除过程示意图，其中，L-short和Right arm分别为LT基因边界左侧和右侧序列，和LT基因序列无重合；
图2为pCas-Red质粒图谱；
图3为LTh donar的构建过程图(A)与结构图(B)，其中，sgRNA的识别序列 CommonsgRNA为TAGTCCATCGAACCGAAGTA；PAM序列为AGG，其中PAM 序列的作用主要是定位CRISPR/CAS系统的基因切除位点，对基因敲除的特异性起到的重要作用；Common sgRNA序列负责和CRISPR/CAS系统中CAS9蛋白结合，引导Cas9核酸内切酶定点切割靶向DNA；
图4为ETEC K88肠毒素基因LT克隆(1)与载体连接转化(2)验证的电泳图；
图5为LT基因敲除菌株的PCR验证结果图，其中，泳道1、5模板为野生型K88；泳道2、6模板为转化pCas-Red质粒的K88；泳道3模板为LT donar替代的K88；泳道4、7模板为LT基因敲除的K88(未消除pCas-Red plasmid)；泳道8模板为去除pCas-Red质粒的LT基因敲除K88；
图6为LT基因敲除前(左)后(右)的菌株溶血现象结果图；
图7为野生型与LT基因敲除菌株的生长曲线。
具体实施方式
本发明旨在利用Crispr/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒大肠杆菌K88的热不稳定性肠毒素基因LT进行敲除，通过构建具有氯霉素筛选标记和LT同源臂的供体片段，并基于同源替代和同源重组修复原理，以Crispr/Cas9基因编辑系统结合λ-Red同源重组系统为敲除工具，对LT基因进行无痕敲除，并验证敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果表明，Crispr/Cas9与λ-Red同源重组系统的结合可成功对产肠毒大肠杆菌K88的LT基因进行无痕敲除，突变菌株丧失溶血能力，减缓生长。利用本发明的方法可快速、便捷的对产肠毒大肠杆菌K88基因进行敲除，为研究LT功能提供了坚实的研究基础。
细菌的基因组敲除，特别是大肠杆菌通常使用λ-Red系统，其优点是对细菌敲除效率较高，缺点是实现无痕敲除步骤较为繁琐，会留下FRT的标记。Crispr/Cas9的优点是易于实现无痕敲除，但是对前间区序列邻近基序(PAM序列) 依赖程度较高，而且对一些细菌的敲除效率不高。本发明通过利用λRed重组提升CRISPR诱发的同源直接修复效率，实现对大肠杆菌基因组更高效的编辑。本发明为大肠杆菌肠毒素基因的敲除提供方法思路，同时也为研究LTs功能提供研究基础，本发明利用Crisper/Cas9和λ-Red级联的敲除系统成功构建ETEC K88 LT-缺陷菌株，其主要过程参见图1。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法；如无特别说明，本发明的试剂和材料均可从市场上或其它公开渠道获得；如无特别说明，本发明中的试剂浓度均为质量浓度。
下面对本发明中涉及的材料与方法进行必要的说明。
1.1试验菌株、基因与质粒
ETEC K88(CVCC 225，血清型：O149：K91，K88ac，STb +、LT+)购自中国兽医微生物菌种保存中心；Chl cassette DNA(含氯霉素抗性基因CmR、sgRNA 的识别序列Common sgRNA:PAM序列:TAGTCCATCGAACCGAAGTA:AGG)与 pCas-Red质粒(含Crispr/Cas9与Red系统编码基因)由广州艾迪基因科技有限责任公司合成、构建。
1.2试剂与培养基
EasyTaq DNA Polymerase(AP111-01)、pEASY-T1Cloning Kit(CT101-01)，购自全式金生物技术有限公司(北京)；氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)、氯霉素(chloramphenicol，Chl)、异丙基硫代半乳糖苷，(Isopropyl-β-D-Thiogalactoside，IPTG)、甘油、L-阿拉伯糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司；LB、SOC、血琼脂培养基均按标准配方配制，LB培养基中Amp或Chl的抗生素终浓度分别为100μg/mL和35μg/mL。
1.3引物的设计与合成
