ES2748226T3 - Procedimiento de producción de L-metionina - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para producir L-metionina, en el que un microorganismo que tiene actividad de L-homoserina Oacetiltransferasa y actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa se cultiva en un medio de cultivo que comprende L-homoserina y una fuente de azufre, seleccionada del grupo que consiste en metilmercaptano, una sal de metilmercaptano y disulfuro de dimetilo, mediante el que se acumula L-metionina en el medio de cultivo.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de producción de L-metionina
La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de L-metionina, en el que un microorganismo que tiene actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa y actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa se cultiva en presencia de L-homoserina y metilmercaptano, una sal del mismo o disulfuro de dimetilo, mediante el que se acumula la L-metionina en el medio de cultivo.
El aminoácido metionina se produce actualmente industrialmente en todo el mundo en grandes cantidades y tiene una importancia comercial considerable. La metionina se emplea en muchos campos, tales como productos farmacéuticos, para la salud y de acondicionamiento físico, pero particularmente como aditivo para piensos en muchos piensos para diversos animales de ganadería, pudiendo utilizarse tanto la forma racémica como la enantioméricamente pura de metionina.
A escala industrial, la metionina se produce químicamente por medio de la reacción de Bucherer-Bergs, que es una variante de la síntesis de Strecker. En este caso, las sustancias de partida metilmercaptopropionaldehído (preparado a partir de acroleína y metilmercaptano), cianuro de hidrógeno, amoniaco y dióxido de carbono se hacen reaccionar proporcionando 5-(2-metilmercaptoetil)hidantoína (metionina-hidantoína), que se hidroliza subsiguientemente por álcalis proporcionando el metioninato de metal alcalino, liberándose después la metionina por medio de neutralización con ácido (documento EP 0780 370 A2). También se pueden utilizar otros diversos procedimientos para preparar metionina, por ejemplo, la reacción de amidocarbonilación, la hidrólisis de proteínas o la fermentación de microorganismos productores de metionina. En síntesis química, la metionina se produce en forma de una mezcla racémica de D- y L-metionina, mientras que la L-metionina, o precursores configurados en L de la misma, L-homoserina, por ejemplo, se pueden producir mediante la fermentación de microorganismos adecuados.
La L-homoserina, un precursor potencial de L-metionina (H.J. Teas et al., J. Biol. Chem 1948, 172: 651-658), se puede producir tanto químicamente (M.D. Armstrong, J. Am. Chem Soc., Vol. 70, 1756-1759, 1948) como por fermentación por medio de microorganismos (véanse, por ejemplo, los documentos US 3.598.701, US 6.303.348 B1, EP 0994190 A2, EP 1149911 A2, WO 2004/067757 A1).
Hateley et al. divulgan un procedimiento en el que se obtiene L-metionina por medio de una ruta química partiendo de L-homoserina (documento WO 2007/085514 A2).
Lievense ha podido demostrar que cepas de microorganismos que carecen de actividad de homocisteína metilasa, cuya producción de L-homoserina se había regulado al alza y que se habían transformado con un plásmido que codifica una L-homoserina acetiltransferasa y una O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa (O-acetilhomoserina (tiol)-liasa), produjeron L-metionina en exceso de su propia necesidad en presencia de metilmercaptano, a diferencia de la cepa original (E. coli, C. glutamicum o B. flavum) (documento WO 93/17112 A1).
Bolten et al. (J. Microbiol. Biotechnol. (2010), 20 (8), 1196-1203) pudieron mostrar que C. glutamicum (de tipo silvestre) es capaz de crecer en metilmercaptano y en su forma dimérica, disulfuro de dimetilo, como únicas fuentes de azufre en lugar de sulfato, la fuente de azufre más común para el cultivo de microorganismos, e investigaron las rutas y enzimas subyacentes. Demostraron que la MetY (O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa) es responsable de la sustitución del grupo acetilo de O-acetil-L-homoserina por el grupo mercapto de metilmercaptano o de disulfuro de dimetilo para producir directamente L-metionina. A fin de aumentar la producción de L-metionina, los autores sugieren la amplificación no solo de MetY, sino también de otras enzimas de la biosíntesis de L-metionina.
Zelder et al. (documento WO 2007/011939 A2) demostraron que la L-metionina puede producirse en microorganismos, tales como E. coli y C. glutamicum, cultivando los microorganismos que tienen una O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa u O-succinil-L-homoserina sulfhidrilasa y/o L-homoserina acetiltransferasa o L-homoserina succiniltransferasa desreguladas en presencia de un compuesto de sulfuro encapsulado en metilo, tal como el disulfuro de dimetilo o trisulfuro de dimetilo.
