CN112779202B - 一种敲除基因proP和proVWX高产苏氨酸的工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种敲除基因proP和proVWX高产苏氨酸的工程菌及其应用，属于基因工程和发酵工程领域。本发明中，L‑苏氨酸生产菌株TWF001通过改变细胞内的渗透压来改善大肠杆菌苏氨酸的合成途径。本发明在大肠杆菌TWF001中敲除负责编码渗透压保护剂甜菜碱转运的proP和proVWX基因，得到重组菌株TSW003，继续敲除磷酸转移酶(PTS)系统的crr或ptsG基因得到重组菌株TSW008或TSW009，最后TSW008摇瓶发酵36h后产生24.9g/LL‑苏氨酸，TSW009摇瓶发酵48h后产生26g/LL‑苏氨酸，比对照TWF001分别增加了108％和116％。

Description

一种敲除基因proP和proVWX高产苏氨酸的工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种敲除基因proP和proVWX高产苏氨酸的工程菌及其应用，属于基因工程和发酵工程领域。

背景技术

发酵生产过程中，由于渗透压的不平衡，经常遇到生长受限和产物生物合成终止的问题。因此，提高细菌的耐渗透压能力或使用高渗抗性菌株成为生物产品发酵生产的新方向。已开发出高渗抗性菌株Halomonas bluephagenesis，可在高渗透压下产生L-苏氨酸，在摇瓶和7L发酵罐中L-苏氨酸产量分别达到7.5g/L和33g/L。渗透压保护剂已用于改善发酵过程中渗透压不平衡引起的生长和产量限制。但这些方法还不能满足工业生产的需求，因此对高产L-苏氨酸且高渗耐受性菌株的筛选和遗传修饰，具有十分重大的意义。

甜菜碱由于其特殊的甲基化相关结构而被用作渗透保护剂。在大肠杆菌中，甜菜碱在细胞生长和目标代谢产物的产生中起着不可或缺的作用。为了在发酵的后期维持细菌的活性，可以添加甜菜碱以提高对渗透压的耐受性。添加甜菜碱可以增加大肠杆菌中乳酸或苏氨酸的产量和谷氨酸棒杆菌中赖氨酸的产量，对于L-苏氨酸产量也有一定的提高，然而甜菜碱浓度超过2g/L就会对苏氨酸生产有副作用。

大肠杆菌中的甜菜碱生物合成涉及以下基因：编码胆碱脱氢酶的基因betA，编码甜菜碱醛脱氢酶的基因betB，编码胆碱的基因betT，H(+)转运蛋白和调控基因betI。当细胞外渗透压升高时，渗透保护剂(如甜菜碱)会通过转运蛋白从培养基中吸收或通过细胞内生物合成在细胞中蓄积。大肠杆菌中主要的甜菜碱转运蛋白是主要转运蛋白(ProP)和次要转运蛋白(ProVWX)，它们受渗透压调节。在一个主要的渗透调节启动子的控制下，基因proP和proV，proW和proX均协同表达。

磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(phosphoenolpyruvate：carbohydratephosphotransferase system，PTS)是大肠杆菌细胞内参与葡萄糖从膜间质转运和磷酸化到胞内的主要活性转运系统，影响苏氨酸合成前体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的利用率。通过对PTS系统的定向修饰和改造，调节细胞内代谢流向，提高碳源利用率，增加苏氨酸前体合成量，能够构建出较为理想的苏氨酸高产菌。

发明内容

本发明通过敲除编码渗透压保护剂甜菜碱转运蛋白ProP和ProVWX来改变胞内渗透压，使L-苏氨酸产量得到提高；通过进一步敲除编码细菌磷酸转移酶(PTS)系统中的crr或ptsG基因，提高L-苏氨酸的产量。

本发明的第一个目的是提供一种影响细胞内渗透压平衡来提高苏氨酸产量的方法，所述方法是敲除大肠杆菌基因组上负责转运渗透压保护剂甜菜碱的基因，所述负责转运渗透压保护剂甜菜碱的基因为proP和proVWX。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌TWF001，大肠杆菌TWF001己公开于2018年的论文《Increasing L-threonine production in Escherichia coli byengineering the glyoxylate shunt and the 1-threonine biosynthesis pathway》中。

在一种实施方式中，所述基因proP来源于大肠杆菌，其敲除片段序列如SEQ IDNO.1。

在一种实施方式中，所述基因proVWX来源于大肠杆菌，其敲除片段序列如SEQ IDNO.2。

在一种实施方式中，所述基因工程菌还敲除了细菌磷酸转移酶(PTS)系统或甜菜碱生物合成基因。

在一种实施方式中，所述PTS系统涉及的基因有2个，分别为crr，ptsG。

在一种实施方式中，所述基因crr来源于大肠杆菌，其敲除片段序列如SEQ IDNO.7。

在一种实施方式中，所述基因ptsG来源于大肠杆菌，其敲除片段序列如SEQ IDNO.6。

在一种实施方式中，所述甜菜碱生物合成基因betABTI为编码胆碱脱氢酶的基因betA，编码甜菜碱醛脱氢酶的基因betB，编码胆碱的基因betT，H(+)转运蛋白和调控基因betI。