本发明中使用的引物由广州擎科生物技术有限公司合成(表1)，具体信息如下。
表1 PCR引物序列
Figure BDA0002163657900000061
1.4 ETEC K88电转感受态细胞的制备
接种ETEC K88至50mL的LB液体培养基中，于37℃，200r·min-1培养至 OD600＝0.5～0.7左右，将培养后的ETEC K88菌液至于冰上冷却20min，转移至已提前预冷的50mL无菌离心管并于4℃，4000×g，离心15min。弃上清，加入50mL浓度为10％预冷的甘油重悬菌体，离心并弃上清，再次重悬菌体在50 mL 10％预冷的甘油中，离心并弃上清。重悬菌体在约20mL 10％预冷的甘油中，离心并弃上清，再次重悬细胞在1mL 10％预冷的甘油中，等分菌悬液至数个无菌离心管，于-80℃冰箱保存。
1.5 pCas-Red质粒的转化
在冰上解冻ETEC K88感受态细胞，向电转杯中加入1mL的SOC并置于冰上，在预冷的无菌离心管中加入40μL的感受态细胞和2μL的pCas-Red质粒，混匀后在冰上孵育1min左右。转移加入pCas-Red质粒的感受态细胞至电转杯中，进行电转，电转条件：C＝25μF；PC＝200Ω；V＝2.5kV。加入1mL的SOC 至电转杯中并转移细胞悬液至2mL的无菌离心管，在30℃，200r·min-1，复苏 1h。将细胞悬液涂布在含有Amp和1％甘油的LB平板上，30℃培养12h。以引物Cas9-F/Cas9-R进行PCR验证，筛选阳性克隆。
实施例1 LT基因同源重组供体LT donar的构建
通过表1中引物LT-F/LT-R克隆LT基因全长，连接TA-克隆载体，转化感受态细胞。挑选单克隆，将经PCR验证筛选的阳性克隆测序，比对NCBI数据库，获得LT基因全长及其上、下游序列。根据LT基因及其上、下游序列设计其5’端同源臂序列L-arm short和L-arm，3’端同源臂序列R-arm。以DNA片段Cat-chl cassette为LT的替代基因，合成LT基因的供体LThdonar(L-arm+Cat-chl cassette +L-arm short+R-arm)(参见图3)。LTh donar的碱基序列如下所示：
TTCATTTTTTTTATTTTATTAGCATCGCCATTATATGCAAATGGCGACAAATTATACCGTGCTGATTCATGT GCAGCTCCATCAGCAAAAGGGGATGATAAGTTTATCACCACCGACTATTTGCAACAGTGCCGTTGATCG TGCTATGATCGACTGTTATCTCTGGCGGTGTTGACACTGGAGCACCTCAAAAACACCATCATACACTAA ATCAGTAAGTTGGCAGCATCACCCGACGCACTTTGCGCCGAATAAATACCTGTGACGGAAGATCACTTC GCAGAATAAATAAATCCTGGTGTCCCTGTTGATACCGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATG AGACGTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATT TTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCAC CGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTAT AACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTAT CCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGGCAATGAAAGACG GTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTT CATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTG TTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCC TGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCA TGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGG GCGTAATAGTCCATCGAACCGAAGTAAGGACAATTAACAGTTAACAAATAAGCGGAGAACGAGATGAC GTTGTTGTATGATATATAAGTTTTCCTCGATGAAAAATATAACTAGTATGGAAAACTAGTTTGCTTTAAAA GCATGTCTAATGCTAGGAACCTATATAACAACT(SEQ ID NO.1)