Un procedimiento biotecnológico de dos etapas para preparar L-metionina se propuso por Kim et al. (documento WO 2008/013432 A1). En una primera etapa, a este respecto, se obtiene inicialmente un precursor de L-metionina, O-succinil-L-homoserina u O-acetil-L-homoserina, por medio de microorganismos recombinantes, que se acumulan en el caldo de cultivo. En la segunda etapa subsiguiente, el precursor de L-metionina se hace reaccionar con metilmercaptano en presencia de una proteína que tiene actividad de O-succinil-L-homoserina sulfhidrilasa o actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa o en presencia de un microorganismo que produce dicha proteína o un digestor celular de este microorganismo, para dar L-metionina y el ácido carboxílico correspondiente, es decir, acetato o succinato.
Sin embargo, en esta reacción enzimática, se forman cantidades equimolares de acetato o succinato además de L-metionina. La elección de O-acetil-L-homoserina como precursor de L-metionina, por ejemplo, conduce a altas concentraciones de acetato en el transcurso de la reacción, particularmente a escala industrial. A un pH externo bajo, las moléculas de acetato no disociadas pueden introducirse en la célula a través de la membrana y desprotonarse dentro de la misma, lo que conduce a una caída en el pH interno del citoplasma y altera la homeostasis del pH celular (I.R. Stand, Microbiological Reviews 49, N° 4 (1985), 359-378). Además, el acetato no puede eliminarse completamente del producto de L-metionina sin tener que realizar un esfuerzo inaceptable. En consecuencia, Hong et al. (documento WO 2012/091479 A2) proponen numerosos procedimientos para eliminar y reutilizar las cantidades relativamente grandes de acetato generadas en la segunda etapa del proceso de producción de L-metionina a partir del producto de L-metionina.
El objeto de la presente invención es proporcionar un proceso para producir L-metionina en un microorganismo en el que el mismo microorganismo reutilice sustancialmente el acetato formado en la conversión de O-acetil-L-homoserina en L-metionina.
Este objeto se logra mediante un procedimiento para producir L-metionina en el que un microorganismo que tiene actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa y actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa se cultiva en un medio de cultivo que comprende L-homoserina y una fuente de azufre, seleccionándose la fuente de azufre del grupo que consiste en metilmercaptano (MC), una sal de metilmercaptano y disulfuro de dimetilo (DMDS), mediante el que se acumula L-metionina en el medio de cultivo.
Las actividades enzimáticas en microorganismos generalmente se efectúan mediante la expresión del gen correspondiente que codifica la enzima respectiva. Los denominados promotores se encuentran aguas arriba del gen. Un promotor es una secuencia de a Dn que consiste en aproximadamente 40 a 50 pares de bases y que constituye el sitio de unión para una holoenzima de ARN polimerasa y el punto de inicio de la transcripción (M. Pátek et al., Microbial Biotechnology, 6 (2013), 103-117), mediante lo que se puede influir en la fuerza de expresión del polinucleótido o del gen controlado. Se entiende que un "enlace funcional" significa la disposición secuencial de un promotor con un gen, que conduce a una transcripción del gen.
El microorganismo también puede ser recombinante y tener una actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa mejorada y una actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa mejorada.
Las actividades enzimáticas mejoradas en microorganismos pueden efectuarse, por ejemplo, mediante mutación del gen endógeno correspondiente. Las actividades enzimáticas también pueden mejorarse aumentando la expresión del gen correspondiente, por ejemplo aumentando el número de copias del gen y/o mejorando los factores reguladores del gen. La mejora de dichos factores reguladores que influyen positivamente en la expresión génica se puede lograr, por ejemplo, modificando la secuencia del promotor aguas arriba del gen estructural a fin de aumentar la eficacia del promotor o reemplazando completamente dicho promotor por un promotor más eficaz.
En el procedimiento según la presente invención, la actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa y la actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa se potencian preferentemente mediante una expresión aumentada de un gen que codifica una proteína que tiene actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa o una proteína que tiene actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa. El aumento de la expresión génica se logra preferentemente aumentando el número de copias del gen que codifica la proteína que tiene actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa o la proteína que tiene actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa y/o mediante el enlace funcional en cada caso del gen que codifica la proteína que tiene actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa o la proteína que tiene actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa a un promotor fuerte.
Los promotores fuertes adecuados o los procedimientos para producir dichos promotores para aumentar la expresión son conocidos por la literatura (por ejemplo, S. Lisser y H. Margalit, Nucleic Acid Research, 1993, vol. 21, N° 7, 1507-1516; M. Pátek y J. Nesvera en H. Yukawa y M Inui (eds.), Corynebacterium glutamicum, Microbiology Monographs 23, Springer Verlag Berlín Heidelberg 2013, 51-88; B. J. Eikmanns et al., Gene, 102 (1991) 93-98). Por ejemplo, pueden optimizarse promotores nativos alterando la secuencia del promotor en la dirección de las secuencias de consenso conocidas con respecto al aumento de la expresión de los genes unidos funcionalmente a estos promotores (M. Patek et al., Microbiology (1996), 142, 1297-1309; M. Patek et al., Microbial Biotechnology 6 (2013), 103-117).