在一种实施方式中，所述甜菜碱生物合成基因序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是提供应用上述任一方法构建获得的基因工程菌。

本发明的第三个目的是提供一种所述基因工程菌制备L-苏氨酸的方法。

在一种实施方式中，从培养有基因工程菌的平板上挑取单菌落接种于5mL种子培养基中，37℃，200rpm培养4h作为一级种子液。

在一种实施方式中，将上述一级种子液按初始OD₆₀₀为0.1-0.2转接至30mL种子培养基中，37℃，200rpm培养4h作为二级种子液，将二级种子液按初始OD₆₀₀为0.2-0.3转接到30mL发酵培养基中，37℃，200rpm培养36h。

在一种实施方式中，所述发酵培养基组成为：1-5g/L酵母粉，1-5g/L柠檬酸，20-30g/L(NH₄)₂SO₄，5-10g/L KH₂PO₄，25-45g/L葡萄糖，1-5g/L MgSO₄·7H₂O，2-8mg/L FeSO₄·7H₂O，2-8mg/L MnSO₄·4H₂O和15-25g/L CaCO₃，pH＝6～7。

本发明的第四个目的是提供所述提高苏氨酸产量的方法或所述基因工程菌在制备L-苏氨酸中的应用。

有益效果：

大肠杆菌基因组proP或/和proVWX的缺失显着增加了L-苏氨酸的产生。与L-苏氨酸生产菌株TWF001相比，在发酵36h，敲除proP得到的重组菌株TSW001，L-苏氨酸的产量增加了33.3％。敲除proVWX得到的重组菌株TSW002，L-苏氨酸产量增加了40.0％；当proP和proVWX都缺失时，所得重组菌株TSW003在培养36h后产生23.5g/L L-苏氨酸。从TSW003敲除crr或ptsG，得到重组菌株TWS008或TWS009。与TWS003相比，重组菌株TWS008和TWS009产生更多的L-苏氨酸，TSW008培养36h后产生24.9g/L L-苏氨酸，而TSW009培养48h后产生26g/LL-苏氨酸，比对照TWF001分别增加108％和116％。

附图说明

图1：大肠杆菌敲除菌株示意图。

图2：用30g/L或40g/L初始葡萄糖发酵大肠杆菌TWF001、TSW001、TSW002、TSW003和TSW004。a.细胞生长，30g/L葡萄糖；b.细胞生长，40g/L葡萄糖；c.葡萄糖消耗，30g/L葡萄糖；d.葡萄糖消耗，40g/L葡萄糖；L-苏氨酸生产，30g/L葡萄糖；f.L-苏氨酸生产，40g/L葡萄糖。

图3：用30g/L或40g/L初始葡萄糖发酵TSW003、TSW005、TSW006、TSW007、TSW008和TSW009。a.细胞生长，30g/L葡萄糖；b.细胞生长，40g/L葡萄糖；c.葡萄糖消耗，30g/L葡萄糖；d.葡萄糖消耗，40g/L葡萄糖；L-苏氨酸生产，30g/L葡萄糖；f.L-苏氨酸生产，40g/L葡萄糖。

具体实施方式

在本发明的下述实施例中，所用的质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、胶回收试剂盒、大肠杆菌JM109菌株购于天根生物公司，所用的限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR试剂等均购于TaKaRa生物公司，所用引物由金唯智生物公司合成。

大肠杆菌TWF001，己公开于2018年的论文《Increasing L-threonine productionin Escherichia coli by engineering the glyoxylate shunt and the 1-threoninebiosynthesis pathway》中。

(1)CRISPR-Cas9基因敲除方法

CRISPR-Cas9敲除系统被用来高效编辑大肠杆菌基因组。编辑质粒pCas首先被电转入苏氨酸生产大肠杆菌中，该质粒包含具有组成型表达的cas9基因和阿拉伯糖诱导表达的编码lambdaRed重组酶的基因，得到含有pCas的菌株。含有pCas的菌株经过过夜培养(8-14h)，保证初始OD₆₀₀为0.04，接种到LB培养基，并添加50mg/L的卡那霉素和10mM阿拉伯糖，然后在30℃下，200rpm生长直至OD₆₀₀达到0.6。收集50mL已诱导培养后的含pCas的菌株培养物，并用冰浴的10％甘油溶液洗涤三次，然后添加2mL冰浴的10％甘油溶液悬浮菌株，分装到1.5mL EP管中于-70℃下保存，得到带有pCas的感受态细胞。

