KR20210101260A - 무염색체 동적 활성 시스템 - Google Patents

무염색체 동적 활성 시스템 Download PDF

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아날리스 자운브레커 리브스
케이틀린 니콜 스폴딩
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Abstract

본 발명은 고활성 ADAS를 포함하는, 단리된 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 제공한다. 본 발명에 의해 제공된 이러한 ADAS는 다양한 수단에 의해 획득될 수 있다. 이러한 ADAS를 제조하고 이용하는 다양한 관련 방법이 제공된다.

Description

무염색체 동적 활성 시스템
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2019년 12월 10일자 생성된 상기 ASCII 카피는 명칭이 51296-033WO2_Sequence_Listing_12.10.19_ST25이며, 크기가 51,393 바이트이다.
발명의 분야
무염색체 동적 활성 시스템 및 이의 제조 및 이용 방법이 본원에 제공된다.
세포를 표적화하고 생물학적 작용제를 전달할 수 있는 전달 벡터, 이러한 전달 벡터를 함유하는 조성물 및 상기 벡터를 세포에 전달함으로써 동물, 식물 및 곤충 세포, 조직 및 유기체를 포함하는 생물학적 시스템을 조절하는 관련 방법에 대한 필요성이 있다.
본 발명은 특히, 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS), 예를 들어, 이종 카고(cargo)를 포함하는 ADAS, 이들의 제조 방법, 이들을 함유하는 조성물, 및 ADAS 및/또는 카고를 전달하는 및 생물학적 시스템을 조절하는 관련 방법을 제공한다. 본 발명은 적어도 부분적으로, 특정 구현예에서, 향상된 활성(즉, 고활성 ADAS)을 갖는 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)의 본 발명자들의 발견에 기초한다. 이들 고활성 ADAS는 화학적 작업, 단백질 생성 또는 카고의 전달과 같은 작업에 대하여 향상된 능력을 갖는다.
일 양태에서 본 개시는 복수의 ADAS를 포함하는 조성물의 제조 방법을 특징으로 하며, 상기 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없으며, 상기 방법은 (a) 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성의 감소를 갖는 복수의 부모 박테리아를 제조하거나, 제공하거나 또는 수득하는 단계; (b) 부모 박테리아를 미니세포의 형성을 가능하게 하는 조건에 노출시킴으로써, ADAS를 생성하는 단계; 및 (c) ADAS를 부모 박테리아로부터 분리함으로써, 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 SEQ ID NO: 1에 대하여 적어도 40% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 SEQ ID NO: 1에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성(topological specificity) 인자가 minE 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 부모 박테리아는 에스케리키아 콜라이(E. coli)이며, minE 폴리펩티드는 에스케리키아 콜라이 minE이다. 다른 구현예에서, 부모 박테리아는 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)이며, minE 폴리펩티드는 살모넬라 타이피무리움 minE이다.
일부 구현예에서, 부모 박테리아는 Z-링 저해 단백질의 수준 또는 활성의 감소를 갖는다. 일부 구현예에서, Z-링 저해 단백질은 SEQ ID NO: 2에 대하여 적어도 40% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, Z-링 저해 단백질은 SEQ ID NO: 2에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, Z-링 저해 단백질은 SEQ ID NO: 3에 대하여 적어도 40% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, Z-링 저해 단백질은 SEQ ID NO: 3에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
상기 양태의 일부 구현예에서, Z-링 저해 단백질은 minC 폴리펩티드 또는 minD 폴리펩티드이다.
상기 양태의 일부 구현예에서, ADAS는 적어도 2개의 Z-링 저해 단백질의 발현의 감소, 예를 들어, minC 폴리펩티드 및 minD 폴리펩티드의 발현의 감소를 갖는다.
일부 구현예에서, ADAS는 minC 폴리펩티드, minD 폴리펩티드 및 minE 폴리펩티드의 발현의 감소를 갖는다.
상기 양태의 다른 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 SEQ ID NO: 4에 대하여 적어도 40% 동일성, 예를 들어 SEQ ID NO: 4에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성(topological specificity) 인자가 DivIVA 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 부모 박테리아는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이며, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 바실러스 서브틸리스 DivIVA이다.
상기 양태의 일부 구현예에서, 수준 또는 활성의 감소는 기능-소실 돌연변이에 의해 야기된다. 일부 구현예에서, 기능-소실 돌연변이는 minCDE 오페론의 결실 또는 DiVIVA의 결실이다.
상기 양태의 일부 구현예에서, ADAS는 적어도 1 mM, 1.2 nM, 1.3 nM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 2 mM, 2.5 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM 또는 50 mM의 초기 ATP 농도를 갖는다.
상기 양태의 일부 구현예에서, 부모 박테리아는 에스케리키아, 아시네토박터(Acinetobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아나바에나(Anabaena), 아퀴펙스(Aquifex), 아조아르쿠스(Azoarcus), 아조토박터(Azotobacter), 보르데텔라(Bordetella), 브라디리조비움(Bradyrhizobium), 브루셀라(Brucella), 부크네라(Buchnera), 부크홀데리아(Burkholderia), 칸디다투스(Candidatus), 크로모박테리움(Chromobacterium), 크로코스파에라(Crocosphaera), 데클로로모나스(Dechloromonas), 데술피토박테리움(Desulfitobacterium), 데술포탈레아(Desulfotalea), 에르위니아(Erwinia), 프란시셀라(Francisella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 글로에오박터(Gloeobacter), 글루코노박터(Gluconobacter), 헬리코박터, 레지오넬라(Legionella), 마그네토스피릴룸(Magnetospirillum), 메조리조비움(Mesorhizobium), 메틸로코커스(Methylococcus), 네이세리아(Neisseria), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 노스톡(Nostoc), 포토박테리움(Photobacterium), 포토랍두스(Photorhabdus), 폴라로모나스(Polaromonas), 프로클로로코커스(Prochlorococcus), 슈도모나스, 사이크로박터(Psychrobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 루브리비박스(Rubrivivax), 살모넬라, 시와넬라(Shewanella), 시겔라, 시노리조비움(Sinorhizobium), 시네코코커스(Synechococcus), 시네코시스티스(Synechocystis), 써모시네코코커스(Thermosynechococcus), 써모토가(Thermotoga), 써무스(Thermus), 티오바실러스(Thiobacillus), 트리코데스미움(Trichodesmium), 비브리오(Vibrio), 위글레스워티아(Wigglesworthia), 울리넬라(Wolinella), 잔토모나스(Xanthomonas), 자일렐라(Xylella), 예르시니아, 바실러스, 클로스트리디움(Clostridium), 데이노코커스(Deinococcus), 엑시구오박테리움(Exiguobacterium), 게오바실러스(Geobacillus), 락토바실러스, 락토바실러스, 무렐라(Moorella), 오세아노바실러스(Oceanobacillus), 심비오박테리움(Symbiobacterium) 또는 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter)중 임의의 것이며, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 부모 박테리아의 내인성 minE 또는 DivIVA이다.
상기 양태의 일부 구현예에서, 단계 (c)의 조성물은 100 콜로니-형성 유닛(CFU/mL) 미만의 생존 가능한 박테리아 세포, 예를 들어, 10 CFU/mL 미만, 1 CFU/mL 미만 또는 0.1 CFU/mL 미만의 생존 가능한 박테리아 세포를 포함한다.
상기 양태의 일부 구현예에서, ADAS는 카고를 포함한다.
상기 양태의 일부 구현예에서, 조성물은 동물로 전달되기 위해 제형화되거나/제형화되고; 식물로 전달되기 위해 제형화되거나/제형화되고; 곤충으로 전달되기 위해 제형화되거나/제형화되고; 액체, 고체, 에어로졸, 페이스트, 겔 또는 기체 조성물로서 제형화된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 특징으로 하며, ADAS는 적어도 1 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, ADAS는 적어도 1.2 nM, 1.3 nM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 2 mM, 또는 2.5 mM의 초기 ATP 농도를 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 복수의 고활성 ADAS를 포함하는 조성물을 특징으로 하며, 당해 ADAS는 적어도 3 mM의 초기 ATP 농도를 가지며 당해 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, ADAS의 조성물은 적어도 4 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM 또는 50 mM의 초기 ATP 농도를 갖는다.
조성물의 일부 구현예에서, ADAS의 ATP 농도가 12시간 동안 37℃에서 인큐베이션 후에 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 또는 적어도 200%만큼 증가된다.
조성물의 일부 구현예에서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성의 감소를 갖는 부모 박테리아로부터 유래된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 특징으로 하며, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자를 포함하지 않으며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 특징으로 하며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없으며, 하기를 포함하는 과정에 의해 생성된다: (a) 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성의 감소를 갖는 복수의 부모 박테리아를 제조하거나, 제공하거나 또는 수득하는 단계; (b) 부모 박테리아를 미니세포(minicell)의 형성을 가능하게 하는 조건에 노출시킴으로써, 고활성 ADAS를 생성하는 단계; 및 (c) ADAS를 부모 박테리아로부터 분리함으로써, 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 조성물을 생성하는 단계.
일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 SEQ ID NO: 1에 대하여 적어도 40% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 SEQ ID NO: 1에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성(topological specificity) 인자가 minE 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 부모 박테리아는 에스케리키아 콜라이(E. coli)이며, minE 폴리펩티드는 에스케리키아 콜라이 minE이다.
일부 구현예에서, 부모 박테리아는 살모넬라 타이피무리움이며, minE 폴리펩티드는 살모넬라 타이피무리움 minE이다.
일부 구현예에서, 부모 박테리아는 에스케리키아, 아시네토박터(Acinetobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아나바에나(Anabaena), 아퀴펙스(Aquifex), 아조아르쿠스(Azoarcus), 아조토박터(Azotobacter), 보르데텔라(Bordetella), 브라디리조비움(Bradyrhizobium), 브루셀라(Brucella), 부크네라(Buchnera), 부크홀데리아(Burkholderia), 칸디다투스(Candidatus), 크로모박테리움(Chromobacterium), 크로코스파에라(Crocosphaera), 데클로로모나스(Dechloromonas), 데술피토박테리움(Desulfitobacterium), 데술포탈레아(Desulfotalea), 에르위니아(Erwinia), 프란시셀라(Francisella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 글로에오박터(Gloeobacter), 글루코노박터(Gluconobacter), 헬리코박터, 레지오넬라(Legionella), 마그네토스피릴룸(Magnetospirillum), 메조리조비움(Mesorhizobium), 메틸로코커스(Methylococcus), 네이세리아(Neisseria), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 노스톡(Nostoc), 포토박테리움(Photobacterium), 포토랍두스(Photorhabdus), 폴라로모나스(Polaromonas), 프로클로로코커스(Prochlorococcus), 슈도모나스, 사이크로박터(Psychrobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 루브리비박스(Rubrivivax), 살모넬라, 시와넬라(Shewanella), 시겔라, 시노리조비움(Sinorhizobium), 시네코코커스(Synechococcus), 시네코시스티스(Synechocystis), 써모시네코코커스(Thermosynechococcus), 써모토가(Thermotoga), 써무스(Thermus), 티오바실러스(Thiobacillus), 트리코데스미움(Trichodesmium), 비브리오(Vibrio), 위글레스워티아(Wigglesworthia), 울리넬라(Wolinella), 잔토모나스(Xanthomonas), 자일렐라(Xylella), 예르시니아, 바실러스, 클로스트리디움(Clostridium), 데이노코커스(Deinococcus), 엑시구오박테리움(Exiguobacterium), 게오바실러스(Geobacillus), 락토바실러스, 락토바실러스, 무렐라(Moorella), 오세아노바실러스(Oceanobacillus), 심비오박테리움(Symbiobacterium) 또는 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter)이며, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 부모 박테리아의 내인성 minE 또는 DivIVA이다.
일부 구현예에서, ADAS는 Z-링 저해 단백질의 수준의 감소를 갖는다.
일부 구현예에서, Z-링 저해 단백질은 SEQ ID NO: 2에 대하여 적어도 40% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, Z-링 저해 단백질은 SEQ ID NO: 3에 대하여 적어도 40% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, Z-링 저해 단백질은 minC 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, Z-링 저해 단백질은 minD 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, ADAS는 적어도 2개의 Z-링 저해 단백질의 발현의 감소를 갖는다.
일부 구현예에서, ADAS는 minC 폴리펩티드 및 minD 폴리펩티드의 발현의 감소를 갖는다.
일부 구현예에서, ADAS는 minC 폴리펩티드, minD 폴리펩티드 및 minE 폴리펩티드의 발현의 감소를 갖는다.
일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 SEQ ID NO: 4에 대하여 적어도 40% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 SEQ ID NO: 4에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성(topological specificity) 인자가 DivIVA 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 부모 박테리아는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이며, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 바실러스 서브틸리스 DivIVA이다.
일부 구현예에서, 수준 또는 활성의 감소는 기능-소실 돌연변이에 의해 야기된다.
일부 구현예에서, 기능-소실 돌연변이가 유전자 결실이다.
일부 구현예에서, 기능 소실 돌연변이는 유도성 기능-소실 돌연변이이며, 기능 소실은 부모 세포를 유도 조건에 노출시킴으로써 유도된다.
일부 구현예에서, 유도성 기능-소실 돌연변이는 온도 감수성 돌연변이이며, 유도 조건은 온도 조건이다.
일부 구현예에서, 부모 세포는 minCDE 오페론의 결실을 갖는다.
일부 구현예에서, ADAS는 기능적 전사 시스템 및 기능적 번역 시스템을 포함한다.
일부 구현예에서, ADAS는 이종 단백질을 생산한다.
일부 구현예에서, ADAS는 플라스미드를 포함하며, 플라스미드는 유도성 프로모터 및 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, ADAS를 적절한 조건 하에서 유도성 프로모터의 유도제와 접촉시키는 것은 이종 단백질의 생성을 초래한다.
일부 구현예에서, 이종 단백질의 생성은 유도제와 접촉되지 않은 ADAS에 비하여 유도제와 접촉된 ADAS에서 적어도 1.6배 증가된다.
일부 구현예에서, 이종 단백질의 생성 속도는 ADAS와 유도제의 접촉 3시간 이내에 표적 수준에 도달한다.
일부 구현예에서, 이종 단백질은 ADAS당 시간당 적어도 0.1 펨토그램의 속도에서 생성된다.
일부 구현예에서, 이종 단백질은 적어도 8시간의 기간 동안 생성된다.
일부 구현예에서, 조성물은 100 콜로니-형성 유닛(CFU/mL) 미만의 생존 가능한 박테리아 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 10 CFU/mL 미만, 1 CFU/mL 미만 또는 0.1 CFU/mL 미만의 생존 가능한 박테리아 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, ADAS는 카고를 포함한다.
일부 구현예에서, 카고는 핵산, 플라스미드, 폴리펩티드, 단백질, 효소, 아미노산, 소분자, 유전자 편집 시스템, 호르몬, 면역 조절제, 탄수화물, 지질, 유기 입자, 무기 입자 또는 리보핵단백질 복합체(RNP)이다.
일부 구현예에서, 카고가 ADAS에 의해 캡슐화된다.
일부 구현예에서, 카고가 ADAS의 표면에 부착된다.
일부 구현예에서, 핵산은 DNA, RNA, 또는 플라스미드이다.
일부 구현예에서, 핵산은 단백질을 인코딩한다.
일부 구현예에서, 효소가 기질을 변경시켜 표적 산물을 생산한다.
일부 구현예에서, 기질은 ADAS에 존재하며, 표적 생성물은 ADAS에서 생성된다.
일부 구현예에서, 기질은 ADAS가 전달되는 환경 또는 표적 세포에 존재한다.
일부 구현예에서, ADAS는 이종 박테리아 분비 시스템을 포함한다.
일부 구현예에서, 이종 박테리아 분비 시스템은 제3형 분비 시스템이다(T3SS).
일부 구현예에서, 카고는 박테리아 분비 시스템에 의한 유출을 지시하는 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, ADAS는 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 나노바디, 탄수화물 결합 단백질 또는 종양-표적화 펩티드이다.
일부 구현예에서, ADAS는 야생형 부모 박테리아로부터 생성된 ADAS에 비하여 감소된 프로테아제 수준 또는 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, ADAS는 적어도 하나의 프로테아제의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형된 부모 박테리아로부터 생성된다.
일부 구현예에서, ADAS는 야생형 부모 박테리아로부터 생성되는 ADAS에 비하여 감소된 RNase 수준 또는 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, ADAS는 적어도 하나의 RNase의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형된 부모 박테리아로부터 생성된다.
일부 구현예에서, RNase이 엔도리보뉴클레아제 또는 엑소리보뉴클레아제이다.
일부 구현예에서, ADAS는 감소된 지질다당류(LPS)를 갖도록 변형된다.
일부 구현예에서, ADAS는 감소된 LPS를 갖도록 변형된 부모 박테리아로부터 생성된다.
일부 구현예에서, 변형은 지질 A 생합성 미리스토일트랜스퍼라제(msbB) 내의 돌연변이이다.
일부 구현예에서, ADAS는 포유동물의 병원체인 부모 박테리아로부터 또는 포유동물에 대하여 편리공생성인 부모 박테리아로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 포유동물 편리공생성 박테리아는 스타필로코커스(Staphylococcus), 비피도박테리아(Bifidobacterium), 마이크로코커스(Micrococcus), 락토바실러스(Lactobacillus) 또는 악티노마이세스(Actinomyces) 종이거나, 포유동물 병원성 박테리아는 장출혈성 에스케리키아 콜라이(enterohemorrhagic Escherichia coli; EHEC), 살모넬라 타이피무리움, 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 예르시니아 엔테롤리티카(Yersinia enterolitica) 또는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)이다.
일부 구현예에서, ADAS는 식물 병원체인 부모 박테리아로부터 또는 식물에 대하여 편리공생성인 부모 박테리아로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 식물 편리공생성 박테리아는 바실러스 서브틸리스 또는 슈도모나스 푸티다(Psuedomonas putida)이거나, 식물 병원성 박테리아는 잔토모나스(Xanthomonas) 종 또는 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae)이다.
일부 구현예에서, ADAS는 영양요구성 부모 박테리아로부터 유래된다.
일부 구현예에서, ADAS는 동결건조되고 재구성되며, 재구성된 ADAS는 동결건조되지 않은 ADAS의 ATP 농도의 적어도 95%인 ATP 농도를 갖는다.
일부 구현예에서, 재구성된 ADAS는 동결건조되지 않은 ADAS의 ATP 농도와 적어도 동일한 ATP 농도를 갖는다.
일부 구현예에서, 조성물은 동물로의 전달을 위해 제형화된다.
일부 구현예에서, 조성물은 복강내, 정맥내, 근육내, 경구, 국부, 에어로졸, 또는 분무화 투여를 위해 제형화된다.
일부 구현예에서, 조성물은 식물로의 전달을 위해 제형화된다.
일부 구현예에서, 조성물은 곤충으로의 전달을 위해 제형화된다.
일부 구현예에서, 조성물은 액체, 고체, 에어로졸, 페이스트, 겔 또는 기체 조성물로서 제형화된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 고활성 ADAS를 표적 세포에 전달하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (a) 복수의 고활성 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS가 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 단계; 및 (b) 표적 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 ADAS를 표적 세포에 전달하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 복수의 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및 표적 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
이러한 복수의 ADAS를 전달하는 방법에 관한 일부 구현예에서, 표적 세포는 동물 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 카고를 표적 세포에 전달하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS가 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, ADAS가 카고를 포함하며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 단계; 및 (b) 표적 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 카고를 표적 세포에 전달하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 복수의 부모 박테리아로부터 유래되며, ADAS가 카고를 포함하며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및 표적 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
카고의 전달에 관한 구현예에서, 표적 세포는 동물 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 동물 세포의 상태를 조절하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS가 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 단계; 및 (b) 동물 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 동물 세포의 상태를 조절하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 방법은 식물 세포의 상태의 조절 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS가 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 단계; 및 (b) 식물 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 식물 세포의 상태를 조절하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 곤충 세포의 상태의 조절 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS가 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 단계; 및 (b) 곤충 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 곤충 세포의 상태를 조절하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 동물 세포의 상태를 조절하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 복수의 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및 동물 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 동물 세포의 상태를 조절하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 식물 세포의 상태를 조절하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 복수의 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및 식물 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 식물 세포의 상태를 조절하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 곤충 세포의 상태를 조절하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 복수의 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및 곤충 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 곤충 세포의 상태를 조절하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 동물의 치료 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS가 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 단계; 및 (b) 동물을 유효량의 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 동물을 치료하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 동물의 치료 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 복수의 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및 동물을 유효량의 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 동물을 치료하는 단계를 포함한다.
동물의 치료의 일부 구현예에서, 동물은 암을 갖는다.
일부 구현예에서, ADAS는 화학요법 카고(예를 들어, 면역요법 카고)를 전달한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 식물의 치료 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS가 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 단계; 및 (b) 식물 또는 그의 유해물을 유효량의 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 식물을 치료하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 식물의 치료 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 복수의 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및 식물 또는 그의 유해물을 유효량의 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 식물을 치료하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 특징으로 하며, ADAS는 효소를 포함하며, 효소는 기질을 변경시켜, 표적 생성물을 생성한다.
이 조성물의 일부 구현예에서, 기질은 ADAS에 존재하며, 표적 생성물은 ADAS에서 생성된다.
일부 구현예에서, 기질은 ADAS가 전달되는 환경 또는 표적 세포에 존재한다.
일부 구현예에서, 효소는 디아데닐레이트 사이클라제 A이며, 기질은 ATP이며, 표적 생성물은 사이클릭-디-AMP이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a는 에스케리키아 콜라이 부모 박테리아 세포 및 그로부터 유래된 무염색체 동적 활성 세포(ADAS)를 보여주는 일련의 주사 전자 현미경사진이다. 좌측 열은 ADAS를 생성하도록 변형되지 않은 에스케리키아 콜라이 균주 MACH009의 박테리아 세포를 보여준다. 가운데 열은 ADAS를 생성하도록 변형된 에스케리키아 콜라이 균주 MACH060(ΔminCDE)의 박테리아 세포를 보여준다. ADAS 및 비정상적인 격막형성 사건을 겪고 있는 부모 세포가 가시적이다. 우측 열은 MACH060(ΔminCDE) 배양물로부터 정제된 ADAS를 보여준다.
도 1b는 MACH060(ΔminCDE)으로부터 유래된 ADAS를 보여주는 일련의 현미경사진이다. 좌측 패널은 입자의 위치를 보여주는 위상차 이미지이다. 가운데 패널은 DNA 염료 DAPI의 국소화를 보여주는 면역형광 이미지이다. 우측 패널은 지질다당류(LPS)에 대한 염료의 국소화를 보여주는 면역형광 이미지이다. 백색 화살표는 ADAS를 나타내며, 이는 LPS 염료의 존재 및 DAPI 염료의 부재에 의해 확인된다. 기준자는 10 μm이다.
도 1c는 스펙트라다인(Spectradyne)® nCS1 나노입자 분석기를 사용하여 측정되는 바와 같이, ADAS-생성 에스케리키아 콜라이 균주 MACH124(ΔminCDE) 유래의 ADAS의 정제된 집단에서의 주어진 직경의 입자의 농도(입자/mL)를 보여주는 그래프이다.
도 1d는 정제된 ADAS 제제 내의 200 내지 2000 nm 직경의 입자의 총 부피를 보여주는 막대 그래프이다.
도 1e는 MACH124(ΔminCDE) 배양물에, 그리고 배양물로부터 정제된 ADAS 제제에 존재하는 생존 가능한 박테리아 세포의 mL당 콜로니-형성 유닛(CFU)의 농도를 보여주는 막대 그래프이다.
도 1f는 ADAS-생성 에스케리키아 콜라이 균주 MACH060 및 MACH200(둘 모두의 ΔminCDE)의 배양물 내의, 그리고 각각의 배양물로부터 정제된 ADAS 제제 내의 DnaK 및 GroEL에 대한 면역블롯의 이미지이다. 10 ng의 정제된 DnaK 및 GroEL이 대조군으로서 제공된다(재조합 단백질).
도 2a는 BacTiter-GloTM 미생물 세포 생존력 검정을 사용하여 측정되는 바와 같이, 에스케리키아 콜라이 균주 MACH060(ΔminCDE) 유래의 정제된 ADAS의 집단에서 mMol의 ATP의 평균 농도를 보여주는 막대 그래프이다. 부모 박테리아에 의해 생성되는 ATP 농도를 백그라운드로서 제하였다.
도 2b는 BacTiter-GloTM 미생물 세포 생존력 검정을 사용하여 측정되는 바와 같이, 제0시간에 또는 과잉의 영양소의 존재 하에 37℃에서 2시간의 진탕 인큐베이션 후에, 에스케리키아 콜라이 균주 MACH060(ΔminCDE) 유래의 정제된 ADAS의 집단의 분취액에서의 발광을 보여주는 막대 그래프이다.
도 2c는 GFP의 발현을 활성화시키는 유도제인, 안하이드로테트라사이클린(100 ng/mL)의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션시킨 MACH124(ΔminCDE) 배양물에서의, 그리고 배양물로부터 정제된 ADAS 제제에서의 시간이 지남에 따른 GFP 형광(au)을 보여주는 그래프이다. 모든 시료를 항생제의 존재 하에 성장시켜, 임의의 박테리아 성장을 방지하였다. 부모 박테리아의 농도는 ADAS 제제에서 검출되는 CFU의 수(100 CFU/mL)와 동등하였다.
도 2d는 스펙트라다인® nCS1 나노입자 분석기를 사용하여 측정되는 바와 같이, 제제 내의 ADAS의 수에 대하여 정규화된 도 2c의 GFP 형광 데이터를 보여주는 그래프이다. 데이터는 108개의 ADAS 입자당 유도 배수로서 그래프에 나타나 있다.
도 2e는 도 2c의 유도된 및 비유도된 ADAS 제제 간의 GFP 형광의 배수 변화를 보여주는 그래프이다. 유도된 반복실험의 평균 값을 비유도된 반복실험의 평균 값으로 나누어, 배수 변화를 계산하였다.
도 2f는 0, 2, 4, 17 또는 24시간 동안 유도제인, 안하이드로테트라사이클린의 존재 하에 성장시키고, MACH124(ΔminCDE)로부터 정제된, 정제된 ADAS 제제로부터의 250 μL 분취액 내의 GFP에 대한 면역블롯의 일련의 이미지이다(상측 패널). 각각의 레인(lane)은 nCS1 분석에 의해 결정되는 바와 같이, 대략 5.2x107개의 ADAS에 상응한다. GFP 세기를 덴시토메트리(densitometry)에 의해 정량화하고, 로딩 대조군 GroEL의 세기에 대하여 정규화시키고, 동일한 블롯 상에 처리되는, 정제된 재조합 GFP의 분자 표준물질에 대한 비교에 의해 GFP의 질량(ng)으로 전환시켰다(하측 패널).
도 3a는 MACH124(ΔminCDE), MACH556(ΔminC) 및 MACH557(ΔminD) 에스케리키아 콜라이 부모 박테리아 균주로부터 정제된 ADAS 제제에서의 시간이 지남에 따른 108개의 ADAS 입자당 GFP 형광(au)을 보여주는 그래프이다. ADAS를 GFP의 발현을 활성화시키는 유도제인, 안하이드로테트라사이클린(100 ng/mL)의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션시켰다. 비유도된 반복실험의 평균 값을 각각의 유도된 반복실험으로부터 제함으로써 GFP 형광을 계산하였다. 모든 시료를 항생제의 존재 하에 성장시켜, 임의의 박테리아 성장을 방지하였다.
도 3b는 도 3a의 유도된 및 비유도된 ADAS 제제 간의 GFP 형광의 배수 변화를 보여주는 그래프이다. 유도된 반복실험의 평균 값을 비유도된 반복실험의 평균 값으로 나누어, 배수 변화를 계산하였다.
도 3c는 유도제인, 안하이드로테트라사이클린의 존재(+) 또는 부재(-) 하에 성장시키고, MACH124(ΔminCDE), MACH556(ΔminC) 및 MACH557(ΔminD)로부터 정제된, ADAS에서의 GFP에 대한 면역블롯의 이미지이다.
도 3d는 도 3c의 면역블롯에 대한 백그라운드 보정을 보여주는 막대 그래프이다.
도 3e는 도 3c의 면역블롯에 대한 정규화된 GFP 밀도를 보여주는 막대 그래프이다. GFP 세기를 덴시토메트리에 의해 정량화하고, 로딩 대조군 GroEL의 세기에 대하여 정규화시켰다.
도 3f는 BioTek® 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정되는 바와 같이, MACH124(ΔminCDE), MACH556(ΔminC) 및 MACH557(ΔminD)로부터 정제된 ADAS에서의 형광 유닛(au)의 총 GFP 생성을 보여주는 막대 그래프이다. **는 0.0021의 p 값을 나타낸다. ***는 0.0006의 p 값을 나타낸다.
도 3g는 MACH124(ΔminCDE), MACH556(ΔminC) 및 MACH557(ΔminD)로부터 정제된 ADAS에서의 시간당 GFP 생성을 보여주는 막대 그래프이다.
도 3h는 MACH124(ΔminCDE)로부터 생성된 ADAS에 비한, MACH556(ΔminC) 및 MACH557(ΔminD)로부터 정제된 ADAS에서의 GFP 생성의 백분율을 보여주는 막대 그래프이다. MACH124의 단백질 생성 수준을 100%로 설정하였으며, MACH556 및 MACH557에 대한 상대적 단백질 생성을 MACH124에 대하여 정규화시켰다.
도 4는 배양물의 광학 밀도(OD600)에 대하여 정규화된 MACH060 및 MACH284로부터 정제된 ADAS에 대한 DyLight™ 550 형광단의 형광을 보여주는 막대 그래프이다. MACH284는 DyLight™ 550 형광단에 컨쥬게이트된 항체에 의해 검출 가능한 Neae-NB2(나노바디) 융합 단백질을 발현한다.
도 5a는 MACH060으로부터 정제된 ADAS, MACH198로부터 정제된 비유도된 ADAS, 및 효소 데아데닐레이트 사이클라제 A(DacA)를 생성하도록 안하이드로테트라사이클린을 사용하여 유도된 MACH198로부터 정제된 ADAS와 접촉시킨 THP1-DualTM 단핵구에서의 THP1-DualTM 시스템의 발광 판독치를 보여주는 막대 그래프이다.
도 5b는 MACH060으로부터 정제된 ADAS, MACH198로부터 정제된 비유도된 ADAS, 및 효소 DacA를 생성하도록 안하이드로테트라사이클린을 사용하여 유도된 MACH198로부터 정제된 ADAS와 접촉시킨 THP1-DualTM 단핵구의 표현형을 보여주는 일련의 현미경사진이다.
도 5c는 ELISA 검정을 사용하여 측정되는 바와 같이, MACH060으로부터 정제된 ADAS, MACH198로부터 정제된 비유도된 ADAS, 및 효소 DacA를 생성하도록 안하이드로테트라사이클린을 사용하여 유도된 MACH198로부터 정제된 ADAS와 접촉시킨 THP1-DualTM 단핵구에 의해 배양물 내에 분비되는 pg/mL의 인터페론 베타(IFN-B1)의 농도를 보여주는 막대 그래프이다.
도 6은 유럽 조명 나방(European Corn Borer; ECB) 애벌레에서 MACH301로부터 유래된 DyLight™ 800 NHS 에스테르-표지된 ADAS의 형광을 보여주는 일련의 현미경사진이다. 패널 A 및 B는 DyLight™ 800의 형광을 보여준다. 패널 C 및 D는 700 nm에서의 애벌레의 자가형광을 보여준다. 패널 A 및 C는 PBS를 공급한 대조군 애벌레를 보여주며, 패널 B 및 D는 DyLight™ 800 NHS 에스테르-표지된 ADAS를 공급한 애벌레를 보여준다.
도 7a는 MACH124(ΔminCDE) 에스케리키아 콜라이 부모 박테리아 균주로부터 정제된 ADAS 제제에서 시간이 지남에 따른 108개의 ADAS 입자당 GFP 형광(au)을 보여주는 그래프이며, ADAS 제제를 0일 또는 3일 동안 4℃에서 보관하였다. ADAS를 GFP의 발현을 활성화시키는 유도제인, 안하이드로테트라사이클린(100 ng/mL)의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션시켰다. 비유도된 반복실험의 평균 값을 각각의 유도된 반복실험으로부터 제함으로써 GFP 형광을 계산하였다. 모든 시료를 항생제의 존재 하에 성장시켜, 임의의 박테리아 성장을 방지하였다.
도 7b는 MACH556(ΔminC) 에스케리키아 콜라이 부모 박테리아 균주로부터 정제된 ADAS 제제에서 시간이 지남에 따른 108개의 ADAS 입자당 GFP 형광(au)을 보여주는 그래프이며, ADAS 제제를 0일 또는 3일 동안 4℃에서 보관하였다. ADAS를 GFP의 발현을 활성화시키는 유도제인, 안하이드로테트라사이클린(100 ng/mL)의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션시켰다. 비유도된 반복실험의 평균 값을 각각의 유도된 반복실험으로부터 제함으로써 GFP 형광을 계산하였다. 모든 시료를 항생제의 존재 하에 성장시켜, 임의의 박테리아 성장을 방지하였다.
도 7c는 MACH557(ΔminD) 에스케리키아 콜라이 부모 박테리아 균주로부터 정제된 ADAS 제제에서 시간이 지남에 따른 108개의 ADAS 입자당 GFP 형광(au)을 보여주는 그래프이며, ADAS 제제를 0일 또는 3일 동안 4℃에서 보관하였다. ADAS를 GFP의 발현을 활성화시키는 유도제인, 안하이드로테트라사이클린(100 ng/mL)의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션시켰다. 비유도된 반복실험의 평균 값을 각각의 유도된 반복실험으로부터 제함으로써 GFP 형광을 계산하였다. 모든 시료를 항생제의 존재 하에 성장시켜, 임의의 박테리아 성장을 방지하였다.
도 7d는 도 7a의 유도된 및 비유도된 ADAS 제제 간의 GFP 형광의 배수 변화를 보여주는 그래프이다. 유도된 반복실험의 평균 값을 비유도된 반복실험의 평균 값으로 나누어, 배수 변화를 계산하였다.
도 7e는 도 7b의 유도된 및 비유도된 ADAS 제제 간의 GFP 형광의 배수 변화를 보여주는 그래프이다. 유도된 반복실험의 평균 값을 비유도된 반복실험의 평균 값으로 나누어, 배수 변화를 계산하였다.
도 7f는 도 7c의 유도된 및 비유도된 ADAS 제제 간의 GFP 형광의 배수 변화를 보여주는 그래프이다. 유도된 반복실험의 평균 값을 비유도된 반복실험의 평균 값으로 나누어, 배수 변화를 계산하였다.
도 7g는 MACH124(ΔminCDE) 에스케리키아 콜라이 부모 박테리아 균주로부터 정제된 ADAS 제제에서 시간이 지남에 따른 108개의 ADAS 입자당 GFP 형광(au)을 보여주는 그래프이며, ADAS 제제를 동결건조시키고, 6주 동안 보관하고, 재수화시켰다. ADAS를 GFP의 발현을 활성화시키는 유도제인, 안하이드로테트라사이클린(100 ng/mL)의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션시켰다. 비유도된 반복실험의 평균 값을 각각의 유도된 반복실험으로부터 제함으로써 GFP 형광을 계산하였다. 모든 시료를 항생제의 존재 하에 성장시켜, 임의의 박테리아 성장을 방지하였다.
도 7h는 도 7g의 유도된 및 비유도된 ADAS 제제 간의 GFP 형광의 배수 변화를 보여주는 그래프이다. 유도된 반복실험의 평균 값을 비유도된 반복실험의 평균 값으로 나누어, 배수 변화를 계산하였다.
도 8a는 히스티딘-부재 및 메티오닌-부재 배지에서 보관된 대조군 에스케리키아 콜라이 부모 박테리아 세포주 MACH060 또는 영양요구성 에스케리키아 콜라이 부모 박테리아 세포주 MACH002로부터 정제된 ADAS 제제에서 부모 박테리아 세포의 수(CFU/mL)를 보여주는 막대 그래프이다.
도 8b는 류신-부재 배지에서 보관된 대조군 에스케리키아 콜라이 부모 박테리아 세포주 MACH178 또는 영양요구성 에스케리키아 콜라이 부모 박테리아 세포주 MACH151로부터 정제된 ADAS 제제에서 부모 박테리아 세포의 수(CFU/mL)를 보여주는 막대 그래프이다.
I.정의
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "무염색체 동적 시스템" 또는 "ADAS"는 적어도 하나의 막을 포함하고, 카고(예를 들어, 핵산, 플라스미드, 폴리펩티드, 단백질, 효소, 아미노산, 소분자, 유전자 편집 시스템, 호르몬, 면역 조절제, 탄수화물, 지질, 유기 입자, 무기 입자 또는 리보핵단백질 복합체(RNP) 중 하나 이상)를 함유하기에 적합한 내부 부피를 갖는 게놈-부재, 비-복제, 폐쇄된 막 시스템을 지칭한다. 일부 구현예에서, ADAS는 부모 박테리아 세포(예를 들어, 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아 세포)로부터 유래된 미니세포 또는 변형된 미니세포이다. ADAS는 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 부모 세포의 유전학적 조작, 또는 박테리아 미니세포의 형성 가능성을 증가시키는 배양물 또는 조건에 대한 노출을 사용하여 부모 박테리아로부터 유래될 수 있다. ADAS를 제조하기 위한 예시적인 방법은 부모 세포의 세포 분열 기구를 파괴하는 것들이다. 일부 구현예에서, ADAS는 부모 세포 표면의 하나 이상의 내인성 또는 이종 특징부, 예를 들어, 세포벽, 세포벽 변형, 편모 또는 선모, 및/또는 부모 세포의 내부 부피의 하나 이상의 내인성 또는 이종 특징부, 예를 들어, 핵산, 플라스미드, 단백질, 소분자, 전사 기구 또는 번역 기구를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, ADAS는 부모 세포의 하나 이상의 특징부가 결여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, ADAS는 부모 세포에 의해 포함되지 않는 특징부가 로딩되거나, 다르게는 이를 사용하여 변형될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "고활성 ADAS"는 높은 작업 잠재력을 갖는 ADAS, 예를 들어, 유의미한 양의 유용한 작업을 행하는 능력을 갖는 ADAS를 지칭한다. 작업은 적합한 조건 하에서의 (예를 들어, 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물, 폴리머 또는 소분자의) 화학적 합성, (예를 들어, 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물, 폴리머 또는 소분자의) 화학적 변형, 또는 수송(예를 들어, 유입, 유출 또는 분비)을 포함하는 대사적 작업일 수 있다. 특정 구현예에서, 고활성 ADAS는 큰 에너지의 풀, 예를 들어, ATP의 형태의 에너지와 함께 시작한다. 다른 구현예에서, ADAS는 또 다른 공급원으로부터 에너지/ATP를 흡수하거나 생성하는 능력을 갖는다. 고활성 ADAS는 예를 들어, 증가된 ATP 농도, 증가된 ATP 생성 능력, 증가된 단백질 생성 능력, 증가된 단백질 생성 속도 또는 양, 및/또는 생물학적 신호, 예를 들어, 프로모터의 유도에 대한 증가된 반응을 갖는 것에 의해 확인될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "부모 박테리아 세포"는 ADAS가 유래되는 세포(예를 들어, 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아 세포)를 지칭한다. 부모 박테리아 세포는 전형적으로 생존 가능한 박테리아 세포이다. 용어 "생존 가능한 박테리아 세포"는 게놈을 함유하며, 세포 분열할 수 있는 박테리아 세포를 지칭한다. 바람직한 부모 박테리아 세포는 표 4의 균주 중 임의의 것으로부터 유래된다.
부모 박테리아 세포 및/또는 생존 가능한 박테리아 세포가 "실질적으로 없는" ADAS 조성물 또는 제제는 본원에서 mL당 500 이하, 예를 들어, 400, 300, 200, 150, 100 또는 그 이하의 콜로니-형성 유닛(CFU)을 갖는 조성물로서 정의된다. 부모 박테리아 세포 또는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 ADAS 조성물은 박테리아 세포 부재를 포함하여, 50 미만, 25 미만, 10 미만, 5 미만, 1 미만, 0.1 미만 또는 0.001 미만의 CFU/mL를 포함할 수 있다.
용어 "세포 분열 토폴로지 특이성 인자"는 격막의 부위의 결정에 수반되며, 세포 분열 기구의 다른 구성성분의 위치를 제한함으로써, 예를 들어, 하나 이상의 Z-링 저해 단백질의 위치를 제한함으로써 기능하는 박테리아 종 내의 세포 분열 기구의 구성성분을 지칭한다. 예시적인 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 minE를 포함하며, 이는 에스케리키아 콜라이에서 처음 발견되었으며, 그 이후, 매우 다양한 그람-음성 박테리아 종 및 그람-양성 박테리아 종에서 확인된 바 있다(문헌[Rothfield et al., Nature Reviews Microbiology, 3: 959-968, 2005]). minE는 Z-링 저해 단백질 minC 및 minD를 세포의 극에 제한함으로써 기능한다. 제2의 예시적인 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 DivIVA이며, 이는 바실러스 서브틸리스에서 처음 발견되었다(문헌[Rothfield et al., Nature Reviews Microbiology, 3: 959-968, 2005]).
용어 "Z-링 저해 단백질"은 격막의 부위의 결정에 수반되며, 안정한 FtsZ 고리의 형성을 저해하거나, 이러한 구성성분을 막에 고정함으로써 기능하는 박테리아 종 내의 세포 분열 기구의 구성성분을 지칭한다. Z-링 저해 단백질의 국소화는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자, 예를 들어, MinE 및 DivIVA에 의해 조절될 수 있다. 예시적인 Z-링 저해 단백질은 minC 및 minD를 포함하며, 이는 에스케리키아 콜라이에서 처음 발견되었고, 그 이후, 매우 다양한 그람-음성 박테리아 종 및 그람-양성 박테리아 종에서 확인된 바 있다(문헌[Rothfield et al., Nature Reviews Microbiology, 3: 959-968, 2005]). 에스케리키아 콜라이 및 다른 종에서, minC, minD 및 minE는 동일한 유전자좌에서 발생하며, 이는 "min 오페론", minCDE 오페론, 또는 min 또는 minCDE 유전자좌로 지칭될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성의 감소"는 참조 시료(예를 들어, 야생형 세포 또는 야생형 minCDE 오페론 또는 야생형 divIVA 유전자를 갖는 세포로부터 생성되는 ADAS), 참조 세포(예를 들어, 야생형 세포 또는 야생형 minC, minD, minE, divIVA 또는 minCDE 유전자 또는 오페론을 갖는 세포), 대조군 시료 또는 대조군 세포에서의 수준과 비교하여, 표준 방법에 의해 검출되는, 세포 토폴로지 특이성 인자(예를 들어, 단백질 또는 핵산(예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준 또는 활성의 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 중 어느 하나의 전반적인 감소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 감소된 수준 또는 활성은 참조 시료, 참조 세포, 대조군 시료 또는 대조군 세포에서의 세포 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성의 적어도 약 0.9x, 0.8x, 0.7x, 0.6x, 0.5x, 0.4x, 0.3x, 0.2x, 0.1x, 0.05x 또는 0.01x인 시료 내의 수준 또는 활성의 감소를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "동일성 백분율"은 표준 기법에 의한 정렬 후의 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 대한 서열 동일성 백분율(%)을 지칭한다. 핵산 또는 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하는 목적을 위한 정렬은 해당 분야의 숙련자의 능력 이내인 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, PSI-BLAST 또는 Megalign 소프트웨어를 사용하여, 달성될 수 있다. 해당 분야의 숙련자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예를 들어, 서열 동일성 백분율 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 BLAST를 사용하여 생성될 수 있다. 예시로서, 주어진 핵산 또는 아미노산 서열, B에 비한, 그와 또는 그에 대한 주어진 핵산 또는 아미노산 서열, A의 서열 동일성 백분율(이는 대안적으로, 주어진 핵산 또는 아미노산 서열, B에 비하여, 그와 또는 그에 대하여 특정 서열 동일성 백분율을 갖는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열, A로서 표현될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다:
100 곱하기 (분수 X/Y)
상기 식에서, X는 A 및 B의 상기 프로그램의 정렬에서, 서열 정렬 프로그램(예를 들어, BLAST)에 의해 동일한 일치로서 점수화된 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수이며, Y는 B에서의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 총 개수이다. 일부 구현예에서, 서열 동일성, 예를 들어, MinE 또는 DivIVA 단백질의 동족체는 본원에 기재된 바와 같은 고유 서열 MinE(또는 minE) 또는 DivIVA(또는 divIVA) 서열에 대해, 적어도 약 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 심지어 95% 이상의 아미노산 또는 핵산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 또는 핵산 동일성을 가질 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은 어구 "세포의 상태를 조절하는 것"은 이러한 측정을 위한 해당 분야에 알려져 있는 기법 및 방법, 예를 들어, 단백질, 전사물, 후성유전학적 표시의 수준 또는 발현을 측정하기 위한, 또는 생물학적 경로의 활성의 증가 또는 감소를 측정하기 위한 방법을 사용하여 측정되는 바와 같이, 세포(예를 들어, 동물, 식물 또는 곤충 세포)의 상태(예를 들어, 전사체, 프로테옴, 후성유전체, 생물학적 효과 또는 건강 또는 병태)의 관찰 가능한 변화를 지칭한다. 세포 상태의 조절은 투여 전과 대비해서 적어도 1%의 변화를 초래할 수 있다(예를 들어, 투여 전과 대비해서 적어도 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 또는 적어도 98% 이상; 예컨대, 투여 전과 대비해서 최대 100%). 일부 구현예에서, 세포의 상태를 조절하는 것은 세포의 파라미터(예를 들어, 단백질, 전사물의 수준 또는 발현, 또는 생물학적 경로의 활성)를 증가시키는 것을 포함한다. 세포 상태의 증가는 투여 전과 대비해서 적어도 1% 만큼의 매개변수 증가를 초래할 수 있다(예를 들어, 투여 전과 대비해서 적어도 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 또는 적어도 98% 이상; 예컨대, 투여 전과 대비해서 최대 100%). 다른 구현예에서, ~의 상태를 조절하는 것은 세포의 파라미터(예를 들어, 단백질, 전사물의 수준 또는 활성, 또는 생물학적 경로의 활성)를 감소시키는 것을 포함한다. 세포 상태의 감소는 투여 전과 대비해서 적어도 1% 만큼의 매개변수 감소를 초래할 수 있다(예를 들어, 투여 전과 대비해서 적어도 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 또는 적어도 98% 이상; 예컨대, 투여 전과 대비해서 최대 100%).
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "이종"은 그의 천연 발생 상태의 세포 또는 조성물에 고유하지 않음을 의미한다. 일부 구현예에서, "이종"은 ADAS 또는 그것이 생성되는 부모 박테리아(예를 들어, 그람-음성 또는 그람 양성 박테리아 세포)에서 천연적으로 관찰되지 않는 분자; 예를 들어, 카고 또는 페이로드(예를 들어, 폴리펩티드, 핵산, 예컨대 단백질-인코딩 RNA 또는 tRNA 또는 소분자) 또는 구조(예를 들어, 플라스미드 또는 유전자-편집 시스템)를 지칭한다.
II.조성물
A.ADAS 및 고활성 ADAS
본 발명은 적어도 부분적으로, 고활성 ADAS를 포함하는, 본 발명자들의 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)의 발견에 기초하며, 이는 다수의 환경에서 매우 다양한 기능을 제공할 수 있다. "ADAS"는 적어도 하나의 막(일부 구현예에서, 2개의 막, 2개의 막은 교차하지 않음)을 포함하고, 카고(예를 들어, 핵산, 플라스미드, 폴리펩티드, 단백질, 효소, 아미노산, 소분자, 유전자 편집 시스템, 호르몬, 면역 조절제, 탄수화물, 지질, 유기 입자, 무기 입자 또는 리보핵단백질 복합체(RNP))를 함유하기에 적합한 내부 부피를 갖는 게놈-부재, 비-복제, 폐쇄된 막 시스템이다.