其中，
TTCATTTTTTTTATTTTATTAGCATCGCCATTATATGCAAATGGCGACAAATTA TACCGTGCTGA(SEQ ID NO.10)为L-arm序列，
TGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTA CCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAA (SEQ ID NO.11)为cat promoter序列，
TAGTCCATCGAACCGAAGTA(SEQ ID NO.12)为sgCommon(即图1中的sgRNA Common)序列，
AGG为PAM序列，
TTGTATGATATATAAGTTTTCCTCGATGAAAAATATAACT(SEQ ID NO.13)为 L-short序列，
AGTATGGAAAACTAGTTTGCTTTAAAAGCATGTCTAATGCTAGGAACCTATAT AACAACT(SEQ IDNO.14)为R-arm序列。
实施例2 LT donar转化
制备含pCas-Red质粒电转感受态细胞，接种含pCas-Red质粒(图谱参见图 2)的ETEC K88阳性克隆子至50mL含Amp和1％甘油的LB液体培养基中，于30℃，200r·min-1，培养2h后，加入0.1mmol·L-1的IPTG诱导λ-RED蛋白的表达，30℃生长至OD600＝0.6左右，其他步骤同前。取50μL已制备的含 pCas-Red质粒的感受态细胞加入LT donar，转移至电转杯中混匀，进行电转，条件同前。细胞在30℃复苏2h，涂布于含Amp、氯霉素和1％甘油的LB培养基上，30℃培养12h。挑取单克隆，通过表1中的引物LT donor-F和LT donor-R 进行PCR验证LTh donar基因的插入。
实施例3 LT基因敲除菌株的筛选
将已插入LT donar基因的正确克隆子接种于含Amp，IPTG(终浓度0.1 mmol·L-1)和L-阿拉伯糖(终浓度0.2％)的LB培养基中，诱导CRISPR/Cas9 系统和λ-RED蛋白表达。30℃，200r·min-1，培养6h，将细胞涂在含Amp的 LB平板上，30℃培养12h。(涂板前稀释至少10-4倍)。通过引物LT donor-F/LT donor-R，经PCR鉴定克隆子。42℃条件下，pCas-Red质粒对温度敏感，在温度高于37℃时大肠杆菌可能会丢失pCas-Red质粒，培养筛选出的LT基因阳性克隆至对数生长期，将培养物稀释至少10-4倍并涂布在不含任何抗生素的LB平板，37℃培养12h。通过表1中引物Cas9-F/Cas9-R进行PCR验证，筛选阳性克隆，确定pCas-Red质粒的去除，将阳性克隆接种LB培养基，37℃过夜培养，使用终浓度20％甘油保存菌液于-20℃冰箱，命名为ETEC K88-(STb +，LT-)。
实施例4基因敲除菌株的溶血性能
将ETEC K88和LT基因敲除菌株ETEC K88-(STb +，LT-)分别接种至LB 液体培养基，37℃，160r·min-1，培养至对数生长期。取少量菌液，用接种环分别划线至两血琼脂培养基表面，放置于恒温培养箱中，37℃培养12h，观察两菌株菌落周边溶血情况。
实施例5菌株生长曲线的测定
将野生型菌株ETEC K88和突变体菌株ETEC K88-(STb +，LT-)分别接种至2个LB液体培养基，37℃，160r·min-1，培养48h，取不同生长时间的两菌株菌液，测定OD600的吸光值，稀释涂板至LB固体培养基，37℃，培养12h，记录菌落数量，计算不同时间两菌株的生长量，绘制生长曲线。
实施例1～5的结果：
2.1 LT基因的克隆
