CN107109359B

CN107109359B - 用于通过具有改进的甲硫氨酸排出的发酵生产甲硫氨酸的方法和微生物

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Publication number: CN107109359B
Application number: CN201580058215.1A
Authority: CN
Inventors: R·菲格; L·迪蒙-塞格诺弗特; P·瓦苏尔; W·迪彻特
Original assignee: Evonik Operations GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2014-09-01
Filing date: 2015-08-31
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2035-08-31
Also published as: US20170240938A1; RU2723714C2; CN107109359A; WO2016034536A1; BR112017003955A2; JP2017525379A; KR20170044740A; CA2959563A1; EP3189150A1; US10329591B2; MY194223A; RU2017107682A3; MX2017002662A; RU2017107682A

Abstract

本发明涉及针对甲硫氨酸和/或其衍生物的发酵生产优化的重组微生物，其中在所述重组菌株中，通过对来自大肠杆菌(Escherichia coli)的ygaZ和ygaH基因的同源基因的过表达来增强甲硫氨酸排出。还涉及优化甲硫氨酸或其衍生物的发酵生产的方法，其包括如下步骤：a.培养重组微生物，其中在所述微生物中，通过对来自大肠杆菌的ygaZ和ygaH基因的ygaZH同源基因的过表达来增强甲硫氨酸排出，所述培养在包含的可发酵的碳源和硫源的适当培养基中进行，和b.从所述培养基回收甲硫氨酸和/或其衍生物。

Description

用于通过具有改进的甲硫氨酸排出的发酵生产甲硫氨酸的方法和微生物

发明领域

本发明涉及可用于生产L-甲硫氨酸和/或其衍生物的重组微生物和用于制备L-甲硫氨酸的方法。本发明的微生物经修饰从而通过在重组微生物中过表达来自大肠杆菌(E.coli)的ygaZ和ygaH基因的同源基因而增加甲硫氨酸/碳源产量/得率(yield)。

背景技术

含硫化合物如半胱氨酸，高半胱氨酸，甲硫氨酸或S-腺苷甲硫胺酸对细胞代谢至关重要。特别是L-甲硫氨酸这种必需氨基酸，其不能由动物合成，在许多机体功能中起重要作用。大多数工业生产的甲硫氨酸广泛用作动物饲料和食品添加剂。

由于BSE和鸡流感导致动物来源蛋白的使用减少，对纯甲硫氨酸的需求量有所增加。通常，D,L-甲硫氨酸由丙烯醛，甲硫醇和氰化氢化学产生。然而，外消旋混合物的性能不如纯L-甲硫氨酸(Saunderson,1985)。此外，尽管纯L-甲硫氨酸可以由外消旋甲硫氨酸生产，例如通过酰基转移酶处理N-乙酰基-D,L-甲硫氨酸，但这急剧增加了生产成本。因此，对纯L-甲硫氨酸渐增的需求加上环境问题使甲硫氨酸的微生物生产的前景极具吸引力。

其他重要的氨基酸，如赖氨酸、苏氨酸和色氨酸，其通过发酵生产用于动物饲料的用途。因此，这些氨基酸可以使用葡萄糖和其他可再生资源作为起始材料制备。通过发酵的L-甲硫氨酸工业生产尚未成功，但技术的开发正在进行中。

用于优化微生物中的L-甲硫氨酸生产的不同方法此前已有描述(参见例如专利或专利申请US 7,790,424、US 7,611,873、WO 2002/10209、WO 2005/059093和WO 2006/008097)；然而，从微生物进行的L-甲硫氨酸的工业生产需要进一步的改进。

当L-甲硫氨酸以一定水平或更高水平合成时，其通过反馈回路抑制其自身的进一步生产并扰乱细胞的生理学。因此，这些改进之一是减少微生物中的L-甲硫氨酸积累，以通过增强重组L-甲硫氨酸过量产生微生物中的L-甲硫氨酸排出来确保有效的生产。