Para aumentar la expresión del gen que codifica la proteína que tiene actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa (metX) o el gen que codifica la proteína que tiene actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa (metY), es adecuado, por ejemplo, el promotor tacl (Ptacl), (H. A. deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 80, 21-25, enero de 1983, Biochemistry). La secuencia de Ptacl se muestra con el número de secuencia 5 (SEQ ID NO: 5).
Los promotores constitutivos también son adecuados para la sobreexpresión, en la que el gen que codifica la actividad enzimática se expresa continuamente bajo el control del promotor tal como, por ejemplo, el promotor deo dependiente de glucosa. Los promotores inducidos químicamente, tales como tac, lac o trp, también son adecuados. El sistema más extendido para la inducción de promotores es el operón lac de E. coli. En este caso, se utiliza como inductor o bien lactosa o bien isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG). También son comunes como inductores sistemas que utilizan arabinosa (por ejemplo, el sistema pBAD) o ramnosa (por ejemplo KRX de E. coli). Un sistema de inducción física es, por ejemplo, el sistema promotor de choque frío inducido por temperatura basado en el promotor cspA de E. coli de Takara o Lambda PL y también promotores inducibles osmóticamente, por ejemplo, osmB (por ejemplo, el documento WO 95/25785 A1).
En el procedimiento según la presente invención, el microorganismo recombinante se selecciona del grupo que consiste en Enterobacteriaceae y Corynebacteriaceae, por ejemplo una cepa de Escherichia coli (E. coli), por ejemplo la cepa de E. coli K-12 no patógena MG1655 (DSM 18039), o una cepa de Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), por ejemplo ATCC13032, o una cepa de Corynebacterium humireducens (C. humireducens), por ejemplo DSM 45392.
En el procedimiento según la presente invención, la actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa es, por ejemplo, la enzima MetX, que se origina a partir de Corynebacterium glutamicum. La enzima MetX también puede originarse a partir de C. humireducens. Kim et al. (documentos EP 2 657 345 A1; EP 2 657 250 A2) u Ochrombel et al. (documento WO 2015/165746 A1) divulgan ejemplos de enzimas adecuadas que tienen actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa. La enzima MetX utilizada en los ejemplos experimentales que se describen más adelante tiene la secuencia de aminoácidos según la secuencia número 2 (SEQ ID NO: 2). La secuencia de nucleótidos correspondiente para el gen metX se muestra con el número de secuencia 1 (SEQ ID NO: 1). La secuencia se origina a partir de C. glutamicum (ATTC13032) NC_003450.
Una actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa adecuada para el procedimiento según la presente invención es, por ejemplo, la enzima MetY, que se origina a partir de Corynebacterium glutamicum. La enzima MetY también puede originarse a partir de C. humireducens. Mockel et al. (documento WO 02/18613 A1), Kroger et al. (documento WO 2007/024933 A2) o Kim et al. (documento EP 2657345 A1) divulgan ejemplos de enzimas que tienen actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa según la invención. La enzima MetY utilizada en los ejemplos experimentales que se describen más adelante tiene la secuencia de aminoácidos según la secuencia número 4 (SEQ ID NO: 4). La secuencia de nucleótidos correspondiente al gen metY se muestra con el número de secuencia 3 (SEQ ID NO: 3). La secuencia se origina a partir de C. glutamicum (ATTC13032) NC_003450.
La L-homoserina se transporta a los microorganismos a través de importadores de aminoácidos de cadena ramificada, por ejemplo el sistema LIV en Escherichia coli (B.A. Templeton y M. A. Savageau, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 117, N° 3, marzo de 1974, p. 1002-1009). En Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) también existe un sistema de transporte homólogo codificado por BrnQ de cgl2310 (A. Tauch et al., Arch Microbiol 169 (1998): 303-312).
Dentro de la célula, la L-homoserina se activa en su grupo hidroxilo mediante la transferencia del grupo acetilo de la acetil coenzima A (acetil-CoA) para dar O-acetil-L-homoserina a través de una homoserina O-acetiltransferasa (MetX) (heteróloga). La O-acetil-L-homoserina se convierte después en L-metionina y acetato en presencia de una fuente de azufre reducida, tal como metilmercaptano (MC), y de piridoxal-5'-fosfato (PLP) por medio de una sulfhidrilasa (MetY) (heteróloga). Si bien que la O-acetil-L-homoserina es uno de los intermedios naturales de la biosíntesis de metionina en corinebacterias, la biosíntesis de metionina en enterobacterias se realiza de forma análoga a través de un intermedio de O-succinil-L-homoserina (véase, por ejemplo Figge R (2007) Methionine biosynthesis in Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum. En: Wendisch VF (ed) Amino acid biosynthesis -pathways, regulation and metabolic engineering. Microbiology Monographs, vol 5. Springer, Berlin, p. 163-193). Por lo tanto, las actividades de L-homoserina O-acetiltransferasa y de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa deben introducirse en primer lugar de forma heteróloga en enterobacterias tales como E. coli, mientras que estas actividades enzimáticas ya están presentes de forma natural en corinebacterias tales como C. glutamicum. Los genes homólogos o heterólogos correspondientes que codifican las enzimas correspondientes pueden mejorarse mediante las medidas descritas al principio (tales como el aumento del número de copias de ambos genes y/o el uso de promotores fuertes).
