CN115851800A - 一种提高希瓦氏菌电子传递能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种提高希瓦氏菌电子传递能力的方法。具体包括：其针对细胞形态变化对胞外电子传递速率的影响这一关键科学问题，运用合成生物学策略对希瓦氏菌进行细胞形态改造，通过反义RNA阻遏分裂体蛋白翻译和过表达分裂抑制剂，构建出8种不同长度的工程菌株，并对其电化学表征，从电生理和细胞代谢生理角度分别阐明了细胞变长对胞外电子传递的影响机制。结果表明，抑制细胞分裂会使细胞变长，从而细胞在电极表面的缠绕和附着能力，增加电活性生物膜厚度；同时细胞变长能提高细胞色素c表达水平，从而提高直接电子传递速率。本发明为改造电活性微生物、促进工业应用提供了新思路。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高希瓦氏菌电子传递能力的方法。
背景技术
基于电活性微生物胞外电子转移机制(Extracellular Electron Transfer，EET)的微生物电化学系统在能源、环境等领域有着广泛的应用前景，然而胞外电子转移速率低下是限制这些应用的核心瓶颈。模式产电微生物希瓦氏菌主要依赖c型细胞色素(包括内膜锚定的脱氢酶CymA和跨膜复合物MtrCAB)实现基于接触的直接EET。此外，还可以利用自分泌核黄素作为可溶性电子载体，通过氧化还原反应实现间接EET。基于其EET机制，目前已经有很多合成生物学策略从胞内电子生成、跨膜电子传递和生物膜形成等角度出发提高其电子传递速率。例如：拓宽底物利用谱和加强底物利用率，增加细胞NAD(H/+)池或NADH/NAD+比值，增加电子载体的合成和分泌，过表达细胞色素以及成熟系统，调节生物膜成分和形成以及增强全局调控等。然而，目前还未见有调控细胞大小对希瓦氏菌电子传递速率影响机制的研究报道。
形态工程是一种在化学生产过程中操纵细胞生理功能的新策略，可用于提高生物合成效率，其重点在于加速物质交换(包括底物吸收和产物输出)，促进细胞生长，增强细胞抗逆性以及扩大胞内空间。微生物细胞工厂性能受细胞形态影响显著，小细胞生长速度快，能有效分泌有机酸等小分子产物，而大细胞则有利于PHB等包涵体的胞内积累。此外，也有研究表明，细胞形态与生物膜组织和时空排布状态之间存在着不可忽视的关系。在人工条件下，改变细胞形态可以改变生物膜的空间排布。然而，电活性微生物的细胞形态与电子传递能力之间的关系还未被研究，因此，探索细胞形态或大小在细胞生理和电生理方面影响EET速率的具体机制是必要的。
细菌繁殖以二分裂的方式进行，一般将细菌分裂过程分为C期和D期。C期指DNA复制起始到姐妹染色单体分离的这一段时间，D期指复制终止到细胞分裂起始的过程，由细胞分裂蛋白和分裂抑制剂参与，通过调控Z环的形成并进一步组装成细胞分裂复合物(即分裂体)，推动隔膜形成从而实现细胞分裂。有研究表明，通过抑制分裂体关键组成蛋白的表达或者表达分裂抑制剂，从而抑制细胞分裂，可以提高细胞长度和体积。
发明内容
本发明专利针对细胞形态变化对EET的影响这一关键科学问题，运用合成生物学模块化工程策略改造细胞形态，通过反义RNA抑制分裂体蛋白表达与过表达分裂抑制剂的手段，抑制细胞分裂使细胞变长，从而提高其胞外电子传递能力。
本发明的目的是克服现有技术的不足，运用形态工程策略对模式产电微生物，即希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1进行合成生物学改造，通过反义RNA阻遏分裂体蛋白翻译和过表达分裂抑制剂，构建了8种不同长度的希瓦氏菌工程菌株，并对其电子传递能力进行了表征。实验结果表明，抑制细胞分裂会使细胞变长，提高其生物膜形成能力和细胞色素表达水平，从而提高其胞外电子传递能力。这为改造电活性微生物、促进其工业应用提供了一种新思路。