由于构建用于LT基因敲除的donor，需知道LT基因左侧和右侧的同源序列。本研究首先扩增了LT基因，如图4所示，LT全长基因克隆产物电泳条带清晰，无非特异性扩增，基因长度为1300bp左右，与预期结果一致。连接TA克隆载体转化感受态细胞后，经引物M13F/M13R进行PCR验证，基因片段大小与预期结果一致。对片段进行测序，通过NCBI比对发现，扩增的LT片段和Escherichia coli genes for heat-labile enterotoxin A subunit andB subunit上一个片段相似度较高 (NCBI编号：AB011677.1)，相似度为99.9％。根据AB011677.1及两侧序列设计donor的L-arm、L-arm short和R-arm(参见图3)
2.2 LT基因的敲除
本发明采用Crispr/Cas9-Red级联的技术进行LT基因的敲除，其主要步骤分为两步，第一步采用Red系统完成重组交换，第二步采用Crispr/Cas9系统完成抗性基因的消除。通过PCR对各个突变菌株进行验证，结果如图5所示，野生型菌株(泳道1)和转入pCas-Red质粒后(泳道2)均存在LT基因，但是转化LT donor 后出现一个比LT基因稍长的片段，原因是由于LT donor略比LT基因长造成的，说明LT donor已经成功转化到宿主K88中(泳道3)，经过抗性平板筛选可发现LT 基因被成功敲除(泳道4)。同样CAS9-F/CAS9-R进行验证，在高温诱导后，LT 基因敲除菌株内的pCas-Red质粒以去除(泳道6)，获得最终的LT缺失菌株ETECK88-(STb +，LT-)。
2.3 LT基因敲除后的溶血验证结果
LT基因的缺失会影响其溶血能力，可利用溶血反应检测LT肠毒素基因的敲除效果。如图6所示，野生型ETEC K88菌落生长部位的培养基内，红血球已发生溶解，菌落周围有明显可见的透明溶血圈；而LT基因敲除菌株ETEC K88-(STb +， LT-)生长的血平板上无溶血现象，这表明LT基因已被成功敲除，菌株已无溶血能力，毒性减弱。
2.4野生型和突变型菌株生长情况
如图7所示，毒力基因LT敲除后，突变菌株ETEC K88-(STb +，LT-)的生长情况相对野生型菌株发生了一些变化。在菌株的生长速率上，突变株明显比野生型K88菌株生长缓慢；在最大生长浓度上，野生株与突变株分别为OD600＝1.18 和0.98左右。这表明，LT与ETECK88菌株的生长有关，LT基因的缺失减缓了菌株的生长速度。
ETEC K88是造成动物腹泻和死亡失的主要病原菌之一[10,11]。目前，对ETEC 致病因子的研究主要集中于其所产肠毒素ST、LT及定植因子[12-15]。LT的毒性不仅仅在于其具有毒性基团，而且LT还能提高ETEC菌株和其他病原体对肠道上皮的粘附性能力，极大的增强了病原菌的致病性[16]。本发明中，以Crispr/Cas9 结合λ-Red同源重组技术首次成功敲除了ETEC菌株K88的LT基因，不仅为 ETEC K88毒素基因敲除方法提供了思路，而且对于其它一些与LT肠毒素类似的毒素大肠杆菌的基因敲除提供参考依据。
相比于ZFNs、TALENs等基因敲除系统[17,18]，Crispr技术的成本低、编辑效率更高，但其主要存在的问题是PAM位点选择的局限性和脱靶效应，本发明中，选择了介导切割效率更高的PAM序列NGG(AGG)[19]作为Cas9的识别位点，尽可能提高酶的剪切效率，从而提高基因编辑效率。与此同时，在此敲除系统中还引入了λ-Red重组酶基因，以防止K88自身同源重组系统对转入的外源供体片段的降解，提高了同源重组效率[20]，两系统的结合实现了对目的基因进行无痕敲除。
由于抗原(红血球)和抗体(溶血素)可进行特异性的结合，并吸引补体，而使红血球在补体的作用下被溶解，因此可产生溶血现象[21]。本申请的发明人发现，野生型ETECK88中LT基因表达的不耐热肠毒素LT具有抗原性可以产生溶血现象，但是敲除菌株则无溶血现象。此外，对LT基因敲除前后菌株的生长情况的测定发现，LT基因的缺失不仅与ETECK88的毒性相关，还影响其正常的生长。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
参考文献：
[1].WANG H,ZHONG Z,LUO Y,et al.Heat-Stable Enterotoxins ofEnterotoxigenic Escherichia coli and Their Impact on Host Immunity[J].Toxins,2019,11(1):24-36.
