CN104812906A

CN104812906A - 使用改良的肠杆菌科菌株发酵产生l-氨基酸的方法

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Publication number: CN104812906A
Application number: CN201380054141.5A
Authority: CN
Inventors: B·巴特; S·莫尔克; H·普列费特
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2012-08-20
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2015-07-29
Anticipated expiration: 2033-07-31
Also published as: CN104812906B; WO2014029592A1; RU2015109636A; US10077457B2; JP2015525576A; RU2672614C2; EP2700715A1; EP2700715B1; MY175904A; ES2689754T3; PL2700715T3; KR102109440B1; KR20150041803A; US20150353973A1

Abstract

本发明涉及使用具有弱化的proP基因的肠杆菌科微生物发酵生产L-氨基酸的方法，适于所述生产的微生物及编码ProP转运蛋白变体的多核苷酸。

Description

使用改良的肠杆菌科菌株发酵产生L-氨基酸的方法

本发明涉及使用具有弱化的proP基因的肠杆菌科微生物发酵产生L-氨基酸的方法，适于所述生产的微生物及编码ProP转运蛋白的变体的多核苷酸。

有机化合物，特别是含硫L-氨基酸具有重大的经济学意义。L-半胱氨酸用作食品补充剂，用作药物学活性化合物(例如N-乙酰半胱氨酸)及化妆品的起始物。氨基酸L-甲硫氨酸在动物营养中起重要作用，是在脊椎动物代谢中不能生物合成产生的必需氨基酸之一。因此，在动物饲养中，必须保证随着饲料摄取足够量的特定氨基酸。然而，由于L-甲硫氨酸通常以太低的量存在于常规饲料植物(如大豆或谷物)中，不能保证最佳的动物营养，特别是对于猪和家禽，有利的是掺入甲硫氨酸作为动物饲料的添加物。脊椎动物可以将D-甲硫氨酸转变为生物活性L-甲硫氨酸。因此，通常将D-和L-甲硫氨酸的外消旋体加入动物饲料中。动物通过转甲基作用可以将L-高半胱氨酸转变为L-甲硫氨酸，前者因此可代替后者。

下文提及的有机化合物是指选自L-氨基酸，优选含硫L-氨基酸，特别是L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-高半胱氨酸和L-高胱氨酸的一或多种化合物。优选L-甲硫氨酸。

在现有技术中，氨基酸如甲硫氨酸是通过化学合成制备的。这包括首先使丙烯醛与甲硫醇反应产生3-(甲硫基)丙醛，其依次与氰化物、氨和一氧化碳产生乙内酰脲。最终，后者可以水解为外消旋体，两种立体异构体D-和L-甲硫氨酸的等摩尔混合物。由于分子的生物活性形式仅呈现为L形式，因此饲料中存在的D形式必须首先通过脱氨和转氨作用经代谢地转变为活性L形式。

与甲硫氨酸不同，大多数其它天然的蛋白原性氨基酸如L-苏氨酸是通过微生物发酵鉴定制备的。这是利用微生物具有合适的合成天然氨基酸的生物合成途径。此外，许多发酵方法通过使用廉价的反应物如葡萄糖和无机盐实现非常有利的生产成本，并且也实现特定氨基酸的生物活性L形式。

已知有机化合物可以通过肠杆菌科，特别是大肠杆菌(E.coli)和粘质沙雷氏菌的菌株发酵而产生。由于其显著性，不断进行尝试以改良制备方法。生产方法的改良可涉及发酵技术，例如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间使用的糖的选择及糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。

野生型菌株中氨基酸的生物合成途径受到严格代谢控制，以保证氨基酸仅为细胞固有的需要而生产。因此，对于有效的生产方法的一个重要先决条件是用于制备希望的氨基酸的合适的微生物的可利用性，与野生型生物体不同，所述合适的微生物具有大幅度增加的生产产量、超过固有需要(过量生产)。

这种过量产生氨基酸的微生物可以通过传统的突变/选择方法和/或通过现代的特定的重组技术(代谢工程)产生。后者包括首先鉴定由于其修饰、激活或失活而影响氨基酸过量产生的基因或等位基因。然后将这些基因/等位基因导入微生物菌株中或者使用分子生物学技术使其失活以实现最佳的过量生产。然而，通常只有组合多个不同的措施才能导致真正有效的生产。

L-甲硫氨酸与赖氨酸和苏氨酸都衍生自天冬氨酸。将硫以L-半胱氨酸形式(通过胱硫醚作为中间物)通过转硫化导入L-甲硫氨酸中。L-甲硫氨酸的CH₃基团源自C1代谢并由MetE或MetH甲硫氨酸合酶转移至L-高半胱氨酸(参见：Greene RC(1996)in Neidhardt FC et al.(eds.)“Escherichia coli andSalmonella”,2^nd edition,pp.542-560)。例如，发酵生产L-甲硫氨酸的菌株和方法已经在WO2006/001616或WO2009/043803中有对于大肠杆菌的描述。

ProP是大肠杆菌质子/相容性溶质同向转运蛋白，并且因此是大肠杆菌中在高渗条件下酷游活性的转运蛋白之一(Grothe et al.,Journal ofBacteriology 166,253-259(1986)；Racher et al.,Biochemistry 38,1676-1684(1999)；Wood,Methods in Enzymology 428,77-107(2007))。在细胞周围培养基的渗透压增加时，培养基的水势降低并且水分子沿着细胞外的渗透压梯度扩散。细胞的膨压降低，随后，胞质蛋白丧失其功能性相关水化层。这种脱水的结果是，细胞代谢好和细胞分裂停止。为了阻止这种现象，微生物已经在进化过程中进化出不同策略，例如通过合成和/或吸收已知的相容性溶质。如果这些天然存在的保护剂如脯氨酸或甘氨酸甜菜碱可外部获得，其吸收较快及也是更有利的，吸收优选于微生物自身合成(Wood,Microbiology and Molecular Biology Reviews 63,230-262(1999))。ProP同向转运蛋白属于MFS家族(主要协同蛋白超家族(major facilitatorsuperfamily))，催化脯氨酸、甘氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱、伊克多因及其它结构相似的底物与质子在高渗条件下协同吸收进细胞中。ProP是在复水(rekonstituierten)的系统中检测到渗透感受和渗透调节性质的第一种转运蛋白。C末端结构域能形成卷曲螺旋基序。这个结构域的形成对于渗透调节是重要的，并且可能对于渗透刺激感受是重要的(Culham et al.,Journal ofMolecular Recognition 13,309-322(2000))。ProP通过钾离子浓度的内部升高及使用不同链长度的聚乙二醇(PEG)在脂蛋白体中模拟大分子拥挤而激活(Racher et al.,Biochemistry 40,7324-7333(2001)；Culham et al.,Biochemistry42,410-420(2003))。尽管ProP能不用另外的因子而感受到渗透压情况，但是载体在体内的完全活性需要存在胞质ProQ蛋白(Kunte et al.,Journal ofBacteriology 181,1537-43(1999))。

因此，大肠杆菌ProP转运蛋白在渗透调节中的功能很久前就是已知的。

令人惊奇地，本发明发现肠杆菌科微生物生产L-氨基酸可以通过弱化proP基因而增加。

本发明的目的是提供使得含硫氨基酸，特别是L-甲硫氨酸，的过量产生可以增加的方法和微生物。

发明描述

本发明的第一方面是通过肠杆菌科微生物发酵产生L-氨基酸或者含有L-氨基酸的饲料添加物的方法，特征在于应用其中proP基因已经弱化的微生物。

所述微生物产生L-氨基酸并将其优选分泌到周围的培养基中。

此外，所述微生物导致L-氨基酸优选在培养基中和/或细胞内部积聚(积聚)，特别优选在培养基中积聚。

因此，本发明另一方面也是肠杆菌科微生物，其具有弱化的proP基因，特征在于其产生L-氨基酸并优选将其分泌到培养基中，优选导致L-氨基酸在培养基中和/或细胞内部积聚，优选在培养基中积聚。

优选地，与所应用的无弱化的proP基因的起始菌株或亲代菌株相比，在发酵方法中，本发明的微生物显示增加的希望的L-氨基酸的产生及优选分泌。

根据本发明，“弱化”是指proP基因以低水平表达或者已经完全被关闭。

在本发明中，术语“弱化”描述了，通过例如使用比在未针对各酶或蛋白质重组的微生物或亲代菌株中的启动子弱的启动子，或者使用编码各低活性的酶或蛋白质的基因或等位基因，或失活各酶或蛋白质或开放读框或基因，及，如果需要，组合使用这些方法，降低或消除微生物中由相应DNA，特别是本文的proP基因编码的一或多种酶或蛋白质，特别是ProP转运蛋白的胞内活性或浓度。

弱化措施通常使各蛋白质的活性或浓度降低至野生型蛋白质或者未针对各酶或蛋白质重组的微生物或亲代菌株中蛋白质活性或浓度的0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或者0-5％。非重组微生物或亲代菌株是指根据本发明进行弱化或消除的微生物。

弱化可以通过例如降低或消除基因或开放读框的表达或者酶蛋白质的催化活性而实现。可以组合适当这两种措施。

基因表达可以通过合适的培养方法、通过遗传修饰(突变)基因表达的信号结构或者通过反义RNA技术而降低。举例的基因表达的信号结构是阻抑基因、激活基因、操纵子、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。关于这方面的信息可由本领域技术人员在例如Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58:191-195(1998))、Carrier和Keasling(Biotechnology Progress 15:58-64(1999))、Franch和Gerdes(CurrentOpinion in Microbiology 3:159-164(2000))、Kawano等(Nucleic AcidsResearch 33(19),6268-6276(2005))及已知的遗传和分子生物学教科书中找到，所述教科书例如Knippers(“Molekulare Genetik”,6th edition,GeorgThieme Verlag,Stuttgart,Germany,1995)或者Winnacker(“Gene und Klone”,VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany,1990)所著教科书。

本领域已经揭示了导致酶蛋白质催化性质改变或降低的突变，例如下列研究：Qiu和Goodman(Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997))、Yano等(Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 95:5511-5515(1998))、Wente和Schachmann(Journalof Biological Chemistry 266:20833-20839(1991))。概述可见于已知的遗传和分子生物学教科书，例如Hagemann所著的(“Allgemeine Genetik”,GustavFischer Verlag,Stuttgart,1986)。

可以考虑的突变是转换、颠换、插入和删除至少一个碱基对或核苷酸。根据突变所致氨基酸取代对酶活性的作用，称作错义突变或无义突变。错义突变导致蛋白质中指定氨基酸由不同的氨基酸取代，特别是非保守氨基酸取代。这样削弱了所述蛋白质的功能或活性，所述功能性或活性降低至0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或者0-5％。无义突变导致基因的编码区内的终止密码子，因此翻译被过早终止。在基因中插入或删除至少一个碱基对导致移码突变，结果是掺入不正确的氨基酸或者翻译过早终止。如果终止密码子是由于突变而在编码区内产生，其同样导致翻译过早终止。同样，删除至少一个或多个密码子通常导致酶活性的全部丧失。WO 03/074719描述了用合适的t-RNA阻抑物抑制编码区内终止密码子突变而降低基因表达。

产生这种突变的教导属于现有技术，可于已知的遗传学和分子生物学教科书中找到，例如Knippers(“Molekulare Genetik”,6th edition,GeorgThieme Verlag,Stuttgart,Germany,1995)、Winnacker(“Gene und Klone”,VCHVerlagsgesellschaft,Weinheim,Germany,1990)或者Hagemann(“AllgemeineGenetik”,Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1986)所著的教科书。

特别地，“弱化”和“低水平表达”是关于proP基因，是指ProP转运蛋白的活性和/或浓度通过如上述措施，降低至野生型蛋白质的活性和/或浓度，或者在ProP转运蛋白非重组的微生物或亲代菌株中蛋白质的活性和/或浓度的0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或0-5％。

根据本发明，L-氨基酸优选通过微生物过量生产。“过量生产”是指根据本发明关于L-氨基酸的生产性能大幅度增加超过微生物固有需要。

本发明的L-氨基酸优选是含硫氨基酸，特别是L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-高半胱氨酸或L-高胱氨酸，特别优选L-甲硫氨酸。