일부 구현예에서, ADAS는 부모 박테리아 세포(예를 들어, 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아 세포)로부터 유래된 미니세포 또는 변형된 미니세포이다. ADAS는 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 부모 세포의 유전학적 조작, 또는 박테리아 미니세포의 형성 가능성을 증가시키는 배양물 또는 조건에 대한 노출을 사용하여 부모 박테리아로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, ADAS는 약 100 nm 내지 500 μm(예를 들어, 특정 구현예에서, 약: 100 내지 600 nm, 예컨대 100 내지 400 nm; 또는 약 0.5 내지 10 μm 및 10 내지 500 μm)의 주축 단면을 갖는다. 특정 구현예에서, ADAS는 주축의 약 0.001, 0.01, 0.1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 최대 100% 사이의 부축(minor axis) 단면을 갖는다. 특정 구현예에서, ADAS는 약 0.001 내지 1 μm3, 0.3 내지 5 μm3, 5 내지 4000 μm3, 또는 4000 내지 50x107 μm3사이의 내부 부피를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 고활성 ADAS를 제공한다. "고활성" ADAS는 높은 작업 잠재력을 갖는 ADAS, 예를 들어, 유의미한 양의 유용한 작업을 행하는 능력을 갖는 ADAS이다. 작업은 예를 들어, 적합한 조건 하에서의 (예를 들어, 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물, 폴리머 또는 소분자의 합성) 화학적 합성, (예를 들어, 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물, 폴리머 또는 소분자의 합성) 화학적 변형, 또는 수송(예를 들어, 유입, 유출 또는 분비)을 포함하는 대사적 작업으로 규정될 수 있다. 일부 구현예에서, 고활성 ADAS는 큰 에너지의 풀, 예를 들어, 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 형태의 에너지와 함께 시작한다. 다른 구현예에서, ADAS는 또 다른 공급원으로부터 에너지(예컨대, ATP)를 흡수하거나 생성하는 능력을 갖는다. 용어 "본 발명에 의해 제공되는 ADAS"는 구체적인 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 ADAS의 부분집합인, 집합이 "본 발명에 의해 제공되는 고활성 ADAS"로 언급될 수 있는, 고활성 ADAS를 포함하는 본원에 기재된 ADAS의 모든 구현예를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하며, ADAS는 적어도 1 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하며, ADAS는 적어도 3 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 고활성 ADAS는 적어도 1 nM, 1.1. nM, 1.2 nM, 1.3 nM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 2 mM, 2.5 mM, 3 nM, 3.5 nM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM 또는 50 mM의 초기 ATP 농도를 갖는다. ATP 농도는 특정 구현예에서, 용해된 ADAS 상의 BacTiter-GloTM 검정(프로메가(Promega))을 포함하는 다양한 수단에 의해 평가될 수 있다.
고활성은 추가적으로 또는 대안적으로 시간이 지남에 따른 ADAS 내의 ATP 농도의 증가의 속도 또는 양으로서 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, ADAS의 ATP 농도는 적합한 조건 하에서의 인큐베이션, 예를 들어, 37℃에서 12시간 동안의 인큐베이션 후에 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200% 또는 200% 초과로 증가된다. 특정 구현예에서, 고활성 ADAS는 적어도 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 4일, 1주, 또는 2주 동안 약 0.000001, 0.00001, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 500, 1000, 10000 ATP/sec/nm2 초과의 ATP 생성 속도를 갖는다.
다른 양태에서, 고활성은 시간이 지남에 따른 ATP 농도의 감소의 속도로서 평가된다. 일부 구현예에서, ATP 농도는 고활성이 아닌 ADAS에서보다 고활성인 ADAS에서 덜 신속하게 감소할 수 있다. 일부 구현예에서, 제조 후 제24시간에, ADAS 또는 ADAS 조성물 내의 ATP 농도의 감소는 예를 들어, BacTiter-GloTM 검정(프로메가)을 사용하여 측정되는 바와 같이, 초기 ATP 농도(예를 들어, 세포 부피당 ATP)에 비하여, 약 50% 미만(예를 들어, 약 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 또는 5% 미만)이다.
고활성은 추가적으로 또는 대안적으로 ADAS의 수명 지수로서 평가될 수 있다. 수명 지수는 제24시간 대 제30분에서의 GFP 생성 속도의 비로서 계산된다. 일부 구현예에서, 고활성 ADAS는 하기 초과의 수명 지수를 갖는다: 약 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.18, 0.2, 0.25, 0.3,0.35, 0.45, 0.5, 0.60, 0.70, 0.80, 0.90, 1.0 또는 그 이상. 보다 구체적인 구현예에서, 수명 지수는 종-적절한 프로모터를 갖는 기능적 GFP 플라스미드를 함유하는 ADAS에서 측정되며, GFP 농도는 제30분 및 제24시간에 플레이트 판독기를 사용하여 ADAS의 수, ADAS당 플라스미드의 평균 수 및 용액 부피에 비하여 측정된다.
일부 양태에서, ADAS는 단백질, 예를 들어, 이종 단백질을 생산한다. 일부 양태에서, 고활성은 단백질의 생성의 속도, 양 또는 기간, 또는 단백질의 발현의 유도의 속도(예를 들어, 신호에 대한 ADAS의 반응)로서 평가된다. 예를 들어, ADAS는 플라스미드를 포함할 수 있으며, 플라스미드는 유도성 프로모터 및 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, ADAS를 적절한 조건 하에서 유도성 프로모터의 유도제와 접촉시키면, 이종 단백질의 생성이 초래된다. 일부 양태에서, 이종 단백질의 생성은 유도제와 접촉되지 않은 ADAS에 비하여, 유도제와 접촉된 ADAS, 예를 들어, 고활성 ADAS에서 적어도 1.6배 증가된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이종 단백질의 생성은 유도제와 접촉된 ADAS, 예를 들어, 고활성 ADAS에서 적어도 1.5배, 1.75배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배 또는 10배 초과 만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 고활성 ADAS에 의한 이종 단백질의 생성 속도는 ADAS와 유도제의 접촉 이후 특정 기간 내에, 예를 들어, 5분, 10분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간 또는 3시간 초과 이내에 표적 수준에 도달한다. 일부 구현예에서, 단백질(예컨대, 이종 단백질)은 고활성 ADAS당 시간당 적어도 0.1 펨토그램, 예컨대 ADAS당 적어도 0.2 0.4, 0.6, 0.8, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000, 3000, 또는 3500 fg/시간의 속도로 생성된다. 일부 구현예에서, 고활성의 ADAS는 단백질이 생성되는 기간으로서 평가된다. 고활성 ADAS는 적어도 2시간, 적어도 4시간, 적어도 8시간, 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 48시간 또는 48시간 초과의 기간 동안 단백질(예를 들어, 이종 단백질)을 생성할 수 있다.
B.세포 분열 토폴로지 특이성 인자에 결함이 있는 부모 박테리아로부터 유래된 ADAS 및 고활성ADAS
ADAS는 본원에 기재된 바와 같이, 박테리아 부모 세포로부터 유래될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준, 활성 또는 발현의 감소를 갖는 부모 박테리아로부터 유래된 ADAS 및/또는 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하며, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자를 포함하지 않으며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없다.
일부 양태에서, 본 발명은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없으며, 하기를 포함하는 과정에 의해 생성된다: (a) 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성의 감소를 갖는 복수의 부모 박테리아를 제조하거나, 제공하거나 또는 수득하는 단계; (b) 부모 박테리아를 미니세포의 형성을 허용하는 조건에 노출시킴으로써, 고활성 ADAS를 생성하는 단계; 및 (c) ADAS를 부모 박테리아로부터 분리함으로써, 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 조성물을 생성하는 단계.
상기 양태의 일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 이. 콜라이 minE 폴리펩티드(SEQ ID NO: 1)에 대하여 적어도 20% 동일성, 예를 들어 SEQ ID NO: 1에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성(topological specificity) 인자가 minE 폴리펩티드이다. minE 폴리펩티드를 갖는 예시적인 종은 표 4 및 문헌[Rothfield et al., Nature Reviews Microbiology, 3: 959-968, 2005]에 제공된다.
일부 구현예에서, 부모 박테리아는 에스케리키아 콜라이이며, minE 폴리펩티드는 에스케리키아 콜라이 minE이다. 다른 구현예에서, 부모 박테리아는 살모넬라 타이피무리움이며, minE 폴리펩티드는 살모넬라 타이피무리움 minE이다. 또 다른 구현예에서, 부모 박테리아는 에스케리키아, 아시네토박터(Acinetobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아나바에나(Anabaena), 아퀴펙스(Aquifex), 아조아르쿠스(Azoarcus), 아조토박터(Azotobacter), 보르데텔라(Bordetella), 브라디리조비움(Bradyrhizobium), 브루셀라(Brucella), 부크네라(Buchnera), 부크홀데리아(Burkholderia), 칸디다투스(Candidatus), 크로모박테리움(Chromobacterium), 크로코스파에라(Crocosphaera), 데클로로모나스(Dechloromonas), 데술피토박테리움(Desulfitobacterium), 데술포탈레아(Desulfotalea), 에르위니아(Erwinia), 프란시셀라(Francisella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 글로에오박터(Gloeobacter), 글루코노박터(Gluconobacter), 헬리코박터, 레지오넬라(Legionella), 마그네토스피릴룸(Magnetospirillum), 메조리조비움(Mesorhizobium), 메틸로코커스(Methylococcus), 네이세리아(Neisseria), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 노스톡(Nostoc), 포토박테리움(Photobacterium), 포토랍두스(Photorhabdus), 폴라로모나스(Polaromonas), 프로클로로코커스(Prochlorococcus), 슈도모나스, 사이크로박터(Psychrobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 루브리비박스(Rubrivivax), 살모넬라, 시와넬라(Shewanella), 시겔라, 시노리조비움(Sinorhizobium), 시네코코커스(Synechococcus), 시네코시스티스(Synechocystis), 써모시네코코커스(Thermosynechococcus), 써모토가(Thermotoga), 써무스(Thermus), 티오바실러스(Thiobacillus), 트리코데스미움(Trichodesmium), 비브리오(Vibrio), 위글레스워티아(Wigglesworthia), 울리넬라(Wolinella), 잔토모나스(Xanthomonas), 자일렐라(Xylella), 예르시니아, 바실러스, 클로스트리디움(Clostridium), 데이노코커스(Deinococcus), 엑시구오박테리움(Exiguobacterium), 게오바실러스(Geobacillus), 락토바실러스, 락토바실러스, 무렐라(Moorella), 오세아노바실러스(Oceanobacillus), 심비오박테리움(Symbiobacterium) 또는 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter) 박테리아이며, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 부모 박테리아의 내인성 minE 또는 DivIVA이다.
상기 양태의 일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 바실러스 서브틸리스 DivIVA 폴리펩티드(SEQ ID NO: 4)에 대하여 적어도 20% 동일성, 예를 들어 SEQ ID NO: 4에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성(topological specificity) 인자가 DivIVA 폴리펩티드이다. DivIVA 폴리펩티드를 갖는 예시적인 종은 표 4 및 문헌[Rothfield et al., Nature Reviews Microbiology, 3: 959-968, 2005]에 제공된다. 일부 구현예에서, 부모 박테리아는 바실러스 서브틸리스이며, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 바실러스 서브틸리스 DivIVA이다.
일부 구현예에서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성의 감소를 갖는 ADAS 또는 부모 박테리아는 또한 하나 이상의 Z-링 저해 단백질의 수준의 감소를 갖는다.
일부 구현예에서, Z 링 저해 단백질은 이. 콜라이 minC 폴리펩티드(SEQ ID NO: 2)에 대하여 적어도 20% 동일성, 예를 들어 SEQ ID NO: 2에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, Z 링 저해 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Z 링 저해 단백질은 minC 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, Z 링 저해 단백질은 이. 콜라이 minD 폴리펩티드(SEQ ID NO: 3)에 대하여 적어도 20% 동일성, 예를 들어 SEQ ID NO: 3에 대하여 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, Z 링 저해 단백질은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Z 링 저해 단백질은 minD 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, ADAS 또는 부모 박테리아는 적어도 2개의 Z-링 저해 단백질의 수준, 활성 또는 발현의 감소를 갖는다. 일부 구현예에서, ADAS 또는 부모 박테리아는 minC 폴리펩티드 및 minD 폴리펩티드의 발현의 감소를 갖는다. 일부 구현예에서, ADAS 또는 부모 박테리아는 minC 폴리펩티드, minD 폴리펩티드 및 minE 폴리펩티드의 발현의 감소, 예를 들어, minCDE 오페론의 결실(ΔminCDE)을 갖는다.
세포 분열 토폴로지 특이성 인자 또는 Z-링 저해 단백질의 수준, 활성 또는 발현의 감소, 예를 들어, ADAS의 감소 또는 부모 박테리아 세포의 감소는 임의의 적합한 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 수준 또는 활성의 감소는 기능-소실 돌연변이, 예를 들어, 유전자 결실에 의해 야기된다. 일부 구현예에서, 기능 소실 돌연변이는 유도성 기능-소실 돌연변이이며, 기능의 소실은 부모 세포를 유도 조건에 노출시킴으로써 유도되며, 예를 들어, 유도성 기능-소실 돌연변이는 온도-감수성 돌연변이이며, 유도 조건은 온도 조건이다.
일부 구현예에서, 부모 세포는 minCDE 오페론(ΔminCDE) 또는 상동성 오페론의 결실을 갖는다.
C.카고를 포함하는 ADAS
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 ADAS는 ADAS의 내측에 함유된 카고를 포함한다. 카고는 ADAS의 내측에 배치되거나(예를 들어, ADAS에 의해 캡슐화되거나), ADAS의 표면에 컨쥬게이트된 임의의 모이어티일 수 있다. 일부 구현예에서, 카고는 핵산, 플라스미드, 폴리펩티드, 단백질, 효소, 아미노산, 소분자, 유전자 편집 시스템, 호르몬, 면역 조절제, 탄수화물, 지질, 유기 입자, 무기 입자 또는 리보핵단백질 복합체(RNP), 또는 상기 것들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산은 DNA, RNA, 또는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 핵산(예컨대, DNA, RNA, 또는 플라스미드)은 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 단백질이 ADAS 내에서 전사되거나/전사되고 번역된다.
일부 구현예에서, 핵산은 효소이다. 일부 구현예에서, 효소가 기질을 변경시켜 표적 산물을 생산한다. 일부 구현예에서, 기질은 ADAS에 존재하며, 표적 생성물은 ADAS에서 생성된다. 다른 구현예에서, 기질은 표적 세포, 또는 ADAS가 전달되는 환경에 존재한다.
특정 구현예에서, 카고는 미변형된 버전의 카고에 비하여 개선된 안정성을 위하여 변형된다. 카고의 "안정성"은 동일한 환경 조건에서 측정되는 바와 같이, 미변형된 카고의 반감기 대 변형된 카고 반감기의 무단위(unitless) 비이다. 일부 구현예에서, 환경은 실험적으로 제어되며, 예를 들어, 모의 체액, RNAse 미함유 물, 세포질, 세포외 공간 또는 "ADAS 플라즘(plasm)"(즉, 예를 들어, 용해 이후의 ADAS의 내측 부피의 내용물)이다. 일부 응용에서, 그것은 농업 환경, 예를 들어, 다양한 현장 토양, 강물 또는 해수이다. 다른 구현예에서, 환경은 실제 또는 모의: 동물 소화관, 동물 피부, 동물 생식관, 동물 호흡관, 동물 혈류 또는 동물 세포외 공간이다. 특정 구현예에서, ADAS는 실질적으로 카고를 분해하지 않는다.
특정 구현예에서, 카고는 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질은 세포 세포질 또는 다른 환경에서 약 1.01, 1.1, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 100000, 10000000 초과의 안정성을 갖는다. 단백질은 성장 인자; 효소; 호르몬; 면역-조절 단백질; 항생물 단백질, 예컨대 항박테리아, 항진균, 살충제, 단백질 등; 표적화 제제, 예컨대 항체 또는 나노바디 등을 포함하는 임의의 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질이 호르몬, 예를 들어, 파라크린, 엔도크린, 오토크린이다.
일부 구현예에서, 카고는 식물 호르몬, 예컨대 아브시스산, 옥신, 사이토키닌, 에틸렌, 지베렐린 또는 그의 조합을 포함한다.
특정 구현예에서, 카고는 면역 조절제, 예컨대 면역 자극제, (예를 들어, PD-1, PD-L1, CTLA-4의) 관문 저해제, 화학치료제, 억제제, 슈퍼 항원, 소분자(사이클로스포린 A, 사이클릭 디뉴클레오티드(CDN) 또는 STING 효능제(예를 들어, MK-1454))이다.
카고를 포함하는 ADAS에 있어서, 일부 구현예에서, 카고는 RNA, 예컨대 원형 RNA, mRNA, siRNA, shRNA, ASO, tRNA, dsRNA 또는 그의 조합이다. 특정 구현예에서, RNA는 예를 들어 ADAS 플라즘에서 약 1.01, 1.1, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 100000, 10000000 초과의 안정성을 갖는다. RNA 카고는 특정 구현예에서, 예를 들어, 부가된 스템-루프 구조, 예컨대 tRNA 스캐폴드를 사용하여 안정화될 수 있다. 예를 들어, 비-인간 tRNALys3 및 에스케리키아 콜라이 tRNAMet(문헌[Nat. Methods, Ponchon 2007]). 둘 모두는 널리 특성화되고, 재조합적으로 발현된 바 있다. 그러나, 다양한 다른 유형, 예컨대 압타머, lncRNA, 리보자임 등도 또한 사용될 수 있다. RNA는 또한 ADAS가 하나 이상의 리보뉴클레아제에 대하여 널(null)(또는 저형질(hypomorphic))인 부모 균주로부터 수득되는 경우 안정화될 수 있다.
일부 특정 구현예에서, RNA는 단백질-코딩 mRNA이다. 보다 구체적인 구현예에서, 단백질-코딩 mRNA는 효소(예를 들어, 및 간 효소 활성을 부여하는 효소, 예컨대 인간 PBGD(hPBGD) mRNA), 또는 예를 들어, 면역 반응을 유도하는(예컨대, 강력하고 영구적인 중화 항체 역가를 유도하는) 항원을 인코딩하며, 예컨대 CMV 당단백질 gB 및/또는 오량체 복합체(PC)를 인코딩하는 mRNA이다. 특정 구체적인 구현예에서, RNA는 작은 비-코딩 RNA, 예컨대 shRNA, ASO, tRNA, dsRNA 또는 그의 조합이다.
특정 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 ADAS는 유전자 편집 시스템을 포함하는 카고를 포함한다. "유전자 편집 시스템"은 적합한 관련 핵산과 함께, 관심 서열의 삽입에 의해서든 또는 결실에 의해서든, 뿐만 아니라 변경된 메틸화 상태에 의해서 관심 DNA 서열, 예컨대 게놈 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 단백질을 포함한다(또는 인코딩한다). 예시적인 유전자 편집 시스템은 Cas 시스템, 예컨대 Cas9, Cpf1 또는 그들의 동반 RNA와 함께 다른 RNA-표적화된 시스템, 및 아연 핑거 뉴클레아제 및 뉴클레아제에 컨쥬게이트된 TAL-이펙터에 기초한 것들을 포함한다.
본 발명에 의해 제공되는 ADAS의 다른 구현예는 카고로서 DNA를 예를 들어, 플라스미드로서 포함하며, 선택적으로 DNA는 단백질-코딩 서열을 포함한다. 예시적인 DNA 카고는 특정 구현예에서, 예를 들어, 각각의 측 상에 tRNA 삽입물이 측접할 수 있는 관심 RNA 서열(상기 예 참조)을 인코딩하는 플라스미드를 포함한다. 하기를 포함하는 다양한 DNA 카고가 본 발명에 의해 포함된다: ADAS 생성(예를 들어, FTZ 과발현 유도, 게놈 분해 엑소뉴클레아제); 장수명 플라스미드(ATP 신타제 발현, 로돕신-발현); 안정화된 비-코딩 RNA, tRNA, lncRNA를 발현하는 것들; 분비 시스템 태그 단백질, NleE2 이펙터 도메인 및 국소화 태그 발현; 분비 시스템 T3/4SS, T5SS, T6SS; 논리 회로, 조건적으로 발현되는 분비 시스템; 및 그의 조합. 일부 구현예에서, 논리 회로는 유도성 발현 또는 억제 카세트, 예컨대 IPTG-유도성 Plac 프로모터 및 AND 게이트(gate)의 hrpR 부분, 및 예를 들어, 열-유도된 프로모터 pL(보통 열불안정성 단백질에 의해 억제되는 파지 람다 유래) 및 AND 게이트의 hrpS 부분을 포함한다. OR 게이트를 조작하기 위하여, 문헌[Rosado et al., PLoS Genetics, 2018]에 의해 기재된 시스템이 사용될 수 있다. 요약하여, 구성성 프로모터 하에 RFP를 코딩하는 시스-억제된 mRNA가 사용될 수 있다. 이어서, 억제는 RAJ11 sRNA의 존재 하에 제거될 수 있다. 이어서, 둘 모두가 RAJ11 sRNA의 발현을 유도하는, IPTG-유도성 프로모터 PLac 및 열-유도되는 프로모터 pL을 함유하는 플라스미드가 사용될 수 있다. 이어서, 출력은 RFP 발현일 수 있으며, 이는 어느 하나의 입력에 반응하여 관찰된다. 이들 시스템은 다양한 센서-유형 기능에 대하여 조정될 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 ADAS는 일부 구현예에서, 막 내에 수송체를 포함한다. 특정 구현예에서, 수송체는 글루코스, 나트륨, 칼륨, 금속 이온, 음이온 용질, 양이온 용질 또는 물에 특이적이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 ADAS의 막은 효소를 포함한다. 특정 구현예에서, 효소가 프로테아제, 산화환원효소, 또는 그의 조합이다. 일부 구현예에서, 효소는 ADAS 막에, 선택적으로 링커를 통해 외막에 화학적으로 컨쥬게이트된다.
D.분비 시스템을 포함하는 ADAS
특정 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 ADAS는 박테리아 분비 시스템(예를 들어, 내인성 박테리아 분비 시스템 또는 이종 분비 시스템)을 포함한다. "박테리아 분비 시스템"은 박테리아 세포의 세포질(또는 예를 들어, 그로부터 유래된 ADAS)로부터 하기 내에 카고를 유출시킬 수 있는 단백질 또는 단백질 복합체이다: 세포외 공간, 그람-음성 박테리아의 주변세포질 공간 또는 또 다른 세포의 세포내 공간. 일부 구현예에서, 박테리아 분비 시스템은 능동(예를 들어, ATP-의존적 또는 PMF-의존적) 과정에 의해 작동하며, 특정 구현예에서, 박테리아 분비 시스템은 숙주 세포(또는 ADAS)를 표적 세포에 이르게 하는 튜브 또는 스파이크를 포함한다. 다른 구현예에서, 박테리아 분비 시스템은 막횡단 채널이다. 예시적인 박테리아 분비 시스템은 카고를 단백질 튜브의 내측을 통해 횡단시키는 튜브-함유 구조인 T3SS 및 T4SS(및 하기 정의된 바와 같은 T3/T4SS), 및 스파이크의 말단에 카고를 보유하는 T6SS를 포함한다. 다른 예시적인 박테리아 분비 시스템은 T1SS, T2SS, T5SS, T7SS, Sec 및 Tat를 포함하며, 이는 막횡단이다.
일부 구현예에서, 이종 분비 시스템은 T3SS이다.
일부 구현예에서, ADAS는 카고를 포함하며, 카고는 박테리아 분비 시스템에 의한 유출을 지시하는 모이어티를 포함하며, 예를 들어, 일부 구현예에서, 모이어티는 Pho/D, Tat 또는 합성 펩티드 신호이다.
특정 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 ADAS는 2-막 ADAS이다. 보다 구체적인 구현예에서, 2개-막 ADAS가 박테리아 분비 시스템을 추가로 포함한다. 더더욱 구체적인 구현예에서, 박테리아 분비 시스템은 T3SS, T4SS, T3/4SS 또는 T6SS로부터 선택되며, 선택적으로, T3SS, T4SS, T3/4SS 또는 T6SS는 표적 세포의 건강에 영향을 미치지 않는 약독화된 또는 비-기능적 이펙터를 갖는다.
본 발명에 의해 제공되는 ADAS는 일부 구현예에서, 박테리아 분비 시스템을 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리아 분비 시스템, 예컨대 T3SS, T4SS, T3/T4SS 또는 T6SS는 ADAS 외막을 가로질러 표적 세포, 예컨대 동물, 진균, 박테리아 또는 식물 세포 내에 카고를 유출시킬 수 있다.
보다 구체적인 구현예에서, 박테리아 분비 시스템은 T3/4SS이다. "T3/4SS"는 하이브리드 시스템 및 미변형된 버전을 포함하는 T3SS 또는 T4SS에 기초한 분비 시스템이며, 이는 박테리아(또는 ADAS)와 표적 세포 사이에 단백질 튜브를 형성하여, 둘을 연결하고, 하나 이상의 이펙터를 전달한다. 표적 세포는 동물, 식물, 진균 또는 박테리아일 수 있다. 일부 구현예에서, T3/4SS는 이펙터를 포함하며, 이는 변형된 이펙터일 수 있다. T3SS 시스템의 예는 살모넬라 SPI-1 시스템, EHEC 콜라이 ETT1 시스템, 잔타모나스 시트리(Xanthamonas Citri)/캄페스트리(Campestri) T3SS 시스템 및 슈도모나스 시린가에 T3SS 시스템을 포함한다. T4SS 시스템의 예는 아그로박테리움(Agrobacterium) Ti 플라스미드 시스템, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) T4SS를 포함한다. 특정 구현예에서, T3/4SS는 변형된 이펙터 기능, 예를 들어, SopD2, SopE, Bop, Map, Tir, EspB, EspF, NleC, NleH2 또는 NleE2로부터 선택되는 이펙터를 갖는다. 보다 구체적인 구현예에서, 변형된 이펙터 기능은 세포내 표적화, 예컨대, 핵, 골지, 미토콘드리아, 액틴, 미세융모, ZO-1, 미세소관 또는 세포질 내에의 전좌를 위한 것이다. 더더욱 구체적인 구현예에서, 변형된 이펙터 기능은 이. 콜라이에서 유래한 NleE2를 기반으로 한 핵 표적화이다. 다른 구체적인 구현예에서, 변형된 이펙터 기능은 사상위족 형성, 밀착 연접 파괴, 미세융모 소실 또는 SGLT-1 비활성화를 위한 것이다.
다른 구현예에서, 박테리아 분비 시스템을 포함하는 본 발명에 의해 제공되는 ADAS는 T6SS를 포함한다. 일부 구현예에서, T6SS는 그의 천연의 숙주에서 박테리아를 표적화하며, 박테리아를 사멸시키는 이펙터를 함유한다. 특정한 구체적인 구현예에서, T6SS는 슈도모나스 푸티다(P. putida) K1-T6SS로부터 유래되며, 선택적으로, 이펙터는 Tke2의 아미노산 서열(수탁 번호 AUZ59427.1) 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, T6SS는 그의 천연의 숙주에서 진균을 표적화하고, 진균을 사멸시키는 이펙터를 함유하며, 예를 들어, T6SS는 세라티아 마르세슨스(Serratia Marcescens)로부터 유래되며, 이펙터는 하기의 아미노산 서열을 포함한다: Tfe1(진뱅크(Genbank): SMDB11_RS05530) 또는 Tfe2(진뱅크: SMDB11_RS05390).
박테리아 분비 시스템을 함유하는 본 발명에 의해 제공되는 ADAS의 다른 구현예에서, 박테리아 분비 시스템은 카고를 세포외로 유출시킬 수 있다. 특정한 보다 구체적인 구현예에서, 박테리아 분비 시스템은 T1SS, T2SS, T5SS, T7SS, Sec, 또는 Tat이다.
E.프로테아제, RNase 및/또는 LPS가 결여된 ADAS
또 다른 양태에서, 본 발명은 복수의 ADAS(예를 들어, 고활성 ADAS)를 포함하는 조성물을 제공하며, ADAS는 야생형 부모 박테리아로부터 생성되는 ADAS에 비하여 감소된 프로테아제 수준 또는 활성을 갖는다. 일부 양태에서, ADAS는 적어도 하나의 프로테아제의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형된 부모 박테리아로부터 생성된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 복수의 ADAS(예를 들어, 고활성 ADAS)를 포함하는 조성물을 제공하며, ADAS는 야생형 부모 박테리아로부터 생성되는 ADAS에 비하여 감소된 RNAse 수준 또는 활성을 갖는다. 일부 양태에서, ADAS는 적어도 하나의 RNAse의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형된 부모 박테리아로부터 생성된다. 일부 구현예에서, RNase이 엔도리보뉴클레아제 또는 엑소리보뉴클레아제이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하며, ADAS는 감소된 지질다당류(LPS)를 갖도록 변형된다. 일부 구현예에서, 변형은 지질 A 생합성 미리스토일트랜스퍼라제(msbB) 내의 돌연변이이다.
특정 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 ADAS는 하나 이상의 대사적으로 비-필수적인 단백질이 결여된다. "대사적으로 비-필수적인 단백질"은 비-배타적으로 하기를 포함한다: 핌브리아(fimbriae), 편모(flagella), 원하지 않는 분비 시스템, 트랜스포사제(transposase), 이펙터, 파지 요소 또는 그들의 조절 요소, 예컨대 flhC 또는 OmpA. 일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 ADAS는 RNAse, 프로테아제 또는 그의 조합 중 하나 이상이 결여되며, 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 엔도리보뉴클레아제(예컨대, RNAse A, RNAse h, RNAse III, RNAse L, RNAse PhyM) 또는 엑소리보뉴클레아제(예컨대, RNAse R, RNAse PH, RNAse D); 또는 세린, 시스테인, 트레오닌, 아스파르틱, 글루타믹 및 금속-프로테아제 또는 상기의 것들 중 임의의 것의 조합이 결여된다.
E.표적화 모이어티를 포함하는 ADAS
또 다른 구현예에서, 본 발명은 복수의 ADAS(예를 들어, 고활성 ADAS)를 포함하는 조성물을 제공하며, ADAS는 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 나노바디, 탄수화물 결합 단백질 또는 종양-표적화 펩티드이다.
특정 구현예에서, 나노바디는 종양 항원, 예컨대 HER2, PSMA 또는 VEGF-R에 대하여 유도된 나노바디이다. 다른 구현예에서, 탄수화물 결합 단백질은 렉틴, 예를 들어, 만노스 결합 렉틴(MBL)이다. 또 다른 구현예에서, 종양-표적화 펩티드는 RGD 모티프 또는 CendR 펩티드이다.
F.편리공생성 또는 병원성 부모 균주로부터 유래된 ADAS
또 다른 구현예에서, 본 발명은 복수의 ADAS(예를 들어, 고활성 ADAS)를 포함하는 조성물을 제공하며, ADAS는 포유동물 병원체 또는 포유동물 편리공생성 박테리아인 부모 박테리아로부터 유래된다. 일부 경우에, 포유동물 편리공생성 박테리아는 스타필로코커스, 비피도박테리아, 마이크로코커스, 락토바실러스 또는 악티노마이세스 종이거나, 포유동물 병원성 박테리아는 장출혈성 에스케리키아 콜라이(EHEC), 살모넬라 타이피무리움, 시겔라 플렉스네리, 예르시니아 엔테롤리티카 또는 헬리코박터 파일로리이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 복수의 ADAS(예를 들어, 고활성 ADAS)를 포함하는 조성물을 제공하며, ADAS는 식물 병원체 또는 식물 편리공생성 박테리아인 부모 박테리아로부터 유래된다. 일부 경우에, 식물 편리공생성 박테리아는 바실러스 서브틸리스 또는 슈도모나스 푸티다이거나, 식물 병원성 박테리아는 잔토모나스 종 또는 슈도모나스 시린가에이다.
G.영양요구성 부모 균주로부터 유래된 ADAS
또 다른 구현예에서, 본 발명은 복수의 ADAS(예를 들어, 고활성 ADAS)를 포함하는 조성물을 제공하며, ADAS는 영양요구성 부모 박테리아, 즉 성장에 요구되는 유기 화합물을 합성하는 능력이 없는 부모 박테리아로부터 유래된다. 이러한 박테리아는 유기 화합물이 제공되는 경우에만 성장할 수 있다.
H.추가의 모이어티를 포함하는 ADAS
ADAS는 특정 구현예에서, 기능적 ATP 신타제, 일부 구현예에서, 막 매립된 양성자 펌프를 포함한다. ADAS는 게놈-부재 폐쇄된 막 시스템을 생성하도록 조작되거나 유도된 부모 박테리아 균주("부모 균주"), 게놈-제거된 박테리아, (예를 들어, 기계적 또는 기타 수단에 의한) 박테리아 세포 제제 추출물 또는 총 합성물을 포함하며, 선택적으로 박테리아 세포 제제의 분획을 포함하는 상이한 공급원으로부터 유래될 수 있다 일부 구현예에서, 고활성 ADAS는 적어도 하기의 ATP 신타제 농도를 갖는다: 10000 nm2당 1, 5000 nm2당 1, 3500 nm2당 1, 1000 nm2당 1.
본 발명에 의해 제공되는 ADAS는 예를 들어, 광전변환 펌프, 레티날 및 레티날-생성 카세트, 대사 효소, 표적화 제제, 카고, 박테리아 분비 시스템 및 수송체를 포함하고, 상기의 것들의 조합을 포함하고, 하기에 기재되는 특정 구체적인 구현예를 포함하는 다양한 추가의 구성성분을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, ADAS는 다른 요소, 예컨대 대사적으로 비-필수적인 유전자 및/또는 특정 뉴클레아제 또는 프로테아제가 결여된다.
특정 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 ADAS는 ATP 신타제를 포함하며, 선택적으로 조절 도메인이 결여되고, 예컨대 엡실론 도메인이 결여된다. 결실은 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, 결실은 고유 엡실론 도메인의 유도 가능한 결실에 의해 이루어진다. 특정 구현예에서, 결실은 LoxP 부위와의 측접 및 유도 가능한 Cre 발현 또는 CRISPR 낙아웃에 의해 달성될 수 있거나, 유도 가능할 수 있다(ATP 신타제 낙아웃 균주 내의 tTa tet 트랜스작용인자 하의 플라스미드 상에 배치).
ADAS는 일부 구현예에서, 광전변환 양성자 펌프를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 광전변환 양성자 펌프는 프로테오로돕신이다. 보다 구체적인 구현예에서, 프로테오로돕신은 비배양된 해양 박테리아 분류군 SAR86, 진뱅크 수탁 번호: AAS73014.1 유래의 프로테오로돕신의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 광전변환 양성자 펌프는 글로에오박터(gloeobacter) 로돕신이다. 특정 구현예에서, 광전변환 양성자 펌프는 할로비움 살리나룸(Halobium salinarum) 나트로노모나스 파라오니스(Natronomonas pharaonis), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 할로테리게나 투르크메니카(Haloterrigena turkmenica) 또는 할로아르쿨라 마리스모르투이(Haloarcula marismortui) 유래의 박테리오로돕신, 델타로돕신 또는 할로로돕신이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 ADAS는 레티날을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 ADAS는 레티날 합성 단백질(또는 단백질 시스템) 또는 이를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 ADAS는 하나 이상의 당분해 경로 단백질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 당분해 경로 단백질은 예를 들어, 유니프로트(UniProt) 수탁 번호 P0A796의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 포스포프룩토키나제(Pfk-A)이다. 다른 구현예에서, 당분해 경로 단백질은 예를 들어, UniProt 수탁 번호 P0A858의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 트리오스포스페이트 아이소머라제(tpi)이다.
I.ADAS 조성물 및 제형
본 발명은 특히, 본 발명에 의해 제공되는 고활성 ADAS 제제 또는 복수의 개별 ADAS에 세포 분열 토폴로지 특이성 인자가 결여된, 예를 들어, minE 유전자 생성물이 결여된 ADAS 제제를 포함하는 본 발명에 의해 제공되는 ADAS를 함유하는 조성물 또는 제제를 제공하며, 선택적으로 ADAS 제제는 생존 가능한 세포가 실질적으로 없다. 집합적으로, 이들은 "본 발명에 의해 제공되는 조성물들" 또는 "본 발명에 의해 제공되는 조성물" 등이며, 본 발명에 의해 제공되는 임의의 ADAS 및 본 발명에 의해 제공되는 ADAS의 임의의 조합을 함유할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 조성물은 적어도 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9%, 또는 그 이상의 박테리아 분비 시스템을 함유하는 ADAS를 함유한다. 구체적인 구현예에서, 박테리아 분비 시스템은 T3SS, T4SS, T3/4SS, 또는 T6SS 중 하나이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 조성물은 T3SS를 함유하는 ADAS를 함유하며, 여기서, ADAS는 약 40000, 35000,30000, 25000, 19600, 15000, 10000, 또는 5000 nm2 내에 1 초과의 평균 T3SS 막 밀도를 포함한다. 일부 특정 구현예에서, ADAS가 에스. 티피뮤리움 또는 이. 콜라이 부모 균주로부터 유래된다.
본 발명에 의해 제공되는 조성물의 특정 구현예는 T3SS를 함유하는 ADAS를 함유하며, 여기서, ADAS는 약 300000, 250000, 200000, 150000, 100000, 50000, 20000, 10000, 5000 nm2 내에 1 초과의 평균 T3SS 막 밀도를 포함한다. 일부 특정 구현예에서, ADAS가 아그로박테리움 투메파시엔스 부모 균주로부터 유래된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 ADAS의 조성물을 제공하며, 적어도 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9% 또는 그 이상의 ADAS는 T3, T4, T3/4SS, T6SS를 포함하고, 선택적으로 외인성 탄수화물, 인산염 생성 신타제, 광 반응성 단백질, 유입 단백질, 효소, 기능적 카고, 유기체-특이적 이펙터, 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 박테리아 분비 시스템을 함유한다.
용이하게 명백해질 것처럼, 본 발명에 의해 제공되는 조성물 및 제제는 본 발명에 의해 제공되는 임의의 ADAS, 예컨대 고활성 ADAS 또는 minE 유전자 생성물이 결여된 ADAS를 함유할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 조성물은 임의의 적합한 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 제형은 IP, IV, IM, 경구, 국소(크림, 겔, 연고, 경피 패치), 에어로졸화 또는 분무화 투여에 적합할 수 있다. 일부 구현예에서, 제형이 액체 제형이다. 다른 구현예에서, 제형은 동결건조된 제형이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 ADAS 조성물은 100 콜로니-형성 유닛(CFU/mL) 미만의 생존 가능한 박테리아 세포, 예를 들어, 50 CFU/mL 미만, 20 CFL/mL 미만, 10 CFU/mL 미만, 1 CFU/mL 미만 또는 0.1 CFU/mL 미만의 생존 가능한 박테리아 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 ADAS 조성물을 제공하며, 여기서, ADAS는 동결건조되고 재구성되며, 재구성된 ADAS는 동결건조되지 않는 ADAS의 ATP 농도의 적어도 90%인, 예를 들어, 동결건조되지 않은 ADAS의 ATP 농도의 적어도 95%, 98%이거나 또는 적어도 이와 동일한 ATP 농도를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 ADAS 조성물을 제공하며, 여기서, ADAS는 보관되며, 예를 들어, 4℃에서 보관되며, 보관 후에, ADAS는 보관되지 않은 ADAS의 ATP 농도의 적어도 90%인, 예를 들어, 보관되지 않은 ADAS의 ATP 농도의 적어도 95%, 98%이거나 또는 적어도 이와 동일한 ATP 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, 보관은 적어도 1일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 6개월 또는 적어도 1년 동안 이루어진다.
일부 구현예에서, ADAS는 보존되거나, 다르게는 "정지" 상태로 존재한 다음 신속하게 활성화될 수 있다.
일부 구현예에서, ADAS 조성물은 동물로의 전달을 위해 제형화되고, 예를 들어, 복강내, 정맥내, 근육내, 경구, 국부, 에어로졸, 또는 분무화 투여를 위해 제형화된다.
일부 구현예에서, ADAS 조성물은 식물로의 전달을 위해 제형화된다.
일부 구현예에서, ADAS 조성물은 곤충으로의 전달을 위해 제형화된다.
일부 구현예에서, 조성물은 액체, 고체, 에어로졸, 페이스트, 겔 또는 기체 조성물로서 제형화된다.
J.효소를 포함하는 ADAS
일 양태에서, 본 발명은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 특징으로 하며, ADAS는 효소를 포함하며, 효소는 기질을 변경시켜, 표적 생성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 기질은 ADAS에 존재하며, 표적 생성물은 ADAS에서 생성된다. 다른 구현예에서, 기질은 표적 세포, 또는 ADAS가 전달되는 환경에 존재한다. 일부 구현예에서, 효소는 디아데닐레이트 사이클라제 A이며, 기질은 ATP이며, 표적 생성물은 사이클릭-디-AMP이다.
III.ADAS의 제조 방법
A.ADAS 및 고활성 ADAS의 제조
일부 양태에서, 본 발명은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물의 제조 방법을 특징으로 하며, 상기 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없으며, 상기 방법은 (a) 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성의 감소를 갖는 복수의 부모 박테리아를 제조하거나, 제공하거나 또는 수득하는 단계; (b) 부모 박테리아를 미니세포의 형성을 가능하게 하는 조건에 노출시킴으로써, 고활성 ADAS를 생성하는 단계; 및 (c) 고활성 ADAS를 부모 박테리아로부터 분리함으로써, 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 조성물을 생성하는 단계를 포함한다.
부모 박테리아는 ADAS가 생성될 수 있는 임의의 적합한 박테리아 종(예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여 ADAS를 생성하도록 변형될 수 있는 종)을 포함한다. 표 4는 ADAS가 유래될 수 있는 적합한 속의 비-제한적인 목록을 제공한다.
[표 4] ADAS 생성을 위한 박테리아 종
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
일부 양태에서, 본 발명은 본원의 섹션 I에 기재된 ADAS 조성물 중 임의의 것, 예를 들어, 고활성 ADAS 조성물의 제조 방법을 특징으로 한다. 예를 들어, 고활성 ADAS의 제조 방법; 세포 분열 토폴로지 특이성 인자가 결여되고, 선택적으로, Z-링 저해 단백질이 결여된 ADAS의 제조 방법(예를 들어, ΔminCDE 부모 박테리아로부터 ADAS의 제조 방법) 및 본원에 언급된 ADAS 중 임의의 것의 제조 방법이 본원에 제공되며, ADAS는 카고를 포함한다.
상기 청구범위 중 임의의 것의 고활성 ADAS는 박테리아 세포로부터 제조될 수 있으며, 부모 균주는 식물 박테리아, 예컨대 식물 편리공생체(예를 들어, 바실러스 서브틸리스 또는 슈도모나스 푸티다) 또는 식물 병원체 박테리아(예를 들어, 잔토모나스 종 또는 슈도모나스 시린가에) 또는 인간 박테리아, 예컨대 편리공생성 인간 박테리아(예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 스타필로코커스 종, 비피도박테리움 종, 마이크로코커스 종, 락토바실러스 종 또는 악티노마이세스 종) 또는 병원성 인간 박테리아(예를 들어, 에스케리키아 콜라이 EHEC, 살모넬라 타이피무리움, 시겔라 플렉스네리, 예르시니아 엔테롤리티카, 헬리코박터 파일로리), 또는 극한생물로부터 선택되며, 이는 예를 들어, 기능적 카세트, 예컨대 박테리아가 하기 중 하나 이상을 행하도록 유도하는 기능적 카세트를 포함하는, 상기의 것들 중 임의의 것의 작용화된 유도체를 포함한다: 항미생물제 분비, 플라스틱 분해, 살충제 분비, 극한 환경에서 생존, 나노입자 제조, 다른 유기체 내의 통합, 환경에 대한 반응 및 리포터 신호 생성.
부모 박테리아는 예를 들어, 기능적 카세트, 예컨대 박테리아가 하기 중 하나 이상을 행하도록 유도하는 기능적 카세트를 포함하는 상기의 것들 중 임의의 것의 작용화된 유도체를 포함할 수 있다: 항미생물제 분비, 플라스틱 분해, 살충제 분비, 극한 환경에서 생존, 나노입자 제조, 다른 유기체 내의 통합, 환경에 대한 반응 및 리포터 신호 생성.
일부 구현예에서, ADAS는 ATP 신타제를 과발현하도록 조작되거나 유도된 부모 균주로부터 유래된다. 일부 더욱 구체적인 구현예에서, ATP 신타제는 부모 균주에 대하여 이종이다. 특정 구체적인 구현예에서, 부모 균주는 기능적 FoF1 ATP 신타제를 발현하도록 변형된다.
특정 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 ADAS는 하기로부터 선택되는 조건 하에서 배양되는 부모 균주로부터 수득된다: 인가된 전압(예를 들어, 37 mV), 비-대기 산소 농도(예를 들어, 1 내지 5% O2, 5 내지 10% O2, 10 내지 15% O2, 25 내지 30% O2), 낮은 pH(약: 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5) 또는 그의 조합.
상기 청구범위 중 어느 하나의 고활성 ADAS는 극한생물로부터 제조되며, 이는 예를 들어, 기능적 카세트, 예컨대 박테리아가 하기 중 하나 이상을 행하도록 유도하는 기능적 카세트를 포함하는, 상기의 것들 중 임의의 것의 작용화된 유도체를 포함한다: 항미생물제 분비, 플라스틱 분해, 살충제 분비, 극한 환경에서 생존, 나노입자 제조, 다른 유기체 내의 통합, 환경에 대한 반응 및 리포터 신호 생성.
박테리아의 다양성으로 인하여, ADAS는 예를 들어, 표적 세포에의 투여 시에 ADAS의 생체분포를 개선시키도록, 변형된 막을 사용하여 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 막은 식물 또는 동물에서 면역원성 또는 면역자극성이 더 낮도록 변형된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, ADAS는 부모 균주로부터 수득되며, 부모 균주의 면역자극 능력은 세제, 효소 또는 PEG를 사용한 작용화를 사용하여 생성 후 처리를 통해 감소되거나 제거된다. 특정 구현예에서, ADAS는 부모 균주로부터 제조되며, 막은 예를 들어, msbB를 낙아웃시킴으로써 부모 균주에서 LPS 합성 경로의 낙아웃을 통해 변형된다. 다른 구체적인 구현예에서, ADAS는 고삼투압 조건에 대한 노출을 통해 세포벽-결함 입자를 생성하는 부모 균주로부터 제조된다.
일부 구현예에서, 방법은 부모 균주를 유도성 DNAse 시스템, 예컨대 exoI(NCBI GeneID: 946529) 및 sbcD(NCBI GeneID: 945049) 뉴클레아제 또는 I-CeuI(예를 들어, 스위스프로트(Swissprot): P32761.1) 뉴클레아제를 사용하여 형질전환시키는 단계를 포함한다. 보다 구체적인 구현예에서, 방법은 단일, 이중, 삼중 또는 사중 영양요구성 균주를 사용하는 것과, 유도성 뉴클레아제를 인코딩하는 플라스미드 상에 상보성 유전자를 갖는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 방법의 방법에서, 부모 균주는 하기로부터 선택되는 조건 하에서 배양된다: 인가되는 전압(예를 들어, 37 mV), 비-대기 산소 농도(예를 들어, 1 내지 5% O2, 5 내지 10% O2, 10 내지 15% O2, 25 내지 30% O2), 낮은 pH(4.5-6.5) 또는 그의 조합.
특정 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 방법의 방법에서, 부모 균주는 편모 및 원하지 않는 분비 시스템이 결여되며, 선택적으로, 편모 및 원하지 않는 분비 시스템은 람다 레드(lambda red) 재조합을 사용하여 제거된다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 방법에서, 편모 방제 구성성분은 예를 들어, 편모 방제 유전자, 예컨대 flhD 및 flhC를 향해 표적화된 CRISPR 도메인을 함유하는 플라스미드의 삽입을 통해 부모 균주 게놈으로부터 절제된다.
특정 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 방법은 고활성 ADAS를 제조하기 위한 것이며, 로돕신-인코딩 유전자를 함유하는 플라스미드를 포함하는 ADAS는 광의 존재 하에 배양된다. 보다 구체적인 구현예에서, 로돕신은 진뱅크 수탁 번호: AAS73014.1의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편을 갖는 SAR86 비배양된 박테리아 유래의 프로테오로돕신이다. 더더욱 구체적인 구현예에서, 배양물은 레티날이 보충된다. 다른 더욱 구체적인 구현예에서, 로돕신은 프로테오로돕신이며, 플라스미드는 레티날을 함유하는 유전자를 추가적으로 함유한다(이러한 플라스미드는 문헌[Kim et al., Microb Cell Fact, 2012]으로부터의 pACYC-RDS 플라스미드이다).
