ES2720803T3 - Un microorganismo para la producción de metionina con mayor eflujo de metionina - Google Patents

Abstract

Una cepa de Escherichia coli (E. coli) recombinante optimizada para la producción fermentativa de metionina y/o sus derivados, seleccionados de N-acetil-metionina (NAM), S-adenosil-metionina (SAM), y análogo hidroxi de metionina (MHA), en donde en dicha cepa recombinante, al menos un gen seleccionado entre metN, metI o metQ se atenúa en comparación con la cepa no modificada y los genes ygaZH se sobreexpresan en comparación con la cepa no modificada.

Description

DESCRIPCIÓN

Un microorganismo para la producción de metionina con mayor eflujo de metionina

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un microorganismo recombinante útil para la producción de L-metionina y/o sus derivados y procedimientos para la preparación de L-metionina. El microorganismo de la invención se modifica en una forma que aumenta el rendimiento de metionina/fuente de carbono combinando la atenuación del sistema de captación de L-metionina con la sobreexpresión de un sistema de exportación específico. En particular, se elimina el operón metNIQ y los genes y ygaH o sus genes homólogos son sobreexpresados en el microorganismo recombinante.

Técnica anterior

Los compuestos que contienen azufre tales como cisteína, homocisteína, metionina o S-adenosilmetionina son críticos para el metabolismo celular. En particular, la L-metionina, un aminoácido esencial, que no puede ser sintetizada por animales, tiene una función importante en muchas funciones corporales. La mayor parte de la metionina producida industrialmente se usa ampliamente como un pienso animal y aditivo alimentario.

Con la disminución del uso de proteínas derivadas de animales como resultado de la BSE y la gripe aviar, ha aumentado la demanda de metionina pura. Normalmente, la D,L-metionina se produce químicamente a partir de acroleína, metilmercaptano y cianuro de hidrógeno. Sin embargo, la mezcla racémica no funciona tan bien como la L-metionina pura (Saunderson, 1985). Además, aunque la L-metionina pura se puede producir a partir de la metionina racémica, por ejemplo, por el tratamiento con acilasa de la N-acetil-D,L-metionina, esto aumenta notablemente los costes de producción. Por consiguiente, la mayor demanda de L-metionina pura junto con la preocupación medioambiental, hacen de la producción microbiana de metionina una perspectiva atractiva.

Otros aminoácidos importantes, tales como la lisina, treonina y triptófano se producen por fermentación para usar en pienso animal. Por lo tanto, estos aminoácidos se pueden hacer usando glucosa y otros recursos renovables como materiales de partida. La producción industrial de L-metionina por fermentación todavía no ha tenido éxito, pero está en marcha el desarrollo de la tecnología.

Se han descrito previamente numerosos enfoques para la optimización de la producción de L-metionina en microorganismos (véase, por ejemplo, las patentes o solicitudes de patentes US 7.790.424, US 7.611.873, WO 2002/10209, WO 2005/059093 y WO 2006/008097); sin embargo, la producción industrial de L-metionina a partir de microorganismos requiere mejoras adicionales.

Cuando la L-metionina se sintetiza en un determinado nivel o superior, inhibe su propia producción posterior por un bucle de retroalimentación y altera la fisiología de la célula. Por lo tanto, una de estas mejoras es reducir la acumulación de L-metionina en el microorganismo para asegurar una producción eficaz reduciendo la capacidad de importación de L-metionina del microorganismo mientras que se potencia el eflujo de L-metionina al mismo tiempo en un sobreproductor de L-metionina recombinante.

Los estudios bioquímicos y cinéticos previos demostraban que la captación de metionina en Escherichia coli implica al menos dos transportadores específicos, los sistemas de transporte MetD de alta afinidad y MetP de baja afinidad (Jones y George, 1999; Kadner, 1974). Ambos son regulados por el tamaño de la acumulación de metionina interna, y para MetD se ha inferido represión mediada por MetJ (Kadner, 1975; Kadner y Winkler, 1975). El sistema de captación de metionina MetD se caracterizó como un transportador ABC. En 2002, Merlin et al, describieron que los genes abc, yaeC, y yaeE comprenden metD, el locus que codifica un sistema de captación de metionina. Propusieron renombrar abc, yaeE y yaeC como metN, metí y metQ, respectivamente.

La exportación de metionina es mediada, en Escherichia coli por el complejo YgaZH y en Corynebacterium glutamicum por el complejo homólogo BrnFE (Trotschel et al., 2005). YgaZ es un miembro de la familia de exportadores de aminoácidos de cadena ramificada (LIV-E) responsable de la exportación de L-valina y L-metionina. YgaZ forma un complejo con YgaH, una proteína de membrana interna prevista, para exportar aminoácidos en condiciones en las que sus niveles serían tóxicos para la célula.

Las solicitudes de patentes WO 2002/097096 y WO 2005/085463 se refieren a la reducción de la captación de L-metionina en Coynebacterium atenuando el sistema de captación de metionina MetD2, en especial eliminando uno o más de los genes yaeC, abc y yaeE. En Corynebacterium, la atenuación del sistema de captación de metionina MetD2 conduce a una producción mejorada de metionina. El sistema de captación de metionina MetD homólogo, codificado por los genes metN, metI y metQ, también se ha caracterizado en Escherichia coli (Jones y George, 1999; Kadner 1974, Merlin et al., 2002). La solicitud de patente WO 2008/127240 describe que en Escherichia coli como en Corynebacterium la producción de metionina aumenta cuando se atenúa el sistema de captación de metionina MetD.

Las solicitudes de patente EP 1239041 y WO 2008/082211 describen la sobreexpresión de un exportador de aminoácidos de cadena ramificada (YgaZH) responsable de la exportación de L-valina y L-metionina en Escherichia coli. Esta sobreexpresión conduce a una producción mejorada de metionina en E. coli.

Trotschel et al. sobreexpresaron en Corynebacterium glutamicum los genes brnFy brnE que codifican el exportador de metionina BrnFE y al mismo tiempo eliminaron el sistema metD (Trotschel et al., 2005). No obstante, no se ha publicado ninguna prueba de estas modificaciones en la producción de metionina ni en Corynebacterium glutamicum ni en Escherichia coli.

A diferencia de la técnica anterior en C. glutamicum y E. coli, los autores de la invención han mostrado que la eliminación de solo metD en E. coli (lograda por la eliminación de uno de los genes del operón metNIQ o por eliminación del operón entero, eliminación de cualquier gen individual de este operón que conduzca a la anulación de la captación de metionina de alta afinidad) es suficiente para mejorar los rendimientos de producción de metionina. Esta modificación debe combinarse con la sobreexpresión de un sistema de exportación de L-metionina. Por lo tanto, esta es la primera vez que se muestra que la combinación de la eliminación del sistema de captación de L-metionina con la sobreexpresión de un exportador de L-metionina, es beneficiosa para la producción de metionina. Resumen de la invención

La invención se refiere a una cepa de Escherichia coli recombinante y a un método para la producción de metionina y/o sus derivados, en donde la importación de metionina se atenúa y el eflujo de metionina se potencia. En el microorganismo recombinante, es decir E. coli, se atenúa la importación de metionina mediante la atenuación de la expresión o la eliminación de al menos un gen seleccionado entre metN, metI o metQ mientras que se potencia el eflujo de metionina por la sobreexpresión de los genes ygaZH.

La E. coli recombinante también puede comprender otras modificaciones genéticas tales como:

una mayor expresión de al menos uno de los siguientes genes: ptsG, pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysl, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metH, fldA, fpr, metA, alelo de metA.* que codifica una enzima con menor sensibilidad de retroalimentación para la S-adenosilmetionina y/o metionina, thrA, o un alelo de thrA* que codifica una enzima con menor inhibición de retroalimentación para la treonina y/o una expresión atenuada de uno de los siguientes genes: metJ, pykA, pykF, purU, ybdL, udhA, dgsA, metE o yncA. En una realización particular, la presente invención se refiere a un microorganismo recombinante en donde: a) se eliminan los genes metN, metI y metQ mientras que los genes ygaZ e ygaH procedentes de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica,

Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae o Citrobacter freundii son sobreexpresados, y b) se potencia la expresión de los genes metA *, metH, cysPUWAM, cys.JIH, gcvTHP, metF, serA, serB, serC, cysE, thrA* y pyc; y c) se atenúa la expresión de los genes metJ, pykA, pykF, purU, ybdL, yncA, dgsA, metE y udhA.