优选地，本发明的微生物及在本发明方法中应用的微生物优选地特征在于与不具有弱化的proP基因的微生物相比具有增加的甲硫氨酸耐受性。优选地，其甚至能在50或60克每升的甲硫氨酸浓度，特别优选在70、75、80、90或100克每升的甲硫氨酸浓度生长，因为其对这些甲硫氨酸浓度具有抗性。本文关于L-甲硫氨酸的耐受性数据优选基于具有相应L-甲硫氨酸浓度的基本琼脂。

这种甲硫氨酸-抗性菌株可以从已经产生L-甲硫氨酸的大肠杆菌菌株开始，通过在含有甲硫氨酸的最小琼脂上选择而分离。

本发明的甲硫氨酸-抗性菌株是优选使用本领域描述的选择方法产生的，所述方法尤其可参见Miller(A Short Course in Bacterial Genetics,ALaboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1992))或者“Manual of Methods forGeneral Bacteriology”of the American Society for Bacteriology(WashingtonD.C.,USA)。

因此，本发明的另一方面是鉴定肠杆菌科微生物的方法，去能使含硫氨基酸，优选L-甲硫氨酸以改良的方式产生，其具有弱化的proP基因，所述方法包括如下步骤：

a)筛选具有增加的甲硫氨酸耐受性的肠杆菌科微生物，其能产生含硫L-氨基酸，优选L-甲硫氨酸；

b)分离并增殖在a)中产生的突变体；

c)任选地，提供来自在b)中获得的突变体的核酸；

d)任选地，通过使用聚合酶链式反应从来自c)的核酸和引物对开始制备核酸分子，所述引物对包含第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQID NO:38的核苷酸序列的位置1-1000中的至少15个连续核苷酸，所述第二引物包含SEQ ID NO:38的序列互补序列的位置2504-3503中的至少15个连续核苷酸；

e)任选地，确定在d)中获得的核酸分子的核苷酸序列，及确定所编码的氨基酸序列；

f)任选地，将在e)中确定的氨基酸序列与SEQ ID NO:2进行比较；及

g)任选地，鉴定所获得的proP突变体。

为了在proP基因中特异性地进行突变，可以使用定点诱变方法，所述方法使用诱变的寡核苷酸(T.A.Brown:Gentechnologie für Einsteiger[orig.title:Gene Cloning and DNA Analysis-An Introduction],SpektrumAkademischer Verlag,Heidelberg,Germany,1993)或者聚合酶链式反应(PCR)，如Gait:Oligonucleotide synthesis:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,UK,1984)或Newton and Graham(PCR,Spektrum AkademischerVerlag,Heidelberg,1994)所述。为了设计突变，可以使用例如来自Stratagene(Amsterdam,Netherlands)的Quick Change Site-Directed Mutagenesis试剂盒。使用这些方法包括借助于聚合酶链式反应(PCR)从野生型菌株的分离的总DNA开始扩增现有技术中描述的proP基因，将所述基因克隆进合适的质粒载体中，然后对所述DNA进行诱变。借助于“GeneSOEing”(Gene Splicing byOverlap Extension,Horton,Molecular Biotechnology 3:93-98(1995))，甚至可以通过PCR获得点突变。核苷酸序列的从头开始的基因合成(例如通过GENEART AG,Regensburg,Germany)也可以用于在proP基因中产生突变。所产生的突变可以通过DNA测序确定和检查，例如通过Sanger等(Proceedings of the National Academy of Science USA 74(12):5463-5467,1977)的方法。

所产生的等位基因可以整合入合适菌株的染色体中，例如通过转化及基因或等位基因取代的方法。

在Hamilton等(Journal of Bacteriology 171,4617-4622(1989))中描述的习惯性的方法是借助于有条件地复制pSC101衍生物pMAK705或用pKO3的基因取代方法(Link et al.,Journal of Bacteriology 179:6228-6237)。同样可以利用现有技术中描述的其它方法，例如Martinez-Morales等(Journal ofBacteriology 1999,7143-7148(1999))或者Boyd等(Journal of Bacteriology182,842-847(2000))所述方法。

另一习惯性的方法包括借助于Lambda Red重组酶或者进行取代，通过短的同源侧翼序列将通过PCR或基因合成产生的DNA片段直接整合入染色体中(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(12),6640-6645(2000)；Nature Genetics20,123-128,1998)。

也可以通过缀合或者转导将产生的等位基因转移至各种菌株中。

proP核酸序列可见于美国国家生物技术信息中心(NCBI)、美国国家医学图书馆(Bethesda,MD,USA)的数据库，欧洲分子生物学实验室(EMBL,Heidelberg,Germany和Cambridge,UK)的核苷酸序列数据库或者日本DNA数据库(DDBJ,Mishima,Japan)。

出于例证的目的，大肠杆菌proP基因的已知序列以SEQ ID NO:1示出，同属于肠杆菌科的肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)和宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)的proP基因的已知序列以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5示出。由这些读框编码的蛋白质以SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:6示出。proP基因的其它核苷酸序列在例如下列肠杆菌中发现：鲍氏志贺菌(Shigella boydii，Accession NO:NC_007613)、弗氏志贺菌(Shigellaflexneri，Accession NO:NC_004741)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae，Accession NO:NC_007606)、柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium，AccessionNO:NC_013716)、Erwinia pyrifoliae(Accession NO:NC_012214)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae，Accession NO:NC_011283)。

由大肠杆菌K12proP基因编码的蛋白质也称作渗透感受性MFS转运蛋白ProP或者称作质子/相容性溶质同向转运蛋白(Accession NO:11612(Region:4328525-4330027)；另外的基因名称:b4111,ECK4104)；Grothe et al.,Journal of Bacteriology 166,253-259(1986)；Racher et al.,Biochemistry 38,1676-1684(1999)；Wood,Methods in Enzymology 428,77-107(2007))。

在本发明优选的实施方案中，待弱化的proP基因是与SEQ ID NO:1、3、5或7的完整多核苷酸序列，特别优选是与SEQ ID NO:1的完整多核苷酸序列具有至少80％、优选至少90％、特别是至少95％、尤其是至少98％、99％或100％序列相同性的基因。

关于proP基因及所述proP基因的开放读框的参考文献已经在上文示出。这些参考可以根据本发明以适当方式使用，以弱化proP基因。此外，由于遗传密码简并或者功能性中性有义突变而获得的所述基因的等位基因或开放读框也可用于制备弱化的proP基因。优选使用内源性基因或内源性开放读框。

含有功能性中性有义突变的proP基因的等位基因包括导致在其编码的蛋白质中不超过40个或不超过30个或不超过20个、优选不超过10个或不超过5个、特别优选不超过3个或不超过2个、或者恰好是1个保守氨基酸取代的那些等位基因。

在芳香族氨基酸的情况中，保守取代是其中苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸彼此取代的那些取代。在疏水性氨基酸的情况中，保守取代是其中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸彼此取代。在极性氨基酸的情况中，保守取代是其中谷氨酰胺和天冬酰胺彼此取代。在碱性氨基酸的情况中，保守取代是其中精氨酸、赖氨酸和组氨酸彼此取代。在酸性氨基酸的情况中，保守取代是其中天冬氨酸和谷氨酸彼此取代。在含有羟基基团的氨基酸的情况中，保守取代是其中丝氨酸和苏氨酸彼此取代。

相似地，也可以使用编码所提及的蛋白质的变体的那些核苷酸序列，所述变体另外含有在N或C末端的延伸或截短至少一个氨基酸。所述延伸或截短不超过10、5、3或2个氨基酸或氨基酸残基。

合适的变体还包括编码其中已经插入(插入)或除去(删除)至少一个氨基酸的蛋白质的那些变体。这种称作插入缺失的修饰的最大数目可以影响2、3、5但是不超过10个氨基酸。

合适的变体也包括通过杂交，特别是在严格条件下使用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或其部分，特别是编码区和/或与其互补的序列杂交可获得的那些变体。

本领域技术人员可在“The DIG System User’s Guide for FilterHybridization”from Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim,Germany,1993)及在Liebl等(International Journal of Systematic Bacteriology 41:255-260(1991))中找到关于通过杂交鉴定DNA序列的指导。杂交在严格条件下发生，即仅形成这样的杂交体，其中探针和靶序列(即用所述探针处理的多核苷酸)是至少70％相同的。已知杂交、包括洗涤步骤的严格性受缓冲液成分、温度和盐浓度的变化的影响或由其确定。杂交反应通常以与洗涤步骤相比相对低的严格性进行(Hybaid Hybridisation Guide,Hybaid Limited,Teddington,UK,1996)。

例如，可以应用5×SSC缓冲液、温度为大约50℃-68℃以进行杂交反应。在此，探针也可以与和该探针序列低于70％相同性的多核苷酸杂交。这种杂交体较不稳定，并通过在严格条件下洗涤除去。这可以通过例如降低盐浓度至2×SSC及在适当时随后用0.5×SSC而实现(The DIG SystemUser’s Guide for Filter Hybridisation,Boehringer Mannheim,Mannheim,Germany,1995)，温度设置为大约50℃-68℃、大约52℃-68℃、大约54℃-68℃、大约56℃-68℃、大约58℃-68℃、大约60℃-68℃、大约62℃-68℃、大约64℃-68℃、大约66℃-68℃。优选温度范围为大约64℃-68℃或者大约66℃-68℃。任选可以降低盐浓度至对应于0.2×SSC或0.1×SSC的浓度。通过以大约1-2℃梯度将杂交温度从50℃逐步增加至68℃，可以分离与应用的探针的序列或者SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:5所示核苷酸序列例如至少70％或至少80％或至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的多核苷酸片段。关于杂交的进一步指导可以“试剂盒”形式在市场上获得(例如DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany,Catalogue No.1603558)。

待弱化的proP基因编码ProP转运蛋白，所述ProP转运蛋白优选具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示氨基酸序列、优选与SEQ ID NO:2序列具有至少85％、特别是至少90％、优选至少95％、特别优选至少98％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列，所述相同性优选是在所述序列全长的相同性。优选地，ProP转运蛋白包含或具有基本为500个氨基酸的长度，优选500个氨基酸的长度。特别优选地，ProP蛋白包含或具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，该序列可任选包括不超过40个、30个、优选不超过20个、10个、5个、3个、2个、特别优选不超过一个保守氨基酸取代。所述保守氨基酸取代基本上不改变ProP转运蛋白的活性，即根据本发明，优选地，基于起始序列，所述活性通过所述保守氨基酸取代的改变不超过10％。

在这一点上，术语“基本为500个氨基酸的长度”是考虑到这样的事实，即在所述多肽内或者在所述多肽的N或C末端插入或删除一或多个，不超过10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸，导致在肠杆菌科的不同种或菌株中所编码的多肽的长度的轻微变化。一个实例是Erwinia pyrifoliae ProP蛋白。在这种情况中，多肽(见SEQ ID No:8)的长度为501个氨基酸。

在本发明优选的实施方案中，SEQ ID NO:1的proP基因的弱化通过具有如下任何突变的基因实现：

a)SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的位置971或相当的位置的核碱基鸟嘌呤由核碱基胸腺嘧啶取代；

b)SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的位置1399或相当的位置的核碱基胸腺嘧啶由核碱基胞嘧啶取代；

c)SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的位置1234或相当的位置的核碱基鸟嘌呤由核碱基胸腺嘧啶取代；

d)删除SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的位置854的核碱基腺嘌呤；

e)删除SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的位置1173-1223的一或多个核碱基，优选删除在所述位置1173-1223的所有核碱基；

f)在SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的位置842插入核碱基胞嘧啶；

g)在SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的位置973插入一或多个核碱基，优选在位置973插入19个核碱基；

h)在SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的位置183插入一或多个核碱基，优选在位置183插入1359个核碱基。

因此，在本发明优选的实施方案中，弱化的proP基因是与SEQ ID NO:1所示多核苷酸，优选与SEQ ID NO:1多核苷酸的完整序列具有至少80％、优选至少90％、特别是至少95％、特别优选至少98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸，及所述多核苷酸在SEQ ID NO:1的多核苷酸上必须进一步具有一或多个，特别优选一个如下突变：

a)编码SEQ ID NO:2的位置324或氨基酸序列相当的位置的L-精氨酸的三联体由编码选自L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸的氨基酸的三联体取代，所述氨基酸优选L-亮氨酸；

b)编码SEQ ID NO:2的位置467或氨基酸序列相当的位置的L-酪氨酸的三联体由编码选自L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸的氨基酸的三联体取代，所述氨基酸优选L-组氨酸；

c)编码SEQ ID NO:2的位置412或氨基酸序列相当的位置的L-谷氨酸的三联体由编码终止密码子的三联体取代；

d)删除SEQ ID NO:1的proP基因的位置854的核碱基腺嘌呤；

e)删除SEQ ID NO:1的proP基因的位置1173-1223的一或多个核碱基，或者删除所述位置1173-1223的所有核碱基；

f)在SEQ ID NO:1的proP基因的位置842插入核碱基；

g)在SEQ ID NO:1的proP基因的位置973插入一或多个核碱基，优选在位置973插入19个核碱基；

h)在SEQ ID NO:1的proP基因的位置183插入一或多个核碱基，优选在位置183插入1359个核碱基。

在每种情况中，本文基于SEQ ID NO:1的多核苷酸所述的相同性涉及不具有上述一或多个必需的突变的多核苷酸序列。.