특정 구체적인 구현예에서, 부모 균주는 이어서 ADAS의 막 상에 발현되는 나노바디를 인코딩하는 핵산 서열을 함유한다.
본 발명에 의해 제공되는 방법의 일부 구현예에서, 부모 균주는 하나 이상의 박테리아 분비 시스템 오페론을 인코딩하는 핵산 서열을 함유한다. 예시적인 플라스미드는 살모넬라 SPI-1 T3SS, 시겔라 플렉스네리 T3SS, 아그로(Agro) Ti 플라스미드 및 슈도모나스 푸티다 K1-T6SS 시스템을 포함한다.
특정 구현예에서, 부모 균주는 카고를 포함한다. 일부 구현예에서, 부모 균주는 소분자 카고를 합성하는 일련의 유전자를 인코딩하는 핵산 서열을 함유한다.
IV. ADAS 및 AND 조성물 정제
본원에 제공되는 방법 및 조성물의 일부 구현예에서, ADAS는 생존 가능한 박테리아, 예를 들어, 부모 박테리아를 포함하는 조성물(예를 들어, 배양물)로부터 정제된다. 예를 들어, 본 발명은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물의 제조 방법을 특징으로 하며, 상기 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없으며, 상기 방법은 (a) 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성의 감소를 갖는 복수의 부모 박테리아를 제조하거나, 제공하거나 또는 수득하는 단계; (b) 부모 박테리아를 미니세포의 형성을 가능하게 하는 조건에 노출시킴으로써, 고활성 ADAS를 생성하는 단계; 및 (c) 고활성 ADAS를 부모 박테리아로부터 분리함으로써, 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 조성물을 생성하는 단계를 포함한다.
정제는 ADAS를 더 크고, 게놈을 함유하는 생존 가능한 부모 박테리아 세포로부터 분리한다. 고활성 ADAS를 부모 박테리아로부터 분리하는 것은 본원에 기재된 바와 같이, 다수의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 본원에 기재된 예시적인 정제 방법은 원심분리, 선택적 성장 및 완충제 교환/농축 과정을 포함한다.
일부 양태에서, ADAS 조성물 및 이러한 조성물의 비교 방법이 본원에 제공되며, 조성물은 부모 박테리아 세포 및/또는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없으며, 예를 들어, mL당 500 이하, 예를 들어, 400, 300, 200, 150 또는 100 또는 50 미만, 25 미만, 10 미만, 5 미만, 1 미만, 0.1 미만의 콜로니-형성 유닛(CFU)을 갖는다. 일부 구현예에서, 부모 박테리아 세포가 실질적으로 없는 ADAS 조성물은 박테리아 세포를 포함하지 않을 수 있다.
영양요구성 부모 균주를 사용하여 본 발명에 의해 제공되는 ADAS를 제조할 수 있다. 하기에 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 이러한 제조 방법은 ADAS의 정제에 유용하다. 예를 들어, ADAS 생성 후에, 부모 박테리아 세포는 부모 박테리아의 생존력에 필수적인 영양소(예를 들어, 아미노산)가 결여된 배지에서의 성장에 의해 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 ADAS는 하기 중 적어도 1, 2, 3, 4가지 또는 그 이상에 대하여 영양요구성인 부모 균주로부터 유래된다: 아르기닌(예를 들어, argA에서의 낙아웃, 예컨대 균주 JW2786-1 및 NK5992), 시스테인 cysE에서의 낙아웃(예컨대 균주 JW3582-2 및 JM15), 글루타민, 예를 들어, glnA에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW3841-1 및 M5004), 글리신, 예를 들어, glyA에서의 낙아웃(예컨대 균주 JW2535-1 및 AT2457), 히스티딘, 예를 들어, hisB에서의 낙아웃(예컨대 균주 JW2004-1 및 SB3930), 이소류신, 예를 들어, ilvA에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW3745-2 및 AB1255), 류신, 예를 들어, leuB에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW5807-2 및 CV514), 라이신, 예를 들어, lysA에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW2806-1 및 KL334), 메티오닌, 예를 들어, metA에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW3973-1 및 DL41), 페닐알라닌, 예를 들어, pheA에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW2580-1 및 KA197), 프롤린, 예를 들어, proA에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW0233-2 및 NK5525), 세린, 예를 들어, serA에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW2880-1 및 JC158), 트레오닌, 예를 들어, thrC에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW0003-2 및 Gif 41), 트립토판, 예를 들어, trpC에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW1254-2 및 CAG18455), 티로신, 예를 들어, tyrA에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW2581-1 및 N3087), 발린/이소류신/류신, 예를 들어, ilvd에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW5605-1 및 CAG18431).
특정 구현예에서, 방법은 단일, 이중, 삼중 또는 사중 영양요구성 부모 균주를 사용하는 것을 포함하며, 선택적으로, 상기 부모 균주는 ftsZ를 발현하는 플라스미드를 추가로 포함한다.
V. ADAS의 이용 방법
A.ADAS의 전달 방법
일 양태에서, 본 발명은 고활성 ADAS를 표적 세포에 전달하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (a) 복수의 고활성 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS가 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 단계; 및 (b) 표적 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 ADAS(예를 들어, 고활성 ADAS)를 표적 세포에 전달하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및 표적 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
표적 세포는 예를 들어, 동물 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포일 수 있다.
B.카고의 전달 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 카고(예를 들어, 핵산, 플라스미드, 폴리펩티드, 단백질, 효소, 아미노산, 소분자, 유전자 편집 시스템, 호르몬, 면역 조절제, 탄수화물, 지질, 유기 입자, 무기 입자 또는 리보핵단백질 복합체(RNP))를 표적 세포에 전달하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS가 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, ADAS가 카고를 포함하며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 단계; 및 (b) 표적 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 카고(예를 들어, 핵산, 플라스미드, 폴리펩티드, 단백질, 효소, 아미노산, 소분자, 유전자 편집 시스템, 호르몬, 면역 조절제, 탄수화물, 지질, 유기 입자, 무기 입자 또는 리보핵단백질 복합체(RNP))를 표적 세포에 전달하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 부모 박테리아로부터 유래되며, ADAS가 카고를 포함하며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및 표적 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
카고가 전달되는 표적 세포는 예를 들어, 동물 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포일 수 있다.
C.세포의 상태를 조절하는 방법
일 양태에서, 본 발명은 동물 세포의 상태를 조절하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS가 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 단계; 및 (b) 동물 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 동물 세포의 상태를 조절하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 식물 세포의 상태의 조절 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS가 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 단계; 및 (b) 식물 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 식물 세포의 상태를 조절하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 곤충 세포의 상태의 조절 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS가 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 단계; 및 (b) 곤충 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 곤충 세포의 상태를 조절하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 동물 세포의 상태를 조절하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및 동물 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 동물 세포의 상태를 조절하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 식물 세포의 상태를 조절하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및 식물 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 식물 세포의 상태를 조절하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 곤충 세포의 상태를 조절하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및 곤충 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 곤충 세포의 상태를 조절하는 단계를 포함한다.
조절은 이러한 측정을 위한 해당 분야에 알려져 있는 기법 및 방법, 예를 들어, 단백질, 전사물, 후성유전학적 표시의 수준 또는 발현을 측정하기 위한, 또는 생물학적 경로의 활성의 증가 또는 감소를 측정하기 위한 방법을 사용하여 측정되는 바와 같은, 세포(예를 들어, 동물, 식물 또는 곤충 세포)의 상태(예를 들어, 전사체, 프로테옴, 후성유전체, 생물학적 효과 또는 건강 또는 질병 상태)의 임의의 관찰 가능한 변화일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 상태를 조절하는 것은 세포의 파라미터(예를 들어, 단백질, 전사물의 수준 또는 발현, 또는 생물학적 경로의 활성)를 증가시키는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, ~의 상태를 조절하는 것은 세포의 파라미터(예를 들어, 단백질, 전사물의 수준 또는 활성, 또는 생물학적 경로의 활성)를 감소시키는 것을 포함한다.
D.동물, 식물 또는 곤충의 치료 방법
일부 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 동물의 치료 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS가 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 단계; 및 (b) 동물을 유효량의 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 동물을 치료하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 동물의 치료 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및 동물을 유효량의 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 동물을 치료하는 단계를 포함한다.
치료를 필요로 하는 동물은 질병, 예를 들어, 암을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, ADAS는 화학요법 카고 또는 면역요법 카고를 보유한다.
일부 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 식물의 치료 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS가 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 단계; 및 (b) 식물 또는 그의 유해물(예를 들어, 곤충 유해물)을 유효량의 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 식물을 치료하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 식물의 치료 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및 식물 또는 그의 유해물(예를 들어, 곤충 유해물)을 유효량의 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 식물을 치료하는 단계를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 표적 세포의 조절 방법을 제공한다. 표적 세포는 동물 세포(예를 들어, 인간, 및 농장 또는 애완 동물, 유해 동물을 포함하는 비-인간 동물), 식물 세포(농작물 또는 유해물 유래의 것 포함), 진균 세포 또는 박테리아 세포를 포함하는 임의의 세포일 수 있다. 세포는 예를 들어, 시험관 내에서, 또는 다른 구현예에서, 생체 내에서 유기체 내에서 단리될 수 있다. 이들 방법은 유효량으로 본 발명에 의해 제공되는 ADAS 또는 본 발명에 의해 제공되는 조성물에, 표적 세포에 대한 접근을 제공하는 것을 수반한다. 표적 세포에 대한 접근은 예를 들어, 표적 세포가 예컨대 표적 세포에 근접한 일부 제제의 근접한 분비 또는 표적 세포 내의 제제의 주입에 의해 ADAS에 의해 직접적으로 조절되는 경우, 직접적일 수 있거나, 또는 간접적일 수 있다. 표적 세포의 간접적인 조절은 상이한 세포를 표적화시킴으로써, 예를 들어, 표적 세포에 인접한 세포를 조절함으로써 이루어질 수 있으며, 인접 세포는 표적 세포에 대하여 병원성이거나, 편리공생성일 수 있다. 인접 세포는 표적 세포와 같이, 시험관 내 또는 생체 내에, 즉, 편리공생성이거나 병원성일 수 있는 유기체 내에 존재할 수 있다. 이들 방법은 집합적으로 "본 발명에 의해 제공되는 이용 방법" 등이다. 관련 양태에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 이용 방법과 일치하는, 본 발명에 의해 제공되는 ADAS 및 조성물의 표적 용도를 제공한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 동물 세포에 대한 유효량의 본 발명에 의해 제공되는 ADAS 또는 본 발명에 의해 제공되는 조성물 접근을 제공하는 단계에 의한, 동물 세포의 상태의 조절 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, ADAS 또는 조성물에는, 동물, 예컨대 포유동물, 예컨대 인간에서, 생체 내에서 동물 세포에 대한 접근이 제공된다. 일부 구현예에서, 동물 세포가 건강한 동물 내의 박테리아에 노출된다. 보다 구체적인 구현예에서, 동물 세포는 폐 상피, 면역 세포, 피부 세포, 구강 상피 세포, 소화관 상피 세포, 생식관 상피 세포 또는 요로 세포이다. 더더욱 구체적인 구현예에서, 동물 세포는 소화관 상피 세포, 예컨대 염증성 장 질병, 예컨대 크론병 또는 대장염을 갖는 인간 대상체 유래의 소화관 상피 세포이다. 보다 더 구체적인 구현예에서, 동물 세포는 염증성 장 질병을 갖는 대상체 유래의 소화관 상피 세포이며, ADAS는 박테리아 분비 시스템 및 항-염증제를 포함하는 카고를 포함한다.
다른 구현예에서, 동물 세포가 질병 이환 상태인 박테리아에 노출된다. 특정 구현예에서, 동물 세포는 병원성, 예컨대 종양이다. 다른 구현예에서, 동물 세포가 질병 이환 상태, 예를 들어, 상처, 궤양, 종양, 또는 염증성 장애 내의 박테리아에 노출된다.
특정 구현예에서, ADAS가 동물 편리공생성 부모 균주로부터 유래된다. 다른 구현예에서, ADAS가 동물 병원성 부모 균주로부터 유래된다.
특정 구체적인 구현예에서, 동물 세포는 T3/4SS 또는 T6SS 및 카고를 포함하는 유효량의 ADAS와 접촉되며, 카고는 동물 세포 내에 전달된다. 일부 구체적인 구현예에서, 동물 세포에는, 카고 및 분비 시스템을 포함하는 유효량의 ADAS에 대한 접근이 제공되며, 카고는 세포외로 분비되며, 동물 세포와 접촉한다.
일부 구현예에서, 동물 세포의 상태는 유효량의 본 발명에 의해 제공되는 ADAS 또는 본 발명에 의해 제공되는 조성물에, 동물 세포의 부근의 박테리아 또는 진균 세포에 대한 접근을 제공함으로써 조절된다. 즉, 이들 방법은 동물 세포의 상태를 간접적으로 조절하는 것을 수반한다. 특정 구현예에서, 박테리아 또는 진균 세포는 병원성이다. 보다 구체적인 구현예에서, 병원성 박테리아 또는 진균 세포의 건강이 감소된다. 다른 특정 구현예에서, 박테리아 또는 진균 세포는 편리공생성이다. 보다 구체적인 구현예에서, 편리공생성 박테리아 또는 진균 세포의 건강이 증가된다. 더더욱 구체적인 구현예에서, 중성, 편리공생성, 또는 병원성일 수 있는 경쟁 박테리아 또는 진균의 수의 건강 감소를 통해 편리공생성 박테리아 또는 진균 균주의 건강이 증가된다.
특정 구체적인 구현예에서, 동물 세포 부근의 박테리아 또는 진균 세포는 T3/4SS 또는 T6SS 및 카고를 포함하는 유효량의 ADAS와 접촉되며, 카고는 박테리아 또는 진균 세포 내에 전달된다. 다른 구체적인 구현예에서, 동물 세포 부근의 박테리아 또는 진균 세포에는, 박테리아 또는 진균 세포와 접촉하는 카고를 세포외로 분비하는 유효량의 ADAS에 대한 접근이 제공된다.
특정 구현예에서, ADAS가 박테리아 또는 진균 세포의 경쟁자인 부모 균주로부터 유래된다. 다른 구현예에서, ADAS가 박테리아 또는 진균 세포의 상리공생균인 부모 균주로부터 유래된다.
이해될 바와 같이, 동물 세포의 상태를 조절하는 본 발명에 의해 제공되는 다양한 이용 방법은 식물, 진균 또는 박테리아 세포의 상태를 조절하기 위한 상응하는 방법에 대해 용이하게 조정될 수 있다. 예시의 목적을 위하여, 식물의 세포 또는 진균 세포의 조절 방법은 더욱 구체적으로 설명될 것이다.
따라서, 관련 양태에서, 본 발명은 a) 식물 또는 진균 세포, b) 식물 또는 진균 세포 부근의 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포, 또는 c) 식물 또는 진균 세포 부근의 곤충 또는 선충 세포에 대한 유효량의 본 발명에 의해 제공되는 ADAS 또는 본 발명에 의해 제공되는 조성물 접근을 제공하는 단계에 의한 식물 또는 진균 세포의 상태의 조절 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, ADAS에는, 식물계 내에서, 예를 들어, 농작 식물, 예컨대 줄뿌림 작물, 예를 들어, 옥수수, 밀, 대두 및 벼, 및 채소 작물, 예를 들어, 솔라나세아에(solanaceae), 예컨대 토마토 및 후추; 조롱박, 예컨대 멜론 및 오이; 브라시카(brassicas), 예컨대 양배추 및 브로콜리; 녹색 채소, 예컨대 케일 및 상추; 뿌리 및 덩이뿌리, 예컨대 감자 및 당근; 대립종 채소, 예컨대 콩 및 옥수수; 및 버섯에서 식물 세포에 대한 접근이 제공된다. 일부 구현예에서, 식물 또는 진균 세포가 건강한 식물 또는 진균 내의 박테리아에 노출된다. 다른 구현예에서, 식물 또는 진균 세포가 질병 이환 상태인 박테리아에 노출된다.
특정 구현예에서, 식물 또는 진균 세포는 분열조직 세포와 같이 분열하거나, 종양과 같이 병원성이다. 일부 구현예에서, 식물 또는 진균 세포가 질병 상태, 예컨대 상처 내의 박테리아에 노출되며, 식물 또는 진균 세포는 인간 음식물의 일부가 아니다.
특정 구현예에 대해서, ADAS가 편리공생성 부모 균주로부터 유래된다. 다른 구현예에서, ADAS가 식물 또는 진균 병원성 부모 균주로부터 유래된다.
일부 구현예에서, ADAS는 T3/4SS 또는 T6SS 및 카고를 포함하며, 카고는 식물 또는 진균 세포 내에 전달된다. 다른 구현예에서, 식물 또는 진균 세포에는, 박테리아 분비 시스템 및 카고를 포함하는 유효량의 ADAS에 대한 접근이 제공되며, 박테리아 분비 시스템은 카고를 세포외로 분비함으로써, 식물 또는 진균 세포를 카고와 접촉시킨다.
일부 구현예에서, 방법은 식물 또는 진균 세포 부근의 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포에 대한 유효량의 ADAS 또는 조성물 접근을 제공하는 것을 수반한다. 보다 구체적인 구현예에서, 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포는 병원성이며, 선택적으로 병원성 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포의 건강이 감소된다. 다른 보다 구체적인 구현예에서, 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포는 편리공생성이며, 선택적으로 편리공생성 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포의 건강이 증가된다. 더더욱 구체적인 구현예에서, 중성, 편리공생성, 또는 병원성일 수 있는 경쟁 박테리아 또는 경쟁 진균의 감소를 통해 건강이 증가된다.
일부 구현예에서, 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포는 T3/4SS 또는 T6SS 및 카고를 포함하는 유효량의 ADAS와 접촉되며, 카고는 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포 내에 전달된다.
다른 구현예에서, 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포에는 박테리아 분비 시스템 및 카고를 포함하는 유효량의 ADAS에 대한 접근이 제공되며, 박테리아 분비 시스템은 카고를 세포외로 분비함으로써, 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포를 카고와 접촉시킨다.
일부 구현예에서, ADAS가 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포의 경쟁자인 부모 균주로부터 유래된다. 다른 구현예에서, ADAS가 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포의 상리공생 박테리아인 부모 균주로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 방법은 식물 또는 진균 부근의 곤충 또는 선충 세포에 대한 유효량의 ADAS 또는 조성물 접근을 제공하는 단계를 포함한다. 보다 구체적인 구현예에서, 곤충 또는 선충은 병원성이다. 더더욱 구체적인 구현예에서, 병원성 곤충 또는 선충 세포의 건강이 감소된다. 보다 더 구체적인 구현예에서, 병원성 곤충 또는 선충 세포의 건강이 곤충 또는 선충 세포 내의 공생생물의 조절을 통해 감소된다. 다른 구체적인 구현예에서, 곤충 또는 선충은 편리공생성이다. 보다 구체적인 구현예에서, 편리공생성 곤충 또는 선충 세포의 건강이 증가된다. 더더욱 구체적인 구현예에서, 중성, 편리공생성, 또는 병원성일 수 있는 경쟁 박테리아 또는 진균의 감소를 통해 건강이 증가된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 환경을 유효량의 본 발명에 의해 제공되는 ADAS 또는 본 발명에 의해 제공되는 조성물과 접촉시키는 단계로서, ADAS가 하나 이상의 바람직하지 않은 물질을 흡수하거나, 킬레이트화시키거나 또는 분해하는 하나 이상의 분자(예컨대, 단백질, 폴리머, 나노입자, 결합제 또는 그의 조합)를 포함하는 단계를 포함하는 환경으로부터 하나 이상의 바람직하지 않은 물질의 제거 방법을 제공한다. "환경"은 세포가 아닌 표적, 예컨대 해양, 토양, 슈퍼펀드 사이트(superfund site), 피부, 못, 소화관 내강 및 용기 내의 음식으로서 정의된다.
특정 구현예에서, 바람직하지 않은 물질은 중금속, 예컨대 수은을 포함하며, ADAS는 중금속에 결합하는 하나 이상의 분자(예컨대, 단백질, 폴리머, 나노입자, 결합제 또는 그의 조합), 예컨대 수은에 대한 MerR을 포함한다. 일부 구현예에서, 바람직하지 않은 물질은 플라스틱, 예컨대 PET를 포함하며, ADAS는 하나 이상의 플라스틱 분해 효소, 예컨대 PETase를 포함한다. 특정 구현예에서, 바람직하지 않은 물질은 하나 이상의 유기 소분자를 포함하며, ADAS는 상기 하나 이상의 유기 소분자를 대사시킬 수 있는 하나 이상의 효소를 포함한다.
E.RNA 전달 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 박테리아 또는 ADAS를 함유하는 조성물을 제공하며, 박테리아 또는 ADAS는 T4SS, RNA 결합 단백질 카고 및 RNA 결합 단백질에 의해 결합되는 RNA 카고를 포함하며, T4SS를 통한 표적 세포 내의 전달에 적합하다. 특정 구현예에서, RNA 결합 단백질은 VirE2 및 VirF에 융합된 Cas9이며, RNA 카고는 가이드 RNA이며, 선택적으로, T4SS는 아그로박테리움(Agrobacterium) 유래의 Ti 시스템이다. 다른 구현예에서, RNA 결합 단백질은 VirE2 또는 VirF에 융합된 카네이션 이탈리안 링스폿(Carnation Italian Ringspot) 바이러스 유래의 p19이며, RNA 카고는 siRNA이며, 선택적으로, T4SS는 아그로박테리움 유래의 Ti 시스템이다.
관련 양태에서, 본 발명은 이들 특정 조성물의 제조 방법을 제공하며, 이러한 방법은 VirE2 및 VirF에 융합된 Cas9 및 RNA 카고를 함유하는 플라스미드를 아그로박테리움 세포 내에 트랜스펙션시키는 단계를 수반한다.
추가의 관련 양태에서, 본 발명은 식물 세포 또는 동물 세포를 박테리아 또는 ADAS와 접촉시키는 단계로서, 박테리아 또는 ADAS가 T4SS, RNA 결합 단백질 카고 및 RNA 카고를 포함하며, RNA가 식물 세포 또는 동물 세포에 전달되는 단계를 포함하는 식물 세포 또는 동물 세포에의 RNA의 전달 방법을 제공한다. 보다 구체적인 구현예에서, RNA-결합 단백질 카고는 또한, 식물 세포 또는 동물 세포에 전달된다.
실시예
목차
실시예 1유전자 조작에 의한 ADAS 생산
실시예 2ADAS 정제
실시예 3ADAS 특성화
실시예 4ADAS 활성 측정
실시예 5ΔminCDE 부모로부터 생성되는 ADAS는 고활성이다
실시예 6막 디스플레이된 단백질을 갖는 ADAS
실시예 7카고 생성 및 ADAS에 의한 전달
실시예 8RNA 카고를 이용한 이. 콜라이 ADAS의 로딩
실시예 9인시목으로의 이. 콜라이의 전달
실시예 10ADAS의 저장
실시예 11ADAS 특성화를 위한 보충 방법
실시예 12이. 콜라이 ADAS의 생산을 위한 보충 방법
실시예 13에스케리키아 콜라이로부터 유래된 ADAS의 정제 및 효율 측정을 위한 보충적 방법
실시예 14대형 에스케리키아 콜라이 ADAS의 제조
실시예 15영양요구성 ADAS-생성 박테리아 균주를 생성하여, 순도를 증가시키기 위한 보충적 방법
실시예 16ADAS 활성 측정을 위한 보충 방법
실시예 17에스케리키아 콜라이로부터 유래된 ADAS의 보관을 위한 보충적 방법
실시예 18부모 박테리아에 대한 대형 ADAS의 유사성의 평가
실시예 19더 높은 순도의 영양요구성 ADAS를 나타내기 위한 보충적 방법
실시예 20발현되는 ATP 신타제를 갖는 ADAS가 고활성인지 여부를 결정하기 위한 보충적 방법
실시예 21ATP 신타제 ε 구성성분의 억제를 갖는 ADAS에서의 증가된 활성에 대한 검정
실시예 22변형된 당분해 경로를 갖는 고활성 ADAS
실시예 23특수 배양 조건에서 합성된 ADAS에서의 증가된 활성에 대한 검정
실시예 24편모 및 다른 비-필수 특징부가 제거된 ADAS에서의 증가된 활성에 대한 검정
실시예 25광합성 능력을 갖는 ADAS에서의 증가된 활성에 대한 검정
실시예 26안정한 핵산 및 단백질 페이로드를 갖는 에스케리키아 콜라이 ADAS를 생성하기 위한 보충적 방법
실시예 27에스케리키아 콜라이 ADAS로부터 리보뉴클레아제의 제거에 의한 카고 안정성의 증가
실시예 28Tat 신호 펩티드를 갖는 바실러스 서브틸리스 ADAS의 합성
실시예 29종양 억제를 위한 면역조절성 ADAS
실시예 30슈도모나스 푸티다 ADAS 및 고활성 ADAS의 합성
실시예 31항미생물제 및 식물 보호제로서의 T6SS-발현 ADAS
실시예 32모델 항진균 ADAS로서의 세라티아 마르세슨스 ADAS
실시예 33과발현된 T3SS를 통한 인간 소화관 상피 세포에의 단백질의 전달
실시예 34T3SS 시스템을 갖는 에스케리키아 콜라이 ADAS의 표적화된 전달을 위한 보충적 방법
실시예 35식물에의 T3SS 전달을 위한 잔토모나스 시트리 ADAS의 합성
실시예 36T4SS를 사용한 식물 형질전환제로서의 아그로박테리움 ADAS의 합성
실시예 37ADAS 분비 효율 측정
실시예 38비-막대-형상의 나노입자-함유 ADAS(마그네토스피릴룸 마그네티쿰(Magnetospirillum magneticum))
실시예 39환경 반응적(Environmentally responsive) ADAS
실시예 40에스케리키아 콜라이 및 극한생물 유래의 중금속-제거 ADAS
실시예 41에스케리키아 콜라이 ADAS에 의한 락토스 흡수 및 대사
실시예 42플라스틱의 분해를 위한 PETase-발현 에스케리키아 콜라이 ADAS
실시예 43T4 분비 시스템을 통한 RNA 분비
실시예 1: 유전자 조작에 의한 ADAS 생산
ADAS는 몇몇의 수단에 의해 부모 박테리아 세포로부터 생성될 수 있다. 본 실시예에서, ADAS는 부모 세포 분할 기능의 조절에 수반되는 하나 이상의 유전자의 파괴, 즉, Z-링 저해 단백질의 파괴(예를 들어, ΔminC 또는 ΔminD) 또는 Z-링 저해 단백질 및 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 파괴(예를 들어, ΔminCDE)에 의해 생성된다. 본 실시예는 격막 기구 성분 FtsZ의 과발현 또는 min 오페론의 파괴를 통해 ADAS-생성 균주를 생성하는 유전학적 수단을 상세히 설명한다.
A.min 돌연변이를 통한 ADAS의 생성
min 오페론을 파괴하기 위하여, 람다-RED 재조합 방법을 문헌[Datsenko and Wanner, PNAS, 97(12): 6640-6645, 2000]에 나타낸 프로토콜에 따라 조정하였다. 람다-RED 시스템을 위한 플라스미드를 조작하고 이를 함유하기 위한 균주를 예일 대학교(Yale University)의 콜라이 유전학적 스톡 센터(Coli Genetic Stock Center; CGSC)로부터 획득하였다. 요약하여, 대략 40개의 게놈 상동성의 염기쌍을 프라이머의 5' 말단 내에 인코딩함으로써, 에스케리키아 콜라이 minC(부모 박테리아 균주 MACH061 생성), minD(부모 박테리아 균주 MACH062 생성) 또는 전체 minCDE 오페론(부모 박테리아 균주 MACH060 생성)의 코딩 서열을 무극성으로 결실시키도록 프라이머를 설계하였다. 이들 프라이머의 3' 말단은 표적 돌연변이를 받는 부모 박테리아 균주를 선택하기 위해 사용되는 항생제 마커를 제공하는 람다-RED 시스템의 플라스미드 pKD3 및 pKD4에 상동성이다. 결실을 위해 사용되는 프라이머 서열은 표 1에 제공되어 있다. DNA 주형으로서 pKD3과 함께 프라이머를 사용하여 표준 PCR을 수행한 후에, 문헌[Datsenko and Wanner, PNAS, 97(12): 6640-6645, 2000]의 방법에 따라, 정제된 앰플리콘을 pKD46, 즉, 파지-유래된 람다-RED 상동성 재조합 시스템을 함유하는 플라스미드를 사용하여 제조된 박테리아 내에 전기천공법을 통해 형질전환시켰다. 형질전환체를 35 μg/mL 클로람페니콜을 갖는 LB 아가 상에서 선택하였다. 표준 대립형질-특이적 PCR을 사용하여 이들 생성된 콜로니가 유전학적 파괴(즉, ΔminC, ΔminD 또는 ΔminCDE)를 갖는 것을 확인하였다. 균주 유전형은 표 2에 제공되어 있다.
[표 1] 프라이머
Figure pct00004
[표 2] 균주
Figure pct00005
B.ftsZ의 과발현에 의한 ADAS 생산
격막 기구의 과발현으로부터 ADAS를 생성하기 위하여, 본 발명자들은 야생형 에스케리키아 콜라이로부터 FtsZ Z-링 단백질의 발현을 유도하는 플라스미드를 구축하였다. 요약하여, 강력한 리보솜 결합 부위 및 에스케리키아 콜라이 FtsZ 단백질에 대한 코딩 서열을 드 노보 디엔에이(De Novo DNA)로부터의 컴퓨터 툴을 사용하여 신규로 최적화시켰다. 이 번역 유닛을 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈(Integrated DNA Technologies; IDTTM)로부터 드 노보 DNA 합성을 위해 주문하였으며, 표준 클로닝 기법을 사용하여 백본 내에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드, pFtsZ(표 3)는 TetR 억제인자, TetR 단백질에 의해 억제되는 TetA 프로모터, 카나마이신 내성 마커 및 pMB1 복제 원점을 특징으로 한다. 양립 가능한 박테리아 내에 형질전환되는 경우, pFtsz는 배양물에의 안하이드로테트라사이클린의 첨가를 통해 FtsZ 단백질을 과발현하도록 유도될 수 있다. 이어서, 이 단백질은 자발적 원섬유(protofilament)를 형성할 수 있으며, 이는 부모 박테리아 세포의 비대칭적인 분열과 그에 의한 ADAS 생성을 야기한다.
[표 3] 플라스미드
Figure pct00006
실시예 2: ADAS 정제
본 실시예에는 ADAS-생성 박테리아 부모 균주의 배양물로부터 ADAS의 집단을 정제하는 방법이 기재된다. 이 방법을 사용하여, 실시예 1 또는 표 3의 균주를 포함하는 본원에 기재된 ADAS-생성 균주 중 임의의 것을 정제할 수 있다. 정제는 ADAS를 더 크고, 게놈을 함유하는 생존 가능한 부모 박테리아 세포로부터 분리한다. ADAS를 하기의 조합을 통하여 ADAS-생성 균주의 고 세포 밀도 배양물로부터 정제하였다: 1) 저속 원심분리, 2) 선택적 성장 및 3) 완충제 교환/농축. 저속 원심분리 절차를 사용하여, 혼합된 현탁액 중에 ADAS를 농축시키면서, 생존 가능한 부모 박테리아 세포 및 큰 세포 데브리스를 선택적으로 고갈시켰다. 선택적 성장 절차를 사용하여, 직접적으로 항미생물성(즉, 미생물 게놈을 갖는 세포에 대하여 독성)인 화합물 및/또는 저속 원심분리를 통한 생존 가능한 세포 침강을 향상시키는 화합물의 부가를 통해 시료에 존재하는 생존 가능한 부모 박테리아 세포의 수를 감소시켰다. 완충제 교환/농축 절차를 사용하여, 배양물 첨가제 및 세포 데브리스를 제거하면서, 더 큰 부피의 박테리아 배양 배지로부터 더 작은 부피의 1x PBS 내에 ADAS를 이동시켰다.
A.ADAS 정제
ADAS-생성 균주를 실시예 1에 기재된 분자 클로닝 절차를 사용하여 생성한 다음, 배양 배지에서 높은 세포 밀도로 배양하였다. 배양물을 예를 들어, 1 mL에서 1000 mL 또는 그 이상의 배양 배지까지 규모 확대시킬 수 있다.
배양물을 원심분리용 튜브로 옮기고, ADAS를 상청액 중에 유지하면서, 온전한 세포 및 큰 세포 데브리스를 펠렛화시키려는 목적으로, 저속 원심분리 절차로 처리하였다. 저속 원심분리 절차를 4℃ 또는 실온에서 수행하였다. 일부 경우에, 저속 원심분리 절차는 알레그라(Allegra)® X14R 벤치탑(benchtop) 원심분리기(베크만 쿨터(Beckman Coulter)) 또는 에펜도르프(Eppendorf)TM 5424 R 벤치탑 원심분리기(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)) 상에서 수행되는 1,000xg, 2,000xg, 3,000xg 및 4,000xg에서의 순차적인 10-분 회전의 순서였다. 일부 경우에, 저속 원심분리 절차는 4℃에서 20분 동안의 순차적 2,000xg 회전으로 이루어졌으며, 여기서, 제1 회전의 상청액을 제2 회전 이전에 멸균 원심분리용 병 내로 경사분리하였다. 일부 경우에, 저속 원심분리 절차는 소르발(Sorvall)TM Lynx 6000 슈퍼스피드(Superspeed) 원심분리기(써모 사이언티픽TM)에서 4,000xg에서의 단일의 40-분 회전이었으며, 로터 가속 속도는 가능한 가장 낮은 설정으로 설정하였다.
저속 원심분리 후에, 배양물 상청액을 멸균 배양 튜브 내에 경사분리하고, 선택적 성장 과정으로 처리하였다. 일부 경우에, 농축된 항생제 용액(예를 들어, 세프트리악손(ceftriaxone), 카나마이신(kanamycin), 카베니실린(carbenicillin), 젠타마이신(gentamicin) 및/또는 시프로플록사신(ciprofloxacin)) 또는 다른 농축된 화학 용액(예를 들어, 염화나트륨, 수산화나트륨, M 염산, 글루코스, 카사미노산 및/또는 D-아미노산)을 배양물 상청액에 바로 첨가하였다. 다른 경우에, 배양물 상청액을 10,000xg 내지 20,000xg에서 5 내지 60분 동안의 고속 원심분리를 통해 펠렛화시키고, 펠렛을 생존 가능한 세포에 저해성인 농도의 항생제 또는 다른 화학 용액을 함유하는 신선한 배양 배지 중에 재현탁화시켰다. ADAS를 4℃ 내지 42℃에서 1 내지 3시간 동안 250 rpm에서의 진탕과 함께 인큐베이션시킴으로써 선택적 성장을 수행하였다. 이어서, ADAS를 멸균 원심분리용 튜브에 옮기고, 4℃, 4,000xg에서 15분 동안 추가의 회차의 저속 원심분리로 처리하였다.
선택적 성장 및 저속 원심분리 후에, 상청액을 완충제 교환/농축 절차로 처리하였다. 일부 경우에, 상청액을 0.2 μm 비대칭 폴리에테르술폰(aPES) 멤브레인 필터(써모 피셔) 상에서 통과시키고, 이어서 1 내지 9 부피의 1x PBS를 통과시킴으로써 이를 수행하였다. 다른 경우에, ADAS를 10,000xg 내지 20,000xg에서 5 내지 60분 동안의 원심분리를 통해 펠렛화시키고, 1 내지 9 부피의 1x PBS 중에 세척하고, 다시 펠렛화시키고, 1x PBS 중에 출발 배양물 부피로부터 1 내지 100,000x 농도로 재현탁화시켰다.
B.영양요구성 ADAS-생성 부모 균주로부터의 ADAS 정제
영양요구성인, 즉, 성장에 필요한 유기 화합물을 합성할 수 없는 ADAS-생성 부모 균주는 ADAS의 제조에 유용하다. 이러한 균주는 유기 화합물이 제공되는 경우에만 성장할 수 있다. 이에 따라, ADAS 제제를 유기 화합물이 결여된 배지 중에 보관하거나 인큐베이션시킴으로써 영양요구성 부모 균주가 선택될 수 있으며, 이에 따라, ADAS 제제 내의 부모 버든(burden)을 감소시키기 위한 추가의 방법을 제공한다.
영양요구성 에스케리키아 콜라이 부모 박테리아의 제조
하나의 영양요구성 ADAS-생성 부모 균주를 획득하였으며, 제2 균주를 생성하였다. MACH002(표 2)를 예일 대학교 콜라이 유전학적 스톡 센터(CGSC)로부터 획득하였다(균주 CGSC14165). MACH002는 ADAS를 생성하는 minB 파괴를 갖는 히스티딘(his-53) 및 메티오닌(metB65) 이중-영양요구성 균주이다. 제2 영양요구성 ADAS-생성 부모 균주를 구축하기 위하여, 실시예 1 및 표 3에 기재된 pFtsZ 플라스미드를 류신 영양요구성(leu-) Top10 에스케리키아 콜라이 균주 내에 형질전환시키고, 카나마이신 50 μg/mL를 사용하여 선택하여, MACH151을 생성하였다(전체 유전형에 대하여 표 2 참조). 안하이드로테트라사이클린을 배양 상청액에 첨가하는 경우, TetA 프로모터의 TetR-억제가 완화되며, FtsZ 단백질이 발현되며, 부모 박테리아는 ADAS를 생성한다(실시예 1). 에스케리키아 콜라이 ADAS를 실시예 2의 방법에 따라, 그러나 MACH002에 대해서는 히스티딘 및 메티오닌을 배지에 포함시키거나, MACH151에 대해서는 류신 및 안하이드로테트라사이클린을 배지에 포함시켜 생성하였다. ADAS를 실시예 2의 방법을 사용하여 정제한 다음, MACH002에 대해서는 히스티딘-부재 및 메티오닌-부재 배지 중에 또는 MACH151에 대해서는 류신-부재 배지 중에 보관하였다.
영양요구성 부모 균주 유래의 ADAS는 증가된 순도를 갖는다
ADAS를 영양요구성 및 비-영양요구성 부모 균주로부터 생성하였다. MACH060(비-영양요구성) 및 MACH002(히스티딘 메티오닌 영양요구성) ADAS를 실시예 2에 약술된 과정에 의해 제조하고 정제하였다. MACH178(비-영양요구성 FtsZ 과발현주) 및 MACH151(류신 영양요구성 FtsZ-과발현주) ADAS를 성장 프로토콜에 대한 약간의 변형과 함께 실시예 2에 약술된 과정에 의해 제조하고 정제하였다: 안하이드로테트라사이클린을 성장 동안 50 ng/mL의 최종 농도로 배양물에 첨가하여, FtsZ 발현으로 인한 ADAS 생성을 유도하였다. ADAS 제제의 순도를 측정하기 위하여, 1 mL의 상청액 시료를 실시예 2의 정제 과정의 초기 4000 xg 순차적 원심분리 단계 후에 수집하였다. 이들 시료는 ADAS, 및 순차적 원심분리에 의해 제거되지 않은 임의의 부모 박테리아 세포 둘 모두를 함유하였다. 그 다음, 100 μl 분취액을 비-허용 배지(M9 + 0.2% 글루코스) 상에 플레이팅하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 다음날, 플레이트당 CFU의 수를 계수함으로써 부모 버든을 열거하였다(도 8a 및 도 8b). 야생형 MACH060 및 MACH178로부터 생성되는 ADAS 제제가 상당한 부모 버든을 갖는 한편, MACH002 및 MACH151 영양요구체 둘 모두로부터의 ADAS 제제는 검출 가능하지 않은 수준의 부모 박테리아를 나타내었다. 따라서, 2가지 상이한 방법에 의해 생성되는 영양요구성 ADAS 제제는 각각 비-영양요구성 ADAS로부터의 ADAS 제제보다 더 높은 순도를 갖는다. 일부 비-배타적인 구현예에서, MACH002는 MACH060보다 적어도 106개 더 적은 부모 버든을 보이며; MACH151은 MACH178보다 적어도 104개 더 적은 부모 버든을 보인다.
실시예 3: ADAS의 특성화
본 실시예에는 전자 현미경법, 광 현미경법 및 면역형광, 나노입자 특성화, 생존 가능한 세포 플레이팅, 면역블롯팅 및 유세포측정법을 포함하는 다양한 접근법을 사용한, 정제된 ADAS의 집단 및/또는 비정제된 ADAS-생성 박테리아 배양물의 특성화 방법이 기재된다.
주사 전자 현미경법(SEM)
SEM을 사용하여, 격막형성 과정을 가시화시키고, 다양한 관심 박테리아 균주 내의 ADAS 집단의 존재를 확인하였다. SEM 시료를 제조하기 위하여, 유리 커버슬립을 24 웰 플레이트 내에 배치하고, 0.01% 폴리-라이신을 사용하여 코팅하고, 건조시켰다. 그 다음, 관심 균주를 실시예 1에 기재된 분자 클로닝 절차를 사용하여 생성하고, 높은 세포 밀도로 배양하고, 일부 경우에, 실시예 2에 기재된 ADAS 정제 절차로 처리하였다. 관심 균주 또는 정제된 ADAS를 PBS 중에 현탁화시키고, 폴리-라이신 코팅된 유리 커버슬립이 있는 24 웰 플레이트에 옮기고, 실온에서 30분 동안 침강되게 하였다. 용액을 조심스럽게 흡인시키고, SEM 고정액(0.1M 코카딜산나트륨(sod cac) 완충제 중 포름알데히드-글루타르알데히드 2.5%)으로 대체하였다. 다음날, 고정액을 제거하고, 시료를 물을 사용하여 세척하고, 커버슬립을 24 웰 플레이트로부터 제거하고, 임계점 건조를 사용하여 건조시켰다. 건조 후에, 커버슬립을 히타치(Hitachi) SEM 마운트(mount) 상의 카본 테이프 상에 마운팅하고, 10 nm의 백금막을 사용하여 스퍼터 코팅하고, 히타치 S-4700 전계 방사형 주사 전자 현미경(FE-SEM)을 사용하여 영상화시켰다. 도 1a는 MACH009(야생형 에스케리키아 콜라이), MACH060(ADAS 생성을 가능하게 하도록 minCDE 결실을 갖는 에스케리키아 콜라이), 및 MACH060 유래의 정제된 ADAS(표 2 참조)의 대표적인 이미지를 보여준다. MACH009 야생형 에스케리키아 콜라이 균주는 에스케리키아 콜라이의 정상 표현형을 나타내며, 모든 딸 세포는 동일한 크기이다(도 1a, 좌측 패널). 비정제된 MACH060 균주는 더 작고 구형인 ADAS 입자의 크기 및 존재의 증진된 다분산성을 갖는 집단을 보인다(도 1a, 가운데 패널). 정제된 MACH060은 ADAS 집단만을 보인다(도 1a, 우측 패널). 상기 기재된 바와 같은 SEM을 사용하여, 상이한 ADAS-생성 기법(각각 ftsZ의 과발현 및 minCDE의 결실)을 사용하여 비브리오 및 살모넬라 속의 박테리아 종으로부터 생성되는 ADAS는 또한 비정제된 집단에서도 가시화될 수 있다(데이터 미도시). 추가로, 비정제된 이미지에서, 비정상적인 격막형성 사건이 현저하며; 비정상적인 격막형성은 ADAS 생성 이전의 사건이다.
광 현미경법 및 면역형광
MACH060 에스케리키아 콜라이 균주를 실시예 1에 기재된 분자 클로닝 절차를 사용하여 생성한 다음, 높은 세포 밀도로 하룻밤 배양하였다. 개별적으로, ibidi®로부터의 유리 커버슬립 바닥 35 mm 접시를 0.01% 폴리-라이신 용액을 사용하여 5분 동안 코팅하고; 용액을 흡인시키고, 접시가 건조되게 하였다. MACH060의 고밀도 현탁액을 1 μL 액적으로 커버슬립 바닥 상에 배치하고, 거의 건조되게 하였다. 그 다음, 1 mL의 2.8% 파라포름알데히드 / 0.04% 글루타르알데히드 고정액을 30분 동안 첨가하였다. 시료를 PBS 중에 3회 세척하고, 0.1% 트리톤(Triton)TM X-100(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))을 사용하여 투과화시키고, PBS를 사용하여 2회 세척하고, 10 μg/mL의 라이소자임을 사용하여 추가로 투과화시키고, PBS를 사용하여 2회 세척하고, 1% 당나귀 혈청을 사용하여 블로킹하고, PBS를 사용하여 2회 세척하고, 일차 항체(항-에스케리키아 콜라이 LPS)를 사용하여 염색하고, 세척하고, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 555(써모 피셔)에 결합된 이차 항체를 사용하여 염색하였다. 접시를 DAPI를 사용하여 10분 동안 대조-염색하고, PBS를 사용하여 3회 세척하였다. 최종 접시를 올림푸스(Olympus) IX83 도립 현미경(올림푸스) 상의 100X 오일-침지(oil-dipping) 대물 렌즈를 사용하여 영상화하였다. 이미지를 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어 패키지 피지(Fiji)를 사용하여 렌더링하였다. 도 1b는 100배에서 위상 현미경법(좌측 패널) 및 형광(가운데 및 우측 패널)의 대표 이미지를 보여주며, 이는 부모 집단 내에, LPS 막 염색을 갖지만, 게놈이 결여된(DAPI 양성 염색 부재) ADAS가 존재하는 것을 보여준다.
나노입자 특성화
에스케리키아 콜라이 BW25113의 ADAS-생성 균주인, MACH124를 실시예 1에 기재된 분자 클로닝 절차를 사용하여 생성한 다음, 1 L의 배양 배지 중에 높은 세포 밀도로 배양하고, 실시예 2에 기재된 ADAS 정제 절차로 처리하였다. 정제된 ADAS의 집단을 1x PBS 중에 현탁화시키고, mL당 107 내지 109개의 입자의 농도로 희석하고, 트윈(TWEEN)® 20(시그마 알드리치)을 0.1%(v/v)의 최종 농도로 첨가하여 입자 응집을 최소화시켰다. 이 ADAS의 현탁액을 20배 희석하고, TS2000 카트리지(테크놀로지(Technology)® 서플라이즈 리미티드(Supplies Ltd.)) 상에 로딩하고, 스펙트라다인® nCS1TM 나노입자 분석기 상에서 분석하였다. nCS1TM은 정의된 크기의 협착부에 바이어스 전압을 인가하고, 시간의 함수로서 전기의 저항의 변화를 모니터링함으로써, 현탁액 중 개별 입자의 크기 및 농도 둘 모두를 측정한다(문헌[Fraikin et al., Nature Nanotechnology, 6(5): 308-313, 2011]). 200 내지 2,000 nm의 범위 내의 24,392개의 입자를 측정하였다. 다른 예에서, 측정되는 입자의 수는 10 내지 100,000개 입자이다. 생성된 데이터를 누적 크기 분포로서 플롯팅하였으며(도 1c), 이는 MACH124로부터 정제된 ADAS의 현탁액 중 200 내지 2,000 nm 직경의 입자의 농도를 드러낸다. MACH124로부터 정제된 가장 높은 농도의 ADAS는 400 내지 800 nm의 크기 범위 내에 있다. 추가로, 데이터를 통합 범위 리포트(integration range report)로서 내보내었으며, 이는 정제된 ADAS의 현탁액 중 200 내지 2,000 nm 입자의 총 부피를 열거한다(도 1d). 집합적으로, 이들 데이터는 정제된 ADAS의 농도 및 크기 분포가 나노입자 특성화 방법을 통해 정량화될 수 있는 것을 보여준다. 추가로, 정제된 ADAS의 집단 내에서 관찰되는 소분자(예를 들어, ATP - 실시예 4 및 5), 핵산 또는 단백질(예를 들어, GFP - 실시예 4 및 5)의 정량화를 검정에 존재하는 ADAS의 총 부피 또는 입자의 수로 나누어, 정제된 ADAS의 집단 내의 관심 소분자, 핵산 또는 단백질의 평균 농도의 계산을 가능하게 할 수 있다.