甲硫氨酸输出在大肠杆菌中由复合体YgaZH介导，而在谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)中由同源复合体BrnFE介导(

等,2005)。YgaZ是负责L-缬氨酸和L-甲硫氨酸输出的支链氨基酸输出蛋白(LIV-E)家族的成员。YgaZ与YgaH(一种预测的内膜蛋白)形成复合体，以在其水平会对细胞具有毒性的条件下输出氨基酸。

专利申请EP 1239041和WO 2008/082211描述了负责在大肠杆菌中输出L-缬氨酸和L-甲硫氨酸的支链氨基酸输出蛋白(YgaZH)的过表达。这种过表达导致大肠杆菌中甲硫氨酸的生产改进。

本发明人已经从大肠杆菌中鉴定了ygaZ和ygaH基因的几个同源基因，其对于甲硫氨酸生产比来自大肠杆菌的ygaZ和ygaH基因令人惊奇地更有效。

发明概述

本发明涉及用于优化甲硫氨酸和/或其衍生物的生产的重组微生物和方法，其中增强了甲硫氨酸输出。在所述重组微生物中，通过对来自大肠杆菌的ygaZ和ygaH基因的同源基因进行过表达而增强甲硫氨酸排出(efflux)。

具体地，本发明涉及重组微生物及其在优化甲硫氨酸和/或其衍生物的生产的方法中的用途，其中在所述重组微生物中，通过对来自大肠杆菌的ygaZ和ygaH基因的ygaZH同源基因进行过表达而增强甲硫氨酸排出，条件是该过表达既不与来自大肠杆菌的metH和任选的fldA和fpr或来谷氨酸棒状杆菌的同源基因的过表达组合，也不与metN、metI或metQ中至少一个基因的表达减弱组合，所述ygaZH同源基因选自下组：柠檬酸杆菌属(Citrobacter)菌种、志贺氏菌属(Shigella)菌种、柔武氏菌属(Raoultella)菌种、肠杆菌属(Enterobacter)菌种、耶尔森氏菌属(Yersinia)菌种和光杆状菌属(Photorhabdus)菌种。

本发明的重组微生物还可以包含其他遗传修饰，如：

-如下基因的至少一个的表达增加：ptsG、pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metA、metA*等位基因(其编码具有降低的针对S-腺苷甲硫胺酸和/或甲硫氨酸的反馈敏感性的酶)、thrA、或thrA*等位基因(其编码具有降低的针对苏氨酸的反馈抑制的酶)和/或

-如下基因的至少一个的表达减弱：metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、udhA、dgsA、metE或yncA。

在一个具体实施方案中，本发明涉及重组微生物，其中：a)来自大肠杆菌的ygaZH基因的源自克氏柠檬酸杆菌、弗氏志贺氏菌、解鸟氨酸柔武氏菌、肠杆菌属菌种、小肠结肠炎耶尔森氏菌、发光光杆状菌、杨氏柠檬酸杆菌或弗氏柠檬酸杆菌的同源基因是过表达的；条件是该过表达既不与来自大肠杆菌的metH和任选的fldA和fpr或来自谷氨酸棒状杆菌的同源基因的过表达组合，也不与选自metN、metI或metQ的至少一个基因的表达减弱组合，和b)如下至少一个基因的表达是增强的：metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*和pyc；且c)如下至少一个基因的表达是减弱的：metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、yncA、dgsA、metE和udhA。

优选地，所述重组微生物是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。

发明详述

在详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于具体例示的方法，并且当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述本发明的具体实施例的目的，并不意在限制，而是仅由所附权利要求书限制。

本文引用的所有出版物，专利和专利申请，无论是上文还是下文内容，均通过提述以其整体并入本文。

此外，除另有说明外，本发明的实践使用本领域技术范围内的常规微生物和分子生物学技术。这些技术是本领域技术人员已知的，并且在文献中有充分解释。

必须指出，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”，“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。因此，例如，对“微生物”的提述包括多个这样的微生物，而对“内源基因”的提述是指一个或多个内源基因，等等。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然可以使用与本文所述类似或等同的任何材料和方法来实践或测试本发明，但是此处描述了优选的材料和方法。