“相当的位置”可以通过比对来比较氨基酸序列而鉴定，例如借助于Clustal W程序(Thompson et al.,Nucleic Acids Research 22,4637-4680(1994))或者借助于MAFFT程序(Katoh et al.,Genome Information 2005；16(1),22-33)。

本发明的及用于本发明方法中的肠杆菌科微生物优选是埃希式杆菌属、欧文氏菌属、普罗维登杆菌属或沙雷氏菌属的细菌，特别是埃希式杆菌属的细菌。特别优选大肠杆菌(Escherichia coli)。

在本发明的产生L-氨基酸，特别是含硫L-氨基酸的方法中，发酵优选在含有无机硫源的培养基中进行。例如，可以使用的硫源是二硫代硫酸盐(硫代硫酸盐)，，如果需要，与其它硫源如硫酸盐、亚硫酸盐或连二亚硫酸盐一起使用(也见EP专利申请11151526.8)。

L-氨基酸优选在获得的发酵液体培养基中积聚，然后，如果需要，分离、收集和/或纯化。

L-氨基酸也可以与来自发酵液体培养基和/或生物量的成分一起分离或收集。

关于一或多个参数，分离的细菌或者使用所述分离的细菌的发酵方法的产出基于起始菌株或亲代菌株或者使用这些菌株的发酵过程优选改进至少0.5％、至少1％、至少1.5％或至少2％，所述参数选自产物浓度(产物/体积)、产物产率(形成的产物/消耗的碳源)及产物形成(形成的产物/体积和时间)，或者其它参数及其组合。

在本发明的方法中，细菌可以连续培养-如在例如PCT/EP2004/008882中所述，或者以分批方法(分批培养)或以补料分批方法或者重复补料分批方法不连续地培养，以生产L-氨基酸。关于已知培养方法的一般性概述可见于Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或者Storhas(Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen(Vieweg Verlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))所著教科书。

使用的培养基或发酵培养基必须以合适方式满足特定菌株的需要。关于各种微生物的培养基的描述包括在Manual of Methods for GeneralBacteriology of the American Society for Bacteriology(Washington D.C.,USA,1981)中。术语培养基与发酵培养基或培养基可互换使用。

可以使用的碳源是糖及碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、来自甜菜或甘蔗加工的含蔗糖溶液、淀粉、淀粉水解产物和纤维素，油和脂肪如大豆油、葵花油、落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇如甘油、甲醇和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。

可使用的氮源是含氮的有机化合物如胨、酵母提取物、肉膏、麦芽提取物、玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。

可使用的磷源是磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应的钠盐。

此外，优选地，培养基含有生长必需的金属盐，如氯化物形式，例如钠、钾、镁、钙和铁，如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用必需的生长因子如氨基酸例如高丝氨酸，和维生素如钴胺素、硫胺素、生物素或泛酸。

此外，可将特定氨基酸的适当前体加入培养基中。

所述起始物质可以单批形式加入培养基中或在培养期间以适当方式补加。

可以用适当方式采用碱性化合物如NaOH、KOH、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸控制培养物的pH值，。pH通常被调节为6.0-9.0，优选6.5-8。为了控制泡沫产生，可以使用止泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了保持质粒的稳定性，可以在培养基中加入适当的选择性作用物质例如抗生素。可将氧气或含氧混合气，例如空气，导入培养物中以保持有氧条件。也可以使用富集过氧化氢的液体。，如果需要，在升高的压力进行发酵，例如在0.03-0.2Mpa的压力。培养温度通常在20℃-45℃，优选25℃-40℃。在分批方法中，持续培养直至形成希望的产物的最大量。这个目标通常在10-160小时内达到。在持续方法中，可以进行更长的培养时间。

合适的发酵培养基尤其在US 6,221,636、US 5,840,551、US 5,770,409、US 5,605,818、US 5,275,940和US 4,224,409中描述。

确定L-氨基酸的方法已在现有技术中公开。例如，所述分析可以如Spackman等(Analytical Chemistry，30，(1958)，1190)所述通过阴离子交换层析及随后的茚三酮衍生化进行，或者可以通过反向HPLC进行，如Lindroth等(Analytical Chemistry(1979)51:1167-1174)所述。

优选地，随后，将以此方式产生的发酵液体培养基加工为固体或液体产物。

发酵液体培养基是指发酵培养基，在其中将微生物在一定温度培养一定时间。发酵培养基或在发酵期间使用的培养基优选包括保证所述微生物增殖和希望的氨基酸形成的任何物质或成分。

在完成发酵时，所得发酵液体培养基包含：a)微生物生物量，由于所述微生物的细胞增殖而形成，b)在发酵期间形成的希望的氨基酸，c)在发酵期间形成的有机副产物，及d)应用的一或多种发酵培养基或者起始物质的成分，例如维生素如生物素，氨基酸如高丝氨酸或者盐如硫酸镁，所述成分在所述发酵期间未被消耗。

所述有机副产物包括由在发酵中所应用的微生物产生的除了特定希望的L-氨基酸之外物质，并且所述物质是可以分泌的。其包括与希望的氨基酸相比，还不到30％、20％或10％的L-氨基酸。此外，其包括具有1-3个羧基基团的有机酸，如乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸或反丁烯二酸。最后，其也包括糖如海藻糖。

适于工业目的及根据本发明优选的典型的发酵液体培养基的氨基酸含量为40g/kg-180g/kg或者50g/kg-150g/kg。生物量含量(干重)通常为20-50g/kg。

因此，本发明还涉及与SEQ ID NO:1的序列具有至少80％、优选至少90％、特别是至少95％、尤其是至少98％、99％或100％相同性的多核苷酸，所述相同性优选关于SEQ ID NO:1的全部序列，特征在于该多核苷酸与SEQ ID NO:1的多核苷酸相比必须具有的一或多个突变，所述突变选自：

d)删除SEQ ID NO:1的proP基因的位置854的核碱基腺嘌呤；

e)删除SEQ ID NO:1的proP基因的位置1173-1223的一或多个核碱基，优选删除位置1173-1223的所有核碱基；

f)在SEQ ID NO:1的proP基因的位置842插入核碱基胞嘧啶；

g)在SEQ ID NO:1的proP基因的位置973插入一或多个核碱基；

本文在每种情况中基于SEQ ID NO:1的多核苷酸的相同性是关于没有上述一或多个必需的突变的多核苷酸序列。

特别优选的是选自如下的一或多个必需的突变：

d)删除SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的位置854的核碱基腺嘌呤；

e)删除SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列的位置1173-1223的一或多个核碱基，优选删除位置1173-1223的所有核碱基；

f)在SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的位置842的核碱基胞嘧啶插入；

根据本发明，优选地，上述多核苷酸特征在于与一或多个与SEQ ID NO:1、3或5互补，优选与SEQ ID NO:1互补的多核苷酸杂交，优选在严格杂交条件下杂交，所述严格杂交条件优选是通过洗涤步骤获得，所述洗涤步骤中，温度为64℃-68℃，缓冲液盐浓度为2×SSC-0.1×SSC。

本发明特别优选的多核苷酸与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的多核苷酸具有至少90％、优选至少95％、特别优选至少98％、99％或100％的序列相同性。

本发明非常特别优选的多核苷酸是和/或包含SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23的多核苷酸。

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的载体。

因此，本发明还涉及与SEQ ID NO:2所示序列具有至少80％、优选至少90％、特别是至少95％、尤其是至少98％、99％或100％相同性的多肽，特征在于所述多肽与SEQ ID NO:2的多肽相比必须具有的一或多个突变，所述突变选自：

a.SEQ ID NO:2的位置324或氨基酸序列的相当的位置的L-精氨酸由选自L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸的氨基酸取代，所述氨基酸优选L-亮氨酸；

b.SEQ ID NO:2的位置467或者氨基酸序列的相当的位置的L-酪氨酸由选自L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸的氨基酸取代，所述氨基酸优选L-组氨酸；

c.删除SEQ ID NO:2的位置392-408或氨基酸序列的相当的位置的17个氨基酸；

d.删除SEQ ID NO:2的序列C末端至多420个氨基酸，优选删除SEQID NO:2的氨基酸序列的C末端88、163、202、212或420个氨基酸。

对于a和b的突变体，本文所述相同性是与SEQ ID NO:2的全部序列相关，在每种情况中对于c和d的突变体，是与SEQ ID NO:2序列的无指定删除的区域的亚区相关。

本发明优选的多肽是与SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、22或24具有至少90％、优选至少95％、特别是至少98％、99％或100％序列相同性的多肽。

本发明特别优选的多肽是和/或包含SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、22或24的多肽。

本发明还涉及具有本发明的多核苷酸和/或载体和/或多肽的重组微生物。

本发明的微生物和本发明方法中应用的微生物优选具有增强的天冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4)活性，优选具有反馈抗性的等位基因。大肠杆菌具有由thrA、metL或lysC基因编码的三个不同的天冬氨酸激酶。根据本发明特别优选的是存在增强的ThrA天冬氨酸激酶活性。

此外，优选地，本发明的微生物及本发明方法中使用的微生物特征在于具有增强的MetA高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(EC 2.3.1.46)和/或CysE丝氨酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.30)的活性。

此外，通过弱化或删除由metJ基因编码的MetJ调节蛋白可增加L-甲硫氨酸生物合成。MetJ是大肠杆菌中L-甲硫氨酸生物合成的主要阻抑物。因此，本发明进一步优选metJ基因被弱化。

此外，优选地，本发明的微生物及本发明方法中应用的微生物特征在于降低的MetK S-腺苷甲硫氨酸合酶(EC 2.5.1.6)活性。

此外，使用肠杆菌科细菌对生产含硫氨基酸有利于额外增强已知的氨基酸生物合成途径的一或多种酶或者回补代谢的酶或者产生还原型磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的酶或者糖酵解的酶或者PTS酶或者硫代谢的酶或者增加其活性。