[2].SIMON N C,KLAUS A,and BARBIERI J T.Novel bacterial ADP-ribosylating toxins: structure and function[J].Nature Reviews Microbiology,2014,12(9):599-611.
[3].MONTAGUE T,CRUZ J,GAGNON J,et al.CHOPCHOP:a CRISPR/Cas9 and TALENweb tool for genome editing[J].Nucleic Acids Research,2014,42(1):401-407.
[4].杨佳儒,郭美华,柳爱华,et al.CRISPR-Cas9的原理及其应用进展[J].昆明医科大学学报,2016,37(5):118-122.
YANG J R,GUO M H,LIU A H,et al.Priciple and Application Progress ofCRISPR-Cas9. Journal of Kuming Medical University,2016,37(5):118-122.(inChinese)
[5].MA Y,ZHANG L,and HUANG X.Genome modification by CRISPR/Cas9[J].The FEBS Journal,2014,281(23):5186-5193.
[6].JIANG F and DOUDNA J A.CRISPR-Cas9 structures and mechanisms[J].Annual review of biophysics,2017,46:505-529.
[7].LIU S-C,LU H-H,FAN H-C,et al.The identification of the TRPM8channel on primary culture of human nasal epithelial cells and its responseto cooling[J].Medicine, 2017,96(31):e7640-e7640.
[8].LEE Z H,YAMAGUCHI N,and ITO T,Using CRISPR/Cas9 system tointroduce targeted mutation in Arabidopsis,in Plant transcription factors:Methods and Protocols,N.Yamaguchi,Editor. 2018,Springer New York:New York,NY.p.93-108.
[9].余深翼,赵金荣,郑玲红,et al.利用CRISPR/Cas 9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用[J].畜牧兽医学报,2016,47(4):762-770.(in Chinese)；
YU S Y,ZHAO J R,ZHENG L H,et al.The application of CRISPR/Cas 9technology for aroA gene knockout in Escherichia coli.Acta veterinaria etZootechnica Sinica,2016,47(4):762-770.
[10].NAGY B and FEKETE P Z.Enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC)infarm animals[J]. Veterinary Research,1999,30(2-3):259-284.
[11].DUBREUIL J D,ISAACSON R E,and SCHIFFERLI D M.Animalenterotoxigenic Escherichia coli[J].Ecosal Plus,2016,7(1):1-47.
[12].KAPER J B,NATARO J P,and MOBLEY H L.Pathogenic Escherichia coli[J].Nature Reviews Microbiology,2004,295(6):355-356.
[13].WEIGLMEIER P R,R SCH P,and BERKNER H.Cure and curse:E.coli heat-stable enterotoxin and its receptor guanylyl cyclase C[J].Toxins,2010,2(9):2213-2229.
[14].VON MENTZER A,TOBIAS J,WIKLUND G,et al.Identification andcharacterization of the novel colonization factor CS30 based on whole genomesequencing in enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC)[J].Scientific reports,2017,7(1):12514-12524.
[15].NAGY B and FEKETE P Z.Enterotoxigenic Escherichia coli inveterinary medicine[J]. Journal of Medical Microbiology,2005,295(6):443-454.
[16].VERBRUGGHE E,VAN P A,LEYMAN B,et al.Heat-labile enterotoxin ofEscherichia coli promotes intestinal colonization of Salmonella enterica[J].Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases,2015,43:1-7.
[17].ZANG D,WANG C,JI X,et al.Tamarix hispida zinc finger proteinThZFP1participates in salt and osmotic stress tolerance by increasing prolinecontent and SOD and POD activities[J].Plant Science,2015,235:111-121.