Descripción detallada de la invención

Antes de describir la presente invención con detalle, debe entenderse que esta invención no está limitada a métodos ilustrados en particular, y por supuesto puede variar. También deben entenderse que la terminología usada en la presente memoria es solo para el fin de describir realizaciones particulares de la invención, y no se pretende que sea limitante, la cual estará limitada solo por las reivindicaciones adjuntas.

Además, la práctica de la presente invención usa, salvo que se indique otra cosa, técnicas de microbiología y biología molecular convencionales dentro de la técnica. Dichas técnicas son bien conocidas para el experto, y se explican con detalle en la bibliografía.

Debe indicarse que como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen la referencia plural, salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a "un microorganismo" incluye una pluralidad de dichos microorganismos, y una referencia a "un gen endógeno" es una referencia a uno o más genes endógenos, etc. Salvo que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen los mismos significados que entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se puede usar cualquier material y método similar o equivalente a los descritos en la presente memoria para la práctica o ensayo de la presente invención, ahora se describen los materiales y métodos preferidos.

En las siguientes reivindicaciones y en la descripción de la invención a continuación, excepto donde el contexto requiere otra cosa debido al lenguaje expreso o implicación necesaria, la palabra "comprenden", "contienen", "implican" o "incluyen" o variaciones tales "comprende", "que comprende", "que contiene", "implicado", "incluye", "que incluye", se usan en un sentido inclusivo, es decir, para especificar la presencia de las características expuestas pero no para excluir la presencia o adición de características adicionales en diferentes realizaciones de la invención.

El término "metionina" y "L-metionina" designan el aminoácido esencial que contiene azufre con fórmula química HO2CCH(NH2)CH2CH2SCH3 y número CAS 59-51-8 o 63-68-3 para el isómero L específico.

"Derivados de metionina" se refiere a moléculas análogas a la metionina que presentan la misma cadena principal química pero difieren de la metionina en al menos un grupo químico. En esta invención, los derivados de metionina preferidos son la N-acetil-metionina (NAM), S-adenosil-metionina (SAM) e hidroximetionina (o análogo hidroxi de la metionina o MHA).

El término "microorganismo", como se usa en la presente memoria, se refiere a una bacteria, levadura u hongo que no está modificado artificialmente. Preferiblemente, el microorganismo se selecciona entre Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteriaceae. Más preferiblemente, el microorganismo es una especie de Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Salmonella o Corynebacterium. Incluso más preferiblemente, el microorganismo de la invención es cualquiera de la especie Escherichia coli o Corynebacterium glutamicum.

La expresión "microorganismo recombinante" o "microorganismo genéticamente modificado", como se usa en la presente memoria, se refiere a una bacteria, levadura u hongo que no se encuentra en la naturaleza y es genéticamente diferente de su equivalente encontrado en la naturaleza. Significa que está modificado por introducción o por eliminación o por modificación de elementos genéticos. También se puede transformar forzando el desarrollo y evolución de nuevas rutas metabólicas combinando la mutagénesis dirigida y la evolución bajo presión de selección específica (véase, por ejemplo, los documento WO 2004/076659 o WO 2007/011939).

Un microorganismo se puede modificar para expresar genes exógenos si esos genes se introducen en el microorganismo con todos los elementos que permiten su expresión en el microorganismo hospedante. La modificación o "transformación" de microorganismos con ADN exógeno es una tarea rutinaria para los expertos en la técnica.

Un microorganismo se pude modificar para modular el nivel de expresión de un gen endógeno.

La expresión "gen endógeno" significa que el gen estaba presente en el microorganismo antes de cualquier modificación genética. Los genes endógenos se pueden sobreexpresar introduciendo secuencias heterólogas además de, o en lugar de elementos reguladores endógenos, o introduciendo una o más copias complementarias del gen en el cromosoma o un plásmido. Los genes endógenos también se pueden modificar para modular su expresión y/o actividad. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones en la secuencia codificante para modificar el producto génico o se pueden introducir secuencias heterólogas además de o en lugar de elementos reguladores endógenos. La modulación de un gen endógeno pueda dar como resultado la regulación por aumento y/o la potenciación de la actividad del producto génico, o alternativamente regulación por disminución y/o menor actividad del producto génico endógeno.

Otra forma de modular su expresión es intercambiar el promotor endógeno de un gen (p. ej., promotor de tipo natural) con un promotor más fuerte o más débil para regular por aumento o disminución la expresión del gen endógeno. Estos promotores pueden ser homólogos o heterólogos. Está en la experiencia del experto en la técnica seleccionar promotores adecuados.

A la inversa, "gen exógeno" significa que el gen se introdujo en un microorganismo, por medios bien conocidos para el experto en la técnica, en donde este gen no se encuentra de forma natural en el microorganismo. Los genes exógenos se pueden integrar en el cromosoma del hospedante, o pueden ser expresados de forma extracromosómica por plásmidos o vectores. Se conocen bien en la técnica una variedad de plásmidos que difieren con respecto a su origen de replicación y su número de copias en la célula. Estos genes pueden ser homólogos. En el contexto de la invención, la expresión "gen homólogo" no está limitada a designar genes que tienen un antecedente genético común teórico, sino que incluyen genes que pueden no estar relacionados genéticamente que, no obstante, han evolucionado para codificar proteína que realiza funciones similares y/o tiene estructura similar. Por lo tanto, la expresión "homólogo funcional" para los fines de la presente invención se refiere al hecho de que una determinada actividad enzimática la puede proporcionar no solo una proteína específica de secuencia de aminoácidos definida, sino también proteínas de secuencia similar de otros microorganismos (no) relacionados. Usando las referencias dadas en Genbank para genes conocidos, los expertos en la técnica pueden determinar los genes equivalentes en otros organismos, cepas bacterianas, levaduras, hongos, mamíferos, plantas, etc. Este trabajo rutinario se hace ventajosamente usando secuencias consenso que se pueden determinar llevando a cabo alineamientos de secuencias con genes derivados de otros microorganismos y diseñando sondas degeneradas para clonar el gen correspondiente en otro organismo. Estos métodos rutinarios de biología molecular son bien conocidos en la técnica.

La expresión "producción de metionina mejorada", "mejor producción de metionina" y sus equivalentes gramaticales, como se usan en la presente memoria, se refieren a un mayor rendimiento de metionina/fuente de carbono (relación de gramos/mol de metionina producida por gramos/mol de fuente de carbono consumida, que se puede expresar en porcentaje). Los métodos para determinar la cantidad de la fuente de carbono consumida y de metionina producida, son bien conocidos para los expertos en la técnica. El rendimiento es mayor en el microorganismo recombinante en comparación con el correspondiente microorganismo no modificado.

Las expresiones "microorganismo optimizado para la producción fermentativa de metionina" se refiere a microorganismos convertidos y/o modificados genéticamente para presentar una mejor producción de metionina en comparación con la producción endógena de los correspondientes microorganismos de tipo natural. Dichos microorganismos "optimizados" para la producción de metionina son bien conocidos en la técnica, y se han descrito en particular en las solicitudes de patente WO 2005/111202, WO 2007/077041, WO 2009/043803 y WO 2012/098042.

De acuerdo con la invención, las expresiones "producción fermentativa", "cultivo" o "fermentación" se usan para indicar el crecimiento de bacterias. Este crecimiento en general se lleva a cabo en fermentadores con un medio de cultivo adecuado adaptado al microorganismo que se está usando y que contiene al menos una fuente de carbono simple, y si es necesario cosustratos.

Un "medio de cultivo adecuado" indica un medio (p. ej., un medio líquido estéril) que comprende nutrientes esenciales o beneficiosos para el mantenimiento y/o crecimiento de la célula, tales como fuentes de carbono o sustratos de carbono, fuentes de nitrógeno, por ejemplo, peptona, extractos de levadura, extractos de carne, extractos de malta, urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio y fosfato de amonio; fuentes de fósforo, por ejemplo, fosfato de monopotasio o fosfato de dipotasio; oligoelementos (p. ej., sales de metales), por ejemplo, sales de magnesio, sales de cobalto y/o sales de manganeso; así como factores de crecimiento tales como aminoácidos y vitaminas.

La expresión "fuente de carbono" o "sustrato de carbono o "fuente de carbono" de acuerdo con la presente invención, indica cualquier fuente de carbono que puede usar el experto en la técnica para mantener el crecimiento normal de un microorganismo, que incluye monosacáridos (tales como glucosa, galactosa, xilosa, fructosa o lactosa), oligosacáridos, disacáridos (tales como sacarosa, celobiosa o maltosa), melazas, almidón o sus derivados, hemicelulosas y combinaciones de los mismos. Una fuente de carbono simple especialmente preferida es la glucosa. Otra fuente de carbono simple preferida es la sacarosa. La fuente de carbono se puede obtener de materia prima renovable. La materia prima renovable se define como materia prima necesaria para determinados procedimientos industriales, que se puede regenerar con un breve retraso y en suficiente cantidad para permitir su transformación en el producto deseado. La biomasa vegetal tratada o no, es una fuente de carbono renovable interesante.

