BR112016004371B1 - Cepa de escherichia coli recombinante otimizada para a produção fermentativa de metionina e/ou seus derivados e método para a produção fermentativa de metionina ou seus derivados - Google Patents

Abstract

MICROORGANISMO PARA PRODUÇÃO DE METIONINA COM EFLUXO DE METIONINA AUMENTADO. A presente invenção está relacionada a uma cepa de Escherichia coli (E. coli ) recombinante otimizada para a produção fermentativa de metionina e/ou seus derivados, em que a referida cepa recombinante, a importação de metionina é atenuada e o efluxo de metionina é aumentado. Está também relacionada com um método para otimizar a produção fermentativa de metionina e/ou seus derivados, compreendendo as etapas de: a. cultura de um microrganismo recombinante, em que no referido microrganismo, a importação de metionina é atenuada e o efluxo de metionina é aumentado, num meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono fermentável e uma fonte de enxofre, e b. recuperação de metionina e/ou seus derivados a partir do meio de cultura.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção relaciona-se a um microorganismo recombinante útil para a produção de L- metionina e/ou seus derivados e ao processo para preparação de L-metionina. O microrganismo da invenção é modificado de forma a que o rendimento metionina/fonte de carbono é aumentado combinando a atenuação do sistema de captação de L-metionina à sobre-expressão de um sistema de exportação específico. Em particular, o operon metNIQ é deletado e os genes ygaZ e ygaH ou genes seus homólogos são sobre- expressos no microrganismo recombinante.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Compostos contendo enxofre, como cisteína, homocisteína, metionina ou S-adenosilmetionina são críticos no metabolismo celular. Em particular L-metionina, um aminoácido essencial, que não pode ser sintetizado por animais, desempenha um papel importante em muitas funções do corpo. A maior parte da metionina produzida industrialmente é vastamente utilizada como aditivo alimentar ou de rações para animais.

[003] Com a diminuição do uso de proteínas de origem animal devida à BSE e gripe aviária, a demanda por metionina pura aumentou. Geralmente, D,L-metionina é produzida quimicamente a partir de acroleína, metil mercaptano e cianeto de hidrogênio. Contudo, a mistura racêmica não tem o mesmo nível de desempenho da L-metionina pura (Saunderson, 1985). Ademais, apesar de a L-metionina pura poder ser produzida a partir da metionina racêmica, por exemplo, através do tratamento de N-acetil-D,L- metionina com acilase, isto aumenta drasticamente os custos de produção. Desse modo, a demanda crescente por L- metionina pura, acompanhada por preocupações ambientais, torna a produção microbiana de metionina uma perspectiva atraente.

[004] Outros aminoácidos importantes, como lisina, treonina, e triptofano, são produzidos por fermentação para uso em rações animais. Portanto, estes aminoácidos podem ser produzidos usando glucose e outros recursos renováveis como matéria prima. Até agora, a produção fermentativa de L-metionina ainda não obteve sucesso, mas o desenvolvimento da tecnologia encontra-se em andamento.

[005] Foram já descritas diferentes abordagens para a otimização da produção de L-metionina em microrganismos (ver, por exemplo, patentes ou pedidos de patente US7,790,424, US7,611,873, WO2002/10209, WO2005/059093 e WO2006/008097); no entanto, a produção industrial de L-metionina por microrganismos carece de melhoramento.

[006] Quando L-metionina é sintetizada em um determinado nível ou acima dele, isso inibe sua própria produção futura por ciclo de feedback e perturba a fisiologia da célula. Assim, um desses melhoramentos é a redução de acumulação de L-metionina no microrganismo de forma a assegurar uma produção eficiente, reduzindo a capacidade de importação de L-metionina do microrganismo e aumentando o efluxo de L-metionina simultaneamente em um sobre-produtor recombinante de L-metionina.

[007] Estudos bioquímicos e cinéticos iniciais demonstraram que a captação de metionina em Escherichia coli envolve pelo menos dois transportadores específicos: os sistemas de transporte de elevada-afinidade MetD e baixa-afinidade MetP (Jones & George, 1999; Kadner, 1974). Ambos são regulados pela dimensão do estoque interno de metionina e, para MetD, foi inferida repressão mediada por MetJ (Kadner, 1975; Kadner & Winkler, 1975). O sistema de captação de metionina MetD foi caracterizado como transportador ABC. Em 2002, Merlin et al, reportaram que os genes abc, yaeC, e yaeE compreendem metD, o locus que codifica o sistema de captação de metionina. Eles propõem renomear abc, yaeE, e yaeC como metN, metI, e metQ, respectivamente.

[008] A exportação de metionina é mediada, em Escherichia coli, pelo complexo YgaZH e em Corynebacterium glutamicum pelo complexo homólogo BrnFE (Trotschel et al., 2005). YgaZ é membro da família (LIV-E) de exportadores de aminoácidos de cadeia ramificada, responsável pela exportação de L-valina e L-metionina. YgaZ forma um complexo com YgaH, uma presumível proteína de membrana interna, para exportar aminoácidos sob condições em que os seus níveis seriam tóxicos para a célula.

[009] Os pedidos de patente WO2002/097096 e WO2005/085463 relacionam-se à redução da captação de L- metionina em Corynebacterium pela atenuação do sistema de captação de metionina MetD2, especialmente pela deleção de um ou mais dos genes yaeC, abc e yaeE. Em Corynebacterium, a atenuação do sistema de captação de metionina MetD2 leva a uma produção de metionina melhorada. O sistema de captação de metionina homólogo MetD, cofificado pelos genes metN, metI e metQ, também foi caracterizado em Escherichia coli (Jones & George, 1999; Kadner 1974, Merlin et al., 2002). O pedido de patente WO2008/127240 revela que em Escherichia coli, tal como em Corynebacterium, a produção de metionina é aumentada quando o sistema de captação de metionina MetD é atenuado.

[010] Os pedidos de patente EP1239041 e WO2008/082211 descrevem a sobre-expressão do exportador de um exportador de aminoácidos de cadeia ramificada (YgaZH) responsável pela exportção de L-valina e L-metionina em Escherichia coli. Esta sobre-expressão leva a uma produção aumentada de metionina em E. coli.

[011] Trotschel et al. procederam à sobre- expressão dos genes brnF e brnE, codificando o exportador de metionina BrnFE, deletando ao mesmo tempo o sistema metD em Corynebacterium glutamicum (Trotschel et al., 2005). Todavia, não foi publicada nenhuma prova do impacto destas modificações na produção de metionina em Corynebacterium glutamicum ou Escherichia coli.

[012] Ao contrário da técnica anterior em C. glutamicum e E. coli, inventores mostraram que a deleção de apenas metD em E. coli (conseguida ou por deleção de um dos genes do operon metNIQ ou pela deleção de todo o operon, deleção de qualquer gene deste operon levando a supressão da captação de metionina de elevada-afinidade) não é suficiente para melhorar os desempenhos na produção de metionina. Esta modificação deve ser combinada à sobre- expressão de um sistema de exportação de L-metionina.

[013] Esta é assim a primeira vez que se demonstra que a combinação da deleção do sistema de captação de L- metionina com a sobre-expressão de exportação de L- metionina é benéfica para a produção de metionina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[014] A invenção relaciona-se a uma cepa recombinante de Escherichia coli e método para otimizar a produção de metionina e/ou seus derivados, em que a importação de metionina é atenuada e o efluxo de metionina é aumentado. No microrganismo recombinante, a importação de metionina é atenuada pela atenuação da expressão ou deleção de pelo menos um gene escolhido entre metN, metI ou metQ, enquanto o efluxo de metionina é aumentado pela sobre- expressão dos genes ygaZH ou seus genes homólogos.

[015] O microrganismo recombinante pode compreender também outras modificações genéticas, tais como: • uma expressão aumentada de pelo menos um dos seguintes genes: ptsG, pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metH, fldA, fpr, metA, alelo de metA* codificando para uma enzima com sensibilidade de feed-back reduzida a S-adenosilmetionina e/ou metionina, thrA, ou um alelo de thrA* codificando para uma enzima com inibição de feed-back reduzida para treonina e/ou • uma expressão aumentada de pelo menos um dos seguintes genes: metJ, pykA, pykF, purU, ybdL, udhA, dgsA, metE ou yncA.

[016] Em uma modalidade particular, a presente invenção relaciona-se a um microrganismo recombinante em que: a) os genes metN, metI e metQ estão deletados, enquanto os genes ygaZ e ygaH ou seus genes homólogos oriundos de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii estão em sobre-expressão, e b) a expressão dos genes metA*, metH, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serA, serB, serC, cysE, thrA* e pyc está aumentada; e c) a expressão dos genes metJ, pykA, pykF, purU, ybdL, yncA, dgsA, metE e udhA está atenuada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[017] Antes de descrever a presente invenção em detalhe, deve entender-se que esta invenção não se limita aos métodos exemplificados em particular e pode, naturalmente, variar. Deve também ser entendido que a terminologia aqui usada serve unicamente o propósito de descrever modalidades particulares da invenção, que serão limitadas apenas pelas reivindicações anexadas, e não se destina a ser limitativa.