En enterobacterias tales como E. coli, las actividades mejoradas de L-homoserina O-acetiltransferasa y de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa pueden introducirse mediante transformación por medio de vectores adecuados que comprenden las secuencias génicas metX (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) y metY (por ejemplo, SEQ ID NO: 3), que en cada caso se encuentran aguas arriba de un promotor fuerte (por ejemplo Ptacl). Un ejemplo de dicho constructo es la secuencia según la secuencia número 6 (SEQ ID NO: 6).
El acetato liberado por la conversión de O-acetil-L-homoserina en L-metionina, en presencia de metilmercaptano (MC) y piridoxal-5'-fosfato (PLP) y también la sulfhidrilasa (MetY) (heteróloga), se utiliza después de nuevo para la síntesis de acetil-CoA, con consumo de ATP, en el citoplasma de E. coli (igualmente Bacillus subtilis) por medio de una acetil-CoA sintetasa (Acs) inducible por acetato, que se activa particularmente en la fase estacionaria o en condiciones anaeróbicas por el regulador CsrA (S. Kumari et al., JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 177, N° 10, mayo de 1995, p. 2878-2886).
A diferencia de E. coli, el exceso de acetato en C. glutamicum se convierte exclusivamente en una reacción dependiente de ATP en acetilfosfato, por medio de una acetato quinasa (AK), que finalmente reacciona por medio de una fosfotransacetilasa (PTA) en presencia de CoA para dar acetil-CoA. Los genes correspondientes, ack y pta, están organizados en C. glutamicum en un operón regulado por acetato a nivel transcripcional (R. Gerstmeir et al.
Journal of Bacteriology 104 (103) 99-122).
La L-metionina se excreta al exterior de la célula de E. coli por medio del exportador YjeH (Q. Liu et al., Appl Environ Microbiol 81 (2015) p. 7753-7766). Además, el gen ygaZH en E. coli codifica un exportador de metionina (documento WO2015/028675 A1). La L-metionina se excreta al exterior de la célula de C. glutamicum en el medio de cultivo con la ayuda del exportador BrnFEC. Trotschel et al., JOURNAL OF BACTERIOLOGY, junio de 2005, p. 3786-3794). Figura 1 Muestra el mapa del plásmido pMW218.
Figura 2: Muestra el mapa de plásmido pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY.
Figura 3: Muestra la conversión catalítica de L-homoserina y acetil-CoA por los homogeneizados celulares de MG1655/pMW218 o MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY.
Figura 4: Muestra la conversión catalítica de metilmercapturo de sodio en presencia de O-acetilhomoserina y piridoxal-5'-fosfato (PLP) por la enzima O-acetilhomoserina sulfhidrilasa (MetY). La comparación de los homogeneizados celulares de MG1655/pMW218 y MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY se muestra con las respectivas concentraciones de proteína total utilizadas.
EJEMPLOS
1) Preparación de una enterobacteria que expresa heterólogamente los genes para una L-homoserina O-acetiltransferasa y una sulfhidrilasa de una especie de corinebacterias
Sobre la base de la secuencia del genoma de Corynebacterium glutamicum (ATCC13032) NC_003450, se sintetizaron las secuencias de genes metX (SEQ ID NO: 1) y metY (SEQ ID NO: 3), que codifican la L-homoserina O-acetiltransferasa que tiene la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2 y la O -acetil-L-homoserina sulfhidrilasa que tiene la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 4, respectivamente, ambas con el promotor aguas arriba Ptacl (SEQ ID NO: 5) (H.A. deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 80, 21-25, enero de 1983, Biochemistry) de Life Technologies Invitrogen GeneArt (Alemania), (SEQ ID NO: 6).
En esta SEQ ID NO: 6, el promotor Ptacl es del par de bases 407 al 447, la secuencia génica de metX de 502 a 1638, el promotor Ptacl nuevamente de 1645 a 1685 y la secuencia génica de metY de 1742 a 3055.