La expresión "fuente de azufre" de acuerdo con la invención se refiere a sulfato, tiosulfato, sulfuro de hidrógeno, ditinoato, ditionito, sulfito, metilmercaptano, sulfuro de dimetilo y otros sulfuros terminados en metilo, o una combinación de las diferentes fuentes. Más preferiblemente, la fuente de azufre en el medio de cultivo es sulfato o tiosulfato o una mezcla de los mismos.

Las expresiones "fuente de nitrógeno" corresponden a una sal de amonio o amoniaco gaseoso. La fuente de nitrógeno se suministra en forma de amonio o amoniaco.

Las expresiones "atenuación" o "expresión atenuada" significa en este contexto que la expresión de un gen o la producción de una enzima disminuye o se suprime en comparación con el microorganismo no modificado, conduciendo a una disminución en la concentración intracelular de un ácido ribonucleico, una proteína o una enzima en comparación con el microorganismo no modificado. El experto en la técnica conoce diferentes medios y métodos para medir la concentración de ácido ribonucleico o concentración de proteína en la célula que incluyen, por ejemplo, el uso de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR), para determinar la concentración de ácido ribonucleico, y el uso de anticuerpo específico para determinar la concentración de proteína específica.

La disminución o supresión de la producción de una enzima se obtiene por la atenuación de la expresión del gen que codifica dicha enzima.

La atenuación de genes se puede lograr por medios y métodos conocidos para el experto en la técnica. En general, la atenuación de la expresión génica se puede lograr por:

- Mutación de la región codificante o la región promotora, o

- Eliminación de toda o una parte de la región promotora necesaria para la expresión génica, o

- Eliminación de toda o una parte de la región codificante del gen por recombinación homóloga, o

- Inserción de un elemento externo en la región codificante o en una región promotora, o

- Expresión del gen bajo el control de un promotor débil o un promotor inducible.

El experto en la técnica conoce una variedad de promotores que presentan diferentes fuerzas y qué promotor usar para una expresión genética débil o inducible.

El término "actividad" de una enzima se usa de forma intercambiable con el término "función" e indica, en el contexto de la invención, la reacción que es catalizada por la enzima. El experto en la técnica sabe cómo medir la actividad enzimática de dicha enzima.

Las expresiones "actividad atenuada" o "actividad reducida" de una enzima significan bien una actividad catalítica específica reducida de la proteína obtenida por mutación en la secuencia de aminoácidos y/o concentraciones menores de la proteína en la célula obtenidas por mutación de la secuencia de nucleótidos o por eliminación de la región codificante del gen.

Las expresiones "actividad potenciada" o "mayor actividad" de una enzima indican bien una actividad catalítica específica mayor de la enzima, y/o una menor cantidad/capacidad de la enzima en la célula, obtenida por ejemplo por sobreexpresión del gen que codifica la enzima.

Las expresiones "mayor expresión", "expresión potenciada" o "sobreexpresión" y sus equivalentes gramaticales, se usan de forma intercambiable en el texto y tienen un significado similar. Estas expresiones significan que la expresión de un gen o la producción de una enzima aumenta en comparación con el microorganismo no modificado, conduciendo a un aumento en la concentración intracelular de un ácido ribonucleico, una proteína o una enzima en comparación con el microorganismo no modificado. El experto en la técnica conoce diferentes medios y métodos para medir la concentración de ácido ribonucleico o concentración de proteína en la célula que incluyen el uso de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR), para determinar la concentración de ácido ribonucleico, y el uso de anticuerpo específico para determinar la concentración de proteína específica.

La mayor producción de una enzima se obtiene aumentando la expresión del gen que codifica dicha enzima.

Para aumentar la expresión de un gen, el experto en la técnica conoce diferentes técnicas tales como:

- Aumentar el número de copias del gen en el microorganismo. El gen es codificado de forma cromosómica o extracromosómica. Cuando el gen está situado en el cromosoma, se pueden introducir varias copias en el cromosoma mediante métodos de recombinación, conocidos por el experto en el campo (que incluyen el reemplazo génico). Cuando el gen está situado extracromosómicamente, se puede llevar a cabo mediante diferentes tipos de plásmidos que difieren con respecto a su origen de replicación y por lo tanto su número de copias en la célula. Estos plásmidos están presentes en el microorganismo en 1 a 5 copias, o aproximadamente 20 copias, o hasta 500 copias, dependiendo de la naturaleza del plásmido: plásmidos de bajo número de copias con replicación ajustada (pSC101, RK2), plásmidos de bajo número de copias (pACYC, pRSF1010) o plásmidos de alto número de copias (pSK bluescript II).

- Usando un promotor que conduce a un alto nivel de expresión del gen. El experto en la técnica sabe qué promotores son los más convenientes, por ejemplo, los promotores Ptrc, Ptac, Plac, o el promotor lambda cI se usan ampliamente. Estos promotores pueden ser "inducibles" por un compuesto particular o por condiciones externas específicas tales como la temperatura o luz. Estos promotores pueden ser homólogos o heterólogos.

- Atenuando la actividad o la expresión de un represor de la transcripción, específico o no específico del gen.

- Usando elementos que estabilizan el correspondiente ARN mensajero (Carrier y Keasling, 1999) o elementos que estabilizan la proteína (p. ej., marcadores GST, GE Healthcare).

Los términos "que codifica" o "codificante" se refieren al procedimiento por el cual un polinucleótidos, a través de mecanismos de transcripción y traducción, produce una secuencia de aminoácidos. El(los) gen(es) que codifican la(s) enzima(s) pueden ser exógenos o endógenos.

Las expresiones "sensibilidad por retroalimentación" o "inhibición por retroalimentación" se refieren a un control del mecanismo celular en el que una o varias enzimas que catalizan la producción de una sustancia particular en la célula son inhibidas o son menos activas cuando la sustancia se ha acumulado en un cierto nivel. Por lo tanto, las expresiones "sensibilidad por retroalimentación reducida" o "inhibición por retroalimentación reducida" significa que la actividad de dicho mecanismo es menor o está suprimida en comparación con un microorganismo no modificado. El experto en la técnica sabe cómo modificar la enzima para obtener este resultado. Dichas modificaciones se han descrito en la solicitud de patente WO 2005/111202 o en la patente US 7.611.873.

En un primer aspecto de la invención, una cepa de Escherichia coli recombinante se optimiza para la producción fermentativa de metionina y/o sus derivados, atenuando la captación de metionina y potenciando el eflujo de metionina en dicho microorganismo..

Como se ha descrito antes, la importación de metionina es mediada por el sistema de captación de metionina MetD codificado por los genes metN, metí y metQ, anteriormente llamados abc, yaeE y yaeC respectivamente. Estos genes se han identificado en varios microorganismos incluidos E. coli y C. glutamicum. MetNIQ pertenece a la famosa familia de transportadores ABC.

En una realización de la invención, se atenúa la expresión de al menos un gen seleccionado entre metN, metí y metQ en el microorganismo recombinante. El experto en la técnica conoce diferentes medios para atenuar la expresión génica tales como clonación del gen para ser atenuado bajo control de un promotor inducible o débil, eliminación de toda o parte de la región promotora o región codificante del gen que se va a atenuar. Preferiblemente, se elimina al menos uno de los genes metN, metí y metQ. Más preferiblemente, se eliminan los tres genes metN, metí y metQ en el microorganismo recombinante de la invención.

En los microorganismos productores de aminoácidos, la metionina es excretada por un transportador de eflujo específico. En especial, en E. coli, este transportador se llama YgaZH y es codificado por los genes ygaZ e ygaH mientras que en C. glutamicum, se llama BrnFE y es codificado por los genes brnF y brnE. Se han identificado homólogos funcionales de este sistema de eflujo de metionina en varios otros microorganismos. Alternativamente, el microorganismo recombinante de la invención puede sobreexpresar homólogos funcionales de los sistemas YgaZH o BrnFE. Las proteínas homólogas de YgaZ y YgaH se presentan respectivamente en la tabla 1 y tabla 2.