[018] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados, tanto supra como infra, são aqui incorporadas na sua totalidade por referência.

[019] Ademais, a prática da presente invenção aplica, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de microbiologia e biologia molecular dentro do estado da técnica. Estas técnicas são bem conhecidas do especialista no assunto e encontram-se explicadas em detalhe na literatura.

[020] Deve notar-se que, tal como usadas aqui ou nas reivindicações anexadas, as formas singulares "um/uma" e "o/a", compreendem referência plural, exceto se o contexto ditar claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um microrganismo" compreende a pluralidade de tais microrganismos, e a referência a "um gene endógeno" relaciona-se a um ou mais genes endógenos, e assim por diante. Salvo indicação em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o significado comumente entendido por um especialista no assunto a que esta invenção se relaciona. Apesar de poderem ser usados quaisquer materiais e métodos semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos para levar à prática ou testar a presente invenção, os materiais e métodos preferidos são aqui descritos.

[021] Nas reivindicações que se seguem e subsequente descrição da invenção, exceto quando o contexto dite o contrário por linguagem expressa ou implicação necessária, as palavras “compreender”, “conter”, “envolver” ou “incluir” ou variações como “compreende”, “compreendendo”, ”contendo”, “envolvido”, “inclui”, “incluindo” são usadas com sentido inclusivo, i.e., para especificar a presença do aspecto referido, não excluindo a presença ou acréscimo de outros aspectos em várias modalidades da invenção.

[022] Os termos “metionina” e “L-metionina” designam o aminoácido essencial contendo enxofre com a fórmula química HO2CCH(NH2)CH2CH2SCH3 e número CAS 59-51-8 ou 63-68-3 para o L-isómero específico.

[023] “Derivados de metionina” refere-se a moléculas análogas a metionina que apresentam a mesma cadeia química principal, mas diferem da metionina em pelo menos um grupo químico. Nesta invenção, os derivados de metionina preferidos são N-acetil metionina (NAM), S- adenosil metionina (SAM) e hidroximetionina (ou um análogo de hidroximetionina ou MHA).

[024] O termo “microrganismo”, aqui usado, refere- se a uma bactéria, levedura ou fungo não modificado artificialmente. Preferencialmente, o microrganismo é selecionado de entre Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae e Corynebacteriaceae. Mais preferencialmente, o microrganismo é uma espécie de Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Salmonella, ou Corynebacterium. Dentro destes, na presente invenção, são preferidas as espécies Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum.

[025] A designação “microrganismo recombinante” ou “microrganismo geneticamente modificado”, tal como aqui usada, refere-se a uma bactéria, levedura ou fungo que não se encontra na natureza e é geneticamente diferente do seu equivalente encontrado na natureza. Isto significa que ele é modificado por introdução, deleção ou modificação de elementos genéticos. Também pode ser transformado forçando o desenvolvimento e evolução de novas vias metabólicas, por combinação de mutagênese direcionada e evolução sob uma pressão seletiva específica (ver, por exemplo, WO2004/076659 ou WO2007/011939).

[026] Um microrganismo pode ser modificado de forma a expressar genes exógenos se esses genes forem introduzidos com todos os elementos necessários à sua expressão no microrganismo hospedeiro. A modificação ou “transformação” de microrganismos com DNA exógeno é uma tarefa de rotina para o especialista no assunto.

[027] Um microrganismo pode ser modificado de forma a modular o nível de expressão de um gene endógeno.

[028] A designação “gene endógeno” significa que o gene estava presente no microrganismo antes de qualquer modificação genética. Genes endógenos podem ser sobre- expressos por introdução de sequências heterólogas, em acréscimo a, ou em substituição de elementos regulatórios endógenos ou, ainda, introduzindo uma ou mais cópias suplementares do gene no cromossomo ou um plasmídeo. Genes endógenos também podem ser modificados para modular a sua expressão e/ou atividade. Por exemplo, podem ser introduzidas mutações na sequência codificadora para modificar o produto do gene, ou podem introduzir-se sequências heterólogas em acréscimo a, ou substituição de, elementos regulatórios endógenos. A modulação de um gene endógeno pode resultar na supra-regulação e/ou aumento da atividade do produto do gene, ou, em alternativa, infraregular e/ou diminuir a atividade do produto do gene endógeno.

[029] Outra forma de modular a sua expressão é trocar o promotor endógeno de um gene (por exemplo, promotor tipo selvagem) por outro, mais forte ou mais fraco, de forma a supra ou infra-regular a expressão do gene endógeno. Estes promotores podem ser homólogos ou heterólogos. Está dentro da capacidade do especialista no assunto selecionar promotores adequados.

[030] Pelo contrário, "gene exógeno" significa que o gene foi introduzido no microrganismo, por meios bem conhecidos do especialista no assunto, sendo que ele não ocorre naturalmente no microrganismo. Genes exógenos podem ser integrados no cromossomo hospedeiro, ou ser expressos extra-cromossomicamente por plasmídeos ou vetores. São conhecidos no estado da técnica uma variedade de plasmídeos, que diferem quanto à sua origem de replicação e número de cópias na célula. Estes genes podem ser homólogos.

[031] No contexto da invenção, "gene homólogo" não se limita a designar genes com um antepassado genético comum teórico, mas inclui também genes que podendo ser geneticamente não relacionados, evoluíram, ainda assim, para codificar uma proteína que desempenha funções idênticas e/ou apresenta estrutura semelhante. Assim, no contexto da presente invenção, a designação "homólogo funcional" relaciona-se ao fato de uma determinada atividade enzimática poder não ser gerada apenas por uma proteína específica com determinada sequência de aminoácidos, mas também por proteínas com sequência semelhante de outros microrganismos aparentados, ou não. Utilizando as referências fornecidas pelo Genbank para genes conhecidos, os especialistas no assunto são capazes de determinar os genes equivalentes noutros organismos, cepas bacterianas, leveduras, fungos, mamíferos, plantas, etc. Este trabalho de rotina é vantajosamente realizado usando sequências de consenso, que podem ser determinadas procedendo ao alinhamento de sequências com genes derivados de outros microrganismos e criando sondas degeneradas para clonar o gene correspondente em outro organismo. Estes métodos de rotina de biologia molecular, são bem conhecidos dos especialistas no assunto.

[032] As expressões "produção aumentada de metionina", "aumento de produção de metionina" e seus equivalentes gramaticais aqui usados, relacionam-se a um aumento do rendimento metionina/fonte de carbono (razão de grama/mol de metionina produzida por grama/mol de fonte de carbono consumida, que pode ser expresso em porcentagem). São do conhecimento dos especialistas no assunto métodos para determinação da quantidade de fonte de carbono consumida e de metionina produzida. O rendimento é mais elevado no microrganismo recombinante, quando comparado com o microrganismo não modificado correspondente.

[033] A designação "microrganismo otimizado para a produção fermentativa de metionina" relaciona-se a microrganismos que evoluíram e/ou foram geneticamente modificados para apresentarem produção de metionina aumentada em comparação com a produção endógena nos microrganismos tipo selvagem correspondentes. Estes microrganismos "otimizados" para a produção de metionina são bem conhecidos no estado da técnica, e foram revelados em particular nos pedidos de patentes WO2005/111202, WO2007/077041, WO2009/043803 e WO2012/098042.

[034] De acordo com a invenção, "produção fermentativa", "cultura" ou "fermentação" são usados para indicar crescimento bacteriano. Este crescimento é geralmente levado a cabo em fermentadores com um meio de cultura apropriado, adaptado ao microrganismo utilizado e contendo pelo menos uma fonte de carbono simples e co- substratos se necessário.

[035] Um "meio de cultura apropriado" designa um meio (por exemplo, um meio líquido, estéril) contendo nutrientes essenciais ou benéficos para a manutenção e/ou crescimento da célula, tais como fontes ou substratos de carbono; fontes de nitrogênio, por exemplo, peptona, extratos de levedura, extratos de carne, extratos de malte, ureia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, nitrato de amônio e fosfato de amônio; fontes de fósforo, por exemplo, fosfato monopotássico, fosfato dipotássico; oligoelementos (por exemplo, sais metálicos), por exemplo sais de magnésio, cobalto e/ou manganês; assim como fatores de crescimento, tais como aminoácidos e vitaminas.

