CN103328644B - 发酵制备含硫氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及发酵制备选自L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-高半胱氨酸和L-高胱氨酸的含硫氨基酸的方法，包括步骤：a)提供与特定起始菌株相比具有增加的硫代硫酸硫转移酶活性的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)或棒杆菌科(Corynebacteriaceae)微生物；b)在含有无机硫源的培养基中发酵来自a)的微生物，获得发酵液，所述无机硫源来自硫代硫酸盐或者硫代硫酸盐和硫酸盐的混合物；和c)浓缩来自b)的发酵液中的含硫氨基酸。

Description

发酵制备含硫氨基酸的方法
本发明涉及发酵制备选自L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-高半胱氨酸和L-高胱氨酸的含硫氨基酸的方法。
含硫氨基酸有重大经济重要性。L-半胱氨酸用作食品添加物、用作药物活性化合物(例如N-乙酰半胱氨酸)的起始物质及用于化妆品。L-甲硫氨酸在动物营养中起主要作用。其属于必需氨基酸，不能由脊椎动物代谢中的生物合成而产生。因此，在动物繁殖饲养中，必须保证在饲料中摄入足够量的甲硫氨酸。但是，由于L-甲硫氨酸通常在传统饲料植物(如大豆或谷类)中的存在量很低不能保证最佳动物营养，特别是对于猪和禽类而言，因此有利的是将甲硫氨酸作为添加物混合到动物饲料中。D-甲硫氨酸可以由脊椎动物转化为生物学活性的L-甲硫氨酸。D-和L-甲硫氨酸的外消旋物因此被加入到动物饲料中。L-高半胱氨酸可以由动物通过甲基转移作用而转化成L-甲硫氨酸，因此可以替代其。
在现有技术中，氨基酸如甲硫氨酸通过化学合成制备。在这一制备中，丙烯醛和甲基硫醇首先反应以产生3-甲硫基丙醛，3-甲硫基丙醛随后与氰化物、氨及一氧化碳反应生成乙内酰脲。乙内酰脲可以最终被水解为外消旋物，即两种立体异构体D-和L-甲硫氨酸的等摩尔混合物。由于该分子的生物学活性形式特指L-形式，所有饲料中含有的D形式必须首先在代谢中通过脱氨基和氨基交换被转化成活性L形式。
与甲硫氨酸相反，大多数其他天然蛋白质氨基酸主要由微生物发酵而制备。这利用的事实是微生物具有合成天然氨基酸的合适生物合成途径。另外，许多发酵方法用不昂贵的浸提物如葡萄糖和矿物盐实现了非常有利的生产成本，另外输送生物学活性L形式的特定氨基酸。
但是，氨基酸的生物合成途径在野生型菌株中受严格代谢控制，其保证了氨基酸仅为细胞自身需要而产生。因此有效生产方法的一个重要前提条件是合适的微生物是可利用的，所述微生物与野生型微生物不同，具有强力增加的生产产量以用于制备希望的氨基酸。
过量产生氨基酸的这种微生物可以通过传统的突变/选择方法和/或通过现代的靶向重组技术(代谢工程)而产生。在后一种情况中，首先鉴别基因或等位基因，这些基因或等位基因通过它们的修饰、激活或失活而实现氨基酸过量产生。这些基因/等位基因然后被导入到微生物菌株中或者被分子生物学技术失活，以便实现最佳过量生产。但是，通常仅一些不同措施的组合导致真正有效的生产。
在大肠杆菌(E.coli)和谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)中，L-半胱氨酸生物化学衍生自L-丝氨酸。L-丝氨酸由丝氨酸乙酰转移酶CysE激活为O-乙酰丝氨酸。O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂合酶然后以硫化物形式转移还原的硫，结果形成L-半胱氨酸。与谷氨酸棒杆菌相反，大肠杆菌具有两种不同的O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂合酶，O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂合酶B(“CysM”)也能够转移硫代硫酸(thiosulphate)至O-乙酰丝氨酸。结果，形成S-磺基半胱氨酸(sulphocysteine)，其然后以一种尚未鉴定的方式分解为L-半胱氨酸和亚硫酸盐(sulphite)或硫酸盐(sulphate)(KredichN.M.(1996)inNeidhardtFCetal.(ed.)"EscherichiacoliandSalmonella",2ndedition,p.514-527).
L-甲硫氨酸与赖氨酸和苏氨酸一起衍生自天冬氨酸。硫是以L-半胱氨酸形式(经胱硫醚作为中间产物)经转硫化(transsulphurization)(在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中；在大肠杆菌中的唯一路径)而导入L-甲硫氨酸中。与此平行，例如，在谷氨酸棒杆菌中有直接巯基化路径，其中硫化物以L-高半胱氨酸形式被同化(B-JHwang,H-JYeom,YKim,H-SLee,2002,JBacteriol.,184(5):1277–1286)。L-甲硫氨酸的C1基团源自C1代谢并且其被甲硫氨酸合酶MetE和MetH转移至L-高半胱氨酸(Review:GreeneRC(1996)inNeidhardtFCetal.(ed.)"EscherichiacoliandSalmonella",2ndedition,p.542-560)。谷氨酸棒杆菌中的L-甲硫氨酸生物合成由Rückertetal.描述(RückertC,PühlerA,KalinowskiJ,2003,JBiotechnol.,104(1-3):213-28)。用于发酵生产L-甲硫氨酸的菌株和方法已有描述，例如针对大肠杆菌(WO2006/001616,WO2009/043803)和谷氨酸棒杆菌(WO2009/144270)。
使用硫代硫酸盐作为硫源使得在含硫氨基酸生产中有显著更高的理论收率(与硫酸盐相比)(JO,WittmannC,SH,HeinzleE,MetabEng.,2006,8(4)，pp.353-369;和WO2007/020295)。硫代硫酸盐的优势解释如下：在硫酸盐(SO4 2-)中，硫原子以氧化水平+6存在。为了同化，其必须被还原至氧化水平-2(硫化物=S2-)。为了还原硫酸盐为硫化物，细胞必须使用2ATP和4NADPH(=8个电子)。在硫代硫酸盐中，中央硫原子具有氧化水平+5，末端硫原子具有氧化水平-1(两个硫原子的平均正式氧化水平(averageformaloxidationlevel):+2)。因此为了还原硫代硫酸盐的两个硫原子，仅需要8个电子，相比之下还原2个硫酸盐需要16个电子。
使用硫代硫酸盐作为硫源用大肠杆菌生产L-半胱氨酸在例如DE102007007333和WO2001/27307中描述。
WO2007/077041中显示大肠杆菌中的L-甲硫氨酸生产也可以通过使用硫代硫酸盐取代硫酸盐而显著改善。
目前为止尚无实验显示使用硫代硫酸盐也导致谷氨酸棒杆菌中的L-甲硫氨酸生产被改善。WO2007/020295(p.240)中示出用硫代硫酸钠作为硫源，谷氨酸棒杆菌形成更多生物量。这被评价为更低ATP和NADPH消耗的指示。实践中未研究使用硫代硫酸盐生产L-甲硫氨酸。
在大肠杆菌中，硫代硫酸盐被硫酸盐/硫代硫酸盐转运蛋白CysPUWA-Sbp吸收(KredichN.M.(1996)inNeidhardtFCetal.(ed.)"EscherichiacoliandSalmonella",2ndedition,p.514-527)。CysP和Sbp是两种不同的周质结合蛋白。CysP具有更高的对硫代硫酸盐的亲和性，Sbp具有更高的对硫酸盐的亲和性。CysA形成ATP-结合成分。CysU和CysW是跨膜成分。在WO2009/043803中，cysPUWAM操纵子的表达在大肠杆菌中增加，由此实现了L-甲硫氨酸生产的改善。对于在谷氨酸棒杆菌中硫代硫酸盐的摄取一无所知。推定的硫酸盐摄取系统CysZ(cg3112)的敲除突变体以硫代硫酸盐作为硫源仍能生长(RückertC.etal.(2005)，BMCGenomics.,vol.6(121))。CysZ因此不是(唯一的)负责硫代硫酸盐的转运。
O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂合酶B(=CysM,EC2.5.1.47)使得大肠杆菌可以用硫代硫酸盐作为硫源合成L-半胱氨酸和L-甲硫氨酸。所述酶催化从O-乙酰丝氨酸和硫代硫酸盐形成S-硫半胱氨酸(R-S-SO3)和乙酸盐。S-硫半胱氨酸然后以一种目前尚未鉴定的方式裂解为L-半胱氨酸和硫化物或硫酸盐(KredichN.M.(1996)inNeidhardtFCetal.(ed.)"EscherichiacoliandSalmonella",2ndedition,p.514-527)。硫酸盐在三个步骤中被ATP硫酸化酶(CysDN)、APS激酶(CysC)和PAPS硫转移酶(CysH)还原为亚硫酸盐(SO3 2-)。亚硫酸盐然后进一步被NADPH亚硫酸盐还原酶还原生产硫化物(S2-)，其可以被O-丝氨酸(硫醇)裂合酶A(CysK)和O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂合酶B(CysM)利用合成第二个L-半胱氨酸分子。
谷氨酸棒杆菌可以在以硫代硫酸盐为硫源的基本培养基中生长(RückertC.etal.(2005)，BMCGenomics.,vol.6(121))。尽管如此，谷氨酸棒杆菌不具有O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂合酶B("CysM")(RückertandKalinowski(2008)inA.Burkovski(ed.)"Corynebacteria:GenomicsandMolecularBiology",CaisterAcademicPress)。因此硫代硫酸盐肯定以另一种方式被同化。
本发明的目的是提供可以更高过量生产含硫氨基酸特别是L-甲硫氨酸的方法和微生物菌株。
这个目的通过发酵制备选自L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-高半胱氨酸和L-高胱氨酸的含硫氨基酸的方法而实现，所述方法包括步骤：
a)提供与特定起始菌株相比具有增加的硫代硫酸硫转移酶活性的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)微生物或棒杆菌科(Corynebacteriaceae)微生物；
b)在含有硫代硫酸盐或者硫代硫酸盐和硫酸盐的混合物作为无机硫源的培养基中发酵来自a)的微生物，获得发酵液；和
c)浓缩来自b)的发酵液中的含硫氨基酸。
本发明进一步提供了发酵制备选自L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-高半胱氨酸和L-高胱氨酸的含硫氨基酸的方法，包括步骤：
a)提供过表达编码具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽的基因的肠杆菌科微生物或棒杆菌科微生物；
b)在含有硫代硫酸盐或者硫代硫酸盐和硫酸盐的混合物作为无机硫源的培养基中发酵来自a)的微生物，获得发酵液，和
c)浓缩来自b)的发酵液中的含硫氨基酸。
硫代硫酸硫转移酶(Thiosulphatesulphurtransferase)，也称为"硫氰酸生成酶(rhodanese)"(EC2.8.1.1)，是将还原的硫原子从硫代硫酸盐转移至氰化物(CN-)的酶。
一些硫代硫酸硫转移酶也可以将还原的硫原子转移到另外的底物，例如二氢硫辛酸盐(dihydrolipoate)(AlexanderK.,VoliniM,1987,J.Biol.Chem.,262:6595-6604)。在数据库"ClustersofOrthologousGroupsofproteins"(COG)中，在所有三种生命范畴中的168个同源硫转移酶目前在类别COG0607“硫氰酸生成酶相关硫转移酶”中发现(TatusovRL,FedorovaND,JacksonJD,JacobsAR,KiryutinB,KooninEV,KrylovDM,MazumderR,MekhedovSL,NikolskayaAN,RaoBS,SmirnovS,SverdlovAV,VasudevanS,WolfYI,YinJJ,NataleDA,2003,BMCBioinformatics,4:41;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)。硫氰酸生成酶具有一或多个特征性硫氰酸生成酶样结构域(PFAM数据库PF00581,http://pfam.sanger.ac.uk/;GliubichF,GazerroM,ZanottiG,DelbonoS,BombieriG,BerniR,1996,JBiolChem.,271(35):21054-61)。
来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S288c的RDL2基因(硫氰酸生成酶样蛋白质)编码149个氨基酸长的蛋白质Rdl2p。其具有硫氰酸生成酶样结构域(PFAM数据库PF00581,http://pfam.sanger.ac.uk/)。实验显示Rdl2p是硫代硫酸硫转移酶(硫氰酸生成酶,EC2.8.1.1;FosterMW,ForresterMT,StamlerJS,2009,ProcNatlAcadSciUSA,106(45):18948-53)。SEQIDNO:1显示RDL2基因的DNA序列。SEQIDNO:2显示由RDL2编码的蛋白质Rdl2p的氨基酸序列。