例如从大肠杆菌TWF001中敲除转运蛋白(ProP)基因构建TSW001(图1)。通过使用引物proP-sgRNA-F和sgRNA-R通过PCR从原始pTargetF载体构建质粒pTargetF-proP。使用引物Y-pTargetF-F和Y-pTargetF-R进行测序确认其序列。pCas被转化为TWF001，得到TWF001/pCas。阿拉伯糖被用于诱导Red酶在TWF001/pCas中的重组表达。引物proPf1和proPr1用于扩增proP基因的上游片段，而引物proPf2和proPr2用于扩增proP基因的下游片段。使用引物proPf1和proPr2通过重叠PCR连接获得的上下游片段得到重叠片段。将500ng的重叠片段和100ng的pTargetF-proP混合并电转化到100μL TWF001/pCas感受态细胞中。在30℃下恢复细胞1h，将其涂在含有壮观霉素(50mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的LB琼脂平板上，然后在30℃下孵育24～36h。使用引物proPf1和proPr2进行菌落PCR确认正确的转化子。最后，通过添加0.5mM IPTG去除pTargetF-proP，然后通过在42℃下培养24h来去除pCas。本发明中的其他敲除菌株的构建与以上步骤相同。

(2)胞外代谢物测定方法

细胞生长测定：通过UV-1800分光光度计(日本岛津市)测量600nm处的光密度(OD₆₀₀)。

葡萄糖的水平测定：使用SBA-40E生物传感器(山东，中国)测定培养基中的残留葡萄糖。取800μL培养物并以13800g离心20min以获得上清液，将10μL上清液稀释100倍，以测定培养基中的残留葡萄糖。

L-苏氨酸的含量测定：使用1260系列高效液相色谱(HPLC)系统(AgilentTechnology，USA)测定培养基中的L-苏氨酸。取800μL培养物并以13800g离心20min以获得上清液，将50μL上清液用三氯乙酸稀释(用于蛋白质沉淀)至1mL，以测定培养基中的L-苏氨酸含量。使用Thermo ODS-2HYPERSIL C18色谱柱(250mm×4.0mm，美国)分离和定量L-苏氨酸。流动相是溶剂混合物A和B：溶剂A每升包含3.01g乙酸钠，200μL三乙胺和5mL四氢呋喃；溶剂B是将3.01g乙酸钠，400mL乙腈和400mL甲醇混合在200mL去离子水中。在18min内将两种溶剂的比例从8％的溶剂B调整为100％溶剂B到0.8mL min。将20μL样品衍生，注入并在338nm处监控。

实施例1基因工程菌的构建

使用CRISPR-Cas9敲除系统编辑大肠杆菌菌株的基因组来构建基因工程菌。

大肠杆菌TWF001，己公开于2018年的论文《Increasing L-threonine productionin Escherichia coli by engineering the glyoxylate shunt and the l-threoninebiosynthesis pathway》中。

TSW001：以大肠杆菌TWF001为出发菌株，敲除proP基因，得到菌株TSW001。

TSW002：以大肠杆菌TWF001为出发菌株，敲除proVWX基因，得到菌株TSW002。

TSW003：以大肠杆菌TSW002为出发菌株，敲除proP基因，得到菌株TSW003。

TSW004：以大肠杆菌TWF001为出发菌株，敲除betABIT基因，得到菌株TSW004。

TWS005：以大肠杆菌TSW003为出发菌株，敲除betABIT基因，得到菌株TSW005。

TWS006：以大肠杆菌TSW003为出发菌株，敲除proC基因，得到菌株TSW006。

TWS007：以大肠杆菌TSW003为出发菌株，敲除fadR基因，得到菌株TSW007。

TSW008：以大肠杆菌TSW003为出发菌株，敲除crr基因，得到菌株TSW008。

TSW009：以大肠杆菌TSW003为出发菌株，敲除ptsG，基因，得到菌株TSW009。

表1基因序列表

表2引物序列表

实施例2敲除负责转运渗透压保护剂甜菜碱的基因对L-苏氨酸产量的影响

种子培养基组成：10g/L蔗糖，5g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，15g/L(NH₄)2SO₄，1g/LMgSO₄。

发酵培养基组成：2g/L酵母粉，2g/L柠檬酸，25g/L(NH₄)₂SO₄，7.46g/L KH₂PO₄，30g/L或40g/L葡萄糖，2g/L MgSO₄·7H₂O，5mg/L FeSO₄·7H₂O，5mg/L MnSO₄·4H₂O和20g/LCaCO₃，pH＝6.8。

摇瓶发酵生产L-苏氨酸，将菌株在LB琼脂平板上划线，并在37℃条件下培养24h。挑取单菌落于装有5mL种子培养基的试管中，37℃，200rpm培养4h作为一级种子液，然后按初始OD₆₀₀为0.1转接至30mL/250mL种子培养基中，37℃，200rpm培养4h作为二级种子液，最后按初始OD₆₀₀为0.2转接至30mL/500mL发酵培养基中，37℃，200rpm培养36h，取样测定L-苏氨酸的产量。

由图2可以看出，与对照TWF001相比，基因工程菌TSW001和TSW002生长速率较慢，葡萄糖的消耗速度较慢。但当发酵时间大于16h，TSW001和TSW002能产生更多的L-苏氨酸。发酵36h，在初始葡萄糖浓度为40g/L时，TSW001得最高的L-苏氨酸产量(18g/L)，L-苏氨酸产量增加了33.3％；TSW002中获得最高的L-苏氨酸产量(21.1g/L)，L-苏氨酸产量增加了40.0％。