[036] Na presente invenção, as designações "fonte de carbono" ou "substrato carbônico" referem-se a qualquer fonte de carbono que possa ser usada pelo especialista no assunto para sustentar o crescimento normal de um microrganismo, incluindo monossacarídeos (como glucose, galactose, xilose, frutose ou lactose), oligossacarídeos, dissacarídeos (como sacarose, celobiose ou maltose), melaço, amido ou seus derivados, hemiceluloses e combinações entre eles. A glucose é uma fonte especialmente preferida de carbono simples. Outra destas fontes preferida é a sacarose. A fonte de carbono pode ser derivada de matéria prima renovável. Matéria prima renovável é definida como matéria base necessária para determinados processos industriais, que pode regenerar-se em um curto espaço de tempo e em quantidade suficiente para permitir a sua transformação no produto desejado. Biomassa vegetal, tratada ou não, é uma interessante fonte renovável de carbono.

[037] De acordo com esta invenção, "fonte de enxofre" refere-se a sulfato, tiossulfato, sulfito de hidrogênio, ditionato, ditionito, sulfito, metil mercaptano, dimetilsulfito e outros sulfitos com grupos metil, ou uma combinação das diferentes fontes. Mais preferencialmente, a fonte de enxofre no meio de cultura será sulfato, ou tiossulfato, ou uma mistura dos dois.

[038] "Fonte de nitrogênio" corresponde a um sal de amônio ou um gás de amônio. A fonte de nitrogênio é fornecida sob a forma de amônio ou amoníaco.

[039] Neste contexto, as expressões "atenuação" ou "expressão atenuada" significam que a produção de um gene ou a produção de uma enzima estão diminuídas ou suprimidas quando comparadas com as do microrganismo não modificado, levando a uma diminuição da concentração intracelular de um ácido ribonucleico, uma proteína ou uma enzima, por comparação com o microrganismo não modificado. O especialista no assunto conhece diferentes meios e métodos para medir a concentração de ácido ribonucleico ou proteína na célula, incluindo, por exemplo, o uso de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) por transcrição reversa (RT-PCR) e Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (qPCR) para determinar a concentração de ácido ribonucleico, e a utilização de um anticorpo específico para determinar a concentração de uma proteína específica.

[040] A diminuição ou supressão da produção de uma enzima é obtida através da atenuação da expressão do gene que a codifica.

[041] A atenuação de genes pode ser conseguida através de métodos conhecidos dos especialistas no assunto. Duma forma geral, a atenuação de genes pode ser obtida das seguintes formas: o mutando a região codificante ou a região promotora, ou o deletando a totalidade ou parte da região promotora necessária à expressão do gene, ou o deletando a totalidade ou parte da região codificadora do gene por recombinação homóloga, ou o inserindo um elemento externo na região codificadora ou na região promotora, ou o expressando o gene sob o controle de um promotor fraco ou um promotor induzível.

[042] O especialista no assunto conhecerá uma variedade de promotores com diferentes forças e saberá qual utilizar para obter uma expressão genética fraca ou induzível.

[043] O termo “atividade” de uma enzima é usado de forma intercambiável com o termo “função” e designa, no contexto desta invenção, a reação que é catalisada pela enzima. O especialista no assunto saberá medir a atividade enzimática da enzima em questão.

[044] Os termos “atividade atenuada” ou “atividade reduzida” de uma enzima referem-se a uma redução da atividade catalítica específica da proteína obtida por mutação na sequência de aminoácidos e/ou concentrações diminuídas da proteína na célula obtidas por mutação da sequência nucleotídica ou por deleção da região codificante do gene.

[045] Os termos “atividade aumentada” ou “atividade melhorada” de uma enzima designam um aumento da atividade catalítica específica da enzima e/ou um aumento da quantidade/disponibilidade da enzima na célula, obtida, por exemplo, pela sobre-expressão do gene que a codifica.

[046] Os termos “expressão aumentada”, “expressão melhorada” ou “sobre-expressão” e seus equivalentes gramaticais, são usados de forma intercambiável no texto e têm significado idêntico. Estes termos significam que a expressão de um gene ou a produção de uma enzima está aumentada quando comparada com o microrganismo não modificado, levando a um aumento da concentração intracelular de um ácido ribonucleico, uma proteína ou uma enzima, quando comparada com o microrganismo não modificado. O especialista no assunto conhecerá diferentes meios e métodos para medição da concentração de ácido ribonucleico ou de proteína na célula, por exemplo, PCR por transcrição reversa (RT-PCR) e PCR em tempo real (qPCR) para determinar a concentração de ácido ribonucleico e o uso de anticorpos específicos para determinar a concentração de uma proteína específica.

[047] O aumento da produção de uma enzima é obtido aumentando a expressão do gene que a codifica.

[048] Para aumentar a expressão de um gene, o especialista no assunto conhecerá diferentes técnicas, como: o aumento do número de cópias do gene no microrganismo. O gene é codificado cromossômica ou extracromossicamente. Quando o gene está localizado no cromossomo, podem ser introduzidas várias cópias do gene no cromossomo através de métodos de recombinação, conhecidos do especialista no assunto (incluindo substituição de genes). Quando o gene está localizado extracromossicamente, ele poderá ser transportado por diversos tipos de plasmídeos, que diferem ao nível da sua origem de replicação e, assim, do seu número de cópias na célula. Estes plasmídeos estão presentes no microrganismo em número de 1 a 5 cópias, ou cerca de 20 cópias, ou até 500 cópias, dependendo do tipo de plasmídeo: plasmídeos de baixo número de cópias com replicação controlada (pSC101, RK2), plasmídeos de baixo número de cópias (pACYC, pRSF1010) ou plasmídeos de elevado número de cópias (pSK bluescript II). o utilização de um promotor, levando a um nível elevado de expressão do gene. O especialista no assunto sabe quais os promotores mais convenientes, por exemplo, os promotores Ptrc, Ptac, Plac, ou o promotor lambda cI são amplamente utilizados. Estes promotores podem ser “indutíveis” por um composto particular ou condição externa específica, como luz ou temperatura. Estes promotores podem ser homólogos ou heterólogos. o atenuação da atividade ou expressão de um repressor de transcrição específico, ou não, para o gene. o uso de elementos estabilizadores do RNA mensageiro correspondente (Carrier e Keasling, 1999) ou elementos estabilizadores da proteína (por exemplo, etiquetas GST, GE Healthcare).

[049] Os termos “codificando” ou “codificante” relacionam-se ao processo pelo qual um polinucleotídeo, através dos mecanismos de transcrição e translação, produz uma sequência de aminoácidos. O(s) gene(s) que codificam a(s) enzima(s) podem ser exógenos ou endógenos.

[050] Os termos “sensibilidade de feed-back” ou “inibição de feed-back” referem-se a um mecanismo de controle celular no qual uma ou várias enzimas que catalisam a produção de uma dada substância na célula são inibidas ou sua atividade reduzida quando essa substância se acumulou até um certo nível. Assim, os termos “sensibilidade de feed-back reduzida” ou “inibição de feedback reduzida” significam que a atividade desse mecanismo se encontra diminuída ou suprimida quando comparada com a do microrganismo não modificado. O especialista no assunto sabe como modificar a enzima para obter este resultado. Tais modificações foram descritas no pedido de patente WO2005/111202 ou na patente US7,611,873.

[051] Em uma primeira modalidade da invenção, uma cepa recombinante de Escherichia coli é otimizada para a produção fermentativa de metionina e/ou seus derivados, atenuando a captação de metionina e aumentando o efluxo de metionina no referido microrganismo.

[052] Como descrito acima, a importação de metionina é mediada pelo sistema de captação de metionina MetD codificado pelos genes metN, metI e metQ, anteriormente chamados abc, yaeE, e yaeC respectivamente. Estes genes foram identificados em diversos microrganismos, entre eles E. coli e C. glutamicum. MetNIQ pertence à famosa família de transportadores ABC.

[053] Em uma modalidade da invenção, a expressão de pelo menos um gene escolhido entre metN, metI e metQ está atenuado no microrganismo recombinante. O especialista no assunto conhece diferentes meios para atenuar a expressão gênica, como clonar o gene a ser atenuado sob o controle de um promotor indutível ou fraco, deletando a totalidade ou parte da região promotora ou região codificadora do gene a ser atenuado. Preferivelmente, pelo menos um dos genes metN, metI e metQ está deletado. Mais preferencialmente, os três genes metN, metI e metQ estão deletados no microrganismo recombinante da invenção.

[054] Em microrganismos produtores de aminoácidos, a metionina é excretada por um transportador específico de efluxo. Particularmente em E. coli, este transportador é designado YgaZH e é codificado pelos genes ygaZ e ygaH, enquanto que em C. glutamicum, é designado BrnFE e codificado pelos genes brnF e brnE. Foram identificados homólogos funcionais deste sistema de efluxo de metionina em diversos outros microrganismos. Em alternativa, o microrganismo recombinante da invenção pode sobre-expressar homólogos funcionais dos sistemas YgaZH ou BrnFE. São apresentadas proteínas homólogas de YgaZ e YgaH respectivamente na tabela 1 e tabela 2. Tabela 1: proteínas homólogas de YgaZ Tabela 2: proteínas homólogas de YgaH

[055] Utilizando o número de acesso indicado nas tabelas para cada homólogo, o especialista no assunto poderá obter a sequência de aminoácidos e a sequência de nucleotídeos que a codifica, por exemplo, nos bancos de dados do NCBI.