Subsiguientemente, la clonación de esta secuencia sintética se realizó a través de los sitios de restricción BssHII y BgII en la secuencia del vector pMW218 (número de acceso: AB005477) (Nippon Gene, Toyama, Japón) (figura 1). El plásmido pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY se forma a partir del mismo (figura 2). Para analizar el plásmido pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY, se llevó a cabo la secuenciación del ADN por Eurofins MWG Operon. Se verificó la corrección de las secuencias de ADN obtenidas utilizando el programa informático Clone Manager de forma que se confirmara la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6.
Los plásmidos pMW218 y pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY se han transformado en cada caso en la cepa de Escherichia coli K-12 MG1655 (DSM N° 18039). Los transformantes se cultivaron subsiguientemente en placas de agar de medio LB con 50 |jg/ml de kanamicina de forma que se pudieran generar las cepas MG1655/pMW218 y MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY. En cada caso, se seleccionó una colonia que se inoculó en cada caso a 10 ml de medio LB con 50 jg/ml de kanamicina, y se cultivó a 37 °C, 200 rpm, durante 6 horas. Subsiguientemente, se inocularon a 10 ml de medio A [25 g/l de sulfato de amonio; 1 g/l de sulfato de magnesio heptahidratado; 2 g/l de dihidrogenofosfato de potasio; 0,03 g/l de heptahidrato de hierro; 0,02 g/l de monohidrato de sulfato de manganeso; 20 g/l de glucosa monohidrato; 30 g/l de carbonato de calcio; 0,05 g/l de kanamicina; 0,025 g/l de piridoxal-5'-fosfato (PLP); 0,0024 g/l de isopropil-p-D-tiogalactopiranosido (IPTG)] 200 j l del cultivo de células en crecimiento y se incubaron a 37 °C, 200 rpm, durante 16 h. Estos cultivos celulares se diluyeron con 10 ml de medio A nuevo en un matraz de 100 ml a una DO de 2 y se cultivaron adicionalmente en condiciones idénticas hasta que se alcanzó una DO de aproximadamente 5 (aproximadamente 3-4 h). Subsiguientemente, estas células, que se encuentran en la fase de crecimiento exponencial y tienen actividad de homoserina O-acetiltransferasa (MetX) y de sulfhidrilasa (MetY), pueden utilizarse para la biotransformación. Se entiende que biotransformación significa una conversión de sustancia, en la que se utilizan células vivas enteras, células fijas o enzimas aisladas libres o unidas a un vehículo o la combinación de las anteriores.
2) Detección de las actividades enzimáticas de L-homoserina O-acetiltransferasa y acetil-L-homoserina sulfhidrilasa Se inocularon en cada caso a 10 ml de medio LB con 50 jg/ml de kanamicina una sola colonia de las cepas MG1655/pMW218 y MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY y se cultivaron a 37 °C, 200 rpm, durante 6 horas. Subsiguientemente, se inocularon a 10 ml de medio A (véase el ejemplo 1) 200 j l del cultivo de células en crecimiento y se incubaron a 37 °C, 200 rpm, durante 16 h. Los cultivos celulares se recogieron cada uno (8 ml normalizados a una DO = 1), los sobrenadantes se eliminaron por centrifugación (20 min, 4000 rpm, 4 °C) y las células sedimentadas se lavaron dos veces con 800 j l de tampón de fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,5) y se recogieron en 1 ml de tampón. La disrupción celular mecánica se llevó a cabo en un instrumento FastPrep FP120 (QBiogene, Heidelberg), en el que las células se agitaron tres veces durante 20 s a 6,5 m/s en recipientes de digestión con 300 mg de perlas de vidrio (0 0,2-0,3 mm). El extracto bruto se centrifugó después a 12.000 rpm, 4 °C, 20 min, para eliminar las células no digeridas y los desechos celulares. La cantidad total de proteína se determinó utilizando el ensayo de cuantificación de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Estados Unidos). El homogeneizado celular se utilizó después para la detección enzimática de la actividad citoplasmática de L-homoserina O-acetiltransferasa y acetil-L-homoserina sulfhidrilasa.
2a) Detección de la actividad citoplasmática de MetX (L-homoserina O-acetiltransferasa)
La reacción que cataliza la enzima L-homoserina O-acetiltransferasa (MetX) [EC2.3.1.31] es la conversión de L-homoserina y acetil-CoA en O-acetil-L-homoserina y CoA. Utilizando una solución de DTNB (ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico, "reactivo de Ellmans", Sigma Aldrich, Alemania), el progreso de esta reacción se puede registrar mediante mediciones de absorción a 412 nm, ya que el DTNB forma una sustancia amarilla con el grupo SH de CoA (S. Yamagata Journal of Bacteriology 169, N° 8 (1987) 3458-3463) El ensayo fotométrico de la enzima MetX se realizó a 37 °C, llevándose a cabo la calibración previamente utilizando concentraciones de CoA de entre 0-200 pM. Cada preparación se realizó en una mezcla de reacción de 0,2 ml con tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,5), DNTB 0,65 mM [100 pl de una solución madre de DTNB 1,3 mM], acetil-CoA 0,13 mM [30 pl de una solución madre de acetil-CoA 0,886 mM, Sigma Aldrich, Alemania], L-homoserina 10 mM [20 pl de una solución madre de L-homoserina 100 mM, Sigma Aldrich, Alemania] y la concentración de proteína especificada de 0,012 mg/ml, o 0,024 mg/ml del homogeneizado celular respectivo.