与对照TWF001相比，在初始葡萄糖浓度为30g/L时，缺失了基因proP和proVWX的基因工程菌TSW003，在发酵早期阶段(8-16h)生长速度缓慢，消耗的葡萄糖显着降低，并且产生的L-苏氨酸较少，但在后期阶段(24-36h)TSW003生长状态与其他菌株无明显差异，并产生更多的L-苏氨酸。在发酵36h，在30g/L初始葡萄糖下TSW003产生18.9g/L L-苏氨酸，葡萄糖转化率为0.63g/g，比对照TWF001产生的L-苏氨酸提高了57.5％(0.575倍)。在40g/L初始葡萄糖下，TSW003的生长速率相对在30g/L初始葡萄糖下相对提高了24.3％。在发酵早期阶段(8-16h)葡萄糖消化依旧缓慢且L-苏氨酸产率较低，但在后期阶段(24-36h)TSW003葡萄糖消耗增加，最高产生23.5g/L的L-苏氨酸，葡萄糖转化率达到0.59g/g，比对照TWF001产生的L-苏氨酸提高了95.8％。

实施例3敲除细菌磷酸转移酶(PTS)系统相关基因对L-苏氨酸产量的影响

L-苏氨酸摇瓶发酵生产具体实施方式同实施例2。

1)由图3可以看出，在初始葡萄糖为30g/L的情况下，基因工程菌TSW008在最初的24h内几乎不消耗葡萄糖，24h后开始生长，发酵36h，TSW008摇瓶发酵产生L-苏氨酸为19.6g/L；基因工程菌TSW009在发酵16h后开始缓慢生长，消耗葡萄糖速率缓慢，发酵36h，TSW009摇瓶发酵产生L-苏氨酸为19.6g/L。

2)当初始葡萄糖为40g/L时，在TSW008和TSW009中观察到相似的生长模式、葡萄糖消耗和L-苏氨酸产量。发酵36h后，TSW008的L-苏氨酸产量最高(24.9g/L)，生产力为0.69g/L/h；发酵48h后，TSW009的最高生产力为0.54g/L/h(26g/L)。相较基因工程菌TSW003生产L-苏氨酸的产量提高了108％和116％。结果表明crr或ptsG基因的缺失可以提高L-苏氨酸的产量。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种敲除基因proP和proVWX高产苏氨酸的工程菌及其应用

<130> BAA201684A

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgctgaaaa ggaaaaaagt aaaaccgatt acccttcgtg atgtcaccat tattgatgac 60

ggtaaactgc gtaaagccat taccgcagca tcactgggta atgcaatgga atggttcgat 120

tttggtgttt atggttttgt tgcttacgca ttaggtaaag tttttttccc gggggctgac 180

cccagcgtgc agatggttgc tgcacttgcc actttctccg ttccctttct gattcgaccg 240

cttggcggac tcttctttgg tatgttgggc gataaatatg gtcgccagaa gatcctcgct 300

atcactattg tgattatgtc gatcagtacg ttctgtattg gcttaatacc gtcctacgac 360

acgattggta tttgggcacc gattctgctg ttgatctgta agatggcaca aggtttctcg 420

gtcggcggtg aatataccgg ggcgtcgata tttgttgcgg aatactcccc tgaccgtaaa 480

cgtggcttta tgggcagctg gctggacttc ggttctattg ccgggtttgt gctgggtgcg 540

ggcgtggtgg tgttaatttc gaccattgtc ggcgaagcga acttcctcga ttggggctgg 600

cgtattccgt tctttatcgc tctgccgtta gggattatcg ggctttacct gcgccatgcg 660

ctggaagaga ctccggcgtt ccagcagcat gtcgataaac tggaacaggg cgaccgtgaa 720

ggtttgcagg atggcccgaa agtctcgttt aaagagattg ccactaaata ctggcgcagc 780

ctgttgacat gtattggtct ggtaattgcc accaacgtga cttactacat gttgctgacc 840

tatatgccga gttatttgtc gcataacctg cattactccg aagaccacgg ggtgctgatt 900

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cgttttggcc gtcgtccgtt tgtgctactt ggtagtgttg ccctgtttgt gttggcgatc 1020

ccggcgttta ttctgattaa cagtaacgtc atcggcctga tttttgccgg gttactgatg 1080

ctggcggtga tccttaactg ctttacgggc gttatggctt ctaccttgcc agcgatgttc 1140

ccgacgcata tccgttacag cgcgctggcg gcggcattta atatttcggt gctggttgcc 1200

ggtctgacgc caacgctggc ggcctggctg gtcgaaagct cgcagaatct gatgatgcct 1260

gcctattacc tgatggtagt ggcggtggtt ggtttaatca ccggcgtaac catgaaagag 1320

acggcaaatc gtccgttgaa aggtgcgaca ccggcggcgt cagatataca ggaagcgaag 1380

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taa 1503

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<211> 3310

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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gaattatggc ttcccggtca gcaccatgca tatcgttgcc aacaaagcct gggccgagaa 3120