[18].BEUMER K J,TRAUTMAN J K,CHRISTIAN M,et al.Comparing zinc fingernucleases and transcription activator-like effector nucleases for genetargeting in Drosophila[J].G3 Genes Genomes Genetics,2013,3(10):1717-1725.
[19].ZHANG Y,GE X,YANG F,et al.Comparison of non-canonical PAMs forCRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells[J].Scientific Reports,2014,4:5405-5409.
[20].THOMASON L C,COSTANTINO N,and COURT D L.Examining a DNAreplication requirement for bacteriophageλRed-and Rac prophage RecET-Promotedrecombination in Escherichia coli[J].Mbio,2016,7(5):e01443-16.
[21].杨正时and钟熙.平板免疫溶血法检测产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素[J].医学研究杂志,1987,16(8):13-14.
YANG Z S and ZHONG X.Detection of toxigenic Escherichia coli heat-labile enterotoxin by plate immunohemolytic method[J].Journal of medicalresearch,1987,16(8):13-14(in Chinese)。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院动物科学研究所
<120> 一种肠毒素基因LT敲除的大肠杆菌及其构建方法
<130> 2019
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1282
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttcatttttt ttattttatt agcatcgcca ttatatgcaa atggcgacaa attataccgt 60
gctgattcat gtgcagctcc atcagcaaaa ggggatgata agtttatcac caccgactat 120
ttgcaacagt gccgttgatc gtgctatgat cgactgttat ctctggcggt gttgacactg 180
gagcacctca aaaacaccat catacactaa atcagtaagt tggcagcatc acccgacgca 240
ctttgcgccg aataaatacc tgtgacggaa gatcacttcg cagaataaat aaatcctggt 300
gtccctgttg ataccgggaa gccctgggcc aacttttggc gaaaatgaga cgttgatcgg 360
cacgtaagag gttccaactt tcaccataat gaaataagat cactaccggg cgtatttttt 420
gagttatcga gattttcagg agctaaggaa gctaaaatgg agaaaaaaat cactggatat 480
accaccgttg atatatccca atggcatcgt aaagaacatt ttgaggcatt tcagtcagtt 540
gctcaatgta cctataacca gaccgttcag ctggatatta cggccttttt aaagaccgta 600
aagaaaaata agcacaagtt ttatccggcc tttattcaca ttcttgcccg cctgatgaat 660
gctcatccgg aattccgtat ggcaatgaaa gacggtgagc tggtgatatg ggatagtgtt 720
cacccttgtt acaccgtttt ccatgagcaa actgaaacgt tttcatcgct ctggagtgaa 780
taccacgacg atttccggca gtttctacac atatattcgc aagatgtggc gtgttacggt 840
gaaaacctgg cctatttccc taaagggttt attgagaata tgtttttcgt ctcagccaat 900
ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta aacgtggcca atatggacaa cttcttcgcc 960
cccgttttca ccatgggcaa atattatacg caaggcgaca aggtgctgat gccgctggcg 1020
attcaggttc atcatgccgt ctgtgatggc ttccatgtcg gcagaatgct taatgaatta 1080
caacagtact gcgatgagtg gcagggcggg gcgtaatagt ccatcgaacc gaagtaagga 1140
caattaacag ttaacaaata agcggagaac gagatgacgt tgttgtatga tatataagtt 1200
ttcctcgatg aaaaatataa ctagtatgga aaactagttt gctttaaaag catgtctaat 1260
gctaggaacc tatataacaa ct 1282
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cggattgtct tcttgtatga t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatcggtatt gcctcctcta c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgtaaaacga cgacgccagt 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caggaaacag ctatgacc 18
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttcatttttt ttattttatt agcatcgc 28
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agttgttata taggttccta gcatt 25