在本发明的权利要求书和本发明的连续说明书中，除上下文另有规定外，由于明确的语言或必要的含义，词语“包含(comprise)”，“含有(contain)”，“涉及(involve)”或“包括(include)”或变体如“包含(comprises)”，“包含(comprising)”，“含有(containing)”，“涉及(involved)”，“包括(includes)”，“包括(including)”在本发明的各种实施方案中以含括性意义使用，即指定所述特征的存在，但不排除其他特征的存在或添加进一步的特征。

术语“甲硫氨酸”和“L-甲硫氨酸”表示必需的含硫氨基酸，其具有化学式HO₂CCH(NH₂)CH₂CH₂SCH₃和CAS号59-51-8或63-68-3(对于具体的L-异构体)。

“甲硫氨酸衍生物”是指甲硫氨酸的分子类似物，其存在相同的化学主链，但与甲硫氨酸至少有一个化学基团不同。在本发明中，优选的甲硫氨酸衍生物是N-乙酰甲硫氨酸(NAM)，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和羟基甲硫氨酸(或甲硫氨酸羟基类似物或MHA)。

如本文所用的，术语“微生物”意指未经人工修饰的细菌、酵母或真菌。优选地，所述微生物选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优选地，所述微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)、或棒状杆菌属(Corynebacterium)的菌种。更加优选地，本发明的微生物是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌种。

本文所用的术语“重组微生物”或“遗传修饰的微生物”是指在自然界中不存在并且在遗传上不同于其在自然界中发现的等同物的细菌、酵母或真菌。这意味着，其是通过引入或缺失或修饰遗传元件来加以修饰的。也可以通过组合定向诱变和在特定选择压力下的进化来强迫新代谢途径的发展和进化而转变(参见例如WO 2004/076659或WO 2007/011939)。

如果将这些基因与允许其在宿主微生物中表达的所有元件一起导入到微生物中，则可以修饰微生物以表达外源基因。用外源DNA的修饰或“转化”微生物是本领域技术人员的常规任务。

可以修饰微生物以调节内源基因的表达水平。

术语“内源基因”是指在任何遗传修饰之前该基因就已存在于微生物中。通过额外引入异源序列或引入异源序列来替代内源性调控元件，或通过将一个或多个该基因的补充拷贝引入染色体或质粒，可以过表达内源基因。还可以修饰内源基因以调节其表达和相应的编码蛋白的活性。例如，可以引入突变至编码序列中以修饰基因产物，或者可以额外引入异源序列或引入异源序列来替代内源性调节元件。内源基因的调节可导致基因产物的活性的上调和/或增强，或者下调和/或降低内源基因产物的活性。

调节它们的表达的另一种方式是将基因的内源启动子(例如野生型启动子)与更强或更弱的启动子进行交换，以上调或下调内源基因的表达。这些启动子可以是同源的或异源的。选择合适的启动子完全在本领域技术人员的能力范围内。

相反，“外源基因”是指通过本领域技术人员已知的方法将该基因引入微生物，而该基因不是天然存在于所述微生物中的。外源基因可以整合到宿主染色体中，或通过质粒或载体在染色体外表达。各种质粒(关于其复制起点及其在细胞中的拷贝数是不同的)是本领域已知的。这些基因可以是同源的。

在本发明的上下文中，术语“同源基因”不限于表示具有理论上共同遗传祖先的基因，而是包括可能在遗传上无关的基因，所述遗传上无关的基因仍然进化到编码发挥与其相似功能和/或具有相似结构的蛋白质。因此，用于本发明目的术语“功能同源物”涉及以下事实：某些酶活性不仅可以由限定氨基酸序列的具体蛋白提供，而且还可以由来自其它相关/不相关微生物的相似序列的蛋白提供。