aaacccggca gcagcgaaac tgtttgccat tatgcagttg ccagtggcag atattaacgc 3180

ccagaacgcc attatgcatg acggcaaagc ctcagaaggc gatattcagg gacacgttga 3240

tggttggatc aaagcccacc agcagcagtt cgatggctgg gtgaatgagg cgctggcagc 3300

gcagaagtaa 3310

<210> 3

<211> 5920

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcacgcgtcc gggaacatca cgctatggcc cggcgcttca cgatggagat gaataaagtt 60

aaggtgccgc tcgtactggt caagaatatc ggtgatcacc tgctctttgc tgtagtccat 120

caggtcgttg ccctggctgc cttctaacag gaaggtttcc agccggtagt aggtcgattt 180

accgctgcgt gcgcggtagg taaagcccgg caccgaatat tgctgcggcc aaatctgata 240

gacaaagttt tgctcttcgc ccatatgcac caacaaatcc agatgaccca actgctgtcc 300

ctcttccggt ggcaggcttt ttagctccac gtacgcgccg cgcaaccgca actcctgcgc 360

cacttcttcc attgccgggt aacagaccgt ctccatcatc tgtttagtgt aacgcgtgcc 420

cggataattc atcaggcgcg agagacgttt tttccagctc aggcgatcct gaagccccag 480

cggtcgcggt gcggtatcgc ggttggcact ttcacggcgg taatcttcta ccttcagaga 540

tttatacaac cccgccatca cgaagaagat cacaaagctg aacggcagcc ccataatcac 600

cgtggtgttt tgcagcgcgg atatcccgtt agtcatcagc atgccgagcg tcagcaggcc 660

aatcgccacc gaccagaaga cgcgcagcca gccgggggcg tcgctgttga tatctttaag 720

ctgcgaggtg aaattcccca gcaccagcgc cccggagtcc gccgaggtca cataaaacag 780

caggccagta atggtggcga cggaggcgct aaaggtaaac gccggatact gcgccagcag 840

gctgtagaag ccgcgctccg gatggaccat cgcttcctcg gcaaatgccg cgccgccgtg 900

gatgatttca tacagcgcgc tattgccgaa caccgagagc cataacagcg tgaaggtaaa 960

cggaataatc aacgtgccca gcacgaactg gcgaatggta cgcccacgcg agatacgcgc 1020

caggaacaag ccgacaaacg gcgaccatgc cacccaccat gcccagaaga agagcgtcca 1080

gttattcatc cactcaaccg gacggtcgaa ggcaaaactg ttgagcgtca tgcccataaa 1140

gcgattcaca tagtcgccaa cattcagcac cagtgcatta agcaggaacg aagtgtcgcc 1200

cataaacaat acgaacagga tcaatcccag cgccagcgcg acattaagct ccgataacac 1260

gcgaatgccc ttatcgacac cggaggtgac agagatcgtg gcgattatca ccgacaaggc 1320

gatcagtgcc gctttcgccg ccatcgaatc gggaatatca aacagtacgc tcaagccata 1380

gttaagctgc accacaccga taccgagcgt agtggcaata ccgaagatag tgccgatcac 1440

cgctgcaata tccactgagt gacctatcgg cccgttaatc cgtttaccga agatcgggta 1500

cagcgccgag cggatggtga gcggcaaatt ataacgatag ctaaagtatc cgagcgccat 1560

gcccatcagc gcatacatcg accagccggt taagccgtag tgaaacagcg tccagaccat 1620

cgcctgacgc gcggcctcaa tcgtctgtcc cgcgccttcc ggcggctgca tatactgcgt 1680

taccggttcg gctacggaga agaacatcag gtcgataccg atcccggcag caaacagcat 1740

cgccgcccaa ctcagcaggc tgaattccgg tttggattgt tctggcccga gcttcaccga 1800

accaaaacgc gaacaagcga tacagaccac aaagacaata tagagcgttg ccgccagcag 1860

atagtaccaa ccgaaggttt tagaaaccca gtccagcgtg cggccaatcc acagggccga 1920

gaagtcgcga aacaggatcg ttgtcaggga aaacaacaaa atcagtccgg cggaggtgta 1980

aaacaccacc ggattgattt tgtccttttc cctgctgtgt gaaaggtctg tcatccagta 2040

tccccactgt tattgttact atttaaaatc aaattcgtaa caattaagac acattttata 2100

ttgaacgtcc aatcaataac cgctttaata gataaacacc gctgatgaat ggagtggcga 2160

aaatgcccaa attggggatg cagtcgatcc ggcgcagaca actgatcgac gccacactgg 2220

aagcaataaa tgaagtgggc atgcacgatg caacgatcgc gcagatcgcc cgccgtgcag 2280

gcgtttctac ggggatcatc agccactatt tcagggacaa aaatggtctg ctggaagcaa 2340

ccatgcgcga tatcaccagt cagctgcgtg acgcggtttt gaatcgatta catgcacttc 2400