Dado que la acetil-CoA se utiliza dentro de la célula para diversas biosíntesis, hay diversas enzimas presentes en el citoplasma que catalizan la escisión de acetil-CoA en CoA, de forma que debe considerarse la diferencia entre los homogeneizados celulares con y sin MetX.
Como resultado del ensayo enzimático, se observó que el aumento de absorción de DNTB del homogeneizado celular de MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY era constantemente superior al de MG1655/pMW218 a lo largo del transcurso del tiempo (figura 3). Esto confirma que MetX, a este respecto, es catalíticamente activo como enzima adicional. La comparación de las pendientes de las regiones lineales iniciales de las curvas registradas muestra actividades en el homogeneizado celular de MG1655/pMW218 de alrededor de 580 pmol/min por g de proteína total y en MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY de alrededor de 730 pmol/min por g de proteína total. Por lo tanto, la diferencia es la actividad específica de la L-homoserina O-acetiltransferasa (MetX) a alrededor de 150 unidades por g de proteína total (1 unidad = 1 pmol de conversión de sustrato/min).
2b) Detección de la actividad citoplasmática de MetY (O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa)
La reacción que cataliza la enzima O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa (MetY) [EC 2.5.1.49] es la conversión de O-acetil-L-homoserina con metanotiol (MC) en presencia de piridoxal-5'-fosfato (PLP) para dar L-metionina y acetato. Tal como se describe en el ejemplo 2a, el progreso de esta reacción puede determinarse por medio de mediciones de absorción de DTNB a 412 nm, dado que DTNB reacciona con el grupo SH de metilmercaptano sin reaccionar para dar una sustancia amarilla. Para este fin, las dos cepas MG1655/pMW218 y MG1655/pMW218_PtacmetX_Ptac-metY se prepararon como homogeneizados celulares tal como se ha descrito anteriormente y la disminución o la conversión del sustrato metilmercapturo de sodio se midió en el ensayo enzimático subsiguiente. Cada preparación se realizó a 37 °C en una mezcla de reacción de 1 ml con tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,5), metilmercapturo de sodio (NaMC) 2 mM [10 pl de una solución madre de NaMC 200 mM], OAH HCI 3 mM [30 pl de una solución madre de OAH HCl 100 mM] y P l P 0,01 mM [10 pl de una solución madre de PLP 1 mM] con el homogeneizado celular respectivo a una concentración de proteína total de 0,012 g/l; 0,024 g/l, o 0,048 g/l. Después de la reacción enzimática de tiempo limitado, se realizó la medición fotométrica del contenido de NaMC por medio de DTNB, llevándose a cabo previamente una calibración utilizando concentraciones de MC de entre 0 y 200 pM. Para este fin, se añadieron 180 pl de una solución de DTNB (4 mg/ml) a cada 20 pl de la mezcla de reacción enzimática y subsiguientemente se midió a 412 nm.
La presencia del homogeneizado celular de la cepa MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY conduce a la disminución del NaMC, que está catalizada de forma significativamente más rápida que en presencia del homogeneizado celular de MG1655/pMW218, debido a la actividad enzimática de MetY, que depende de la concentración total de proteína (figura 4). La disminución de NaMC que también tiene lugar, pero más débilmente, en las preparaciones con el homogeneizado celular de MG1655/pMW218 es independiente de la cantidad de proteína utilizada. También se pudo observar una disminución idéntica en una preparación sin homogeneizado celular, y esto se debe a la desgasificación químicamente dependiente del metilmercaptano que se produce a partir de las soluciones. A partir de la diferencia en las pendientes en el intervalo lineal, se puede calcular una actividad específica de sulfhidrilasa de MetY de alrededor de 1500 unidades por g de proteína total (1 unidad = 1 pmol de conversión de sustrato/min), que se encuentra en el mismo nivel que la de la enzima MetX.