使用Genbank中提供的已知基因的参考，本领域技术人员能够确定其他生物体，细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等同基因。这种常规工作有利地使用共有序列来进行，所述共有序列可以通过与来源于其他微生物的基因进行序列比对，并设计简并探针以克隆另一生物体中的相应基因来确定。分子生物学的这些常规方法是本领域技术人员已知的。

本文使用的术语“改进的甲硫氨酸生产”，“改进甲硫氨酸生产”及其语法等同物是指增加的甲硫氨酸/碳源得率(每克/摩尔消耗的碳源产生的克/摩尔甲硫氨酸的比，其可以百分比表示)。用于确定消耗的碳源和产生的甲硫氨酸的量的方法是本领域技术人员已知的。与对应的未修饰的微生物相比，重组微生物的得率更高。

术语“针对甲硫氨酸的发酵生产优化的微生物”是指与对应的野生型微生物的内源产生相比，经进化和/或遗传修饰呈现出改进的甲硫氨酸生产的微生物。此类针对甲硫氨酸生产“优化的”微生物是本领域已知的，并具体描述于专利申请WO 2005/111202、WO2007/077041、WO 2009/043803WO2010/020681、WO2011/073738、WO2011/080542、WO2011/080301、WO2012/055798、WO2013/001055、WO2013/190343、WO2015/028675和WO2015/028674中。

根据本发明，术语“发酵生产”，“培养”或“发酵”用于表示细菌的生长。这种生长通常在具有适合于使用微生物且含有至少一种简单的碳源(及共同底物，如果需要的话)的适当培养基的发酵罐中进行。

“适当培养基”是指包含营养素的培养基(例如无菌的液体培养基)，所述营养素对于细胞的维持和/或生长是必要的或有益的，如碳源或碳底物，氮源，例如蛋白胨，酵母提取物，肉提取物，麦芽提取物，尿素，硫酸铵，氯化铵，硝酸铵和磷酸铵；磷源，例如磷酸二氢钾或磷酸氢二钾；微量元素(例如金属盐)，例如镁盐，钴盐和/或锰盐；以及生长因子如氨基酸和维生素。

根据本发明的术语“碳源”或“碳底物”或“碳源(source of carbon)”表示本领域技术人员可用于支持微生物的正常生长的任何碳源，包括单糖，(如葡萄糖，半乳糖，木糖，果糖或乳糖)，寡糖，二糖(如蔗糖，纤维二糖或麦芽糖)，糖蜜，淀粉或其衍生物，半纤维素及其组合。特别优选的简单碳源是葡萄糖。另一个优选的简单碳源是蔗糖。碳源可以来源于可再生原料。可再生原料定义为某些工业过程所需的原材料，其可以在短的延迟内以足量重新生成以允许其转化成所需的产物。植物生物质(处理的或未处理的)是一种有趣的可再生碳源。

根据本发明的术语“硫源”是指硫酸盐，硫代硫酸盐，硫化氢，连二硫酸盐，连二亚硫酸盐，亚硫酸盐，甲硫醇，二甲基硫醚(dimethylsulfide)和其它甲基封端的硫化物或不同来源的组合。更优选地，培养基中的硫源是硫酸盐或硫代硫酸盐或其混合物。

术语“氮源”对应于铵盐或氨气。氮源以铵或氨的形式供应。

术语“减弱”或“表达减弱”在本上下文中意指与非修饰的微生物相比，基因的表达和/或酶的产生是降低或抑制的，导致核糖核酸、蛋白质或酶的细胞内浓度与非修饰的微生物相比降低。本领域技术人员知道测量细胞中核糖核酸浓度或蛋白浓度的不同手段和方法，包括例如使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)来确定核糖核酸浓度和使用特异性抗体来确定特定蛋白的浓度。