除了熟知的硫氰酸生成酶GlpE和PspE(AdamsH,TeertstraW,KosterM,TommassenJ,2002,FEBSLett.518:173-6)之外，大肠杆菌还具有7个进一步的具有硫氰酸生成酶样结构域的平行进化同源酶(paralogousenzyme)(ChengH,DonahueJL,BattleSE,RayWK,LarsonTJ,2008,OpenMicrobiolJ.,2:18-28)：
YgaP具有N-末端硫氰酸生成酶样结构域和两个跨膜结构域。其显示体外硫氰酸生成酶活性(Ahmed,F.,2003,Dissertation)。
YbbB是tRNA2-硒代尿苷(selenouridine)合酶并且具有N-末端硫氰酸生成酶样结构域(WolfeMD,AhmedF,LacourciereGM,LauhonCT,StadtmanTC,LarsonTJ,2004,JBiolChem.,279(3):1801-1809)。
ThiI是硫胺素合成必需的并且在tRNA位置8的尿苷转化为硫代尿苷中起作用(PalencharPM,BuckCJ,ChengH,LarsonTJ,MuellerEG,2000,JBiolChem.,275(12):8283-8286)。
SseA是3-巯基丙酮酸:氰化物硫转移酶，其优先转移3-巯基丙酮酸而非硫代硫酸至氰化物(ColnaghiR,CassinelliG,DrummondM,ForlaniF,PaganiS,2001,FEBSLett.,500(3):153-156)。该酶具有两个硫氰酸生成酶样结构域。
ORFynjE编码具有3个硫氰酸生成酶样结构域的推定的硫转移酶(P,DahlJU,KuperJ,UrbanA,Müller-TheissenU,LeimkühlerS,SchindelinH.,2009,ProteinSci.,18(12):2480-2491)。
ORFyibN编码具有C-末端硫氰酸生成酶样结构域的推定的硫转移酶。
ORFyceA编码具有硫氰酸生成酶样结构域的推定的硫转移酶。
在谷氨酸棒杆菌中，至少7个ORF编码推测的硫转移酶：
ORFthtR(=cg0803,NCgl0671)编码具有两个硫氰酸生成酶样结构域的长度为301个氨基酸的推定的硫转移酶。
ORFsseA2(=cg1613,NCgl1369)编码具有两个硫氰酸生成酶样结构域的长度为289个氨基酸的推定的硫转移酶。
ORFcg3000(=NCgl2616)编码具有硫氰酸生成酶样结构域的长度为96个氨基酸的推定的硫转移酶。
ORFcg0073(=NCgl0053)编码具有硫氰酸生成酶样结构域的长度为97个氨基酸的推定的硫转移酶。
ORFcg0074(=NCgl0054)编码具有硫氰酸生成酶样结构域的长度为197个氨基酸的推定的硫转移酶。
ORFsseA1(=cg3073,NCgl2678)编码具有两个硫氰酸生成酶样结构域的长度为274个氨基酸的推定的硫转移酶。
ORFcg3319(=NCgl2890)编码具有硫氰酸生成酶样结构域的长度为312个氨基酸的推定的硫转移酶。
来自牛(Bostaurus)的硫代硫酸硫转移酶具有两个硫氰酸生成酶样结构域并且已被清楚地鉴定(CannellaC,CostaM,PensaB,RicciG,PecciL,CavalliniD.,1981,EurJBiochem.,119(3):491-495)。
在所述方法的一个优选实施方案中，所述微生物过表达一或多个编码具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽的基因，所述具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽选自下列a)-d)：
a)由多肽Rdl2p、GlpE、PspE、YgaP、ThiI、YbbB、SseA、YnjE、YceA、YibN、NCgl0671、NCgl1369、NCgl2616、NCgl0053、NCgl0054、NCgl2678、NCgl2890；来自哺乳动物的硫代硫酸硫转移酶，例如来自牛肝(Bostaurus)的硫代硫酸硫转移酶；优选Rdl2p、GlpE、PspE，且特别优选Rdl2p组成或包含其的多肽；
b)由SEQIDNO:2所示氨基酸序列组成或包含SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽；
c)具有与a)或b)的氨基酸序列有70%或更高相同性的氨基酸序列的多肽，所述多肽具有硫代硫酸硫转移酶活性；
d)具有相对于SEQIDNO:2所示氨基酸序列含有1-45个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列的多肽，所述多肽具有硫代硫酸硫转移酶活性。
如上所述，具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽还包括a)或b)所述酶的变体，其氨基酸序列与a)或b)所述序列的氨基酸序列有70%或更高相同性，所述变体具有硫代硫酸硫转移酶活性。优选的实施方案包括与上述氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的变体，即其中至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的氨基酸位置与上述氨基酸序列相同。百分比相同性优选在氨基酸或核酸区域的总长度上计算。本领域技术人员可利用一些基于大量算法的程序进行序列对比。关于这一点，NeedlemanandWunsch或者SmithandWaterman的算法给出特别可靠结果。为了对比序列，可利用程序PileUp(J.Mol.Evolution.,25,351-360,1987,Higginsetal.,CABIOS,51989:151-153)或者程序GapandBestFit[NeedlemanandWunsch(J.Mol.Biol.48;443-453(1970))及SmithandWaterman(Adv.Appl.Math.2;482-489(1981))]，其属于GCG软件包[GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711(1991)]。上述给出的序列相同性百分比值优选是用GAP程序在总序列区域计算的。
具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽还包括a)或b)所述酶的片段。这些片段具有上述活性。在本专利申请上下文中具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽的片段含有上述氨基酸序列之一的至少30个、至少50个或至少80个连续氨基酸残基。
如上所述，具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽还包括a)或b)所述酶的变体，所述变体具有相对于SEQIDNO:2所示氨基酸序列含有1-45个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，所述多肽具有硫代硫酸硫转移酶活性。在优选实施方案中，所述氨基酸序列含有相对于SEQIDNO:2所示氨基酸序列1-40个、进一步优选1-30个、还进一步优选1-20个、优选1-15个、还进一步优选1-10个及最优选1-5个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加。
在进一步优选的方法中，所述多肽由包括SEQIDNO:1的核苷酸序列的基因编码，所述核苷酸序列相应于来自酿酒酵母S288c的RDL2基因的野生型序列。
进一步优选的是所述多肽由包括SEQIDNO:3的核苷酸序列的基因编码。此处密码子使用轻度适应于大肠杆菌。
进一步优选的是所述多肽由包括SEQIDNO:4的核苷酸序列的基因编码。此处密码子使用更高度适应于大肠杆菌。
进一步优选的是所述多肽由包括SEQIDNO:5的核苷酸序列的基因编码。此处密码子使用完全适应于大肠杆菌。
在进行本发明的方法时，编码具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽的基因的表达优选通过一或多种下列措施而增加：
a)所述基因的表达在启动子的控制下，所述启动子在用于所述方法的微生物中导致与起始菌株相比增加的表达。关于这一点，例如可以使用大肠杆菌gapA基因的组成型GAPDH启动子或者可诱导的lac、tac、trc、lambda、ara或tet启动子(综述:MakridesSC.Micro-biolRev.1996Sep;60(3):512-38)。
b)与起始菌株相比增加编码具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽的基因的拷贝数。这可以通过例如将所述基因以增加的拷贝数插入质粒中或者通过将所述基因以多个拷贝整合进微生物染色体中而实现(BaneyxF,1999,Curr.Opin.Biotechnol.10,411–421)。
c)使用核糖体结合位点实现所述基因的表达，所述核糖体结合位点导致与起始菌株相比在用于所述方法的微生物中的翻译增加(MakridesSC.MicrobiolRev.1996Sep;60(3):512-38)。
d)所述基因的表达通过针对用于所述方法的微生物优化密码子使用而增加(Welch,Villalobos,GustafssonandMinshull,JRSocInterface,2009,6:S467-76)。密码子适应指数(CAI)例如适合作为基因对生物体的密码子使用的适应性的测量(SharpPM,LiWH,1987,NucleicAcidsRes.,15(3):1281-95)。
e)所述基因的表达通过降低由所述基因转录的mRNA中的mRNA二级结构而增加(KudlaG,MurrayAW,TollerveyD,PlotkinJB.,Science,2009Apr10;324(5924):255-8;Welch,Villalobos,GustafssonandMinshull,JRSocInterface,2009,6:S467-76)。
f)所述基因的表达通过消除由所述基因转录的mRNA中的RNA聚合酶终止子而增加(Welch,Villalobos,GustafssonandMinshull,JRSocInterface,2009,6:S467-76)。
g)所述基因的表达通过使用由所述基因转录的mRNA中的mRNA稳定化序列而实现(CarrierTA,KeaslingJD,BiotechnolProg.,1997,Nov-Dec;13(6):699-708)。作为稳定大肠杆菌的metF基因的mRNA的例子可以提及序列ARNmst17(WO2009/043803)。
在本发明方法的进一步实施方案中，优选的是硫代硫酸盐是选自碱金属盐、碱土金属盐、铵盐及其混合物的盐，优选铵盐。
进一步优选的是硫酸盐是选自碱金属盐、碱土金属盐、铵盐(及混合物)的盐，优选铵盐。
优选地，培养基或发酵液中的硫代硫酸盐的浓度是0.05g/kg至100g/kg，优选0.1g/kg至20g/kg，特别优选0.2g/kg至12g/kg。
在优选的方法中，培养基或发酵液中的硫代硫酸盐的浓度在发酵期间保持在至少0.05g/kg至100g/kg，优选0.1g/kg至20g/kg，特别优选0.2g/kg至12g/kg。
在进一步优选的方法中，在发酵期间将硫代硫酸盐的含量基于在培养基中和发酵液中无机硫的总含量保持在至少5mol%。
本发明的方法可以设计为分批方法、补料分批方法、重复补料分批方法及连续方法。
含硫氨基酸可以进一步作为固体产物得自发酵液或者以溶解形式在液体产物中。
在本发明的优选的方法中，生产的含硫氨基酸是L-甲硫氨酸。
进一步优选的是，所述微生物是埃希氏菌属(Escherichia)，特别优选大肠杆菌种。
在一替代方法中，所述微生物是棒杆菌属(Corynebacterium)，特别优选是谷氨酸棒杆菌种。
在本发明特别优选的方法中，所述微生物选自：
-与起始菌株相比具有增加的天冬氨酸激酶活性和/或表达且调节蛋白McbR被弱化或缺失的谷氨酸棒杆菌；
-与起始菌株相比具有增加的天冬氨酸激酶活性和/或表达且调节蛋白MetJ被弱化或缺失的大肠杆菌。
本发明进一步提供了微生物，选自
-与起始菌株相比具有增加的天冬氨酸激酶活性和/或表达且调节蛋白McbR被弱化或缺失的谷氨酸棒杆菌；
-与起始菌株相比具有增加的天冬氨酸激酶活性和/或表达且调节蛋白MetJ被弱化或缺失的大肠杆菌；
其中所述微生物分泌或产生L-甲硫氨酸，并且其中所述微生物与特定起始菌株相比具有增加的硫代硫酸硫转移酶活性。
本发明另外提供了微生物，选自
-与起始菌株相比具有增加的天冬氨酸激酶活性和/或表达且调节蛋白McbR被弱化或缺失的谷氨酸棒杆菌；
-与起始菌株相比具有增加的天冬氨酸激酶活性和/或表达且调节蛋白MetJ被弱化或缺失的大肠杆菌；
其中所述微生物分泌或产生L-甲硫氨酸，并且其中所述微生物过表达编码具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽的基因。