在进一步优选的实施方案中，生产L-甲硫氨酸的细菌具有选自如下的一或多种特征：

a)过表达编码CysPUWA硫代硫酸盐/硫酸盐转运系统(EC 3.6.3.25)的一或多种成分的多核苷酸，

b)过表达编码CysH 3’-磷酸腺苷5’-磷酸硫酸酐还原酶(EC 1.8.4.8)的多核苷酸，

c)过表达编码CysJI亚硫酸盐还原酶(EC 1.8.1.2)的一或多种成分的多核苷酸，

d)过表达编码CysK半胱氨酸合酶A(EC 2.5.1.47)的多核苷酸，

e)过表达编码CysM半胱氨酸合酶B(EC 2.5.1.47)的多核苷酸，

f)过表达编码CysE丝氨酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.30)的多核苷酸，

g)过表达编码GcvTHP-Lpd甘氨酸裂解系统(EC 2.1.2.10、EC 1.4.4.2、EC 1.8.1.4)的一或多种成分的多核苷酸，

h)过表达编码LipA硫辛酰合酶(EC 2.8.1.8)的多核苷酸，

i)过表达编码LipB硫辛酰-蛋白质连接酶(EC 2.3.1.181)的多核苷酸，

j)过表达编码SerA磷酸甘油酸脱氢酶(EC 1.1.1.95)的多核苷酸，

k)过表达编码SerB 3-磷酸丝氨酸磷酸酶(EC 3.1.3.3)的多核苷酸，

l)过表达编码SerC 3-磷酸丝氨酸/磷酸羟基苏氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.52)的多核苷酸，

m)过表达编码GlyA丝氨酸羟甲基转移酶(EC 2.1.2.1)的多核苷酸，

n)过表达编码ThrA天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I(EC 2.7.2.4、EC1.1.1.3)的多核苷酸，

o)过表达编码LysC天冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4)的多核苷酸，

p)过表达编码Hom高丝氨酸脱氢酶(EC 1.1.1.3)的多核苷酸，

q)过表达编码MetX高丝氨酸O-乙酰转移酶(EC 2.3.1.31)的多核苷酸，

r)过表达编码MetA高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(EC 2.3.1.46)的多核苷酸，

s)过表达编码MetB胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)的多核苷酸，

t)过表达编码AecDβ-C-S-裂解酶(EC 4.4.1.8，也称作β-裂解酶)的多核苷酸，

u)过表达编码MetC胱硫醚β-裂解酶(EC 4.4.1.8)的多核苷酸，

v)过表达编码MetE B12-非依赖性高半胱氨酸S-甲基转移酶(EC2.1.1.14)的多核苷酸，

w)过表达编码MetH B12-依赖性高半胱氨酸S-甲基转移酶(EC2.1.1.13)的多核苷酸，

x)过表达编码MetF亚甲基四氢叶酸还原酶(EC 1.5.1.20)的多核苷酸，

y)过表达编码谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)BrnFE L-甲硫氨酸输出蛋白的一或多种成分的多核苷酸，

z)过表达大肠杆菌YgaZH缬氨酸输出蛋白(b2682、b2683)的一或多种成分的多核苷酸，

aa)过表达编码假定的大肠杆菌YjeH转运蛋白(b4141)的多核苷酸，

bb)过表达编码PntAB吡啶核苷酸转氢酶(EC 1.6.1.2)的一或多种成分的多核苷酸，

cc)过表达编码MetZ O-琥珀酰高丝氨酸巯基化酶(Sulfhydrylase)(EC2.5.1.48)的多核苷酸，

dd)过表达编码Pyc磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(EC 4.1.1.31)的多核苷酸，

ee)过表达编码RDL2硫代硫酸盐硫转移酶(EC 2.8.1.1)的多核苷酸，

ff)过表达编码硫代硫酸盐-硫醇硫转移酶(EC 2.8.1.3)的多核苷酸，

gg)过表达编码硫代硫酸盐-二硫醇硫转移酶(EC 2.8.1.5)的多核苷酸。

优选的特征是选自如下的一或多种特征：

d)过表达编码CysK半胱氨酸合酶A(EC 2.5.1.47)的多核苷酸，

e)过表达编码CysM半胱氨酸合酶B(EC 2.5.1.47)的多核苷酸，

f)过表达编码CysE丝氨酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.30)的多核苷酸，

h)过表达编码LipA硫辛酰合酶(EC 2.8.1.8)的多核苷酸，

j)过表达编码SerA磷酸甘油酸脱氢酶(EC 1.1.1.95)的多核苷酸，

k)过表达编码SerB 3-磷酸丝氨酸磷酸酶(EC 3.1.3.3)的多核苷酸，

m)过表达编码GlyA丝氨酸羟甲基转移酶(EC 2.1.2.1)的多核苷酸，

n)过表达编码ThrA天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I(EC 2.7.2.4,EC 1.1.1.3)的多核苷酸，

o)过表达编码LysC天冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4)的多核苷酸，

p)过表达编码Hom高丝氨酸脱氢酶(EC 1.1.1.3)的多核苷酸，

q)过表达编码MetX高丝氨酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.31)的多核苷酸，

r)过表达编码MetA高丝氨酸O-转琥珀酰酶(EC 2.3.1.46)的多核苷酸，

s)过表达编码MetB胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)的多核苷酸，

u)过表达编码MetC胱硫醚β-裂解酶(EC 4.4.1.8)的多核苷酸，

w)过表达编码MetH B12-依赖性高半胱氨酸S-甲基转移酶(EC 2.1.1.13)的多核苷酸，

y)过表达编码RDL2硫代硫酸盐硫转移酶(EC 2.8.1.1)的多核苷酸。

非常特别优选的特征选自：

a)过表达编码ThrA天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I(EC 2.7.2.4、EC 1.1.1.3)的多核苷酸，

b)过表达编码CysE丝氨酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.30)的多核苷酸，

c)过表达编码LysC天冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4)的多核苷酸，

d)过表达编码Hom高丝氨酸脱氢酶(EC 1.1.1.3)的多核苷酸，

e)过表达编码MetX高丝氨酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.31)的多核苷酸，

f)过表达编码MetA高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(EC 2.3.1.46)的多核苷酸，

g)过表达编码MetB胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)的多核苷酸，

h)过表达编码AecDβ-C-S-裂解酶(EC 4.4.1.8，也称作β-裂解酶)的多核苷酸，

i)过表达编码MetC胱硫醚β-裂解酶(EC 4.4.1.8)的多核苷酸，

j)过表达编码MetE B12-非依赖性高半胱氨酸S-甲基转移酶(EC 2.1.1.14)的多核苷酸，

k)过表达编码MetH B12-依赖性高半胱氨酸S-甲基转移酶(EC 2.1.1.13)的多核苷酸，

l)过表达编码MetF亚甲基四氢叶酸还原酶(EC 1.5.1.20)的多核苷酸，

m)过表达编码RDL2硫代硫酸盐硫转移酶(EC 2.8.1.1)的多核苷酸。

根据本发明，术语“过表达”、“增强”或“增加的活性”描述了微生物中一或多种由相应DNA编码的酶的胞内酶活性增加。

原则上，酶活性可以通过例如增加编码所述酶的一或多种基因序列的拷贝数、使用强启动子或者使用编码具有增加的活性的相应酶的基因或等位基因及这些措施的适当组合而增加。例如，本发明遗传修饰的细胞是用包含希望的基因、所述基因的等位基因或其部分的载体及使得所述基因能够表达的载体，通过转化、转导、缀合或者这些方法的组合产生的。具体而言，通过将基因或等位基因整合进细胞染色体或者在染色体外复制的载体中实现异源表达。

在DE-A-100 31 999中以丙酮酸羧化酶为例给出了增加细胞中酶活性的可能性的概述，将其以引用形式并入本文，其关于增加细胞中酶活性的可能性的公开内容是本发明公开内容的一部分。

酶活性增加可以通过例如使相应多核苷酸的拷贝数在染色体或染色体外增加至少一个拷贝而实现。

增加拷贝数的一种广泛使用的方法包括将相应多核苷酸整合入通过细菌复制的载体中，优选整合入质粒中。

可以用于肠杆菌科的合适质粒载体的例子是衍生自pACYC184的克隆载体(Bartolomé et al.；Gene 102:75-78(1991))、pTrc99A(Amann et al.；Gene69:301-315(1988))或者pSC101衍生物(Vocke and Bastia；Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 80(21):6557-6561(1983))。衍生自pCL1920(Lerner,C.G.and Inouye,M.,Nucl.Acids Res.(1990)18:4631[PMID:2201955])的质粒也是特别合适的。衍生自细菌人工染色体(BAC)的质粒载体如pCC1BAC(EPICENTRE Biotechnologies,Madison,USA)同样适于增加大肠杆菌中相应多核苷酸的拷贝数。

此外，转座子、插入元件(IS元件)或噬菌体可以用作载体。这种遗传系统在例如专利说明书US 4,822,738、US 5,804,414和US 5,804,414中描述。在WO 92/02627中描述的IS元件ISaB1或质粒pXZ10142的Tn 45转座子(见“Handbook of Corynebacterium glutamicum”(editors:L.Eggeling and M.Bott))可以相同方式使用。

实现过表达的另一广泛使用的方法是染色体基因扩增方法。在这种方法中，将感兴趣的多核苷酸的至少一个额外的拷贝插入细菌染色体中。这种扩增方法在例如WO 03/014330或WO 03/040373中描述。

另外一种实现过表达的方法包括将各个基因或等位基因以功能性方式与启动子或表达盒连接(可操纵地连接)。大肠杆菌的合适启动子的已知例子是启动子T3、T7、SP6、M13、lac、tac和trc，由Amann等(Gene 69(2),301-315(1988))以及Amann和Brosius(Gene 40(2-3),183-190(1985))描述。例如，这种启动子可插入在所述基因的上游，通常与起始密码子距离大约1-500个核碱基。US 5,939,307报道了将表达盒或启动子如tac启动子、trp启动子、lpp启动子或噬菌体λPL和PR启动子整合入染色体苏氨酸操纵子的上游，能实现表达增加。可以相同方式使用噬菌体T7启动子、变速箱启动子(gear-box-Promotoren)、nar启动子或者基因rrsG、rnpB、csrA、csrB、ompA、fusA、pepQ、rplX或rpsG的启动子。这种表达盒或启动子也可以用于过表达质粒结合的基因，如EP 0593792所述。通过使用lacIQ等位基因，转而可以控制质粒结合的基因的表达(Glascock and Weickert,Gene 223,221-231(1998))。此外，启动子活性增加可能是由于其序列的修饰，所述修饰通过一或多个核苷酸取代，通过插入和/或删除进行。

如果酶活性增加是由内源基因的突变所致，这种突变可以通过常规方法以非靶向方式产生，例如通过UV照射，或者通过诱导突变的化学物，或者以靶向方式通过遗传工程方法如删除、插入和/或核苷酸取代方法产生。所述突变产生遗传修饰的细胞。特别优选的突变的酶尤其是可以不再被反馈抑制的或者与野生型酶相比至少具有降低的反馈抑制作用的那些酶。

如果酶活性增加是由于酶的表达增加所致，例如，增加相应基因的拷贝数，或者突变位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点。整合入结构基因上游的表达盒以相同方式作用。可诱导的启动子另外使得表达在任何时间增加。此外，所谓的“增强子”也可以分配给基因作为调节序列，其通过改良的RNA聚合酶与DNA之间的相互作用同样导致增加的基因表达。延长mRNA寿命的措施同样改良表达。此外，酶活性也通过防止酶蛋白降解而增强。在本发明中，所述基因或基因构建体存在于具有不同拷贝数的质粒中或者整合在染色体中并扩增。或者，所述基因的过表达可进一步通过调整培养基成分和培养程序而实现。本领域技术人员可以在Martin等(Bio/Technology 5,137-146(1987))、Guerrero等(Gene 138,35-41(1994))、Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6,428-430(1988))、Eikmanns等(Gene 102,93-98(1991))、EP-A-0472869、US 4,601,893、Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9,84-87(1991))、Reinscheid等(Applied andEnvironmental Microbiology 60,126-132(1994))、LaBarre等(Journal ofBacteriology 175,1001-1007(1993))、WO-A-96/15246、Malumbres等(Gene134,15-24(1993))、JP-A-10-229891、Jensen和Hammer(Biotechnology andBioengineering 58,191-195(1998))及已知的遗传学和分子生物学教科书中找到关于这方面的指导。上述措施与突变一样产生遗传修饰的细胞。

此外，那些有助于通过整合进染色体中进行基因扩增的方法使其可以可以应用的载体也是适合的。在通过杂交事件同源重组之后，所得菌株含有所述基因的至少两个拷贝。在例如Link,A.J.,Phillips,D.and Church,G.M.(1997),J.Bacteriology 179:6228-6237中描述了一种用于大肠杆菌的方法。