本发明提供了一种抑制细胞分裂提高希瓦氏菌电子传递能力的方法；具体包括如下步骤：
(1)筛选与细胞分裂体蛋白的编码基因，通过反义RNA技术抑制其基因表达而使细胞变长；
(2)筛选编码细胞分裂抑制剂的基因，通过过表达细胞分裂抑制剂基因而使细胞变长；
(3)运用电化学测试对菌株进行胞外电子传递能力的表征；
(4)运用扫描电子显微镜观察细胞形态；
(5)运用ImageJ图像处理软件测量细胞长、宽，并计算工程菌株的体积，得出细胞体积与产电能力的关系；
(6)测定工程菌株的生长曲线、胞内代谢活力等生理代谢指标；
(7)对工程菌株进行电生理表征，具体包括：①测量生物膜厚度及导电性；②测量细胞色素含量和核黄素产量；
其中，所述的步骤(1)筛选出的基因ftsZ的序列为SEQ ID NO.1；基因ftsA的序列为SEQ ID NO.2；基因ftsQ的序列为SEQ ID NO.3；基因ftsN的序列为SEQ ID NO.4；所述的步骤(2)筛选出的基因minD的序列为SEQ ID NO.5；基因sulA的序列为SEQ ID NO.6；基因minC的序列为SEQ ID NO.7；基因slmA的序列为SEQ ID NO.8。
所述的步骤(5)细胞长度、宽度及体积计算方法为取扫描电镜2μm尺度拍摄的图片，用ImageJ图像处理软件对SEM图片内的10个细胞长宽进行测量，从而得到工程菌单个细胞的平均长度L和平均宽度D。将细胞体积近似看作一个圆柱体和一个球体体积之和。单个细胞体积计算公式如下：
其中，L为细胞长度，r为细胞宽度的一半，π为圆周率，计算时取3.14。每张图片选择10个单细胞计算体积并求取平均值，得到单个细胞的平均体积。
本发明的有益效果是：本发明通过抑制细胞分裂来增加希瓦氏菌细胞长度，并从电生理和细胞代谢生理角度分别阐明了细胞变长对胞外电子传递的影响机制。具体来说，其通过反义RNA阻遏分裂体蛋白翻译和过表达分裂抑制剂，构建了8种不同长度的希瓦氏菌工程菌株，并对其电子传递能力进行了表征。结果表明，长细胞在电极更好的缠绕增加了生物膜厚度同时长细胞的细胞色素表达量提高，最终通过促进生物膜形成和色素介导的电子跨膜传递来提高胞外电子传递速率，且功率密度会随着细胞长度的增加而升高。电化学测试结果表明，最优菌株SluA的功率密度达到184mW/m2，是野生型的2.96倍。
附图说明
图1为电化学表征(a)电压曲线(b)CV曲线(c)功率密度曲线(d)极化曲线；
图2为SEM观察电池阳极菌体大小(a)WT(b)AsftsN(c)AsftsQ(d)AsftsA(e)AsftsZ(f)MinD(g)SulA(h)MinC(i)SlmA；
图3为阳极菌体细胞长宽(a),体积和功率密度(b)；
图4为不同基因对生长曲线(a)以及胞内ATP、NADH/+(b)含量的影响；
图5为阳极生物膜激光共聚焦显微镜扫描图(a)WT(b)AsftsN(c)AsftsQ(d)AsftsA(e)AsftsZ(f)MinD(g)SulA(h)MinC(i)SlmA；
图6为电极细胞色素水平、核黄素产量情况(a)细胞色素含量(b)核黄素产量；
图7为本发明技术总结与展示示意图。
具体实施方式
(1)筛选与细胞分裂体蛋白表达相关的基因，通过反义RNA技术抑制其基因表达而使细胞变长