cgcagggcag tgcagagcag cgattacagg cgattgttgg cggaaacttc gatgaaacgc 2460

aggtgagcag tgcggcgatg aaagcctggc tggcgttctg ggccagcagt atgcatcagc 2520

cgatgctcta tcgtttacag caggtcagca gccgccgctt gctgtcgaat ctggtgagcg 2580

agtttcgtcg cgaattgccg cgcgaacagg cacaggaagc gggctacggc ctggccgcgc 2640

tgattgatgg attatggctg cgcgcggctc tgagcggcaa accgctggat aaaacccgcg 2700

ctaattccct gacccgccac tttatcactc agcatctacc caccgattaa ccgaggagac 2760

gtgatgtccc gaatggcaga acagcagctt tatatacatg gtggttatac ctccgccacc 2820

agcggtcgca ccttcgagac cattaacccg gccaacggta acgtgctggc gaccgtgcag 2880

gccgccgggc gcgaggatgt cgatcgcgcc gtgaaaagcg cccagcaggg gcaaaaaatc 2940

tgggcgtcga tgaccgccat ggagcgctcg cgtattctgc gtcgggccgt tgatattctg 3000

cgtgaacgca atgacgaact cgcaaaactg gaaaccctcg acaccggaaa agcatattcg 3060

gaaacctcaa ccgtcgatat cgttaccggt gcggacgtgc tggagtacta cgccgggctg 3120

atcccggcgc tggaaggcag ccagatcccg ttgcgtgaaa cgtcctttgt gtatacccgc 3180

cgcgaaccgc tgggcgtagt ggcagggatt ggcgcatgga actacccgat ccagattgcc 3240

ctgtggaaat ccgccccggc gctggcggca ggcaacgcaa tgattttcaa accgagcgaa 3300

gttaccccgc ttaccgcgtt aaagctggct gaaatttaca gcgaagcggg cctgccggac 3360

ggcgtattta acgtgttgcc gggcgtgggc gcggagaccg ggcaatatct gaccgagcat 3420

ccgggcattg ccaaagtgtc atttaccggc ggtgtcgcca gcggcaaaaa agtgatggct 3480

aactcggcgg cctcttccct gaaagaagtg accatggaac tgggcggtaa atcaccgctg 3540

atcgttttcg atgatgcgga tctcgatctc gccgccgata tcgccatgat ggcaaacttc 3600

ttcagctccg gtcaggtgtg taccaatggc acccgcgtct tcgttccggc gaaatgcaaa 3660

gccgcatttg agcagaaaat tctggcgcgc gttgagcgca ttcgcgcggg cgacgttttc 3720

gatccgcaaa ctaacttcgg cccgctggtc agcttcccgc atcgcgataa cgtgctgcgc 3780

tatatcgcca aaggcaaaga ggaaggcgcg cgcgtactgt gcggcggcga tgtactgaaa 3840

ggcgatggct tcgataacgg cgcatgggtt gcaccgacag tgttcaccga ttgcagcgac 3900

gatatgacca tcgtgcgtga agagatcttc gggccagtga tgtccattct gacctacgag 3960

tcggaagacg aagtcattcg ccgcgctaac gataccgact acggcctggc ggcgggcatc 4020

gtgacagcgg acctgaaccg cgcgcatcgc gtcattcatc agctggaagc gggtatttgc 4080

tggatcaaca cctggggcga atccccggca gagatgcccg ttggcggcta caaacactcc 4140

ggcattggtc gcgagaacgg cgtgatgacg ctccagagtt acacccaggt gaagtccatc 4200

caggttgaga tggctaaatt ccagtccata ttctaaccag gaggtttatt tgcaatttga 4260

ctacatcatt attggtgccg gctcagccgg caacgttctc gctacccgtc tgactgaaga 4320

tccgaatacc tccgtgctgc tgcttgaagc gggcggcccg gactatcgct ttgacttccg 4380

cacccagatg cccgctgccc tggcattccc gctacagggt aaacgctaca actgggccta 4440

tgaaacggaa cctgaaccgt ttatgaataa ccgccgcatg gagtgcggac gcggtaaagg 4500

tctgggtgga tcgtcgctga tcaacggcat gtgctacatc cgtggcaatg cgctggatct 4560

cgataactgg gcgcaagaac ccggtctgga gaactggagc tacctcgact gcctgcccta 4620

ctaccgcaag gccgagactc gcgatatggg tgaaaacgac tatcacggcg gtgatggccc 4680

ggtgagcgtc actacctcca aacccggcgt caatccgctg tttgaagcga tgattgaagc 4740

gggcgtgcag gcgggctacc cgcgcacgga cgatctcaac ggttatcagc aggaaggttt 4800

tggtccgatg gatcgcaccg tcacgccgca gggccgtcgc gccagcaccg cgcgtggcta 4860

tctcgatcag gccaaatcgc gtcctaacct gaccattcgt actcacgcta tgaccgatca 4920

catcattttt gacggcaaac gcgcggtggg cgtcgaatgg ctggaaggcg acagcaccat 4980

cccaacccgc gcaacggcca acaaagaagt gctgttatgt gcaggcgcga ttgcctcacc 5040