也可以使用重组酶介导的方法，例如，如Datsenko KA,Wanner BL.,2000,Proc Natl Acad Sci USA.,97(12):6640-5所述，在染色体中插入或删除DNA。

优选地，上文和在下文说明中使用的用语“与其野生型菌株或起始菌株相比增加的酶活性”总是指特定酶的活性，其已经增加至少2倍、特别优选至少10倍，额外优选100倍，额外更加优选1000倍及最优选至少10000倍。此外，特别地，具有“与其野生型或起始菌株相比增加的酶活性”的本发明的细胞还包括这样的细胞，其野生型或起始菌株没有所述酶活性或者至少没有可检测的所述酶活性，其仅在通过例如过表达而增加酶活性后才显示可检测的这种酶的活性。在这一点上，在如下说明中使用的术语“过表达”或者“增加表达”还包括这样的情况，其中起始细胞如野生型细胞不具有表达或者至少不具有可检测的表达，所述酶的可检测表达只通过重组方法被诱导。

确定各种酶的酶活性的方法可以在文献中找到。

上述酶或基因的表达可以借助于一维和二维蛋白质凝胶分级分离及随后使用合适的评估软件光学鉴定凝胶中蛋白质浓度进行检测。如果酶活性仅仅基于相应基因的表达，可以通过对比野生型和遗传修饰的细胞的一维或二维蛋白质分级分离以简便的方式定量酶活性的增加。就细菌来说，制备蛋白质凝胶及鉴定蛋白质的常规方法由Hermann等(Electrophoresis,22:1712.23(2001))描述。蛋白质浓度也可以用特异于待检测的蛋白质的抗体通过Western印迹杂交(Sambrook et al.,Molecular Cloning:a laboratory manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY USA,1989)及随后使用合适的浓度测量软件光学评估(Lohaus and Meyer(1989)Biospektrum,5:32-39；Lottspeich(1999),Angewandte Chemie 111:2630-2647)进行分析。DNA结合蛋白的活性可以通过DNA带位移测定(也称作凝胶阻滞法)测量(Wilson et al.(2001)Journal of Bacteriology,183:2151-2155)。DNA结合蛋白对于其它基因表达的作用可以通过各种充分描述的报道基因测定方法检测(Sambrook et al.,Molecular Cloning:a laboratory manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY USA,1989)。细胞内酶活性可以通过已经描述的各种方法确定(Donahue et al.(2000)Journalof Bacteriology 182(19):5624-5627；Ray et al.(2000)Journal of Bacteriology182(8):2277-2284；Freedberg et al.(1973)Journal of Bacteriology 115(3):816-823)。如果在下文的说明中未指定确定特定酶的活性的具体方法，则酶活性的增加及酶活性的降低优选通过Hermann et al.,Electophoresis,22:1712-23(2001),Lohaus et al.,Biospektrum 532-39(1998)、Lottspeich,Angewandte Chemie 111:2630-2647(1999)和Wilson et al.,Journal ofBacteriology 183:2151-2155(2001)中所述的方法确定。

此外，对于L-氨基酸，特别是L-甲硫氨酸的生产，有利的是消除不希望的副反应(Nakayama:“Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms“,in:Overproduction of Microbial Products,Krumphanzl,Sikyta,Vanek(eds.),Academic Press,London,UK,1982)。

因此，为了改良在大肠杆菌中L-甲硫氨酸的生产，有利的是弱化，任选地，关闭选自如下的一或多个基因，或者降低其表达：

a)编码L-甲硫氨酸生物合成的转录调节子(MetJ)的metJ基因(b3938,ECK3930)，

b)编码葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi,EC No.5.3.1.9)的pgi基因(b4025,ECK4017)，

c)编码高丝氨酸激酶(ThrB,EC 2.7.1.39)的thrB基因(b0003,ECK0003)，

d)编码S-腺苷甲硫氨酸合酶(MetK,EC No.2.5.1.6)的metK基因(b2942,ECK2937)，

e)编码二氢吡啶二羧酸合酶(DapA,EC No.4.2.1.52)的dapA基因(b2478,ECK2474)，

f)编码磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(Pck,EC No.4.1.1.49)的pck基因(b3403,ECK3390)，

g)编码甲酰四氢叶酸水解酶(PurU,EC No.3.5.1.10)的purU基因(b1232,ECK1227)，

h)编码丙酮酸激酶II(PykA,EC No.2.7.1.40)的pykA基因(b1854,ECK1855)，

i)编码丙酮酸激酶I(PykF,EC 2.7.1.40)的pykF基因(b1676,ECK1672)，

j)编码L-甲硫氨酸转运蛋白亚基(MetQNI)的metQ基因(b0197,ECK0197)，

k)编码L-甲硫氨酸转运蛋白亚基(MetQNI)的metI基因(b0198,ECK0198)，

l)编码L-甲硫氨酸转运蛋白亚基(MetQNI)的metN基因(b0199,ECK0199)，

m)编码脱氧胞苷-5’三磷酸脱氨酶(Dcd,EC No.3.5.4.13)的dcd基因(b2065,ECK2059)，

n)编码推定的N-乙酰转移酶(YncA,Metabolic ExplorerWO2010/020681)的yncA基因(b1448,ECK1442)，

o)编码FnrS调节性sRNA的fnrS基因(b4699,ECK4511)，

p)编码RpoSσ因子的rpoS基因(b2741,ECK2736)。

特别优选的特征选自：

a)编码L-甲硫氨酸生物合成转录调节因子(MetJ)的metJ基因(b3938,ECK3930)，

b)编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MetK,EC No.2.5.1.6)的metK基因(b2942,ECK2937)，

c)编码磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(Pck,EC No.4.1.1.49)的pck基因(b3403,ECK3390)，

d)编码甲酰四氢叶酸水解酶(PurU,EC No.3.5.1.10)的purU基因(b1232,ECK1227)，

e)编码丙酮酸激酶II(PykA,EC No.2.7.1.40)的pykA基因(b1854,ECK1855)，

f)编码丙酮酸激酶I(PykF,EC 2.7.1.40)的pykF基因(b1676,ECK1672)，

g)编码L-甲硫氨酸转运蛋白亚基(MetQNI)的metQ基因(b0197,ECK0197)，

h)编码L-甲硫氨酸转运蛋白亚基(MetQNI)的metI基因(b0198,ECK0198)，

i)编码L-甲硫氨酸转运蛋白亚基(MetQNI)的metN基因(b0199,ECK0199)，

j)编码推定的N-酰基转移酶(YncA,Metabolic ExplorerWO2010/020681)的yncA基因(b1448,ECK1442)，

k)编码RpoSσ因子的rpoS基因(b2741,ECK2736)。

非常特别优选的特征选自：

c)编码L-甲硫氨酸转运蛋白亚基(MetQNI)的metQ基因(b0197,ECK0197)，

d)编码L-甲硫氨酸转运蛋白亚基(MetQNI)的metI基因(b0198,ECK0198)，

e)编码L-甲硫氨酸转运蛋白亚基(MetQNI)的metN基因(b0199,ECK0199)，

f)编码推定的N-酰基转移酶(YncA,Metabolic ExplorerWO2010/020681)的yncA基因(b1448,ECK1442)，

g)编码RpoSσ因子的rpoS基因(b2741,ECK2736)。

在适当情况中，除了所述增强基因以增加甲硫氨酸生产的措施，或者，如果需要，与所述措施组合，执行弱化措施。

根据本发明，在本发明的措施之前产生L-氨基酸的微生物不包括野生型菌株及经常使用的实验室菌株，尤其是例如DH5α、DH5αmcr、W3110、MG1655、MC4100、Y1089、H560、BL21和MM152。

然而，产生L-氨基酸的微生物可以衍生自所述野生型菌株及经常使用的实验室菌株。

因此，微生物起始菌株优选衍生自大肠杆菌MG1655、大肠杆菌W3110、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌DH10B、大肠杆菌BW2952、大肠杆菌REL606。

根据本发明优选的分泌或产生L-甲硫氨酸的菌株的例子是大肠杆菌生产菌株MG1655ΔmetJ metA*11Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykA Ptrc09-gcvTHPΔpurU Ptrc36-ARNmst17-metF，具有生产质粒pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11和pCC1BAC-serB-glyA-serA-serC(WO2009/043803)。

根据本发明优选的分泌或产生L-甲硫氨酸的菌株的另一实例是大肠杆菌生产菌株MG1655ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP，具有生产质粒pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11。

大肠杆菌生产菌株MG1655ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc-metFPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP可以通过一系列P1转导和固化而克隆，如专利申请WO2009/043803所述。该菌株基于大肠杆菌K12MG1655野生型菌株。在这个菌株的基因组中导入如下修饰：

·删除L-甲硫氨酸生物合成的阻抑物metJ基因。

·将强trc启动子插入metH基因(编码钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶)的上游。

·将强trc启动子插入metF基因(编码5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶)的上游。

·将强trcF启动子插入在cysPUWAM操纵子上游。cysPUWA编码硫酸盐/硫代硫酸盐摄取转运蛋白。cysM编码半胱氨酸合酶B。

·将强trcF启动子插入cysJIH操纵子的上游。cysJI编码亚硫酸盐还原酶及cysH编码3’-磷酸腺苷-硫酸还原酶。

·将强trc09启动子插入gcvTHP操纵子的上游。gcvT、gcvH和gcvP编码甘氨酸裂解系统的三种成分。

大肠杆菌生产质粒pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11的克隆在专利申请WO2007/077041和WO2009/043803中描述。该质粒是基于载体pCL1920的低拷贝数质粒(低拷贝质粒)(Lerner,C.G.and Inouye,M.,Nucl.Acids Res.(1990)18:4631[PMID:2201955])。空白质粒pME101具有lacI^q基因，其编码lac阻抑物的强表达的等位基因。将thrA*1基因克隆在可以被Lac阻抑物抑制的强trc启动子的下游。其编码大肠杆菌ThrA天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的反馈抗性变体。相同方向的下游是cysE基因及其天然启动子。其编码大肠杆菌丝氨酸乙酰转移酶。cysE的下游是强大肠杆菌gapA启动子，其控制metA*11基因的表达。metA*11编码大肠杆菌高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的具有反馈抗性的变体。

可能提及的根据本发明优选的其它分泌或生产L-甲硫氨酸的微生物的例子是如下菌株：

-大肠杆菌TF4076BJF metA#10+metYX(Lm)(WO2008/127240；page46)；

-大肠杆菌W3110ΔJ/pKP451(EP 1445310B1,page 7,example 4)；

-大肠杆菌WΔthrBCΔmetJmetK32pMWPthrmetA4Δ5Δ9(YoshihiroUsuda and Osamu Kurahashi,2005,Applied and Environmental Microbiology,Vol.71,NO:6,pp.3228-3234)；

-W3110/pHC34(WO01/27307第13页，实施例3)；

-大肠杆菌ECM2(EP2205754A2、EP2326724A1和EP12156052.8)。

各种合适的微生物的进一步实例在Gomes等(Enzyme and MicrobialTechnology 37(2005),3-18)中描述。

大肠杆菌的基因或开放读框(ORFs)的核苷酸序列属于现有技术且可在由Blattner等(Science 277:1453-1462(1997))公开的大肠杆菌基因组序列中找到。已知宿主内源性酶(甲硫氨酸氨基肽酶)能除去N-末端氨基酸甲硫氨酸。

关于遗传和分子生物学术语的更详细的解释见于已知的遗传和分子生物学教科书，例如Birge的教科书(Bacterial and Bacteriophage Genetics,4^th ed.,Springer Verlag,New York(USA),2000)或者Berg、Tymoczko和Stryer的教科书(Biochemistry,5^th ed.,Freeman and Company,New York(USA),2002)或者Sambrook等的手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,(3-volumeset),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。