A.생존 가능한 세포 플레이팅
정제 이전 및 이후에 존재하는 생존 가능한 부모 박테리아 세포의 농도를 결정하기 위하여, 실시예 3C에 기재된 ADAS-생성 배양물 및 정제된 ADAS 집단을 생존 가능한 세포 플레이팅을 통해 검정하였다. 100 μL의 ADAS-생성 배양물 또는 정제된 ADAS의 집단을 900 μL의 1x PBS 내에 반복 전달함으로써 연속 희석액을 제조하였다. 그 다음, 각각의 희석액 10 μL를 선택 배지 상에 스폿팅하고, 37℃에서 인큐베이션시켜, 생존 가능한 세포의 성장을 가능하게 하였다. 24시간 후에, 1 내지 100개의 콜로니를 함유하는 희석액을 계수하였으며, 이 콜로니 계수를 적절한 희석 인자와 곱하여, 시료 mL당 콜로니 형성 유닛(CFU)의 수(즉, 각각의 시료에 존재하는 생존 가능한 세포의 농도)를 열거하였다(도 1e). MACH124 배양물은 높은 밀도의 에스케리키아 콜라이의 배양물과 일치하게, 108 CFU/mL 초과를 가졌지만; 정제된 ADAS의 집단에 존재하는 생존 가능한 세포의 수는 이 검정을 위한 검출 한계인 100 CFU/mL 미만이었다. 따라서, 시료에 존재하는 생존 가능한 세포의 농도를 생존 가능한 세포 플레이팅을 통해 열거할 수 있으며, 실시예 2에 기재된 ADAS 정제 절차는 정제된 ADAS에 존재하는 생존 가능한 세포의 수를 일부 구현예에서, 적어도 100 CFU/mL 미만으로 감소시키기에 충분하다.
면역블롯팅
ADAS 단백질 조성을 측정하는 능력을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 부모 에스케리키아 콜라이 박테리아 세포에 존재하는 것으로 알려져 있는 2개의 하우스키핑 단백질인, DnaK 및 GroEL의 ADAS 내에서의 존재를 특성화하였다. 에스케리키아 콜라이 BW25113(MACH060) 및 MG1655(MACH200)의 ADAS-생성 균주를 실시예 1에 기재된 분자 클로닝 절차를 사용하여 생성한 다음, 100 mL의 배양 배지 중에 높은 세포 밀도로 배양하고, 실시예 2에 기재된 ADAS 정제 절차로 처리하였다. 병행하여, ADAS-생성 배양물의 분취액 5 mL를 20,000xg에서 펠렛화시키고, 5 mL의 1x PBS 중에 재현탁화시킨 다음, 1x PBS 중에 100배 희석하였다. 4x NuPAGETM LDS 시료 완충제(써모 피셔)를 희석된 배양물의 분취액 100 μL 및 정제된 ADAS에 첨가하여, 시료를 용해시켰다. 다양한 용해물을 85℃에서 2분 동안 인큐베이션시킨 다음, 40 μL의 각각의 시료를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하였다. 10 ng의 정제된 재조합 에스케리키아 콜라이 GroEL 단백질(아브캄(Abcam), ab51307) 또는 재조합 DnaK 단백질(아브캄, ab51121)을 포함하는 양성 대조군을 또한, 85℃에서 2분 동안 1x LDS 시료 완충제 중에서 변성시키고, 겔 상에서 분리하였다. 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인에 전달하고, 이를 인터셉트(Intercept)®(PBS) 블로킹 완충제(LI-COR®) 중에 실온에서 1시간 동안 블록킹하고, GroEL(아브캄, ab90522) 또는 DnaK(아브캄, ab69617)를 표적화하는 항체의 1:1,000 희석액과 실온에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 그 다음, 블롯을 과잉 부피의 PBS + 0.05% 트윈® 20 중에 세척하고, 형광 염료에 컨쥬게이트된 항-마우스(LI-COR®, 926-68070) 및 항-토끼(LI-COR®, 926-32211) 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 과잉 부피의 PBS + 0.05% 트윈® 20 중에 다시 세척하고, 인비트로겐(Invitrogen)TM 아이브라이트(iBright)TM 영상화기(써모 피셔) 상에 영상화시켰다. GroEL 및 DnaK에 상응하는 특정 밴드가 ADAS-생성 배양물 유래의 용해물을 함유하는 레인(lane) 및 정제된 ADAS 유래의 용해물을 함유하는 레인에 존재하였으며(도 1f); 이에 따라, ADAS의 단백질 함량은 면역블롯팅을 통해 검출될 수 있다.
실시예 4: ADAS 활성 측정
본 발명자들은 세포 작업을 수행하는 ADAS의 능력 및 이 작업을 측정하는 본 발명자들의 능력을 시험하였다. 본 발명자들은 ADAS 내의 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 수준을 시험함으로써, 그리고 표적 단백질을 전사하고 번역하는 ADAS의 능력을 평가함으로써, 작업 능력을 측정하였다. 작업을 수행하는 세포의 능력은 그의 ATP의 수준과 직접 관련된다. ATP는 원핵 및 진핵 유기체의 주요 에너지 운반체이며, 이는 그의 3개의 인산염 기 사이의 결합 내에 화학 에너지를 운반하며, 화학 에너지는 결합이 파괴되는 경우에 방출된다. ATP는 전사, 번역, 수송 및 대사와 같은 필수적인 세포 과정에 필요하다.
A.ATP 측정
MACH060(BW25113 ΔminCDE; 표 2) 부모 박테리아로부터 유래된 ADAS를 농축된 배양물 상청액으로부터 선택적 성장을 사용하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제하였다. 정제된 ADAS를 실시예 3에 기재된 바와 같이 나노입자 특성화 및 생존 가능한 세포 플레이팅 절차로 처리하였다. 정제된 ADAS 제제 내의 ADAS의 농도는 5x108개 ADAS/mL였으며, 존재하는 입자의 총 부피는 3.2x1016 nm3/mL였다. CFU 플레이팅에 의해, 정제된 ADAS의 집단 내에 존재하는 생존 가능한 세포(예를 들어, 부모 세포)의 농도가 검출 한계(100 CFU/mL)이거나, 그 미만이었음이 드러났다.
정제된 ADAS의 집단에 존재하는 ATP 농도를 제조처의 설명에 따라 BacTiter-GloTM 미생물 세포 생존력 검정(프로메가)을 사용하여 3벌로 측정하였다. 요약하여, 100 μL의 재수화된 검정 완충제를 100 μL의 정제된 ADAS 또는 분자 표준물질로서 제공되는 정의된 질량의 ATP를 함유하는 웰에 첨가하였다. 각각의 웰로부터의 발광 신호를 플레이트 판독기 상에 기록하였다. 정의된 ATP의 질량에 대한 로그-변환된 발광 신호를 로그-변환된 ATP의 질량에 대하여 플롯팅하였으며, 라인을 이들 데이터에 핏팅시켜, 표준 곡선을 생성하였다. 이후에, 정제된 ADAS를 함유하는 웰에서 관찰되는 발광 신호를 이 표준 곡선에 핏팅시켜, 웰에 존재하는 ATP의 질량을 계산하였다(도 2a). 생존 가능한 세포 오염물질에 의해 생성되는 ATP 수준은 검정에 대한 검출 한계 미만이었으며, 백그라운드로서 총 ADAS로부터 제하였다. 정제된 ADAS의 각각의 웰 내에 존재하는 ATP의 질량을 웰 내에 존재하는 ADAS의 총 입자 부피로 나누었으며: 이 비는 100 CFU/mL 미만까지 정제된 ADAS 의 집단 내에 존재하는 ATP의 농도를 나타낸다.
B.ATP 생성
게놈의 부재 하에 ATP를 생성하는 ADAS의 능력을 결정하기 위하여, 정제된 ADAS로부터의 ATP 농도를 시간이 지남에 따라 측정하였다. MACH124(BW25113 ΔminCDE; 표 2)로부터 유래된 ADAS를 농축된 배양물 상청액으로부터의 선택적 성장을 사용하여 실시예 2에 나타낸 바와 같이 정제하였다. 정제된 ADAS를 50 μg/mL의 항생제 카베니실린과 함께 영양소-풍부 배지(10% 루리아 브로쓰(Luria Broth))를 사용하여 보충하였다. ADAS를 2개의 분취액으로 분할하고, 병행하여 시험하였으며; 하나의 분취액을 바로 4℃에서 보관하고, 다른 분취액을 에펜도르프 써모믹서(ThermoMixer)®에서 37℃, 800 rpm에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 2시간 인큐베이션 후에, 두 분취액 모두의 ATP 농도를 상기 기재된 바와 같이 측정하였다. 2시간 동안의 인큐베이션은 ATP의 양의 54.9% 증가를 초래하였으며, 이는 ADAS가 게놈의 부재 하에 ATP를 생성할 수 있음을 나타낸다(도 2b).
C.표적 단백질: GFP의 전사 및 번역
표적 유전자를 전사하고 번역하는 ADAS의 능력을 측정하기 위하여, MACH060(BW25113 ΔminCDE(표 2))을 녹색 형광 단백질(GFP)을 인코딩하는 플라스미드인 pGFP를 사용하여 형질전환시켰다. 이 서열을 에스케리키아 콜라이에서의 발현을 위하여 코돈-최적화시키고, TetA 프로모터, TetR 억제인자(TetA 프로모터 억제), pMB1 복제 원점 및 항생제 선택을 위한 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 플라스미드 내에 클로닝하였다. 그 다음, ADAS를 이 균주(MACH124)로부터 유래하였으며, 농축된 배양물 상청액으로부터 선택적 성장을 사용하여, 실시예 2에 나타낸 바와 같이 정제하였다. 부모 버든은 CFU 플레이팅에 의한 검출 한계(100 CFU/mL 미만)에 있는 것으로 결정되었다. ADAS 내의 단백질 발현을 시험하기 위하여, 2가지 방법을 사용하였다: (1) 플레이트 판독기를 사용한 시간이 지남에 따른 GFP 형광 측정; 및 (2) 면역블롯팅.
(1) 플레이트 판독기 방법
정제된 ADAS 또는 부모 박테리아를 최소 성장 배지(0.2% 카사미노산, 0.2% 글루코스 및 100 ug/mL의 세프트리악손을 갖는 최소 염(M9) 배지) 중에 인큐베이션시켰다. 정제된 ADAS 시료에 항생제를 보충하여, 임의의 게놈-함유 부모 박테리아의 성장을 방지하였다. 추가로, 유도된 시료에 있어서, 유도제인, 안하이드로테트라사이클린을 100 ng/mL의 최종 농도까지 배지에 첨가하였다. 안하이드로테트라사이클린의 첨가 시에, TetA 프로모터의 TetR 억제가 완화되었으며, GFP 단백질이 발현되었다. 각각 방출 및 여기에 대하여 479 nm 및 520 nm의 파장을 사용하여 GFP 신호 검출을 측정하였다. 도 2c 내지 도 2e는 12시간에 걸친, MACH124 ADAS에서 GFP 형광에 의해 측정되는 바와 같은, GFP의 전사 및 번역의 유도제-의존적 증가를 보여준다. 유도제의 부재(비유도) 하에, GFP 신호의 증가가 존재하지 않았다. 이 관찰은 ΔminCDE ADAS가 유도제-의존적 방식으로 표적 유전자를 전사하고 번역할 수 있는 것을 보여준다. 추가로, 도 2c는 100 CFU/mL의 부모 박테리아로부터의 GFP 신호가 ADAS의 것보다 유의미하게 더 낮으며, 시간이 지남에 따라 증가하지 않았기 때문에, 정제된 ADAS에 의해 생성되는 GFP 신호가 부모 오염으로 인한 것이 아닌 것을 보여준다.
(2) 면역블롯팅 방법
MACH124 정제된 ADAS 및 100 μg/mL의 카베니실린 및 안하이드로테트라사이클린(1000 ng/mL) 유도제가 보충된 동일한 부피의 루리아 브로쓰를 멸균 원심분리용 튜브 내에 분취하였다. 시료를 에펜도르프 써모믹서®에서 37℃, 800 rpm에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 24시간 후에, ADAS를 4℃에서 10분 동안 20,000xg에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛화된 ADAS를 용해 완충제(1x NuPAGETM LDS 시료 완충제(써모 피셔)와 함께 1x 버그버스터(BugBuster)TM 단백질 추출 시약(밀리포어시그마(MilliporeSigma)TM)) 중에 재현탁화시키고, 85℃에서 2분 동안 가열하였다. 그 다음, 동일한 부피의 용해된 ADAS를 4 내지 12% BisTris 폴리아크릴아미드 겔 내에 로딩하였다. 겔 상의 단백질을 분리하고, 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전달하고, 인터셉트®(PBS) 블로킹 완충제(LI-COR®) 중에 실온에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 멤브레인을 일차 항체(1:500 희석에서 마우스 항-GroEL(아브캄, ab90522) 및 1:500 희석에서 토끼 항-GFP(아브캄, ab6556))와 함께 실온에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 항체를 0.2% 트윈® 20이 보충된 인터셉트® PBS 블로킹 완충제 중에 재현탁화시켰다. 이후에, 멤브레인을 1x PBS + 0.05% 트윈® 20 중에 3회 세척한 후에, 관련 이차 항체(둘 모두 1:5,000 희석에서 염소 항-마우스 800(Abcam, ab216772) 및 염소 항-토끼 680(Abcam, ab175773))가 보충된 인터셉트® PBS 블로킹 완충제와 0.2% 트윈® 20 중에서의 인큐베이션을 행하였다. 멤브레인을 1x PBS + 0.05% 트윈® 20 중에 3회 세척하고, 인비트로겐TM 아이브라이트TM 영상화기(써모 피셔) 상에서 영상화하였다. 밴드 세기를 덴시토메트리(densitometry)를 통해 정량화하고, GFP 세기를 로딩 대조군인, GroEL에 대하여 정규화시켜 표현하였다. 도 2f는 유도된 ADAS에서 검출되는 GFP 단백질의 양의 시간-의존적 증가를 보여준다.
실시예 5: ΔminCDE 부모로부터 생성되는 ADAS는 고활성이다
돌연변이 ΔminC, ΔminD 또는 ΔminCDE를 포함하는 부모 세포로부터 정제된 ADAS를 플레이트 판독기 및 면역블롯팅을 통해 검정하여, GFP 리포터 유전자를 전사하고 번역하는 그들의 능력을 비교하였다. 예상치 않게, ΔminCDE 부모 세포로부터 유래된 ADAS는 ΔminC 또는 ΔminD 부모 박테리아 세포로부터 유래된 ADAS보다 더 큰 활성을 갖는 것으로 관찰되었다.
A.ΔminCDE, ΔminC 또는 ΔminD 배양물로부터 ADAS의 정제
ADAS-생성 균주 MACH124(BW25113 ΔminCDE + pGFP), MACH556(BW25113 ΔminC + pGFP) 및 MACH557(BW25113 ΔminD + pGFP)(표 2 참조)을 1 L의 배양 배지 중에 높은 세포 밀도로 배양하고, 실시예 2에 기재된 ADAS 정제 절차로 처리하였다. 이들 균주 3개 모두가 보유하는 pGFP 플라스미드는 표 3에 추가로 상세히 기재되어 있다. 정제된 ADAS를 실시예 3에 기재된 나노입자 특성화 및 생존 가능한 세포 플레이팅 절차로 처리하였다. ADAS의 농도는 하기와 같았다: MACH124 = 2.4x109개 ADAS/mL, MACH556 = 1.86x109개 ADAS/mL 및 MACH557 = 1.98x109개 ADAS/mL. 정제된 ADAS에 존재하는 생존 가능한 부모 박테리아 세포 버든은 CFU 플레이팅에 의한 검출 한계보다 더 낮은 것으로 관찰되었다(100 CFU/mL 미만).
B.플레이트 판독기를 통해 검정되는 GFP 발현 역학
GFP를 유도제-의존적 방식으로 발현하는 ADAS의 능력을 실시예 4C에 기재된 바와 같이 평가하였다. 도 3a 및 도 3b는 12시간에 걸쳐 지속되는 MACH124, MACH556 및 MACH557 ADAS에서의 GFP의 전사 및 번역의 유도제-의존적 증가를 보여준다. 유도제의 부재(비유도) 하에, ADAS는 GFP를 생성하지 않았다. 도 3a 및 도 3b의 데이터를 실시예 4C에 기재된 바와 같이 정규화하였다. 3가지 모두의 min 유전자좌 결실 균주로부터 유래된 ADAS가 유도 시에 GFP를 발현할 수 있었지만, MACH124(BW25113 ΔminCDE)로부터 유래된 ADAS가 시간이 지남에 따라 더 높은 GFP 신호를 생성하였다. 제12시간에, MACH124 ADAS GFP 신호는 MACH557 ADAS의 신호보다 약 119% 더 높았으며, MACH556 ADAS의 신호보다 약 186% 더 높았다. 이에 따라, ΔminCDE 부모로부터 생성되는 ADAS는 ΔminC 또는 ΔminD 부모로부터 생성되는 것들보다 유도시에 더 높은 수준의 GFP를 발현한다.
MACH124, MACH556 및 MACH557에 대하여 관찰되는 미가공 GFP 생성 곡선을 사용하여, 각각의 균주로부터 정제하고 유도제의 존재 하에 인큐베이션시킨 ADAS에 대한 총 단백질 생성 및 평균 단백질 생성 속도를 비교하였다. 회귀선을 각각의 데이터 세트에 핏팅시켰으며, 12시간에 걸친 총 GFP 생성을 반영하는 곡선 아래 면적을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 사용하여 계산하였다. MACH124 ADAS는 MACH556 또는 MACH557 ADAS보다 유의미하게 더 많은 GFP를 생성하였다(도 3d). 실험 과정에 걸쳐 평균 GFP 생성 속도를 평가하기 위하여, 각각의 곡선 아래 면적을 실험의 기간으로 나누었다. 12시간에 걸친 평균 GFP 생성 속도는 MACH556 또는 MACH557 ADAS보다 MACH124 ADAS에 대하여 유의미하게 더 컸다(도 3e). 마지막으로, MACH556 및 MACH 557 ADAS에 의해 생성되는 GFP의 총량을 100%로 정규화시킨 MACH124 ADAS에 의해 생성되는 GFP의 백분율로서 표현하였다. 이들 데이터는 (도 3f)에 플롯팅되어 있다. MACH124(ΔminCDE) ADAS는 MACH556(ΔminC) 및 MACH557(ΔminD) 중 어느 하나보다 더 많은 총량의 GFP를 생성하였다.
C.면역블롯팅을 통해 검정되는 GFP 발현
MACH124, MACH556 및 MACH557 ADAS를 37℃, 800 rpm에서 24시간 동안 에펜도르프 써모믹서®에서, 안하이드로테트라사이클린(1 μg/mL)의 존재 또는 부재 하에 그리고 50 μg/mL 카베니실린과 함께 50% LB 배양 배지 중에서 인큐베이션시켰다. 면역블롯팅을 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행한다. 24시간 후에, ADAS를 4℃에서 10분 동안 20,000xg에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛화된 ADAS를 용해 완충제(1x NuPAGETM LDS 시료 완충제(써모 피셔)와 함께 1x 버그버스터(BugBuster)TM 단백질 추출 시약(밀리포어시그마(MilliporeSigma)TM)) 중에 재현탁화시키고, 85℃에서 2분 동안 가열하였다. 그 다음, 동일한 부피의 용해된 ADAS를 4 내지 12% BisTris 폴리아크릴아미드 겔 내에 로딩하였다. 겔 상의 단백질을 분리하고, 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전달하고, 인터셉트® PBS 블로킹 완충제 중에 실온에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 멤브레인을 일차 항체(1:500 희석에서 마우스 항-GroEL 및 1:500 희석에서 토끼 항-GFP)와 함께 실온에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 항체를 0.2% 트윈® 20이 보충된 인터셉트® PBS 블로킹 완충제 중에 재현탁화시켰다. 이후에, 멤브레인을 1x PBS + 0.05% 트윈® 20 중에 3회 세척한 후에, 관련 이차 항체(둘 모두 1:5,000 희석에서 염소 항-마우스 800 및 염소 항-토끼 680)가 보충된 인터셉트 PBS 블로킹 완충제 + 트윈® 20 중에서의 인큐베이션을 행하였다. 멤브레인을 1x PBS + 0.05% 트윈® 20 중에 3회 세척하고, 인비트로겐TM 아이브라이트TM 영상화기(써모 피셔) 상에서 영상화하였다(도 3c). 밴드 세기를 덴시토메트리를 통해 정량화하고(도 3c, 가운데 패널), GFP 세기를 로딩 대조군인, GroEL에 대하여 정규화시켜 표현하였다(도 3c, 하측 패널). MACH124 ADAS는 MACH556 및 MACH557 ADAS에 비하여 증가된 GFP의 생성을 보였으며, 이는 MACH124(ΔminCDE)가 단백질 생성의 면에서 더 높은 활성을 보이는 것을 나타낸다.
실시예 6: 막 디스플레이된 단백질을 갖는 ADAS
본 실시예는 ADAS에 대한 모델 표적화 제제로서 나노바디의 막 디스플레이를 보여준다. 나노바디는 알려져 있는 가장 작은 기능적 항체 단편이며, 최근의 연구에 의해, 그들이 에스케리키아 콜라이 세포의 표면 상에서 발현될 수 있는 것이 나타났다(문헌[Salema and Fernandez, Microb Biotechnol, 10(6), 2017]). 표면 나노바디는 표적 단백질에 효율적으로 결합할 수 있으며, 이를 사용하여, 세포-특이적 결합 친화성을 향상시킬 수 있다. 본 실시예는 표적화 제제(이 경우에는 나노바디)가 ADAS의 표면 상에 발현될 수 있는 것을 보여준다.
A.HER2 표적화 나노바디를 함유하는 에스케리키아 콜라이 균주의 생성
HER2 수용체(유방암과 연관됨)를 표적화할 수 있는 ADAS를 구축하기 위하여, 플라스미드(pNeae-NB2)(표 3)를 EHEC O157:H7 균주 EDL933stx-의 인티민(intimin) 유전자에 융합된 나노바디 서열을 사용하여 합성하였다. 구체적으로, 인티민 유전자(Neae)의 N-말단 부분의 583개 아미노산을 E-태그(SEQ ID NO: 5), 글리신-글리신-세린 링커, NB2 나노바디 서열(SEQ ID NO: 6), 세린-글리신 링커 및 C-말단 FLAG-태그(SEQ ID NO: 7)에 융합시켰다. 이 서열을 에스케리키아 콜라이에서의 발현을 위하여 코돈-최적화시키고, TetA 프로모터, TetR 억제인자(이는 TetA 프로모터를 억제함), CloDF13 복제 원점 및 항생제 선택을 위한 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 플라스미드 내에 클로닝하여, pNeae-NB2를 생성하였다(표 3 참조). 안하이드로테트라사이클린을 배양물 상청액에 첨가하는 경우, TetA 프로모터의 TetR-억제가 완화되고, Neae-NB2 융합 단백질이 발현되었다. Neae-NB2 융합 단백질은 플라스미드를 보유하는 에스케리키아 콜라이 부모 박테리아 세포의 외막 내에 조립되며, NB2 나노바디는 외측으로 디스플레이된다. pNeae-NB2 플라스미드를 클로람페니콜 내성 카세트와 함께 minCDE 유전자좌의 결실을 보유하는 에스케리키아 콜라이 BW25113 균주 내에 형질전환시키고, 성장 배지 중 50 μg/mL 카나마이신 및 35 μg/mL 클로람페니콜의 첨가를 사용하여 선택하여, MACH284를 생성하였다(표 2 참조).
B.HER2 나노바디 발현을 갖는 ADAS의 생성
MACH060(미변형됨, 음성 대조군 ADAS) 및 그들의 표면 상에 표적화 항체를 갖는 MACH284 ADAS를 성장 배지에 대한 약간의 변형과 함께, 실시예 2에 약술된 과정에 의해 제조하고 정제하였다. 본원에서, 안하이드로테트라사이클린을 배양물에 성장 동안 50 ng/mL의 최종 농도로 첨가하여, ADAS가 부모로부터 생성됨에 따라, 그들이 플라스미드로부터 표적화 Neae-NB2 융합 단백질을 발현하게 하였다.
C.ADAS 표면 상의 HER2 나노바디의 디스플레이의 확인
ADAS의 표면 상의 Neae-NB2의 발현을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 면역형광 표지를 수행하였다. MACH060 및 MACH284 유래의 ADAS를 스펙트라다인® nCS1TM 나노입자 분석기를 사용한 분석에 의해 결정되는 바와 같이 PBS 중 약 5x108개 입자/mL의 농도로 희석하였다. Neae-NB2 융합물 내의 E-태그 특징부를 표적화하는 항체(아브캄, ab3397)를 1 mL의 시료 중 5 μg/mL의 최종 농도까지 시료에 첨가하였다. 이들 시료를 온건하게 혼합하고, 얼음 상에서 2.5시간 동안 인큐베이션되게 하였다. 인큐베이션 후에, ADAS를 4℃에서 10분 동안 15,000xg에서의 원심분리에 의해 수집하였다. 상청액을 폐기하고, 펠렛을 800 μL의 PBS + 0.05% v/v 트윈® 20 중에 온건하게 재현탁화시켰다. 이 세척을 2회 반복하고, 최종 펠렛을 0.5 mL의 PBS + 0.05% 트윈® 20 중에 재현탁화시켰다. DyLight® 550 형광단에 컨쥬게이트된 당나귀 항-토끼(아브캄, ab98489) 2.5 μL를 시료에 첨가하고, 온건하게 혼합하고, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 인큐베이션 후에, ADAS를 4℃에서 10분 동안 15,000xg에서의 원심분리에 의해 수집하였다. 상청액을 폐기하고, 펠렛을 500 μL의 PBS + 0.05% 트윈® 20 중에 재현탁화시켰다. 이 세척을 총 3회 반복하였으며, 최종 펠렛을 250 μL의 완충제 중에 재현탁화시켰다. 200 μL의 시료를 흑색-벽, 투명-바닥 96 웰 폴리프로필렌 플레이트 내에 옮겼다. 그 다음, 이 플레이트를 웰의 영역 스캔(area scan)을 사용하여 DyLight® 550 형광(여기: 487 nm, 발광: 528 nm) 및 600 nm에서의 광학 밀도에 대하여 판독하였다. 도 4는 광학 밀도에 대하여 정규화된 DyLight® 550 형광을 사용한 표지 실험의 결과를 보여준다. 야생형 MACH060 ADAS가 무시할 수 있는 형광을 보였지만, Neae-NB2 나노바디-디스플레이 MACH284 ADAS는 통계적으로 유의미한, 거의 10배의 형광의 증가를 보였다. 따라서, 표적화 나노바디는 효율적으로 발현되고, ADAS의 외막 상에 디스플레이되었다.
실시예 7: 카고 생성 및 ADAS에 의한 전달
본 실시예는 본 발명의 ADAS가 표적 세포 또는 유기체 상에 특이적인 효과를 갖는 카고를 생성하고 전달할 수 있는 것을 보여준다. 한 모델로서, 본 발명자들은 특정 사이클릭 디뉴클레오티드(CDN)를 생성하는 에스케리키아 콜라이 ADAS를 생성하였다. 특히, ADAS를 이종 효소의 발현을 통해, 포유동물 세포(문헌[Witte et al., Mol Cell, 30(2): 167-178, 2008])의 RECON(NF-κB 제어 환원효소)을 통하여 인터페론 유전자의 자극인자(STING) 경로에 관여하는 박테리아 뉴클레오티드 c-디-AMP를 생성하도록 유도하였다. 본 실시예는 추가로 ADAS가 카고의 생성을 촉매시키는 효소를 발현할 수 있는 것을 보여주며, 카고는 이어서 표적 세포에 전달될 수 있다.
A.STING 효능제 에스케리키아 콜라이 ADAS의 구축
STING 경로를 활성화시킬 수 있는 ADAS를 생성하기 위하여, 디아데닐레이트 사이클라제를 실시예 1에서 제조된 바와 같이, BW25113 에스케리키아 콜라이 ΔminCDE::CamR(MACH060) 균주에서 발현시켰다. 이렇게 행하기 위하여, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)(수탁 번호: Q8Y5E4)의 디아데닐레이트 사이클라제 A(DacA) 단백질의 아미노산 서열을 에스케리키아 콜라이에서의 발현을 위하여 코돈-최적화시키고, 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈에 의해 신규로 합성하고, TetA 프로모터(pTet), TetR 억제인자(이는 TetA 프로모터를 억제함), pMB1 복제 원점 및 항생제 선택을 위한 베타-락타마제 유전자를 함유하는 플라스미드 내에 클로닝하여, pSTING 플라스미드를 제공하였다(표 3). 이 플라스미드를 MACH060(BW25113 에스케리키아 콜라이 ΔminCDE::CamR) 내에 형질전환시키고, 성장 배지 중 100 μg/mL 카베니실린 및 35 μg/mL 클로람페니콜을 사용하여 선택하여, 균주 MACH198을 제공하였다(표 2). 성장 배지에 첨가되는 안하이드로테트라사이클린을 사용하여 유도되는 경우, MACH198은 DacA를 생성하였으며, 이는 강력한 STING 활성화인자 사이클릭-디-AMP 내에의 2개의 ATP 분자의 축합을 촉매한다.
B.MACH060 및 MACH198 ADAS의 정제
STING 활성화 검정을 위하여, MACH060 및 MACH198을 미소한 변형과 함께 실시예 2에 약술된 방법을 사용하여 제조하였다. 요약하여, 2개의 MACH198의 배양물을 사용하였으며: 하나는 정상적으로 성장시켰고(비유도), 하나는 200 ng/mL의 안하이드로테트라사이클린을 첨가하였다(유도). ADAS를 0.2 μm 바틀 탑(bottle top) 필터를 사용하여 농축시키고 수거하였으며, THP1-DualTM 성장 배지(인비보겐(InvivoGen)) 중에 대략 109개 입자/mL의 최종 농도로 재현탁화시켰다. 실시예 2에 요약된 CFU 플레이팅 방법에 의해 평가되는 바와 같이, 잔류 부모 버든은 200 CFU/mL 미만의 부모 박테리아 세포를 보였다.
C.포유동물 세포 검정을 사용한 기능의 평가
THP1-DualTM 단핵구 세포주(인비보겐)를 사용하여, 발광 판독을 사용해 STING 경로의 활성화를 평가하였다. THP1-DualTM 세포는 5개의 IFN-자극된 반응 요소와 함께 ISG54 최소 프로모터의 제어 하의, 분비된 루시퍼라제 리포터 유전자인 루시아(Lucia) 유전자를 특징으로 한다. IFN-자극된 반응 요소가 예를 들어, c-디-AMP에 대한 노출에 의해(예를 들어, c-디-AMP를 포함하는 ADAS(예를 들어, MACH198 ADAS)의 식세포작용에 의해) 활성화되는 경우, ISG54 최소 프로모터가 활성화되며, 루시퍼라제가 전사되고 번역되며, 세포 배지 내에 루시퍼라제가 분비된다. 루시퍼라제를 정량화하기 위하여, 기질 QUANTI-LucTM(인비보겐)를 세포 배지에 첨가한다. QUANTI-LucTM는 루시퍼라제 기질 코엘렌테라진(coelenterazine)을 함유하며, 이는 플레이트 판독기를 사용하여 정량화될 수 있는 루시퍼라제에 의해 가수분해되는 경우 광 신호를 생성한다.
ADAS가 THP1-DualTM 세포에서 STING 경로를 활성화시키는지 여부를 평가하기 위하여, THP1-DualTM 세포를 인비보겐의 설명에 따라 배양하고, 웰당 125 μL로 5x105개 세포/mL의 농도로 96 웰 플레이트에 씨딩하였다. MACH060, 비유도된 MACH198 및 유도된 MACH198(표 2) 유래의 ADAS를 웰당 100 μL의 부피에서 약 4x107개 ADAS/mL로 첨가하였다. 37℃에서 42시간 동안의 인큐베이션 후에, 플레이트를 300xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 마지막으로, 20 μL의 배지를 각각의 웰로부터 제거하고, 웰당 50 μL의 QUANTI-LucTM를 함유하는 백색-벽 플레이트 내에 배치하였다. 발광을 즉시 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다. 도 5a는 실시예 1에 기재된 바와 같이 스펙트라다인® nCS1TM 나노입자 분석기를 사용하여 결정되는 바와 같이, 첨가되는 ADAS의 부피에 대하여 정규화된 각각의 실험 조건으로부터의 시료의 평균 발광을 보여준다. 각각의 ADAS 조건은 6개의 생물학적 반복검증을 포함하였다. 발광 신호가 MACH060 ADAS로부터 거의 수득되지 않거나 수득되지 않으며, 이는 DacA 유전자를 함유하지 않았으며, 대부분 THP1-DualTM 세포에서 IFN-자극된 반응 요소를 촉발시키지 않았다. 그러나, pTet의 제어 하에 DacA 유전자를 함유하는 MACH198 ADAS는 THP1-Dual 세포를 자극하였다. 가장 큰 자극은 DacA 발현이 안하이드로테트라사이클린과 함께 배양함으로써 유도되었던 시료에서 관찰되었다. 추가로, 단핵구가 IFN 유전자의 자극을 경험하는 경우에, 세포는 활성화된 표현형으로 가정되고, 현탁액 중 비-부착 단핵구로부터 활성화된 부착 대식구로 전이된다. 본 발명자들은 다양한 ADAS 집단에 노출되는 시료에서 이 전이를 관찰하였다. 도 5b는 활성화된 부착 표현형이 THP1-DualTM 세포를 안하이드로테트라사이클린-유도된 MACH198 ADAS를 사용하여 처리한 시료에서 가장 명백한 것을 보여준다.
다운스트림 I형 인터페론 반응의 유도는 STING 경로의 기능에 필수적이다. 이 반응의 시그너쳐는 I형 인터페론, 예컨대 인터페론 베타(IFNB1)의 분비이다. 기능적 STING 반응을 유도하는 ADAS의 능력을 추가로 설명하기 위하여, IFNB1을 인간 IFN-베타 퀀티카인(Quantikine) ELISA 키트(DIFNB0, 알앤디 시스템즈(R&D Systems)®)를 사용하여 각각의 시료에 대하여 정량화하였다. 세포 상청액을 상기 검정된 웰로부터 흡인시키고, ELISA의 선형 범위로 희석하였다. ELISA를 제조처의 설명에 따라 수행하였다. 도 5c는 ELISA의 결과를 보여준다. MACH060 ADAS 및 소분자 STING 효능제(대조군으로서 제공됨)가 ELISA 검정의 검출 한계 미만(5 pg/mL 미만)인 IFNB1 수준을 보였지만, 비유도된 MACH198 ADAS는 미량의 IFNB1(약 7 ng/mL)을 보였으며, 유도된 MACH198은 세포 상청액 내에 분비되는 IFNB1의 40배 초과의 증가를 보였다(약 300 ng/mL). 이에 따라, ADAS는 이종 효소의 발현을 통한 카고의 제조 능력을 보였으며, 이 카고는 표적 세포에 전달되고, 기능적(이 경우에 면역조절) 반응을 유도하였다.
실시예 8: RNA 카고를 사용한 에스케리키아 콜라이 ADAS의 로딩
본 실시예에는 RNA 카고, 이 경우에는 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella) 유래의 키모트립신에 대한 유전자(chy1)를 표적화하는 dsRNA의 발현 및 ADAS 내로의 패키징이 기재된다.
A.dsRNA를 함유하는 에스케리키아 콜라이 부모 세포주의 구축
dsRNA가 패키징된 ADAS를 구축하기 위하여, 키모트립신에 대한 플루텔라 자일로스텔라 chy1 유전자의 코딩 영역의 일부에 상응하는 412 bp 서열(SEQ ID NO: 8)을 듀얼(dual) T7 프로모터, pMB1 복제 원점 및 항생제 선택을 위한 앰피실린 내성 유전자를 함유하는 플라스미드 L4440(문헌[Fire et al., Nature, 391(6669): 806-811, 1999]) 내에 클로닝하여, pRNAi를 제공하였다(표 3 참조). 이 플라스미드를 클로람페니콜 내성 카세트를 함유하는 에스케리키아 콜라이 HT115(DE3) ΔminCDE 균주인 MACH300(표 2) 내에 형질전환시키고, 성장 배지 중 50 μg/mL 카베니실린 및 35 μg/mL 클로람페니콜의 첨가를 사용하여 선택하여, MACH301을 생성하였다(표 2). MACH301은 또한, 테트라사이클린 내성 카세트와 함께, dsRNA를 분해하는 RNase III을 인코딩하는 rnc 유전자의 파괴를 보유한다. 이 균주는 DE3 프로파지를 추가로 보유하며, 이는 lac 프로모터 뒤에 T7 RNA 중합효소 유전자의 카피를 인코딩한다. 이소프로필 β- d-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 배지에 첨가하는 경우, T7 RNA 중합효소가 발현된다. 이어서, T7 RNA 중합효소는 둘 모두의 T7 프로모터로부터 삽입된 chy1 서열을 전사시켜, 상응하는 dsRNA를 생성한다.
B.dsRNA에 의한 ADAS 생산
dsRNA가 로딩된 MACH301 ADAS를 성장 조건에 대한 변형과 함께, 실시예 2에 요약된 과정에 의해 제조하고 정제하였다. 요약하여, MACH301의 밤샘 배양물을 50 μg/mL의 카베니실린을 갖는 LB 중에 1:200 희석하고, OD600 = 0.4까지 성장시켰다. 이어서, IPTG를 배양물에 1 mM의 최종 농도로 첨가하고, 성장을 4시간 동안 계속하여, ADAS가 부모로부터 생성됨에 따라, 그들이 플라스미드로부터 dsRNA 구축믈을 발현하도록 하였다.
C.ADAS 내의 dsRNA 로딩의 정량화
ADAS 내의 dsRNA의 수준을 정량화하기 위하여, 본 발명자들은 겔 전기영동에 의해 핵산 함량을 분석하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같은 스펙트라다인® nCS1TM 나노입자 분석기 분석에 의해 결정되는 바와 같은, PBS 중 약 3.3x1010개 입자/mL의 농도의 ADAS를 80℃에서 20분 동안의 열 처리를 통해 용해시켰다. 이 처리는 핵산의 방출 및 아가로스 겔 전기영동을 통한 용이한 가시화를 야기하였다. 20 μL의 열-처리된 ADAS 용해물을 제조처의 권고된 환경에 따라, 125 ng/μL의 시험관내 전사된 dsRNA의 연속 희석에 의해 생성된 표준 곡선과 함께 2% 아가로스 E-GelTM EX(써모 피셔) 상에서 전개하였다. 겔을 핵산 겔 환경에서 인비트로겐TM 아이브라이트TM 영상화기(써모 피셔)를 사용하여 영상화하였다. 밴드 세기를 ImageJ를 사용하여 정량화하였다. 로딩된 dsRNA의 양은 109개의 ADAS당 97 ng인 것으로 계산되었다. 본 실시예는 ADAS가 RNA 카고를 사용하여 효율적으로 로딩될 수 있는 것을 보여준다.
실시예 9: 나비목(Lepidoptera)에의 에스케리키아 콜라이 ADAS의 전달
본 실시예에는 인공 식이에의 ADAS의 첨가 후에, 인시목 곤충, 구체적으로, 유럽 조명 나방 내의 ADAS의 형광 표지 및 가시화가 기재된다.
A.가시화를 위한 ADAS의 형광 표지
유럽 조명 나방 내의 ADAS를 가시화시키기 위하여, 본 발명자들은 NHS 에스테르 형광 염료를 사용하여 ADAS를 형광 표지하였다. MACH301 ADAS를 실시예 8에 약술된 과정에 의해 제조하고 정제하였다. 30 μL의 0.5 M 붕산나트륨을 스펙트라다인® nCS1TM 나노입자 분석기 분석에 의해 측정되는 바와 같이 1x1011개의 농도로 1 mL의 ADAS에 첨가하였다. ADAS의 외막 표면 상의 아민-함유 분자(예를 들어, 단백질의 일차 아민)와 반응하는 DyLight™ 800 NHS 에스테르(써모피셔)를 무수 디메틸포름아미드 중에 10 mg/mL의 농도로 용해시켰다. 20 μL의 DyLight™ 800 NHS 에스테르 스톡을 1.5 mL 튜브 내의 ADAS에 첨가하고, 간단히 와류시켰다. 이후의 반응 혼합물을 호일에 싸고, 실온에서 1시간 동안 로커(rocker) 상에 배치하였다. 과잉의 염료를 제거하기 위하여, ADAS를 실온에서 10분 동안 20,000xg에서 펠렛화시키고, 1 mL의 PBS 중에 재현탁화시켰다. 이 세척을 3회 반복하였으며, ADAS를 1 mL의 최종 부피의 PBS 중에 재현탁화시켰다.
B.유럽 옥수수 천공충(ECB)에 대한 피딩 표지된 ADAS
유럽 조명 나방(오스트리니아 누빌랄리스(Ostrinia nubilalis)) 알을 벤존 리서치 인코포레이티드(Benzon Research Inc.)로부터 수득하였으며, 벤존 리서치 인코포레이티드로부터 구입한 인공 식이(일반 녹투이드(noctuid) 식이)에서 사육하였다. 식이를 하기와 같이 제조하였다: 162 g의 일반 녹투이드식이 분말을 끓는 물에 첨가하였으며; 80℃ 내지 90℃의 온도를 유지하면서, 내용물을 15분 동안 완전히 혼합하였으며; 혼합물을 70℃까지 냉각시키고, 5 mL의 아마인유를 첨가하고, 완전히 혼합하였으며; 음식을 사육 용기 내에 분배하고, 냉각되고 고형화되게 하였다.
ECB 알을 식이 상에 배치하고, 부화되고 피딩되게 하였다. 모든 사육 용기를 25℃, 16시간:8시간 광:암 주기 및 50 내지 60% 습도에서 유지하였다. 일단 유충이 2령기에 도달하면, 그들을 피딩 검정을 위해 사용하였다. 피딩을 위한 환경을 준비하기 위하여, 25 mL의 일반 녹투이드 식이를 제조하고, (뜨거울 때, 70℃) 0.4 리터 용기(시스테마(Sistema) 1543 클립 잇 박스(Klip It box))의 뚜껑에 붓고, 고형화하는 동안 바닥이 절단된(바닥으로부터 약 2 mm가 제거된) 48 웰 PCR 플레이트를 음식 내에 바로 배치하였다: 이는 2령기 유충에 대한 이 피딩 검정을 위한 정량의 식이를 갖는 개별 웰을 생성하였다. DyLight™ 800 NHS 에스테르-표지된 ADAS 또는 PBS를 대조군으로서 투여하기 위하여, 2 μL의 표지된 ADAS 또는 PBS를 개별적으로 5개의 웰에 첨가하고, 건조되게 하였다. 이어서, 개별 2령기 유충을 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 동안 피딩하게 하였다.
C.유럽 옥수수 천공충(European Corn Borer) 내의 형광 ADAS 시각화
ECB 유충에서 ADAS를 가시화시키기 위하여, PBS 또는 DyLight™ 800 NHS 에스테르-표지된 ADAS를 피딩한 유충을 웰로부터 제거하고, 점착성 테이프 상에 배치하여, 그들을 고정시킨 다음, 촬상면 상에 배치하였다. 700 nm 및 800 nm 채널 둘 모두를 유충을 스캐닝하기 위해 사용하였다. 유충은 700 nm 채널에서 자가형광이며; 이에 따라 영상화기 상의 유충의 위치를 찾기 위하여 이 채널을 사용하였다. 800 nm 채널을 사용하여 유충 내의 표지된 ADAS를 검출하였다.
도 6은 피딩 실험의 결과를 보여주며, PBS 피딩된 유충에서 800 nm 채널에 신호가 거의 없고, DyLight™ 800 NHS 에스테르-표지된 MACH301 ADAS를 피딩한 유충에 강력한 형광 신호가 존재한다. 따라서, ADAS는 식이에 첨가되는 경우, 유럽 조명 나방에 의해 섭취되며, 그 내에 존재한다.
실시예 10: ADAS의 보관
본 실시예에서, 본 발명자들은 모델 ADAS-생성 박테리아로서 에스케리키아 콜라이를 사용하여 ADAS를 제형화하고 보관하는 방법을 보여주었다. 유도성 GFP 플라스미드를 갖는 에스케리키아 콜라이 ADAS를 실시예 1 내지 3에 제공된 방법에 따라 합성하고 정제하였다. 이어서, 그들을 다양한 조건에서 보관하여, 재구성되고 생존하는 그들의 능력에 대하여 평가하였다.
A.저온 조건에서의 ADAS의 장기에 걸친 보관
본 실시예에서, 4℃에서 0 및 3일 동안의 보관 후에 유도 가능한 방식으로 GFP를 발현하는 ADAS의 능력을 평가하였다. ADAS를 테트라사이클린 유도성 프로모터의 제어 하에 GFP 발현을 유도하는 pGFP 플라스미드(표 3)를 함유하는 3개의 균주로부터 유도하였다: MACH124(BW25113 ΔminCDE), MACH556(BW25113 ΔminC) 및 MACH557(BW25113 ΔminD): 유전형 정보에 대해서는 표 2를 참조한다. ADAS를 농축된 배양 상청액으로부터 선택적 성장을 사용하여 실시예 2에 나타낸 바와 같이 정제하였다. 정제된 MACH124 제제에 있어서, ADAS의 농도는 정제 직후에 2.4x109개 ADAS/mL이고, 3일의 보관 후에 2.18 x109개 ADAS/mL인 것으로 결정되었다. 정제된 MACH556 제제에 있어서, ADAS의 농도는 정제 직후에 1.86x109개 ADAS/mL이고, 3일의 보관 후에 2.2x109개 ADAS/mL인 것으로 결정되었다. 정제된 MACH557 제제에 있어서, ADAS의 농도는 정제 직후에 1.98x109개 ADAS/mL이고, 3일의 보관 후에 2.08x109개 ADAS/mL인 것으로 결정되었다. 모든 ADAS 농도 측정치를 스펙트라다인® nCS1TM 나노입자 분석기(실시예 3에 약술됨)를 사용하여 취하였다. 정제된 ADAS 제제를 실시예 3에 기재된 나노입자 특성화 및 생존 가능한 세포 플레이팅 절차로 처리하였다. 각각의 제제에 있어서, 생존 가능한 세포 버든은 실시예 3에 기재된 바와 같이, CFU 플레이팅에 의해 검출 한계(100 CFU/mL)이거나, 그 미만인 것으로 결정되었다. 유도제-의존적 방식으로 GFP를 발현하는 보관된 ADAS의 능력을 실시예 4C에 기재된 바와 같이 평가하였다. 제0일에(0일의 보관), 유도제-의존적 GFP 신호가 관찰되었으며, 이는 모든 3가지 균주에서 12시간에 걸쳐 증가하였다. 3일의 보관 후에, 본 발명자들은 12시간에 걸쳐 지속되는 MACH124 및 MACH557 ADAS에서의 GFP의 전사 및 번역의 유도제-의존적 증가를 관찰하였다(도 7a 내지 도 7f). MACH556은 약 제6시간까지 GFP 신호의 유도제-의존적 증가를 보였으며, 그 다음, 신호는 제12시간까지 비유도된 수준으로 다시 감소하였다. 유도제의 부재(비유도) 하에, 임의의 시험된 균주에 대하여 GFP 신호의 증가가 존재하지 않았다. 도 7a 내지 도 7f의 데이터를 실시예 4C에 기재된 바와 같이 정규화하였다.
B.ADAS의 동결건조 및 재구성
동결건조 후에 작업을 수행하는 ADAS의 능력을 시험하기 위하여, ATP 수준을 동결건조 후 제1주, 제2주 또는 제6주에 재수화된 ADAS에서 측정하였다. 추가로, 재수화 후에 표적 유전자 GFP를 전사하고 번역하는 동결건조된 ADAS의 능력도 또한 평가하였다. MACH124 유래의 ADAS를 실시예 2에 나타낸 바와 같이 정제하였다. ADAS를 동결건조시키기 위하여, 정제된 ADAS를 21,000xg에서 20분 동안 펠렛화시키고, 미생물 동결건조 완충제(오피에스 디아그노스틱스(OPS Diagnostics)) 중에 재현탁화시켰다. ADAS를 액체 질소에서 급속-동결시키고, 0.3 mbarr의 진공으로 설정된 랩콘코(Labconco)TM 프리존(FreeZone) 동결 건조기의 자동 설정에서 18시간 동안 동결-건조시켰다. 동결-건조된 ADAS를 재수화시까지 실온에서 집락(Ziploc) 백에 암 중에 보관하였다. 동결건조 후에 ADAS의 ATP 수준을 결정하기 위하여, ADAS를 동결건조 후 제1주, 제2주 및 제6주에 재수화시키고, ATP 수준을 제조처의 설명에 따라 BacTiter-GloTM 미생물 세포 생존력 검정 키트(프로메가)를 사용하여 측정하였다. 검정은 동결건조된 및 재수화된 ADAS가 제1주, 제2주 또는 제6주의 보관 후에 ATP를 유사한 수준으로 유지하는 것을 보여주었으며, 제2주 및 제6주의 ATP 수준은 제1주에 측정되는 ATP 수준보다 약간 증가하였다(각각 1.49 및 1.48배). 이 데이터는 ATP 수준이 동결건조, 보관 또는 재수화 과정에 의해 유지되는 것을 보여준다.