[056] A partir da sequência de aminoácidos ou sequência nucleotídica, é uma tarefa de rotina para o especialista no assunto obter genes codificando estes homólogos. Isto pode ser feito tanto por síntese artificial do gene que codifica a proteína de interesse a partir da sua sequência de aminoácidos, como através de amplificação por PCR da região codificante de interesse a partir do DNA genômico correspondente. No contexto desta invenção, estes genes são designados “genes homólogos de ygaZ ou ygaH”. As sequências destes genes homólogos de ygaZH podem ser ajustadas ao desvio de códons do microrganismo hospedeiro.

[057] Em uma modalidade específica da invenção, o microrganismo recombinante sobre-expressa os genes ygaZ e ygaH, que codificam as proteínas cujas sequências estão divulgadas respectivamente em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 genes homólogos dos mesmos. De preferência, os genes homólogos de ygaZ e ygaH serão um par de genes oriundos do mesmo organismo, composto pelo gene homólogo de ygaZ e o gene homólogo de ygaH. No entanto, poderá usar-se um par irregular com um gene homólogo de ygaZ de um primeiro organismo e um gene homólogo de ygaH de um segundo organismo. De preferência, os genes ygaZH, brnFE ou seus genes homólogos são sobre-expressos.

[058] Os genes homólogos de YgaZH são escolhidos de entre genes codificando os homólogos de YgaZ e YgaH divulgados, respectivamente, nas tabelas 1 e 2. Preferencialmente, os genes homólogos de ygaZH são escolhidos de entre genes codificando homólogos de YgaZH de espécies de Citrobacter, Shigella, Raoultella, Enterobacter, Yersinia e Photorhabdus. Mais preferencialmente, os genes homólogos de ygaZH serão originários de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii. Mais preferivelmente, os genes homólogos de ygaZH procederão de Citrobacter koseri, Citrobacter youngae, Citrobacter freundii ou Enterobacter sp..

[059] Assim, os genes homólogos de ygaZH são escolhidos preferivelmente entre genes codificando o par constituído por homólogo de YgaZ e homólogo de YgaH definido respectivamente por: SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 de Citrobacter koseri, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 de Shigella flexneri, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 de Raoultella ornithinolytica, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10 de Enterobacter sp. (R4-368), SEQ ID NO: 11 ou 12 e SEQ ID NO: 13 ou 14 de Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16 de Photorhabdus luminescens subsp. laumondii, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 de Citrobacter youngae, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20 de Citrobacter freundii.

[060] Em uma modalidade específica, o microrganismo recombinante é caracterizado por: o atenuação de pelo menos um dos genes metN, metI ou metQ; e o sobre-expressão dos genes ygaZH ou genes seus homólogos originários de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii.

[061] Em outra modalidade específica, o microrganismo recombinante é caracterizado por: o atenuação do gene metN; e o sobre-expressão dos genes ygaZH ou seus genes homólogos de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii.

[062] Em outra modalidade específica, o microrganismo recombinante é caracterizado por: o atenuação do gene metI; e o sobre-expressão dos genes ygaZH ou seus genes homólogos de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii.

[063] Em outra modalidade específica, o microrganismo recombinante é caracterizado por: o atenuação do gene metQ; e o sobre-expressão dos genes ygaZH ou genes seus homólogos de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii.

[064] Em outra modalidade específica, o microrganismo recombinante é caracterizado por: o atenuação dos genes metN, metI e metQ; e o sobre-expressão dos genes ygaZH ou seus genes homólogos de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii.

[065] Em uma modalidade preferida da invenção, estes genes são sobre-expressos sob o controle de um promotor induzível. Por exemplo, promotores como ÀPR ou ÀPL podem ser usados para sobre-expressar genes ygaZH ou genes homólogos de ygaZH originários de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii no microrganismo recombinante da invenção.

[066] Outro objetivo da invenção é identificar genes homólogos de ygaZH e obter a sua sobre-expressão em um microrganismo produtor de aminoácidos, isoladamente ou em combinação com outras modificações genéticas, como discutido abaixo.

Otimização da via de biossíntese de metionina

[067] O microrganismo recombinante, de acordo com a invenção, é modificado para aumentar a produção de metionina. Os genes envolvidos na produção de metionina são bem conhecidos na área e compreendem genes envolvidos na via de biossíntese específica de metionina, assim como genes envolvidos em vias fornecedoras de precursores e genes envolvidos em vias que consomem metionina.

[068] A produção eficiente de metionina requer a otimização da via específica de metionina e várias vias produtoras de precursores. Foram já descritas cepas produtoras de metionina, em particular nos pedidos de patente WO2005/111202, WO2007/077041 e WO2009/043803. Estes pedidos foram incorporados como referência no presente pedido.

[069] Salvo indicação em contrário, todos os genes mencionados abaixo com relação à otimização da via de biossíntese de metionina referem-se a genes de E. coli.

[070] Em uma modalidade específica da invenção, o microrganismo recombinante é modificado como descrito abaixo: a expressão de pelo menos um gene escolhido entre ptsG, pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metH, fldA, fpr, metA, alelo de metA* codificando para uma enzima com sensibilidade de feed-back a S-adenosilmetionina e/ou metionina reduzida, thrA, e alelo de thrA* codificando para uma enzima com inibição por feedback reduzida para treonina, se encontra aumentada. o ptsG codifica a enzima PTS IICBGlc, como descrito no pedido de patente WO2013/001055, o pyc codifica uma piruvato carboxilase, como descrito no pedido de patente WO2013/001055. Em uma modalidade preferida, o gene pyc é heterólogo e escolhido de entre genes pyc de Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, Pseudomonas fluorescens ou espécies de Corynebacterium, o pntAB codificam subunidades de uma transidrogenase ligada à membrana, tal como descrito no pedido de patente WO2012/055798, o cysP codifica uma proteína periplasmática de ligação a sulfato, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o cysU codifica um componente de transportador de sulfato de tipo ABC, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o cysW codifica uma proteína transportadora de sulfato ligada à membrana, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o cysA codifica uma sulfato permease, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o cysM codifica uma O-acetilserina sulfidralase, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o cysI e cysJ codificam respectivamente as subunidades alfa e beta duma sulfito redutase como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803. De preferência, cysI e cysJ são sobre-expressas em conjunto, o cysH codifica um adenililsulfato redutase, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803.

[071] O aumento do metabolismo C1 constitui também uma modificação que leva à produção aumentada de metionina. Ele relaciona-se ao aumento de atividade de pelo menos uma enzima envolvida no metabolismo C1, escolhida entre GcvTHP, Lpd, MetF ou MetH. Em uma modalidade preferida da invenção, o metabolismo C1 é aumentado melhorando a expressão e/ou atividade de pelo menos um dos seguintes: o gcvT, gcvH, gcvP, e lpd, codificando o complexo de clivagem de glicina, como descrito no pedido de patente WO2007/077041. O complexo de clivagem de glicina (GCV) é um complexo multienzimático que catalisa a oxidação de glicina, produzindo dióxido de carbono, amônia, metileno-THF e um nucleotídeo de piridina reduzido. O complexo GCV consiste em quatro componentes proteicos: a glicina desidrogenase, a referida proteína P (GcvP), a lipoilproteína-GcvH, a referida proteína H (GcvH), a aminometiltransferase, a referida proteína T (GcvT), e a diidrolipoamida desidrogenase, a referida proteína L (GcvL ou Lpd). A proteína P catalisa a libertação de CO2 dependente de piridoxal fosfato a partir de glicina, daí resultando uma fração de metilamina. Esta fração de metilamina é transferida para o grupo ácido lipóico da proteína H, que se encontra ligado à proteína P anteriormente à descarboxilação da glicina. A proteína T catalisa a libertação de NH3 a partir do grupo metilamina e transfere a restante unidade C1 para THF, formando metileno-THF. A proteína L oxida então o componente de ácido lipóico da proteína H e transfere os elétrons para NAD+, formando NADH; o MetF codificando uma metilenotetraidrofolato redutase, como descrito no pedido de patente WO2007/077041; o MetH (homocisteína-N5-metiltetraidrofolato transmetilase dependente de B12) codificando metiltransferases.