术语“基因”是指脱氧核糖核酸(DNA)上的一段，其包括首先产生(转录)核糖核酸(RNA)的信息，RNA包括产生(翻译)蛋白质(多肽)的信息，在这种情况中，多肽具有(p)ppGpp合成酶II的活性。基因或多核苷酸包括产生蛋白质的信息的事实也称作由基因或者由RNA编码蛋白质或多肽。内源基因和多核苷酸分别是指存在于种群中的开放读框(ORFs)、基因或等位基因及其多核苷酸。术语“基因”和“ORF”(开放读框)在本发明中同义使用。

术语“多核苷酸”通常是指多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。

术语“多肽”是指含有通过肽键连接的两或多个氨基酸的肽或蛋白质。术语多肽和蛋白质可同义使用。蛋白质是所有细胞的基本构件。其不仅提供细胞结构，而且还是，转运物质、催化化学反应及识别信号物质的分子“机器”。

“蛋白原性氨基酸”是指在天然蛋白质中，即在微生物、植物、动物和人的蛋白质中，发现的氨基酸。其更特别地包括选自如下的L-氨基酸：L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸，以及硒代半胱氨酸。蛋白原性氨基酸总是α-氨基酸。α-碳原子对于除了甘氨酸之外的所有蛋白原性氨基酸(其是手性分子)是不对称的：每个这些氨基酸存在两种对映异构体。两个对映异构体之一是蛋白原性的，其是L-氨基酸：合成蛋白质所需装置——核糖体、tRNA、氨酰基-tRNA合成酶(其给tRNA提供氨基酸)等-自身是手性的，且仅可识别L-变体。

术语“基因表达”(简称“表达”)通常是指遗传信息经由表型的表现。狭义地讲，基因表达是指基因转录为RNA，随后RNA翻译为可能具有酶活性的多肽。

“起始菌株”(亲代菌株)是指微生物菌株，对其进行增加一或多种氨基酸、肽或蛋白质生产性的措施，或者增加一或多种酶活性的措施(例如导致过表达的措施)。起始菌株可以是野生型菌株，或者是已经预先修饰的菌株(例如产生L-氨基酸的微生物(生产菌株))。

细胞的“野生型”优选是指其基因组是通过进化自然发生的状态。该术语用于完整细胞及单独的基因。术语“野生型”因此特别不包括其基因序列已经至少部分通过人工重组方法修饰的那些细胞或那些基因。

本发明基于举例的实施方案在下文更详细阐明。

用于大肠杆菌的最小(M9)和完全(LB)培养基已经由J.H.Miller(A shortcourse in bacterial genetics(1992),Cold Spring Harbor Laboratory Press)描述。除非另外描述，从大肠杆菌中分离质粒DNA及关于限制性酶切、连接、Klenow处理和碱性磷酸酶处理的所有技术根据Sambrook等(Molecularcloning-A laboratory manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述进行。除非另外描述，大肠杆菌的转化根据Chung等(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 86:2172-2175(1989))所述进行。

除非另外描述，产生菌株和转化体的温育温度是37℃。

实施例1：筛选L-甲硫氨酸-耐受性突变体

生产L-甲硫氨酸的大肠杆菌菌株ECM2基于K12野生型菌株MG1655。如EP2205754A2、EP2326724A1和EP12156052.8所述，ECM2菌株具有具有反馈抗性的metA等位基因，基因metJ、yncA、pykA和pykF的删除，spoT基因的变体，及metH、metF、gcvT、cysP和cysJ每个基因上游的启动子增强。

1.1将serC基因克隆进质粒pUC18

借助于聚合酶链式反应(PCR)扩增来自大肠杆菌MG1655的serC基因，然后克隆进pUC18质粒(Fermentas GmbH,St.Leon-Rot,Germany)中。

PCR引物serCF(XbaI)和serCR(HindIII)在每种情况中在其5’末端具有6个随机的核苷酸，随后分别是限制性核酸内切酶XbaI(TCTAGA)和HindIII(AAGCTT)的识别序列。serCF(XbaI)的核苷酸13-38结合在大肠杆菌MG1655基因组位置956619-956644。serCR(HindIII)的核苷酸13-37结合在大肠杆菌MG1655基因组的位置958028-958004。

serCF(XbaI)(SEQ ID NO:25)

5'AGGTGCTCTAGAGTCCGCGCTGTGCAAATCCAGAATGG 3'

serCR(HindIII)(SEQ ID NO:26)

5'TACACCAAGCTTAACTCTCTACAACAGAAATAAAAAC 3'

将serC基因使用聚合酶链式反应(PCR)扩增，使用引物serCF(XbaI)和serCR(HindIII)及Phusion DNA聚合酶(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)进行。大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为模板。所得DNA片段大小为1434bp。将其用XbaI和HindIII限制性核酸内切酶裂解，并借助于QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。非甲基化的pUC18质粒DNA通过XbaI和HindIII限制性核酸内切酶裂解，并借助于QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。然后将裂解质粒与PCR产物连接，转化进大肠杆菌DH5α中。含有serC基因的质粒克隆通过限制裂解和DNA测序鉴定。所得质粒称作pUC18-serC。

1.2将serA基因克隆进pUC18-serC质粒中

将大肠杆菌MG1655的serA基因借助于聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后克隆进质粒pUC18-serC中。

PCR引物serAF(XbaI)在其5’末端具有6个随机改核苷酸，随后是XbaI限制性核酸内切酶的识别序列(TCTAGA)。核苷酸12-33结合在大肠杆菌MG1655基因组位置3055199-3055220。PCR引物serAR(SHSSNB)在其5’末端具有6个随机核苷酸，随后是限制性核酸内切酶SacI、HindIII、SphI、SmaI、NotI和BglII的识别序列。核苷酸49-58结合在大肠杆菌MG1655基因组位置3056880-3056861。

serAF(XbaI)(SEQ ID NO:27)

5'CTGTAGTCTAGATTAGTACAGCAGACGGGCGCG 3'

serAR(SHSSNB)(SEQ ID NO:28)

5'CAAGAGCTCAAGCTTGCATGCGATTCCCGGGCGGCCGCAATAAGATCTCCGTCAGGGCGTGGTGACCG 3'

将serA基因使用聚合酶链式反应(PCR)扩增，使用引物serAF(XbaI)和serAR(SHSSNB)及Phusion DNA聚合酶(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)。大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为模板。所得DNA片段大小为1731bp。

将其用XbaI和SacI限制性核酸内切酶裂解，并借助于QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。将pUC18-serC质粒同样通过XbaI和SacI限制性核酸内切酶裂解及借助于QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。然后将裂解的质粒与PCR产物连接，并转化进大肠杆菌DH5α中。含有serA基因的质粒克隆通过限制性裂解和DNA测序鉴定。所得质粒称作pUC18-serAC。

1.3将serB基因克隆进pUC18-serAC质粒中

将大肠杆菌MG1655的serB基因借助于聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后克隆进pUC18-serAC质粒中。

PCR引物serB(SphI)在其5’末端具有6个随机核苷酸，随后是SphI限制性核酸内切酶的识别序列(GCATGC)。核苷酸13-34结合在大肠杆菌MG1655基因组位置4622816-4622837。

PCR引物serB(SmaI)在其5’末端具有6个随机核苷酸，随后是SalI(GTCGAC)和SmaI(CCCGGG)限制性核酸内切酶的识别序列。核苷酸54-75结合在大肠杆菌MG1655基因组位置4623887-4623866。

serB(SphI)(SEQ ID NO:29)

5'CCATGCGCATGCCCACCCTTTGAAAATTTGAGAC 3'

serB(SmaI)(SEQ ID NO:30)

5'CCGCATGTCGACATCCCGGGGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGTGTGATTACTTCTGATTCAGGCTGCC 3'

将serB基因使用聚合酶链式反应(PCR)扩增，使用引物serB(SphI)和serB(SmaI)及Phusion DNA聚合酶(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)。大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为模板。所得DNA片段大小为1137bp。

将其通过SphI和SmaI限制性核酸内切酶裂解，并借助于QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。将pUC18-serAC质粒同样通过SphI和SmaI限制性核酸内切酶裂解，通过碱性磷酸酶去磷酸，及借助于QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。然后将裂解的质粒与PCR产物连接并转化进大肠杆菌DH5α中。含有serB基因的质粒克隆通过限制性裂解及DNA测序鉴定。所得质粒称作pUC18-serBAC。

1.4将glyA基因克隆进pUC18-serBAC质粒中

将大肠杆菌MG1655的glyA基因借助于聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后克隆进pUC18-serBAC质粒中。

PCR引物glyA-下游在其5’末端具有6个随机核苷酸，随后是BglII限制性核酸内切酶的识别序列(AGATCT)。核苷酸13-35结合在大肠杆菌MG1655基因组位置2682063-2682085。

PCR引物glyA-上游在其5’末端具有6个随机核苷酸，随后是NotI限制性核酸内切酶的识别序列(GCGGCCGC)。核苷酸15-33结合在大肠杆菌MG1655基因组位置2683762-2683744。

glyA-下游(SEQ ID NO:31)

5'ATCTAAAGATCTGTTACGACAGATTTGATGGCGCG 3'

glyA-上游(SEQ ID NO:32)

5'TTCATCGCGGCCGCGAAAGAATGTGATGAAGTG 3'

将glyA基因使用聚合酶链式反应(PCR)扩增，使用引物glyA-下游和glyA-上游及Phusion DNA聚合酶(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)。大肠杆菌MG1655的基因组DNA作为模板。所得DNA片段大小为1726bp。

将其通过BglII和NotI限制性核酸内切酶裂解，并借助于QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。将pUC18-serBAC质粒同样用BglII和NotI限制性核酸内切酶裂解，并借助于QIAquick PCR纯化(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。然后将裂解的质粒与PCR产物连接，并转化进大肠杆菌DH5α中。将含有glyA基因的质粒克隆通过限制性裂解和DNA测序鉴定。所得质粒称作pUC18-serB-glyA-serAC。

1.5将基因serB-glyA-serAC从pUC18-serB-glyA-serAC中克隆至 pCC1-BAC

将pUC18-serB-glyA-serAC质粒通过HindIII限制性核酸内切酶裂解，将DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳分级分离。从该凝胶中分离含有基因serB、glyA、serA和serC的5.9kb DNA片段。将该片段与来自Epicentre/Madison,USA)的已经通过HindIII裂解的质粒pCC1BAC Cloning-Ready Vector(HindIII)连接，并转化进大肠杆菌EPI300中。将含有包含serB、glyA、serA和serC的DNA片段的质粒克隆通过限制性裂解和DNA测序鉴定。所得生产质粒称作pCC3。

1.6克隆pME-RDL2a生产质粒

将pME-RDL2a生产质粒如EP申请11151526.8所述克隆。其包括大肠杆菌cysE基因、大肠杆菌thrA和metA基因的反馈抗性等位基因及编码酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)RDL2p硫代硫酸盐硫转移酶的RDL2a基因。其另外包括链霉素抗性基因。

1.7用生产质粒转化菌株ECM2

将ECM2菌株用实施例1.5的pCC3生产质粒转化，用20mg/l氯霉素选择转化体。然后将细胞用实施例1.6的pME-RDL2a质粒转化，所得转化体用20mg/l氯霉素+100mg/l链霉素选择。所得菌株称作ECM2/pCC3/pME-RDL2a。

1.8 L-甲硫氨酸-耐受性突变体的筛选及测序

体通过将ECM2/pCC3/pME-RDL2a菌株预培养物铺板于含有75g/l L-甲硫氨酸(Merck,Frankfurt,Germany)的PC1最小培养基平板(表1，具有14g/l琼脂)上选择L-甲硫氨酸-耐受性突变。预培养物包含10ml预培养基(10％含有2.5g/l葡萄糖的LB培养基和90％PC1最小培养基)，接种100μl细胞培养物，在37℃培养10小时。

表1:PC1最小培养基

物质	浓度
		ZnSO4*7H2O	4mg/l
CuCl2*2H2O	2mg/l
		MnSO4*H2O	20mg/l
H3BO3	1mg/l
		Na2MoO4*2H2O	0.4mg/l
MgSO4*7H2O	1g/l
		柠檬酸*1H2O	6.56g/l
CaCl2*2H2O	40mg/l