Tabla 1 :_Proteínas homólogas de YgaZ

Tabla 2:_Proteínas homologas de YgaH

Con el número de acceso descrito en las tablas para cada homólogo el experto en la técnica puede obtener la secuencia de aminoácidos y su secuencia de nucleótidos codificante en la base de datos del NCBI, por ejemplo. A partir de la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos, es una tarea rutinaria para el experto en la técnica obtener genes que codifican estos homólogos. Se puede hacer por síntesis artificial del gen que codifica la proteína de interés a partir de su secuencia de aminoácidos o por amplificación por PCR de la región codificante de interés a partir del correspondiente ADN genómico. Las secuencias de estos genes ygaZH se puede ajustar respecto al sesgo de codones del microorganismo hospedante.

En una realización específica de la invención E. coli recombinante sobreexpresa los genes ygaZ e ygaH que codifican las proteínas cuyas secuencias se describen respectivamente en las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o sus genes homólogos. Preferiblemente, los genes ygaZe ygaH están compuestos por la pareja de genes que proceden del mismo organismo y compuestos por el gen ygaZ y el gen ygaH. Sin embargo, se podría usar el emparejamiento erróneo de un gen ygaZ de un primer organismo y un gen ygaH de un segundo organismo.

Los genes YgaZH se seleccionan entre los genes que codifican YgaZ e YgaH descritos respectivamente en la tabla 1 y en la tabla 2. Preferiblemente, los genes ygaZH se seleccionan entre los genes que codifican YgaZH de especies de Citrobacter, especies de Shigella, especies de Raoultella, especies de Enterobacter, especies de Yersinia y especies de Photorhabdus. Más preferiblemente, los genes ygaZH proceden de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacteryoungae o Citrobacter freundii. Lo más preferiblemente, los genes ygaZH proceden de Citrobacter koseri, Citrobacter youngae, Citrobacter freundii o Enterobacter sp.

Por lo tanto, los genes, ygaZH se seleccionan preferiblemente entre los genes que codifican el par de YgaZe YgaH definidos respectivamente por: SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 de Citrobacter koseri, SEQ ID ⁿO: 5 y SEQ ID NO: 6 de Shigella flexneri, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 de Raoultella ornithinolytica, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 de Enterobacter sp. (R4-368), SEQ ID NO: 11 o 12 y SEQ ID NO: 13 o 14 de Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 de Photorhabdus luminescens subsp. launiondii, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 de Citrobacter youngae, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 de Citrobacter freundii.

En una realización específica, el microorganismo recombinante se caracteriza por:

- atenuación de al menos uno de los genes metN, metI o metQ; y

- sobreexpresión de los genes ygaZH o sus genes homólogos procedentes de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae o Citrobacter freundii.

En otra realización específica, el microorganismo recombinante se caracteriza por:

- atenuación del gen metN; y

- sobreexpresión de los genes ygaZH o sus genes homólogos de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella omithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae o Citrobacter freundii.

En otra realización específica, el microorganismo recombinante se caracteriza por:

- atenuación del gen metI; y

- sobreexpresión de los genes ygaZH o sus genes homólogos de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae o Citrobacter freundii.

En otra realización específica, el microorganismo recombinante se caracteriza por:

- atenuación del gen metQ; y

- sobreexpresión de los genes ygaZH o sus genes homólogos de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae o Citrobacter freundii.

En otra realización específica, el microorganismo recombinante se caracteriza por:

- atenuación de los genes metN, metI y metQ; y

- sobreexpresión de los genes ygaZH o sus genes homólogos de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae o Citrobacter freundii.

En una realización preferida de la invención estos genes son sobreexpresados bajo el control de un promotor inducible. El experto en la técnica conoce dichos promotores inducibles. Por ejemplo, se pueden usar promotores como APr o APl para sobreexpresar los genes ygaZH o genes homólogos de ygaZH procedentes de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae o Citrobacter freundii en el microorganismo recombinante de la invención.

Optimización de la ruta de biosíntesis de la metionina

El microorganismo recombinante de acuerdo con la invención se modifica para mejorar la producción de metionina. Los genes implicados en la producción de metionina son bien conocidos en la técnica, y comprenden genes implicados en la ruta de biosíntesis específica de metionina, así como genes implicados en las rutas que proporcionan precursores y genes implicados en las rutas de consumo de metionina.

La producción eficaz de metionina requiere la optimización de la ruta específica de la metionina y varias rutas que proporcionan precursores. Las cepas productoras de metionina ya se han descrito, en particular en las solicitudes de patente WO 2005/111202, WO 2007/077041 y WO 2009/043803.

Salvo que se exponga otra cosa, todos los genes mencionados a continuación relacionados con la optimización de la ruta de biosíntesis de la metionina se refieren a los de E. coli.

En una realización específica de la invención, el microorganismo recombinante se modifica como se describe a continuación: aumenta la expresión de al menos un gen seleccionado entre ptsG, pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysI, cysL cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metH, .fldA, fpr, metA, alelo de metA* que codifica una enzima con menor sensibilidad por retroalimentación por S-adenosilmetionina y/o metionina, thrA, y alelo de thrA* que codifica una enzima con menor inhibición por retroalimentación por treonina.

- ptsG codifica la enzima PTS IICBGlc descrita en la solicitud de patente WO 2013/001055.

- pyc codifica una piruvato carboxilasa como se describe en la solicitud de patente WO 2013/001055. En una realización preferida, el gen pyc es heterólogo y se selecciona de genes pyc de Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, Pseudomonas fluorescens o especies de Corynebacterium,

- pntAB codifica subunidades de una transhidrogenasa unida a membrana, tal como se describe en la solicitud de patente WO 2012/055798,

- cysP codifica una proteína de unión a sulfato periplasmática, como se describe en el documento WO 2007/077041 y en WO 2009/043803,

- cysU codifica un componente de un transportador ABC de sulfato, como se describe en el documento WO 2007/077041 y en WO 2009/043803.

- cysW codifica una proteína de transporte de sulfato unida a membrana, como se describe en el documento WO 2007/077041 y en WO 2009/043803,

- cysA codifica una sulfato permeasa, como se describe en el documento WO 2007/077041 y en WO 2009/043803, - cysM codifica una O-acetil serina sulfhidralasa, como se describe en el documento WO 2007/077041 y en WO 2009/043803,

- cysl y cysJ codifican respectivamente las subunidades alfa y beta de una sulfito reductasa, como se describe en el documento WO 2007/077041 y en WO 2009/043803. Preferiblemente cysl y cysJ son sobreexpresados juntos, - cysH codifica una adenilsulfato reductasa, como se describe en el documento WO2007/077041 y en WO 2009/043803.

Aumentar el metabolismo de C1 también es una modificación que conduce a mejor producción de metionina. Se refiere al aumento de la actividad de al menos una enzima implicada en el metabolismo C1 seleccionada entre GcvTHP, Lpd, MetF o MetH. En una realización preferida de la invención, el metabolismo del carbono uno se aumenta potenciando la expresión y/o actividad de al menos uno de los siguientes:

- gcvT, gcvH, gcvP y lpd, que codifican el complejo de escisión de glicina, como se describe en la solicitud de patente WO 2007/077041. El complejo de escisión de glicina (GCV) es un complejo multienzimático que cataliza la oxidación de la glicina, dando dióxido de carbono, amoniaco, metilen-THF y un nucleótido de piridina reducido. El complejo GCV consiste en cuatro componentes de proteína, la glicina deshidrogenasa llamada proteína P (GcvP), la lipoil-GcvH-proteína llamada proteína H (GcvH), la aminometiltransferasa llamada proteína T (GcvT), y la dihidrolipoamida deshidrogenasa llamada proteína L (GcvL o Lpd). La proteína P cataliza la liberación de CO2 dependiente de piridoxal-fosfato de la glicina, dejando un resto metilamina. El resto metilamina es transferido al grupo ácido lipoico de la proteína H, que se une a la proteína P antes de la descarboxilación de la glicina. La proteína T cataliza la liberación de NH3 del grupo metilamina y transfiere la unidad C1 que queda al THF, formando metilen-THF. La proteína L oxida entonces el componente ácido lipoico de la proteína H y transfiere los electrones al NAD+, formando NADH;

- MetF codifica una metilentetrahidrofolato reductasa, como se describe en la solicitud de patente WO 2007/077041; - MetH (N5-metiltetrahidrofolato-homocisteina dependiente de B12 transmetilasa) codifica metiltransferasas.

La sobreexpresión de al menos uno de los siguientes genes implicados en la biosíntesis de serina también reduce la producción del subproducto isoleucina:

- serA que codifica una fosfoglicerato deshidrogenasa, como se describe en el documento WO 2007/077041 y en WO 2009/043803,

- serB que codifica una fosfoserina fosfatasa, como se describe en el documento WO 2007/077041 y en WO 2009/043803,

- serC que codifica una fosfoserina aminotransferasa, como se describe en el documento WO 2007/077041 y en WO 2009/043803.