分泌或产生L-甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株优选具有增加的天冬氨酸激酶(EC2.7.2.4)酶活性，优选的是反馈抗性等位基因。在棒杆菌属中，这个天冬氨酸激酶由基因lysC编码。由于调节蛋白McbR(其由基因mcbR编码)的弱化或缺失，进一步发生了硫利用的增加。McbR是谷氨酸棒杆菌中整个硫利用级联的阻遏物(ReyDA,NentwichSS,KochDJ,RückertC,PühlerA,TauchA,KalinowskiJ.,MolMicrobiol.,2005,56(4):871-887)。
分泌或产生L-甲硫氨酸的大肠杆菌菌株优选具有增加的天冬氨酸激酶(EC2.7.2.4)酶活性，优选的是反馈抗性等位基因。在大肠杆菌中有三种不同的天冬氨酸激酶，由基因thrA、metL或lysC编码。由于由基因metJ编码的调节蛋白MetJ的弱化或缺失，进一步发生了L-甲硫氨酸生物合成中的增加。MetJ是大肠杆菌中L-甲硫氨酸生物合成的主要阻遏物。
进一步优选的是这种微生物过表达一或多个编码具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽的基因，具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽选自下列a)至d)：
a)由多肽Rdl2p、GlpE、PspE、YgaP、ThiI、YbbB、SseA、YnjE、YceA、YibN、NCgl0671、NCgl1369、NCgl2616、NCgl0053、NCgl0054、NCgl2678、NCgl2890；来自哺乳动物的硫代硫酸硫转移酶例如来自牛肝(Bostaurus)的硫代硫酸硫转移酶；优选Rdl2p、GlpE、PspE，且特别优选Rdl2p组成或包含其的多肽;
b)由SEQIDNO:2所示氨基酸序列组成或包含SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽；
c)具有与a)或b)的氨基酸序列有70%或更高相同性的氨基酸序列的多肽，所述多肽具有硫代硫酸硫转移酶活性；
d)具有相对于SEQIDNO:2所示氨基酸序列含有1-45个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列的多肽，所述多肽具有硫代硫酸硫转移酶活性。
微生物的起始菌株进一步优选地衍生自下组，所述的组由大肠杆菌MG1655、大肠杆菌W3110、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌DH10B、大肠杆菌BW2952、大肠杆菌REL606、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌R、谷氨酸棒杆菌DSM20411(先前名称黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum))、谷氨酸棒杆菌DSM20412(先前名称乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum))、谷氨酸棒杆菌DSM1412(先前名称乳发酵短杆菌)、CorynebacteriumefficiensYS-314T(=DSM44549)、谷氨酸棒杆菌ATCC21608、谷氨酸棒杆菌DSM17322组成。
分泌或产生L-甲硫氨酸的进一步的菌株是例如大肠杆菌生产菌株MG1655ΔmetJPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP，其含有生产质粒pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11(WO2009/043803)。
大肠杆菌生产菌株MG1655ΔmetJPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP的克隆在专利申请WO2009/043803中描述。该菌株基于野生型菌株大肠杆菌K12MG1655。下列修饰已被引入这个菌株的基因组中：
·L-甲硫氨酸生物合成的阻遏物基因metJ已被缺失。
·在基因metH(编码钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶)的上游已插入强trc启动子。
·在基因metF(编码5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶)的上游已插入强trc启动子。
·在操纵子cysPUWAM的上游已插入强trcF启动子。cysPUWA编码硫酸盐/硫代硫酸盐摄取转运蛋白。cysM编码半胱氨酸合酶B。
·在操纵子cysJIH的上游已插入强trcF启动子。cysJI编码亚硫酸盐还原酶，cysH编码3'-磷酸腺苷酰硫酸还原酶。
·在操纵子gcvTHP的上游已插入强trc09启动子。gcvT、gcvH和gcvP编码甘氨酸裂解系统的三个成分。
大肠杆菌生产质粒pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11的克隆在专利申请WO2007/077041中描述。其是基于载体pCL1920的具有低拷贝数的质粒(低拷贝质粒)(Lerner,C.G.andInouye,M.,Nucl.AcidsRes.(1990)18:4631[PMID:2201955])。空质粒pME101具有lacIq基因，其编码lac阻遏物的高度表达的等位基因。基因thra*1克隆在强trc启动子的下游，其可以被Lac阻遏物阻遏。其编码来自大肠杆菌的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶ThrA的反馈抗性变体。在其之后同一方向是基因cysE及其天然启动子。其编码来自大肠杆菌的丝氨酸乙酰转移酶。在cysE下游，是来自大肠杆菌的强gapA启动子，其控制基因metA*11的表达。metA*11编码来自大肠杆菌的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的反馈抗性变体。
作为分泌或产生L-甲硫氨酸的进一步微生物的例子，可以提及下列菌株：
-谷氨酸棒杆菌M1179(=DSM17322)(WO2007/011939)
-大肠杆菌TF4076BJFmetA#10+metYX(Lm)(WO2008/127240;page46)
-大肠杆菌W3110ΔJ/pKP451(EP1445310B1,page7ex.4)
-大肠杆菌WΔthrBCΔmetJmetK32pMWPthrmetA4Δ5Δ9(YoshihiroUsudaandOsamuKurahashi,2005,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,vol.71,no.6,p.3228-3234)
-W3110/pHC34(WO01/27307page13,ex.3)。
各种合适微生物的进一步的例子描述于Gomesetal.(EnzymeandMicrobialTechnology37(2005)，3-18)。
在进一步优选的实施方案中，生产L-甲硫氨酸的细菌具有选自下组的一或多个特征：
1)过表达的编码硫代硫酸/硫酸转运系统CysPUWA(EC3.6.3.25)的一或多种成分的多核苷酸，
2)过表达的编码3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸还原酶CysH(EC1.8.4.8)的多核苷酸，
3)过表达的编码亚硫酸还原酶CysJI(EC1.8.1.2)的一或多种成分的多核苷酸，
4)过表达的编码半胱氨酸合酶ACysK(EC2.5.1.47)的多核苷酸，
5)过表达的编码半胱氨酸合酶BCysM(EC2.5.1.47)的多核苷酸，
6)过表达的编码丝氨酸乙酰转移酶CysE(EC2.3.1.30)的多核苷酸，
7)过表达的编码甘氨酸裂解系统GcvTHP-Lpd(EC2.1.2.10,EC1.4.4.2,EC1.8.1.4)的一或多种成分的多核苷酸，
8)过表达的编码硫辛酰合酶LipA(EC2.8.1.8)的多核苷酸，
9)过表达的编码硫辛酰蛋白连接酶LipB(EC2.3.1.181)的多核苷酸，
10)过表达的编码磷酸甘油酸脱氢酶SerA(EC1.1.1.95)的多核苷酸，
11)过表达的编码3-磷酸丝氨酸磷酸酶SerB(EC3.1.3.3)的多核苷酸，
12)过表达的编码3-磷酸丝氨酸/磷酸羟基苏氨酸转氨酶SerC(EC2.6.1.52)的多核苷酸，
13)过表达的编码丝氨酸羟甲基转移酶GlyA(EC2.1.2.1)的多核苷酸，
14)过表达的编码天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶IThrA(EC2.7.2.4,EC1.1.1.3)的多核苷酸，
15)过表达的编码天冬氨酸激酶LysC(EC2.7.2.4)的多核苷酸，
16)过表达的编码高丝氨酸脱氢酶Hom(EC1.1.1.3)的多核苷酸，
17)过表达的编码高丝氨酸O-乙酰转移酶MetX(EC2.3.1.31)的多核苷酸，
18)过表达的编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶MetA(EC2.3.1.46)的多核苷酸，
19)过表达的编码胱硫醚→-合酶MetB(EC2.5.1.48)的多核苷酸，
20)过表达的编码β-C-S-裂合酶AecD(EC4.4.1.8,也称为β-裂合酶)的多核苷酸，
21)过表达的编码胱硫醚β-裂合酶MetC(EC4.4.1.8)的多核苷酸，
22)过表达的编码B12-不依赖性高半胱氨酸S-甲基转移酶MetE(EC2.1.1.14)的多核苷酸，
23)过表达的编码B12-依赖性高半胱氨酸S-甲基转移酶MetH(EC2.1.1.13)的多核苷酸，
24)过表达的编码亚甲基四氢叶酸还原酶MetF(EC1.5.1.20)的多核苷酸，
25)过表达的编码来自谷氨酸棒杆菌的L-甲硫氨酸输出蛋白(exporter)BrnFE的一或多种成分的多核苷酸，
26)过表达的编码来自大肠杆菌的缬氨酸输出蛋白YgaZH的一或多种成分(b2682,b2683)的多核苷酸，
27)过表达的编码来自大肠杆菌推定的转运蛋白YjeH(b4141)的多核苷酸，
28)过表达的编码吡啶核苷酸转氢酶PntAB(EC1.6.1.2)的一或多种成分的多核苷酸，
29)过表达的编码O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶MetZ(EC2.5.1.48)的多核苷酸，
30)过表达的编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶Pyc(EC4.1.1.31)的多核苷酸。
此处优选的特征是选自下组的一或多个特征：
1)过表达的编码硫代硫酸盐/硫酸盐转运系统CysPUWA(EC3.6.3.25)的一或多种成分的多核苷酸，
2)过表达的编码3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸还原酶CysH(EC1.8.4.8)的多核苷酸，
3)过表达的编码亚硫酸还原酶CysJI(EC1.8.1.2)的一或多种成分的多核苷酸，
4)过表达的编码半胱氨酸合酶ACysK(EC2.5.1.47)的多核苷酸，
5)过表达的编码半胱氨酸合酶BCysM(EC2.5.1.47)的多核苷酸，
6)过表达的编码丝氨酸乙酰转移酶CysE(EC2.3.1.30)的多核苷酸，
7)过表达的编码甘氨酸裂解系统GcvTHP-Lpd(EC2.1.2.10,EC1.4.4.2,EC1.8.1.4)的一或多种成分的多核苷酸过表达的编码的多核苷酸，
8)过表达的编码硫辛酰合酶LipA(EC2.8.1.8)的多核苷酸，
9)过表达的编码硫辛酰蛋白连接酶LipB(EC2.3.1.181)的多核苷酸，
10)过表达的编码磷酸甘油酸脱氢酶SerA(EC1.1.1.95)的多核苷酸，
11)过表达的编码3-磷酸丝氨酸磷酸酶SerB(EC3.1.3.3)的多核苷酸，
12)过表达的编码3-磷酸丝氨酸/磷酸羟基苏氨酸转氨酶SerC(EC2.6.1.52)的多核苷酸，
13)过表达的编码丝氨酸羟甲基转移酶GlyA(EC2.1.2.1)的多核苷酸，
14)过表达的编码天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶IThrA(EC2.7.2.4,EC1.1.1.3)的多核苷酸，
15)过表达的编码天冬氨酸激酶LysC(EC2.7.2.4)的多核苷酸，
16)过表达的编码高丝氨酸脱氢酶Hom(EC1.1.1.3)的多核苷酸，
17)过表达的编码高丝氨酸乙酰转移酶MetX(EC2.3.1.31)的多核苷酸，
18)过表达的编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶MetA(EC2.3.1.46)的多核苷酸，
19)过表达的编码胱硫醚→-合酶MetB(EC2.5.1.48)的多核苷酸，
20)过表达的编码β-C-S-裂合酶AecD(EC4.4.1.8,也称为β-裂合酶)的多核苷酸，
21)过表达的编码胱硫醚β-裂合酶MetC(EC4.4.1.8)的多核苷酸，
22)过表达的编码B12-不依赖性高半胱氨酸S-甲基转移酶MetE(EC2.1.1.14)的多核苷酸，
23)过表达的编码B12-依赖性高半胱氨酸S-甲基转移酶MetH(EC2.1.1.13)的多核苷酸，