K2HPO4	8.02g/l
		Na2HPO4	2g/l
(NH4)2HPO4	8g/l
		NH4Cl	0.13g/l
(NH4)2SO3	5.6g/l
		MOPS	5g/l
NaOH 10M	调节为pH 6.8

FeSO4*7H2O	40mg/l
		盐酸硫胺素	10mg/l
维生素B12	10mg/l
		葡萄糖	10g/l
异丙基-硫代-β-半乳糖苷(IPTG)	2.4mg/l
		壮观霉素	50mg/l
氯霉素	20mg/l

在温育5天后，从平板分离L-甲硫氨酸耐受性突变体的单菌落。

为了准备测序，在无抗生素的LB培养基中增殖大约6代后，分离不再含有质粒pCC3和pME-RDL2a的ECM2/pCC3/pME-RDL2a菌株的L-甲硫氨酸-耐受性突变体的衍生物。获得的菌株是链霉素和氯霉素敏感性菌株。

从8个突变体中分离染色体DNA。这个DNA用于全基因组测序(GATC,Constance,Germany)。

与ECM2起始菌株相比，仅在proP基因中发现突变。下表2列出突变。proP等位基因的序列在SEQ ID No:9-SEQ ID No:24中示出。

表2:

根据布达佩斯条约，菌株DM2321、DM2322、DM2323、DM2324、DM2325、DM2326、DM2327和DM2328于2011年8月23日保藏在DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstraβe 7B,38124Brunswick,Germany)，DSM编号为DSM 25095(＝DM2321)、25096(＝DM2322)、25097(＝DM2323)、25098(＝DM2324)、25099(＝DM2325)、25100(＝DM2326)、25101(＝DM2327)和25102(＝DM2328)。

实施例2：L-甲硫氨酸-耐受性proP突变体活性的检测

所述proP突变体的ProP活性通过例如与起始菌株ECM2对比分析菌株DM2328的脯氨酸摄取而确定。为此，将10ml预培养物1在LB培养基中在37℃摇动温育一天。将1ml预培养物转移至20ml的M9培养基中作为预培养物2，培养过夜。将预培养物2接种在50ml的新鲜M9培养基中，至OD600为0.2。随后将细胞培养3-4小时，然后用冰冷的M9缓冲液洗涤3次，调节至OD600为2并在冰上贮存。

脯氨酸摄取通过放射标记的[14C(U)]L-脯氨酸(放射性比活性：1.85MBq；Hartmann Analytic,Germany)确定。为此，在每种情况中将2.3ml细胞悬浮液置于搅拌管中，加入10mM葡萄糖在37℃通电2分钟。转运测量以加入浓度为24.6mM的20μl的L-[14C]-脯氨酸搅拌开始。在不同的时间点(0、15、30、45、60、75、90、105和120s)，在每种情况中取出200μl并移液于玻璃纤维过滤器(Millipore)上。周围的培养基通过真空过滤管抽吸而除去，随后将细胞用2.5ml的0.1M LiCl溶液洗涤两次。将过滤器用3.8ml的闪烁液(Roth,Karlsruhe,Germany)处理，放射性借助于闪烁计数器(LS6500,Beckman Instruments,Munich,Germany)测量。反应混合物中的总活性通过不用过滤直接测量样品而确定。测量每个样品的每分钟衰变(dpm)。摄取活性以nmol/min(干重mg)计算(0.36＝大肠杆菌干重比率[mg/mlOD＝1])。转运速率nmol/mg*min得自摄取动力学的线性部分。下表3示出三组平行测量的平均值。

表3：

菌株	L-脯氨酸转运速率(nmol/mg*min)
		ECM2	2.39
DM2328	1.27

实施例3：用生产质粒转化菌株DM2321、DM2322、DM2323、DM2324、 DM2325、DM2326、DM2327和DM2328

将菌株DM2321、DM2322、DM2323、DM2324、DM2325、DM2326、DM2327和DM2328用实施例1.5的pCC3生产质粒转化，转化体用20mg/l氯霉素选择。然后将细胞用实施例1.6的pME-RDL2a质粒转化，所得转化体用20mg/l氯霉素和100mg/l链霉素选择。所得菌株称作DM2321/pCC3/pME-RDL2a、DM2322/pCC3/pME-RDL2a、DM2323/pCC3/pME-RDL2a、DM2324/pCC3/pME-RDL2a、DM2325/pCC3/pME-RDL2a、DM2326/pCC3/pME-RDL2a、DM2327/pCC3/pME-RDL2a和DM2328/pCC3/pME-RDL2a。

实施例4：在摇瓶实验中的性能测定

大肠杆菌L-甲硫氨酸生产菌株的性能通过在100ml锥形瓶中进行生产测试而评估。在每种情况中，以100μl细胞培养物接种10ml预培养培养基(10％含有2.5g/l葡萄糖的LB和90％PC1最小培养基)的预培养物在37℃培养10小时。然后在每种情况中用这些培养物接种10ml的PC1最小培养基(见实施例1中表1)，至OD 600nm为0.2(Eppendorf Bio-Photometer；Eppendorf AG,Hamburg,Germany)，将培养物在37℃培养24小时。胞外L-甲硫氨酸浓度通过离子交换层析和茚三酮检测柱后衍生化确定，所述确定使用氨基酸分析仪(Sykam GmbH,Eresing,Germany)进行。胞外葡萄糖浓度使用YSI 2700Select Glucose Analyzer(YSI Life Sciences,Yellow Springs,Ohio,USA)确定。结果列于表4。24小时后，在两种培养物中葡萄糖均已经完全用尽。

表4:所检测的大肠杆菌菌株的发酵液体培养基中的L-甲硫氨酸浓度

菌株	OD(600nm)	L-甲硫氨酸(g/l)
			ECM2/pCC3/pME-RDL2a	3.27	1.71
DM2321/pCC3/pME-RDL2a	3.04	1.83
			DM2322/pCC3/pME-RDL2a	3.38	1.83
DM2323/pCC3/pME-RDL2a	3.20	1.83
			DM2324/pCC3/pME-RDL2a	3.38	1.82
DM2325/pCC3/pME-RDL2a	3.44	1.83
			DM2326/pCC3/pME-RDL2a	3.23	1.87
DM2327/pCC3/pME-RDL2a	3.22	1.99
			DM2328/pCC3/pME-RDL2a	3.12	1.86

实施例5：将M8、M4和M6proP等位基因克隆进质粒pMAK705中

将proP等位基因M8(来自DM2321)、M4(来自DM2323)和M6(来自DM2326)借助于聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后克隆进pMAK705质粒中。

基于针对proP等位基因获得的序列设计引物对(见实施例1)，使得在每种情况中包含特定突变的片段被扩增。然后所述片段可以克隆进pMAK705质粒中(Hamilton CM,Aldea M,Washburn BK,Babitzke P,Kushner SR(1989)；J Bacteriol.；171(9):4617-4622)。

PCR引物proPmut1(NotI)在其5’末端具有4个随机核苷酸，随后是HindIII限制性核酸内切酶的识别序列。

PCR引物proPmut2(BamHI)在其5’末端具有4个随机核苷酸，随后是BamHI限制性核酸内切酶的识别序列。

proPmut1(NotI)的核苷酸13-32结合大肠杆菌MG1655基因组的位置4328800-4328819。proPmut2(NotI)的核苷酸13-37结合大肠杆菌MG1655基因组的位置4330303-4330322。

proPmut1(HindIII)(SEQ ID NO:33)

5'GTCAAAGCTT ATATGGTCGCCAGAAGATCC 3'

proPmut2(BamHI)(SEQ ID NO:34)

5'GTCAGGATCC TCAGCCGCATTACACAGTTG 3'

菌株DM2321、DM2323和DM2328的基因组DNA(见实施例1)作为模板。

在每种情况中，使用聚合酶链式反应(PCR)用Phusion DNA聚合酶(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)扩增跨越proP基因中各个突变的片段。含有E412*突变的来自DM2321的片段(具有proP-M8)大小为1564bp(SEQ IDNO:35)。包含核苷酸位置854下游的“A”删除的来自DM2323的片段(具有proP-M4)大小为1542bp(SEQ ID NO:36)。含有在核苷酸位置973下游插入19bp的来自DM2326的片段(具有proP-M6)的大小为1563bp(SEQ ID NO:37)。

将所有这3个片段通过HindIII和BamHI限制性核酸内切酶裂解并借助于QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。然后将该片段用于与pMAK705质粒连接。

将pMAK705质粒用HindIII和BamHI限制性核酸内切酶裂解，通过碱性磷酸酶去磷酸化(Alkaline Phosphatase,Calf Intestinal,New EnglandBiolabs,Frankfurt a.M.,Germany)，并通过QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden)纯化。然后将质粒与特定的proP片段混合并通过Quick DNA连接酶(New England BioLabs,Frankfurt,Germany)连接。将连接混合物转化进大肠杆菌DH5α(Grant et al.；Proceedings of the National Academy of SciencesUSA,87(1990)4645-4649)中。通过20mg/l氯霉素选择正确的质粒克隆并通过限制性裂解及随后的插入体测序而鉴定。由此获得的质粒称作pMAK_proP-M4、pMAK_proP-M6和pMAK_proP-M8。pMAK_proP-M8在图3中以示例的方式示出。

实施例6：在大肠杆菌菌株ECM2中诱变proP基因

在每种情况中，将生产L-甲硫氨酸的大肠杆菌菌株ECM2(见实施例1)中的染色体proP野生型等位基因用介导甲硫氨酸抗性的proP等位基因M4、M6和M8置换。为此，在每种情况中将菌株通过电穿孔用质粒pMAK_proP-M4、pMAK_proP-M6和pMAK_proP-M8(见实施例5)转化。质粒pMAK具有氯霉素抗性基因和温度敏感性复制起点。质粒通过大肠杆菌在30℃而不是在44℃复制。在每种情况中，将转化混合物铺板于含有20mg/l氯霉素的LB琼脂上并在30℃温育40小时。然后将细胞使用接种环取出，重悬浮于LB培养基中，并在LB培养基中稀释10000倍。将100μl稀释液铺板于含有20mg/l氯霉素的LB琼脂上并在44℃再温育24小时。结果，选择在每种情况中pMAK_proP-M4、pMAK_proP-M6和pMAK_proP-M8质粒染色体整合的菌落。在每种情况中，将这些菌落之一使用接种环渐渐稀疏地涂于含有20mg/l氯霉素的LB琼脂上，在44℃温育24小时。导入的突变通过标准PCR方法检测(Innis et al.(1990)PCR Protocols.A guide to methods and applications,Academic Press)，使用如下引物对进行(见实施例11)：

proPmut1(HindIII)(SEQ ID NO:33)

5'GTCAAAGCTT ATATGGTCGCCAGAAGATCC 3'

proPmut2(BamHI)(SEQ ID NO:34)

5'GTCAGGATCC TCAGCCGCATTACACAGTTG 3'

在每种情况中获得的PCR产物使用这两种引物在GATC(Constance,Germany)测序。在每种情况中将所有这三种proP等位基因移至大肠杆菌菌株ECM2中，所得菌株称作ECM2_proP-M4、ECM2_proP-M6和ECM2_proP-M8。

实施例7：用生产质粒转化菌株ECM2_proP-M4、ECM2_proP-M6和 ECM2_proP-M8

将菌株ECM2_proP-M4、ECM2_proP-M6和ECM2_proP-M8用实施例1.5的pCC3生产质粒转化，转化体用20mg/l氯霉素选择。然后将细胞用实施例1.6的pME-RDL2a质粒转化，所得转化体用20mg/氯霉素和100mg/l链霉素选择。所得菌株称作ECM2_proP-M4/pCC3/pME-RDL2a、ECM2_proP-M6/pCC3/pME-RDL2a和ECM2_proP-M8/pCC3/pME-RDL2a。