3) Detección de la biotransformación celular de L-homoserina y metilmercapturo de sodio para dar L-metionina Las cepas MG1655/pMW218 y MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY se cultivaron tal como se describe en el ejemplo 1 y después, en la fase exponencial de cada preparación, se ajustaron a una DO600 de alrededor de 7. La biotransformación se llevó a cabo en matraces de 100 ml con agitación a 37 °C, 200 rpm, durante un período de tiempo de 0, 2, 4 y 24 h. Cada preparación se realizó en 10 ml de medio A con 6,5 g/l de L-homoserina [500 pl de una solución madre de homoserina de 100 g/l] (Sigma Aldrich, Alemania), 3 g/l de NaMC [500 pl de una solución madre de NaMC al 6%] y 12 g/l KH2PO4 [600 pl de una solución madre de 200 g/l de KH2PO4].
La conversión de L-homoserina con metilmercaptano para dar L-metionina se realizó utilizando la cepa MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY, mientras que no se sintetizó L-metionina utilizando la cepa MG1655/pMW218 (tabla 1). Los diversos rendimientos basados en las cantidades de NaMC cargadas inicialmente y las cantidades de L-homoserina consumidas se basan en una estequiometría igual de ambos sustratos presentes al inicio, pero considerando la evaporación subsiguiente que tiene lugar de forma natural del metilmercaptano.
Tabla 1: Comparación de las biotransformaciones de 6,5 g/l de L-homoserina sintética y 3 g/l de metilmercapturo de sodio utilizando las cepas MG1655/pMW218 y MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY. Se muestran el título de L-metionina obtenido a lo largo del transcurso tiempo y los rendimientos relacionados en base a la cantidad de NaMC pulsada al inicio y la cantidad de L-homoserina (L-HS) consumida.
Figure imgf000007_0001
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Además, se llevó a cabo una biotransformación utilizando la cepa MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY en la que se utilizó NaMC deuterado (D3CSNa) en lugar de la solución madre de NaMC de Sigma Aldrich. Este se preparó introduciendo CD3SD (Sigma-Aldrich, 98% en átomos de D) en una cantidad equimolar de solución acuosa de hidróxido de sodio. (Alternativamente, se puede preparar según J. Voss et al., Phosphorous, Sulfur and Silicon and the Related Elements, 2012, 187, 382 a partir de tiourea y CD3 I). El análisis de la solución después de 24 h de reacción por CL-EM mostró una relación de metionina con respecto a metionina-d-3 de 1:200. Pudo detectarse, por lo tanto, que la metionina formada en la biotransformación se forma exclusivamente mediante la incorporación de metilmercaptano suministrado externamente.
4) Conversión de L-homoserina, producida por fermentación, en L-metionina mediante una biotransformación Sobre la base de la biotransformación de L-homoserina sintética a L-metionina realizada en el ejemplo 3a, también se investigó la biotransformación de L-homoserina producida por fermentación. La concentración del caldo de L-homoserina producido por fermentación fue de 10 g/l. La cepa MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY se cultivó como en el ejemplo 1 y la biotransformación se llevó a cabo en la fase exponencial a una DO de 5 en presencia de 5 g/l de L-homoserina producida por fermentación y tal como se describe en el ejemplo 3a durante 2, 4 y 24 h. Tal como se muestra en la tabla 2, después de dos horas de biotransformación alrededor del 7%, después de cuatro horas alrededor del 12% y después de 24 horas alrededor del 45% de los sustratos L-homoserina o NaMC se convirtieron en L-metionina, lo que se reflejó en un título máximo de alrededor de 2,9 g/l de L-metionina.
Tabla 2: L-metionina y los rendimientos relacionados formados por la biotransformación de 5 g/l de L-homoserina producida por fermentación y 3 g/l de metilmercapturo de sodio por la cepa MG1655/pMW218_Ptac-metX_PtacmetY.
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5) Reciclaje celular de acetato durante la biotransformación
Para investigar las cantidades de acetato formadas en la biotransformación de L-homoserina y metilmercaptano, se documentaron preparaciones utilizando las cepas MG1655/pMW218 y MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY en presencia de 5 g/l de L-homoserina y 3 g/l de metilmercapturo de sodio y 12 g/l KH2PO4 [600 |jl de solución madre de 200 g/l de KH2PO4] durante cuatro horas con respecto a su contenido de acetato.
Las cepas MG1655/pMW218 y MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY se prepararon tal como se describe en el ejemplo 1, de forma que se utilizó un cultivo exponencial que tenía una DO inicial de alrededor de 3 para las preparaciones de 10 ml respectivas en matraces de 100 ml tal como se describe en el ejemplo 3b.
Las concentraciones de acetato que se forman durante la biotransformación de 5 g/l de L-homoserina y 3 g/l de metilmercapturo de sodio por las cepas MG1655/pMW218 y MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY se documentan en la tabla 3. Se forma L-metionina solo en la preparación con la cepa que expresa heterólogamente los genes metX y metY, mientras que en la preparación con la cepa de control MG1655/pMW218 no se detectó L-metionina.