24)过表达的编码亚甲基四氢叶酸还原酶MetF(EC1.5.1.20)的多核苷酸。
此处非常特别优选的特征选自下组：
1)过表达的编码天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶IThrA(EC2.7.2.4,EC1.1.1.3)的多核苷酸，
2)过表达的编码天冬氨酸激酶LysC(EC2.7.2.4)的多核苷酸，
3)过表达的编码高丝氨酸脱氢酶Hom(EC1.1.1.3)的多核苷酸，
4)过表达的编码高丝氨酸乙酰转移酶MetX(EC2.3.1.31)的多核苷酸，
5)过表达的编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶MetA(EC2.3.1.46)的多核苷酸，
6)过表达的编码胱硫醚→-合酶MetB(EC2.5.1.48)的多核苷酸，
7)过表达的编码β-C-S-裂合酶AecD(EC4.4.1.8,也称为β-裂合酶)的多核苷酸，
8)过表达的编码胱硫醚β-裂合酶MetC(EC4.4.1.8)的多核苷酸，
9)过表达的编码B12-不依赖性高半胱氨酸S-甲基转移酶MetE(EC2.1.1.14)的多核苷酸，
10)过表达的编码B12-依赖性高半胱氨酸S-甲基转移酶MetH(EC2.1.1.13)的多核苷酸，
11)过表达的编码亚甲基四氢叶酸还原酶MetF(EC1.5.1.20)的多核苷酸。
为改良谷氨酸棒杆菌中的L-甲硫氨酸生产，有利的是弱化选自下组的一或多个基因：
a)编码葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi,ECno.5.3.1.9)的基因pgi,
b)编码高丝氨酸激酶(ThrB,ECno.2.7.1.39)的基因thrB,
c)编码S-腺苷甲硫氨酸合酶(MetK,ECno.2.5.1.6)的基因metK,
d)编码二氢吡啶二羧酸合酶(DapA,ECno.4.2.1.52)的基因dapA,
e)编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Pck,ECno.4.1.1.49)的基因pck,
f)编码胱硫醚γ-裂合酶(Cg3086,ECno.4.4.1.1)的基因cg3086,
g)编码胱硫醚β-合酶(Cg2344,ECno.4.2.1.22)的基因cg2344,
h)编码调节蛋白Cg3031的基因cg3031,
i)编码L-甲硫氨酸生物合成的转录调节物(McbR)的基因mcbR,
j)编码L-甲硫氨酸转运蛋白(MetQNI)亚基的基因metQ,
k)编码L-甲硫氨酸转运蛋白(MetQNI)亚基的基因metN,
l)编码L-甲硫氨酸转运蛋白(MetQNI)亚基的基因metI,
m)编码L-甲硫氨酸转运蛋白(MetP)的基因metP。
为改良大肠杆菌中的L-甲硫氨酸生产，有利的是弱化选自下组的一或多个基因：
a)编码L-甲硫氨酸生物合成的转录调节物(MetJ)的基因metJ(b3938,ECK3930)，
b)编码葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi,ECno.5.3.1.9)的基因pgi(b4025,ECK4017)，
c)编码高丝氨酸激酶(ThrB,ECno.2.7.1.39)的基因thrB(b0003,ECK0003)，
d)编码S-腺苷甲硫氨酸合酶(MetK,ECno.2.5.1.6)的基因metK(b2942,ECK2937)，
e)编码二氢吡啶二羧酸合酶(DapA,ECno.4.2.1.52)的基因dapA(b2478,ECK2474)，
f)编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Pck,ECno.4.1.1.49)的基因pck(b3403,ECK3390)，
g)编码甲酰四氢叶酸水解酶(PurU,ECno.3.5.1.10)的基因purU(b1232,ECK1227)，
h)编码丙酮酸激酶II(PykA,ECno.2.7.1.40)的基因pykA(b1854,ECK1855)，
i)编码丙酮酸激酶I(PykF,ECno.2.7.1.40)的基因pykF(b1676,ECK1672)，
j)编码L-甲硫氨酸转运蛋白(MetQNI)亚基的基因metQ(b0197,ECK0197)，
k)编码L-甲硫氨酸转运蛋白(MetQNI)亚基的基因metI(b0198,ECK0198)，
l)编码L-甲硫氨酸转运蛋白(MetQNI)亚基的基因metN(b0199,ECK0199)，
m)编码脱氧胞苷5'-三磷酸脱氨酶(Dcd,ECno.3.5.4.13)的基因dcd(b2065,ECK2059)，
n)编码推定的N-酰基转移酶(YncA,MetabolicExplorerWO2010/020681)的基因yncA(b1448,ECK1442)，
o)编码调节性sRNAFnrS的基因fnrS(b4699,ECK4511)。
发明详述
本发明涉及发酵制备选自L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-高半胱氨酸和L-高胱氨酸的含硫氨基酸的方法。所述方法用过表达编码具有硫代硫酸硫转移酶酶活性的多肽的基因的肠杆菌科微生物或棒杆菌科微生物进行。
术语“基因”在本文是指脱氧核糖核酸(DNA)上的区段(section)，其含有用于首先产生(转录)核糖核酸(RNA)的信息，以及用于产生(翻译)蛋白质(多肽)的信息，在此，多肽具有硫代硫酸硫转移酶活性。基因或多核苷酸含有用于产生蛋白质的信息这个事实也称为蛋白质或多肽由基因或RNA编码。内源基因或多核苷酸是指存在于物种群体中的开放读框(ORF)、基因或等位基因或多核苷酸。术语“基因”和“ORF”(开放读框)在本发明中是同义词。
术语“多核苷酸”一般涉及多核糖核酸和多脱氧核糖核酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。
术语“多肽”是指含有两个或多个经肽键连接的氨基酸的肽或蛋白质。术语多肽和蛋白质是同义词。蛋白质属于所有细胞的基础单位。它们不仅赋予细胞结构，而且是转运物质、催化化学反应及识别信号物质的分子“机制”。
“蛋白质氨基酸”是指在天然蛋白质中即在微生物、植物、动物和人类蛋白质中发生的氨基酸。其特别包括L-氨基酸，选自L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸，以及硒代半胱氨酸。关于这一点，蛋白质氨基酸总是α-氨基酸。除了甘氨酸之外，对于所有蛋白质氨基酸而言，α-碳原子是不对称的(分子是手性的)：这些氨基酸每一种均存在两个对映异构体。关于这一点，两个对映异构体中仅一个是蛋白质氨基酸，事实上是L-氨基酸：构建蛋白质所需的机构-核糖体、tRNA、氨酰-tRNA合成酶(这将氨基酸负载在tRNA上)等-本身也是手性的并且仅可以识别L-变体。
术语“基因表达”(简称“表达”)一般是指遗传信息的表达以形成表型。在更窄意义上，基因表达是指基因转录为RNA及RNA随后翻译成多肽，所述多肽可具有酶活性。
术语“过表达”通常是指与起始菌株(亲代菌株)或野生型菌株相比核糖核酸、蛋白质或者酶的胞内浓度或活性的增加。在本发明中，编码硫代硫酸硫转移酶多肽的硫代硫酸硫转移酶基因或多核苷酸被过表达。
“起始菌株”(亲代菌株)是指在其上进行了如下措施的微生物菌株，所述措施为增加一或多种氨基酸、肽或蛋白质的产率的措施，或者增加一或多种酶的活性的措施(例如导致过表达的措施)。起始菌株可以是野生型菌株，也可以是先前已被修饰的菌株(例如生产菌株)。
细胞的“野生型“优选指其基因组在例如由进化而天然形成的状态的细胞。该术语针对整个细胞和针对个体基因而使用。因此，特别地，基因序列已人工通过重组方法至少部分修饰的那些细胞或那些基因不属于术语“野生型”范畴。
本发明中获得的突变体显示出与采用的起始菌株或亲代菌株相比在发酵方法中希望的氨基酸的分泌或产生增加。关于这一点，氨基酸释放进周围培养基中或者累积在细胞中(累积)。
术语“增加”或者“增加的活性”描述了微生物中由相应DNA编码的一或多种酶的胞内酶活性增加。
原则上，酶活性的增加可以例如通过增加编码酶的基因序列的拷贝数、使用强启动子或使用编码具有增加的活性的相应酶的基因或等位基因及任选组合这些措施而实现。根据本发明遗传修饰的细胞例如通过用含有希望的基因、该基因的等位基因或其部分的载体及赋予所述基因的可能表达的载体转化、转导、接合或这些方法的组合而产生。异源表达特别通过将基因或等位基因整合进细胞染色体中或染色体外复制载体而实现。
DE-A-10031999给出了以丙酮酸羧化酶为例增加细胞中酶活性的可能性的概况，该文献引入本文做参考，并且其针对增加细胞中的酶活性的可能性的公开内容组成本发明公开的一部分。
酶活性的增加可以例如通过增加染色体或染色体外相应多核苷酸的拷贝数至少一个拷贝而实现。
一种广泛使用的增加拷贝数的方法包括将相应多核苷酸掺入由细菌复制的载体优选质粒。
适合肠杆菌科的质粒载体是例如衍生自pACYC184(Bartoloméetal.;Gene102:75-78(1991))，pTrc99A(Amannetal.;Gene69:301-315(1988))或pSC101衍生物(VockeandBastia;ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80(21):6557-6561(1983))的载体。衍生自pCL1920的质粒(Lerner,C.G.andInouye,M.,Nucl.AcidsRes.(1990)18:4631[PMID:2201955])是进一步特别合适的。衍生自细菌人工染色体(BAC)的质粒载体例如pCC1BAC(EPICENTREBiotechnologies,Madison,USA)同样适合在大肠杆菌中增加相应多核苷酸的拷贝数。
适合谷氨酸棒杆菌的质粒载体是例如pZ1(Menkeletal.,AppliedandEnvironmentalMicrobiology64:549-554(1989))，pEKEx1(Eikmannsetal.,Gene107:69-74(1991))或pHS2-1(Sonnenetal.,Gene107:69-74(1991))。它们基于隐蔽性质粒pHM1519、pBL1或pGA1。其它质粒载体例如基于pCG4(US4,489,160)或pNG2(Serwold-Davisetal.,FEMSMicrobiologyLetters66:119-124(1990))或pAG1(US5,158,891)的那些质粒载体可以以相同方式被采用。关于谷氨酸棒杆菌中的质粒的概述文章见Tauchetal.(JournalofBiotechnology104,27-40(2003))。
转座子、插入元件(IS元件)或者噬菌体可以进一步用作载体。这种遗传系统描述于例如专利说明书US4,822,738、US5,804,414和US5,804,414。WO92/02627中描述的IS元件ISaB1或者质粒pXZ10142的转座子Tn45(参见"HandbookofCorynebacteriumglutamicum"(编辑:L.EggelingandM.Bott))可以相同方式被采用。
用于实现过表达的另一种普遍方法是染色体基因扩增方法。在这种方法中，至少一个额外拷贝的感兴趣多核苷酸被插入细菌染色体中。这种扩增方法例如在WO03/014330或WO03/040373中描述。
另一个实现过表达的方法包括将相应的基因或等位基因以功能方式连接(可操作连接)于启动子或表达盒。谷氨酸棒杆菌的合适启动子描述于例如Pateketal.(JournalofBiotechnology104(1-3)，311-323(2003))的综述文章的图1。Vasicovaetal.(JournalofBacteriology181,6188-6191(1999))描述的dapA启动子的变体例如启动子A25可以相同方式被采用。可进一步使用谷氨酸棒杆菌的gap启动子(EP06007373)。
对于大肠杆菌，例如Amannetal.(Gene69(2)，301-315(1988))和AmannandBrosius(Gene40(2-3)，183-190(1985))描述的启动子T3、T7、SP6、M13、lac、tac和trc是已知的，其中一些也可用于谷氨酸棒杆菌。这种启动子可以被插入例如感兴趣基因的上游，距离典型地为从起始密码子大约1-500个核碱基。US5,939,307报道通过将表达盒或启动子例如tac启动子、trp启动子、lpp启动子或者噬菌体λ的PL启动子和PR启动子掺入例如染色体苏氨酸操纵子的上游，可以实现表达增加。噬菌体T7的启动子、gear-box启动子或者nar启动子可以相同方式应用。这种表达盒或启动子也可以用于过表达质粒结合型(plasmid-bound)基因，如EP0593792所述。通过使用lacIQ等位基因，质粒结合型基因的表达可以由此被控制(GlascockandWeickert,Gene223,221-231(1998))。启动子的活性可以进一步通过一或多个核苷酸交换、插入和/或缺失修饰它们的序列而增加。
通过过表达措施，相应多肽的活性或浓度通常基于采取过表达措施之前相应起始菌株(野生型或起始微生物)的多肽的活性或浓度增加至少10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400%或500%,最大高达1,000%或2,000%。