细菌繁殖以二分裂的方式进行，一般将细菌分裂过程分为C期和D期。通过改变细菌在C期和D期停留时间的长短，可以实现对细菌大小形态的控制。C期指DNA复制起始到姐妹染色单体分离的这一段时间，D期指复制终止到细胞分裂起始过程，受细胞分裂蛋白的调控。具体来说，细菌分裂D期首先要由FtsZ蛋白自聚合形成Z环，随后通过招募众多分裂体蛋白形成细胞分裂复合物(即分裂体)，从而推动隔膜形成，实现完整地分裂过程。FtsZ是一种细菌微管蛋白同系物，其聚合成丝状结构，可以进一步在细胞未来的分裂位点自聚合组装形成Z环，作为支架招募其他细胞分裂蛋白的组装，以形成完整的分裂体。FtsA是FtsZ在细胞膜上的锚点蛋白。FtsQ是双向膜蛋白，是分裂体形成的主要成分，可以与FtsL、FtsB构成支架复合物以招募下游分裂体蛋白。FtsN是最后一个被招募到分裂位点的细胞分裂蛋白，其具有激活细胞分裂的作用。有研究表明，通过抑制分裂体关键组成蛋白的表达从而抑制细胞分裂，可以提高细胞长度和体积。
本发明中，首先筛选得到希瓦氏菌分裂过程中4种主要分裂体组成蛋白，分别是：①分裂Z环的组成成分FtsZ；②FtsZ在细胞膜上的锚点蛋白FtsA；③分裂体形成的主要成分FtsQ；④分裂激活蛋白FtsN，然后通过反义RNA技术抑制其基因表达而使细胞变长。
通过反义RNA技术抑制4种与细胞分裂有关基因表达的具体步骤如下：
①从NCBI网站下载Shewanella oneidensis MR-1菌株的基因组序列(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP053946.1)；②用Snapgene软件打开基因组序列文件，通过基因名字搜索定位ftsZ，ftsA，ftsQ，和ftsN的蛋白编码序列(CDS)位置；③在每个基因的起始密码子(常为ATG)上下游各截取50bp，共100bp，将其反向互补序列作为相应基因反义RNA的靶向序列；④在反义RNA靶向序列的两端添加反向互补的38bp序列PT1(SEQ IDNO.14:AGGAGGAATTAACCATGCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGC)和PT2(SEQ ID NO.15:GCACCACCACCACCACCACTGCATGGTTAATTCCTCCT)，得到四个反义RNA(asftsZ，asftsA，asftsQ，和asftsN)；⑤分别在每个反义RNA的5’端添加NdeⅠ酶切位点(CATATG)，3’端添加酶切位点SacⅠ(GTCGAC)；⑤通过酶切连接的方法将四个反义RNA序列连接到含有IPTG诱导型启动子Ptac的穿梭质粒pYYDT上，得到重组质粒pYYDT-asftsZ,pYYDT-asftsA,pYYDT-asftsQ,和pYYDT-asftsN。
其中，基因ftsZ的序列为SEQ ID NO.1；基因ftsA的序列为SEQ ID NO.2；基因ftsQ的序列为SEQ ID NO.3；基因ftsN的序列为SEQ ID NO.4。基因asftsZ的序列为SEQ IDNO.9；基因asftsA的序列为SEQ ID NO.10；基因asftsQ的序列为SEQ ID NO.11；基因asftsN的序列为SEQ ID NO.12；穿梭质粒pYYDT的序列为SEQ ID NO.13。
酶切连接的具体步骤如下：
①对合成的反义RNA片段和载体pYYDT进行双酶切，酶切体系如列表1所示，酶切温度为37℃，时间为1h。
表1酶切反应体系
②连接：使用T4连接酶连接被相同内切酶切割并进行琼脂糖凝胶电泳及胶回收的目的DNA片段及载体骨架。连接温度为22℃，时间为2h。连接体系列表(表2)如下：
表2 DNA连接反应体系
(2)筛选编码细胞分裂抑制剂的基因，通过过表达细胞分裂抑制剂基因而使细胞变长