gcagatcctg caacgctccg gcgtcggcaa cgctgaactg ctggcggagt ttgatattcc 5100

gctggtgcat gaattacccg gcgtcggcga aaatcttcag gatcatctgg agatgtatct 5160

gcaatatgag tgcaaagaac cggtttccct ctaccctgcc ctgcagtggt ggaaccagcc 5220

gaaaatcggt gcggagtggc tgtttggcgg cactggcgtt ggtgccagca accactttga 5280

agcaggtgga tttattcgca gccgtgagga atttgcgtgg ccgaatattc agtaccattt 5340

cctgccagta gcgattaact ataacggctc gaatgcagtg aaagagcacg gtttccagtg 5400

ccacgtcggc tcaatgcgct cgccaagccg tgggcatgtg cggattaaat cccgcgaccc 5460

gcaccagcat ccggcgattc tgtttaacta catgtcgcac gagcaggact ggcaggagtt 5520

ccgcgacgca attcgcatca cccgcgagat catgcatcaa cccgcgctgg atcagtatcg 5580

tggccgcgaa atcagccccg gtgtcgaatg ccagacggat gaacagctcg atgagttcgt 5640

gcgtaaccac gccgaaaccg ccttccatcc gtgcggtacc tgcaaaatgg gttacgacga 5700

gatgtccgtg gttgacggcg aaggccgcgt acacgggtta gaaggcctgc gtgtggtgga 5760

tgcgtcgatt atgccgcaga ttatcaccgg gaatttgaac gccacgacaa ttatgattgg 5820

cgagaaaata gcggatatga ttcgtggaca ggaagcgctg ccgaggagca cggcgggata 5880

ttttgtggca aatgggatgc cggtgagagc gaaaaaatga 5920

<210> 4

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggaaaaga aaatcggttt tattggctgc ggcaatatgg gaaaagccat tctcggcggt 60

ctgattgcca gcggtcaggt gcttccaggg caaatctggg tatacacccc ctccccggat 120

aaagtcgccg ccctgcatga ccagttcggc atcaacgccg cagaatcggc gcaagaagtg 180

gcgcaaatcg ccgacatcat ttttgctgcc gttaaacctg gcatcatgat taaagtgctt 240

agcgaaatca cctccagcct gaataaagac tctctggtcg tttctattgc tgcaggtgtc 300

acgctcgacc agcttgcccg cgcgctgggc catgaccgga aaattatccg cgccatgccg 360

aacactcccg cactggttaa tgccgggatg acctccgtaa cgccaaacgc gctggtaacc 420

ccagaagata ccgctgatgt gctgaatatt ttccgctgct ttggcgaagc ggaagtaatt 480

gctgagccga tgatccaccc ggtggtcggt gtgagcggtt cttcgccagc ctacgtattt 540

atgtttatcg aagcgatggc cgacgccgcc gtgctgggcg ggatgccacg cgcccaggcg 600

tataaatttg ccgctcaggc ggtaatgggt tccgcaaaaa tggtgctgga aacgggagaa 660

catccggggg cactgaaaga tatggtctgc tcaccgggag gcaccaccat tgaagcggta 720

cgcgtactgg aagagaaagg cttccgtgct gcagtgatcg aagcgatgac gaagtgtatg 780

gaaaaatcag aaaaactcag caaatcctga 810

<210> 5

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggtcatta aggcgcaaag cccggcgggt ttcgcggaag agtacattat tgaaagtatc 60

tggaataacc gcttccctcc cgggactatt ttgcccgcag aacgtgaact ttcagaatta 120

attggcgtaa cgcgtactac gttacgtgaa gtgttacagc gtctggcacg agatggctgg 180

ttgaccattc aacatggcaa gccgacgaag gtgaataatt tctgggaaac ttccggttta 240

aatatccttg aaacactggc gcgactggat cacgaaagtg tgccgcagct tattgataat 300

ttgctgtcgg tgcgtaccaa tatttccact atttttattc gcaccgcgtt tcgtcagcat 360

cccgataaag cgcaggaagt gctggctacc gctaatgaag tggccgatca cgccgatgcc 420

tttgccgagc tggattacaa catattccgc ggcctggcgt ttgcttccgg caacccgatt 480

tacggtctga ttcttaacgg gatgaaaggg ctgtatacgc gtattggtcg tcactatttc 540

gccaatccgg aagcgcgcag tctggcgctg ggcttctacc acaaactgtc ggcgttgtgc 600

agtgaaggcg cgcacgatca ggtgtacgaa acagtgcgtc gctatgggca tgagagtggc 660

gagatttggc accggatgca gaaaaatctg ccgggtgatt tagccattca ggggcgataa 720

<210> 6

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgtttaaga atgcatttgc taacctgcaa aaggtcggta aatcgctgat gctgccggta 60