[072] A sobre-expressão de pelo menos um dos seguintes genes envolvidos na biossíntese de serina também reduz a produção do subproduto isoleucina: o serA que codifica uma fosfoglicerato desidrogenase, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o serB que codifica uma fosfosserina fosfatase, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o serC que codifica uma fosfosserina aminotransferase, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803.

[073] Já foi demonstrado que a sobre-expressão dos seguintes genes aumenta a produção de metionina: o cysE codifica uma serina aciltransferase; a sua sobre- expressão permite um aumento na produção de metionina, como descrito em WO2007/077041; o metA codifica uma homosserina succiniltransferase. O alelo metA* codifica uma enzima com sensibilidade de feed-back reduzida a S-adenosilmetionina e/ou metionina. Preferencialmente, usa-se o alelo metA* descrito no pedido de patente WO2005/111202; o thrA codifica uma aspartoquinase/homosserina desidrogenase; o alelo thrA* codifica uma enzima com inibição de feed-back reduzida para treonina, como descrito em WO2005/111202.

[074] Em uma modalidade específica da invenção, os genes podem estar sob o controle de um promotor indutível. Em uma modalidade preferida da invenção, pelo menos um destes genes está sob o controle de um promotor indutível por temperatura. De preferência, a expressão de pelo menos um dos seguintes genes: thrA, cysE, metA, está sob o controle de um promotor indutível, direta or indiretamente. Mais preferencialmente, os genes thrA, cysE e metA estão sob o controle de um promotor indutível, direta ou indiretamente. Em uma modalidade preferida da invenção, a expressão do gene thrA está sob controle direto de um promotor indutível e a expressão do gene cysE está sob efeito polar da expressão indutível do gene thrA. Em outra modalidade preferida da invenção, a expressão do gene thrA encontra-se sob controle direto de um promotor indutível e a expressão dos genes cysE e metA está sob efeito polar da expressão indutível do gene thrA.

[075] Em uma modalidade mais preferida, o promotor indutível por temperatura pertence à família de promotores PR. Uma cepa produtora de metionina com genes sob o controle de promotores indutíveis está descrita no pedido de patente WO2011/073122.

[076] Em outra modalidade específica da invenção, o microrganismo foi sujeito a mais modificações, e a expressão de pelo menos um dos seguintes genes está atenuada: metJ, pykA, pykF, purU, ybdL, yncA, metE, dgsA, ou udhA. o O gene metJ codifica a proteína repressora MetJ (GenBank 1790373), responsável pela regulação negativa do regulon de metionina, como sugerido no pedido de patente JP2000/157267, o Os genes pykA e pykF codificam as enzimas ‘piruvato quinase’. A atenuação da expressão de pelo menos uma ou ambas piruvato quinases diminui o consumo de fosfoenol piruvato (PEP). Disponibilidade aumentada de PEP pode aumentar a produção de oxaloacetato, um precursor importante de aspartato, que, por sua vez, é um precursor de metionina, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o purU codifica uma formiltetraidrofolato desformilase, uma enzima que catalisa a reação formil-THF desformilase. A atenuação da atividade da desformilase aumenta a produção de metil-THF que é necessária para a metilação de homocisteína. A perda de metabolitos C1 por desformilação leva a um aumento da produção de homocisteína que não pode ser transformada em metionina. A homocisteína pode então constituir substrato para a enzima cistationina gamma sintase (MetB), que pode catalisar a reação entre O-succinil homosserina e homocisteína, resultando na produção de homolantionina, como descrito em WO2007/077041 e em WO2009/043803, o ybdL codifica uma aminotransferase como descrito no pedido de patente WO2012/090021, o yncA codifica uma N-aciltransferase, como descrito no pedido de patente WO2010/020681, o metE codifica uma metionina sintase independente de cobalamina, como descrito no pedido de patente PCT/IB2012/001336, o dgsA, mais conhecido como Mlc, codifica um regulador de transcrição duplo que controla a expressão de genes codificando enzimas dos sistemas fosfotransferase (PTS) e fosfoenolpiruvato (PEP) como descrito no pedido de patente WO2013/001055, o udhA codifica nucleotídeo piridina transidrogenase solúvel, como descrito no pedido de patente WO2012/055798.

[077] Em uma modalidade mais preferida da invenção, a produção fermentativa de metionina e/ou seus derivados por um microrganismo recombinante, em que a importação de metionina está atenuada e o efluxo de metionina aumentado, a partir de glucose como fonte principal de carbono, pode ser conseguida através de uma combinação das modificações no referido microrganismo discutidas acima, por exemplo: o a expressão do gene metJ está atenuada e a expressão de um alelo de metA* codificando uma enzima com sensibilidade de feed-back reduzida a S- adenosilmetionina e/ou metionina (MetA*) está aumentada; o a expressão do gene metJ está atenuada; a expressão de um alelo de metA* codificando uma enzima com sensibilidade de feed-back reduzida a S- adenosilmetionina e/ou metionina (MetA*) está aumentada; e a expressão de um alelo de thrA* codificando uma enzima com inibição de feed-back reduzida para treonina (thrA*) está aumentada; o a expressão do gene metJ está atenuada; a expressão de um alelo de metA* codificando uma enzima com sensibilidade de feed-back reduzida a S- adenosilmetionina e/ou metionina (MetA*) está aumentada; a expressão de um alelo de thrA* codificando uma enzima com inibição de feed-back reduzida para treonina (thrA*) está aumentada; e a expressão do gene cysE está aumentada; o a expressão do gene metJ está atenuada; a expressão de um alelo de metA* codificando uma enzima com sensibilidade de feed-back reduzida a S- adenosilmetionina e/ou metionina (MetA*) está aumentada; a expressão de um alelo de thrA* codificando uma enzima com inibição de feed-back reduzida para treonina (thrA*) está aumentada; a expressão do gene cysE está aumentada; e a expressão dos genes metF está aumentada.

[078] Em uma modalidade particular da invenção, o microrganismo recombinante compreende as seguintes modificações genéticas: o os genes metN, metI, metQ estão deletados e os genes ygaZ e ygaH ou seus genes homólogos originários de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii estão sobre-expressos, o a expressão dos genes metA*, metH, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serA, serB, serC, cysE, thrA*, ptsG e pyc está aumentada, e o a expressão dos genes metJ, pykA, pykF, purU, metE, dgsA e yncA está atenuada.

[079] Em uma modalidade particular da invenção, o microrganismo provém da família bacteriana Enterobacteriaceae ou Corynebacteriaceae.

[080] Preferencialmente, o microrganismo é Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum. Mais preferencialmente, o microrganismo da invenção é E. coli.

Condições de cultura

[081] Em uma segunda modalidade da invenção, é otimizado um método para a produção fermentativa de metionina e/ou seus derivados. Ele compreende as seguintes etapas: o cultivo de um microrganismo recombinante em que a importação de metionina é atenuada pela atenuação da expressão de pelo menos um gene entre metN, metI, metQ e o efluxo de metionina está aumentado pela sobre- expressão dos genes ygaZH ou seus genes homólogos em um meio de cultura apropriado contendo uma fonte fermentável de carbono e uma fonte de enxofre, e, o recuperação de metionina e/ou seus derivados a partir do meio de cultura.

[082] O especialsta no assunto é capaz de definir as condições de cultura para os microrganismos de acordo com a invenção. Em particular as bactérias são fermentadas a uma temperatura entre 20°C e 55°C, preferencialmente entre 25°C e 40°C, e mais especificamente cerca de 30°C para C. glutamicum e cerca de 37°C para E. coli.

[083] Para E. coli, o meio de cultura pode ser de composição idêntica ou semelhante a um meio M9 (Anderson, 1946), um meio M63 (Miller, 1992); ou um meio como definido por Schaefer et al., (1999).

[084] Para C. glutamicum, o meio de cultura pode ser de composição idêntica ou semelhante a um meio BMCG (Liebl et al., 1989) ou a um meio como descrito por Riedel et al., (2001).

[085] No método da invenção, os genes homólogos de ygaZH que estão em sobre-expressão no microrganismo recombinante são escolhidos de preferência entre o grupo que compreende genes homólogos de espécies de Citrobacter, Shigella, Raoultella, Enterobacter, Yersinia e Photorhabdus, e mais preferencialmente originários de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii.

[086] De acordo com uma modalidade específica da invenção, o método é realizado com um microrganismo recombinante que compreende: a. deleção de pelo menos um gene escolhido entre metN, metI ou metQ, e b. sobre-expressão dos genes ygaZH ou seus genes homólogos.

[087] Nesta modalidade específica do método da invenção, os ditos genes homólogos de ygaZH são escolhidos, de preferência, de entre o grupo que consiste em genes homólogos originários de espécies de Citrobacter, Shigella, Raoultella, Enterobacter, Yersinia e Photorhabdus, e, mais preferencialmente, escolhidos de entre o grupo consistindo em genes homólogos originários de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii.