通过减弱编码酶的基因的表达来获得所述酶的产生的减少或抑制。

基因的减弱可以通过本领域技术人员已知的手段和方法来实现。通常，基因表达的减弱可以通过以下方式实现：

-突变编码区或启动子区，或

-缺失基因表达必需的全部或部分的启动子区，或

-通过同源重组缺失基因的全部或部分的编码区，或

-插入外部元件至编码区中或启动子区中，或

-在弱启动子或诱导型启动子控制下表达基因。

本领域技术人员知晓表现出不同强度的多种启动子，以及用于弱或诱导型基因表达的启动子。

术语酶的“活性”可与术语“功能”互换使用，并且在本发明的上下文中表示由酶催化的反应。本领域技术人员知晓如何测量所述酶的酶活性。

术语酶的“活性减弱”或“活性降低”意指通过氨基酸序列的突变获得的蛋白特异性催化活性降低和/或通过核苷酸序列突变或通过基因的编码区的缺失获得的细胞中的蛋白浓度降低。

术语酶的“活性增强”或“活性增加”表示增加的酶的特异性催化活性增加，和/或细胞中酶的量/利用度增加，其例如通过过表达编码该酶的基因而获得的。

术语“表达增加”，“表达增强”或“过表达”及其语法等同物在文中可互换使用并具有相似含义。这些术语意味着与非修饰微生物相比，基因的表达或酶的产生增加，导致与非修饰的微生物相比，核糖核酸，蛋白或酶的细胞内浓度增加。本领域技术人员知晓测量细胞中核糖核酸浓度或蛋白浓度的不同手段和方法，包括例如使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)来确定核糖核酸浓度和使用特异性抗体来确定特定蛋白的浓度。

通过增加编码所述酶的基因的表达来获得酶的生产的增加。

为了增加基因的表达，本领域技术人员知晓不同的技术，如：

-增加微生物中该基因的拷贝数。该基因是染色体或染色体外编码的。当基因位于染色体上时，可以通过本领域专家所知的重组方法(包括基因替换)在染色体上引入数个拷贝的基因。当基因位于染色体外时，其可以由不同类型的质粒携带，所述质粒的复制起点不同，因此在细胞中的拷贝数不同。这些质粒在微生物中存在1至5个拷贝，或约20个拷贝，或多至500个拷贝，取决于质粒的性质：具有紧密复制的低拷贝数质粒(pSC101，RK2)，低拷贝数质粒(pACYC,pRSF1010)或高拷贝数质粒(pSK bluescript II)。

-使用引起基因高水平表达的启动子。本领域技术人员知道哪些启动子是最方便的，例如启动子Ptrc、Ptac、Plac或λ启动子P_R和P_L被广泛使用。这些启动子可由特定化合物“诱导”或由特定的外部条件如温度或光“诱导”。这些启动子可以是同源的或异源的。

-减弱基因特异性或非特异性的转录抑制子的活性或表达。

-使用稳定对应信使RNA的元件(Carrier和Keasling,1999)或稳定蛋白质的元件(例如GST标签，GE Healthcare)。

术语“编码”或“编码”是指这样的过程，通过所述过程多核苷酸通过转录和翻译机制产生氨基酸序列。编码酶的基因可以是外源的或内源的。

术语“反馈敏感性”或“反馈抑制”是指一种细胞机制控制，其中当细胞中某种具体物质积累到一定水平时，催化该具体物质的生成的一种或几种酶受到抑制或活性较低。因此，术语“反馈敏感性降低”或“反馈抑制降低”意指与非修饰微生物相比，这种机制的活性是降低或抑制的。本领域技术人员知晓如何修饰酶以获得该结果。此类修饰已描述于专利申请WO 2005/111202中或专利US 7,611,873中。

在本发明的第一方面，通过增强所述微生物中的甲硫氨酸排出，来优化重组微生物用于甲硫氨酸和/或其衍生物的发酵生产。优选地，重组微生物选自肠杆菌科或棒状杆菌科。更优选地，重组微生物选自大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。更优选地，本发明的微生物是大肠杆菌的重组菌株。