추가로, 유도제-의존적 방식으로 GFP를 전사하고 번역하는 재수화된 ADAS의 능력을 실시예 4C에 약술된 프로토콜을 사용하여 시험하였다. 도 7g 및 도 7h는 15시간에 걸쳐 지속되는 재수화된 MACH124 ADAS 내의 GFP 신호의 유도제-의존적 증가를 보여준다. 유도제의 부재(비유도) 하에, GFP 신호의 증가가 존재하지 않았다. 도 7g 및 도 7h의 데이터를 실시예 4C에 기재된 바와 같이 정규화하였다.
재수화된 ADAS에서 관찰되는 활성은 ADAS 온전성이 동결건조 과정에 의해 유지되는 것을 나타낸다.
실시예 11. ADAS 특성화를 위한 보충 방법
본 실시예에는 ADAS 및 부모 세포의 조성을 특성화하기 위해 사용되는 다양한 보충적 분석 방법이 기재된다.
A.전자 현미경법
ADAS를 실시예 12에 기재된 바와 같이 부모 박테리아, 세포 데브리스 및 내독소로부터 정제한다. 편모 및 분비 시스템을 포함하는 주변세포질 구조를 가시화시키기 위하여, ADAS를 분리 후에 이전의 방법(문헌[H C Neu and L A Heppel. 240:3685-3692, 1965])과 유사한 방식으로 삼투압-충격을 가한다. 그런 다음, 분리된 페리플라즈믹 구조를 문헌[Wu et al., Analyst, 2015]으로부터의 프로토콜에 따라, 투과 전자 현미경(JEOL, 도쿄)에서 시각화한다.
B.형광 및 광학 현미경법
ADAS 및 부모 박테리아를 형광 장비 정립 현미경(라이카(Leica), 자이스(Zeiss), CCD 카메라 및 브로드-스펙트럼 광원)을 사용하여 가시화시킨다. 시료를 6-, 12-, 24- 또는 96-웰 형식의 조직 배양 멀티-웰(써모 피셔), 트랜스웰 인서트(transwell insert)(코닝(Corning)) 또는 아가-코팅된 폴리스티렌 페트리 디쉬(써모 피셔) 내에서 영상화한다. 추가로, 시료를 추가의 분석을 위하여 이들 용기 내에서 또는 유리 커버슬립 상에서 고정할 수 있다.
C.농도의 OD600 측정
주어진 부피의 배지에 존재하는 ADAS 또는 부모 박테리아의 개수를 정량화하기 위하여, 광학 밀도를 OD600에서 측정하고, 하기의 식을 사용한다:
ADAS의 개수/ml = OD600 x A x B
상기 식에서, A는 부모 세포에 비한 ADAS의 상대적 크기이며, B는 그들의 LPS 함량에 대한 ADAS의 OD600과 관련된 검정 곡선 인자이다. 이는 박테리아 세포에 대한 표준 AD600 측정으로부터 유래된다.
D.ADAS 및 부모 박테리아의 나노입자 추적 분석
나노입자 추적 분석을 전형적으로 소낭의 순도를 측정하기 위하여 사용하고, ADAS 순도를 측정하기 위해 변형시킨다. 약술하여, 나노입자 추적을 레이저 및 고감도 디지털 카메라와 함께 구성된 나노사이트(NanoSight) LM10 시스템(영국 에임즈베리 소재의 나노사이트 리미티드(NanoSight Ltd))을 사용하여 행한다. 비디오를 입력물로서 예상되는 입자 크기를 사용하여, 표준 소프트웨어를 사용해 수집하고 분석한다. 각각의 시료를 (분광광도계 정량화를 사용하여) 108개 입자/ml의 범위의 알려져 있는 농도로 희석하고, 나노사이트의 펌프 시스템을 사용하여 제어된 유동 하에 투여하고 기록한다. 카메라를 최대 프레임 속도 및 해상도에서 작동시킨다. 정확한 크기 범위의 입자의 수를 크기 범위 밖의 전체 입자(예를 들어, 부모 세포)의 백분율과 함께 정량화한다.
E.동적 광 산란 및 제타 전위
ADAS 및 부모 박테리아 집단 크기 분포를 동적 광 산란(DLS)(말번 인스트루먼츠 리미티드(Malvern Instruments Ltd.)로부터의 제타사이저 나노(Zetasizer Nano) S)을 사용하여 측정한다. ADAS 현탁액을 광에 노출시킴으로써, 산란광 세기를 공개된 프로토콜(문헌[Jorge Stetefield, Biophys Rev (2016) 8:409-427])을 사용하여 용액 중 물체의 확산 계수와 관련시킴으로써 수력학적 반경을 측정한다. 이들 연구는 유사한 방식으로, 나노입자, 박테리아, 단백질 및 핵산을 사용하여 이전에 수행된 바 있다. 일회용 큐벳을 전형적으로 ADAS 크기 측정을 위해 사용하여 멸균성을 유지하고, 교차-시료 오염을 회피한다. 유기 용매를 필요로 하는 일부 응용을 위하여, 재사용 가능한 유리 큐벳을 세제(알코녹스(Alconox)), 5% 아세트산, 탈이온수 및 70% 에탄올의 순차적인 세정을 포함하는 세심한 세정 프로토콜에 이어서, 완전한 건조 과정과 함께 사용한다.
F.면역형광 염색:
ADAS를 실시예 12에 기재된 방법을 사용하여 부모 박테리아로부터 단리한다. ADAS를 희석하고, 500 g에서 깨끗한 유리 커버슬립 상에 회전시키고, PBS 용액 중 4% 파라포름알데히드 중에 20분 동안 고정한다. 시료를 세척하고, 제조처의 설명에 따라 항체의 염색 용액 중에 인큐베이션시키고, 제조처의 설명에 따라 안티페이드 마운턴트(antifade mountant)를 사용하여 슬라이드 상에 마운팅하고, 건조시키고, 공초점 현미경 하에 영상화한다. ImageJ를 사용하여 이미지를 처리한다.
G.유세포분석:
부모 박테리아 및 ADAS를 제조처의 설명에 따라 NanoFCM(NanoFCM, 중국 소재) 상에서 유세포분석을 사용하여 분석한다. 형광 ADAS를 사용하여, NanoFCM을 1- 또는 2-색 모드 중 어느 하나에서 사용하여(488 nm 및 555 nm 파장에서의 노출), 플라스미드 흡수, 단백질 발현 및 순도를 포함하는 ADAS의 다양한 특성을 확인한다. 예를 들어, 제조처에 의해 기술되는 바와 같이, 형광 친지성 염료, 예컨대 DiOC6(아이씨엔 바이오메디컬즈(ICN Biomedicals))를 ADAS 막 내로 혼입시킨다. ADAS를 실시예 12에 설명된 바와 같이 분류하고 정제한 다음, 차가운 인산염-완충된 염수(pH = 7) 중에 세척하고, 재펠렛화시키고(40,000 g, 5분, 4℃), (1E5, 1E6, 1E7) ADAS/mL로 희석하고, 488 nm 여기 및 535 방출에서 DiOC6 형광 세기를 측정한다.
H.PCR
정제된 ADAS를 용해시키고, DNA를 제조처의 지침에 따라 QIAquick PCR 정제 키트(퀴아젠)를 사용하여 정제한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 23S-센스(59 GAA AGG CGC GCG ATA CAG 39) 및 23S-안티센스(59 GTC CCG CCC TAC TCA TCG A 39)를 사용하여 문헌[Vilalta et al., Anal Biochem, 2001]에 기재된 바와 같이 에스케리키아 콜라이 게놈 내에 7개의 카피로 존재하는 23S 리보솜 RNA 유전자의 70-bp 단편을 증폭시킨다. 증폭 반응을 제조처의 설명에 따라 TaqMan 시약(써모피셔 사이언티픽)을 사용하여 수행한다.
I.RNA SEQ
전체 전사체 분석을 문헌[Giannoukos et al., Genome Biol, 2012]에 기재된 바와 같이 RNAseq를 사용하여 행한다. 약술하여, ADAS를 LB 브로쓰(broth) 중 약 0.5의 OD600으로 정제하고, 4,000 × g에서 10분 동안 실온에서의 원심분리에 의해 수집한다. 펠렛을 25 ml의 RNAlater(앰비온(Ambion), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 중에 재현탁화시킨다. 튜브를 4℃에서 하룻밤 회전기 상에서 교반하고, 4,000 × g에서 10분 동안 원심분리하고, 에탄올/드라이 아이스 배쓰에 배치하여, 펠렛을 급속 동결시키고, -80℃에서 보관한다.
RNA 추출을 제조처의 설명에 따라 Ion Total RNA-seq 키트 v2(써모피셔 사이언티픽)를 사용하여 행한다. mRNA-ONLY 원핵생물 mRNA 단리 키트(에피센트레(Epicentre))를 사용한 효소 반응을 제조처의 설명에 따라 수행한다. 오베이션(Ovation) 원핵생물 RNA-Seq 시스템(누젠 테크놀로지즈, 인코포레이티드(NuGEN Technologies, Inc.), 미국 캘리포니아주 샌 카를로스 소재)을 하기와 같이 사용한다. 온전한 RNA는 상기 기재된 바와 같이 처리되는 DNase이며, 제조처의 프로토콜에 따라 cDNA로 합성한다.
정제된 생성물을 겔 상에서 크기 선택한다(대략 300 내지 450 bp). 시료를 25 μL의 최종 부피 중 일루미나(Illumina) PE1.0 및 PE2.0 프라이머(각각 1 μM), 1×의 아큐프라임(AccuPrime) PCR 완충제 I(10×), 0.5 U의 아큐프라임 Taq 고 충실도(High Fidelity) 중합효소(5 U/μL; 인비트로겐)를 사용하여 농축시킨다. 농축된 반응물을 아젠코트(Agencourt) AMPure XP 비드(반응 부피의 0.8배)를 사용하여 정제한다. 라이브러리를 일루미나 GAII 또는 Hi-Seq 기기 상에서 시퀀싱한다. RNA-seq 데이터의 미가공 판독물을 피카드(Picard) 파이프라인을 사용하여 가공한다. 약술하여, 판독물을 정렬하고, 에스케리키아 콜라이에 대한 프로그램 HISAT2 서열 데이터를 사용하여 참조 게놈에 할당하고, 각각의 게놈 서열에 대해 정렬한다. 그 다음, HISAT2-정렬된 판독물을 분석하고, 진뱅크에 의해 제공되는 게놈 주석에 따라 개별 유전자에 할당한다.
J.DNA SEQ
부모 세포주 유래의 잔류 DNA를 킹피셔 플렉스 익스프레스(KingFisher Flex Express) 96-딥(deep)-웰 자동화 플랫폼을 사용하여 resDNASEQ 정량적 에스케리키아 콜라이 DNA 키트(써모피셔 사이언티픽)를 사용해 측정하여, 제조처의 설명에 따른 숙주-세포주 잔류 DNA의 추출을 자동화시킨다. 약술하여, 2개의 세척 및 1개의 용리 플레이트를 준비하고, 시료를 로딩한다. 그 다음, 시료를 용해시키고, PrepSEQ_resDNA_v1 스크립트(script)를 사용하여 킹피셔 플렉스 상에서 처리한다. 표준 곡선을 에스케리키아 콜라이 부모 세포주를 사용하여 생성하고, 시료를 마스터 믹스를 사용하여 증폭시키고, 결과를 SDS 소프트웨어를 사용하여 판독하고 분석한다.
K.겔
ADAS 및 에스케리키아 콜라이 부모 세포주 유래의 DNA를 표준 프로토콜을 사용하여 추출하고, 제조처의 설명에 따라 크기 분석을 위해 아가로스 겔 상에 로딩한다. 게놈 DNA는 약 4.5 Mb인 한편, 플라스미드 DNA는 약 3 내지 5 kb이다.
I.ELISA
플루오로셀렉트(FluoroSELECT) 에스케리키아 콜라이 검정 키트(시그마-알드리치)를 부모 세포의 ELISA 검출을 위해 사용한다. 검출 시스템을 형광성 기질을 사용하며, 이는 (펩티드 가수분해 동안) 특정 효소에 의해 가수분해되는 경우 형광 신호를 생성한다. 약술하여, 시료를 제조처의 설명에 따라 제조하고, 형광측정기를 사용하여 판독한다. 보정 후에, 측정된 P1이 30,000 초과이면, 시료는 부모 세포주 세포에 대하여 양성이다. P1이 30,000 미만이면, P2를 측정한다. 수치 (P2-P1)가 (3%xP1) 미만이면, 시료는 음성이다.
실시예 12. 이. 콜라이 ADAS 의 생산을 위한 보충 방법
본 실시예에는 에스케리키아 콜라이로부터의 ADAS의 생성 및 특성화를 위한 보충적 방법이 기재되어 있다.
A.이. 콜라이 ADAS의 생산
ADAS를 생성하기 위하여, 에스케리키아 콜라이를 T7 프로모터 하에 ftsZ 단백질을 과발현하는 플라스미드를 사용하여 트랜스펙션시킨다. 대안적으로, 통합 플라스미드를 사용한 에스케리키아 콜라이의 트랜스펙션에 의해 파괴된 MIN 유전자를 갖는 에스케리키아 콜라이 돌연변이체를 생성한다. 플라스미드를 써모 피셔에 의해 상업적으로 합성한다. 트랜스펙션을 표준 박테리아 트랜스펙션 과정(문헌[Thermo Fisher Molecular Biology Handbook])을 사용하여 수행한다. 요약하여, 컴피턴트(competent) 세포를 실온 아가 플레이트 상에 플레이팅한다. 0.5 내지 2 ng/ml의 DNA를 바이얼 내의 컴피턴트 세포에 첨가하고, 20 내지 30분 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 각각의 튜브를 42℃ 수조에서 30 내지 60초 동안 배치함으로써 튜브에 열 충격을 가하여, 세포 표면 내에 일시적인 포어(pore)를 생성한다. 이어서, 세포를 선택적 항생제가 사전로딩된 아가 겔 상에 플레이팅하고, 하룻밤 성장시켜, 플라스미드로 트랜스펙션된 박테리아만이 생존한다. 단일의 콜로니를 픽킹하고, 37℃에서 50 내지 100 μg/mL의 앰피실린을 함유하는 LB 배지 중에 120 rpm에서 연속 진탕과 함께 배양한다. 시간이 지남에 따라, 선택된 콜로니는 증식하고, ADAS를 지속적으로 생성한다.
실시예 13. 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 ADAS의 정제 및 효율 측정을 위한 보충적 방법
본 실시예에는 미정제 제제로부터 에스케리키아 콜라이 ADAS를 정제하기 위한 보충적 방법 및 오염성 생 박테리아의 양을 특성화하기 위한 방법이 기재된다.
A.이. 콜라이 ADAS의 정제
고순도 생성을 위하여 부모 박테리아로부터 ADAS를 분리하기 위하여, 세척, 원심분리, 멸균 여과 및 항생제 처리의 조합이 사용된다. 몇몇의 변형과 함께 이전에 공개된 방법(문헌[Reeve, J 1979], 문헌[Jivrajani 2013], 문헌[Rampley et al 2017])으로부터 조정된 프로토콜을 사용한다. 요약하여, 용액을 정제하기 위하여, 부모 박테리아 및 ADAS 용액의 혼합물을 수집하고, 각각의 단계에서 10분 동안 1000 g로부터 4000 g까지 1000 g 증분식으로 증가하는 속도로 4℃에서 원심분리하며(베크만 쿨터(Beckman Coulter)), 여기서, 현탁액으로부터 증가하는 분율의 부모 세포가 제거된다. 부모 박테리아가 제거된 것을 추가로 보장하기 위하여, 100 μg/mL의 강력한 항생제(세프트리악손)를 첨가하고, 시료를 최종 상청액 용액과 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시킨다. 다음날, 용액을 400 g에서 4℃에서 원심분리하여, 임의의 세포 데브리스를 펠렛화시키고, ADAS가 풍부한 상청액을 수집한 다음, 4000 g에서 5분 동안 4℃에서 원심분리한다. 마지막으로, 용액을 .2 μm 멤브레인 필터를 사용하여 멸균 여과한 다음, ADAS를 원하는 농도로 Ca2+ 및 Mg2+를 갖는 멸균 PBS 중에 재현탁화시킨다.
B.ADAS 정제 효율 측정
ADAS 생성의 각각의 단계에서, 상청액 또는 침강물을 수집하고, 아가 플레이트 상에 플레이팅하고, 37℃에서 인큐베이션시켜, 부모 세포가 용액으로부터 제거된 것을 가시적으로 확인한다. 병행하여, 혈구계를 사용하여, ADAS 및 부모 박테리아의 수를 광학 현미경법을 사용하여 계수한다. 추가적으로, ADAS가 잔류 DNA를 함유하지 않는 것을 보장하기 위하여, ADAS가 잔류 DNA에 대하여 양성이면 UV 형광이 될 NucBlue 라이브(Live) 레디프로브스(ReadyProbes) 시약(인비트로겐, R37605)을 사용한 형광-기반의 검정을 수행한다. 시약을 제조처에 의해 지시된 바와 같이 첨가하고(시료 mL당 2방울), 15 내지 30분 동안 인큐베이션시키고, 영상화 이전에 PBS 용액을 사용하여 세척하여, 과잉의 시약을 제거한다. 405 nm 파장 광에 대한 노출 시에, 염료가 임의의 잔류 DNA에 커플링된다면, 염료는 청색 스펙트럼에서 여기될 것이다. 대조염색으로서, 적색-형광 FM 4-64 염료(인비트로겐)를 ADAS 및 부모 박테리아의 외측 소엽(leaflet)을 염색하는 층간삽입 친지성 막-기반의 염료로서 사용한다. 여기 및 방출 스펙트럼을 핵 염색으로부터 분리하여 특유한 신호가 수집될 수 있는 것을 보장한다. 시료의 순도를 잔류 집단 내의 ADAS의 백분율 = 100x (적색의 수 - 청색의 수) / (적색의 수)로서 계산한다. 추가로, 동적 광산란(DLS) 방법(제타 사이저 말번(Zeta Sizer Malvern))을 사용하여, 약 1 μm(부모 세포) 및 약 500 nm(ADAS)와 관련된 피크의 세기를 비교하고, 부모 세포 피크가 순도 증가의 시료에서 0에 근접하는 것을 보여줌으로써 순도를 평가한다.
대안적으로, 잔류 ADAS DNA를 판매사에 의해 확립된 프로토콜을 사용하여 Quant-iT™ 피코그린(PicoGreen)™ DNA 검정 키트(인비트로겐, Cat# P11496)를 사용해 결정한다. ADAS를 PBS 중에 수집하고, 용해 완충제를 사용하여 용해한다. 피코그린 시약을 혼합하고, 형광 측정을 사용하여 시료에서 반응을 관찰한다.
대안적으로, ADAS를 농축하고, 적합한 배양 배지 중에 2.5x1011개 ADAS/mL로 스프레딩하고, 4 mL를 적합한 성장 아가(agar)를 갖는 60 mm 플레이트 상에 플레이팅하고, 적합한 조건에서 배양한다. 콜로니를 2일 후에 계수하여, 1012개 ADAS당 생 박테리아의 수를 결정한다.
대안적으로, 나노입자 추적, 제타사이저 및 다른 크기 분포 추적 방법을 사용하여, 크기 분포를 결정하고, 실시예 11의 프로토콜에 따라 생 박테리아를 나타내는 큰 입자의 피크의 존재에 대하여 확인한다. 대안적으로, 시료가 나노포어를 통과할 때 입자 크기, 농도 및 전하를 측정하기 위해 조정 가능한 저항성 펄스 감지를 사용하는 큐나노 골드(qNano Gold)(이존 사이언스 리미티드(Izon Science Ltd.)) 상에서 시료를 시험한다.
실시예 14. 대형 에스케리키아 콜라이 ADAS의 제조
실시예 12의 ADAS를 비대칭 세포 분열을 야기하는 격막형성 유전자의 파괴 및 부모 박테리아 세포주로부터의ADAS의 생성을 통해 제조한다. 본 실시예는 직접적으로 부모 박테리아의 게놈을 선택적으로 분해하는 엑소뉴클레아제를 사용한 ADAS의 생성을 보여주며, 이는 실시예 12에 기재된 ADAS 제제에 비하여 몇몇의 이점, 예를 들어, 세포질 조성 제어 개선, 카고 카피수 증가 및 ATP 증가를 제공한다.
A.대형 에스케리키아 콜라이 ADAS의 생성
2가지 플라스미드를 구축한다, (1) 많은 입체형태의 DNA를 분해하는 엑소뉴클레아제를 인코딩하는 sbcB 또는 sbcCD 유전자를 과발현하고, 선천적으로 발현되는 RecBCD가 게놈을 분해하게 허용하도록 아라비노스 프로모터 함유, 및 (2) IPTG-유도된 lac 프로모터의 제어 하에 recA 유전자를 낙 아웃시키는 카세트를 함유하는 플라스미드. 플라스미드를 상업적으로 합성하고, (1), (2) 또는 둘 모두를 실시예 12의 프로토콜과 같은 표준 프로토콜에 따라 에스케리키아 콜라이 세포 내에 트랜스펙션시킨다.
B.거대 이. 콜라이 ADAS의 정제
박테리아 배양물이 600 O.D에 도달한 후에, Exo1 유전자를 0.1% 아라비노스 및 글루코스 부재 배지 또는 IPTG 또는 둘 모두를 사용하여 활성화시킨다. 15분, 1시간, 2시간 및 6시간 후에, 세포를 수집하고, 4℃에서 5분 동안 원심분리하고, PBS 중에 재현탁화시킨다. 실시예 15에 기재된 바와 같이, 영양요구성 ADAS를 사용하여, 용액 순도를 증가시키며, 이는 실시예 2 또는 12의 측정을 사용하여 결정된다.
실시예 15. 영양요구성 ADAS-생성 박테리아 균주를 생성하여, 순도를 증가시키기 위한 보충적 방법
본 실시예에는 생존 가능한 박테리아 오염 ADAS 제제의 수를 감소시키기 위한 메커니즘으로서 영양요구성인 부모 균주로부터의 ADAS의 합성이 기재된다.
A.영양요구성 에스케리키아 콜라이 부모 박테리아의 제조
감소된 수의 부모 박테리아 오염물질을 갖는 ADAS를 영양요구성 에스케리키아 콜라이 균주, 예컨대 아르기닌 합성 낙아웃(argA) 균주 JW2786-1을 사용하여 생성한다. 에스케리키아 콜라이 ADAS를 배지에 아르기닌을 첨가한 것을 제외하고 실시예 12의 방법에 따라 생성한다. ADAS를 실시예 13의 방법을 사용하여 정제한 다음, 아르기닌-부재 배지 중에 보관한다.
B.영양요구성 균주로부터의 대형 에스케리키아 콜라이 ADAS의 제조
영양요구성 부모 균주 유래의 대형 ADAS를 영양요구성 에스케리키아 콜라이 균주, 예컨대 아르기닌 합성 낙아웃(argA) 균주 JW2786-1을 사용하여 생성한다. 에스케리키아 콜라이 대형 ADAS를 아르기닌 함유 배지에서 배양한 것을 제외하고 실시예 14의 방법에 따라 생성한다. 그 다음, ADAS를 실시예 14의 방법을 사용하여 정제한다.
C.영양요구성 대형 및 보통의 ADAS의 증가된 순도의 입증
대형 및 보통의 ADAS를 상기 방법을 사용하여 제조한다. 비-영양요구성 부모 균주 유래의 ADAS 및 비-영양요구성 및 대형 ADAS를 또한 실시예 12, 실시예 13 및 실시예 14의 방법을 사용하여 제조한다. ADAS 순도를 실시예 15의 방법을 사용하여 측정한다.
실시예 16. ADAS 활성 측정을 위한 보충 방법
본 실시예에는 ADAS의 활성을 측정하기 위한 보충적 방법이 기재된다.
A.ATP 측정
ADAS의 시료를 2개로 분할한다. 절반의 시료의 ATP를 제조처의 설명에 따라 BacTiter Glo 검정(프로메가)을 통해 측정한다. 다른 절반의 크기 및 농도를 실시예 11로부터의 프로토콜을 사용하여, 나노입자 트래킹(tracking) 또는 NanoFCM을 통해 측정한다. ADAS의 전체 막 표면적을 적절한 식을 사용하여 계산하고, BacTiter Glo 검정으로부터의 ATP 양을 면적으로 나누어, 단위 ADAS 표면적당 ATP를 제공한다.
B.ATP 강하 측정
ADAS를 포유동물-관련된 것들에 대하여 37℃에서 그리고 포유동물-관련되지 않은 것들에 대하여 30℃에서 인큐베이션시키고, 제조시에 그리고 24시간 후에 취한 측정 간의 ATP 농도의 비를 파트 a)의 방법을 사용하여 측정한다.
C.수명 인덱스 측정
ADAS를 종-적절한 프로모터를 갖는 기능적 GFP 플라스미드를 사용하여 합성한다. GFP 농도를 제30분 및 제24시간에 플레이트 판독기를 사용하여 ADAS의 수, ADAS당 플라스미드의 평균 수 및 용액 부피에 비하여 측정한다. 수명 지수는 제24시간 대 제30분에서의 GFP 생성 속도의 비로서 계산된다.
D.ATP 소비 측정
부모 박테리아 및 ADAS의 활성을 평가하기 위하여, ATP 생성 속도를 측정한다. ATP 생성 속도를 제조처의 설명에 따라 Seahorse XF(아질런트(Agilent))를 사용하여 측정한다.
대안적으로, ADAS의 시료를 절반으로 분할한다. 시료의 절반을 ATP 합성 저해제, 예컨대 디사이클로헥실카보디이미드를 사용하여 처리한다. 그 다음, 둘 모두의 절반을 제조처의 설명에 따라 BacTiter-Glo(프로메가)를 사용하여 검정한다. 2가지 시료의 차이는 ATP 생성 속도인 것으로 여겨진다.
실시예 17. 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 ADAS의 보관을 위한 보충적 방법
본 실시예에는 모델 ADAS로서 에스케리키아 콜라이를 사용하여 ADAS를 보관하고 제형화하기 위한 보충적 방법이 기재된다. pBAD GFP 플라스미드를 갖는 에스케리키아 콜라이 ADAS를 실시예 12의 방법에 따라 합성하고, 실시예 13의 방법에 따라 정제한다. 그 다음, 그들을 다양한 조건에서 보관하여, 재구성하고 생존하는 그들의 능력을 입증한다.
A.ADAS 에스케리키아 콜라이의 장기에 걸친 보관
ADAS를 4℃에서 등장성 완충제 중에 보관하여, 구조적 온전성 및 화학적 활성을 유지한다. 사용 직전에, ADAS를 37℃까지 재가온시킨다.
B.저온에서의 ADAS의 장기에 걸친 보관
ADAS를 4℃에서 등장성 완충제 중에 0, 30, 60, 90 또는 180일 동안 보관한다.
C.ADAS의 동결건조 및 재구성
ADAS를 원심분리하고, 하기의 용액 중에 재현탁화시킨다: 성장 배지 중 20% w/vol 탈지유, 수 중 20% w/vol 탈지유, 물 및 성장 배지의 50:50 믹스 중 12% w/vol 수크로스, 시약 18: 트립티카제 소이 브로쓰(Trypticase Soy Broth), 1.5 g; 수크로스, 10 g; 소 혈청 알부민 분획 V, 5 g; 증류수, 100 ml 및 시약 20: 수크로스, 20 g; 소 혈청 알부민 분획 V, 10 g; 증류수, 100 ml. 모든 용액을 0.2 μm 필터를 통해 여과 살균한다. 그 다음, ADAS를 액체 질소 중에서 급속 동결시키고, 동결건조시킨다. 분말을 0℃, -20℃ 및 25℃에서 0, 30, 60, 90, 180일 동안 보관한다. 시험 기간의 마지막에, 분말을 물 또는 LB 브로쓰를 사용하여 재구성한다.
재구성 후 ADAS 활성을 실시예 16에서의 평가 방법을 사용하여 평가한다.
D.ADAS의 동결 및 재구성
ADAS를 원심분리하고, 10%, 20% 및 30% vol/vol 글리세롤 및 성장 배지 중에 재현탁화시킨다. ADAS를 액체 질소에서 급속 동결시키거나, 날진 미스터 프로스티(Nalgene Mr. Frosty)에서 서서히 동결시킨다. ADAS를 -20℃ 및 -80℃에서 0, 30, 60, 90, 180일 동안 보관한다. 시험 기간의 마지막에, 분말을 물 또는 LB 브로쓰를 사용하여 재구성한다.
보관 후 ADAS 활성을 실시예 16에서의 평가 방법을 사용하여 평가한다.
E.ADAS의 분무-건조 및 재구성
ADAS를 원심분리하고, 성장 배지 중 20% w/vol 탈지유, 수 중 20% w/vol 탈지유, 또는 물 및 성장 배지의 50:50 믹스 중 12% w/vol 수크로스 중에 재현탁화시킨다. 그 다음, ADAS를 실험실 규모 유닛에서 분무 건조시키고, 수집한다. 분말을 0℃, -20℃ 및 25℃에서 0, 30, 60, 90, 180일 동안 보관한다. 시험 기간의 마지막에, 분말을 물 또는 LB 브로쓰를 사용하여 재구성한다.
분무-건조 후 ADAS 활성을 실시예 16에서의 평가 방법을 사용하여 평가한다.
실시예 18. 부모 박테리아에 대한 대형 ADAS의 유사성의 평가
본 실시예에는 보통의 ADAS보다 부모 박테리아와 더욱 유사한 대형 ADAS가 기재된다.
A.대형 에스케리키아 콜라이 ADAS와 다른 ADAS의 비교
에스케리키아 콜라이 ADAS를 실시예 12의 방법에 따라 합성하고, 실시예 13의 방법에 따라 정제한다. ADAS, 대형 ADAS 및 부모 박테리아의 시료를 웰 플레이트 내에 플레이팅하고, 초기 플레이팅 30분 내에 검정을 수행한다. 세포질 조성을 RNAseq(실시예 14에 기재됨)를 사용하여 특성화하여, 상이한 시료에 존재하는 상이한 RNA 전사물을 특성화한다. 상이한 시료의 카피 수를 qPCR을 사용하여 평가하여, 기존의 프로토콜(문헌[Anindyajati et al. "Plasmid Copy Number Determination by Quantitative Polymerase Chain Reaction" Scientia pharmaceutica vol. 84,1 89-101. 14 Feb. 2016])에 기초한 방법을 사용하여 알려져 있는 카피수의 플라스미드 표준물질의 신호에 대하여 단일의 플라스미드로부터의 신호를 정량화한다. 추가로, 3가지 조건의 수명을 실시예 11에 기재된 ATP 활성 검정을 사용하여 비교한다.
ADAS, 대형 ADAS 및 부모 박테리아의 시료를 모두 이전에 실시예 12 내지 15에 기재된 방법을 사용하여 제조하고 정제한다. 전체-전사체 분석을 실시예 12에 기재된 바와 같은 RNAseq를 사용하여 수행하고, 전사 세기의 차이를 기록한다.
실시예 19. 더 높은 순도의 영양요구성 ADAS를 나타내기 위한 보충적 방법
본 실시예에는 비-영양요구성 부모로부터 제조되는 ADAS보다 영양요구성 부모로부터 제조되는 ADAS가 단리 후에 더욱 순수한 것이 기재된다.
A.영양요구성 에스케리키아 콜라이 부모 박테리아의 제조
감소된 부모 박테리아 오염물질을 갖는 ADAS를 영양요구성 에스케리키아 콜라이의 균주, 예컨대 아르기닌 합성 낙아웃(argA) 균주 JW2786-1을 사용하여 생성한다. 에스케리키아 콜라이 ADAS를 배지에 아르기닌을 첨가한 것을 제외하고 실시예 12의 방법에 따라 생성한다. ADAS를 실시예 13의 방법을 사용하여 정제한 다음, 아르기닌-부재 배지 중에 보관한다.
B.영양요구성 대형 에스케리키아 콜라이 ADAS의 제조
영양요구성 대형 ADAS를 생성하기 위하여, 영양요구성 에스케리키아 콜라이의 균주, 예컨대 아르기닌 합성 낙아웃(argA) 균주 JW2786-1 에스케리키아 콜라이를 사용한다. argA 단백질의 발현이 보강된 sbcB 플라스미드의 변형과 함께 실시예 14의 방법에 따라 대형 ADAS를 생성하여, sbcB를 갖는 ADAS만이 배지에서 생존하게 한다. ADAS를 실시예 14의 방법을 사용하여 정제한다.
C.영양요구성 대형 및 보통의 ADAS의 증가된 순도의 입증
영양요구성 대형 및 보통의 ADAS를 상기 방법을 사용하여 제조한다. 비-영양요구성 ADAS 및 대형 ADAS를 또한, 실시예 12, 실시예 13 및 실시예 14의 방법을 사용하여 제조한다. ADAS 순도를 실시예 13의 방법을 사용하여 측정한다.
실시예 20. 발현되는 ATP 신타제를 갖는 ADAS가 고활성인지 여부를 결정하기 위한 보충적 방법
ATP 신타제 발현 및 어셈블리는 모든 유기체에서 엄격하게 조절되는 과정이다. 에스케리키아 콜라이는 ATP 신타제-함유 플라스미드를 사용한 전사에 저항성인데, 이는 ATP 신타제의 과발현이 세포에 치사일 수 있기 때문이다. 본 실시예에는 ATP 신타제의 과발현을 갖는 ADAS를 합성하기 위한 2가지 전략이 기재된다.
A.atpI의 과발현을 갖는 에스케리키아 콜라이 ADAS의 생성
에스케리키아 콜라이 K12 세포주를 보통의 배양 조건 하에서 성장시키고, 전체 RNA를 트리졸(TRIzol) 시약(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 사용하여 정제하고, 2 U의 RNase-부재 DNase를 사용하여 1시간 동안 처리한다. RT-PCR을 문헌[Chen et al., Adv Mat Res, 2014]에 의해 기재된 바와 같이 하기의 프라이머를 사용하여, ATP 신타제에 의한 에너지 생성에 수반되는 유전자인 atpI 상에서 수행한다: 5'-TCAGGCAGTCAGGCGGCTT-3', atpI-F; 5'-TTACCCTTTGTTGTTAATTACAGC-3', atpI-R. PCR 조건은 96℃에서 5분 동안의 초기 변성에 이어서, 96℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분의 15사이클과 함께, 72℃에서 7분의 최종 연장을 포함한다. PCR 산물을 1.2% 아가로스 겔 상에서 용해시킨다. 예상되는 밴드의 세기를 바이오-라드(Bio-Rad) 소프트웨어에 의해 분석하고 비교한다. 에너지 대사 유전자를 과발현하기 위하여, 발현 벡터 pET15b를 사용한다. atpI 유전자의 PCR 생성물을 플라스미드 pET15b 내에 도입하여, 발현 벡터, pAtpI을 수득한다. 발현 벡터를 에스케리키아 콜라이 BL21(DE3) 내에 전기천공시키고, OD550 0.4~0.5의 IPTG의 첨가에 의해 유도한다.
에스케리키아 콜라이 ADAS를 실시예 12에 기재된 바와 같이 이 세포주로부터 생성하고, 실시예 13에 기재된 바와 같이 정제한다.
B.ATP 신타제를 함유하는 플라스미드를 갖는 에스케리키아 콜라이 ADAS의 생성
문헌[Brockmann et al., J Bacteriol, 2013]에 기재된 바와 같은 ATP 신타제 카세트를 함유하는 플라스미드 pBAD33.atp를 상업적으로 합성하고, 논문에 기재된 방법을 사용하여 에스케리키아 콜라이 BL21(DE3) 내에 트랜스펙션시킨다. 그 다음, ADAS를 글루코스의 제거 및 배지에 대한 0.03% wt/vol 아라비노스의 첨가를 사용하여, 실시예 12에 따라 이들 세포로부터 생성한다. 그 다음, ADAS를 실시예 13의 방법을 사용하여 정제한다.
C.에스케리키아 콜라이 ADAS 및 ATP 신타제를 갖는 에스케리키아 콜라이 ADAS의 활성의 비교
상기 방법으로부터 제조된 에스케리키아 콜라이 ADAS 및 ATP 신타제 부가를 갖지 않는 에스케리키아 콜라이 ADAS를 실시예 15의 방법을 사용하여 합성하고 특성화한다.
실시예 21. ATP 신타제 ε 구성성분의 억제를 갖는 ADAS에서의 증가된 활성에 대한 검정
박테리아 FoF1 ATP 신타제의 ε 서브유닛(atpC)은 ATP 합성/가수분해 활성의 고유 저해제이다. 이 조절 도메인에 결함이 있는 돌연변이체는 야생형 세포에 비하여 매우 다양한 성장 조건 및 스트레스원 하에서 성장 속도, 몰 성장 수율, 막 전위 또는 세포내 ATP 농도의 유의미한 차이를 나타내지 않았다(문헌[Klionsky et al., J Bacteriol, 1984]). 본 실시예에서, 에스케리키아 콜라이 세포를 ε 서브유닛의 유도 가능한 절제를 사용하여 합성하거나, 낙아웃 균주로부터 제조한다.
A.ATP 신타제 ε 서브유닛의 유도 가능한 절제를 사용한 에스케리키아 콜라이 부모 세포주의 생성
에스케리키아 콜라이 균주 JW3709 또는 atpC 낙아웃을 갖는 다른 균주를 수득한다. 플라스미드를 상업적 서비스에 의해, 테트라사이클린(tet)의 부재 하에 atpC를 유도 가능하게 발현하도록, 테트라사이클린-제어된 전사활성화인자(transactivator; tTA)를 사용하여 구축한다. 구축물을 atpC 낙아웃 균주 내에 전기천공시켜, tet의 부재 하에 atpC의 발현을 가능하게 하고, tet가 없는 배지에서 성장시킨다. ADAS를 실시예 12에 기재된 프로토콜을 사용하여 이들 세포로부터 합성하고, 실시예 13의 방법을 사용하여 정제한다.
tet의 존재 및 부재 하에 상기 방법으로부터 제조된 에스케리키아 콜라이 ADAS, 균주 JW3709로부터 제조된 에스케리키아 콜라이 ADAS 및 보통의 에스케리키아 콜라이 ADAS를 실시예 15의 방법을 사용하여 특성화한다.
실시예 22. 변형된 당분해 경로를 갖는 고활성 ADAS
당분해 경로는 ATP가 합성되는 경로 중 하나이기 때문에, 주요 효소의 상향조절은 세포에서 더 많은 ATP를 야기할 수 있다. 본 실시예에는 pfkA 및 tpi를 발현하는 플라스미드를 함유하는 에스케리키아 콜라이로부터의 고활성 ADAS의 생성이 기재되며, 이는 더 많은 ATP를 생성하는 것으로 나타났다(문헌[Shimosaka et al, Ag. Bio. Chem, 1981] 참조).
A.pfkA 및 tpi를 발현하는 ADAS의 합성
에스케리키아 콜라이 유전학적 스톡 센터로부터의 에스케리키아 콜라이 균주 pLC16-4를 성장시키고, 상용의 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드 pLC16-4를 추출한다. 전기천공적격(electrocompetent) 에스케리키아 콜라이 C600 세포를 제조하고, 에펜도르프 프로토콜 #4308 915.511의 프로토콜에 따라 플라스미드 pLC16-4를 사용하여 전기천공시킨다. 요약하여, 세포를 37℃에서 LB 배지 중에 0.5 내지 0.6의 OD600의 밀도까지 신선한 에스케리키아 콜라이의 하룻밤 배양물로부터 성장시킨다. 그 다음, 세포를 얼음 상에 두고, 저온 원심분리하고, 0℃의 물 중에 재현탁화시키고, 냉수에 세척하고, 2x1011개 세포/mL의 농도로 희석한다. 그 다음, 40 μL의 세포를 수 중 10 pg의 플라스미드와 혼합하고, 전기천공시킨다. 그 다음, 세포를 바로 SOC 배지 중에 37℃에서 30 내지 60분 동안 성장시키고, 플레이팅한 다음, 표준 배양 조건에서 성장시킨다. 그 다음, pLC16-4 플라스미드를 함유하는 및 이를 함유하지 않는 에스케리키아 콜라이 C600 유래의 에스케리키아 콜라이 ADAS를 실시예 12의 프로토콜에 따라 제조하고, 실시예 13에 따라 정제한다.
B.pfkA 및 tpi를 과발현하는 ADAS와 보통의 ADAS의 비교
pLC16-4 플라스미드를 함유하는 및 이를 함유하지 않는 에스케리키아 콜라이 C600의 활성을 실시예 15의 프로토콜을 사용하여 측정한다.
실시예 23. 특수 배양 조건에서 합성된 ADAS에서의 증가된 활성에 대한 검정
배양 조건은 시험관 내에서 세포의 성장, 성숙, 생존을 현저하게 변경시킬 수 있다(문헌[Wang D, Yu X, Gongyuan W. Pullulan production and physiological characteristics of Aureobasidium pullulans under acid stress. Appl Microbiol Biotechnol. 2013; 97:8069-77]). 본 실시예에는 세포내 ATP를 증가시키는 화합물 및 조건의 스크리닝이 기재된다. 비-배타적으로, 에스케리키아 콜라이를 초기에 pH, 산소 농도 및 인가되는 전압에 중점을 두고 사용한다. 이는 세포 ATP 수준을 조정하기 위한 새로운 배지 첨가제를 확인하기 위한 보충적 방법을 나타낸다.
ADAS를 실시예 12에 기재된 방법을 사용하여 합성하고 단리한다. 단리 후에, ADAS를 다양한 배지 조건 하에 배양하고, ATP 생성 속도를 제조처의 설명에 따라 Seahorse(아질런트, ATP 검정 키트)를 사용하여 측정한다. 0.1 mM, 0.3 mM, 0.4 m, 1 mM 또는 10 mM 글루코스를 기준선으로서 사용한다.
A.낮은 pH에서의 ADAS의 합성
ADAS 성장 배지의 pH를 시트르산 및 NaOH의 적가를 사용하여 조정한다. pH 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5의 배지를 사용하고, 세포내 ATP를 Seahorse ATP 검정을 사용하여, 즉시, 그리고 1, 4, 6, 10시간 후에 측정한다.
본 발명자들의 결과는 더 낮은 pH, 예컨대 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5의 조건에서 상승된 ATP 공급을 보여준다.
B.저산소 환경에서의 ADAS의 합성
저산소 배지 조건을 모방하기 위하여, 배지를 다양한 기체 혼합물(1, 5, 7.5, 10,15, 20.95% O2)에서 24시간 동안 인큐베이션시킨 후 ADAS에 노출시킨다. 그 다음, 에스케리키아 콜라이 ADAS를 사전-제어된 배지에서 배양하고, 세포내 ATP를 Seahorse ATP 검정을 사용하여, 즉시, 그리고 2 시간 후에 측정한다.
본 발명자들의 결과는 1, 5, 7.5, 10, 15, 20.95%의 산소 농도를 갖는 배지가 2시간 후에 증가된 세포내 ATP를 야기하는 것을 보여준다.
C.인가되는 교류 전기장을 사용한 ADAS의 합성
1 내지 100 V/cm의 세기의 진폭을 갖는 외부 인가되는 교류 전기장을 에스케리키아 콜라이 배양을 위해 개발된 이전에 정의된 프로토콜(문헌[Zrimec et al, CELL. MOL. BIOL. LETT. Vol. 7. No. 1. 2002])에 따라 자극 세포 내의 표준 LB 배지 중에 성장시킨 ADAS에 인가한다. 요약하여, 2개의 병렬 백금 전극(0.75 cm2 활성 면적, 2 mm 이격됨) 사이에 전압을 확립하고, 주파수 발생기(메텍스(Metex) MS-9150)를 사용하여 전기장을 인가한다. 시료를 저온으로 유지하고(자극 동안 5℃ 미만), DC 구성요소의 부재 및 50 Hz 내지 1000 kHz 범위의 주파수와 함께 전극 전압의 크기를 0 V로부터 100 V까지 달라지게 한다.
결과는 제조처에 의해 권고되는 바와 같이 BacTiter Glo 검정(프로메가)을 사용하여 세포내 ATP에 의해 측정되는 바와 같이, ADAS에서의 드 노보 ATP 생성이 가장 높은 전압의 시료에서 증가되는 것을 나타낸다.
실시예 24. 편모 및 다른 비-필수 특징부가 제거된 ADAS에서의 증가된 활성에 대한 검정
에스케리키아 콜라이 ADAS에서 비-필수 구조적 특징부의 존재를 최소화하기 위하여, 부모 세포주를 성장, 분열 및 대사에 필수적인 유전자를 함유하는 단순화된 게놈을 사용하여 합성한다. 연구는, 이러한 "필수" 게놈을 사용하여 합성된 에스케리키아 콜라이가 생존하고 분열할 뿐만 아니라, 심지어 일부 유용한 특성을 제공할 수 있는 것을 보여주었다. 문헌[Posfai et al., Science, 2006]은 이들 균주가 다른 미변형된 균주에서 불안정한 플라스미드 및 재조합 유전자의 높은 전기천공 효율 및 정확한 전파를 보이는 것을 보여주었다. 이에 따라, 이들 변형된 균주는 비필수 구조가 없는 에스케리키아 콜라이 ADAS를 초래할 뿐만 아니라, 미변형된 부모 세포주 유래의 것들에 비하여 향상된 활성을 갖는다.
문헌[Arigoni et al., Nature Biotech., 1998] 등에 기재된 바와 같이, 게놈-기반의 접근법을 사용하여, 에스케리키아 콜라이 게놈 내의 필수 유전자를 확인한다. 요약하여, 에스케리키아 콜라이 게놈과 다른 박테리아의 게놈의 비교는, 성장, 성숙 및 분열에 수반되는 주요 유전자가 확인되게 한다. 계통적 유전자 파괴에 의해, 생존 및 분열에 수반되는 주요 유전자를 확인한다. 이에 더하여, 게놈 구조를 최소의 게놈을 안정화시키기 위하여 인 실리코 방법을 사용하여 분석한다. 게놈의 큰 영역의 결실을 CRISPR-Cas9 및 파지-매개의 결실을 사용하여 행한다. 흔적(scar)-부재 결실을 생성하기 위하여, 문헌[Tear et al., Applied Biochem Biotech, 2015]으로부터 조정된 프로토콜을 사용한다. 추가로, 성장 배지는 이러한 유전자 결실의 효과를 차폐하거나 향상시킬 수 있으며, 효과를 완전히 시험하기 위하여 이들 균주를 다양한 배지 상에 성장시키는 것이 필요할 것이다(문헌[Ish-Am et al., PLoS One, 2015]). 특정 기능(예를 들어, 수송체, 구조)에 필수적인 다양한 수의 비-필수 유전자를 갖는 균주의 라이브러리를 생성한다.
A.편모 결실을 이용한 이. 콜라이 ADAS의 생성
에스케리키아 콜라이 MG1655(CGSC 6300)는 에스케리키아 콜라이 유전학적 스톡 센터로부터 수득되며, 이는 flhDC 프로모터에 IS1 요소가 결여된 야생형 균주이다. 이들 돌연변이체는 비운동성이며, 편모 생합성의 중요한 조절인자인, FlhD4C2를 인코딩하는 flhDC 오페론의 조절 영역 내에 위치한 IS1 요소의 바로 하류에서 시작하여 다양한 길이의 결실을 갖는다. ADAS를 실시예 12에 기재된 프로토콜을 사용하여 이들 세포로부터 합성하고, 실시예 13의 방법을 사용하여 정제한다.