实施例8：在摇瓶实验中的性能测定

生产L-甲硫氨酸的大肠杆菌菌株ECM2_proP-M4/pCC3/pME-RDL2a、ECM2_proP-M6/pCC3/pME-RDL2a和ECM2_proP-M8/pCC3/pME-RDL2a的性能通过在100ml锥形瓶中的生产测试而评估。在每种情况中以细胞培养物接种10ml预培养培养基(10％含有2.5g/l葡萄糖的LB培养基和90％PC1最小培养基)的预培养物在37℃培养10小时。然后在每种情况中用这些培养物接种10ml的PC1最小培养基(见实施例1的表1)，至OD 600nm为0.2(Eppendorf Bio-Photometer；Eppendorf AG,Hamburg,Germany)，将培养物在37℃培养24小时。胞外L-甲硫氨酸浓度通过离子交换层析及茚三酮检测柱后衍生化确定，所述确定使用氨基酸分析仪进行(Sykam GmbH,Eresing,Germany)。胞外葡萄糖浓度使用YSI 2700Select Glucose Analyzer(YSI Life Sciences,Yellow Springs,Ohio,USA)确定。结果列于表5。24小时后，在这两种培养中的葡萄糖已经完全用尽。

表5：检测的大肠杆菌菌株的发酵液体培养基中的L-甲硫氨酸浓度

菌株	OD(600nm)	L-甲硫氨酸(g/l)
			ECM2/pCC3/pME-RDL2a	3.27	1.71
ECM2_proP-M4/pCC3/pME-RDL2a	3.38	1.83
			ECM2_proP-M6/pCC3/pME-RDL2a	3.04	1.87
ECM2_proP-M8/pCC3/pME-RDL2a	3.22	1.83

Claims

1.通过肠杆菌科微生物的发酵生产L-氨基酸或含有L-氨基酸的饲料添加物的方法，特征在于采用其中proP基因弱化的微生物。

2.权利要求1的方法，特征在于所述proP基因被关闭。

3.权利要求1的方法，特征在于所述proP基因以低水平表达。

4.权利要求1-3任一项的方法，特征在于所述微生物过量产生L-氨基酸。

5.前述权利要求任一项的方法，特征在于所述微生物导致L-氨基酸在培养基中积聚。

6.权利要求1-5任一项的方法，特征在于所述微生物导致L-氨基酸在细胞中积聚。

7.前述权利要求任一项的方法，特征在于所述L-氨基酸是含硫氨基酸，优选L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-高半胱氨酸或者L-高胱氨酸。

8.权利要求7的方法，特征在于所述含硫氨基酸是L-甲硫氨酸。

9.前述权利要求任一项的方法，特征在于所述微生物与不具有弱化的proP基因的微生物相比具有增加的甲硫氨酸耐受性。

10.前述权利要求任一项的方法，特征在于所述肠杆菌科的微生物是埃希式杆菌属、欧文氏菌属、普罗维登杆菌属或者沙雷氏菌属的细菌，特别是埃希式杆菌属的细菌，特别优选大肠杆菌(Escherichia coli)。

11.前述权利要求任一项的方法，特征在于所述proP基因是与SEQ IDNO:1、3、5或7的多核苷酸序列，特别优选SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少80％、优选至少90％、特别是至少95％、尤其是至少98％、99％或100％序列相同性的基因。

12.前述权利要求任一项的方法，特征在于所述弱化的proP基因是与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少80％、优选至少90％、特别优选至少95％、特别是至少98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸，此外，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的多核苷酸相比必须具有一或多个如下突变：

e.编码SEQ ID NO:2的位置324或氨基酸序列的相当的位置的L-精氨酸的三联体由编码选自L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸的氨基酸的三联体取代，所述氨基酸优选L-亮氨酸；

f.编码SEQ ID NO:2的位置467或者氨基酸序列的相当的位置的L-酪氨酸的三联体由编码选自L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸的氨基酸的三联体取代，所述氨基酸优选L-组氨酸；

g.编码SEQ ID NO:2的位置412或者氨基酸序列的相当的位置的L-谷氨酸的三联体由编码终止密码子的三联体取代；

h.删除SEQ ID NO:1的proP基因的位置854的核碱基腺嘌呤；

i.删除SEQ ID NO:1的proP基因的位置1173-1223的一或多个核碱基，优选删除位置1173-1223的所有核碱基；

j.在SEQ ID NO:1的proP基因的位置842插入核碱基胞嘧啶；

k.在SEQ ID NO:1的proP基因的位置973插入一或多个核碱基，优选在位置973插入19个核碱基；

l.在SEQ ID NO:1的proP基因的位置183插入一或多个核碱基，优选在位置183插入1359个核碱基。

13.前述权利要求任一项的方法，特征在于在含有无机硫源的培养基中进行发酵。

14.前述权利要求任一项的方法，特征在于使所述L-氨基酸在所获得的发酵液体培养基中积聚，然后，如果需要，分离、收集和/或纯化所述L-氨基酸。

15.前述权利要求任一项的方法，特征在于所述L-氨基酸与来自发酵液体培养基和/或生物量的成分一起分离或收集。

16.肠杆菌科的微生物，其具有弱化的proP基因，特征在于其产生L-氨基酸及优选地将所述L-氨基酸分泌到培养基中。

17.权利要求16的微生物，特征在于其导致L-氨基酸在细胞中积聚。

18.权利要求16的微生物，特征在于其导致L-氨基酸在培养基中积聚。

19.前述权利要求任一项的微生物，特征在于所述proP基因被关闭。

20.权利要求16-18任一项的微生物，特征在于所述proP基因以低水平表达。

21.前述权利要求任一项的微生物，特征在于所述微生物过量产生L-氨基酸。

22.前述权利要求任一项的微生物，特征在于所述L-氨基酸是含硫氨基酸，优选L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-高半胱氨酸或L-高胱氨酸。

23.权利要求22的微生物，特征在于所述含硫氨基酸是L-甲硫氨酸。

24.前述权利要求任一项的微生物，特征在于其与不具有减弱的proP基因的微生物相比具有增加的甲硫氨酸耐受性。

25.前述权利要求任一项的微生物，特征在于所述肠杆菌科微生物是埃希式杆菌属、欧文氏菌属、普罗维登杆菌属或沙雷氏菌属的细菌，优选埃希式杆菌属的细菌，特别优选大肠杆菌。

26.前述权利要求任一项的微生物，特征在于所述proP基因是与SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7，特别优选SEQ IDNO:1的多核苷酸序列具有至少80％、优选至少90％、特别是至少95％、尤其是至少98％、99％或100％序列相同性的基因。

27.前述权利要求任一项的微生物，特征在于所述弱化的proP基因是与SEQ ID NO:1的多核苷酸序列具有至少80％、优选至少90％、特别是至少95％、尤其是至少98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸，此外，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的多核苷酸相比必须具有如下一或多个突变：

m.编码SEQ ID NO:2的位置324或者氨基酸序列的相当的位置的L-精氨酸的三联体由编码选自L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸的氨基酸的三联体取代，所述氨基酸优选L-亮氨酸；

n.编码SEQ ID NO:2的位置467或者氨基酸序列的相当的位置的L-酪氨酸的三联体由编码选自L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸的氨基酸的三联体取代，所述氨基酸优选L-组氨酸；

o.编码SEQ ID NO:2的位置412或者氨基酸序列的相当的位置的L-谷氨酸的三联体由编码终止密码子的三联体取代；

p.删除SEQ ID NO:1的proP基因的位置854的核碱基腺嘌呤；

q.删除SEQ ID NO:1的proP基因的位置1173-1223的一或多个核碱基，优选删除位置1173-1223的所有核碱基；

r.在SEQ ID NO:1的proP基因的位置842插入核碱基胞嘧啶；

s.在SEQ ID NO:1的proP基因的位置973插入一或多个核碱基，优选在位置973插入19个核碱基；

t.在SEQ ID NO:1的proP基因的位置183插入一或多个核碱基，优选在位置183插入1359个核碱基。

28.前述权利要求任一项的微生物，特征在于其具有增加的ThrA天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶活性。

29.前述权利要求任一项的微生物，特征在于其具有增加的MetA高丝氨酸O-琥珀酰转移酶和/或CysE丝氨酸乙酰转移酶活性。

30.前述权利要求任一项的微生物，特征在于其具有降低的MetJ L-甲硫氨酸生物合成转录调节物和/或MetK S-腺苷甲硫氨酸合酶活性。

31.与SEQ ID NO:1的序列具有至少80％、优选至少90％、特别是至少95％、尤其至少98％、99％或100％序列相同性的多核苷酸，特征在于所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的多核苷酸相比必须具有一或多个突变，所述突变选自：

u.编码SEQ ID NO:2的位置324或者氨基酸序列的相当的位置的L-精氨酸的三联体由编码选自L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸的氨基酸的三联体取代，所述氨基酸优选L-亮氨酸；

v.编码SEQ ID NO:2的位置467或者氨基酸序列的相当的位置的L-酪氨酸的三联体由编码选自L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸的氨基酸的三联体取代，所述氨基酸优选L-组氨酸；

w.编码SEQ ID NO:2的位置412或者氨基酸序列的相当的位置的L-谷氨酸的三联体由编码终止密码子的三联体取代；

x.删除SEQ ID NO:1的proP基因的位置854的核碱基腺嘌呤；

y.删除SEQ ID NO:1的proP基因的位置1173-1223的一或多个核碱基，优选删除位置1173-1223的所有核碱基；

z.在SEQ ID NO:1的proP基因的位置842插入核碱基胞嘧啶；

aa.在SEQ ID NO:1的proP基因的位置973插入一或多个核碱基，优选在位置973插入19个核碱基；

bb.在SEQ ID NO:1的proP基因的位置183插入一或多个核碱基，优选在位置183插入1359个核碱基。

32.权利要求31的多核苷酸，特征在于其与选自如下的一或多个多核苷酸杂交：与SEQ ID NO:1互补的多核苷酸、与SEQ ID NO:3互补的多核苷酸及与SEQ ID NO:5互补的多核苷酸，优选与SEQ ID NO:1互补的多核苷酸。

33.包含权利要求31或32的多核苷酸的载体。

34.与SEQ ID NO:2所示序列具有至少80％、优选至少90％、特别是至少95％、尤其是至少98％、99％或100％相同性的多肽，特征在于所述多肽与SEQ ID NO:2所示多肽相比必须具有一或多个突变，所述突变选自：

cc.SEQ ID NO:2的位置324或者氨基酸序列的相当的位置的L-精氨酸由选自L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸的氨基酸取代，所述氨基酸优选L-亮氨酸；

dd.SEQ ID NO:2的位置467或者氨基酸序列的相当的位置的L-酪氨酸由选自L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸的氨基酸取代，所述氨基酸优选L-组氨酸；

ee.删除SEQ ID NO:2的位置392-408或者氨基酸序列的相当的位置的17个氨基酸；

ff.删除SEQ ID NO:2的C末端至多420个氨基酸，优选删除SEQ IDNO:2的氨基酸序列的C末端88、163、202、212或者420个氨基酸。

35.具有权利要求31或32的多核苷酸和/或权利要求33的载体和/或权利要求34的多肽的重组微生物。

36.鉴定肠杆菌科微生物的方法，所述微生物使得含硫L-氨基酸能够以改良的方式产生，并且具有弱化的proP基因，所述方法包括如下步骤：

gg.筛选具有增加的甲硫氨酸耐受性的肠杆菌科微生物，其能产生含硫L-氨基酸；

hh.分离并增殖在a)中产生的突变体；

ii.任选地，提供来自在b)中获得的突变体的核酸；

jj.任选地，使用聚合酶链式反应从来自c)的核酸和引物对开始制备核酸分子，所述引物对由第一引物和第二引物组成，所述第一引物包含SEQ IDNO:38的核苷酸序列的位置1-1000中的至少15个连续核苷酸，所述第二引物包含SEQ ID NO:38的核苷酸序列的位置2504-3503中的至少15个连续核苷酸；

kk.任选地，确定在d)中获得的核酸分子的核苷酸序列，及确定所编码的氨基酸序列；

ll.任选地，将在e)中确定的氨基酸序列与SEQ ID NO:2进行比较；及

mm.任选地，鉴定所获得的proP突变体。