确定硫代硫酸硫转移酶酶活性的方法描述于例如ChengH,DonahueJL,BattleSE,RayWK,LarsonTJ,2008,OpenMicrobiolJ.,2:18-28以及AlexanderK.,VoliniM,1987,J.Biol.Chem.,262:6595-6604。
上述酶或基因的表达可以借助于1维或2维蛋白质凝胶分离及随后用合适评估软件光学鉴别凝胶中的蛋白质浓度而检测。如果酶活性增加绝对基于相应基因表达的增加，则酶活性增加可以通过简单比较野生型和遗传修饰的细胞之间的1维或2维蛋白质分离而量化。在细菌情况中制备蛋白质凝胶和鉴别蛋白质的方法是Hermannetal.(Electrophoresis,22:1712.23(2001))描述的方法。蛋白质浓度的分析同样可以用特异于待检测蛋白质的抗体进行western印迹杂交(Sambrooketal.,MolecularCloning:alaboratorymanual,2nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NYUSA,1989)及随后用确定浓度的合适软件进行光学评估(LohausandMeyer(1989)Biospektrum,5:32-39;Lottspeich(1999)，AngewandteChemie111:2630-2647)。结合DNA的蛋白质的活性可以通过DNA条带迁移测定(也称为凝胶阻滞；Wilsonetal.(2001)JournalofBacteriology,183:2151-2155)而测量。结合DNA的蛋白质对其它基因的表达的作用可以通过报道基因测定的各种熟知方法检测(Sambrooketal.,MolecularCloning:alaboratorymanual,2nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NYUSA,1989)。胞内酶活性可以用已描述的各种方法确定(Donahueetal.(2000)JournalofBacteriology182(19):5624-5627;Rayetal.(2000)JournalofBacteriology182(8):2277-2284;Freedbergetal.(1973)JournalofBacteriology115(3):816-823)。如果以下未给出确定特定酶的活性的具体方法，则酶活性增加的确定以及酶活性降低的确定优选通过Hermannetal.,Electophoresis,22:1712-23(2001)，Lohausetal.,Biospektrum532-39(1998)，Lottspeich,AngewandteChemie111:2630-2647(1999)及Wilsonetal.,JournalofBacteriology183:2151-2155(2001)描述的方法进行。
如果酶活性增加是通过内源基因突变实现的，则这种突变可以通过传统方法以非靶向方式产生，例如通过UV照射或者突变诱导突变的化学物质产生，或者以靶向方式通过基因工程方法如缺失、插入和/或核苷酸交换而产生。通过这些突变获得遗传修饰的细胞。特别优选的酶突变体特别是那些可以不再是反馈抑制的或者至少可以是反馈抑制程度比野生型酶低的酶。
如果酶活性增加是由增加酶表达实现的，则例如相应基因的拷贝数是增加的，或者位于结构基因上游的启动子和调节区或者核糖体结合位点被突变。掺入结构基因上游的表达盒以相同方式起作用。通过诱导型启动子另外可以在任何希望的时间点增加表达。但是，另外可以将所谓的增强子作为调节序列赋予酶基因，它们同样具有经RNA聚合酶和DNA之间改善的相互作用而增加基因表达的作用。通过延长mRNA寿命的措施也可以改善表达。可进一步通过防止酶蛋白降解而增加酶活性。关于这一点，基因或基因构建体以不同拷贝数存在于质粒中，或者整合进染色体并且扩增。或者，感兴趣基因的过表达可以进一步通过修饰培养基组成和培养程序而实现。关于这一点的指导本领域技术人员可以特别在如下文献中找到：Martinetal.(Bio/Technology5,137-146(1987))，Guerreroetal.(Gene138,35-41(1994))，TsuchiyaandMorinaga(Bio/Technology6,428-430(1988))，Eikmannsetal.(Gene102,93-98(1991))，EP-A-0472869,US4,601,893,SchwarzerandPühler(Bio/Technology9,84-87(1991))，Reinscheidetal.(AppliedandEnvironmentalMicrobiology60,126-132(1994))，LaBarreetal.(JournalofBacteriology175,1001-1007(1993))，WO-A-96/15246,Malumbresetal.(Gene134,15-24(1993))，JP-A-10-229891,JensenandHammer(BiotechnologyandBioengineering58,191-195(1998))以及已知的遗传学和分子生物学教科书。上述措施像突变样导致遗传修饰的细胞。
通过整合进染色体中进行基因扩增方法使用的质粒载体也是适合的，例如Reinscheidetal.(AppliedandEnvironmentalMicrobiology60:126-132(1994))描述的用于倍增或扩增hom-thrB操纵子的质粒载体。在这个方法中，完整基因被克隆进可以在宿主(典型地大肠杆菌)中复制但是不在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒载体中。可能的载体例如是pSUP301(Simonetal.,Bio/Technology1:784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(etal.,Gene145:69-73(1994))，pGEM-T(PromegaCorporation,Madison,Wisconsin,USA)，pCR2.1-TOPO(Shuman,JournalofBiologicalChemistry269:32678-84(1994))，pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen,Groningen,TheNetherlands)，pEM1(Schrumpfetal.,JournalofBacteriology173:4510-4516))或者pBGS8(Sprattetal.,Gene41:337-342(1986))。含有待扩增基因的质粒载体然后通过接合或转化转到谷氨酸棒杆菌的希望菌株中。接合方法例如在etal.,AppliedandEnvironmentalMicrobiology60:756-759(1994)中描述。转化方法例如在Thierbachetal.,AppliedMicrobiologyandBiotechnology29:356-362(1988)，DunicanandShivnan,Bio/Technology7:1067-1070(1989)和Tauchetal.,FEMSMicrobiologyLetters123:343-347(1994)中描述。通过交换事件同源重组后，所得菌株含有至少两个拷贝的感兴趣基因。针对大肠杆菌的类似方法在Link,A.J.,Phillips,D.andChurch,G.M.(1997)，J.Bacteriology179:6228-6237中描述。
对于DNA在染色体中的插入或缺失，也可以使用重组酶介导的方法，例如由DatsenkoKA,WannerBL.,2000,ProcNatlAcadSciUSA.,97(12):6640-5描述的方法。
上述和下述使用的表述“与其野生型菌株或起始菌株相比酶活性增加”优选是指特定酶活性增加至少2倍、特别优选至少10倍、更优选至少100倍、还更优选至少1000倍、最优选至少10000倍。具有“与其野生型菌株或起始菌株相比增加的酶活性”的本发明细胞进一步还特别包括这样的细胞，其野生型或起始菌株不具有这个酶的活性或者至少不具有这个酶的可检测到的活性，并且其仅在例如通过过表达增加酶活性后才显示出这个酶的可检测到的活性。关于这一点，下述使用的术语“过表达”或者“表达增加”还包括这样的情况，其中起始细胞例如野生型细胞不具有酶表达或者至少不具有可检测到的酶表达，并且可检测到的酶表达仅由重组方法诱导。
由本发明措施获得的分离的细菌显示出与采用的起始菌株或亲代菌株相比在发酵过程中希望的氨基酸的增加的分泌或产生。
分离的细菌是指已被分离或产生的本发明的突变体和重组细菌，其特别是肠杆菌科或棒杆菌科，并且与起始菌株相比具有增加的硫代硫酸硫转移酶活性。
基于起始菌株或亲代菌株或使用其的发酵方法，分离的细菌及使用其的发酵方法针对一或多种参数的输出(output)改善至少0.5%、至少1%、至少1.5%或至少2%，所述参数选自产物浓度(每体积产物)、产物收率(每消耗的碳源形成的产物)及产物形成(每体积和时间形成的产物)或者其它方法参数及其组合。
在本发明方法中，细菌可以连续培养，例如如PCT/EP2004/008882所述，或者以分批方法(分批培养)或者补料分批(补料方法)或者重复补料分批方法(重复补料方法)不连续培养，用于生产L-氨基酸。已知培养方法的通用性质的总结见教科书Chmiel(Bioprozesstechnik1.EinführungindieBioverfahrenstechnik(GustavFischerVerlag,Stuttgart,1991))或者教科书Storhas(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen(ViewegVerlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))。
使用的培养基或发酵培养基必须以合适方式满足特定菌株的需要。各种微生物的培养基的描述包括在手册"ManualofMethodsforGeneralBacteriology"oftheAmericanSocietyforBacteriology(WashingtonDC,USA,1981)中。术语培养基和发酵培养基可互换使用。
糖和碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、来自甜菜或蔗糖生产的含蔗糖溶液、淀粉、淀粉水解物和纤维素、油和脂肪如大豆油、葵花油、花生油和椰子油、脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸、醇如甘油、甲醇和乙醇以及有机酸如乙酸可以用作碳源。这些物质可以单独使用或者作为混合物使用。
有机含氮化合物如蛋白胨、酵母膏、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素，或者无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，可以用作氮源。氮源可以单独使用或者作为混合物使用。
磷酸、磷酸二氢钾或者磷酸氢二钾或者相应的含钠盐可以用作磷源。
根据本发明，采用的硫源是硫代硫酸的盐(硫代硫酸盐)，任选地与其它硫源一起，如硫酸盐、亚硫酸盐或连二亚硫酸盐。
培养基必须进一步含有生长所需的金属例如钠、钾、镁、钙和铁的盐，例如氯化物形式的盐，例如硫酸镁或硫酸铁。最终，除了上述物质以外还可以采用必需生长物质如氨基酸例如高丝氨酸和维生素例如硫胺素、生物素或泛酸。
特定氨基酸的合适前体可以另外加入到培养基中。
所述起始物质可以以单批形式加入到培养物中，或者可以在培养期间以合适方式补料。
可以以合适方式采用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或者酸性化合物如磷酸或硫酸以控制培养物的pH。pH通常调节至6.0-9.0，优选6.5-8。可以采用防沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯以控制泡沫产生。具有选择性作用的合适的物质例如抗生素可以加入到培养基中以保持质粒稳定性。为维持有氧条件，氧气或含氧气体混合物如空气被引入培养物中。使用富含过氧化氢的液体也是可以的。发酵任选地在增压下进行，例如在0.03-0.2MPa的压力下。培养温度通常是20℃-45℃，优选25℃-40℃。在分批方法中，培养持续到形成最大量的希望的氨基酸。这个目标通常在10小时至160小时内达到。在连续方法中，更长培养时间是可能的。
合适的发酵培养基特别描述于US6,221,636、US5,840,551、US5,770,409、US5,605,818、US5,275,940和US4,224,409。
确定L-氨基酸的方法是现有技术已知的。分析可以例如如Spackmanetal.(AnalyticalChemistry,30,(1958)，1190)所述经离子交换层析及随后茚三酮衍生化而进行，或者其可以如Lindrothetal.(AnalyticalChemistry(1979)51:1167-1174)所述经反相HPLC进行。
以此方式产生的发酵液然后被进一步加工成固体或液体产物。
发酵液是指其中已在一定温度培养微生物一定时间的发酵培养基。发酵期间采用的一种发酵培养基和/或多种培养基含有保证微生物繁殖和希望的氨基酸形成的所有物质和组分。