B.핌브리아 및 TXSS 결실을 갖는 에스케리키아 콜라이 부모 세포주의 생성
핌브리아 및 TXSS 단백질을 인코딩하는 유전자 내에 파괴를 갖는 다중의 부모 에스케리키아 콜라이 세포주를 퀵 앤드 이지(Quick and Easy) 에스케리키아 콜라이 유전자 결실 키트(진 브릿지즈(Gene Bridges))를 사용하여 생성한다. 이 키트는 Red/ET 재조합을 사용하여, 파지-유래된 단백질 쌍인, RecE/RecT 또는 Redα/Redβ 중 어느 하나를 발현하는 에스케리키아 콜라이에서 상동성 재조합에 의해 정밀하게 변경되는 DNA 분자를 표적화한다. RecE 및 Redα는 5'- 3' 엑소뉴클레아제이며, RecT 및 Redβ는 DNA 어닐링 단백질이다. 요약하여, 관심 유전자를 표적화하는 PCR 생성물을 pRedET 발현 플라스미드 내에 삽입하고, 변형시킬 에스케리키아 콜라이 균주를 제조처의 지침에 따라 형질전환시킨다. Red/ET 발현을 L-아라비노스의 첨가 및 온도 변화에 의해 유도한다. Red/ET-매개의 재조합은 반복 카세트의 삽입에 의해 표적 유전자좌를 파괴하고, 결과는 PCR을 사용하여 입증된다. ADAS를 실시예 12에 기재된 프로토콜을 사용하여 이들 세포로부터 합성하고, 실시예 13의 방법을 사용하여 정제한다.
C.편모, 핌브리아 및 TXSS를 갖는 및 이를 갖지 않는 에스케리키아 콜라이 ADAS의 비교
ADAS를 상기 부모 세포주로부터 생성하고, 활성을 실시예 15의 방법을 사용하여 측정한다.
실시예 25. 광합성 능력을 갖는 ADAS에서의 증가된 활성에 대한 검정
본 실시예에는 모델 단백질로서 다양한 로돕신을 사용하여, 광 에너지를 수집할 수 있는 단백질을 발현하는 플라스미드의 부가를 통해 광을 PMF 또는 ATP로 전환시키는 능력을 갖는 고활성 ADAS의 합성이 기재된다.
A.프로테오로돕신 발현 에스케리키아 콜라이 ADAS의 합성
프로테오로돕신(PR)을 발현하는 에스케리키아 콜라이 세포주를 문헌[Walter et al., PNAS, 2007]에 의해 기재된 프로토콜을 사용하여 생성한다. 요약하여, 에스케리키아 콜라이 세포 내에서 SAR86 γ-프로테오박테리아 PR-변이체를 함유하는 플라스미드를 T7-프로모터 하에 발현시킨다. 세포를 T 브로쓰에서 성장시키고, PR 발현을 1 mM 이소프로필 β-D-티오갈락토시드를 사용하여 유도한다. ADAS를 실시예 12의 방법을 사용하여 PR-함유 에스케리키아 콜라이 세포 및 비-PR 함유 에스케리키아 콜라이 세포로부터 합성하고, 일부의 ADAS를 70 μmol 광자/(m^2 s) 광에 대한 노출 하에 정제하고, 일부를 암 중에 정제하여, 실시예 13의 방법에 따라 정제한다.
레티날에 필요한 유전자 및 PR을 발현하는 에스케리키아 콜라이 세포를 문헌[Kim et al, Microb Cell Fact, 2012]의 프로토콜의 조정 후에 생성한다. 요약하여, 논문에서의 pAcyc-RDS 플라스미드를 상업적으로 합성하고, 제조처의 설명(NEB, 프로토콜 C2527)에 따라 화학적 적격 에스케리키아 콜라이 BL21(DE3) 내에 트랜스펙션시킨다. 요약하여, 세포를 얼음 상에서 천천히 해동시키고, 1 pg 내지 100 ng의 플라스미드 DNA를 세포의 튜브에 첨가하고, 세포를 4 내지 5회 플릭킹하고(flicked), 얼음 위에서 30분 동안 휴지시키고, 42℃에서 10초 동안 열-충격을 가하고, 얼음 위에 5분 동안 두고, SOC를 혼합물에 첨가하고, 세포를 37℃에서 60분 동안 배양한다. 그 다음, 세포를 선택을 위하여 클로람페니콜 플레이트 상에 플레이팅하고, 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지 중에 성장시킨다. ADAS를 실시예 12의 방법을 사용하여 PR-함유 에스케리키아 콜라이 세포 및 비-PR 함유 에스케리키아 콜라이 세포로부터 합성하고, 일부의 ADAS를 70 μmol 광자/(m^2 s) 광에 대한 노출 하에 정제하고, 일부를 암 중에 정제하여, 실시예 13의 방법에 따라 정제한다.
B.ADAS를 함유하는 프로테오로돕신과 ADAS를 함유하는 비-프로테오로돕신의 비교
PR을 함유하는 및 이를 함유하지 않는, 암 또는 광 중에 배양되는 에스케리키아 콜라이의 활성을 실시예 15의 프로토콜을 사용하여 측정한다.
C.ADAS 및 레티날을 함유하는 프로테오로돕신과 ADAS를 함유하는 프로테오로돕신의 비교
레티칼을 갖는 또는 이것을 갖지 않는, 암 또는 광 중에 배양되는 PR-함유 에스케리키아 콜라이의 활성을 실시예 15의 프로토콜을 사용하여 측정한다.
실시예 26. 안정한 핵산 및 단백질 페이로드를 갖는 에스케리키아 콜라이 ADAS를 생성하기 위한 보충적 방법
ADAS 내의 안정한 세포내 RNA(예를 들어, miRNA, siRNA 및 RNA 압타머)는 핵산이 세포질 내의 엔도뉴클레아제에 의해 용이하게 분해될 수 있기 때문에 새로운 RNA 전달 기술의 생성을 향한 중요한 단계이다. 추가로, 숙주 세포에의 유입시에, tRNA-RNA 스캐폴드는 이어서 세포 tRNA의 3' 말단을 한정하도록 기능하는 세포의 tRNase Z에 의한 절단 시에 5′ tRNA 및 3′ 프레(pre)-miRNA로 정밀하게 분리된다. 최근에 개발된 프로토콜(문헌[RNA. 2015 Sep; 21(9): 1683-1689.])을 사용하여 TRNase Z는 가이드 RNA-tRNA 융합체를 절단하기 위해 사용될 수 있다. 본 실시예에는 tRNA로부터 유래되는 비-코딩 RNA의 스캐폴드가 예시적인 예로서 에스케리키아 콜라이 내에서 발현되는 것이 기재되지만, 다른 핵산, 단백질 및 분자가 또한 유사한 스캐폴드-기반의 접근법을 사용하여 ADAS 내에서 안정화될 수 있다.
A.tRNA 안정화된 재조합 RNA 페이로드를 갖는 에스케리키아 콜라이 ADAS
요약하여, 에스케리키아 콜라이 ADAS를 실시예 12 및 13에 의해 기재된 방법을 사용하여 생성하고 정제한다. 이전에 개발된 프로토콜에 기초하여, 2가지 유형의 tRNA를 사용한다: 인간 tRNALys3 및 에스케리키아 콜라이 tRNAMet(문헌[Nat. Methods, Ponchon 2007]). 둘 모두는 널리 특성화되고, 재조합적으로 발현된 바 있다. 이론상으로, 스템 모티프로 종결된 임의의 구조화된 RNA가 포함될 수 있다. 이들은 압타머, lncRNA 및 리보자임을 포함한다. 요약하여, 각각의 측 상에 tRNA 삽입물이 측접하는 관심 RNA 서열을 함유하는 플라스미드를 생성한다. 본 실시예에서, GFP를 인코딩하는 mRNA를 사용한다.
tRNA-mRNA 구축물을 함유하는 ADAS를 합성하고, RNA 및 단백질의 반감기를 측정한다. 요약하여, 세포를 웰 플레이트에 전달하고, 상이한 시점에 용해 완충제를 사용하여 용해시키고, RNA SEQ를 1분, 10분, 50분, 100분, 200분, 500분, 1000분, 2000분 및 최대 1000000분을 포함하는 다양한 시점에 수행하고, 상대 존재비를 사용하여 안정성을 평가한다. 추가로, 정의된 수의 세포를 용해시키고, 플레이트 판독기를 통해 형광을 측정함으로써 GFP 발현을 동일한 시점에 관찰한다.
실시예 27. 에스케리키아 콜라이 ADAS로부터 리보뉴클레아제의 제거에 의한 카고 안정성의 증가
RNase E는 RNA 분해의 일반적인 개시인자이며, 에스케리키아 콜라이 내의 염색체 결실은 에스케리키아 콜라이 균주의 콜로니-형성 능력(CFA)을 파괴한다. 본 실시예는 RNAse E를 조건성 프로모터의 제어 하에 둠으로써 향상된 단백질 및 RNA 안정성이 달성될 수 있는 것을 보여준다.
A.RNase E 결실을 갖는 에스케리키아 콜라이 부모 세포주의 합성
araBAD 프로모터의 제어 하에 플라스미드-전달 Eco-rne 유전자를 삽입함으로써 RNase E를 인코딩하는 Eco-rne의 염색체 결실을 갖는 에스케리키아 콜라이 부모 세포주를 생성하고, 이를 사용하여 에스케리키아 콜라이가 아라비노스의 존재 하에 RNase E를 합성할 수 있게 한다. 에스케리키아 콜라이 내의 플라스미드 통합 방법은 이전의 프로토콜로부터 유래된다(문헌[Tamura et al. PLoS One, 2017]).
B.RNase-부재 ADAS의 합성
ADAS를 염색체 Eco-rne가 결여된 부모 에스케리키아 콜라이 세포주로부터 생성한다. 실시예 12 및 13에 기재된 바와 같이, ADAS 합성 및 정제 이전에, 잔류 RNase E의 분해를 가능하게 하기 위하여, 부모 세포주를 1, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 48시간 또는 3, 4, 5, 10, 14일 동안 아라비노스-부재 배지 중에서 성장시킨다.
C.대사적 활성 및 mRNA 안정성 지수
RNase-부재 및 미변형된 ADAS를 LB 브로쓰 중에 성장시키고, ATP 생성을 제2시간, 제12시간, 제1일, 제7일 및 제30일에 Seahorse XF(아질런트, ATP 속도 검정)를 사용하여 측정한다. RNase 부재 ADAS는 미변형된 ADAS와 유사한 수준의 대사를 보인다. 두 ADAS 세포주 모두는 GFP를 함유하는 플라스미드를 사용한 형질전환 후에 GFP를 발현한다. GFP 발현을 형광 영상화를 사용하여 측정하고, mRNA 수준을 RNAseq를 사용하여 측정한다.
D.에스케리키아 콜라이 ADAS로부터의 리보뉴클레아제의 저해
에스케리키아 콜라이 ADAS내의 기능의 생성 및 유지에 필수적인 RNA의 분해를 저해하기 위하여, 존재하는 리보뉴클레아제를 저해할 수 있다. 이를 위하여, RNase E의 소분자 저해제를 사용한다. RNAse E는 에스케리키아 콜라이 내의 RNA 붕괴의 일반적인 개시인자로 여겨지며, 데그라다좀(degradasom) 복합체를 위한 플랫폼을 형성한다. N-말단은 이 효소의 촉매적 부분을 형성하며, 이와 같이, 소분자에 의해 저해될 수 있다.
온전한 에스케리키아 콜라이를 위해 이전에 개발된 소분자 스크리닝 방법(문헌[Kime et al., Sci. Rep., 2015])을 조정하여, 에스케리키아 콜라이 ADAS에서 RNAse E의 저해를 평가하고, 저해를 위한 최적의 후보물질을 시험관 내에서 시험한다. GFP를 시간이 지남에 따라 정량화하는 상기 기재된 시료 방법을 사용하여 안정성 지수를 계산한다.
실시예 28. Tat 신호 펩티드를 갖는 바실러스 서브틸리스 ADAS의 합성
본 실시예에는 채널-유사 분비 시스템을 통해 펩티드를 분비하기 위해 사용될 수 있는 ADAS, 및 더 긴 기간에 걸쳐 더 많은 단백질을 분비할 수 있는 고활성 바실러스 서브틸리스 ADAS가 기재된다.
A.GFP를 분비하는 바실러스 서브틸리스 ADAS의 합성
바실러스 서브틸리스 ADAS를 "카고"가 세포질 공간 내의 유출을 위해 태깅되는 변형된 방법(문헌[Feucht et al. Microbiology. 2005 Jun;151(Pt 6):2053-64.])을 사용하여 합성한다. 대안적으로, 바실러스 서브틸리스 ADAS를 표적화된 divIVA1 돌연변이를 통해 생성하지만(문헌[JH Cha, GC Stewart - Journal of bacteriology, 1997 - Am Soc Microbiology]), 다르게는 실시예 12 및 실시예 13에 이전에 기재된 바와 같이 수집하고, 정제하고, 특성화한다. Tat 분비 시스템 신호를 표적 단백질 상으로 융합시켜, 생성 및 ADAS 세포질로부터 세포외 공간 내의 유출을 유도한다. 이전에 기재된 변형된 프로토콜(문헌[Wickner et al. Science 2005, B. C. Berks, Mol. Microbiol. 22, 393, 1996])을 사용하여, TAT 신호 펩티드를 PhoD Tat 신호 펩티드에 융합되고, 서브틸리스의 외측으로 분비되는 녹색 형광 단백질(GFP) 내에 혼입시킨다. 세포외 GFP를 형광 현미경법을 사용하여 측정한다.
B.고활성 바실러스 서브틸리스 ADAS의 합성
확인된 바실러스 서브틸리스 버전의 유전자, 프로모터 및 플라스미드의 사용을 통해 바실러스 서브틸리스를 위하여 실시예 20 내지 25로부터의 방법을 조정함으로써 고활성 바실러스 서브틸리스 ADAS를 합성한다. 파트 a)로부터의 TAT-신호 융합된 GFP 플라스미드를 또한, 바실러스 서브틸리스 내에 트랜스펙션시켜, GFP의 분비를 야기한다. 파트 a) 및 파트 b)로부터 합성된 ADAS를 제1시간, 제2시간, 제4시간, 제8시간, 제12시간, 제24시간, 제48시간, 제36시간 및 제72시간에 단백질 분비에 대하여 시험한다.
실시예 29. 종양 억제를 위한 면역조절성 ADAS
본 실시예에는 숙주의 면역계에 특정 효과를 갖는 카고를 함유하고 이를 전달할 수 있는 고활성 ADAS가 기재된다. 이 개념의 유일한 또는 제한하는 구현예가 아닌 모델로서, 특정 사이클릭 디뉴클레오티드(CDN)를 분비하는 고활성 바실리스 서브틸리스 ADAS를 생성한다. 특히, ADAS는 포유동물 세포의 RECON(NF-κB 제어 환원효소)을 통해 STING 경로에 관여하는 박테리아 뉴클레오티드 c-디-AMP를 특이적으로 분비한다(문헌[Mol Cell. 2008;30:167-78]).
바실러스 서브틸리스 ADAS를 실시예 28에 이전에 기재된 바와 같이 합성한다. 요약하여, 문헌[(MacFarland et al: Immunity. 2017 March 21; 46(3): 433-445.)]에 기재된 변형된 검정을 사용하여, 인간 말초 혈액 단핵 세포를 mL당 (1E6, 1E7, 1E8, 1E9, 1E10)개의 농도의 바시러스 서브틸리스 ADAS에 (10, 20, 30, 60, 120,1200분) 동안 노출시킨다. 다음으로, 세포를 용해시키고, PCR을 사용하여 hPBMC 내의 면역자극 유전자, 예컨대 IRF3-, IFN- 및 NF-κB-의존적 유전자의 배수 증가를 결정한다.
실시예 30. 슈도모나스 푸티다 ADAS 및 고활성 ADAS의 합성
본 실시예에는 모델 유기체로서 슈도모나스 푸티다를 사용한, T6SS 발현 및 식물 편리공생 박테리아로부터의 ADAS 및 고-활성 ADAS의 합성이 기재되어 있다.
A.슈도모나스 푸티다 ADAS의 합성
슈도모나스 푸티다 KT2440을 ATCC로부터 수득하고, 제조처의 설명에 따라 배양한다. 유도 가능한 pLac-1k-J23107 프로모터 하에 슈도모나스 푸티다 ftsZ를 과발현하는 플라스미드(문헌[Cook et al., J. Ind. Microb. Biotech., 2018])를 상업적 벡터 생성 회사에 의해 pBBR1MCS-2 백본으로부터 구축한다. 문헌[Chen et al, Chin. J. Appl. Env. Bio., 2010]에 기재된 프로토콜에 따라 박테리아 내의 플라스미드 DNA의 전기천공법에 의해 슈도모나스 푸티다 ADAS 부모 세포주를 합성한다. 요약하여, 슈도모나스 푸티다 KT2440을 0.6 내지 0.75의 OD600으로 성장시키고, 4℃에서 펠렛화시키고, 3 mmol/L HEPES 중에 세척하고, 바이오-라드 유전자 펄서(Gene Pulser) 또는 동등한 기계에서 전기천공시키고, SOC 배지를 사용하여 재구성하고, 30℃에서 인큐베이션시킨다. 그 다음, 세포를 선택을 위하여, LB 카나마이신 아가 상에 플레이팅하고, ADAS 형성을 유도하기 위하여 IPTG의 첨가와 함께 제조처의 설명에 따라 성장시킨다. 그 다음, ADAS를 실시예 13의 방법을 사용하여 정제한다.
B.T3SS 및 편모의 제거를 통한 고활성 슈도모나스 푸티다 ADAS의 합성
슈도모나스 푸티다 EM42 및 EM383 중 어느 하나를 수득하거나, 슈도모나스 푸티다 KT2440의 또 다른 편모-부재 유도체를 문헌[Martinez-Garcia et al, Microb. Cell. Fact., 2014] 및 문헌[Martinez-Garcia et al, Environ. Microbiol., 2013]의 절차에 따라 합성한다. 요약하여, PP4329 및 PP4297 유전자의 750-bp 상류(TS1) 및 816-bp 하류(TS2) 영역을 PCR 증폭시키고, TS1 및 TS2 단편을 오버랩 PCR을 통해 라이게이션시킨다(문헌[Horton et al., Gene, 1989] 참조). 완전한 TS1-TS2 단편을 EcoRI 및 BamHI을 사용하여 분해하고, 플라스미드 pEMG(진뱅크: JF965437.1) 내에 라이게이션시켜, 플라스미드 pEMG-flagella를 생성한다. 플라스미드를 에스케리키아 콜라이 DH5α λpir 내에 형질전환시키고, 문헌[Martinez-Garcia and de Lorenzo, Meth. Mol. Bio., 2012]에 기재된 바와 같이 3-메틸벤조에이트 프로모터 하의 I-SceI 메가뉴클레아제를 사용하여 제조된 슈도모나스 푸티다 KT2440 내에 전기천공시킨다. 양성 동시-통합물을 TS1-TS2 단편의 PCR 증폭을 통해 선택하고, 15 mM 3-메틸벤조에이트를 사용하여 pSW-I 플라스미드로부터 유래된 I-SceI 효소의 유도를 통해 분해한다. 배양물을 LB-Ap500 아가 플레이트 상으로 플레이팅하고, 결실을 PCR에 의해 확인한다.
ADAS를 파트 a)에 기재된 방법을 사용하여 생성된 균주로부터 생성한다.
C.고-T6SS 발현 ADAS
문헌[Bernal et al, ISME J., 2017]에 나타낸 바와 같은 K1 T6SS를 그의 천연의 프로모터를 사용한 상업적 유전자 합성을 통해 amp 내성을 갖고, 천연 프로모터가 pLac-1k-J23107 프로모터(문헌[Cook et al., J. Ind. Microb. Biotech., 2018])에 의해 대체된 pBBR1 기원 벡터 내에 클로닝한다. 그 다음, 플라스미드를 상기 기재된 방법을 사용하여 ADAS-생성 슈도모나스 푸티다 세포주 내에 트랜스펙션시키고, 앰피실린 및 카나마이신 함유 LB 배지 중에 성장시키고, ADAS를 실시예 13의 방법을 사용하여 정제한다.
D.ADAS 상의 T6SS의 수의 결정
VgrG 삼량체에 대한 양자점(quantum-dot) 표지된 항체를 사용하여 ADAS의 표면 상의 활성 T6SS 분비 시스템을 표지한다. 이를 공초점 현미경법에 의해 영상화하고, 활성 T6SS를 반점의 존재에 의해 수동으로 계수한다. 막 상의 T6SS 사이의 평균 거리를 계산하고, 제곱을 구하고, T6SS마다 커버되는 표면적으로 처리한다.
실시예 31. 항미생물제 및 식물 보호제로서의 T6SS-발현 ADAS
슈도모나스 푸티다는 잠재적인 식물 병원체의 T6SS 공격으로 인하여 식물 보호 활성을 갖는 것으로 입증된 식물에서 관찰되는 박테리아이다. 본 실시예에는 모델 박테리아로서 에스케리키아 콜라이를 사용하고, 모델 식물 병원체로서 잔토모나스 켐페스트리스(X. campestris)를 사용하여, T6SS 시스템을 사용해 박테리아를 용해시킬 수 있는 슈도모나스 푸티다 ADAS가 기재된다.
A.에스케리키아 콜라이를 사멸시키기 위한 슈도모나스 푸티다 ADAS의 이용
슈도모나스 푸티다 ADAS 및 고활성 ADAS를 실시예 30의 방법을 사용하여 합성한다. ADAS를 사용하여, 문헌[Bernal et al., ISME J., 2017]으로부터 조정된 프로토콜을 사용해 에스케리키아 콜라이 세포를 용해시킨다. 요약하여, 경쟁 검정을 LB 플레이트 상에서 수행한다. 에스케리키아 콜라이를 PBS 중에 1의 OD600으로 배양하고, 플레이트 상의 슈도모나스 푸티다 ADAS와 1:1 비로 혼합한다. 플레이트를 또한, 어떠한 슈도모나스 푸티다 ADAS도 없이 성장시킨다. 플레이트를 30℃에서 5시간 동안 인큐베이션시키고, 항생제 선택에서 콜로니-형성 유닛을 계수한다.
B.잔토모나스 캄페스트리스를 사멸시키기 위한 슈도모나스 푸티다 ADAS의 이용
잔토모나스 캄페스트리스 세포를 플레이트 상에 24시간 배양한 것을 제외하고, 파트 b)에 기재된 바와 동일한 검정을 사용하여 슈도모나스 푸티다 ADAS를 사용해, 잔토모나스 캄페스트리스 세포를 용해시킨다. 동일한 검정을 시행하여, 슈도모나스 푸티다 ADAS가 잔토모나스 캄페스트리스 콜로니의 수를 감소시키며, 고활성 ADAS가 그 수를 더욱 감소시키는 것을 입증한다.
C.식물 보호제로서의 슈도모나스 푸티다 ADAS의 이용
문헌[Bernal et al., ISME J., 2017]으로부터 조정된 프로토콜에 따라 식물을 손상으로부터 보호하기 위하여 슈도모나스 푸티다 ADAS를 사용한다. 요약하여, 식물계 내 경쟁 검정을 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 잎 내의 박테리아의 침윤에 의해 수행한다. 잔토모나스 캄페스트리스의 밤샘 배양물을 PBS 중에 0.1의 OD600으로 조정한다. 슈도모나스 푸티다 ADAS를 박테리아와 1:1 비로 혼합한다. 대략 100 μL 부피를 1개월 지난 잎의 뒷면 상으로 침윤시키고, 침윤 영역을 표시한다. 식물 챔버(23℃, 16시간 광) 내에서의 24시간의 인큐베이션 후에, 콜로니-형성 유닛을 결정한다. 침윤 영역으로부터 잎의 섹션을 절단하고, PBS 중에 균질화시키고, 순차적으로 단계 희석한다. 잎을 형광 현미경법에 의해 가시화시킨다. 괴사의 평가는 잎의 조직 색상의 가시적인 변화를 사용하여 문헌[Katzen et al., J. Bacteriol, 1998]에 따른 잎의 착색에 기초하며, 이는 말기에 잎의 완전한 부식까지 녹색에서 황색(황백화), 황색에서 갈색 및 잎의 흑변(괴사)으로 변할 수 있다.
실시예 32. 모델 항진균 ADAS로서의 세라티아 마르세슨스 ADAS
세라티아 마르세슨스는 이펙터 Tfe1 및 Tfe2의 T6SS 전달을 통해 진균 세포를 사멸시키는 것이 최근에 입증된 막대-형상의 그람 음성 박테리아이다(문헌[Trunk et al., Nat Microb, 2018]). 본 실시예에는 진균의 건강을 감소시키기 위하여 세라티아 마르세슨스 ADAS를 사용하는 것이 기재된다.
A.에스. 마르세센스 ADAS의 합성 및 정제
슈도모나스 ampR 프로모터 PampR 및 세라티아 마르세슨스 ftsZ 유전자를 함유하는 플라스미드를 문헌[Yan and Fong, Appl. Microbiol. Biotech., 2017]에서의 PQY38 플라스미드와 유사한 방식으로 합성 RBS를 갖는 pUC19 백본 내에 도입한다. 플라스미드를 문헌[Yan and Fong, Appl. Microbiol. Biotech., 2017]에서의 방법에 따라, 전기천공법을 사용하여 카에노랍디티스 유전학 센터(Caenorhabditis Genetics Center)로부터의 세라티아 마르세슨스 Db10 내에 도입한다. 요약하여, 세포를 저온 원심분리기를 통해 냉수 중에 저온 세척하고, 냉수 중에 재현탁화시키고, 플라스미드 DNA를 첨가하고, 혼합물을 전기천공시킨다. 이후에, 세포를 30℃에서 60분 동안 1 mL SOC 배지 중에 성장시킨 다음, LB amp 아가 플레이트 상에 플레이팅한다. 그 다음, ftsZ를 갖는 세라티아 마르세슨스 세포를 30℃에서 M9 배지 0.1% 효모 추출물, 2% 글루코스 및 200 mg/L 앰피실린 중에 성장시킨다. 그 다음, ADAS를 실시예 13의 방법을 사용하여 정제한다.
B.진균을 사멸시키는 세라티아 마르세슨스 ADAS의 능력의 입증
문헌[Trunk et al., Nat Microb, 2018]의 검정과 유사한 동시-배양 검정을 사용하여 항진균 활성을 측정한다. 부모 세포주, ADAS 및 표적 세포를 광학 밀도를 사용하여 정규화시킨다. 표적 세포 및 어느 하나의 부모 세포주, ADAS 또는 대조군 에스케리키아 콜라이를 1:1 부피비로 혼합하고, 12.5 μl의 혼합물을 고형 SC + 2% 글루코스 배지 상에 스폿팅한다. 배양물을 2, 7 및 24시간 동안 인큐베이션시키고, 박테리아 및 ADAS를 제거하기 위한 스트렙토마이신 보충된 YPDA 배지 상에서의 단계 희석 및 생존 가능 세포 계수에 의해 생존 진균 세포를 정량화한다. 진균 세포를 또한 실시간으로 DIC를 사용하여 가시화시켜, 세포 성장 및 분열을 측정한다. 에스케리키아 콜라이를 동시-배양에서 음성 대조군으로서 사용한다. 세라티아 마르세슨스 부모 세포주 및 ADAS 둘 모두는 7시간의 동시-배양 후에 진균 세포를 사멸시킬 수 있다.
실시예 33. 과발현된 T3SS를 통한 인간 소화관 상피 세포에의 단백질의 전달
포유동물 세포에 세포내 단백질을 전달하는 능력은 인간 치료제에서 다양한 응용을 가능하게 할 수 있다. 본 실시예에는 이종 단백질이 ADAS T3 분비 시스템을 사용하여 인간 소화관 상피 세포에 전달될 수 있는 것이 기재된다. 이 모델 구현예는 임의의 수의 동물 및 식물 응용에 적용될 수 있으며, 여기서, 세포내 단백질은 표적 유기체에 현저한 효과를 가질 수 있다.
이 실험에서, 인간 소화관 상피 세포를 다양한 농도의 ADAS(mL당 1E6, 1E7, 1E8, 1E9, 1E10개 ADAS)에 노출시키고, 세포내 GFP를 형광 현미경법을 사용하여 상피 세포에서 측정한다. 다양한 조건에 있어서, GFP에 대해 양성인 세포의 수를 총 세포의 수로 나누어, 전달 및 투여 효율을 계산한다.
Caco-2 포유동물 세포주를 ATCC에 따라 배양한다. 세포를 문헌[Huang and Bystroff, Biochemistry, 2009]에 기재된 바와 같이 절단된 GFP(tGFP)를 발현하도록 변형시킨다. 이 절단된 형태의 GFP는 발현되고, 정확하게 폴딩되지만, 소실된 β-가닥이 공급될 때까지 형광이 아니다. 에스케리키아 및 ADAS를 각각 실시예 12 및 13에 기재된 바와 같이 생성하고 정제한다. 요약하여, 그들을 37℃에서 20%의 우태아혈청이 보충된, 비-필수 아미노산, 2 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨 및 1500 mg/L 중탄산나트륨을 함유하는 ATCC의 커스텀(custom) 이글스(Eagles) 최소 필수 배지(카탈로그 번호 30-2003)를 갖는 코닝® 조직 배양 플라스크(T-25, 75, T-150 또는 T255, 카탈로그 #430641) 상에서 배양한다. 전달 검정을 위하여 Caco-2 세포를 수거하기 위하여, 세포를 이가 양이온(Ca2+ 및 Mg2+)이 없는 PBS를 사용하여 세척하고, 2 내지 3 mL의 0.25%(w/v) 트립신 및 0.05 mM-EDTA 용액을 10 내지 15분 동안 세포 표면에 첨가하고, 효소 활성을 6 내지 8 mL의 완전한 성장 배지를 사용하여 켄칭시킨다. 수거 후에, 세포를 자동화 세포 계수기(카운테스(Countess) II, 써모 피셔) 및 생/사 염색(칼세인(Calcein)-생, 에티디움 동종이량체-사)을 사용하여 계수한다.
A.시겔라 SPI-1으로부터의 T3SS를 이용한 이. 콜라이 ADAS의 합성 및 정제
에스케리키아 콜라이 ADAS를 실시예 12에 기재된 방법을 사용하여 제조한다. ADAS 표면 상의 T3SS의 존재비를 증가시키기 위하여, HilA를 코딩하는 플라스미드를 도입한다. HilA는 SPI-1 T3SS를 조절하며, 이는 존재하는 프로토콜(문헌[Bajaj et al. Molecular Microbiology (1995) 18(4), 715-727])로부터 조정된 것이다. ADAS를 실시예 13에 기재된 방법을 사용하여 제조한다. T3SS를 시각적으로 검사하고, 면역형광 현미경법 및 TEM을 사용하여 계수한다. 단리된 고순도 T3SS 발현 ADAS와 비-정제된 T3SS 발현 ADAS의 비교 이후.
B.단백질-분비 시스템 태그 융합
기능적 T3SS를 사용한 단백질 분비를 가능하게 하기 위하여, GFP β-가닥을 이전에 기재된 플라스미드 설계 방법을 사용하여 T3SS 분비 태그인, SopE의 처음 104개 아미노산에 융합시킨다(문헌[Evans, et. al. J. Virol., Feb. 2003, p. 2400-2409]). 플라스미드를 부모 에스케리키아 콜라이에서 발현시키고, 이후의 ADAS는 절단된 SopE-GFP 하이브리드를 함유한다.
C.단백질 전달 검정
ADAS에의 노출 이전에, 세포를 컨플루언시(confluency) 후 1 또는 3 또는 5일 동안 배양하여, 재생 가능한 세포 성숙도 및 분극화를 보장한다. 각각의 시료에 있어서, ADAS를 컨플루언트 상피 시료에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다. 총 형광 세포의 수를 배양물 내의 총 세포의 수로 나누어 ADAS 전달의 효율을 계산하고, 다양한 조건 간에 비교한다.
실시예 34. T3SS 시스템을 갖는 에스케리키아 콜라이 ADAS의 표적화된 전달을 위한 보충적 방법
표적화된 전달은 약물 전달에서 중요하다. 본 실시예에는 ADAS에 대한 모델 표적화 제제로서 나노바디를 사용하는 것이 기재된다. 나노바디는 알려져 있는 가장 작은 기능적 항체 단편이며, 최근의 연구에 의해, 이들이 에스케리키아 콜라이의 표면 상에 발현될 수 있는 것이 나타났다(문헌[Salema and Fernandez, Microb Biotechnol, 2017]). 표면 나노바디는 표적 단백질에 효율적으로 결합할 수 있으며, 개별 세포 유형에 대한 특이성을 생성하기 위하여 사용될 수 있다.
A.EGFR 나노바디를 함유하는 에스케리키아 콜라이 부모 세포주의 합성
문헌[Salema et al., MAbs, 2016]에 기재된 바와 같이 상피 성장 인자(EGFR)에 대한 표면 나노바디를 발현하는 부모 에스케리키아 콜라이 세포주를 합성한다. 요약하여, EGFR에 대한 나노바디를 코딩하는 서열(TYNPYSRDHYFPRMTTEYDY)을, 나노바디를 인티민 폴리펩티드 Neae의 C-말단에 융합시켜 표면 발현을 가능하게 하는 에스케리키아 콜라이 디스플레이 벡터 pNeae2의 부위 내에 클로닝한다. 플라스미드 pNeae2(CmR)는 인티민 잔기 1 내지 659(EHEC O157:H7 균주 EDL933stx- 유래)에 이어서 E-태그, 헥사히스티딘(His) 에피토프 및 C-말단 myc-태그(EQKLISEED)를 인코딩하는 pNeae 벡터의 유도체이다.
나노바디를 갖는 플라스미드를 보유하는 박테리아를 30℃에서, 플라스미드 선택을 위한 적절한 항생제를 갖는 아가 플레이트 상의 LB 브로쓰 중에서 성장시킨다. 유도 이전의 LB 플레이트 및 사전-접종 배지는 lac 프로모터의 억제를 위하여 2%(w/v) 글루코스를 함유하였다. 사전접종 배양물을 (단일의 클론에 있어서) 개별 콜로니로부터 또는 (라이브러리의 경우) 클론의 혼합물로부터 시작하고, 신선하게 성장시키고, 플레이트로부터 수거하고, 0.5의 초기 OD600으로 희석하고, 정적 조건 하에 하룻밤 성장시킨다. 유도를 위하여, 다르게 나타내지 않는 한, (0.5의 OD600에 상응하는) 박테리아를 원심분리(4000xg, 5분)에 의해 수거하고, 3시간 동안 교반(160 rpm)과 함께 0.05 mM 이소프로필티오-β-D-갈락토시드(IPTG)를 갖지만, 글루코스를 갖지 않는 동일한 배지에서 성장시킨다.
B.EGFR 나노바디 발현을 갖는 ADAS의 합성
ADAS를 실시예 12에 기재된 바와 같이 이들 부모 세포주로부터 합성하고, 상기 기재된 바와 같이 카고(GFP에 대한 단백질 및 유전자 전달)를 로딩한다.
C.EGFR 나노바디를 갖는 ADAS에 대한 특이성 검정
Caco-2(인간 상피 대장 선암종) 및 A-431(표피모양 암종) 세포주를 제조처에 의해 제공되는 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 동시-배양한다. 그 다음, 동시-배양물을 상기 기재된 바와 같이 카고(GFP)를 보유하는 ADAS 또는 변형된 부모 세포주와 함께 인큐베이션시킨다. FACS를 사용하여, A-431 및 Caco-2 세포를 분리하고, GFP를 발현하는 표적 세포의 백분율을 정량화한다. 형광 현미경법도 또한 사용하여, 개별 세포 내의 형광 수준을 정량화하여, 트랜스펙션으로 인한 단백질 발현의 양 또는 주입된 단백질 서브유닛의 수를 측정한다. 세포 특이적 마커에 대하여 표지하기 위한 면역세포화학과 함께, 현미경법도 또한 사용하여, 세포 형태에 기초하여 세포 유형에서의 GFP 발현을 정량화하여, Caco-2와 A-431 세포 사이를 식별한다.
실시예 35. 식물에의 T3SS 전달을 위한 잔토모나스 시트리 ADAS의 합성
본 실시예에는 식물 병원성 박테리아로부터 ADAS를 생성하는 것과 모델 유기체로서 잔토모나스 시트리를 사용하여 그들의 천연 전달 기능을 사용하는 것이 기재된다. 식물 병원체에서 관찰되는 T3SS는 식물 세포에의 효율적인 단백질 전달 시스템에 대한 기반을 형성한다. 잔토모나스 시트리 유래의 T3SS 이펙터가 널리 특성화되어 있지 않기 때문에, 생물막 형성을 측정하기 위한 검정을 사용하여 잔토모나스 시트리 ADAS에서 T3SS 능력을 평가한다. 그 다음, 이펙터를 리포터 단백질(예를 들어, GFP)로 대체하여, T3SS를 통해 이종 발현되는 단백질을 전달하는 능력을 평가할 수 있다.
A.T3SS-결함 X. citri의 합성
T3SS는 잔토모나스 시트리에서 감염 동안 생물막 형성을 위하여 필수적이며, 병원성을 증가시킨다. (문헌[Dunger et al, Plant Pathol, 2005]에 기재된 바와 같이) 주요 T3SS 단백질을 인코딩하는 hrpB 오페론에 결함을 갖는 돌연변이체를 생성함으로써 T3SS-결함 잔토모나스 시트리를 생성한다. 사용되는 프라이머는 5′-GAACTGGGCGGGAAGAACGACGAG-3′ 및 5′-GCCGCCGCCGAAGAAGTGATG-3′이다. 게놈 DNA(100 ng)를 50 μL 반응 혼합물에서 주형으로서 사용한다. PCR을 94℃에서 5분 동안의 변성에 이어서, 94℃에서 30초, 62℃에서 40초, 72℃에서 1분의 30 사이클, 및 72℃에서 5분의 최종 신장을 사용하여 에펜도르프 열 순환기에서 수행한다. PCR-증폭 생성물을 0.9% 아가로스 겔에서 분석한다. 서던 블롯 혼성화를 BamHI을 사용한 분해에 의해 생성되고, 전기영동에 의해 분류된 다음, 하이본드(Hybond)-N 멤브레인에 전달되는 Xachrp-돌연변이 DNA 단편을 사용하여 수행한다. 혼성화 및 검출 프로토콜을 [α-32P]dATP를 사용하여 표지된, 증폭된 hrp840bp PCR 생성물을 사용하여 수행한다.
hrpB 돌연변이체를 플라스미드 통합에 의해 구축한다. 증폭된 생성물을 SmaI을 사용하여 분해된 자살 벡터 pK19mobGII 내에 클로닝하여, 각각 pKmobB 및 pKmobF를 제공한다. 넓은 숙주-범위-동원 에스케리키아 콜라이 S17-1로부터의 양친 교배에 의해 플라스미드를 잔토모나스 악소노포디스 변종 시트리(X. axonopodis pv. citri)에 전달한다. 박테리아 혼합물을 하이본드-C 멤브레인 상에 스폿팅하고, 뉴트리언트(Nutrient) 아가 상에 배치하고, 28℃에서 48시간 동안 인큐베이션시킨다. 그 다음, 멤브레인을 세척하고, 박테리아를 선택 배지에 전달한다. 잔토모나스 악소노포디스 변종 시트리 돌연변이 균주를 벡터-인코딩된 항생제 내성(Km)에 의해 선택하고, 서던 혼성화에 의해 확인한다.
B.잔토모나스 시트리 ADAS의 합성
잔토모나스 시트리 ADAS를 생성하기 위하여, 잔토모나스 시트리(hrpB 돌연변이체 및 비형질전환)를 실시예 12와 유사하게 아라비노스 프로모터 하에 ftsZ 단백질을 과발현하는 플라스미드를 사용하여 트랜스펙션시킨다(문헌[Lacerda et al, Plasmid, 2017]). ftsZ 유전자 서열은 문헌[Kopacz et al., MicrobiologyOpen, 2018]으로부터의 것이다. 사용되는 프라이머 서열은: 정방향-GAGCCCATGGCACATTTCGAACTGATTGAAAAAATGGCTCCCAACGCGGTCATCAAGG; 역방향-AGTTCATATGCGACGCAGCCGACGCTCCTCAG이다. 플라스미드를 써모 피셔에 의해 상업적으로 합성한다. 트랜스펙션을 상기 기재된 과정을 사용하여 수행한다. 시간이 지남에 따라, 선택된 콜로니는 증식하고, ADAS를 지속적으로 생성한다.
C.시트러스 시넨시스(Citrus sinensis)에서 생물막을 형성하는 잔토모나스 시트리 ADAS의 능력
T3SS는 잔토모나스 시트리에 의한 생물막 형성에 필수적이다. hrpB 돌연변이체 및 보통의 균주 유래의 ADAS를 시트러스 시넨시스 식물에서의 감염 검정에 사용한다. 모든 식물을 16시간의 광주기를 사용하여 28℃에서 백열등을 갖는 성장 챔버에서 성장시킨다. ADAS를 1의 OD600으로 정제하고, 10 mM MgCl2 중에 104 내지 107 cfu/ml로 재현탁화시킨다. 이들을 무바늘 주사기를 사용하여 잎 상에 침윤시킨다. 상이한 균주를 접종한 20개의 오렌지 잎으로부터 줄기마름병을 계수하고, 계수된 잎의 면적을 어도브 포토샵(Adobe Photoshop) 소프트웨어를 사용하여 디지털화된 이미지로부터 측정한다. T3SS-발현 잔토모나스 시트리 유래의 ADAS는 T3SS-결함 부모 세포주 유래의 것들보다 유의미하게 더 많은 줄기마름병을 보인다.
실시예 36. T4SS를 사용한 식물 형질전환제로서의 아그로박테리움 ADAS의 합성
본 실시예에는 T4SS를 사용하여 모델 DNA 플라스미드와 같은 페이로드를 전달할 수 있는 ADAS를 생성하는 것이 기재된다. 아그로박테리움 투메파시엔스는 그들의 고유 T4SS 시스템을 사용하여 식물을 형질전환시키기 위한 방식으로서 사용된다. 이는 비-복제성 아그로박테리움이 벗어날 위험 없이 넓은 필드에 분무 방식으로 배치되게 한다.
A.플라스미드를 사용한 아그로박테리움의 트랜스펙션
니코티아나 벤타미아나 트랜스펙션을 위하여, 항생제 내성 유전자를 갖는 플라스미드를 아그로박테리움 형질전환 키트(Agrobacterium Transformation Kit)(MPbio)에 기재된 바와 같은 동결-해동 방법 및 재료를 사용하여 아그로박테리움 균주 GV3101 내에 도입한다. 요약하여, 아그로박테리움을 1.0 내지 2.0의 OD600으로 성장시키고, 형질전환 용액 중에 재현탁화시키고, 플라스미드 DNA와 혼합하고, 1분 동안 액체 질소 내에 침지시키고, 5분 동안 30℃의 수조 내에 침지시키고, 플라스미드 상의 선택 마커를 갖는 루리아-베르타니 배지 중에 재성장시킨다.
토마토 트랜스펙션을 위하여, 항생제 내성 유전자를 갖는 플라스미드를 제조처의 설명에 의해 기재된 방법을 사용하여 아그로박테리움 균주 LBA4404 ElectroMAX 세포(써모 피셔) 내에 도입한다. 요약하여, 아그로박테리움을 젖은 얼음 상에서 해동시키고, 염, 에탄올 및 다른 오염물질이 없는 정제된 플라스미드 DNA와 혼합한다. 혼합물을 전기천공시키고, 실온 배지와 즉시 혼합하고, 3시간 동안 재성장시킨다.
그 다음, 어느 하나의 프로토콜로부터의 세포를 희석하고, 선택하는데 필요한 항생제가 있는 아가에 플레이팅한다. 다음 날, 또는 콜로니가 보이면, 그들을 시퀀싱을 위해 선택한다. 플라스미드 아이덴티티의 확인 후에, 적절한 콜로니를 필요한 선택 마커를 함유하는 배양 배지(제조처의 설명에 의해 특정됨) 중에 하룻밤 진탕시키면서 성장시킨다.
B.아그로박테리움 ADAS의 합성
pSRKGm 백본(문헌[Khan et al, Appl. Environ. Microbiol., 2008]) 상에 아그로박테리움 ftsZ를 함유하는 플라스미드를 상업적으로 합성한다. 그 다음, 그것을 파트 a)에 기재된 방법을 사용하여 아그로박테리움 내에 트랜스펙션시켜, 아그로박테리움 투메파시엔스 ADAS 부모 세포주를 형성한다. 그 다음, 부모 세포주를 IPTG의 첨가와 함께 제조처의 설명에 따라 성장시키고, ADAS를 실시예 15의 방법을 사용하여 정제한다.
C.대형 아그로박테리움 ADAS의 합성
pSRKGm 백본(문헌[Khan et al, Appl. Environ. Microbiol., 2008]) 상에 엑소뉴클레아제 V를 함유하는 플라스미드를 상업적으로 합성한다. 그 다음, 그것을 파트 a)에 기재된 방법을 사용하여 아그로박테리움 내에 트랜스펙션시켜, 아그로박테리움 투메파시엔스 ADAS 부모 세포주를 형성한다. 그 다음, 부모 세포주를 IPTG의 첨가와 함께 제조처의 설명에 따라 성장시키고, ADAS를 실시예 13의 방법을 사용하여 정제한다.
D.GFP 페이로드를 갖는 아그로박테리움 투메파시엔스 ADAS의 합성
문헌[Baltes et al., The Plant Cell, 2014]에 언급된 플라스미드 pLSLGFP.R을 사용한다. 플라스미드 pLSLGFP.R을 파트 a)에 나타낸 방법을 사용하여 트랜스펙션시킨다. 아그로박테리움 투메파시엔스 ADAS를 파트 b) 또는 c)의 방법을 사용하여 합성한다.
E.GFP 페이로드를 갖는 아그로박테리움 ADAS를 사용한 식물의 트랜스펙션
담배(니코티아나 타바쿰 변종 잔티(Nicotiana tabacum var Xanthi)) 식물을 16시간-광 및 8시간-암 주기 하에 60% 습도와 함께 21℃에서 성장시킨다. 4 내지 6주령 담배 식물 유래의 잎(완전히 확장된 윗잎)을 ADAS 형질전환을 위해 사용한다. 식물마다 1개의 잎을 침윤시킨다. 담배 식물 유래의 잎을 1-mL 주사기를 사용하여 아그로박테리움을 사용해 침윤시킨다. 침윤 직후에, 식물을 관수하고, 높은 습도를 유지하기 위하여 플라스틱 돔(plastic dome)을 사용하여 덮는다. 침윤시킨지 약 24시간 후에 플라스틱 돔을 제거한다. 식물을 형광 판독기를 사용하여 영상화하고, 가시적인 GFP를 갖는 잎의 백분율을 측정한다.
실시예 37. ADAS 분비 효율 측정
ADAS의 분비 효율을 측정하기 위하여, 내인적으로 그리고 이종으로 발현되는 단백질을 합성하고 분비하는 능력을 측정한다.
A.GFP를 합성하는 부모 에스케리키아 콜라이 세포주
GFP 및 앰피실린 내성을 보유하는 벡터를 함유하는 에스케리키아 콜라이 세포주를 ATCC(ATCC® 25922GFP™)에서 주문하고, 제조처의 지시에 따라 배양한다.
B.분자를 합성하는 ADAS 능력
ADAS를 GFP를 발현하는 에스케리키아 콜라이 부모 세포주로부터 및 고유 에스케리키아 콜라이로부터 생성한다. 형광 측정은 양성 대조군으로서 GFP-발현 에스케리키아 콜라이 부모 세포주로부터 이루어지며, ADAS로부터 GFP 세기를 측정하기 위한 기준선으로서 사용된다. ADAS를 실시예 12에 따라 합성하고, 96-웰 플레이트 상에 플레이팅하고, 형광을 플레이트 판독기를 사용하여 측정한다. ADAS가 성장 또는 분열에 필요한 단백질을 합성할 필요가 없기 때문에, 생성되는 ADAS 둘 모두는 단백질 합성에서 더욱 효율적이며, 부모 세포주에 비하여 더 큰 GFP 세기를 나타낸다. 세포 수준에서 세기를 측정하기 위하여, 에스케리키아 콜라이 부모 세포주 및 ADAS를 표준 세포 준비 프로토콜을 사용하여 고정하고, 유리 슬라이드 상에 마운팅한다. 이들을 형광 영상화와 함께 공초점 현미경을 사용하여 영상화한다. 이들 이미지를 사용하여 면적의 제곱 단위당 형광 세기를 측정하고, 부모 세포주와의 직접적인 비교를 위해 사용한다.