如上所述，在氨基酸生产微生物中，甲硫氨酸被特异性的排出转运蛋白排出。值得注意的是，在大肠杆菌中，该转运蛋白称为YgaZH，由ygaZ和ygaH基因编码，而在谷氨酸棒状杆菌中，其命名为BrnFE，由brnF和brnE基因编码。这种甲硫氨酸排出系统的功能同源物已经在几种其他微生物中得以鉴定。或者，本发明的重组微生物可以过表达YgaZH或BrnFE系统的功能同源物。YgaZ和YgaH同源蛋白分别列于表1和表2中。

表1:YgaZ同源蛋白

表2:YgaH同源蛋白

对于每个同源物的表中公开的登录号，本领域技术人员能够获得例如NCBI数据库上的氨基酸序列及其核酸编码序列。

从氨基酸序列或核苷酸序列获得编码这些同源物的基因，对于本领域技术人员而言是常规任务。这可以通过从其氨基酸序列人工合成编码目标蛋白的基因或是通过对相应的基因组DNA目的编码区的PCR扩增来完成。在本发明的上下文中，这些基因被称为“ygaZ或ygaH同源基因”。这些ygaZH同源基因的序列可以根据宿主微生物的密码子偏好调整。

根据本发明，重组微生物过表达来自大肠杆菌的ygaZ和ygaH基因的同源基因，其编码序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中所示的蛋白；条件是该过表达既不与来自大肠杆菌的metH和任选的fldA和fpr或来自谷氨酸棒状杆菌的同源基因的过表达组合，也不与选自metN、metI或metQ的至少一个基因的表达减弱组合。优选地，ygaZ和ygaH同源基因由源自相同生物体的一对基因组成，且由ygaZ的同源基因和ygaH的同源基因组成。然而，可以使用来自第一生物体的ygaZ同源基因和来自第二生物体的ygaH同源基因的不匹配对。

ygaZH同源基因选自编码分别如表1和表2中所示的YgaZ和YgaH同源物的基因。优选地，ygaZH同源基因选自编码来自柠檬酸杆菌属菌种、志贺氏菌属菌种、柔武氏菌属菌种、肠杆菌属菌种、耶尔森氏菌属菌种和光杆状菌属菌种的YgaZH同源物的基因。更优选地，ygaZH同源基因源自克氏柠檬酸杆菌、弗氏志贺氏菌、解鸟氨酸柔武氏菌、肠杆菌属菌种、小肠结肠炎耶尔森氏菌、发光光杆状菌、杨氏柠檬酸杆菌或弗氏柠檬酸杆菌。最优选地，ygaZH同源基因源自克氏柠檬酸杆菌、杨氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌或肠杆菌属菌种。

因此，ygaZH同源基因选自编码YgaZH同源物对的基因，所述YgaZH同源物对分别由如下所定义：来自克氏柠檬酸杆菌的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、来自弗氏志贺氏菌的SEQID NO:5和SEQ ID NO:6、来自解鸟氨酸柔武氏菌SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、来自肠杆菌属菌种(R4-368)的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、来自小肠结肠炎耶尔森氏菌小肠结肠炎亚种的SEQ ID NO:11或12和SEQ ID NO:13或14、来自发光光杆状菌洛氏亚种的SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16、来自杨氏柠檬酸杆菌的SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、来自弗氏柠檬酸杆菌的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。

在本发明的一个优选实施方案中，这些基因或总体而言ygaZH同源基因是在诱导型启动子的控制下过表达的。本领域技术人员知晓此类诱导型启动子。例如，诸如λP_R或λP_L的启动子可用于过表达ygaZH同源基因，尤其是源自本发明的重组微生物中的克氏柠檬酸杆菌、弗氏志贺氏菌、解鸟氨酸柔武氏菌、肠杆菌属菌种、小肠结肠炎耶尔森氏菌、发光光杆状菌、杨氏柠檬酸杆菌或弗氏柠檬酸杆菌的ygaZH同源基因