在发酵结束时，形成的发酵液由此含有a)作为微生物细胞繁殖结果形成的微生物的生物量，b)在发酵期间形成的希望的氨基酸，c)在发酵期间形成的有机副产物以及d)所采用的一种发酵培养基/多种发酵培养基的组分或者未被发酵消耗的起始物质的组分，例如维生素，如生物素、氨基酸如高丝氨酸、或者盐如硫酸镁。
有机副产物包括除了特定希望的L-氨基酸之外可能产生的并且可能由发酵中采用的微生物分泌的物质。这包括与希望的氨基酸相比组成小于30%、20%或10%的L-氨基酸。它们进一步包括携带一至三个羧基基团的有机酸，例如乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸或者延胡索酸。最后，它们也包括糖例如海藻糖。
适合工业目的的典型发酵液具有40g/kg-180g/kg或者50g/kg-150g/kg的氨基酸含量。生物量含量(作为干生物量)通常是20-50g/kg。
实施例
实施例1:合成及克隆RDL2基因
为表达来自酿酒酵母的ORFRDL2(SEQIDNO:1)，从头合成了包含上游序列(“upstream”,SEQIDNO:6)、ORFRDL2的序列("RDL2",SEQIDNO:1)及下游序列("downstream",SEQIDNO:7)的核苷酸序列(GENEARTAG;Regensburg,Germany)。上游序列含有限制酶PacI和FseI的识别序列和核糖体结合位点。下游序列含有第二个终止密码子TAA，后接来自大肠杆菌MG1655的rnpB基因的T1终止子。限制酶PmeI和SbfI的识别序列在此之后。合成后，核苷酸序列用SacI和KpnI裂解并克隆进同样用SacI和KpnI裂解的质粒pMA(ampR)中。所得质粒命名为"pMA-RDL2"(SEQIDNO:8,图1)。
从由ORFRDL2(序列"RDL2p",SEQIDNO:2)编码的蛋白质Rdl2p的氨基酸序列起始，产生编码具有野生型氨基酸序列的Rdl2p蛋白质的三种不同DNA序列。这些序列命名为"RDL2a"(SEQIDNO:3)，"RDL2b"(SEQIDNO:4)和"RDL2c"(SEQIDNO:5)。这三个序列各自与上述上游和下游序列一起从头合成并如上所述克隆进质粒pMA中(GENEARTAG;Regensburg,Germany)。所得质粒命名为pMA-RDL2a、pMA-RDL2b和pMA-RDL2c。所述变体在用于方法的微生物的密码子使用的优化方面不同。对密码子使用的适应值如下：
RDL2:密码子使用未适应(密码子适应指数CAI=0.27)
RDL2a:密码子使用轻度适应于大肠杆菌(CAI=0.38)
RDL2b:密码子使用更高度适应于大肠杆菌(CAI=0.72)
RDL2c:密码子使用完全适应于大肠杆菌(CAI=1)。
实施例2:将ORFRDL2、RDL2a、RDL2b和RDL2c克隆进质粒pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11
为了在大肠杆菌中表达，将编码RDL2蛋白的4种基因变体各自克隆进大肠杆菌生产质粒pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11(WO2007/077041)中metA*11的下游。
为此，基因各自用引物RDL2-t4-f(SEQIDNO:11)和RDL2-r(SEQIDNO:12)经聚合酶链反应(PCR)使用PhusionDNA聚合酶(FinnzymesOy,Espoo,Finland)扩增。来自实施例1的质粒pMA-RDL2,pMA-RDL2a、pMA-RDL2b和pMA-RDL2c用作模板。
RDL2-t4-f(SEQIDNO:11):
5'aggacagtcgacggtaccgcaagcttcggcttcgcACTGGAAAGCGGGCAGTGAG3'
RDL2-r(SEQIDNO:12):
5'AGCGCGACGTAATACGACTC3'
大小为804bp的PCR产物及质粒pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11用限制酶SalI和SbfI裂解，连接并转化大肠杆菌菌株DH5α。通过在含有50μg/ml链霉素的LB琼脂上培养选择携带质粒的细胞。分离质粒DNA后，通过用限制酶AgeI对照裂解而检测成功克隆。最终，克隆的DNA片段用下列引物测序：
pME-RDL2-Seqf(SEQIDNO:13):
5'ATGTGGAAGCCGGACTAGAC3'
pME-RDL2-Seqr(SEQIDNO:14):
5'TCGGATTATCCCGTGACAGG3'。
以此方式形成的质粒命名为pME-RDL2、pME-RDL2a、pME-RDL2b和pME-RDL2c。
实施例3：转化大肠杆菌MG1655ΔmetJPtrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP
产生L-甲硫氨酸的大肠杆菌菌株MG1655ΔmetJmetA*11Ptrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH(以下命名为DM2219)在专利申请WO2009/043803A2中描述。
所述菌株各自用质粒pME-RDL2、pME-RDL2a、pME-RDL2b和pME-RDL2c及用质粒pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11(WO2009/043803A2)转化，在含有50μg/ml链霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。转化体各自以转接种到10ml含有1%葡萄糖和50μg/ml链霉素的LB液体中，在37℃培养16小时。然后加入甘油至终浓度为10%，培养物在-70℃冷冻。
实施例4：评估大肠杆菌L-甲硫氨酸生产菌株
大肠杆菌L-甲硫氨酸生产菌株的生产率通过在100ml锥形瓶中的生产实验评估。作为预培养物，在每种情况中10ml预培养培养基(含有2.5g/l葡萄糖和90%PC1基本培养基的10%LB培养基)用100μl细胞培养物接种，培养物在37℃培养10小时。然后在每种情况中用10mlPC1基本培养基(表1)接种这些培养物，至OD600nm为0.2(EppendorfBio-Photometer;EppendorfAG,Hamburg,Germany)，并且在37℃培养24小时。胞外L-甲硫氨酸浓度用氨基酸分析仪(SykamGmbH,Eresing,Germany)经离子交换层析及具有茚三酮检测的柱后衍生化而确定。胞外葡萄糖浓度用YSI2700SelectGlucoseAnalyzer(YSILifeSciences,YellowSprings,Ohio,USA)确定。数据显示ORFRDL2、RDL2a、RDL2b或RDL2c的表达显著增加L-甲硫氨酸浓度(表2)。
表1:PC1基本培养基
物质 浓度
ZnSO4*7H2O 4mg/l
CuCl2*2H2O 2mg/l
MnSO4*H2O 20mg/l
CoCl2*6H2O 8mg/l
H3BO3 1mg/l
Na2MoO4*2H2O 0.4mg/l
MgSO4*7H2O 1g/l
Citric acid*1H2O 6.56g/l
CaCl2*2H2O 40mg/l
K2HPO4 8.02g/l
Na2HPO4 2g/l
(NH4)2HPO4 8g/l
NH4Cl 0.13g/l
(NH4)2SO3 5.6g/l
MOPS 5g/l
NaOH10M 调节至pH6.8
FeSO4*7H2O 40mg/l
盐酸硫胺素 10mg/l
维生素B12 10mg/l
葡萄糖 10g/l
异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG) 2.4mg/l
壮观霉素 50mg/l
表2:在各种携带质粒的E.coliDM2219菌株的发酵液中L-甲硫氨酸浓度
菌株 质粒 OD(600nm) L-甲硫氨酸(g/l)
DM2219 pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 7.51 0.43
DM2219 pME-RDL2 7.59 0.51
DM2219 pME-RDL2a 7.72 0.53
DM2219 pME-RDL2b 7.50 0.52
DM2219 pME-RDL2c 7.64 0.54
实施例5:将ORFRDL2、RDL2a、RDL2b和RDL2c克隆进质粒pEC-XT99A
作为在谷氨酸棒杆菌中表达ORFRDL2、RDL2a、RDL2b和RDL2c的基础载体，使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达质粒pEC-XT99A(EP1085094B1)。实施例1的质粒pMA-RDL2、pMA-RDL2a、pMA-RDL2b和pMA-RDL2c各自用限制酶StuI和NaeI裂解，并在0.8%浓度的琼脂糖凝胶上分离。将638bp大小的DNA片段从凝胶上切下并提取DNA(QIAquickGelExtractionKit,QIAGEN,Hilden,Germany)。表达质粒pEC-XT99A用限制酶Ecl136II裂解。然后使用Ready-To-Go连接试剂盒(AmershamGEHealthcareEuropeGmbH,Freiburg,Germany)在每种情况下用638bp大小的DNA片段进行连接。用连接混合物转化大肠杆菌菌株DH5α(InvitrogenGmbH;Darmstadt;Germany)，在含有5μg/ml四环素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。
分离质粒DNA后，通过用限制酶PmeI和SacII对照裂解而检测成功克隆。最终，质粒用下列引物测序：
pECf(SEQIDNO:9):
5'TACTGCCGCCAGGCAAATTC3'
pECr(SEQIDNO:10):
5'TTTGCGCCGACATCATAACG3'。
其中质粒自身trc启动子和编码RDL2的ORF具有相同方向的质粒构建体命名为如下：pEC-RDL2、pEC-RDL2a、pEC-RDL2b和pEC-RDL2c。
实施例6:转化谷氨酸棒杆菌M1179
谷氨酸棒杆菌菌株M1179是L-甲硫氨酸(WO2007/011939)的乙硫氨酸抗性生产菌。其在2005年5月18日根据布达佩斯条约保藏在德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungfürMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ),Braunschweig,Germany)，保藏号DSM17322。
根据Tauchetal.(1994,FEMSMicrobiologicalLetters,123:343-347)的电穿孔条件，将质粒pEC-RDL2、pEC-RDL2a、pEC-RDL2b、pEC-RDL2c和pEC-XT99A电穿孔进菌株M1179。
携带质粒的细胞的选择在含有5μg/ml四环素的LB琼脂上进行。分离转化体的质粒DNA(Peters-Wendischetal.,1998,Microbiology144,915-927)并用限制裂解及凝胶电泳检查。以此方式形成的菌株命名为M1179/pEC-RDL2、M1179/pEC-RDL2a、M1179/pEC-RDL2b、M1179/pEC-RDL2c和M1179/pEC-XT99A。
实施例7:评估谷氨酸棒杆菌L-甲硫氨酸生产菌株
产生的谷氨酸棒杆菌菌株M1179/pEC-RDL2、M1179/pEC-RDL2a、M1179/pEC-RDL2b、M1179/pEC-RDL2c和M1179/pEC-XT99A在适合生产L-甲硫氨酸的营养培养基中培养，确定培养物上清中的L-甲硫氨酸含量。
为此，菌株首先涂布到琼脂平板上(含有卡那霉素(25mg/l)的脑心琼脂)并且在33℃保温24小时。从这些琼脂平板培养物，在每种情况下将细胞转接种到10ml含有5mg/l四环素的BH培养基(Hirn-HerzBouillon,Merck,Darmstadt,Germany)中，培养物在100ml锥形瓶中在33℃和240rpm下振荡24小时。在每种情况下然后用这些培养物接种10mlPM培养基(表3)至OD660nm为0.1(Genios,TecanDeutschlandGmbH,Crailsheim,Germany)，并且在具有挡板的100ml锥形瓶中在33℃培养24小时。
表3:PM培养基
物质 浓度
葡萄糖 50g/l
(NH4)2S2O3 10g/l
(NH4)Cl 10g/l
MgSO4*7H2O 0.4g/l
KH2PO4 0.6g/l
酵母膏(Difco) 10g/l
FeSO4*7H2O 2mg/l
MnSO4*H2O 2mg/l
氨水 调节至pH7.8
硫胺素*HCl 1mg/l
维生素B12 0.2mg/l
生物素 0.1mg/l
吡哆醇*HCl(维生素B6) 5mg/l
苏氨酸 238mg/l
CaCO3 50g/l
四环素 5mg/l
异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG) 1mM