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tatcggcaca aatagcgtcg g 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
catgcttctt gtcttcttcc acc 23
<210> 10
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttcatttttt ttattttatt agcatcgcca ttatatgcaa atggcgacaa attataccgt 60
gctga 65
<210> 11
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgatcggcac gtaagaggtt ccaactttca ccataatgaa ataagatcac taccgggcgt 60
attttttgag ttatcgagat tttcaggagc taaggaagct aaa 103
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tagtccatcg aaccgaagta 20
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ttgtatgata tataagtttt cctcgatgaa aaatataact 40
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
agtatggaaa actagtttgc tttaaaagca tgtctaatgc taggaaccta tataacaact 60

Claims (1)

1.一种肠毒素基因LT敲除的大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
1）根据LT基因及其上、下游序列设计LT基因的5’端同源臂序列L-short和L-arm，3’端同源臂序列R-arm，以DNA片段Cat-chl cassette为LT的替代基因，构建LT基因同源重组供体LT donar，LT donar的碱基序列依次包括L-arm、cat promoter、CmR、sgCommon、PAM、L-short、R-arm多核苷酸片段；以及
2）制备含pCas-Red质粒的感受态细胞ETEC K88，加入步骤1）的LT donar进行转化，然后接种于含Amp，IPTG和L-阿拉伯糖的LB培养基中，诱导CRISPR/Cas9系统和λ-RED蛋白表达，筛选得到阳性克隆，即得无痕敲除了热不稳定肠毒素基因LT的大肠杆菌；
其中所述L-arm的碱基序列如SEQ ID NO.10所示，L-short的碱基序列如SEQ ID NO.13所示，R-arm的碱基序列如SEQ ID NO.14所示；
所述cat promoter的碱基序列如SEQ ID NO.11所示；
所述sgCommon的碱基序列如SEQ ID NO.12所示；
所述PAM序列为AGG；
所述LT donar的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111154793B (zh) * 2020-01-14 2024-04-09 北京林业大学 基于crispr技术对大肠杆菌基因进行定点突变的方法
CN111454927B (zh) * 2020-03-16 2024-01-30 常州南京大学高新技术研究院 一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统及其应用
CN114540389B (zh) * 2020-11-26 2024-05-14 深圳华大生命科学研究院 一种制备基因工程病毒的方法及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106148376A (zh) * 2016-07-09 2016-11-23 扬州大学 一种K88ac+产肠毒素大肠杆菌致弱株构建方法与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106148376A (zh) * 2016-07-09 2016-11-23 扬州大学 一种K88ac+产肠毒素大肠杆菌致弱株构建方法与应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bolick DT等.Critical Role of Zinc in a New Murine Model of Enterotoxigenic Escherichia coli Diarrhea.《Infection and immunity》.2018,第86卷(第7期),e00183-18页，参见摘要. *
Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells;Yilan Zhang等;《Scientific Reports》;20140623(第4期);第5405页，参见全文 *
CRISPR/Cas9-assisted gRNA-free one-step genome editing with no sequence limitations and improved targeting efficiency;Dongdong Zhao等;《SCIENTIFIC REPORTS》;20171130;第7卷(第1期);第16624页，参见摘要，第2页第4段至第3页第1段，第5页第1段至第6页第2段，及第2页图1和第6页图4 *
Critical Role of Zinc in a New Murine Model of Enterotoxigenic Escherichia coli Diarrhea;Bolick DT等;《Infection and immunity》;20180621;第86卷(第7期);e00183-18页，参见摘要 *
Escherichia coli genes for heat-labile enterotoxin A subunit and B subunit;AB011677.1;《Genbank》;19980423;第1-2页，参见全文 *
K88ac+产肠毒素大肠杆菌强毒力岛HPI缺失株的构建及相关毒力功能探析;许绵;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20180115;D050-467页，参见摘要，第13-14页 *
大肠杆菌基因无痕敲除技术及策略;胡逢雪等;《生物技术通讯》;20130730;第24卷(第4期);第552-557页，参见全文 *

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