La sobreexpresión de los siguientes genes ya se ha mostrado que mejora la producción de metionina:

- cysE codifica una serina aciltransferasa; su sobreexpresión permite un aumento en la producción de metionina, como se describe en el documento WO 2007/077041;

- metA codifica una homoserina succiniltransferasa. El alelo metA* codifica una enzima con menor sensibilidad por retroalimentación a la S-adenosilmetionina y/o metionina. Preferiblemente, se usa el alelo metA* descrito en la solicitud de patente WO 2005/111202;

- thrA codifica una aspartoquinasa/homoserina deshidrogenasa; el alelo thrA* codifica una enzima con menor inhibición por retroalimentación para la treonina, como se describe en el documento WO 2005/111202.

En una realización específica de la invención, los genes pueden estar bajo el control de un promotor inducible. En una realización preferida de la invención, al menos uno de los genes está bajo el control de un promotor inducible por temperatura. Preferiblemente, la expresión de al menos uno de los genes: thrA, cysE, metA, está bajo el control de un promotor inducible, directa o indirectamente. Más preferiblemente, los genes thrA, cysE y metA están bajo el control de un promotor inducible, directa o indirectamente. En una realización preferida de la invención, la expresión del gen thrA está bajo el control directo de un promotor inducible y la expresión del gen cysE está bajo el efecto polar de la expresión inducible del gen thrA. En otra realización preferida de la invención, la expresión del gen thrA está bajo el control directo de un promotor inducible y la expresión de los genes cysE y metA están bajo el efecto polar de la expresión inducible del gen thrA.

En una realización más preferida, el promotor inducible por temperatura pertenece a la familia de promotores P^r. Una cepa que produce metionina que tiene genes bajo el control de promotores inducibles se describe en la solicitud de patente WO 2011/073122.

En otra realización específica de la invención, el microorganismo se ha modificado más, y la expresión de al menos uno de los siguientes genes está atenuada: metJ, pykA, pykF, purU, ybdL, yncA, metE, dgsA o udhA.

- el gen metJ codifica la proteína represora MetJ (GenBank 1790373), responsable de la regulación por disminución del regulón de metionina como se ha sugerido en la solicitud de patente JP 2000/157267,

- Los genes pykA y pykF codifican las enzimas ''piruvato quinasa". La atenuación de la expresión de al menos una o ambas piruvato quinasas disminuye el consumo de fosfoenol piruvato (PEP). La mayor disponibilidad del PEP puede aumentar la producción de oxaloacetato, un precursor de aspartato importante, que a su vez es un precursor de metionina, como se describe en los documentos WO 2007/077041 y en Wo 2009/043803.

- purU codifica una formiltetrahidrofolato desformilasa, una enzima que cataliza la reacción de la formil-THF desformilasa. La atenuación de la actividad de la desformilasa aumenta la producción del metil-THF que es necesario para la metilación de la homocisteína. La pérdida de metabolitos C1 por desformilación conduce a una mayor producción de homocisteína que no puede ser transformada en metionina. La homocisteína puede ser entonces un sustrato para la enzima cistationina gamma sintasa (MetB) que cataliza la reacción entre la O-succinilhomoserina y homocisteína dando como resultado la producción de homolan-tionina, como se describe en los documentos WO2007/077041 y en WO2009/043803,

- ybdL codifica una aminotransferasa como se describe en la solicitud de patente WO 2012/090021,

- yncA codifica una N-aciltransferasa, como se describe en la solicitud de patente WO 2010/020681,

- metE codifica una metionina sintasa independiente de cobalamina, como se describe en la solicitud de patente PCT/IB2012/001336,

- dgsA, mejor conocida como Mlc, codifica un regulador doble transcripcional que controla la expresión de genes que codifican enzimas de los sistemas de fosfotransferasa (PTS) y fosfoenolpiruvato (PEP) como se describe en la solicitud de patente WO 2013/00I055,

- udhA codifica la piridina nucleótido transhidrogenasa soluble, como se describe en la solicitud de patente WO 2012/055798.

En una realización más preferida de la invención, la producción fermentativa de la metionina y/o sus derivados por una E. coli recombinante, en donde la importación de metionina está atenuada y el eflujo de metionina está potenciado, a partir de glucosa como una fuente de carbono principal, se puede lograr por una combinación de las modificaciones descritas antes en dicho microorganismo, por ejemplo:

- la expresión del gen metJ se atenúa y la expresión de un alelo metA* que codifica una enzima con menor sensibilidad por retroalimentación a la S-adenosilmetionina y/o metionina (MetA *) se aumenta;

- la expresión del gen metJ se atenúa; la expresión de un alelo metA* que codifica una enzima con menor sensibilidad por retroalimentación a la S-adenosilmetionina y/o metionina (MetA *) se aumenta; y la expresión de un alelo de thrA* que codifica una enzima con menor inhibición por retroalimentación para la treonina (thrA*) se aumenta;

- la expresión del gen metJ se atenúa; la expresión de un alelo de metA* que codifica una enzima con menor sensibilidad por retroalimentación a la S-adenosilmetionina y/o metionina (MetA*) se aumenta; la expresión de un alelo de thrA* que codifica una enzima con menor inhibición por retroalimentación para la treonina (thrA*) se aumenta; y la expresión del gen cysE se aumenta; la expresión del gen metJ se atenúa; la expresión de un alelo de metA* que codifica una enzima con menor sensibilidad por retroalimentación a la S-adenosilmetionina y/o metionina (MetA*) se aumenta; la expresión de un alelo de thrA* que codifica una enzima con menor inhibición por retroalimentación para la treonina (thrA*) se aumenta; la expresión del gen cysE se aumenta; y la expresión de los genes metF y/o metH se aumenta.

En un aspecto particular de la invención, E. coli comprende las siguientes modificaciones genéticas:

- los genes metN, metI, metQ se eliminan y los genes ygaZ e ygaH o sus genes homólogos procedentes de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacteryoungae o Citrobacter freundii son sobreexpresados,

- la expresión de los genes metA*, metH, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serA, serB, serC, cysE, thrA*, ptsGy pyc se aumenta, y

- la expresión de los genes metJ, pykA, pykF, purU, metE, dgsA y yncA se atenúa.

Condiciones de cultivo

En un segundo aspecto de la invención, se optimiza un método para la producción fermentativa de metionina y/o sus derivados. Comprende las siguientes etapas:

- Cultivar una E. coli recombinante, en donde la importación de metionina se atenúa por atenuación de la expresión de al menos un gen entre metN, metI, metQ y se potencia el eflujo de metionina por sobreexpresión de los genes ygaZH o sus

en un medio de cultivo adecuado que comprende una fuente de carbono fermentable y una fuente de azufre, y - Recuperar la metionina y/o sus derivados del medio de cultivo.

Los expertos en la técnica pueden definir las condiciones de cultivo para los microorganismos de acuerdo con la invención. En particular, las bacterias son fermentadas a una temperatura entre 20°C y 55°C, preferiblemente entre 25°C y 40°C, y más específicamente aproximadamente 37°C para E. coli.

Para E. coli, el medio de cultivo puede ser de composición idéntica o similar a un medio M9 (Anderson, 1946), un medio M63 (Miller, 1992); o un medio tal como definen Schaefer et al., (]999).

En el método de la invención, los genes ygaZH que son sobreexpresados en el microorganismo recombinante se seleccionan preferiblemente entre el grupo que consiste en genes homólogos de especies de Citrobacter, especies de Shigella, especies de Raoultella, especies de Enterobacter, especies de Yersinia y especies de Photorhabdus, y más preferiblemente procedente de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae o Citrobacter freundii.

De acuerdo con un aspecto específico de la invención, el método se lleva a cabo con una E. coli recombinante que comprende

a. eliminación de al menos un gen seleccionado entre metN, metI o metQ, y

b. sobreexpresión de los genes ygaZH o sus genes homólogos.