24小时后测定660nm的OD(Genios,TecanDeutschlandGmbH,Crailsheim,Germany)并且测量形成的L-甲硫氨酸浓度。L-甲硫氨酸用氨基酸分析仪(SykamGmbH,Eresing,Germany)经离子交换层析及具有茚三酮检测的柱后衍生化而确定。表4显示培养物的光密度及L-甲硫氨酸浓度。ORFRDL2、RDL2a、RDL2b或RDL2c的表达导致L-甲硫氨酸浓度显著增加。
表4:在各种携带质粒的谷氨酸棒杆菌M1179菌株的发酵液中的L-甲硫氨酸浓度
菌株 OD(600nm) L-甲硫氨酸(g/l)
M1179/pEC-XT99A 25.7 0.47
M1179/pEC-RDL2 25.8 0.50
M1179/pEC-RDL2a 24.1 0.50
M1179/pEC-RDL2b 26.2 0.55
M1179/pEC-RDL2c 24.5 0.54

Claims (14)

1.发酵制备选自L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-高半胱氨酸和L-高胱氨酸的含硫氨基酸的方法，包括步骤：
a)提供过表达编码具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽的基因的肠杆菌科微生物或棒杆菌科微生物，所述多肽由SEQIDNO:2所示氨基酸序列组成；
b)在含有无机硫源的培养基中发酵来自a)的微生物，获得发酵液，所述无机硫源来自硫代硫酸盐或者硫代硫酸盐和硫酸盐的混合物；和
c)浓缩来自b)的发酵液中的含硫氨基酸。
2.根据权利要求1的方法，其中通过选自下组的一或多种措施增加编码具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽的基因的表达：
a)所述基因的表达在启动子的控制下，所述启动子在用于所述方法的微生物中导致与起始菌株相比增加的表达；
b)与起始菌株相比增加编码具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽的基因的拷贝数，通过将所述基因以多个拷贝插入质粒中或者通过将所述基因以多个拷贝整合进微生物染色体中而进行；
c)通过使用核糖体结合位点实现所述基因的表达，所述核糖体结合位点导致与起始菌株相比在用于所述方法的微生物中的翻译增加；
d)通过针对用于所述方法的微生物优化密码子使用而增加所述基因的表达；
e)通过降低由所述基因转录的mRNA中的mRNA二级结构而增加所述基因的表达；
f)通过消除由所述基因转录的mRNA中的RNA聚合酶终止子而增加所述基因的表达；
g)通过使用由所述基因转录的mRNA中的mRNA稳定化序列而实现所述基因的表达。
3.根据权利要求1的方法，其中所述硫代硫酸盐是选自碱金属盐、碱土金属盐、铵盐及其混合物的盐。
4.根据权利要求1的方法，其中所述硫酸盐是选自碱金属盐、碱土金属盐、铵盐及其混合物的盐。
5.根据权利要求1的方法，其中在发酵期间将硫代硫酸盐的含量基于在培养基中和发酵液中无机硫的总含量保持在至少5mol％。
6.根据权利要求1的方法，其中所述含硫氨基酸是L-甲硫氨酸。
7.根据权利要求1的方法，其中所述微生物是埃希氏菌属。
8.根据权利要求7的方法，其中所述微生物物种是大肠杆菌(Escherichiacoli)。
9.根据权利要求1的方法，其中所述微生物是棒杆菌属。
10.根据权利要求9的方法，其中所述微生物物种是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
11.根据权利要求10的方法，其中所述微生物选自与起始菌株相比具有增加的天冬氨酸激酶活性和/或表达且调节蛋白McbR被弱化或缺失的谷氨酸棒杆菌。
12.根据权利要求8的方法，其中所述微生物选自与起始菌株相比具有增加的天冬氨酸激酶活性和/或表达且调节蛋白MetJ被弱化或缺失的大肠杆菌。
13.微生物，选自
-与起始菌株相比具有增加的天冬氨酸激酶活性和/或表达且调节蛋白McbR被弱化或缺失的谷氨酸棒杆菌；
-与起始菌株相比具有增加的天冬氨酸激酶活性和/或表达且调节蛋白MetJ被弱化或缺失的大肠杆菌；
其中所述微生物分泌或产生L-甲硫氨酸，其中所述微生物过表达编码具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽的基因，所述多肽由SEQIDNO:2所示氨基酸序列组成。
14.根据权利要求13的微生物，其中所述起始菌株衍生自选自如下组的微生物，所述的组由大肠杆菌MG1655、大肠杆菌W3110、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌DH10B、大肠杆菌BW2952、大肠杆菌REL606、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌R、谷氨酸棒杆菌DSM20411(先前名称黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum))、谷氨酸棒杆菌DSM20412(先前名称乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum))、谷氨酸棒杆菌DSM1412(先前名称乳发酵短杆菌)、CorynebacteriumefficiensYS-314T(DSM44549)、谷氨酸棒杆菌ATCC21608、谷氨酸棒杆菌DSM17322组成。
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2479279A1 (de) 2011-01-20 2012-07-25 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Aminosäuren
BR112013023465B1 (pt) * 2011-04-01 2020-10-27 Ajinomoto Co., Inc método para produzir l-cisteína
US9234223B2 (en) 2011-04-01 2016-01-12 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-cysteine
ES2689754T3 (es) * 2012-08-20 2018-11-15 Evonik Degussa Gmbh Procedimiento para la preparación fermentativa de L-aminoácidos utilizando cepas mejoradas de la familia Enterobacteriaceae
EP2762571A1 (de) * 2013-01-30 2014-08-06 Evonik Industries AG Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren
BR112016004367B1 (pt) 2013-08-30 2022-06-14 Evonik Operations Gmbh Microrganismo recombinante e método para a produção fermentativa de metionina e/ou seus derivados
RU2678757C2 (ru) * 2013-08-30 2019-01-31 Эвоник Дегусса Гмбх Микроорганизмы для производства метионина с улучшенным выходом метионина
WO2015033849A1 (ja) * 2013-09-04 2015-03-12 国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学 Ｌ―システインの製造方法
CN104629768B (zh) * 2015-01-22 2017-12-15 河海大学 一种降低滩涂盐碱地土壤碱性的微生物制品
CN108026516A (zh) 2015-08-07 2018-05-11 赢创德固赛有限公司 通过发酵的蛋白硫代羧化物依赖性l-甲硫氨酸生产
ES2748226T3 (es) 2015-11-27 2020-03-16 Evonik Operations Gmbh Procedimiento de producción de L-metionina
RU2018128142A (ru) 2016-01-08 2020-02-10 Эвоник Дегусса Гмбх Способ получения l-метионина по ферментативной технологии
KR102430878B1 (ko) 2016-07-08 2022-08-09 메타볼릭 익스플로러 당 포스포트랜스퍼라제 시스템 (pts)을 코딩하는 유전자를 포함하는 미생물에 의한 관심 분자의 발효적 생산을 위한 방법
KR102605543B1 (ko) 2017-07-11 2023-11-22 아디쎄오 프랑스 에스에이에스 메티오닌-생산 효모
CN108486133B (zh) * 2018-06-29 2021-06-01 江南大学 一种l-丝氨酸转运蛋白的应用方法
KR102472558B1 (ko) * 2019-06-28 2022-12-01 씨제이제일제당 주식회사 황 함유 아미노산 또는 그 유도체 제조방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001027307A1 (de) * 1999-10-14 2001-04-19 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Verfahren zur fermentativen herstellung von l-cystein oder l-cystein-derivaten
WO2007077041A1 (en) * 2006-01-04 2007-07-12 Metabolic Explorer Process for the preparation of methionine and its precursors homoserine or succinylhomoserine employing a microorganism with enhanced sulfate permease expression
WO2007135188A2 (en) * 2006-05-24 2007-11-29 Evonik Degussa Gmbh Process for the preparation of l-methionine
WO2009043803A2 (en) * 2007-10-02 2009-04-09 Metabolic Explorer Increasing methionine yield

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS54105293A (en) 1978-02-01 1979-08-18 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-proline by fermentation
JPS5835197A (ja) 1981-08-26 1983-03-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd プラスミドｐｃｇ２
US4601893A (en) 1984-02-08 1986-07-22 Pfizer Inc. Laminate device for controlled and prolonged release of substances to an ambient environment and method of use
EP0158940B1 (en) 1984-04-04 1991-12-11 Ajinomoto Co., Inc. Transducible composite plasmid
GB2165546B (en) 1984-08-21 1989-05-17 Asahi Chemical Ind A plasmid containing a gene for tetracycline resistance and dna fragments derived therefrom
FR2665711B1 (fr) 1990-08-08 1993-08-13 Centre Nat Rech Scient Integron de corynebacterie, procede de transformation d'une corynebacterie par ledit integron et corynebacterie obtenue.
DE4027453A1 (de) 1990-08-30 1992-03-05 Degussa Neue plasmide aus corynebacterium glutamicum und davon abgeleitete plasmidvektoren
JP3023615B2 (ja) 1990-08-30 2000-03-21 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ―トリプトファンの製造法