[088] No método da invenção, os genes homólogos de ygaZH que estão sobre-expressos no microrganismo recombinante são, mais preferivemente, originários de Citrobacter koseri, Citrobacter youngae, Citrobacter freundii ou Enterobacter sp..

[089] Em uma modalidade da invenção, o crescimento do microrganismo recombinante é sujeito a uma limitação ou carência de um ou vários substratos inorgânicos, em particular fosfato e/ou potássio, no meio de cultura. Ela relaciona-se à condição na qual o crescimento dos microrganismos é determinado pela quantidade de um químico inorgânico fornecido que ainda permite crescimento fraco. Tal limitação no crescimento do microrganismo foi descrita no pedido de patente WO2009/043372. Em uma modalidade preferida da invenção, a cultura é submetida a limitação em fosfato. Em uma modalidade particular do método da invenção, o microrganismo recombinante pretence à família bacteriana Enterobacteriaceae ou Corynebacteriaceae. Preferencialmente, o microrganismo recombinante é Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum, e, mais preferencialmente, o microrganismo recombinante da invenção é E. coli.

[090] A ação de “recuperação de metionina e/ou seus derivados a partir do meio de cultura” designa a ação de recuperar L-metionina e/ou um dos seus derivados, em particular, N-acetil metionina (NAM) e S-adenosil metionina (SAM) e todos os outros derivados que possam ser úteis, como hidroximetionina (ou um análogo de hidroximetionina ou MHA). Os métodos para a recuperação e purificação dos compostos produzidos são do conhecimento do especialista no assunto (ver, em particular, WO2005/007862, WO2005/059155). De preferência, a etapa de recuperação de metionina e/ou seus derivados compreende uma etapa de concentração de metionina e/ou seus derivados no caldo de fermentação.

[091] A quantidade de produto no meio de fermentação pode ser determinada usando diversos métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou cromatografia gasosa (GC). Por exemplo, a quantidade de metionina obtida no meio é medida por HPLC após derivatização com OPA/Fmoc usando L- metionina (Fluka, Ref 64319) como padrão. A quantidade de NAM é determinada por HPLC refratométrico usando NAM (Sigma, Ref 01310) como padrão.

EXEMPLOS

[092] A presente invenção é adicionalmente definida nos exemplos que se seguem. Deve entender-se que estes exemplos, ainda que indiquem modalidades preferidas da invenção, são dados apenas a título ilustrativo. A partir do que foi divulgado acima e destes exemplos, o especialista no assunto pode fazer várias alterações à invenção para adaptá-la a vários usos e condições sem modificar os meios essenciais da invenção.

[093] Em particular, os exemplos mostram cepas modificadas de Escherichia coli (E. coli), mas estas modificações podem ser facilmente realizadas em outros microrganismos da mesma família.

[094] Escherichia coli pertence à família Enterobacteriaceae, que compreende membros Gram-negativos, com formato de bastonete, não formadores de esporos, que têm tipicamente 1-5 μm de comprimento. A maioria deles tem flagelos, usados para movimentar-se, mas alguns gêneros não têm motilidade. Muitos membros desta família fazem parte normal da flora intestinal de humanos e outros animais, enquanto outros podem ser encontrados na água ou no solo, ou são parasitas de uma variedade de diferentes animais e plantas. E. coli é um dos organismos modelo mais importantes, mas a família Enterobacteriaceae compreende outros membros importantes como Klebsiella, em particular Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola ou Klebsiella oxytoca, e Salmonella.

[095] Ademais, vários pedidos de patente apontam que a otimização para produção de metionina pode ser facilmente aplicada em E. coli e em Corynebacterium glutamicum sem experimentação excessiva.

PROTOCOLOS

[096] Foram usados vários protocolos para construir cepas produtoras de metionina, descritos nos exemplos seguintes.

[097] Protocolo 1 (Modificações cromossômicas por recombinação homóloga e seleção de recombinantes) e Protocolo 2 (Transdução do fago P1), usados nesta invenção, foram descritos integralmente no pedido de patente WO2013/001055.

Protocolo 3: Construção de plasmídeos recombinantes

[098] A tecnologia de DNA recombinante encontra-se bem descrita e é conhecida do especialista no assunto.

[099] Resumidamente, os fragmentos de DNA foram amplificados por PCR usando oligonucleotídeos (que o especialista no assunto saberá definir) e DNA genômico MG1655 como matriz. Os fragmentos de DNA e plasmídeo seleccionado foram digeridos com enzima de restrição compatível (que o especialista no assunto sabe definir), depois ligados e transformados em células competentes. Os transformantes foram analisados e os plasmídeos recombinantes de interesse verificados por sequenciação de DNA. Tabela 3: Sequências oligonucleotídicas citadas nos exemplos seguintes

Protocolo 4: Cura plasmidial

[0100] Este método de cura plasmidial baseia-se em eletroporação de alta-voltagem, normalmente usada para transformar DNA. Neste método, o princípio é muito idêntico exceto não ser adicionado nenhum DNA à célula antes do choque elétrico (Heery et al, 1989).

[0101] As tecnologias de transformação de DNA encontram-se bem descritas e são conhecidas do especialista no assunto.

[0102] Resumidamente, a cepa para a qual o plasmídeo tem que ser removido foi cultivada até à fase de crescimento exponencial. As células foram então peletizadas e lavadas três vezes em água deionizada estéril. As células foram incubadas em gelo por 5 a 10 minutos antes, para passar por um pulso elétrico a 2,50kV, 25μF (constante de tempo aproximada 4,5ms). Adicionou-se 1 mL de tampão SOC imediatamente após o pulso e as células foram cultivadas a temperatura apropriada por 1 a 2 horas, antes de ser colocadas em placas com meio não-seletivo para eliminação do plasmídeo (são adicionados antibióticos de acordo com os outros plasmídeos a manter na cepa). Após isolamento das células curadas, foi verificada a ausência de plasmídeo.

[0103] EXEMPLO 1: Sobre-expressão de um sistema de secreção de L-metionina em uma cepa recombinante de E. coli sobre-produtora de L-metionina- Construção da cepa 1

[0104] A cepa produtora de metionina 16, descrita no pedido de patente WO2013/001055 (incorporado como referência neste pedido), foi usada como cepa recipiente. Esta cepa contém a mutação no gene metE revelada no pedido de patente WO2013/190343.

[0105] O gene codificando metionina sintase dependente de cobalamina, metH, foi sobre-produzido usando o mesmo promotor e sítio de ligação com ribossomo como descrito no pedido de patente WO2007/077041 e um cromossomo bacteriano artificial (pCC1BAC, Epicentre). Mais precisamente, o gene metH e o promotor artificial foram clonados no plasmídeo tipo pCC1BAC contido na cepa, descrito no pedido de patente WO2013/001055. Este plasmídeo foi nomeado pME1109.

[0106] Em paralelo, os genes fldA e fpr codificando o sistema de reativação de MetH, foram sobre-expressos a partir do plasmídeo de número de cópias moderado pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990) usando seus promotores naturais. Este plasmídeo foi nomeado pME1089.

[0107] Em terceiro lugar, os genes ygaZH codificando o exportador de metionina, foram sobre- expressos. Eles foram clonados no plasmídeo de número de cópias moderado pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990) usando o promotor natural de ygaZ. Mais precisamente, o operon de ygaZH e seu promotor foram clonados no pME1089 descrito acima. Este plasmídeo foi nomeado pME1219.

[0108] Por último, os plasmídeos pME1109 e pME1219 foram transformados na cepa produtora de metionina 16 do pedido de patente WO2013/001055, resultando na cepa 1.

[0109] EXEMPLO 2: Deleção do sistema de captação de L-metionina em uma cepa de E. coli sobre-produtora de L- metionina - Construção das cepas 2, 3, 4 e 5

[0110] A cepa 16 produtora de metionina do pedido de patente WO2013/001055 foi transformada com os plasmídeos pME1109 e pME1089 (descritos no Exemplo 1), originando a cepa 2.

[0111] Para inativar o importador de metionina codificado pelo operon metNIQ na cepa 2, usou-se a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner, 2000 (de acordo com o Protocolo 1). Assim, os oligonucleotídeos Ome0233/Ome0232 (SEQ ID NO 21 e 22 listados na tabela 1) foram usados para amplificação por PCR da cassette de resistência a cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. O produto de PCR obtido foi então introduzido na cepa MG1655 metA*11 (pKD46) por eletroporação. Os transformantes resistentes a cloranfenicol foram então selecionados e a inserção da cassette de resistência foi verificada por análise de PCR com oligonucleotídeos apropriados. A cepa retida foi designada MG1655 metA*11 ΔmetNIQ::Cm. Por último, a deleção ΔmetNIQ::Cm foi transferida por transdução por fago P1 (de acordo com o protocolo 2) da cepa MG1655 metA*11 ΔmetNIQ::Cm para a cepa 2. Selecionaram-se transdutantes resistentes a cloranfenicol e verificou-se a presença da deleção cromossômica ΔmetNIQ::Cm por PCR com oligonucleotídeos apropriados. A cepa retida foi designada cepa 3.