细菌细胞内共有3个潜在的分裂位点，一个在细胞中部，另外两个位于细胞的两极。正常情况下，细菌仅利用中部的分裂位点以二分裂方式进行对称分裂，并且这种精细的调控依赖分裂抑制剂。研究表明，过表达有些分裂抑制剂的会明显抑制细胞分裂，使细胞变长。编码其分裂抑制剂的基因有min操纵子(minC，minD，和minE)、sulA以及slmA。具体来说，细菌进行细胞分裂时，中部潜在分裂位点的选择受min操纵子的精细调控。该操纵子编码的蛋白中，MinC蛋白是细胞分裂的抑制因子，能与具有ATPase活性的MinD蛋白结合并被其激活从而抑制Z环的形成。在MinE蛋白的作用下，MinCD复合体在大肠杆菌细胞的两极间来回振荡。整个振荡周期中，蛋白复合体在细胞两极的两个潜在分裂位点处所停留的时间较长，导致分裂复合物无法正常组装，因而细胞两极的潜在分裂位点被屏蔽。而该复合体在细胞中部的分裂位点所停留的时间较短，不能有效地抑制分裂复合物的组装。因此，各种细胞分裂蛋白得以在细胞中部的分裂位点组装形成稳定的分裂复合物，使正常的细胞分裂得以进行。SulA是一个位于细胞质中的二聚体细胞分裂抑制蛋白，当细胞处于极端环境时，为避免受损的DNA传递给子代细胞，细胞会触发SOS保护机制，诱导SulA的表达，该蛋白通过与FstZ的相互作用导致GTP水解，阻止FtsZ蛋白聚合形成Z环，从而抑制细胞分裂。SlmA是一种核相关的分裂抑制剂，可以与染色体上特异性的DNA序列(SlmA结合位点)相结合，通过降解FtsZ多聚物，缩短FtsZ早期聚合物以阻止类核Z环的形成，从而抑制细菌分裂。
本发明中筛选得到希瓦氏菌中4种主要的分裂抑制剂MinD，SulA，MinC以及SlmA，通过过表达4种与细胞分裂抑制剂的编码基因，使得细胞变长。
过表达4种与细胞分裂抑制剂有关的基因的具体步骤如下：
①从NCBI网站下载Shewanella oneidensis MR-1菌株的基因组序列(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP053946.1)；②用Snapgene软件打开基因组序列文件，通过基因名字搜索定位minC，minD，sulA，和slmA的蛋白编码序列(CDS)位置；③在每个基因的起始密码子和终止密码子前后分别设计引物(4对，8个引物序列，包含20bp跟基因互补序列以及20bp跟骨架互补的序列，具体引物信息见表3)；④以Shewanella oneidensis MR-1基因组为模板，通过PCR扩增每个基因的片段；⑤通过Gibson连接的方法将四个基因序列连接的空载体含有IPTG诱导型启动子Ptac的穿梭质粒pYYDT上，，得到重组质粒pYYDT-minD,pYYDT-sulA,pYYDT-minC,和pYYDT-slmA。
其中，基因minC的序列为SEQ ID NO.5；基因minD的序列为SEQ ID NO.6；基因sulA的序列为SEQ ID NO.7；基因slmA的序列为SEQ ID NO.8；穿梭质粒pYYDT的序列为SEQ IDNO.13。
表3.构建细胞分裂抑制剂质粒所需的引物名称及序列信息
PCR扩增目的基因和骨架的具体步骤如下：用Snapgene设计pYYDT骨架引物以及每个基因的引物，分别从从含有目的DNA片段的基因组和质粒pYYDT或上使用Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase分别进行扩增目的基因和骨架。扩增体系如下表(表4)所示：
表4 PCR扩增体系
PCR扩增程序如下表所示(表5)：
表5 PCR扩增程序
其中步骤2进行35个循环。
Gibson连接具体步骤如下：使用无缝克隆试剂盒将具有同源臂的PCR扩增产物(胶回收目的DNA片段和消化酶消化1h后的载体骨架)进行环化。目的DNA片段和载体骨架按照3:2的比例加入，无缝克隆连接酶混合物用量为5μL，总体积为10μL。连接温度为50℃，时间为20min。
(3)运用电化学测试对菌株进行胞外电子传递能力的表征