En este aspecto específico del método de la invención, dichos genes ygaZH se seleccionan preferiblemente entre el grupo que consiste en genes homólogos de especies de Citrobacter, especies de Shigella, especies de Raoultella, especies de Enterobacter, especies de Yersinia y especies de Photorhabdus, y más preferiblemente se seleccionan de los grupos que consisten en genes homólogos de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacter youngae o Citrobacter freundii. En el método de la invención, los genes ygaZH que son sobreexpresados en el microorganismo recombinante son lo más preferiblemente procedentes de Citrobacter koseri, Citrobacter youngae, Citrobacter freundii o Enterobacter sp. En alguna realización de la invención, el cultivo de E. coli recombinante se somete a una limitación o supresión de uno o varios sustratos inorgánicos, en particular fosfato y/o potasio, en el medio de cultivo. Se refiere a condiciones en las que el cultivo de los microorganismos está gobernado por la cantidad de un compuesto químico inorgánico suministrado que permite el cultivo débil. Dicha limitación en el cultivo de microorganismos se ha descrito en la solicitud de patente WO 2009/043372. En una realización preferida de la invención, el cultivo se somete a limitación de fosfato.

La acción de "recuperación de metionina y/o sus derivados del medio de cultivo" designa la acción de recuperar L-metionina y/o uno de sus derivados, en particular N-acetilmetionina (NAM) y S-adenosilmetionina (SAM) y todos los demás derivados que puedan ser útiles tales como hidroximetionina (o análogo hidroxi de la metionina o MHA). Los métodos para la recuperación y purificación de los compuestos producidos son bien conocidos para los expertos en la técnica (véase, en particular los documentos WO 2005/007862, WO 2005/059155). Preferiblemente, la etapa de recuperación de metionina y/o sus derivados comprende una etapa de concentración de metionina y/o sus derivados en el caldo de fermentación.

La cantidad de producto en el medio de fermentación se puede determinar usando una serie de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o cromatografía de gases (GC). Por ejemplo, la cantidad de metionina obtenida en el medio se mide por HPLC después de derivatización de OPA/Fmoc usando L-metionina (Fluka, Ref 6431 9) como una referencia. La cantidad de NAM se determina usando HPLC refractométrico usando NAM (Sigma, Ref 01310) como una referencia.

Ejemplos

Protocolos

Se han usado varios protocolos para construir cepas productoras de metionina descritos en los siguientes ejemplos. El protocolo 1 (modificaciones cromosómicas por recombinación homóloga y selección de recombinantes) y el protocolo 2 (transducción de fago PI) usados en esta invención se han descrito con detalle en la solicitud de patente WO 2013/001055.

Protocolo 3: Construcción de plásmidos recombinantes

La tecnología de ADN recombinante está bien descrita y es conocida para el experto en la técnica. Brevemente, los fragmentos de ADN se amplificaron por PCR usando oligonucleótidos (que el experto en la técnica podrá definir) y ADN genómico MG1655 como matriz. Los fragmentos de ADN y el plásmido seleccionado se digirieron con enzima de restricción compatible (que el experto en la técnica puede definir), después se ligaron y se transformaron en células competentes. Los transformantes se analizaron y el plásmido recombinante de interés se verificó por secuenciación de ADN.

Tabla 3: secuencias de oligonucleótidos citadas en los siguientes ejemplos

Protocolo 4: Curado de plásmido

Este método de curado de plásmido se basa en la electroporación de alto voltaje que se usa normalmente para transformar el ADN. Para el curado de plásmido, el principio es más bien el mismo salvo que no se añade ADN a la célula antes del choque eléctrico (Heery et al., 1989).

Las tecnologías de transformación de ADN están bien descritas y son conocidas para el experto en la técnica.

Brevemente, la cepa para la cual hay que retirar el plásmido se cultivó hasta la fase de crecimiento exponencial. Después, las células se sedimentaron y se lavaron tres veces en agua desionizada estéril. Las células se incubaron sobre hielo durante cinco a diez minutos antes de hacer pasar un pulso eléctrico a 2,50 kV, 25 pF (constante de tiempo aproximada 4,5 ms). Se añadió un ml de tampón SOC inmediatamente después del pulso y las células se cultivaron a temperatura adecuada durante una a dos horas antes de cultivo en placa en medio no selectivo para deshacerse del plásmido (se añaden antibióticos de acuerdo con que los otros plásmidos se mantengan en la cepa). Después de aislar las células curadas, se verificó la ausencia de plásmido.

Ejemplo 1: Sobreexpresión de un sistema de secreción de L-metionina en una cepa recombinante de E. coli superproductora de L-metionina - Construcción de la cepa 1

Se usó la cepa productora de metionina 16 descrita en la solicitud de patente WO 2013/001055 como cepa receptora. Esta cepa contiene la mutación en el gen metE descrita en la solicitud de patente WO2013/190343.

El gen que codifica la metionina sintasa dependiente de cobalamina, metH, se sobreprodujo usando el mismo promotor y sitio de unión al ribosoma como se describe en la solicitud de patente WO 2007/077041 y un cromosoma artificial bacteriano (pCC1 BAC, Epicentre). De forma más precisa, el gen metH y el promotor artificial se clonaron en el plásmido de tipo pCC1BAC contenido en la cepa 17 descrita en la solicitud de patente WO 2013/001055. El plásmido se denominó pME1109.

En paralelo, se sobreexpresaron los genes fldA y fpr que codifican el sistema de reactivación de MetH, a partir del plásmido de número de copias moderado pCL1920 (Lerner y Inouye, 1990) usando sus promotores naturales. El plásmido se denominó pME1089.

En tercer lugar, se sobreexpresaron los genes ygaZH que codifican el exportador de metionina. Se clonaron en el plásmido de número de copias moderado pCL1920 (Lerner y Inouye, 1990) con el uso del promotor natural de ygaZ. De forma más precisa, el operón de ygaZH y su promotor se clonaron en el pME1089 descrito antes. El plásmido se denominó pME1219.

Finalmente, los plásmidos pME1109 y pME1219 se transformaron en la cepa productora de metionina 16 de la solicitud de patente WO 2013/001055, dando la cepa 1.

Ejemplo 2: Eliminación del sistema de captación de L-metionina en una cepa de E. coli superproductora de L-metionina - Construcción de las cepas, 2, 3, 4 y 5.

La cepa productora de metionina 16 de la solicitud de patente WO2013/001055, se transformó con los plásmidos pME1109 y pME1089 (descritos en el ejemplo 1), dando lugar a la cepa 2.

Para inactivar el importador de metionina codificado por el operón metNIQ en la cepa 2, se usó la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko y Wanner, 2000 (de acuerdo con el protocolo 1). Por lo tanto, se usaron los oligonucleótidos Ome0233/Ome0232 (SEQ ID N° 21 y 22 dados en la tabla 1) para amplificar por la PCR el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. Después, el producto obtenido de la PCR se introdujo por electroporación en la cepa MG1655 metA*11 (pKD46). Después se seleccionaron los transformantes resistentes a cloranfenicol y la inserción del casete de resistencia se verificó por análisis de PCR con los oligonucleótidos adecuados. La cepa retenida se denomina MG1655 metA*11 AmetNIQ::Cm. Finalmente, la eliminación de AmetNIQ::Cm se transfirió por transducción del fago P1 (de acuerdo con el protocolo 2) de la cepa MG1655 meta*11 AmetNIQ::Cm a la cepa 2. Se seleccionaron los transductores resistentes a cloranfenicol y se verificó la presencia de la eliminación cromosómica de AmetNIQ::Cm por PCR con los oligonucleótidos adecuados. La cepa retenida se llamó cepa 3.

De la misma forma, se eliminaron los 3 genes, metN, metI y metQ en la cepa 1 descrita en la solicitud de patente WO2013/001055. La cepa 1 de la solicitud de patente WO 2013/001055, se renombra en la presente memoria como cepa 4 para ser la referencia de la cepa 5.

La eliminación de metNIQ realizada en la cepa 4 como se ha descrito antes, da lugar a la cepa 5.

Ejemplo 3: Combinación de la sobreexpresión del sistema de secreción de L-metionina con la eliminación del sistema de captación de L-metionina en una cepa de E. coli sobreproductora de L-metionina - Construcción de la cepa 6

Para inactivar el importador de metionina codificado por el operón metNIQ en la cepa sobreproductora del exportador de metionina codificado por el operón ygaZH, la eliminación de AmetNIQ::Cm se transfirió por transducción del fago P1 (de acuerdo con el protocolo 2) de la cepa MG1655 metA*11 AmetNIQ::Cm a la cepa productora de metionina 1. Se seleccionaron los transductores resistentes a cloranfenicol y se verificó la presencia de la eliminación cromosómica de AmetNIQ::Cm por PCR con los oligonucleótidos adecuados. La cepa retenida se llamó cepa 6.

Ejemplo 4: Producción de L-metionina por fermentación en biorreactor.

Se analizaron cepas que producían L-metionina en condiciones de producción en reactores de 2,5 litros (Pierre Guerin) usando una estrategia de cultivo discontinuo alimentado.