DE4130867A1 (de) 1991-09-17 1993-03-18 Degussa Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeuren
DE69219775T3 (de) 1992-10-14 2004-08-05 Ajinomoto Co., Inc. Neuartiges L-threoninproduzierendes Mikrobakterium und eine Herstellungsmethode für L-Threonin
JP3369231B2 (ja) 1992-12-03 2003-01-20 協和醗酵工業株式会社 芳香族アミノ酸の製造法
DE4440118C1 (de) 1994-11-11 1995-11-09 Forschungszentrum Juelich Gmbh Die Genexpression in coryneformen Bakterien regulierende DNA
FR2736066B1 (fr) 1995-06-30 1998-11-20 Ajinomoto Kk Procede d'amplification d'un gene par transposon artificiel, bacterie coryneforme obtenue par ce procede et procede de production d'un acide amine a l'aide de cette bacterie
DE19547361A1 (de) 1995-12-19 1997-06-26 Degussa Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Fermentation
US5939307A (en) 1996-07-30 1999-08-17 The Archer-Daniels-Midland Company Strains of Escherichia coli, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for l-threonine production
JP4075087B2 (ja) 1996-12-05 2008-04-16 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
JPH10229891A (ja) 1997-02-20 1998-09-02 Mitsubishi Rayon Co Ltd マロン酸誘導体の製造法
US6831165B1 (en) 1999-06-25 2004-12-14 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in homeostasis and adaptation
DE10031999A1 (de) 1999-09-09 2001-04-19 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE19943587A1 (de) 1999-09-11 2001-03-15 Degussa Neue für das dapF-Gen codierende Nukleotidsequenzen
US6942996B2 (en) 2000-08-02 2005-09-13 Degussa Ag Isolated polynucleotide from Corynebacterium encoding a homocysteine methyltransferase
US6958228B2 (en) 2000-08-02 2005-10-25 Degussa Ag Nucleotide sequence which code for the metH gene
US6815196B2 (en) 2000-09-02 2004-11-09 Degussa Ag Nucleotide sequences encoding o-succinylhomoserine sulfhydrylase
RU2215784C2 (ru) * 2001-06-28 2003-11-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АМИНОКИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ)
DE60219969T2 (de) 2001-02-13 2008-01-17 Ajinomoto Co., Inc. Methode zur Production von L-Aminosäuren mittels Bakterien der Gattung Escherichia
CA2455878A1 (en) 2001-08-06 2003-05-15 Degussa Ag Production of l-lysine by genetically modified corynebacterium glutamicum strains
AU2002355462A1 (en) 2001-08-06 2003-02-24 Degussa Ag Coryneform bacteria which produce chemical compounds ii
DE10145043A1 (de) 2001-09-13 2003-04-03 Degussa Verfahren und Herstellung von Feinchemikalien
DE10154292A1 (de) 2001-11-05 2003-05-15 Basf Ag Gene die für Stoffwechselweg-Proteine codieren
DE10154181A1 (de) 2001-11-05 2003-05-15 Basf Ag Gene die für Stressresistenz-und Toleranz-Proteine codieren
KR20050084390A (ko) 2002-12-20 2005-08-26 메타노믹스 게엠베하 운트 코. 카게아아 아미노산의 제조 방법
DE10305774A1 (de) 2003-02-06 2004-08-26 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Methionin
RU2275425C2 (ru) * 2003-11-03 2006-04-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-цистеина и способ получения l-цистеина
KR100651220B1 (ko) 2004-06-29 2006-11-29 씨제이 주식회사 Ｌ-메씨오닌 생산 균주 및 상기 균주를 이용한ｌ-메씨오닌의 생산방법
WO2006099184A2 (en) 2005-03-10 2006-09-21 The Regents Of The University Of California Method of diagnosing gum disease-wound healing using single nucleotide polymorphism profiles
US8399214B2 (en) 2005-07-18 2013-03-19 Evonik Degussa Gmbh Use of dimethyl disulfide for methionine production in microoraganisms
WO2007020295A2 (en) 2005-08-18 2007-02-22 Basf Ag Microorganisms with increased efficiency for methionine synthesis
DE102005047596A1 (de) 2005-10-05 2007-04-12 Degussa Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE102007007333A1 (de) 2007-02-14 2008-08-21 Wacker Chemie Ag Verfahren zur Reinigung von L-Cystein
ES2575906T3 (es) 2007-04-11 2016-07-04 Cj Cheiljedang Corporation Composiciones y métodos de producir metionina
US20110111458A1 (en) 2008-03-18 2011-05-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Industrially useful microorganism
US8163532B2 (en) 2008-05-28 2012-04-24 Evonik Degussa Gmbh Microorganisms with a reactivation system for cob(I)alamin-dependent methionine synthase
WO2010020290A1 (en) 2008-08-22 2010-02-25 Metabolic Explorer Producing methionine without n-acetyl methionine
EP2479279A1 (de) 2011-01-20 2012-07-25 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Aminosäuren

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001027307A1 (de) * 1999-10-14 2001-04-19 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Verfahren zur fermentativen herstellung von l-cystein oder l-cystein-derivaten
WO2007077041A1 (en) * 2006-01-04 2007-07-12 Metabolic Explorer Process for the preparation of methionine and its precursors homoserine or succinylhomoserine employing a microorganism with enhanced sulfate permease expression
WO2007135188A2 (en) * 2006-05-24 2007-11-29 Evonik Degussa Gmbh Process for the preparation of l-methionine
WO2009043803A2 (en) * 2007-10-02 2009-04-09 Metabolic Explorer Increasing methionine yield

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dorothea Kessler et al..Enzymatic activation of sulfur for incorporation into biomolecules in prokaryotes.《FEMS MICROBIOLOGY REVIEWS》.2006,第30卷(第6期),825-840. *
Dujon,B. et al..Rdl2p [Saccharomyces cerevisiae S288c].《GenBank登录号：NP_014929.1》.2010,1-2. *
Dujon,B.et al..Saccharomyces cerevisiae S288c Protein with rhodanese activity.《GenBank登录号： NM_001183705.1》.2010,1-2. *

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Publication number Publication date
WO2012098042A1 (de) 2012-07-26
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US20120190084A1 (en) 2012-07-26
US9062332B2 (en) 2015-06-23
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JP6053691B2 (ja) 2016-12-27
RU2013138472A (ru) 2015-02-27
ES2651631T3 (es) 2018-01-29
PL2665826T3 (pl) 2018-03-30
BR112013017109B1 (pt) 2021-05-18
JP2014504875A (ja) 2014-02-27
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