C.분자를 분비하는 ADAS 능력
에스케리키아 콜라이는 감염을 용이하게 하기 위하여 T1SS-매개의 리파제 분비를 사용한다. T1SS는 분비된 단백질 내의 특이적인 C-말단 서열을 인식하는 ABC 수송체를 함유한다. 내인성 리파제와 함께 고유 T1SS를 발현하는 부모 에스케리키아 콜라이 세포주, 및 문헌[Chung et al., Microb Cell Fact, 2009]에 기재된 바와 같이 수송을 위한 C-말단 서열이 융합된 GFP를 함유하는 플라스미드를 사용하여 트랜스펙션된 또 다른 세포주를 생성한다.
요약하여, 리파제 ABC 수송체 도메인(LARD)을 융합 단백질의 분비를 위해 설계한다. LARD는 β-롤 구조를 포함하는 4개의 글리신-풍부 반복부를 포함하며, 시험 단백질의 C-말단에 부가된다. Pro-Gly 링커 또는 인자 Xa 부위 중 어느 하나를 융합 단백질과 LARD 사이에 부가한다. GFP 융합 단백질의 분비를 분석하기 전에, GFP-융합 단백질의 발현을 점검한다. 이들 단백질을 에스케리키아 콜라이에서 발현하고, 그들의 예상되는 크기를 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한다(로클랜드 인코포레이티드(Rockland Inc.), 펜실베이니아 소재, 카탈로그 #KCA215). 또한, GFP의 형광을 입증한다. 이들 단백질을 발현하는 에스케리키아 콜라이의 대표적인 콜로니를 자외선(UV) 광 하에 관찰한다. 분비 표현형을 리파제 활성을 통해 추적할 수 있다. 에스케리키아 콜라이를 트리부틸틴(tributyltin) 아가 상에서 배양하여, TliA-융합 단백질의 분비를 검출한다. 또한, GFP 융합 단백질을 GFP에 대한 항체를 사용하여 검출하는 경우, LARD에 대한 항체에 의해 검출되는 동일한 밴드가 세포 및 상청액에서 검출된다.
또한, 문헌[Chung et al.]으로부터 조정된 방법을 사용하여 분비를 측정하며, 하기 요약된다. ADAS를 실시예 12에 요약된 에스케리키아 콜라이 부모 세포주로부터 생성한다.
ADAS에 의한 리파제 분비를 측정하기 위하여, ADAS를 고체 배지(LAT: LB 브로쓰, 1.5% 박토 아가(Bacto Agar), 0.5% 트리부틸틴) 상에 플레이팅한다. 분비된 리파제는 전형적인 표현형으로서 콜로니 주변에 광륜이 발생하게 한다. ADAS는 부모 세포주보다 더 빠르게 광륜을 발생시킨다. 이에 더하여, 에탄올 및 트리스-HCL 중에 용해된 기질로서 p-니트로페닐 팔미테이트(pNPP)를 첨가함으로써 리파제 활성을 분광광도계에 의해 측정한다. ADAS 및 부모 세포주 배양물로부터의 50 μL 상청액을 200 μL의 기질에 첨가하고, 420 nm의 흡광도를 플레이트 판독기를 사용하여 측정한다. 활성을 광학 밀도의 증가를 사용하여 측정한다.
리파제가 내인적으로 발현되는 단백질이기 때문에, GFP를 사용하여 이종으로 발현되는 단백질의 분비를 측정한다. ADAS 및 부모 세포주를 LB 브로쓰에서 성장시키고, 브로쓰로부터 상청액을 수집하여, GFP 발현을 측정한다. 표준 면역블롯(로클랜드 인코포레이티드, 펜실베이니아 소재, 카탈로그 #KCA215)을 GFP-특이적 항체와 함께 제조처의 설명에 따라 사용하여 GFP 분비를 측정한다.
실시예 38. 비-막대-형상의 나노입자-함유 ADAS(마그네토스피릴룸 마그네티쿰( Magnetospirillum magneticum ))
본 실시예에는 ADAS가 비-막대-형상의 박테리아로부터 합성될 수 있으며, 더 큰 구조, 예컨대 나노입자를 함유할 수 있는 것이 기재된다.
A.마그네토스피릴룸 마그네티쿰 ADAS의 제조
ADAS를 생성하기 위하여, 마그네토스피릴룸 마그네티쿰을 T7 프로모터 하에 ftsZ 단백질을 과발현하는 플라스미드(Q2W8K6_MAGSA)를 사용하여 트랜스펙션시킨다. 플라스미드를 써모 피셔에 의해 상업적으로 합성한다. 트랜스펙션을 표준 박테리아 트랜스펙션 과정(문헌[Thermo Fisher Molecular Biology Handbook] 참조)을 사용하여 수행한다. 요약하여, 컴피턴트(competent) 세포를 실온 아가 플레이트 상에 플레이팅한다. 0.5 내지 2 ng/ml의 DNA를 바이얼 내의 컴피턴트 세포에 첨가하고, 20 내지 30분 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 각각의 튜브를 42℃ 수조에서 30 내지 60초 동안 배치함으로써 튜브에 열 충격을 가하여, 세포 표면 내에 일시적인 포어(pore)를 생성한다. 이어서, 세포를 선택적 항생제가 사전로딩된 아가 겔 상에 플레이팅하고, 하룻밤 성장시켰다. 플라스미드를 사용하여 트랜스펙션된 박테리아만이 생존한다. 단일의 콜로니를 픽킹하고, 37℃에서 50 내지 100 μg/mL의 앰피실린을 함유하는 LB 배지 중에 120 rpm에서 연속 진탕과 함께 배양한다. 시간이 지남에 따라, 선택된 콜로니는 증식하고, ADAS를 지속적으로 생성한다. 대안적으로, 실시예 14에서 사용된 프로토콜과 유사한 프로토콜을 사용하여 대형 ADAS를 제조한다.
이에 더하여, ftsZ-유사 유전자의 결실은 이들 박테리아에서 상자성 자철석 마그네토솜(magnetite magnetosomes)의 생성을 초래한다(문헌[Ding et al., J Bacteriol., 2010]).
B.나노입자의 마그네토스피릴룸 마그네티쿰 ADAS 보유의 특성화
ADAS 마그네토솜의 형태를 문헌[Wang et al., Front Microbiol., 2013]에 기재된 바와 같이 TEM을 사용하여 분석한다. 요약하여, 20 μL의 세포를 2시간 동안 탄소-코팅된 포름바(formvar) 필름으로 커버된 구리 TEM 그리드 상에 적하한 다음, 멸균 증류수를 사용하여 2회 세척하고, 공기 중에 건조시킨다. TEM 현미경사진을 측정함으로써 마그네토솜 크기는 (길이 + 너비)/2로서 정의되며, 형상 계수는 너비/길이로서 정의된다.
C.마그네토스피릴룸 마그네티쿰 ADAS 자성의 입증
마그네토스피릴룸 마그네티쿰 ADAS의 자성 특성을 특성화하기 위하여, 문헌[Ding et al., J Bacteriol., 2010]으로부터 변형된 프로토콜을 사용한다. 요약하여, 시료를 동결-건조시키고, 저온 자성 측정을 퀀텀 디자인(Quantum Design) MPMS XL-5 자력계(감도, 5.0 × 10-10 Am2)를 사용하여 행한다. 2회의 사전처리 후에 5 K의 2.5-T 자기장(본원에서 이후에 SIRM5K_2.5T로 명명됨)에서 획득한 잔류 자기의 열적 자기소거를 5 K에서 300 K까지 측정한다. 제1 전처리는 시료를 무자기장에서 300 K로부터 5 K까지 냉각시키는 것이고(무자기장 냉각 [ZFC]), 제2의 것은 그것을 2.5-T 자기장에서 300 K로부터 5 K까지 냉각시키는 것이다(자기장 내각 [FC]). 버웨이(Verwey) 천이 온도(Tv)는 FC 곡선의 최대 1차 도함수 dM/dT에 상응하는 온도로서 정의된다. 실온 1차 반전 곡선(FORC)을 교번 구배 자력계(감도, 1.0 × 10-11 Am2; MicroMag 모델 2900) 상에서 측정한다. FORC 다이어그램을 2의 평활 계수(SF)와 함께, FORCinel 버전 1.05 소프트웨어를 사용하여 계산한다. FORC 다이어그램은 자성 결정의 도메인 상태, 보자력 및 정자기 상호작용에 대한 정보를 제공한다.
실시예 39. 환경 반응적(Environmentally responsive) ADAS
불(Boolean) 논리 게이트에 기초한 논리 연산을 유전자 조절 네트워크에 인코딩하여, 세포가 상이한 환경 및 세포 신호를 통합하거나, 그 사이를 식별하고, 이에 따라 반응하게 할 수 있다. 맞춤형 유전학적 논리 회로를 설계하여, 고유 세포에서 관찰되지 않는 다양한 세포 센서 및 액츄에이터를 연결할 수 있다. 이들 변형된 세포가 세포내에서 또는 세포외에서 특정 입력에 응답하여 원하는 결과를 생성하도록 프로그래밍할 수 있다. 유전자 회로의 비-모듈성 및 호스트 섀시(host chassis)의 한계와 같은 일부 단점에도 불구하고, 그들은 조작된 유기체에서 매우 유용하며, 유전학적 논리 회로의 라이브러리가 현재 확대되고 있다. 다수의 이러한 회로가 에스케리키아 콜라이에서 설명된 바 있으며, 이는 에스케리키아 콜라이 ADAS 내에 혼입된다.
이들 회로는 환경 반응적 ADAS에 대한 기반을 형성하며, 이는 입력(예를 들어, 대사물질, pH, 열, 광, 외부 리간드)에 응답하여 조정 가능한 출력을 생성할 수 있다. 그들을 다중 입력의 존재에 응답하기 위해 AND 게이트를 사용하여 설계하거나, 인코딩된 입력 중 임의의 것에 응답하기 위해 OR 게이트를 사용하여 설계한다. 이 레퍼토리를 확장시켜, NOR, NAND, XOR 등과 같은 다른 논리 게이트를 포함시킬 수 있다.
A.AND/OR 게이트를 사용한 에스케리키아 콜라이 ADAS의 합성
슈도모나스 시린가에는 T3SS의 발현을 엄격하게 조절하는 AND 게이트를 형성하는 hrpR/hrpS 시스템으로 지칭되는 III형 분비를 위한 조절 시스템을 함유한다. 이들 단백질 둘 모두의 발현은 T3SS 시스템의 생성에 필요하다. 플라스미드 구축 및 DNA 조작을 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 수행하고, AND 게이트의 구축을 문헌[Wang et al., Nat Commun., 2011]에 기재된 프로토콜로부터 변형시킨다. 요약하여, a) IPTG-유도성 Plac 프로모터 및 AND 게이트의 hrpR 부분, 및 b) 열-유도된 프로모터 pL(열불안정성 단백질에 의해 통상적으로 억제되는 파지 람다 유래) 및 AND 게이트의 hrpS 부분을 함유하는 플라스미드를 구축한다. 출력은 GFP 단백질 발현이며, 이는 T3SS 프로모터를 함유하며, 둘 모두의 hrpR 및 hrpR이 발현되는 경우에 발현된다.
플라스미드 구축 및 DNA 조작을 표준 분자 생물학 기법에 따라 수행한다. hrpR 및 hrpS 유전자 프로모터를 바이오브릭(BioBrick) 표준에 따라 진아트(GENEART)에 의해 합성한다. IPTG-유도성 Plac을 함유하는 플라스미드 pAPT110 (p15A ori, Kanr)는 AND 게이트의 hrpR (XbaI/KpnI)의 특성화 및 보유를 위해 사용된다. AND 게이트의 hrpS를 갖는 열-유도성 pL 프로모터를 함유하는 플라스미드 pBAD18-Cm(pBR322 원점, Cmr)을 수득한다. pSB3K3(p15A 원점, Kanr)을 사용하여 이후에 hrpR(XbaI/PstI)을 유도하기 위해 사용되는 합성 AHL-유도성 Plux 프로모터(BBa_F2620)를 클로닝하고 특성화한다. 각각의 유전자 구축물에 대한 다양한 서열을 상응하는 RBS 및 적절한 제한 부위를 함유하는 프라이머를 사용하는 PCR 증폭(스트라타진(Stratagene)으로부터의 PfuTurbo DNA 중합효소 및 에펜도르프 마스터사이클러(Mastercycler) 구배 열 순환기 사용)에 의해 도입한다. 대안적으로, 모든 구축물을 상업적으로 합성한다. 모든 구축물을 표적 세포 균주에서의 그들의 이용 전에 DNA 시퀀싱(Eurofins MWG 오페론)에 의해 입증한다.
모든 특성화 실험을 적절한 탄소원이 보충된 M9 최소 배지(11.28 g M9 염/l, 1 mM 티아민 하이드로클로라이드, 0.2%(w/v) 카사미노산, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2)에서 행한다. 상이한 탄소원을 갖는 2가지 M9 배지를 사용한다: M9-글리세롤(0.4% (v/v) 글리세롤) 및 M9-글루코스(0.01%(v/v) 글루코스). 사용되는 항생제 농도는 카나마이신에 있어서 25 μg/ml, 클로람페니콜에 있어서, 25 μg ml-1 및 앰피실린에 있어서 25 μg/ml이다. 신선하게 스트리킹된 플레이트 상의 단일의 콜로니로부터 접종된 세포를 진탕(200 r.p.m.)과 함께 37℃에서 14 ml 팔콘(Falcon) 튜브 내의 4 ml M9 중에 하룻밤 성장시킨다. 하룻밤 배양물을 낮 배양을 위하여 사전-가온된 M9 배지 내에 OD600=0.05로 희석하고, 이를 다르게 나타내지 않는 한, 분석 전에 30℃에서 5시간 동안 유도하고 성장시킨다. 형광측정법에 의한 형광 검정을 위하여, 희석된 배양물을 96-웰 마이크로플레이트(바이오-그레이너(Bio-Greiner), 침니 블랙(chimney black), 편평 투명 바닥) 내에 로딩하고, 미니채널 피펫에 의해 웰당 200 μL의 최종 부피로 다양한 농도의 5 μL(단일-입력 유도를 위함) 또는 10 μL(이중-입력 유도를 위함) 유도제를 사용하여 유도한다.
OR 게이트를 조작하기 위하여, 문헌[Rosado et al., PLoS Genetics, 2018]에 의해 기재된 시스템을 사용한다. 먼저, 구성성 프로모터 하에 RFP를 코딩하는 시스-억제된 mRNA를 구축한다. 억제는 RAJ11 sRNA의 존재 하에 제거된다. IPTG-유도 가능한 프로모터 PLac 및 열-유도된 프로모터 pL을 함유하는 플라스미드를 합성하며, 이들 둘 모두는 RAJ11 sRNA의 발현을 유도한다. 출력은 RFP 발현이며, 이는 어느 하나의 입력에 응답하여 관찰된다.
전사 인자 LacI 및 pL에 의해 조절되는 합성 PL-기반의 프로모터를 입력 신호(IPTG 및 열)를 감지하기 위한 요소로서 사용한다. 시스템 RAJ11의 리보조절(riboregulatory) 서열(sRNA 및 5' UTR)을 이전의 연구(문헌[Rodrigo et al., PNAS, 2012])로부터 수득한다. 각각의 유전자 구축물에 대한 다양한 서열을 상응하는 RBS 및 적절한 제한 부위를 함유하는 프라이머를 사용하는 PCR 증폭(스트라타진(Stratagene)으로부터의 PfuTurbo DNA 중합효소 및 에펜도르프 마스터사이클러(Mastercycler) 구배 열 순환기 사용)에 의해 도입한다. 모든 구축물을 표적 세포 균주에서의 그들의 이용 전에 DNA 시퀀싱(Eurofins MWG 오페론)에 의해 입증한다.
LB 배지를 하룻밤 배양을 위해 사용하는 한편, 배양물을 특성화하기 위하여 M9 최소 배지(1x M9 염, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2, 0.4% 글루코스, 0.05% 카사미노산 및 0.05% 티아민)를 사용한다. 앰피실린 및 카나마이신을 항생제로서 50 μg/mL의 농도로 사용한다.
GFP 및 RFP 배양물을 형광계(퍼킨 엘머 빅터(Victor) X5)에서검정하여, 흡광도(600 nm 흡광 필터), 녹색 형광(485/14 nm 여기 필터, 535/25 nm 방출 필터) 및 적색 형광(570/8 nm 여기 필터, 610/10 nm 방출 필터)을 측정한다. M9 최소 배지에 상응하는 흡광도 및 형광의 평균 백그라운드 값을 제하여, 판독치를 보정한다. 정규화된 형광을 형광 대 흡광도의 비로서 계산한다. 그 다음, 대조군 플라스미드로 형질전환된 세포에 상응하는 정규화된 형광의 평균 값을 제하여, 최종 발현 추정치를 수득한다.
이들 게이트는 모델 시스템이며, 다른 화학물질, 세포 접촉, pH 및 광을 포함하는 임의의 입력을 사용하여 활성화되도록 추가로 변형될 수 있다.
B.AND/OR 게이트를 사용한 ADAS의 생성
ADAS를 실시예 12에 기재된 프로토콜에 따라 생성하고, 실시예 13의 방법에 따라 정제한다.
C.논리 게이트는 ADAS에서 기능성이다
이전에 기재된 바와 같이, hrpR/hrpS는 AND 논리 게이트를 효율적으로 생성하는 생성물을 생성하기 위하여 두 입력 모두를 필요로 한다. 에스케리키아 콜라이 ADAS를 4가지 조건으로 처리한다: 1. IPTG 부재/열 부재, 2. ITPG/열 부재, 3. IPTG 부재/열, 및 4. ITPG/열. 열 및 IPTG 둘 모두가 존재하는 조건 4만이 GFP의 발현을 야기하는 hrpR/hrpS의 발현을 야기할 것이다.
GFP 발현은 IPTG의 농도 및 자극 노출 기간을 변경시킴으로써 잠재적으로 조절될 수 있다. 상이한 조건에 노출된 에스케리키아 콜라이 ADAS를 96-웰 플레이트 상에 로딩하고, 형광 플레이트 판독기를 사용하여 상이한 조건에 비하여 GFP 발현을 정량화한다. 이중 맹검 실험에 의해, GFP의 존재가 IPTG 및 열 둘 모두의 존재를 나타내는 것이 확인되며, 이는 자극에 반응성인 시스템에 대한 기반을 형성한다.
실시예 40. 에스케리키아 콜라이 및 극한생물 유래의 중금속-제거 ADAS
중금속은 환경 및 건강 위험을 제기하며, 종종 효율적이고 비침습적인 방식으로 제거하기 어렵다. 박테리아는 수은을 향한 높은 친화성 및 선택성을 갖는 금속조절 단백질인 MerR과 같은 단백질의 발현을 사용하여, 중금속, 예컨대 수은을 제거하도록 조작될 수 있다.
A.MerR을 발현하는 에스케리키아 콜라이 부모 세포주의 합성
에스케리키아 콜라이 부모 세포주를 문헌[Bae et al., App Environ Microbiol, 2003]에 기재된 방법을 사용하여 합성한다. 요약하여, MerR을 표면 발현을 위하여 빙핵형성 단백질(INP)과 융합시킨다. 발현을 확인하기 위하여 헥사히스티딘 태그를 융합 단백질의 C-말단에 부가한다.
요약하여, INP-MerR 융합체를 하기와 같이 구축한다. merR 단편을 프라이머 merR1(5′ CCGGGATCCTATGGAAAACAATTTGGAGA 3′) 및 merR2(5′ CAGCTGCAGCCCTAAGGCATAGCCGAACC 3′)를 사용하여 플라스미드 pT7KB로부터 PCR 증폭시킨다. 증폭된 단편을 BamHI 및 PstI을 사용하여 분해하고, 겔 정제하고, pUC18Not 내에 삽입된 EcoRI-BamHI INP 단편을 함유하는 유사하게 분해된 pUNI 내에 서브클로닝하여, pUNIM을 생성한다. 생성된 구축물은 에스케리키아 콜라이의 표면 상의 MerR의 발현을 가능하게 한다.
MerR의 표면 국소화를 탐지하기 위하여, 헥사히스티딘 태그를 INP-MerR 융합체의 C-말단 부분에 부가한다. merR 단편을 C-말단에 6개의 히스티딘을 코딩하는 새로운 역방향 프라이머, merR3(5′ ATTCTGCAGCTAATGATGATGGTGGTGGTGATAAGGCATAGCCGAACCTGCCAAGCTT 3′)을 사용하여 재증폭시킨다. INP-MerR-H6 융합체를 코딩하는 생성되는 플라스미드, pUNIMH를 제조한다.
대조군으로서 비형질전환된 에스케리키아 콜라이와 함께 박테리아 클론을 0, 5, 10, 20, 40, 80, 100, 120, 140 및 160 μM의 농도의 HgCl2의 존재 하에 LB 브로쓰 중에서 성장시킴으로써 수은 제거를 측정한다. 흡광도를 16 및 120시간의 인큐베이션 후에 각각의 박테리아 클론에 대하여 600 nm에서 측정하여, 성장 및 수은에 대한 그들의 상대적 내성을 결정한다.
B.이. 콜라이 ADAS의 합성 및 정제
ADAS를 실시예 12에 기재된 프로토콜에 따라 생성하고, 실시예 13의 방법에 따라 정제한다.
C.에스케리키아 콜라이 ADAS에 의한 수은 제거
에스케리키아 콜라이 ADAS를 0, 5, 10, 20, 40, 80, 100, 120, 140 및 160 μM의 농도의 HgCl2를 함유하는 LB 브로쓰 중에 16 및 120시간 동안 인큐베이션시킨다. 수은을 극히 낮은 수준까지 검출하기 위해 설계된 검정을 사용하여 잔류 수은의 수준을 시험한다(예를 들어, 문헌[Brummer et al., Bioorg. Med. Chem., 2001]에 의해 설계된 킬레이팅 스트립).
실시예 41. 에스케리키아 콜라이 ADAS에 의한 락토스 흡수 및 대사
에스케리키아 콜라이에서의 락토스 흡수는 막-결합된 단백질 베타-갈락토시드 투과효소를 통해 발생하며, 이는 세포 내의 락토스 및 다른 베타-갈락토시드의 수송을 가능하게 한다. 당 분자의 수송은 양성자의 동시수송에 의해 달성되며, 이는 pH 감수성 염료를 사용한 흡수의 검정을 가능하게 한다.
A.베타-갈락토시다제 투과효소를 발현하는 에스케리키아 콜라이 부모 세포주의 합성
에스케리키아 콜라이 부모 세포주를 당원으로서 락토스만을 함유하는 브로쓰를 사용하여 합성한다. 에스케리키아 콜라이는 바람직한 당의 부재 하에 당원으로서 락토스의 흡수 및 이용을 위한 lac 오페론 시스템을 함유한다. 바람직한 당의 제거는 락토스의 흡수 및 대사에 수반되는 단백질의 발현을 유도한다. 흡수가 막-결합된 수송체를 통해 이루어지기 때문에, 이 시스템의 유도는 부분적으로 ADAS에서의 발현을 결정하는 부모 세포주에서 수송체 발현을 증가시키는데 필요하다. 추가로, lac 오페론 시스템을 함유하는 플라스미드를 수송체의 발현을 위하여 에스케리키아 콜라이 ADAS 내에 도입한다.
B.이. 콜라이 ADAS에 의한 락토스 흡수
에스케리키아 콜라이 ADAS를 실시예 12 및 13에 기재된 바와 같이 합성하고 정제한다. 에스케리키아 콜라이 ADAS에 의한 락토스 흡수를 pH 감수성 검정을 사용하여 측정한다. 문헌[Prabhala et al., FEBS Letters, 2014]에 기재된 바와 같이, pH 감수성 염료 피라닌을 사용하여 락토스 흡수를 측정한다. 요약하여, 에스케리키아 콜라이 ADAS를 펠렛화시키고, 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.8 mM MgSO4, 0.3 mM 피라닌 및 다양한 농도의 락토스(1 mM 내지 5 mM)를 함유하는 비완충 크렙스(Krebs) 용액을 사용하여 적어도 3회 세척하고, 재현탁화시킨다. 질소를 현탁액을 통해 5분 동안 버블링시키면서, 현탁액의 pH를 조심스럽게 6.5로 조정하고, 이산화탄소 용해의 결과로서의 pH의 변화를 회피하기 위하여 30 mL의 액체 파라핀을 세포 현탁액 위에 첨가한다. 세포 현탁액을 (455 nm의 여기 파장 및 509 nm의 방출 파장에서 형광광도계를 사용한) 형광 측정을 위하여 검정 플레이트에 바로 전달한다. 대조군 실험을 음성 대조군으로서 빈 형질전환된 에스케리키아 콜라이 세포 및 양성 대조군으로서 부모 세포주를 사용하여 수행한다.
C.락토스를 글루코스 및 갈락토스로 전환시키는 에스케리키아 콜라이 ADAS
글루코스의 부재 하에, 에스케리키아 콜라이는 당원으로서 락토스를 사용하기 위하여 박테리아 오페론 lac 오페론을 사용한다. 박테리아 오페론은 하나의 mRNA 전사물로부터 다중의 단백질을 생성할 수 있는 다시스트론성 전사물이며, 이는 lac 오페론의 경우에 lacZ, lacY 및 lacA이다. lacZ, lacY 및 lacA의 유전자 생성물은 락토스를 글루코스 및 갈락토스로 절단하는 베타-갈락토시다제, 세포 내의 락토스의 수송을 가능하게 하는 베타-갈락토시드 투과효소 및 아세틸-CoA로부터 각각 갈락토시드, 글루코시드 및 락토시드로 아세틸기를 전달하는 효소인 갈락토시드 아세틸트랜스퍼라제이다. 락토스에서 글루코스 및 갈락토스로의 전환은 효소 베타-갈락토시다제를 통해 매개되며, 이 효소의 기능은 효소-활성 검정을 사용하여 직접적으로 측정될 수 있다.
D.이. 콜라이 ADAS의 합성 및 정제
에스케리키아 콜라이 ADAS를 실시예 12 및 13에 기재된 바와 같이 합성하고 정제한다. 락토스 흡수를 글루코스의 부재 하에 에스케리키아 콜라이 ADAS에서 평가한다.
E.에스케리키아 콜라이 ADAS 에 의한 락토스에서 글루코스 및 갈락토스로의 전환
효소 베타-갈락토시드 투과효소의 활성을 평가하기 위하여, 에스케리키아 콜라이 ADAS를 수집하고, 예를 들어, EMBL 프로토콜에 의해 기재된 바와 같이, 단백질 분해를 방지하기 위하여 프로테아제 저해제가 있는 용해 완충제를 사용하여 먼저 용해시킨다.
이 효소의 활성을 제조처의 설명을 사용하여 써모피셔(카탈로그#K145501)로부터의 상업적으로 입수 가능한 키트를 사용하여 측정한다. 요약하여, 베타-갈락토시다제는 β-갈락토시드, 예컨대 오르토-니트로페닐-D-갈락토피라노시드(ONPG)의 가수분해를 촉매한다. ONPG에서 ONP 음이온으로의 가수분해는 연황색을 야기한다. 용액의 β-갈락토시다제 활성을 분광광도계 또는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 정량화하여, 420 nm에서 전환된 기질의 양을 결정한다.
에스케리키아 콜라이 부모 세포주를 양성 대조군으로서 사용한다. 락토스를 분해하는 에스케리키아 콜라이 ADAS의 능력은 락토스 전환 지수(L)에 의해 결정될 것이며, 여기서, L = (에스케리키아 콜라이 ADAS에서의 효소 활성) / (부모 세포주에서의 효소 활성) x100이다.
실시예 42. 플라스틱의 분해를 위한 PETase-발현 에스케리키아 콜라이 ADAS
아이데오넬라 사카이엔시스(Ideonella sakaiensis)는 일반적인 플라스틱, 폴리-(에틸렌 테라프탈레이트) 또는 PET(문헌[Yoshida et al., Science, 2016])를 분해하고 대사할 수 있는 병 재활용 시설 외측으로부터 단리된 박테리아이다. 그것은 효소 PETase를 분비하여, 중합체를 단량체로 분해한다. 아이데오넬라 사카이엔시스 PETase를 발현하는 에스케리키아 콜라이 ADAS는 널리 사용되는 플라스틱 PET를 분해할 수 있다(미국에서 매년 PET 병만 약 35억 파운드가 매립됨).
A.PETase를 발현하기 위한 에스케리키아 콜라이의 형질전환
PETase-합성 에스케리키아 콜라이 ADAS 부모 세포주를 문헌[Han et al., Nat. Commun., 2017]에 기재된 프로토콜을 사용하여 합성한다. 요약하여, N-말단 29개 아미노산이 없는 아이데오넬라 사카이엔시스로부터의 PETase(진뱅크 수탁 번호: GAP38373.1)를 클로닝하고, 상업적으로 pET32a 벡터 내에 라이게이션시킨다. 야생형 또는 변이형인 pET32a-PETase 플라스미드를 37℃에서 LB 배지 중에 약 0.8의 OD600으로 성장시킨 에스케리키아 콜라이 BL21trxB(DE3) 세포 내에 형질전환시킨 다음, 16℃에서 24시간 동안 0.6 mM 이소프로필 β-d-티오갈락토피라노시드(IPTG)에 의해 유도한다. 부모 세포주를 PET 필름(하기 c에 기재됨)과 함께 인큐베이션시켜, PETase 활성을 확인한다.
B.이. 콜라이 ADAS의 합성 및 정제
에스케리키아 콜라이 ADAS를 실시예 12 및 13에 기재된 바와 같이 합성하고 정제한다. 락토스 흡수를 글루코스의 부재 하에 에스케리키아 콜라이 ADAS에서 평가한다.
C.PET를 분해하기 위한 PETase 발현 에스케리키아 콜라이 ADAS의 이용
아이데오넬라 사카이엔시스 201-F6을 BCRC로부터 수득하고, 제조처의 설명에 따라 배양한다. 이를 양성 대조군으로서 제공하여, PETase-발현 에스케리키아 콜라이의 활성을 측정한다.
PET를 분해하는 능력을 문헌[Yoshida et al., Science, 2016]에 기재된 프로토콜을 사용하여 측정한다. 요약하여, 아이데오넬라 사카이엔시스 및 에스케리키아 콜라이 ADAS의 배양된 시료를 저 결정도 PET 박막(PET 필름)(약 60 mg, 20 × 15 × 0.2 mm, Mw: 45 × 103, Mw/Mn: 1.9, Tg: 77℃, Tm: 255℃, 결정도: 1.9%, 밀도: 1.3378 g/cm3)과 함께 10 mM 인산염 완충제(pH 7.0) 중에 현탁화시킨다. PET 필름을 70% 에탄올 중에 살균시키고, 무균 공기 중에 건조시킨 후에, 시험관 내에 배치한다. 관을 30℃에서 300 스트로크/분에서 진탕시킨다.
CO2 생성의 정량화를 PET 분해의 척도로서 사용한다. 생성된 CO2를 아스카라이트(Ascarite) 내에 포획하고, 중량을 측정하여, 흡수된 CO2를 계산한다. 생물막-유사 물질 및 처리된 PET 필름을 배지로부터 분리하여, 분해된 필름의 탄소 중량을 결정한다. PET로부터 CO2로의 전환율(R)을 하기와 같이 계산한다.
R% = CO2 (PET+) x CO2 (PET-) x 100
_____________________________________
분해된 필름의 탄소 중량
상기 식에서, CO2(PET+) 및 CO2(PET-)는 각각 PET의 존재 및 부재 하에 배양되는 생성된 CO2의 탄소 중량을 나타낸다.
에스케리키아 콜라이 ADAS의 플라스틱 분해 효율을 PETase 지수(Y)를 사용하여 측정하며, 이를 하기와 같이 계산한다:
Y = R(에스케리키아 콜라이 ADAS) /R(아이데오넬라 사카이엔시스)
상기 식에서, R은 상기 나타낸 전환율을 나타낸다.
ADAS를 문헌[Austin et al., PNAS, 2018]에 기재된 바와 같이, 추가로 최적화시켜, 더 큰 활성을 갖는 것으로 나타난 돌연변이된 PETase 효소를 발현시키고, 분해되는 플라스틱의 범위를 증가시킬 수 있다.
실시예 43. T4 분비 시스템을 통한 RNA 분비
T4SS가 DNA를 분비할 수 있는 것이 밝혀진 바 있지만, T4SS가 RNA를 분비할 수 있는 것은 아직 밝혀지지 않았다. 본 실시예에는 RNA에의 RNA-결합 단백질의 커플링을 통한 RNA의 분비가 기재된다.
A.RNA-분비 T4 분비 시스템을 갖는 아그로박테리움의 합성
사카로마이세스 세레비지애(문헌[Generoso et al, J. Microbiol. Meth., 2016] 유래) 및 톰부스바이러스(tombusvirus) p19(유니프로트 Q66104) 서열에 대하여 최적화된 Cas9를 virF 프로모터 하에 VirE2 및 VirF의 N-말단에 융합시킨다. sgRNA 또는 siRNA 서열을 또한 virF 프로모터의 제어 하에 이 서열 상에 둔다. ILV1에 대한 sgRNA 서열은 문헌[Generoso et al, J. Microbiol. Meth., 2016]에 기재되어 있다. 프로토콜은 일부 변형과 함께 문헌[Vergunst et al, PNAS, 2005] 및 문헌[Vergunst et al, Science, 2000]에 기재되어 있다. 요약하여, 플라스미드를 상업적으로 합성하고, T4SS 시스템을 함유하는 아그로박테리움 및 T4SS 시스템을 갖지 않은 아그로박테리움 내에 전기천공시킨다. 이어서, 아그로박테리움을 LB 플레이트 상에서 배양한 다음, 표준 프로토콜에 따라 성장시킨다. 융합 단백질의 존재를 웨스턴 블롯을 통해 입증한다. 추가로, sgRNA 또는 siRNA 서열을 써모 피셔로부터의 상용의 스몰(small) RNA단리 키트를 사용한 RNA 단리 후에 퀀티진(Quantigene) 검정을 통해 확인한다.
B.효모에의 RNA의 T4SS 전달의 입증
효모에의 T4SS의 전달을 위한 프로토콜은 문헌[Schrammeijer et al., Nucl. Acids Res., 2003]에 기재되어 있다. 요약하여, 아그로박테리움 균주를 항생제가 있는 최소 배지 중에서 하룻밤 성장시키고, 수거하고, 유도 배지 중에 희석한 다음, 사용 전에 5시간 동안 성장시킨다. 사카로마이세스 세레비지애 균주를 표준 배지 중에 하룻밤 성장시키고, 1:10 희석하고, 또 다시 5시간 동안 재성장시킨다. 아그로박테리움 및 효모의 배양물을 1:1로 함께 혼합하고, 셀룰로스 니트레이트 필터 상에서 성장시킨다. 6일의 동시 배양 후에, 혼합물을 세포탁심(cefotaxim)이 있는 효모 배지 상에 플레이팅함으로써 분석하고, 효모 콜로니를 성장시키고, 써모 피셔로부터의 상용의 스몰 RNA단리 키트를 사용한 RNA 단리 후에 전달되는 RNA의 존재에 대하여 퀀티진 검정에 의해 분석한다.
C.효모 내의 DNA의 T4SS 매개의 편집의 입증
상기 언급된 프로토콜에 따라, 효모 콜로니를 이소류신이 없는 배지 중에 성장시키고, T4SS가 있는 및 이것이 없는, 및 sgRNA/Cas9 카세트가 있는 및 이것이 없는 아그로박테리움과 동시배양된 것들에 대하여 콜로니를 측정한다.
기타 구현예
본 발명의 일부 구현예는 하기의 넘버링된 단락 내에 있다.
구현예 1.
단리된 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS).
구현예 2.
단락 1에 있어서, 적어도 10000 nm2당 1, 5000 nm2당 1, 3500 nm2당 1, 1000 nm2당 1의 ATP 신타제 농도를 갖는 고활성 ADAS.
구현예 3.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, ADAS가 ATP 신타제를 포함하며, 선택적으로 조절 도메인이 결여되고, 예컨대 엡실론 도메인이 결여되는 고활성 ADAS.
구현예 4.
광전변환 양성자 펌프를 추가로 포함하는, 상기 단락들 중 어느 하나의 고활성 ADAS.
구현예 5.
단락 4에 있어서, 광전변환 양성자 펌프가 프로테오로돕신(proteorhodopsin)인 고활성 ADAS.
구현예 6.
단락 5에 있어서, 프로테오로돕신이 비배양된 해양 박테리아 분류군 SAR86, 진뱅크 수탁 번호: AAS73014.1 유래의 프로테오로돕신의 아미노산 서열을 포함하는, 고활성 ADAS.
구현예 7.
단락 4에 있어서, 광전변환 양성자 펌프가 글로이오박터 로돕신(gloeobacter rhodopsin)인 고활성 ADAS.
구현예 8.
단락 4에 있어서, 광전변환 양성자 펌프는 할로비움 살리나룸(Halobium salinarum) 나트로노모나스 파라오니스(Natronomonas pharaonis), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 할로테리게나 투르크메니카(Haloterrigena turkmenica) 또는 할로아르쿨라 마리스모르투이(Haloarcula marismortui) 유래의 박테리오로돕신, 델타로돕신 또는 할로로돕신인 고활성 ADAS.
구현예 9.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, 레티날을 추가로 포함하는 고활성 ADAS.
구현예 10.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, 레티날 합성 단백질(또는 단백질 시스템) 또는 이를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 고활성 ADAS.
구현예 11.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 당분해 경로 단백질을 추가로 포함하는 고활성 ADAS.
구현예 12.
단락 11에 있어서, 당분해 경로 단백질은 포스포프룩토키나제(Pfk-A)인 고활성 ADAS.
구현예 13.
단락 12에 있어서, Pfk-A가 UniProt 수탁번호 P0A796의 아미노산 서열을 포함하는 고활성 ADAS.
구현예 14.
단락 12에 있어서, 당분해 경로 단백질은 트리오스포스페이트 아이소머라제(tpi)인 고활성 ADAS.
구현예 15.
단락 14에 있어서, tpi가 UniProt 수탁번호 P0A858의 아미노산 서열을 포함하는 고활성 ADAS.
구현예 16.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 대사적으로 비-필수적인 단백질이 결여되는 고활성 ADAS.
구현예 17.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, RNAse, 프로테아제 또는 그의 조합 중 하나 이상이 결여되며, 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 엔도리보뉴클레아제(예컨대, RNAse A, RNAse h, RNAse III, RNAse L, RNAse PhyM) 또는 엑소리보뉴클레아제(예컨대, RNAse R, RNAse PH, RNAse D); 또는 세린, 시스테인, 트레오닌, 아스파르틱, 글루타믹 및 금속-프로테아제 또는 상기의 것들 중 임의의 것의 조합이 결여되는, 고활성 ADAS.
구현예 18.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 분비 시스템을 추가로 포함하는 고활성 ADAS.
구현예 19.
단락 18에 있어서, 박테리아 분비 시스템이 ADAS 외막을 가로질러 표적 세포, 예를 들어 동물, 진균, 박테리아, 또는 식물 세포 내로 카고를 방출시킬 수 있는 고활성 ADAS.
구현예 20.
단락 18 또는 단락 19에 있어서, 박테리아 분비 시스템이 T3SS, T4SS, 또는 T6SS인 고활성 ADAS.
구현예 21.
단락 18 또는 단락 19에 있어서, 박테리아 분비 시스템이 T3/4SS인 고활성 ADAS.
구현예 22.
단락 21에 있어서, T3/4SS는 변형된 이펙터 기능, 예를 들어, SopD2, SopE, Bop, Map, Tir, EspB, EspF, NleC, NleH2 또는 NleE2로부터 선택되는 이펙터를 갖는 고활성 ADAS.
구현예 23.
단락 22에 있어서, 변형된 이펙터 기능은 세포내 표적화, 예컨대, 핵, 골지, 미토콘드리아, 액틴, 미세융모, ZO-1, 미세소관 또는 세포질 내에의 전좌를 위한 것인 고활성 ADAS.
구현예 24.
단락 22에 있어서, 변형된 이펙터 기능은 이. 콜라이에서 유래한 NleE2를 기반으로 한 핵 표적화인 고활성 ADAS.
구현예 25.
단락 22에 있어서, 변형된 이펙터 기능은 사상위족 형성, 밀착 연접 파괴, 미세융모 소실 또는 SGLT-1 비활성화를 위한 것인 고활성 ADAS.
구현예 26.
단락 18 또는 단락 19에 있어서, 박테리아 분비 시스템이 T6SS인 고활성 ADAS.
구현예 27.
단락 26에 있어서, T6SS는 그의 천연의 숙주에서 박테리아를 표적화하며, 박테리아를 사멸시키는 이펙터를 함유하는 고활성 ADAS.
구현예 28.
단락 26 또는 단락 27에 있어서, T6SS는 슈도모나스 푸티다(P. putida) K1-T6SS로부터 유래되며, 선택적으로, 이펙터는 Tke2의 아미노산 서열(수탁 번호 AUZ59427.1)을 포함하는 고활성 ADAS.
구현예 29.
단락 26에 있어서, T6SS는 그의 천연의 숙주에서 진균을 표적화하며, 진균을 사멸시키는 이펙터를 함유하는 고활성 ADAS.
구현예 30.
단락 29에 있어서, T6SS는 세라티아 마르세슨스(Serratia Marcescens)로부터 유래되며, 이펙터는 Tfe1(진뱅크(Genbank): SMDB11_RS05530) 또는 Tfe2(진뱅크: SMDB11_RS05390)의 아미노산 서열을 포함하는 고활성 ADAS.
구현예 31.
단락 18에 있어서, 박테리아 분비 시스템이 카고를 세포외로 방출시킬 수 있는 고활성 ADAS.
구현예 32.
단락 31에 있어서, 박테리아 분비 시스템이 T1SS, T2SS, T5SS, T7SS, Sec, 또는 Tat인 고활성 ADAS.
구현예 33.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, 막 내에 수송체를 포함하는 고활성 ADAS.
구현예 34.
단락 33에 있어서, 수송체는 글루코스, 나트륨, 칼륨, 금속 이온, 음이온 용질, 양이온 용질 또는 물에 특이적인 고활성 ADAS.
구현예 35.
막이 표적화 제제를 포함하는, 상기 단락들 중 어느 하나의 고활성 ADAS.
구현예 36.
단락 35에 있어서, 표적화 제제가 나노바디, 예컨대 종양 항원과 관련된 나노바디, 예컨대 HER2, PSMA, 또는 VEGF-R인 고활성 ADAS.
구현예 37.
단락 35에 있어서, 표적화 제제가 탄수화물 결합 단백질, 예컨대 렉틴, 예를 들어, 만노스 결합 렉틴(MBL)인 고활성 ADAS.
구현예 38.
단락 35에 있어서, 표적화 제제가 종양-표적화 펩티드, 예컨대 RGD 모티프 또는 CendR 펩티드인 고활성 ADAS.
구현예 39.
ADAS가 효소를 포함하는, 상기 단락들 중 어느 하나의 고활성 ADAS.
구현예 40.
단락 39에 있어서, 효소가 프로테아제, 산화환원효소, 또는 그의 조합인 고활성 ADAS.
구현예 41.
단락 39 또는 단락 40에 있어서, 효소가 ADAS 막에, 선택적으로 링커를 통해 외막에 화학적으로 컨쥬게이트되는 고활성 ADAS.
구현예 42.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, ADAS의 내부 부피에 분산된 카고를 포함하며, 카고는 핵산, 리보솜, 펩티드, 호르몬, 아미노산, 탄수화물, 지질, 단백질, 유기 분자, 무기 분자, 소분자, 또는 그의 조합을 포함하는 고활성 ADAS.
구현예 43.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, ADAS가 카고 및 박테리아 분비 시스템을 포함하며, 선택적으로 카고가 박테리아 분비 시스템에 의한 유출을 지시하는 모이어티를 포함하며, 예를 들어, 일부 구현예에서, 모이어티는 Pho/D, Tat 또는 합성 펩티드 신호인 고활성 ADAS.
구현예 44.
단락 42 또는 단락 43에 있어서, 카고가 미변형된 버전의 카고에 비하여 개선된 안정성을 위하여 변형되는 ADAS.
구현예 45.
단락 42 내지 단락 44 중 어느 한 단락에 있어서, 카고가 단백질을 포함하는 고활성 ADAS.
구현예 46.
단락 45에 있어서, 단백질이 호르몬, 예를 들어, 파라크린, 엔도크린, 오토크린인 고활성 ADAS.
구현예 47.
단락 60 또는 단락 61에 있어서, 단백질이 세포 세포질 또는 다른 환경에서 약 1.01, 1.1, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 100000, 10000000 초과의 안정성을 갖는 고활성 ADAS.
구현예 48.
단락 42 내지 단락 44 중 어느 한 단락에 있어서, 카고가 식물 호르몬, 예컨대 아브시스산, 옥신, 사이토키닌, 에틸렌, 지베렐린 또는 그의 조합을 포함하는 고활성 ADAS.
구현예 49.
단락 42 내지 단락 44 중 어느 한 단락에 있어서, 카고가 면역 조절제, 예컨대 면역 자극제, (예를 들어, PD-1, PD-L1, CTLA-4의) 관문 저해제, 억제제, 슈퍼 항원, 소분자(사이클로스포린 A, 사이클릭 디뉴클레오티드(CDN) 또는 STING 효능제(예를 들어, MK-1454))인 고활성 ADAS.
구현예 50.
단락 42 내지 단락 44 중 어느 한 단락에 있어서, 카고가 RNA, 예컨대 원형 RNA, mRNA, siRNA, shRNA, ASO, tRNA 또는 그의 조합을 포함하는, 고활성 ADAS.
구현예 51.
단락 50에 있어서, 카고가 단백질-코딩 mRNA인 고활성 ADAS.
구현예 52.
단락 51에 있어서, 단백질-코딩 mRNA는 효소(예를 들어, 및 간 효소 활성을 부여하는 효소, 예컨대 인간 PBGD(hPBGD) mRNA), 또는 예를 들어, 면역 반응을 유도하는(예컨대, 강력하고 영구적인 중화 항체 역가를 유도하는) 항원을 인코딩하며, 예컨대 CMV 당단백질 gB 및/또는 오량체 복합체(PC)를 인코딩하는 mRNA인 고활성 ADAS.
구현예 53.
단락 50에 있어서, RNA가 작은 비-코딩 RNA, 예컨대 shRNA, ASO, tRNA 또는 그의 조합인 고활성 ADAS.
구현예 54.
단락 50 내지 단락 53 중 어느 한 단락에 있어서, RNA가 예를 들어, 부가된 스템-루프 구조, 예컨대 tRNA 스캐폴드를 사용하여 안정화되는 고활성 ADAS.
구현예 55.
단락 65 내지 단락 70 중 어느 한 단락에 있어서, RNA가 예를 들어 ADAS 플라즘에서 약 1.01, 1.1,10, 100, 1000, 10000, 100000, 100000, 10000000 초과의 안정성을 갖는 ADAS.
구현예 56.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, 고활성 ADAS가 카고를 분해하지 않는 고활성 ADAS.
구현예 57.
단락 42 또는 단락 43에 있어서, 카고가 유전자 편집 시스템을 포함하는 고활성 ADAS.
구현예 58.
단락 58에 있어서, 카고가 DNA, 예컨대 플라스미드, 또는 원형 RNA이며, 선택적으로 DNA 또는 원형 RNA가 단백질-코딩 서열을 포함하는 고활성 ADAS.
구현예 59.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, ADAS가 2개-막 ADAS인 고활성 ADAS.
구현예 60.
단락 59에 있어서, 2개-막 ADAS가 박테리아 분비 시스템을 추가로 포함하는 고활성 ADAS.
구현예 61.
단락 60에 있어서, 박테리아 분비 시스템이 T3SS, T4SS, T3/4SS 또는 T6SS로부터 선택되며, 선택적으로, T3SS, T4SS, T3/4SS 또는 T6SS는 표적 세포의 건강에 영향을 미치지 않는 약독화된 또는 비-기능적 이펙터를 갖는 고활성 ADAS.
구현예 62.