Brevemente, se usó un cultivo de 24 horas cultivado en 10 ml de medio LB con glucosa 2,5 g.l^-1 para inocular un precultivo de 24 horas en medio mínimo (Bla). Estas incubaciones se llevaron a cabo en 500 ml en matraces con deflectores de 50 ml de medio mínimo (Bla) en un agitador rotatorio (200 rpm). El primer precultivo se llevó a cabo a una temperatura de 30°C, el segundo a una temperatura de 34°C.

Se llevó a cabo una tercera etapa de precultivo en biorreactores (Sixfors) cargados con 200 ml de medio mínimo (B1b) inoculado con una concentración de biomasa de 1,2 g.l^-1 con 5 ml de precultivo concentrado. La temperatura del precultivo se mantuvo constante a 34°C y el pH se ajustó automáticamente a un valor de 6,8 usando una disolución de NH⁴OH al 10%. La concentración de oxígeno disuelto se ajustó continuamente a un valor de 30% de saturación de la presión parcial de aire con suministro de aire y/o agitación. Después de agotarse la glucosa del medio discontinuo, se inició el discontinuo alimentado con un caudal inicial de 0,7 ml .h, antes de aumentar exponencialmente durante 26 horas con una tasa de crecimiento de 0,13 h^-1 con el fin de obtener una concentración celular final de aproximadamente 20 g.l^-1.

Tabla 4: Composición del medio mineral de precultivo discontinuo (B1 a y B1b)

Tabla 5: Composición del medio mineral de precultivo discontinuo alimentado (F1)

Posteriormente se cargaron termentadores de 2,5 litros (Pierre Guerin) con 600 o 620 ml de medio mínimo (B2) y se inocularon con una concentración de biomasa de 3,2 g.l^-1 con un volumen de precultivo en el intervalo de 80 a 100 ml.

El cultivo celular se controla mediante fosfato, que es por lo que la concentración final de fosfato en el medio discontinuo B2 se ajustó a un valor comprendido entre 0 a 20 mM, por adición de diferentes concentraciones de KH²PO⁴, K²HPO⁴ y (NH⁴)²HPO⁴. De la misma forma, la concentración final de fosfato del medio F2 se ajustó a un valor comprendido entre 5 a 30 mM, por adición de diferentes concentraciones de KH²PO⁴, K²HPO⁴ y (NH⁴)²HPO⁴. La concentración de tiosulfato en el medio discontinuo alimentado se puede ajustar con el fin de prevenir un agotamiento de este compuesto durante el cultivo.

Tabla 6: Composición del medio mineral de cultivo discontinuo (B2)

Tabla 7: Composición del medio de cultivo discontinuo alimentado (F2)

La temperatura del cultivo se mantuvo constante a 37°C y el pH se mantuvo en el valor de trabajo (6,8) por adición automática de disoluciones de NH⁴OH (10% y 28%). La velocidad de agitación inicial se fijó en 200 rpm durante la fase discontinua y se aumentó hasta 1000 rpm durante la fase discontinua alimentada. El caudal de aire inicial se fijó en 40 NL.h^-1 durante la fase discontinua y se aumentó a 100 NL.h^-1 al principio de la fase discontinua alimentada. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo en valores entre 20 y 40%, preferiblemente 30% de saturación por aumento de la agitación.

Se añadió IPTG al medio discontinuo y discontinuo alimentado cuando era necesario en una concentración final de 20 pM. Cuando era necesario, se añadieron antibióticos en una concentración de 50 mg.l^-1 para la estreptomicina, 30 mg.l^-1 para el cloranfenicol y 100 mg.l^-1 para la ampicilina.

Cuando la masa de células alcanzó una concentración cercana a 5 g.l^-1, se inició la alimentación discontinua con un caudal inicial de 5 ml.h^-1. Se inyectó la disolución de alimentación con un perfil sigmoideo con un caudal creciente que alcanzó 24 ml.h^-1 después de 25 horas. Las condiciones de alimentación precisas se calcularon mediante la ecuación:

donde Q(t) es el caudal de alimentación en ml.h-1 con p1 = 1,80, p2 = 22,4, p3 = 0,27, p4 = 6,50. Este caudal se aumentó de 10 a 50%, preferiblemente entre 20 y 30% a lo largo del cultivo entero.

Después de 25 horas de alimentación discontinua, se detuvo la bomba de disolución de alimentación y el cultivo se finalizó después de agotamiento de la glucosa.

Los aminoácidos extracelulares se cuantificaron por HPLC después de derivatización con OPA/Fmoc y se analizaron otros metabolitos relevantes usando HPLC con detección refractométrica (ácidos orgánicos y glucosa) y GC-MS después de sililación.

Se analizó el impacto de la combinación de la eliminación del operón metNIQ y/o la sobreexpresión del operón ygaZH en la producción de metionina. Los resultados se presentan en la tabla 8 y tabla 9.

Tabla 8: Rendimientos de metionina máximos y finales producidos en cultivos discontinuos alimentados por las diferentes cepas Los rendimientos de las cepas de interés, cepa 3, 1 y 6, se comparan con la cepa de referencia, cepa 2, cultivada en las mismas condiciones. El símbolo ~ indica que no hay diferencia entre las cepas, el símbolo indica un aumento entre 1 a 3% y el símbolo + indica un aumento mayor de 3%. Para la definición del rendimiento de metionina/glucosa véase a continuación.

Los resultados presentados en la tabla 8 muestran que la eliminación del operón metNIQ no es beneficiosa para la producción de metionina (cepa 3) en el contexto genético de la cepa 2. Por lo tanto, esta modificación genética se ensayó en la cepa 4 con un contexto genético diferente de la cepa 2. Este ensayo muestra un efecto negativo de la eliminación del operón metNIQ en la producción de metionina (véase la siguiente tabla 9). Las cepas 4 y 5 se cultivaron en reactores de 2 L como se describe en la solicitud de patente WO2013/001055.

Tabla 9: Rendimientos de metionina máximos y finales producidos en cultivos discontinuos alimentados por la cepa 5. Los rendimientos de la cepa de interés (cepa 5) se comparan con la cepa de referencia, cepa 4, cultivada en las mismas condiciones. El símbolo - indica una disminución mayor de 4% en comparación con la cepa de referencia. Para la definición del rendimiento de metionina/glucosa véase a continuación.

Estos resultados muestran que a pesar de lo descrito en la técnica anterior para C. glutamicum, la eliminación de solo el operón metNIQ en E. coli no potencia la producción de metionina cualquiera que sea el contexto genético (cepa 3 y 5). Además, los rendimientos de la cepa 5 están por debajo de los rendimientos de su cepa madre (cepa 4). Incluso aunque la sobreexpresión de ygaZH conduce a una mayor producción de metionina (cepa 1, tabla 8) al final del cultivo, sorprendentemente la combinación de la eliminación del operón metNIQ y la sobreexpresión de ygaZH potencia los rendimientos generales de la producción de metionina de la cepa 6. Este resultado no era esperado puesto que la eliminación del operón metNIQ se mostró que era negativa o neutra en los rendimientos de producción de L-metionina en diferentes contextos genéticos incluyendo la cepa madre.

Determinación del rendimiento de metionina/glucosa (Y^met)

El volumen del reactor se calculó añadiendo al volumen inicial la cantidad de disoluciones añadidas para regular el pH y para alimentar el cultivo y restando el volumen usado para la toma de muestra y la pérdida por evaporación.

El volumen discontinuo alimentado se controló continuamente pesando la disolución madre de alimentación. La cantidad de glucosa inyectada se calculó entonces basándose en el peso inyectado, la densidad de la disolución y la concentración de glucosa determinada por el método de Brix ([glucosa]). El rendimiento de metionina se expresaba como sigue:

Con Metioninaü y Metioninat respectivamente las concentraciones inicial y final de metionina, y V0 y Vt los volúmenes inicial y el tiempo t.

La glucosa consumida se calculó como sigue:

Glucosa inyectada^t = volumen alimentado^t * [Glucosa]

Glucosa consumida^t = [Glucosa]o * V⁰ + Glucosa inyectada - [Glucosa]^residual * V^t

Con la [Glucosa]⁰, [Glucosa], [Glucosa]^residual respectivamente las concentraciones de glucosa inicial, la alimentada y la residual.

Ejemplo 5: Combinación de la eliminación del sistema de captación de L-metionina con la sobreproducción de diferentes sistemas de secreción de L-metionina de varios microorganismos en una cepa de E. coli sobreproductora de L-metionina - Construcción de las cepas 7 a 15

Los genes homólogos ygaZH de especies de Citrobacter, especies de Raoultella, especies de Shigella, especies de Enterobacter, especies de Yersinia y especies de Photorhabdus se sobreexpresaron en el contexto genético de la cepa 3.