[0112] Da mesma forma, os 3 genes, metN, metI e metQ foram deletados ne cepa 1 descrita no pedido de patente WO2013/001055. Esta cepa 1 do pedido de patente WO2013/001055, é aqui renomeada como cepa 4 para ser a referência da cepa 5.

[0113] A deleção de metNIQ realizada na cepa 4 como descrito acima, deu origem à cepa 5.

[0114] EXEMPLO 3: Combinação da sobre-expressão de um sistema de secreção de L-metionina com a deleção do sistema de captação de L-metionina em uma cepa de E. coli sobre-produtora de L-metionina - Construção da cepa 6

[0115] Para inativar o importador de metionina codificado pelo operon metNIQ na cepa que sobre-produz o exportador de metionina codificado pelo operon ygaZH, a deleção ΔmetNIQ::Cm foi transferida por transdução por fago P1 (de acordo como o Protocolo 2) da cepa MG1655 metA*11 ΔmetNIQ::Cm para a cepa 1 produtora de metionina. Selecionaram-se os transdutantes resistentes a cloranfenicol e verificou-se a presença da deleção cromossômica ΔmetNIQ::Cm por PCR com oligonucleotídeos apropriados. A cepa retida foi designada cepa 6.

[0116] EXEMPLO 4: Produção fermentativa de L- metionina em biorreator

[0117] Cepas produtoras de L-metionina foram testadas sob condições de produção em reatores 2,5 L (Pierre Guerin) usando uma estratégia de batelada alimentada.

[0118] Resumidamente, foi usada uma cultura de 24 horas cultivada em 10 mL de meio LB com 2,5 g.L-1 de glucose para inocular uma pré-cultura de 24 horas em meio mínimo (B1a). Estas incubações foram feitas em frascos com defletores de 500 mL contendo 50 mL de meio mínimo (B1a) em um agitador rotativo (200 RPM). A primeira pré-cultura foi realizada a uma temperatura de 30°C, a segunda a uma temperatura de 34°C.

[0119] Uma terceira etapa de pré-cultura foi levado a cabo em biorreatores (Sixfors) preenchidos com 200 mL de meio mínimo (B1b) inoculado para uma concentração de biomassa de 1,2 g.L-1 com 5 mL de pré-cultura concentrada. A temperatura da pré-cultura foi mantida constante a 34°C e o pH automaticamente ajustado para um valor de 6,8 usando uma solução de NH4OH a 10%. A concentração de oxigênio dissolvido foi continuamente ajustada para um valor de 30% da saturação de pressão de ar parcial com fornecimento de ar e/ou agitação. Após esgotamento da glucose no meio de batelada, iniciou-se batelada alimentada com um quociente de vazão inicial de 0,7 mL.h-1, antes de aumentar exponencialmente por 26 horas com uma taxa de crescimento de 0,13 h-1 a fim de obter uma concentração celular final de aproximadamente 20 g.L-1. Tabela 4: Composição do meio mineral de batelada da pré- cultura (B1a e B1b) Tabela 5: Composição do meio mineral de batelada alimentada da pré-cultura (F1)

[0120] Subsequentemente, fermentadores de 2,5 L (Pierre Guerin) foram preenchidos com 600 ou 620 mL de meio mínimo (B2) e foram inoculados para uma concentração de biomassa de 3,2 g.L-1 com um volume de pré-cultura variando entre 80 e 100 mL.

[0121] O crescimento celular é controlado por fosfato, sendo por isso que a concentração final de fosfato no meio de batelada B2 foi ajustado para um valor compreendido entre 0 e 20 mM, adicionando diferentes concentrações de KH2PO4, K2HPO4 e (NH4)2HPO4. Do mesmo modo, a concentração final de fosfato do meio F2 foi ajustada para um valor compreendido entre 5 e 30 mM, adicionando diferentes concentrações de KH2PO4, K2HPO4 e (NH4)2HPO4. A concentração de tiossulfato no meio de batelada alimentada pode ser ajustada de forma a prevenir a deficiência deste composto durante o cultivo. Tabela 6: Composição do meio mineral de batelada da cultura (B2) Tabela 7: Composição do meio mineral de batelada alimentada da cultura (F2)

[0122] A temperatura de cultivo foi mantida constante a 37 °C e o pH mantido no valor de trabalho (6,8) por adição automática de soluções de NH4OH (10% e 28%). A taxa de agitação inicial foi fixada em 200 RPM durante a fase de batelada e foi aumentada até 1000 RPM durante a fase de batelada alimentada. A taxa inicial de circulação de ar foi fixada em 40 NL.h-1 durante a fase de batelada e aumentada para 100 NL.h-1 no início da fase de batelada alimentada. A concentração de oxigênio dissolvido foi mantida em valores entre 20 e 40%, preferencialmente 30% de saturação, por aumento da agitação.

[0123] Foi adicionado IPTG aos meios de batelada e batelada alimentada quando necessário, em concentração final de 20 μM. Quando necessário, foram adicionados antibióticos em concentração de 50 mg.L-1 para espectinomicina, 30 mg.L-1 para cloranfenicol e 100 mg.L-1 para ampicilina.

[0124] Quando a massa celular atingiu uma concentração próxima a 5 g.L-1, iniciou-se a batelada alimentada com um quociente de vazão inicial de 5 mL.h-1. A solução de alimentação foi injetada de acordo com uma função sigmóide com um quociente de vazão crescente que atingiu 24 mL.h-1 após 25 horas. As condições precisas de alimentação foram calculadas através da equação: na qual Q(t) é o quociente de vazão de alimentação em mL.h- 1 com p1 = 1,80, p2 = 22,4, p3 = 0,27, p4 = 6,50. Este quociente de vazão foi aumentado de 10 a 50%, de preferência entre 20 e 30% durante todo o cultivo.

[0125] Após 25 horas de batelada alimentada, a bomba de alimentação de solução foi parada e o cultivo foi finalizado após esgotamento da glucose.

[0126] Os aminoácidos extracelulares foram quantificados por HPLC após derivatização com OPA/Fmoc e outros metabolitos relevantes foram analisados usando HPLC com detecção refratométrica (ácidos orgânicos e glucose) e GC-MS após sililação.

[0127] Foi testado o impacto da combinação da deleção do operon metNIQ e/ou sobre-expressão do operon ygaZH na produção de metionina. Os resultados são apresentados na tabela 8 e tabela 9. Tabela 8: Rendimentos máximos e finais de metionina produzida em culturas de batelada alimentada por diferentes cepas. O desempenho das cepas de interesse, cepas 3, 1 e 6 é comparado com a cepa de referência 2, tendo sido cultivadas nas mesmas condições. O símbolo ~ indica que não há diferença entre cepas, o símbolo + indica um aumento entre 1 e 3% e o símbolo ++ indica um aumento superior a 3%. Ver abaixo a definição de rendimento de metionina/glucose.

[0128] Os resultados apresentados na tabela 8 mostram que a deleção do operon metNIQ não traz qualquer benefício à produção de metionina (cepa 3) no fundo genético da cepa 2. Assim, esta modificação genética foi testada na cepa 4 com um fundo genético diferente do da cepa 2. Este ensaio mostra um efeito negative da deleção do operon metNIQ na produção de metionina (ver abaixo tabela 9). As cepas 4 e 5 foram cultivadas em reatores de 2L como descrito no pedido de patente WO2013/001055. Tabela 9: Rendimentos máximos e finais de metionina produzida em culturas de batelada alimentada pela cepa 5. Os desempenhos da cepa de interesse (cepa 5) foram comparados à cepa de referência, cepa 4, cultivada nas mesmas condições. O símbolo - indica uma diminuição maior do que 4% comparado com a cepa de referência. Ver abaixo a definição de rendimento de metionina/glucose.

[0129] Estes resultados mostram que, ao contrário de trabalhos anteriores descritos para C. glutamicum, a deleção isolada do operon metNIQ em E. coli não aumenta a produção de metionina, independentemente do fundo genético (cepas 3 e 5). Ademais, desempenhos da cepa 5 são inferiors ao da sua cepa mãe (cepa 4). Ainda que a sobre-expressão de ygaZH leve a uma produção aumentada de metionina (cepa 1, Tabela 8) no final do cultivo, surpreendentemente, a combinação da deleção do operon metNIQ e sobre-expressão de ygaZH aumenta os desempenhos globais de produção de metionina da cepa 6. Este resultado não era esperado, uma vez que foi demonstrado que a deleção do operon metNIQ é negativa ou neutral nos desempenhos de produção de L- metionina em diferentes fundos genéticos, incluindo a cepa mãe.