단락 59 내지 단락 61 중 어느 한 단락의 고활성 ADAS로서, 박테리아 부모 균주로부터 유래되며, 부모 균주가 식물 박테리아, 예컨대 식물 편리공생체(예를 들어, 바실러스 서브틸리스 또는 슈도모나스 푸티다) 또는 식물 병원체 박테리아(예를 들어, 잔토모나스 종 또는 슈도모나스 시린가에) 또는 인간 박테리아, 예컨대 편리공생성 인간 박테리아(예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 스타필로코커스 종, 비피도박테리움 종, 마이크로코커스 종, 락토바실러스 종 또는 악티노마이세스 종) 또는 병원성 인간 박테리아(예를 들어, 에스케리키아 콜라이 EHEC, 살모넬라 타이피무리움, 시겔라 플렉스네리, 예르시니아 엔테롤리티카, 헬리코박터 파일로리), 또는 극한생물로부터 선택되며, 이는 예를 들어, 기능적 카세트, 예컨대 박테리아가: 항미생물제 분비, 플라스틱 분해, 살충제 분비, 극한 환경에서 생존, 나노입자 제조, 다른 유기체 내의 통합, 환경에 대한 반응 및 리포터 신호 생성 중 하나 이상을 행하도록 유도하는 기능적 카세트를 포함하는, 상기의 것들 중 임의의 것의 작용화된 유도체를 포함하는, 고활성 ADAS.
구현예 63.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, 이. 콜라이, 아그로박테리움, 리조비움, 슈도모나스, 잔토모나스, 아나플라즈마, 헬리코박터, 세라티아, 비브리오, 살모넬라, 또는 시겔라로부터 선택된 부모 균주로부터 유래되는 고활성 ADAS.
구현예 64.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, ATP 신타제를 과발현하도록 조작되거나 유도된 부모 균주로부터 유래되는 고활성 ADAS.
구현예 65.
단락 64에 있어서, ADAS가 부모 균주에 대해 이종성인 ATP 신타제를 포함하는 고활성 ADAS.
구현예 66.
단락 64 또는 단락 65에 있어서, 부모 균주가 기능성 FoF1 ATP 신타제를 발현하도록 변형되는 고활성 ADAS.
구현예 67.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, 하기로부터 선택되는 조건 하에서 배양되는 부모 균주로부터 수득되는 고활성 ADAS: 인가된 전압(예를 들어, 37 mV), 비-대기 산소 농도(예를 들어, 1 내지 5% O2, 5 내지 10% O2, 10 내지 15% O2, 25 내지 30% O2), 낮은 pH(약: 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5) 또는 그의 조합.
구현예 68.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, 하기 중 적어도 1, 2, 3, 4가지 또는 그 이상에 대하여 영양요구성인 부모 균주로부터 유래되는 고활성 ADAS: 아르기닌(예를 들어, argA에서의 낙아웃, 예컨대 균주 JW2786-1 및 NK5992), 시스테인 cysE에서의 낙아웃(예컨대 균주 JW3582-2 및 JM15), 글루타민, 예를 들어, glnA에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW3841-1 및 M5004), 글리신, 예를 들어, glyA에서의 낙아웃(예컨대 균주 JW2535-1 및 AT2457), 히스티딘, 예를 들어, hisB에서의 낙아웃(예컨대 균주 JW2004-1 및 SB3930), 이소류신, 예를 들어, ilvA에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW3745-2 및 AB1255), 류신, 예를 들어, leuB에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW5807-2 및 CV514), 라이신, 예를 들어, lysA에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW2806-1 및 KL334), 메티오닌, 예를 들어, metA에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW3973-1 및 DL41), 페닐알라닌, 예를 들어, pheA에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW2580-1 및 KA197), 프롤린, 예를 들어, proA에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW0233-2 및 NK5525), 세린, 예를 들어, serA에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW2880-1 및 JC158), 트레오닌, 예를 들어, thrC에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW0003-2 및 Gif 41), 트립토판, 예를 들어, trpC에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW1254-2 및 CAG18455), 티로신, 예를 들어, tyrA에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW2581-1 및 N3087), 발린/이소류신/류신, 예를 들어, ilvd에서의 낙아웃(예컨대, 균주 JW5605-1 및 CAG18431).
구현예 69.
상기 단락들 중 어느 하나의 고활성 ADAS로서, 박테리아 세포로부터 제조되며, 부모 균주가 식물 박테리아, 예컨대 식물 편리공생체(예를 들어, 바실러스 서브틸리스 또는 슈도모나스 푸티다) 또는 식물 병원체 박테리아(예를 들어, 잔토모나스 종 또는 슈도모나스 시린가에) 또는 인간 박테리아, 예컨대 편리공생성 인간 박테리아(예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 스타필로코커스 종, 비피도박테리움 종, 마이크로코커스 종, 락토바실러스 종 또는 악티노마이세스 종) 또는 병원성 인간 박테리아(예를 들어, 에스케리키아 콜라이 EHEC, 살모넬라 타이피무리움, 시겔라 플렉스네리, 예르시니아 엔테롤리티카, 헬리코박터 파일로리), 또는 극한생물로부터 선택되며, 이는 예를 들어, 기능적 카세트, 예컨대 박테리아가: 항미생물제 분비, 플라스틱 분해, 살충제 분비, 극한 환경에서 생존, 나노입자 제조, 다른 유기체 내의 통합, 환경에 대한 반응 및 리포터 신호 생성 중 하나 이상을 행하도록 유도하는 기능적 카세트를 포함하는, 상기의 것들 중 임의의 것의 작용화된 유도체를 포함하는, 고활성 ADAS.
구현예 70.
상기 단락들 중 어느 하나에 있어서, 변형된 막을 포함하는, 고활성 ADAS.
구현예 71.
단락 70에 있어서, 막이 식물 또는 동물에서 덜 면역원성이거나 덜 면역자극성이도록 변형되는 고활성 ADAS.
구현예 72.
단락 71에 있어서, 부모 균주로부터 제조되며, 부모 균주의 면역자극 능력은 세제, 효소 또는 PEG를 사용한 작용화를 사용하여 생성 후 처리를 통해 감소되거나 제거되는 고활성 ADAS.
구현예 73.
단락 71에 있어서, 부모 균주로부터 제조되며, 막은 예를 들어, msbB 및/또는 purI를 낙아웃시킴으로써 부모 균주에서 LPS 합성 경로의 낙아웃을 통해 변형되는 고활성 ADAS.
구현예 74.
단락 71에 있어서, 고삼투압 조건에 대한 노출을 통해 세포벽-결함 입자를 생성하는 부모 균주로부터 제조되는 고활성 ADAS.
구현예 75.
상기 단락들 중 어느 하나의 고활성 ADAS를 포함하는 조성물.
구현예 76.
적어도 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9%, 또는 그 이상의 박테리아 분비 시스템을 함유하는 ADAS를 함유하는 조성물.
구현예 77.
단락 76에 있어서, 박테리아 분비 시스템이 T3SS, T4SS, T3/4SS, 또는 T6SS 중 하나인 조성물.
구현예 78.
ADAS의 조성물로서, T3SS를 포함하며, 여기서, ADAS는 약 40000, 35000,30000, 25000, 19600, 15000, 10000, 또는 5000 nm2 내에 1 초과의 평균 T3SS 막 밀도를 포함하는 조성물.
구현예 79.
단락 78에 있어서, ADAS가 에스. 티피뮤리움 또는 이. 콜라이 부모 균주로부터 유래되는 조성물.
구현예 80.
ADAS의 조성물로서, T3SS를 포함하며, 여기서, ADAS는 약 300000, 250000, 200000, 150000, 100000, 50000, 20000, 10000, 5000 nm2 내에 1 초과의 평균 T3SS 막 밀도를 포함하는 조성물.
구현예 81.
단락 80에 있어서, ADAS가 아그로박테리움 투메파시엔스 부모 균주로부터 유래되는 조성물.
구현예 82.
적어도 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9% 또는 그 이상의 ADAS는 T3, T4, T3/4SS, T6SS를 포함하고, 선택적으로 외인성 탄수화물, 인산염 생성 신타제, 광 반응성 단백질, 유입 단백질, 효소, 기능적 카고, 유기체-특이적 이펙터, 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 박테리아 분비 시스템을 함유하는, ADAS의 조성물.
구현예 83.
단락 75 내지 단락 82 중 어느 한 단락에 있어서, ADAS가 고활성 ADAS인 조성물.
구현예 84.
단락 75 내지 단락 83 중 어느 한 단락에 있어서, IP, IV, IM, 경구, 국소(크림, 겔, 연고, 경피 패치), 에어로졸화 또는 분무화 투여를 위해 제형화되는 조성물.
구현예 85.
단락 75 내지 단락 84 중 어느 한 단락에 있어서, 액체 제형, 또는 동결건조 제형인 조성물.
구현예 86.
단락 1 내지 단락 74 중 어느 한 단락의 ADAS 중 임의의 하나를 제조하는 방법으로서, ADAS 형성을 촉진하는 조건 하에 부모 균주를 배양하는 단계, 및 ADAS를 수집하는 단계를 포함하며, 선택적으로 임의의 잔여 부모 균주 세포 또는 다른 오염물질로부터 ADAS를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구현예 87.
단락 86에 있어서, 단일, 이중, 삼중 또는 사중 영양요구성 부모 균주를 사용하는 것을 포함하며, 상기 부모 균주는 ftsZ를 발현하는 플라스미드를 추가로 포함하는 방법.
구현예 88.
단락 86에 있어서, 부모 균주를 유도성 DNAse 시스템, 예컨대 exoI(NCBI GeneID: 946529) 및 sbcD(NCBI GeneID: 945049) 뉴클레아제 또는 I-CeuI(예를 들어, 스위스프로트(Swissprot): P32761.1) 뉴클레아제를 사용하여 형질전환시키는 단계를 포함하는 방법.
구현예 89.
단락 88에 있어서, 단일, 이중, 삼중 또는 사중 영양요구성 균주를 사용하는 것과, 유도성 뉴클레아제를 인코딩하는 플라스미드 상에 상보성 유전자를 갖는 것을 포함하는 방법.
구현예 90.
단락 86에 있어서, 부모 균주가 인가되는 전압(예를 들어, 37 mV), 비-대기 산소 농도(예를 들어, 1 내지 5% O2, 5 내지 10% O2, 10 내지 15% O2, 25 내지 30% O2), 낮은 pH(4.5-6.5) 또는 그의 조합으로부터 선택되는 조건 하에서 배양되는 방법.
구현예 91.
단락 86에 있어서, 부모 균주가 편모 및 원하지 않는 분비 시스템이 결여되며, 선택적으로, 편모 및 원하지 않는 분비 시스템은 람다 레드(lambda red) 재조합을 사용하여 제거되는 방법.
구현예 92.
단락 86에 있어서, 편모 방제 구성성분이 편모 방제 유전자, 예컨대 flhD 및 flhC를 향해 표적화된 CRISPR 도메인을 함유하는 플라스미드의 삽입을 통해 부모 균주 게놈으로부터 절제되는 방법.
구현예 93.
고활성 ADAS를 제조하기 위한 방법으로서, 로돕신-인코딩 유전자를 함유하는 플라스미드를 포함하는 ADAS는 광의 존재 하에 배양되는 방법.
구현예 94.
단락 93에 있어서, 로돕신이 진뱅크 수탁 번호: AAS73014.1의 아미노산 서열을 갖는 SAR86 비배양된 박테리아 유래의 프로테오로돕신이며, 추가로 선택적으로 배양물은 레티날이 보충되는 방법.
구현예 95.
단락 93 또는 단락 94에 있어서, 로돕신이 프로테오로돕신이며, 플라스미드는 레티날을 함유하는 유전자를 추가적으로 함유하는(이러한 플라스미드는 문헌[Kim et al., Microb Cell Fact, 2012]으로부터의 pACYC-RDS 플라스미드이다) 방법.
구현예 96.
단락 86 내지 단락 95 중 어느 한 단락에 있어서, 부모 균주가 이어서 ADAS의 막 상에 발현되는 나노바디를 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 방법.
구현예 97.
단락 86 내지 단락 95 중 어느 한 단락에 있어서, 부모 균주가 하나 이상의 박테리아 분비 시스템 오페론을 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 방법.
구현예 98.
단락 86 내지 단락 97 중 어느 한 단락에 있어서, 부모 균주가 카고를 포함하는 방법.
구현예 99.
단락 86 내지 단락 97 중 어느 한 단락에 있어서, 부모 균주는 소분자 카고를 합성하는 일련의 유전자를 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 방법.
구현예 100.
단락 86 내지 단락 99 중 어느 한 단락의 방법에 의해 제조되는 ADAS.
구현예 101.
동물 세포의 상태를 조절하는 방법으로서, 유효량의 ADAS 또는 동물 세포에 접근 가능한 상기 단락들 중 어느 하나의 조성물을 제공하는 것을 포함하는 방법.
구현예 102.
단락 101에 있어서, ADAS 또는 조성물에는, 동물, 예컨대 포유동물, 예컨대 인간에서, 생체 내에서 동물 세포에 대한 접근이 제공되는, 방법.
구현예 103.
단락 102에 있어서, 동물 세포가 건강한 동물 내의 박테리아에 노출되는 방법.
구현예 104.
단락 103에 있어서, 동물 세포가 폐 상피, 면역 세포, 피부 세포, 구강 상피 세포, 소화관 상피 세포, 생식관 상피 세포 또는 요로 세포인 방법.
구현예 105.
단락 104에 있어서, 동물 세포가 소화관 상피 세포, 예컨대 염증성 장 질병, 예컨대 크론병 또는 대장염을 갖는 인간 대상체 유래의 소화관 상피 세포인 방법.
구현예 106.
단락 105에 있어서, 동물 세포가 염증성 장 질병을 갖는 대상체 유래의 소화관 상피 세포이며, ADAS는 박테리아 분비 시스템 및 항-염증제를 포함하는 카고를 포함하는 방법.
구현예 107.
단락 102에 있어서, 동물 세포가 질병 이환 상태인 박테리아에 노출되는 방법.
구현예 108.
단락 102에 있어서, 동물 세포가 병원성, 예를 들어 종양인 방법.
구현예 109.
단락 102에 있어서, 동물 세포가 질병 이환 상태, 예를 들어, 상처, 궤양, 종양, 또는 염증성 장애 내의 박테리아에 노출되는 방법.
구현예 110.
단락 102 내지 단락 109 중 어느 한 단락에 있어서, ADAS가 동물 편리공생성 부모 균주로부터 유래되는 방법.
구현예 111.
단락 102 내지 단락 109 중 어느 한 단락에 있어서, ADAS가 동물 병원성 부모 균주로부터 유래되는 방법.
구현예 112.
단락 102에 있어서, 동물 세포가 T3/4SS 또는 T6SS 및 카고를 포함하는 유효량의 ADAS와 접촉되며, 카고는 동물 세포 내에 전달되는 방법.
구현예 113.
단락 102에 있어서, 동물 세포에는, 카고 및 분비 시스템을 포함하는 유효량의 ADAS에 대한 접근이 제공되며, 카고는 세포외로 분비되며, 동물 세포와 접촉하는 방법.
구현예 114.
동물 세포의 상태를 조절하는 방법으로서, 유효량의 ADAS 또는 동물 세포 부근의 박테리아 또는 진균 세포에 접근 가능한 단락 1 내지 단락 85 중 어느 한 단락의 조성물을 제공하는 것을 포함하는 방법.
구현예 115.
단락 114에 있어서, 박테리아 또는 진균 세포가 병원성인 방법.
구현예 116.
단락 115에 있어서, 병원성 박테리아 또는 진균 세포의 건강이 감소되는 방법.
구현예 117.
단락 114에 있어서, 박테리아 또는 진균 세포가 편리공생성인 방법.
구현예 118.
단락 117에 있어서, 편리공생성 박테리아 또는 진균 세포의 건강이 증가되는 방법.
구현예 119.
단락 118에 있어서, 중성, 편리공생성, 또는 병원성일 수 있는 경쟁 박테리아 또는 진균의 수의 건강 감소를 통해 건강이 증가되는 방법.
구현예 120.
단락 114에 있어서, 박테리아 또는 진균 세포가 T3/4SS 또는 T6SS 및 카고를 포함하는 유효량의 ADAS와 접촉되며, 카고는 박테리아 또는 진균 세포 내에 전달되는 방법.
구현예 121.
제120항에 있어서, 박테리아 또는 진균 세포에는, 박테리아 또는 진균 세포와 접촉하는 카고를 세포외로 분비하는 유효량의 ADAS에 대한 접근이 제공되는 방법.
구현예 122.
단락 114 내지 단락 121 중 어느 한 단락에 있어서, ADAS가 박테리아 또는 진균 세포의 경쟁자인 부모 균주로부터 유래되는 방법.
구현예 123.
단락 114 내지 단락 121 중 어느 한 단락에 있어서, ADAS가 박테리아 또는 진균 세포의 상리공생균인 부모 균주로부터 유래되는 방법.
구현예 124.
진균 세포의 상태의 조절 방법으로서, a) 식물 또는 진균 세포, b) 식물 또는 진균 세포 부근의 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포, 또는 c) 식물 또는 진균 세포 부근의 곤충 또는 선충 세포에 대한 유효량의 단락 1 내지 단락 85 중 어느 한 단락의 ADAS 또는 조성물 접근을 제공하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 125.
단락 124에 있어서, ADAS 또는 조성물에는, 식물계 내에서, 예를 들어, 농작 식물, 예컨대 줄뿌림 작물, 예를 들어, 옥수수, 밀, 대두 및 벼, 및 채소 작물, 예를 들어, 솔라나세아에(solanaceae), 예컨대 토마토 및 후추; 조롱박, 예컨대 멜론 및 오이; 브라시카(brassicas), 예컨대 양배추 및 브로콜리; 녹색 채소, 예컨대 케일 및 상추; 뿌리 및 덩이뿌리, 예컨대 감자 및 당근; 대립종 채소, 예컨대 콩 및 옥수수; 및 버섯에서 식물 세포에 대한 접근이 제공되는 방법.
구현예 126.
단락 125에 있어서, 식물 또는 진균 세포가 건강한 식물 또는 진균 내의 박테리아에 노출되는 방법.
구현예 127.
단락 125에 있어서, 식물 또는 진균 세포가 질병 이환 상태인 박테리아에 노출되는 방법.
구현예 128.
단락 125에 있어서, 식물 또는 진균 세포가 분열조직 세포와 같이 분열하거나, 종양과 같이 병원성인 방법.
구현예 129.
단락 125에 있어서, 식물 또는 진균 세포가 질병 상태, 예컨대 상처 내의 박테리아에 노출되며, 식물 또는 진균 세포는 인간 음식물의 일부가 아닌 방법.
구현예 130.
단락 124 내지 단락 129 중 어느 한 단락에 있어서, ADAS가 편리공생성 부모 균주로부터 유래되는 방법.
구현예 131.
단락 124 내지 단락 129 중 어느 한 단락에 있어서, ADAS가 식물 또는 진균 병원성 부모 균주로부터 유래되는 방법.
구현예 132.
단락 124에 있어서, ADAS가 T3/4SS 또는 T6SS 및 카고를 포함하며, 카고가 식물 또는 진균 세포 내로 전달되는 방법.
구현예 133.
제124항에 있어서, 식물 또는 진균 세포에는, 박테리아 분비 시스템 및 카고를 포함하는 유효량의 ADAS에 대한 접근이 제공되며, 박테리아 분비 시스템은 카고를 세포외로 분비함으로써, 식물 또는 진균 세포를 카고와 접촉시키는 방법.
구현예 134.
단락 124에 있어서, 식물 또는 진균 세포 부근의 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포에 대한 유효량의 ADAS 또는 조성물 접근을 제공하는 것을 포함하는 방법.
구현예 135.
제134항에 있어서, 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포는 병원성이며, 선택적으로 병원성 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포의 건강이 감소되는 방법.
구현예 136.
제134항에 있어서, 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포는 편리공생성이며, 선택적으로 편리공생성 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포의 건강이 증가되는 방법.
구현예 137.
단락 136에 있어서, 중성, 편리공생성, 또는 병원성일 수 있는 경쟁 박테리아 또는 경쟁 진균의 감소를 통해 건강이 증가되는 방법.
구현예 138.
단락 134에 있어서, 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포는 T3/4SS 또는 T6SS 및 카고를 포함하는 유효량의 ADAS와 접촉되며, 카고는 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포 내에 전달되는 방법.
구현예 139.
단락 134에 있어서, 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포에는 박테리아 분비 시스템 및 카고를 포함하는 유효량의 ADAS에 대한 접근이 제공되며, 박테리아 분비 시스템은 카고를 세포외로 분비함으로써, 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포를 카고와 접촉시키는 방법.
구현예 140.
단락 134 내지 단락 139 중 어느 한 단락에 있어서, ADAS가 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포의 경쟁자인 부모 균주로부터 유래되는 방법.
구현예 141.
단락 134 내지 단락 139 중 어느 한 단락에 있어서, ADAS가 인접 박테리아 또는 인접 진균 세포의 상리공생 박테리아인 부모 균주로부터 유래되는 방법.
구현예 142.
단락 124에 있어서, 식물 또는 진균 부근의 곤충 또는 선충 세포에 대한 유효량의 ADAS 또는 조성물 접근을 제공하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 143.
단락 142에 있어서, 곤충 또는 선충이 병원성인 방법.
구현예 144.
단락 142에 있어서, 병원성 곤충 또는 선충 세포의 건강이 감소되는 방법.
구현예 145.
단락 144에 있어서, 병원성 곤충 또는 선충 세포의 건강이 곤충 또는 선충 세포 내의 공생생물의 조절을 통해 감소되는 방법.
구현예 146.
단락 142에 있어서, 곤충 또는 선충이 편리공생성인 방법.
구현예 147.
단락 146에 있어서, 편리공생성 곤충 또는 선충 세포의 건강이 증가되는 방법.
구현예 148.
단락 147에 있어서, 중성, 편리공생성, 또는 병원성일 수 있는 경쟁 박테리아 또는 진균의 감소를 통해 건강이 증가되는 방법.
구현예 149.
환경을 유효량의 ADAS, 예컨대 단락 1 내지 단락 84 중 어느 한 단락의 ADAS 또는 조성물과 접촉시키는 단계로서, ADAS가 하나 이상의 바람직하지 않은 물질을 흡수하거나, 킬레이트화시키거나 또는 분해하는 하나 이상의 분자(예컨대, 단백질, 폴리머, 나노입자, 결합제 또는 그의 조합)를 포함하는 단계를 포함하는, 환경으로부터 하나 이상의 바람직하지 않은 물질의 제거 방법.
구현예 150.
단락 149에 있어서, 바람직하지 않은 물질은 중금속, 예컨대 수은을 포함하며, ADAS는 중금속에 결합하는 하나 이상의 분자(예컨대, 단백질, 폴리머, 나노입자, 결합제 또는 그의 조합), 예컨대 수은에 대한 MerR을 포함하는 방법.
구현예 151.
단락 149에 있어서, 바람직하지 않은 물질은 플라스틱, 예컨대 PET를 포함하며, ADAS는 하나 이상의 플라스틱 분해 효소, 예컨대 PETase를 포함하는 방법.
구현예 152.
단락 149에 있어서, 바람직하지 않은 물질은 하나 이상의 유기 소분자를 포함하며, ADAS는 상기 하나 이상의 유기 소분자를 대사시킬 수 있는 하나 이상의 효소를 포함하는 방법.
구현예 153.
박테리아 또는 ADAS를 포함하는 조성물로서, 박테리아 또는 ADAS는 T4SS, RNA 결합 단백질 카고 및 RNA 결합 단백질에 의해 결합되는 RNA 카고를 포함하며, T4SS를 통한 표적 세포 내의 전달에 적합한 조성물.
구현예 154.
단락 153에 있어서, RNA 결합 단백질은 VirE2 및 VirF에 융합된 Cas9이며, RNA 카고는 가이드 RNA이며, 선택적으로, T4SS는 아그로박테리움(Agrobacterium) 유래의 Ti 시스템인 조성물.
구현예 155.
단락 153에 있어서, RNA 결합 단백질은 VirE2 또는 VirF에 융합된 카네이션 이탈리안 링스폿(Carnation Italian Ringspot) 바이러스 유래의 p19이며, RNA 카고는 siRNA이며, 선택적으로, T4SS는 아그로박테리움 유래의 Ti 시스템인 조성물.
구현예 156.
단락 156의 조성물을 제조하는 방법으로서, VirE2 및 VirF에 융합된 Cas9 및 RNA 카고를 함유하는 플라스미드를 아그로박테리움 세포 내에 트랜스펙션시키는 방법.
구현예 157.
식물 세포 또는 동물 세포에의 RNA의 전달 방법으로서, 식물 세포 또는 동물 세포를 박테리아 또는 ADAS와 접촉시키는 단계를 포함하며, 박테리아 또는 ADAS가 T4SS, RNA 결합 단백질 카고 및 RNA 카고를 포함하는 방법.
구현예 158.
식물 세포 또는 동물 세포에의 RNA 및 단백질의 전달 방법으로서, 식물 세포 또는 동물 세포를 박테리아 또는 ADAS와 접촉시키는 단계를 포함하며, 박테리아 또는 ADAS가 T4SS, RNA 결합 단백질 카고 및 RNA 카고를 포함하는 방법.
SEQUENCE LISTING <110> Flagship Pioneering Innovations VI, LLC <120> ACHROMOSOMAL DYNAMIC ACTIVE SYSTEMS <130> 51296-033WO2 <150> US 62/777,305 <151> 2018-12-10 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 88 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Ala Leu Leu Asp Phe Phe Leu Ser Arg Lys Lys Asn Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ile Ala Lys Glu Arg Leu Gln Ile Ile Val Ala Glu Arg Arg Arg Ser 20 25 30 Asp Ala Glu Pro His Tyr Leu Pro Gln Leu Arg Lys Asp Ile Leu Glu 35 40 45 Val Ile Cys Lys Tyr Val Gln Ile Asp Pro Glu Met Val Thr Val Gln 50 55 60 Leu Glu Gln Lys Asp Gly Asp Ile Ser Ile Leu Glu Leu Asn Val Thr 65 70 75 80 Leu Pro Glu Ala Glu Glu Leu Lys 85 <210> 2 <211> 231 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Ser Asn Thr Pro Ile Glu Leu Lys Gly Ser Ser Phe Thr Leu Ser 1 5 10 15 Val Val His Leu His Glu Ala Glu Pro Lys Val Ile His Gln Ala Leu 20 25 30 Glu Asp Lys Ile Ala Gln Ala Pro Ala Phe Leu Lys His Ala Pro Val 35 40 45 Val Leu Asn Val Ser Ala Leu Glu Asp Pro Val Asn Trp Ser Ala 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agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 3000 agcgaggtat gtaggcg 3017 <210> 24 <211> 3528 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 gatacgggag ggcttaccat ctggccccag ggctgcaata ataccgcggg acccacgctc 60 accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 120 tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag cgagagtaag 180 aagttcgcca gttaagagtt tgcgcaacgt tgttgccata gctacaggca tcgtggtgtc 240 acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 300 atgatcaccc atgttgtgca aaaaagcggt aagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 360 aagtaagttg gccgccgtgt tatcactcat ggttatggca gcgctgcata attcgcgtac 420 tgtcatgccg tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 480 agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc 540 gccacagagc agaactttaa aagtgctcat cattgggaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 600 ctcaagaatc ttaccgctgt tgaggtccag ttcgatgtaa cccacacgtg cacccaactg 660 atcttcggca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga 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Claims (130)

  1. 복수의 ADAS를 포함하는 조성물의 제조 방법으로서, 상기 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없으며, 상기 방법은:
    (a) 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성의 감소를 갖는 복수의 부모 박테리아를 제조하거나, 제공하거나 또는 수득하는 단계;
    (b) 부모 박테리아를 미니세포의 형성을 가능하게 하는 조건에 노출시키는 단계; 및
    (c) 미니세포를 부모 박테리아로부터 분리함으로써, 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 생성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자가 SEQ ID NO: 1에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자가 SEQ ID NO: 1에 대하여 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자가 minE 폴리펩티드인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 부모 박테리아가 에스케리키아 콜라이(E. coli)이며, minE 폴리펩티드는 에스케리키아 콜라이 minE인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 부모 박테리아가 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)이며, minE 폴리펩티드는 살모넬라 타이피무리움 minE인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 부모 박테리아가 Z-링 저해 단백질의 수준 또는 활성의 감소를 갖는 방법.
  8. 제7항에 있어서, Z-링 저해 단백질이 SEQ ID NO: 2에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, Z-링 저해 단백질이 SEQ ID NO: 3에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 방법.
  10. 제8항에 있어서, Z-링 저해 단백질이 minC 폴리펩티드인 방법.
  11. 제9항에 있어서, Z-링 저해 단백질이 minD 폴리펩티드인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 적어도 2개의 Z-링 저해 단백질의 발현에서의 감소를 갖는 방법.
  13. 제12항에 있어서, ADAS가 minC 폴리펩티드 및 minD 폴리펩티드의 발현에서의 감소를 갖는 방법.
  14. 제13항에 있어서, ADAS가 minC 폴리펩티드, minD 폴리펩티드, 및 minE 폴리펩티드의 발현에서의 감소를 갖는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자가 SEQ ID NO: 4에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자가 SEQ ID NO: 4에 대하여 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 방법.
  17. 제1항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자가 DivIVA 폴리펩티드인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 부모 박테리아가 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이며 세포 분열 토폴로지 특이성 인자가 비. 서브틸리스 DivIVA인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 수준 또는 활성의 감소가 기능-소실 돌연변이에 의해 야기되는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 기능-소실 돌연변이가 minCDE 오페론의 결실 또는 DiVIVA의 결실인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 적어도 1 mM, 1.2 nM, 1.3 nM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 2 mM, 2.5 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM 또는 50 mM의 초기 ATP 농도를 갖는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 부모 박테리아가 에스케리키아, 아시네토박터(Acinetobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아나바에나(Anabaena), 아퀴펙스(Aquifex), 아조아르쿠스(Azoarcus), 아조토박터(Azotobacter), 보르데텔라(Bordetella), 브라디리조비움(Bradyrhizobium), 브루셀라(Brucella), 부크네라(Buchnera), 부크홀데리아(Burkholderia), 칸디다투스(Candidatus), 크로모박테리움(Chromobacterium), 크로코스파에라(Crocosphaera), 데클로로모나스(Dechloromonas), 데술피토박테리움(Desulfitobacterium), 데술포탈레아(Desulfotalea), 에르위니아(Erwinia), 프란시셀라(Francisella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 글로에오박터(Gloeobacter), 글루코노박터(Gluconobacter), 헬리코박터, 레지오넬라(Legionella), 마그네토스피릴룸(Magnetospirillum), 메조리조비움(Mesorhizobium), 메틸로코커스(Methylococcus), 네이세리아(Neisseria), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 노스톡(Nostoc), 포토박테리움(Photobacterium), 포토랍두스(Photorhabdus), 폴라로모나스(Polaromonas), 프로클로로코커스(Prochlorococcus), 슈도모나스, 사이크로박터(Psychrobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 루브리비박스(Rubrivivax), 살모넬라, 시와넬라(Shewanella), 시겔라, 시노리조비움(Sinorhizobium), 시네코코커스(Synechococcus), 시네코시스티스(Synechocystis), 써모시네코코커스(Thermosynechococcus), 써모토가(Thermotoga), 써무스(Thermus), 티오바실러스(Thiobacillus), 트리코데스미움(Trichodesmium), 비브리오(Vibrio), 위글레스워티아(Wigglesworthia), 울리넬라(Wolinella), 잔토모나스(Xanthomonas), 자일렐라(Xylella), 예르시니아, 바실러스, 클로스트리디움(Clostridium), 데이노코커스(Deinococcus), 엑시구오박테리움(Exiguobacterium), 게오바실러스(Geobacillus), 락토바실러스, 락토바실러스, 무렐라(Moorella), 오세아노바실러스(Oceanobacillus), 심비오박테리움(Symbiobacterium) 또는 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter) 박테리아이며, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 부모 박테리아의 내인성 minE 또는 DivIVA인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 조성물이 100 콜로니-형성 유닛(CFU/㎖) 미만의 생존 가능한 박테리아 세포를 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 단계 (c)의 조성물은 10 CFU/mL 미만, 1 CFU/mL 미만 또는 0.1 CFU/mL 미만의 생존 가능한 박테리아 세포를 포함하는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 카고를 포함하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 동물로의 전달을 위해 제형화되는 방법.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 식물로의 전달을 위해 제형화되는 방법.
  28. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 곤충으로의 전달을 위해 제형화되는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 액체, 고체, 에어로졸, 페이스트, 겔 또는 기체 조성물로서 제형화되는 방법.
  30. 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물로서, ADAS는 적어도 1 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 조성물.
  31. 제30항에 있어서, ADAS가 적어도 1.2 nM, 1.3 nM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 2 mM, 또는 2.5 mM의 초기 ATP 농도를 갖는 조성물.
  32. 복수의 고활성 ADAS을 포함하는 조성물로서, ADAS는 적어도 3 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 조성물.
  33. 제32항에 있어서, ADAS가 적어도 4 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM 또는 50 mM의 초기 ATP 농도를 갖는 조성물.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS의 ATP 농도가 12시간 동안 37℃에서 인큐베이션 후에 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 또는 적어도 200%만큼 증가되는 조성물.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성에서 감소를 갖는 부모 박테리아로부터 유래되는 조성물.
  36. 복수의 ADAS를 포함하는 조성물로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자를 포함하지 않으며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 조성물.
  37. 복수의 ADAS를 포함하는 조성물로서, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없으며, 하기를 포함하는 과정:
    (a) 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성의 감소를 갖는 복수의 부모 박테리아를 제조하거나, 제공하거나 또는 수득하는 단계;
    (b) 부모 박테리아를 미니세포의 형성을 가능하게 하는 조건에 노출시키는 단계; 및
    (c) 미니세포를 부모 박테리아로부터 분리함으로써, 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는 조성물을 생성하는 단계
    에 의해 생성되는, 조성물.
  38. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자가 SEQ ID NO: 1에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자가 SEQ ID NO: 1에 대하여 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 조성물.
  40. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자가 minE 폴리펩티드인 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 부모 박테리아가 이. 콜라이이며, minE 폴리펩티드는 이. 콜라이 minE인 조성물.
  42. 제42항에 있어서, 부모 박테리아가 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)이며, minE 폴리펩티드는 살모넬라 타이피무리움 minE인 조성물.
  43. 제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 부모 박테리아가 에스케리키아, 아시네토박터(Acinetobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아나바에나(Anabaena), 아퀴펙스(Aquifex), 아조아르쿠스(Azoarcus), 아조토박터(Azotobacter), 보르데텔라(Bordetella), 브라디리조비움(Bradyrhizobium), 브루셀라(Brucella), 부크네라(Buchnera), 부크홀데리아(Burkholderia), 칸디다투스(Candidatus), 크로모박테리움(Chromobacterium), 크로코스파에라(Crocosphaera), 데클로로모나스(Dechloromonas), 데술피토박테리움(Desulfitobacterium), 데술포탈레아(Desulfotalea), 에르위니아(Erwinia), 프란시셀라(Francisella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 글로에오박터(Gloeobacter), 글루코노박터(Gluconobacter), 헬리코박터, 레지오넬라(Legionella), 마그네토스피릴룸(Magnetospirillum), 메조리조비움(Mesorhizobium), 메틸로코커스(Methylococcus), 네이세리아(Neisseria), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 노스톡(Nostoc), 포토박테리움(Photobacterium), 포토랍두스(Photorhabdus), 폴라로모나스(Polaromonas), 프로클로로코커스(Prochlorococcus), 슈도모나스, 사이크로박터(Psychrobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 루브리비박스(Rubrivivax), 살모넬라, 시와넬라(Shewanella), 시겔라, 시노리조비움(Sinorhizobium), 시네코코커스(Synechococcus), 시네코시스티스(Synechocystis), 써모시네코코커스(Thermosynechococcus), 써모토가(Thermotoga), 써무스(Thermus), 티오바실러스(Thiobacillus), 트리코데스미움(Trichodesmium), 비브리오(Vibrio), 위글레스워티아(Wigglesworthia), 울리넬라(Wolinella), 잔토모나스(Xanthomonas), 자일렐라(Xylella), 예르시니아, 바실러스, 클로스트리디움(Clostridium), 데이노코커스(Deinococcus), 엑시구오박테리움(Exiguobacterium), 게오바실러스(Geobacillus), 락토바실러스, 락토바실러스, 무렐라(Moorella), 오세아노바실러스(Oceanobacillus), 심비오박테리움(Symbiobacterium) 또는 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter) 박테리아이며, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자는 부모 박테리아의 내인성 minE 또는 DivIVA인 조성물.
  44. 제30항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 Z-링 저해 단백질의 수준에서의 감소를 갖는 조성물.
  45. 제44항에 있어서, Z-링 저해 단백질이 SEQ ID NO: 2에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 조성물.
  46. 제44항에 있어서, Z-링 저해 단백질이 SEQ ID NO: 3에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 조성물.
  47. 제44항에 있어서, Z-링 저해 단백질이 minC 폴리펩티드인 조성물.
  48. 제44항에 있어서, Z-링 저해 단백질이 minD 폴리펩티드인 조성물.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 적어도 2개의 Z-링 저해 단백질의 발현에서의 감소를 갖는 조성물.
  50. 제49항에 있어서, ADAS가 minC 폴리펩티드 및 minD 폴리펩티드의 발현에서의 감소를 갖는 조성물.
  51. 제50항에 있어서, ADAS가 minC 폴리펩티드, minD 폴리펩티드, 및 minE 폴리펩티드의 발현에서의 감소를 갖는 조성물.
  52. 제35항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자가 SEQ ID NO: 4에 대하여 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자가 SEQ ID NO: 4에 대하여 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 조성물.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 세포 분열 토폴로지 특이성 인자가 DivIVA 폴리펩티드인 조성물.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 부모 박테리아가 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)이며 세포 분열 토폴로지 특이성 인자가 비. 서브틸리스 DivIVA인 조성물.
  56. 제35항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 수준 또는 활성의 감소가 기능-소실 돌연변이에 의해 야기되는 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 기능-소실 돌연변이가 유전자 결실인 조성물.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 기능 소실 돌연변이가 유도성 기능-소실 돌연변이이며, 기능 소실은 부모 세포를 유도 조건에 노출시킴으로써 유도되는 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 유도성 기능-소실 돌연변이가 온도 감수성 돌연변이이며, 유도 조건은 온도 조건인 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 부모 세포가 minCDE 오페론의 결실을 갖는 조성물.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 기능성 전사 시스템 및 기능성 번역 시스템을 포함하는 조성물.
  62. 제61항에 있어서, ADAS가 이종 단백질을 생산하는 조성물.
  63. 제62항에 있어서, ADAS가 플라스미드를 포함하며, 플라스미드는 유도성 프로모터 및 이종 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, ADAS를 적절한 조건 하에서 유도성 프로모터의 유도제와 접촉시키는 것은 이종 단백질의 생성을 초래하는 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 이종 단백질의 생성이 유도제와 접촉되지 않은 ADAS에 비하여 유도제와 접촉된 ADAS에서 적어도 1.6배 증가되는 조성물.
  65. 제64항에 있어서, 이종 단백질의 생성 속도가 ADAS와 유도제의 접촉 3시간 이내에 표적 수준에 도달하는 조성물.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 이종 단백질이 ADAS당 시간당 적어도 0.1 펨토그램의 비율로 생산되는 조성물.
  67. 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 단백질이 적어도 8시간의 기간 동안 생산되는 조성물.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 100 콜로니-형성 유닛(CFU/㎖) 미만의 생존 가능한 박테리아 세포를 포함하는 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 조성물이 10 CFU/mL 미만, 1 CFU/mL 미만 또는 0.1 CFU/mL 미만의 생존 가능한 박테리아 세포를 포함하는 조성물.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 카고를 포함하는 조성물.
  71. 제70항에 있어서, 카고가 핵산, 플라스미드, 폴리펩티드, 단백질, 효소, 아미노산, 소분자, 유전자 편집 시스템, 호르몬, 면역 조절제, 탄수화물, 지질, 유기 입자, 무기 입자 또는 리보핵단백질 복합체(RNP)인 조성물.
  72. 제71항에 있어서, 카고가 ADAS에 의해 캡슐화되는 조성물.
  73. 제71항에 있어서, 카고가 ADAS의 표면에 부착되는 조성물.
  74. 제71항에 있어서, 핵산이 DNA, RNA, 또는 플라스미드인 조성물.
  75. 제71항 또는 제74항에 있어서, 핵산이 단백질을 인코딩하는 조성물.
  76. 제71항에 있어서, 효소가 기질을 변경시켜 표적 산물을 생산하는 조성물.
  77. 제76항에 있어서, 기질이 ADAS에 존재하며, 표적 생성물은 ADAS에서 생성되는 조성물.
  78. 제76항에 있어서, 기질이 ADAS가 전달된 표적 세포 또는 환경에 존재하는 조성물.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 이종 박테리아 분비 시스템을 포함하는 조성물.
  80. 제79항에 있어서, 이종 박테리아 분비 시스템이 3형 분비 시스템(T3SS)인 조성물.
  81. 제79항 또는 제80항에 있어서, 카고가 박테리아 분비 시스템에 의한 유출을 지시하는 모이어티를 포함하는 조성물.
  82. 제1항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 표적화 모이어티를 포함하는 조성물.
  83. 제82항에 있어서, 표적화 모이어티가 나노바디, 탄수화물 결합 단백질 또는 종양-표적화 펩티드인 조성물.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 야생형 부모 박테리아로부터 생산된 ADAS에 비하여 감소된 프로테아제 수준 또는 활성을 갖는 조성물.
  85. 제84항에 있어서, ADAS가 적어도 하나의 프로테아제의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형된 부모 박테리아로부터 생성되는 조성물.
  86. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 야생형 부모 박테리아로부터 생산된 ADAS에 비하여 감소된 RNase 수준 또는 활성을 갖는 조성물.
  87. 제86항에 있어서, ADAS가 적어도 하나의 RNase의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형된 부모 박테리아로부터 생성되는 조성물.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, RNase이 엔도리보뉴클레아제 또는 엑소리보뉴클레아제인 조성물.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 감소된 지질다당류(LPS)를 갖도록 변형된 조성물.
  90. 제60항에 있어서, ADAS가 감소된 LPS를 갖도록 변형된 부모 박테리아로부터 생성되는 조성물.
  91. 제89항에 있어서, 변형이 지질 A 생합성 미리스토일트랜스퍼라제(msbB)에서의 돌연변이인 조성물.
  92. 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 포유동물 병원체 또는 포유동물 편리공생성 박테리아인 부모 박테리아로부터 유래되는 조성물.
  93. 제92항에 있어서, 포유동물 편리공생성 박테리아가 스타필로코커스, 비피도박테리아, 마이크로코커스, 락토바실러스 또는 악티노마이세스 종이거나, 포유동물 병원성 박테리아는 장출혈성 에스케리키아 콜라이(EHEC), 살모넬라 타이피무리움, 시겔라 플렉스네리, 예르시니아 엔테롤리티카 또는 헬리코박터 파일로리인 조성물.
  94. 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 식물 병원체 또는 식물 편리공생성 박테리아인 부모 박테리아로부터 유래되는 조성물.
  95. 제94항에 있어서, 식물 편리공생성 박테리아가 바실러스 서브틸리스 또는 슈도모나스 푸티다이거나, 식물 병원성 박테리아는 잔토모나스 종 또는 슈도모나스 시린가에인 조성물.
  96. 제1항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 영양요구성 부모 박테리아로부터 유래되는 조성물.
  97. 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 동결건조되고 재구성되며, 재구성된 ADAS는 동결건조되지 않은 ADAS의 ATP 농도의 적어도 95%인 ATP 농도를 갖는 조성물.
  98. 제97항에 있어서, 재구성된 ADAS가 동결건조되지 않은 ADAS의 ATP 농도와 적어도 동일한 ATP 농도를 갖는, 조성물.
  99. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 동물로의 전달을 위해 제형화되는 조성물.
  100. 제99항에 있어서, 조성물이 복강내, 정맥내, 근육내, 경구, 국부, 에어로졸, 또는 분무화 투여를 위해 제형화되는 조성물.
  101. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 식물로의 전달을 위해 제형화되는 조성물.
  102. 제1항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 곤충으로의 전달을 위해 제형화되는 조성물.
  103. 제99항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 액체, 고체, 에어로졸, 페이스트, 겔 또는 기체 조성물로서 제형화되는 조성물.
  104. 표적 세포로의 고활성 ADAS 전달 방법으로서,
    (a) 복수의 고활성 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및
    (b) 표적 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  105. 표적 세포로의 ADAS 전달 방법으로서,
    (a) 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및
    (b) 표적 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  106. 제104항 또는 제105항에 있어서, 표적 세포가 동물 세포인 방법.
  107. 제104항 또는 제105항에 있어서, 표적 세포가 식물 세포인 방법.
  108. 제104항 또는 제105항에 있어서, 표적 세포가 곤충 세포인 방법.
  109. 표적 세포로의 카고 전달 방법으로서,
    (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며, ADAS는 카고를 포함하고, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및
    (b) 표적 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  110. 표적 세포로의 카고 전달 방법으로서,
    (a) 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 부모 박테리아로부터 유래되며, ADAS는 카고를 포함하며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및
    (b) 표적 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  111. 제109항 또는 제110항에 있어서, 표적 세포가 동물 세포인 방법.
  112. 제109항 또는 제110항에 있어서, 표적 세포가 식물 세포인 방법.
  113. 제109항 또는 제110항에 있어서, 표적 세포가 곤충 세포인 방법.
  114. 동물 세포의 상태를 조절하는 방법으로서,
    (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및
    (b) 동물 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 동물 세포의 상태를 조절하는 단계
    를 포함하는 방법.
  115. 식물 세포의 상태를 조절하는 방법으로서,
    (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및
    (b) 식물 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 식물 세포의 상태를 조절하는 단계
    를 포함하는 방법.
  116. 곤충 세포의 상태를 조절하는 방법으로서,
    (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및
    (b) 곤충 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 곤충 세포의 상태를 조절하는 단계
    를 포함하는 방법.
  117. 동물 세포의 상태를 조절하는 방법으로서,
    (a) 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및
    (b) 동물 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 동물 세포의 상태를 조절하는 단계
    를 포함하는 방법.
  118. 식물 세포의 상태를 조절하는 방법으로서,
    (a) 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및
    (b) 식물 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 식물 세포의 상태를 조절하는 단계
    를 포함하는 방법.
  119. 곤충 세포의 상태를 조절하는 방법으로서,
    (a) 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및
    (b) 곤충 세포를 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 곤충 세포의 상태를 조절하는 단계
    를 포함하는 방법.
  120. 치료를 필요로 하는 동물에서의 치료 방법으로서,
    (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및
    (b) 동물을 유효량의 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 동물을 치료하는 단계
    를 포함하는 방법.
  121. 치료를 필요로 하는 동물에서의 치료 방법으로서,
    (a) 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및
    (b) 동물을 유효량의 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 동물을 치료하는 단계
    를 포함하는 방법.
  122. 제120항 또는 제121항에 있어서, 동물이 암을 갖는 방법.
  123. 제120항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 화학치료 카고를 담지하는 방법.
  124. 제120항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, ADAS가 면역치료 카고를 담지하는 방법.
  125. 치료를 필요로 하는 식물에서의 치료 방법으로서,
    (a) 복수의 고활성 무염색체 동적 활성 시스템(ADAS)을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 적어도 1.25 mM의 초기 ATP 농도를 가지며 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및
    (b) 식물 또는 그의 유해물을 유효량의 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 식물을 치료하는 단계
    를 포함하는 방법.
  126. 치료를 필요로 하는 식물에서의 치료 방법으로서,
    (a) 복수의 ADAS를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, ADAS는 세포 분열 토폴로지 특이성 인자의 수준 또는 활성이 감소된 부모 박테리아로부터 유래되며, 조성물에는 생존 가능한 박테리아 세포가 실질적으로 없는, 단계; 및
    (b) 식물 또는 그의 유해물을 유효량의 단계 (a)의 조성물과 접촉시킴으로써, 식물을 치료하는 단계
    를 포함하는 방법.
  127. ADAS가 효소를 포함하며, 효소는 기질을 변경시켜, 표적 생성물을 생성하는, 복수의 ADAS를 포함하는 조성물.
  128. 제127항에 있어서, 기질이 ADAS에 존재하며, 표적 생성물은 ADAS에서 생성되는 조성물.
  129. 제127항 또는 제128항에 있어서, 기질이 ADAS가 전달된 표적 세포 또는 환경에 존재하는 조성물.
  130. 제127항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 효소가 디아데닐레이트 사이클레이스 A이며, 기질이 ATP이고, 표적 산물이 사이클릭-디-AMP인 조성물.
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