Antes de usar la cepa 3, se eliminó el plásmido pME1089 de esta cepa usando un método de plásmido de curado como describen Heery et al., 1989 (de acuerdo con el protocolo 4). Se seleccionaron las células curadas sin el plásmido pME1089, pero que tenían retenido el plásmido pME1109. La cepa resultante se denominó cepa 7.

Construcción de las cepas 8 a 15 - Sobreproducción de sistemas de secreción de L-metionina homólogos, sobreexpresión de ygaZH del género y especies dadas en la tabla 10.

Para sobreexpresar los genes homólogos de ygaZH dados en la tabla 10, se clonó cada pareja de genes, como para los genes ygaZH de E. coli, en el plásmido de número de copias moderado pCL1920 (Lerner y Inouye, 1990) usando el promotor natural y el sitio de unión al ribosoma natural del gen de E. coli ygaZ. De forma más precisa, los genes homólogos de ygaZH se clonaron en el plásmido pME1089 descrito antes. Como se especifica en la tabla 11, los genes homólogos de ygaZH se amplificaron a partir del ADN genómico de la cepa correspondiente o se sintetizaron químicamente, con o sin optimización del uso de codones para E. coli (propuesto por el servicio de GeneArt® Gene Synthesis con el software GeneOptimizer® - Lifetechnologies). Los fragmentos de ADN amplificados que comprenden los genes homólogos de ygaZH se describen en la SEQ ID indicada en la tabla 11. Los plásmidos resultantes se nombran como se menciona en la tabla 11. Finalmente, cada plásmido se transformó en la cepa 7, dando lugar a las cepas 8 a 15 citadas como "nombre de cepa" en la tabla 11.

Tabla 10: Proteínas homólogas de YgaZH

Tabla 11: Plásmidos y cepas que llevan genes homólogos de ygaZH

Ejemplo 6: Producción de L-metionina por fermentación en experimentos en matraces.

Productores de L-metionina recombinantes que tenían la eliminación del operón metNIQ combinada con la sobreexpresión de diferentes sistemas de secreción de L-metionina de varios microorganismos (homólogos de YgaZH de E.coli) se evaluaron en matraces Erlenmeyer pequeños.

Un precultivo de 5,5 ml se cultivó a 30°C durante 21 horas en un medio mixto (10% de medio LB (Sigma 25%) con 2,5 g.l^-1 de glucosa y 90% de medio mínimo PC1, Tabla 12). Se usó para inocular un cultivo de 50 ml a una OD⁶⁰⁰ de 0,2 en medio PC1. Se añadieron estreptomicina y kanamicina en una concentración de 50 mg.l^-1, cloranfenicol en 30 mg.l^-1 y gentamicina en 10 mg.l^-1 cuando era necesario. La temperatura de los cultivos era 37°C. Cuando el cultivo alcanzó una OD^6oo de 5 a 7, los aminoácidos extracelulares se cuantificaron por HPLC después de derivatización con OPA/Fmoc y se analizaron otros metabolitos relevantes usando HPLC con detección refractométrica (ácidos orgánicos y glucosa) y GC-MS después de sililación.

Tabla 12:_Composición del medio mínimo (PC1)

Tabla 13: Rendimiento de metionina (Ymet) en g de metionina / % g de glucosa producido en el cultivo en matraces por las cepas de interés, que llevaban homólogos de los genes ygaZH y la eliminación del operón metNIQ. Para la definición precisa de rendimiento de metionina/glucosa véase más adelante. "n" indica el número de repeticiones

Como puede verse en la tabla 13, la sobreexpresión de genes homólogos de ygaZH de diferentes microorganismos en el productor de L-metionina que lleva la eliminación del operón metNIQ conduce a rendimientos equivalentes o menores que los obtenidos con la cepa 6 que sobreexpresa ygaZH de E.coli. Los sistemas de secreción de L-metionina homólogos de otros microorganismos distintos de E. coli pueden sustituir las proteínas endógenas de la bacteria. Las proteínas homólogas de YgaZH de Citrobacter Koseri (cepa 8, Ymet=19,6 g/g), Citrobacter youngae (cepa 14, Ymet=19,6 g/g), Citrobacter freundii (cepa 15, Ymet=19,6 g/g) y Enterobacter sp. (cepa 11, Ymet=19,4 g/g) mostraban los mejores rendimientos de producción de L-metionina de la cepa 6 (Ymet=18,7 g/g).

El rendimiento de metionina se expresaba como sigue:

Referencias

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una cepa de Escherichia coli (E. coli) recombinante optimizada para la producción fermentativa de metionina y/o sus derivados, seleccionados de N-acetil-metionina (NAM), S-adenosil-metionina (SAM), y análogo hidroxi de metionina (MHA), en donde en dicha cepa recombinante, al menos un gen seleccionado entre metN, metí o metQ se atenúa en comparación con la cepa no modificada y los genes ygaZH se sobreexpresan en comparación con la cepa no modificada.

2. La cepa de E. coli de la reivindicación 1, en donde se elimina al menos un gen seleccionado de metN, metI o metQ.

3. La cepa de E. coli de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dichos genes ygaZH se seleccionan entre el grupo que consiste en genes ygaZH de especies de Citrobacter, especies de Shigella, especies de Raoultella, especies de Enterobacter, especies de Yersinia y especies de Photorhabdus.

4. La cepa de E. coli de la reivindicación 3, en donde dichos genes ygaZH proceden de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacteryoungae o Citrobacter freundii.

5. La cepa de E. coli de la reivindicación 1 a 4, en donde dichos genes ygaZH son expresados bajo el control de un promotor inducible.

6. La cepa de E. coli de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde se aumenta también la expresión de al menos uno de los siguientes genes en comparación con la cepa no modificada: ptsG, pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysl, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metH, fldA, fpr, metA, alelo metA* que codifica una enzima con menor sensibilidad de retroalimentación para la S-adenosilmetionina y/o metionina, thrA, o un alelo thrA*que codifica una enzima con menor inhibición de retroalimentación para la treonina.

7. La cepa de E. coli de la reivindicación 6, en donde al menos uno de dichos genes está bajo el control de un promotor inducible.

8. La cepa de E. coli de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la expresión de al menos uno de los siguientes genes también se atenúa en comparación con la cepa no modificada: metJ, pykA, pykF, purU, ybdL, yncA, metE, dgsA o udhA.

9. La cepa de E. coli de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde:

a. se eliminan los genes metN, metI y metQ y se sobreexpresan los genes ygaZe ygaH en comparación con la cepa no modificada,

b. se aumenta la expresión de los genes metA*, metH, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serA, serB, serC, cysE, thrA*, ptsG y pyc en comparación con la cepa no modificada; y

c. se atenúa la expresión de los genes metJ, pykA, pykF, purU, dgsA, nietE y yncA en comparación con la cepa no modificada.

10. Un método para la producción fermentativa de metionina o sus derivados seleccionados de N-acetil-metionina (NAM), S-adenosil-metionina (SAM), y análogo hidroxi de metionina (MHA), que comprende las etapas de:

a. cultivar una E. coli recombinante en donde en dicha E. coli, al menos un gen seleccionado entre metN, metI o metQ se atenúa en comparación con la E. coli no modificada, y los genes ygaZH se sobreexpresan en comparación con la E. coli no modificada, en un medio de cultivo adecuado que comprende una fuente fermentable de carbono y una fuente de azufre, y

b. recuperar la metionina y/o sus derivados seleccionados de N-acetil-metionina (NAM), S-adenosil-metionina (SAM), y análogo hidroxi de metionina (MHA), del medio de cultivo.

11. El método de la reivindicación 10, en donde la E. coli recombinante comprende:

a. eliminación de al menos un gen seleccionado entre metN, metI o metQ, y

b. sobreexpresión de los genes ygaZH en comparación con E. coli no modificada.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en donde dichos genes ygaZH se seleccionan entre el grupo que consiste en genes ygaZH de especies de Citrobacter, especies de Shigella, especies de Raoultella, especies de Enterobacter, especies de Yersinia y especies de Photorhabdus.

13. El método de la reivindicación 12, en donde dichos genes ygaZH proceden de Citrobacter koseri, Shigella flexneri, Raoultella ornithinolytica, Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Photorhabdus luminescens, Citrobacteryoungae o Citrobacter freundii.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde el cultivo de E. coli recombinante se somete a limitación o deficiencia de uno o varios sustratos inorgánicos, en particular fosfato y/o potasio, en el medio de cultivo.