将构建的工程菌株、以野生型对照菌株，通过摇瓶培养导入细胞分裂相关基因的工程希瓦氏菌，对于四个反义RNA加1mM IPTG进行诱导表达，而四种分裂抑制剂基因加入10μM IPTG诱导表达，并将发酵液作为阳极微生物催化剂(按OD600＝0.5接种到微生物燃料电池的阳极室)，K3[Fe(CN)6]溶液为阴极液的微生物燃料电池，对这些变长的工程菌和野生型对照进行了电子传递能力表征。得到的工程菌株电压曲线、功率密度曲线、CV曲线及极化曲线如图1所示。由图1可知，从菌株AsftsN，AsftsQ，AsftsA，AsftsZ，MinD到SulA的输出电压、功率密度都远高于野生型，表明细胞变长可以提高其电子传递能力。
(4)运用扫描电子显微镜(SEM)观察细胞形态变化；
为了进一步验证电子传递能力与细胞长度的对应关系，本发明对电池放电结束后的阳极碳布上希瓦氏菌进行了SEM观察，结果如图2所示，与摇瓶中培养的菌液观察结果相同。导入8个不同质粒的工程希瓦氏菌形态相较于对照菌都发生了变化，与预期结果相同，都比野生型希瓦氏菌长一些。其中过表达分裂抑制剂的菌株MinD，MinC，SulA和SlmA的长度变化最明显，呈纤维状。另外，从SEM图像中可明显看出纤维状工程菌MinD，SulA，MinC，和SlmA更易在碳纤维丝上缠绕，且在阳极碳布上形成比野生型更大的团簇。这说明细胞变长利于其在电极上的紧密聚集，其中SulA菌株聚集现象最为明显。
(5)运用ImageJ图像处理软件测量细胞长、宽，并计算工程菌株的体积；
使用ImageJ图像处理软件对SEM图片的10个细胞长宽进行测量，得到工程菌单个细胞平均长度和宽度，用球加圆柱的模型对工程菌体积、比表面积进行计算，并对应其功率密度，结果如图3所示。与对照菌相比，阳极碳布上工程菌单个细胞长度均有所增加从菌株AsftsN，AsftsQ，AsftsA，AsftsZ，MinD，SulA，MinC到SlmA，希瓦氏菌细胞长度逐渐增加，相应地体积也逐渐增加。工程菌SlmA的细胞长度达到139.09±13.83μm，约为野生型菌株的56倍，体积达到15.94±1.59μm3(图3中a)。由图3中b的细胞体积和功率变化趋势可以看出功率密度随希瓦氏菌体积的增大而增大，其中菌株SulA电子传递能力最强，长度达到75.48±14.17μm，功率密度184mW/m2，约为对照的2.96倍。但菌株MinC及SlmA却未延续趋势，功率密度急剧下降。
(6)测定细菌的生长及生理代谢指标：
为了阐明细胞变长对希瓦氏菌株生长和生理代谢的影响，本发明对三株最长的工程菌的生长曲线进行测定，结果如图4所示。由图可知，过表达细胞分裂抑制剂基因sulA，minC及slmA均导致细菌生长变缓，并且随着细胞体积的增大，OD600减小幅度逐渐增大，因细胞分裂抑制剂基因minC及slmA对希瓦氏菌细胞生长影响太大，导致电子传递能力无法随着细胞变长而进一步提高。同时，变长菌株SulA和SlmA的胞内ATP和NAD+/NADH水平远低于野生型菌株，表明细胞变长导致改造菌株的代谢活力和胞内电子生成速率降低。
(7)对工程菌株进行电生理表征
①测量生物膜厚度及导电性
为了验证电子传递能力的增强是否由于生物膜厚度和致密度升高所致，本发明对阳极碳布上的生物膜进行了观察，使用激光共聚焦扫描显微镜逐层扫描，叠加后结果如图5所示。可以看出，相比对照菌，工程菌阳极碳布生物膜厚度均有所增加。其中，菌AsftsN，AsftsQ，AsftsA，AsftsZ，MinC及SulA随着细胞变长而生物膜厚度依次增加，说明细胞变长会增强其在电极的聚集附着能力，越长的细胞在电极上越容易紧密的缠绕，更有利于阳极生物膜的形成。SulA菌株的生物膜厚度达到最高215μm，是野生型的2.15倍。而菌株MinC和SlmA细胞长度虽然进一步增加，阳极生物膜厚度增加却并不明显，这可能是由于细菌生长受阻导致阳极周围菌体活力低，出现大量的死细胞，从而难以形成更致密的生物膜。