tccgtactgc ctatcgcagg tattctgctg ggcgtcggtt ccgcgaattt cagctggctg 120

cccgccgttg tatcgcatgt tatggcagaa gcaggcggtt ccgtctttgc aaacatgcca 180

ctgatttttg cgatcggtgt cgccctcggc tttaccaata acgatggcgt atccgcgctg 240

gccgcagttg ttgcctatgg catcatggtt aaaaccatgg ccgtggttgc gccactggta 300

ctgcatttac ctgctgaaga aatcgcctct aaacacctgg cggatactgg cgtactcgga 360

gggattatct ccggtgcgat cgcagcgtac atgtttaacc gtttctaccg tattaagctg 420

cctgagtatc ttggcttctt tgccggtaaa cgctttgtgc cgatcatttc tggcctggct 480

gccatcttta ctggcgttgt gctgtccttc atttggccgc cgattggttc tgcaatccag 540

accttctctc agtgggctgc ttaccagaac ccggtagttg cgtttggcat ttacggtttc 600

atcgaacgtt gcctggtacc gtttggtctg caccacatct ggaacgtacc tttccagatg 660

cagattggtg aatacaccaa cgcagcaggt caggttttcc acggcgacat tccgcgttat 720

atggcgggtg acccgactgc gggtaaactg tctggtggct tcctgttcaa aatgtacggt 780

ctgccagctg ccgcaattgc tatctggcac tctgctaaac cagaaaaccg cgcgaaagtg 840

ggcggtatta tgatctccgc ggcgctgacc tcgttcctga ccggtatcac cgagccgatc 900

gagttctcct tcatgttcgt tgcgccgatc ctgtacatca tccacgcgat tctggcaggc 960

ctggcattcc caatctgtat tcttctgggg atgcgtgacg gtacgtcgtt ctcgcacggt 1020

ctgatcgact tcatcgttct gtctggtaac agcagcaaac tgtggctgtt cccgatcgtc 1080

ggtatcggtt atgcgattgt ttactacacc atcttccgcg tgctgattaa agcactggat 1140

ctgaaaacgc cgggtcgtga agacgcgact gaagatgcaa aagcgacagg taccagcgaa 1200

atggcaccgg ctctggttgc tgcatttggt ggtaaagaaa acattactaa cctcgacgca 1260

tgtattaccc gtctgcgcgt cagcgttgct gatgtgtcta aagtggatca ggccggcctg 1320

aagaaactgg gcgcagcggg cgtagtggtt gctggttctg gtgttcaggc gattttcggt 1380

actaaatccg ataacctgaa aaccgagatg gatgagtaca tccgtaacca ctaa 1434

<210> 7

<211> 510

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgggtttgt tcgataaact gaaatctctg gtttccgacg acaagaagga taccggaact 60

attgagatca ttgctccgct ctctggcgag atcgtcaata tcgaagacgt gccggatgtc 120

gtttttgcgg aaaaaatcgt tggtgatggt attgctatca aaccaacggg taacaaaatg 180

gtcgcgccag tagacggcac cattggtaaa atctttgaaa ccaaccacgc attctctatc 240

gaatctgata gcggcgttga actgttcgtc cacttcggta tcgacaccgt tgaactgaaa 300

ggcgaaggct tcaagcgtat tgctgaagaa ggtcagcgcg tgaaagttgg cgatactgtc 360

attgaatttg atctgccgct gctggaagag aaagccaagt ctaccctgac tccggttgtt 420

atctccaaca tggacgaaat caaagaactg atcaaactgt ccggtagcgt aaccgtgggt 480

gaaaccccgg ttatccgcat caagaagtaa 510

Claims (6)

1.一种提高苏氨酸产量的方法，其特征在于，所述方法是敲除大肠杆菌基因组上基因proP和proVWX；敲除所述基因proP的序列如SEQ ID NO.1所示；敲除所述基因proVWX的序列如SEQ ID NO.2所示；所述大肠杆菌为大肠杆菌TWF001。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，还敲除了细菌磷酸转移酶系统相关基因crr或ptsG；敲除所述基因crr的序列如SEQ ID NO.7所示；敲除所述基因ptsG的序列如SEQ IDNO.6所示。

3.应用权利要求1或2所述方法构建获得的基因工程菌。

4.一种权利要求3所述基因工程菌制备L-苏氨酸的方法，其特征在于，将权利要求3所述基因工程菌置于37℃，200 rpm培养4 h的一级种子液按初始OD₆₀₀为0.1-0.2转接至种子培养基中，37℃，200 rpm培养4 h的二级种子液按初始OD₆₀₀为0.2-0.3转接到发酵培养基中，37℃，200rpm培养36 h。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，发酵培养基组成为：1-5 g/L酵母粉，1-5 g/L柠檬酸，20-30 g/L(NH₄)₂SO₄，5-10 g/L KH₂PO₄，25-45 g/L葡萄糖，1-5 g/LMgSO₄∙7H₂O，2-8mg/L FeSO₄∙7H₂O，2-8 mg/L MnSO₄∙4H₂O和15-25 g/LCaCO₃，pH=6~7。

6.权利要求1或2所述方法或权利要求3所述基因工程菌在制备L-苏氨酸中的应用。

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