Dentro de las primeras cuatro horas se forman alrededor de 11 mM de acetato debido a los parámetros experimentales en la preparación de control, mientras que en la biotransformación se forman alrededor de 17 mM de acetato y 7 Mm de L-metionina. El exceso de acetato medido en la preparación de biotransformación que da lugar a la diferencia es, por lo tanto, de 6 mM. Debido a la síntesis adicional de metionina con una producción equimolar de acetato y metionina, que no se describe para sistemas no celulares (documento WO 2008/013432 A1), este valor sería de 7 mM. Por lo tanto, se pudo detectar un reciclaje celular del acetato formado en la síntesis de L-metionina en la biotransformación. El acetato adicional resultante de la biotransformación, por lo tanto, obviamente se ha reciclado parcialmente por la acetil-CoA sintetasa (Acs) dando acetil-CoA.
Tabla 3: Formación y reciclaje de acetato en preparaciones de biotransformación con las cepas MG1655/pMW218 y MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY en presencia de 5 g/l de L-homoserina y 3 g/l de metilmercapturo de sodio.
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6) Adición externa de L-homoserina
Las cepas MG1655/pMW218 y MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY se prepararon tal como se describe en el ejemplo 1, de forma que se utilizó un cultivo exponencial con una DO inicial de alrededor de 3 para las preparaciones de 10 ml respectivas en matraces de 100 ml tal como se describe en el ejemplo 3b. Las preparaciones respectivas vinieron seguidas en el punto temporal de 0 h en primer lugar de ninguna adición, de la adición de 5 g/l de L-homoserina, de la adición de 3 g/l de metilmercapturo de sodio con 12 g/l de KH2PO4 [600 j l de solución madre de 200 g/l de KH2PO4] y de la adición de 5 g/l de L-homoserina con 3 g/l de metilmercapturo de sodio y 12 g/l de KH2PO4 [600 j l de solución madre de 200 g/l de KH2PO4].
Los títulos de L-metionina y L-homoserina de las preparaciones se determinaron en los puntos temporales 0, 2, 4 y 6 h.
Tabla 4: Títulos de L-metionina y L-homoserina después de la adición externa de 5 g/l de L-homoserina (L-HS) a las preparaciones de biotransformación utilizando las cepas MG1655/pMW218 y MG1655/pMW218_Ptac-metX_PtacmetY en presencia y ausencia de 3 g/l de metilmercapturo de sodio (Na-MC).
Figure imgf000009_0001
7) Biotransformación de L-homoserina y disulfuro de dimetilo (DMDS) o de L-homoserina y metilmercapturo de sodio (NaMC) para dar L-metionina
La cepa MG1655/pMW218_Ptac-metX_Ptac-metY se cultivó tal como se describe en el ejemplo 1 y a continuación, en la fase exponencial de cada preparación, se ajustó a una DO600 de alrededor de 10.
La biotransformación se llevó a cabo en matraces con agitación de 100 ml a 37 °C, 200 rpm, durante un período de tiempo de 0, 24 y 48 h. Cada preparación se realizó en 10 ml de medio A (véase el ejemplo 1) con 5,0 g/l de L-homoserina y 12 g/l de KH2PO4 [600 pl de una solución madre de 200 g/l de KH2PO4] y las cantidades de la fuente de azufre (es decir, NaMC o DMDs ) tal como se proporcionan en la tabla 5. El control no contenía ninguna fuente de azufre (es decir, ni NaMC ni DMDS).
Tabla 5: Comparación de los resultados de la biotransformación con NaMC, control (sin fuente de azufre) y DMDS a diferentes concentraciones y períodos de tiempo de reacción
Figure imgf000010_0001

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para producir L-metionina, en el que un microorganismo que tiene actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa y actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa se cultiva en un medio de cultivo que comprende L-homoserina y una fuente de azufre, seleccionada del grupo que consiste en metilmercaptano, una sal de metilmercaptano y disulfuro de dimetilo, mediante el que se acumula L-metionina en el medio de cultivo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el microorganismo es recombinante y se potencian la actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa y la actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa y la actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa se potencian ambas mediante el aumento de expresión de un gen que codifica una proteína que tiene actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa o una proteína que tiene actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el aumento de la expresión génica se efectúa aumentando el número de copias del gen que codifica la proteína que tiene actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa y/o la proteína que tiene actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa.
5. Procedimiento según la reivindicación 3 o 4, en el que el aumento de la expresión génica se efectúa mediante el enlace funcional del gen que codifica la proteína que tiene actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa y/o la proteína que tiene actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa a un promotor fuerte.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en Enterobacteriaceae y Corynebacteriaceae.
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la actividad de L-homoserina O-acetiltransferasa es la enzima MetX, que se origina a partir de Corynebacterium glutamicum.
8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la actividad de O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa es la enzima MetY, que se origina a partir de Corynebacterium glutamicum.
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