②测量细胞色素含量和核黄素产量；
胞外电子传递机制包括细胞色素介导的直接电子传递和核黄素介导的间接电子传递，为进一步阐明细胞变长提高电子传递速率的机理，本发明测试了工程菌AsftsZ，MinD，和SulA的色素含量和核黄素产量(如图6所示)。通过紫外-可见光谱扫描c型细胞色素在419nm，525nm，和552nm的特征峰，发现变长的工程菌株的细胞色素表达量都高于野生型菌株，从而提高了直接电子传递能力；而通过高效液相色谱(HPLC)测量工程菌核黄素浓度未发现明显差异，表明细胞变长对间接电子传递没有影响。
综上所述，如图7所示，本发明针对细胞形态变化对EET的影响这一关键科学问题，运用形态工程策略对模式产电微生物，即希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1进行合成生物学改造，通过反义RNA阻遏分裂体蛋白翻译和过表达分裂抑制剂，构建了8种不同长度的希瓦氏菌工程菌株，并对其电子传递能力进行了表征。实验结果表明，抑制细胞分裂会使细胞变长，从而提高其胞外电子传递能力。其主要原因是细胞变长一方面增强了细胞在电极表面的附着能力，从而增加生物膜厚度；另一方面，也提高了整体细胞色素水平，最终通过促进生物膜形成和色素介导的电子跨膜传递来提高胞外电子传递速率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.提高希瓦氏菌电子传递能力的方法，其特征在于，包括抑制希瓦氏菌的分裂。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述抑制希瓦氏菌的分裂的方法，包括抑制与细胞分裂体蛋白表达相关基因的表达，和/或过表达编码细胞分裂抑制剂基因。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述细胞分裂体蛋白表达相关基因选自：ftsZ，ftsA，ftsQ和ftsN；
所述ftsZ的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；ftsA的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；ftsQ的核苷酸序列为SEQ ID NO.3；ftsN的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
4.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，通过反义RNA技术抑制与细胞分裂体蛋白表达相关基因的表达。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，利用与细胞分裂体蛋白表达相关基因设计的反义RNA序列分别为asftsZ，asftsA，asftsQ和asftsN；
其中asftsZ的序列为SEQ ID NO.9；asftsA的序列为SEQ ID NO.10；asftsQ的序列为SEQ ID NO.11；asftsN的序列为SEQ ID NO.12。
6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述编码细胞分裂抑制剂基因选自：minD，sulA，minC和slmA；
所述minD的核苷酸序列为SEQ ID NO.5；sulA的核苷酸序列为SEQ ID NO.6；minC的核苷酸序列为SEQ ID NO.7；slmA的核苷酸序列为SEQ ID NO.8。
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