Determinação do rendimento de metionina/glucose (Ymet)

[0130] O volume do reator foi calculado adicionando ao volume inicial a quantidade de soluções adicionadas para regulação de pH e alimentação da cultura e subtraindo o volume utilizado para amostragem e perdido por evaporação.

[0131] O volume de batelada alimentada foi seguido continuamente por pesagem do estoque de alimentação. A quantidade de glucose injetada foi então calculada com base no peso injetado, densidade da solução e concentração de glucose determinada pelo método de Brix ([Glucose]). O rendimento de metionina foi expresso da seguinte forma: Em que Metionina0 e Metioninat são, respectivamente, as concentrações de metionina inicial e final e V0 e Vt os volumes inicial e no momento t.

[0132] A glucose consumida foi calculada da seguinte forma: Glucose Injetadat = volume alimentadot * [Glucose] Glucose Consumidat = [Glucose]o * Vo + Glucose Injetada - [Glucose]residual * Vt Em que [Glucose]0, [Glucose], [Glucose] residual são, respectivamente, as concentrações de glucose inicial, injetada e residual.

[0133] EXEMPLO 5: Combinação da deleção do sistema de captação de L-metionina com a sobre-produção de diferentes sistemas de secreção de L-metionina de vários microrganimos em uma cepa de E. coli sobre-produtora de L- metionina - Construção das cepas 7 a 15

[0134] Os genes homólogos de ygaZH originários de espécies de Citrobacter, Raoultella, Shigella, Enterobacter, Yersinia e Photorhabdus foram sobre-expressos no fundo genético da cepa 3.

[0135] Antes de usar a cepa 3, o plasmídeo pME1089 foi removido desta cepa usando o método de cura plasmidial como descrito por Heery et al, 1989 (de acordo com o Protocolo 4). Foram selecionadas as células curadas sem plasmídeo pME1089 mas que retiveram o plasmídeo pME1109. A cepa resultante foi chamada cepa 7.

Construção de cepas 8 a 15 - Sobre-produção de sistemas homólogos de secreção de L-metionina, sobre-expressão de ygaZH a partir de gêneros e espécies listados na Tabela 10.

[0136] Para obter a sobre-expressão dos genes homólogos de ygaZH listados na tabela 10, cada par de genes foi clonado (tal como para genes ygaZH de E. Coli) no plasmídeo de número de cópias moderado pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990) usando um promotor natural e um sítio de ligação com ribossomo natural do gene ygaZ de E. Coli. Mais precisamente, os genes homólogos de ygaZH foram clonados no plasmídeo pME1089 descrito acima. Como especificado na tabela 11, os genes homólogos de ygaZH foram amplificados a partir de DNA genômico da cepa correspondente ou sintetizados quimicamente, otimizando, ou não, o uso de codon para E. coli (como proposto por GeneArt® Gene Synthesis service com GeneOptimizer® software - Lifetechnologies). Os fragmentos de DNA amplificados compreendendo os genes homólogos de ygaZH são listados em SEQ ID, indicado na tabela 11. Os plasmídeos resultantes foram nomeados como indicado na tabela 11. Finalmente, cada plasmídeo foi transformado na cepa 7, originando as cepas 8 a 15, listado como “nome da cepa” na tabela 11. Tabela 10: Proteínas homólogas de YgaZH Tabela 11: Plasmídeos e cepas compreenc endo genes homólogos de ygaZH

[0137] EXEMPLO 6: Produção fermentativa de L- metionina em frascos de experimento

[0138] Produtores recombinantes de L-metionina com deleção do operon metNIQ combinada com a sobre-expressão de diferentes sistemas de secreção de L-metionina de vários microrganismos (homólogos de YgaZH de E. coli) foram avaliados em frascos Erlenmeyer pequenos.

[0139] Foi cultivada uma pré-cultura de 5,5 mL a 30°C por 21 horas em um meio misto (10% meio LB (Sigma 25%) com 2,5 g.L-1 glucose e 90% meio mínimo PC1, Tabela 12). Ela foi usada para inocular uma cultura de 50 mL para um OD600 de 0,2 em meio PC1. Foram adicionadas espectinomicina e canamicina em concentração de 50 mg.L-1, cloranfenicol de 30 mg.L-1 e gentamicina de 10 mg.L-1 quando necessário. A temperatura das culturas foi 37°C. Quando a cultura atingiu um OD600 de 5 a 7, quantificaram-se os aminoácidos extracelulares por HPLC após derivatização com OPA/Fmoc e analisaram-se outros metabolitos relevantes usando HPLC com deteção refratométrica (ácidos orgânicos e glucose) e GC-MS após sililação. Tabela 12: Composição do meio mínimo (PC1) Tabela 13: Rendimento de metionina (Ymet) em g metionina/% g de glucose produzida em frascos de cultura por cepas de interesse com sobre-expressão dos genes homólogos de ygaZH e a deleção do operon metNIQ. Ver abaixo para a definição precisa de rendimento metionina/glucose. “n” indica o número de repetições.

[0140] Como pode ser visto na tabela 13, a sobre- expressão de genes homólogos de ygaZH de vários microrganismos no produtor de L-metionina com deleção do operon leva a desempenhos equivalentes ou superiores aos obtidos com a cepa 6, que tem sobre-expressão de ygaZH de E. coli. Os sistemas homólogos de secreção de L-metionina de microrganismos que não E. coli podem substituir as proteínas endógenas das bactérias.

[0141] As proteínas homólogas de YgaZH de Citrobacter Koseri (cepa 8, Ymet=19,6g/g), Citrobacter youngae (cepa 14, Ymet=19,6g/g), Citrobacter freundii (cepa 15, Ymet=19,6g/g) e Enterobacter sp. (cepa 11, Ymet=19,4g/g) mostraram os melhores rendimentos de produçao de L- metionina em comparação com a cepa 6 (Ymet=18,7g/g). O rendimento de metionina foi expresso da seguinte forma: REFERÊNCIAS - Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120128. - Carrier T., Keasling J.D., 1999, Biotechnology Progress, 15:58-64 - Datsenko K.A., Wanner B.L., 2000, Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A, 97:66406645 - Heery D.M., Powell R., Gannon F., Dunican L.K., 1989, Nucleic Acids Res. 17(23):10131 - Jones P.M. and George A.M., 1999, FEMS Microbiol. Lett. 179:187-202 - Kadner R.J. and Winkler H.H., 1975, Journal of Bacteriology. 123(3):985-991 - Kadner R.J., 1974, Journal of Bacteriology. 117(1):232-241 - Kadner R.J., 1975, Journal of Bacteriology. 122(1):110-119 - Lerner C.G. and Inouye M., 1990, Nucleic Acids Research, 18(15):4631 - Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210. - Merlin C., Gardiner G., Durand S., Masters M., 2002, Journal of Bacteriology. 184(19):5513-5517 - Miller, 1992; “A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. - Riedel et al., 2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583. - Saunderson C.L., 1985, British Journal of Nutrition, 54:621-633 - Schaefer et al. 1999, Anal. Biochem. 270: 88-96. - Trotschel C., Deutenberg D., Bathe B., Burkovski A., Kramer R., 2005, Journal of Bacteriology. 187(11):3786-3794

Claims (6)

1. Método para a produção fermentativa de metionina ou seus derivados, caracterizado por compreender: a) cultivar um E. coli recombinante, em que no referido E. coli, pelo menos um gene escolhido entre metN, metI ou metQ é atenuado ou deletado, e os genes ygaZH são sobre-expressos, em um meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte fermentável de carbono e uma fonte de enxofre, e b) recuperar metionina e/ou seus derivados a partir do meio de cultura; em que os referidos genes ygaZH codificam as proteínas YgaZ e YgaH, respectivamente, em que a proteína YgaZ compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ou 19; e a proteína YgaH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20; em que os genes ygaZH compreendem a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30; e em que a referida cepa de E. coli recombinante sobre-produz metionina e/ou seus derivados em comparação com uma cepa de E. coli não transformada.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que E. coli recombinante compreende: a) atenuação ou deleção de pelo menos um gene escolhido entre metN, metI ou metQ, e b) sobre-expressão dos genes ygaZH.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os referidos genes de ygaZH são escolhidos entre o grupo que compreende genes homólogos de espécies de Citrobacter, espécies de Shigella, espécies de Raoultella, espécies de Enterobacter, espécies de Yersinia e espécies de Photorhabdus.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os referidos genes homólogos ygaZH são oriundos de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae ou Citrobacter freundii.

5. Método, de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o crescimento da E. coli recombinante é submetido a limitação ou deficiência por um ou vários substratos inorgânicos no meio de cultura.

6. Método, de acordo com reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que os referidos substratos inorgânicos compreendem fosfato e/ou potássio.