任选地，本发明的重组微生物中的内源性ygaZH或brnFE基因是缺失的。

本发明的优选实施方案是在氨基酸生产微生物中过表达ygaZH同源基因，其单独或与下文所公开的其他遗传修饰组合，尤其是分别公开于表1和表2中的过表达编码YgaZ和YgaH同源物的ygaZH同源基因，其单独或与下文所公开的其它遗传修饰组合。

甲硫氨酸生物合成途径的优化

本发明的重组微生物经修饰用于改进甲硫氨酸的生产。甲硫氨酸生产中涉及的基因是本领域所已知的，且包含甲硫氨酸特异性生物合成途径中涉及的基因以及前体提供途径中涉及的基因和甲硫氨酸消耗途径中涉及的基因。

甲硫氨酸的有效生产需要优化甲硫氨酸特异性途径和数个前体提供途径。已描述了甲硫氨酸生产菌株，具体描述于专利申请WO 2005/111202、WO 2007/077041和WO 2009/043803中。这些申请通过提述并入本申请。

除另有说明外，下文提及的涉及甲硫氨酸生物合成途径的优化的所有基因是指来自大肠杆菌的那些。

在本发明的一个具体实施方案中，所述重组微生物按如下所述修饰：至少一个选自如下的基因的表达是增加的：ptsG,pyc,pntAB,cysP,cysU,cysW,cysA,cysM,cysJ,cysI,cysH,gcvT,gcvH,gcvP,lpd,serA,serB,serC,cysE,metF,metA,metA*等位基因(其编码具有降低的针对S-腺苷甲硫胺酸和/或甲硫氨酸的反馈敏感性的酶)、thrA、和thrA*等位基因(其编码具有降低的针对苏氨酸的反馈抑制的酶)。

·ptsG编码PTS酶IICB^Glc，如专利申请WO 2013/001055中所述。

·pyc编码丙酮酸羧化酶，如专利申请WO2013/001055中所述。在一个优选实施方案中，所述pyc基因是异源性的且选自来自豆根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)或棒状杆菌属菌种的pyc基因，

·pntAB编码膜结合的转氢酶的亚基，如专利申请WO 2012/055798中所述，

·cysP编码周质硫酸盐结合蛋白，如WO 2007/077041和WO 2009/043803中所述，

·cysU编码硫酸盐ABC转运蛋白的组分，如WO 2007/077041和WO 2009/043803中所述，

·cysW编码膜结合硫酸盐转运蛋白，如WO 2007/077041和WO 2009/043803中所述，

·cysA编码硫酸盐通透酶，如WO 2007/077041和WO 2009/043803中所述，

·cysM编码O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(sulfhydralase)，如WO 2007/077041和WO2009/043803中所述，

·cysI和cysJ各编码亚硫酸盐还原酶的α和β亚基，如WO 2007/077041和WO 2009/043803中所述。优选地，cysI和cysJ一起过表达，

·cysH编码腺苷酰硫酸还原酶，如WO2007/077041和WO 2009/043803中所述。

增加C1代谢也是引起甲硫氨酸生产改进的一种修饰。它涉及选自GcvTHP，Lpd或MetF的C1代谢中涉及的至少一种酶的活性的增加。在本发明的一个优选实施方案中，通过增强如下至少一项的表达和/或活性来增加一碳代谢：

·gcvT、gcvH、gcvP和lpd，其编码甘氨酸切割复合体，如专利申请WO2007/077041中所述。所述甘氨酸切割复合体(GCV)是多酶复合体，其催化甘氨酸的氧化，产生二氧化碳、氨、亚甲基-THF和还原的吡啶核苷酸。GCV复合体由4个蛋白组分组成，甘氨酸脱氢酶称为P蛋白(GcvP)，硫辛酰基(lipoyl)-GcvH-蛋白称为H蛋白(GcvH)，氨甲基转移酶称为T蛋白(GcvT)，且二氢硫辛酰胺脱氢酶称为L蛋白(GcvL或Lpd)。P蛋白催化CO₂自甘氨酸的吡哆醛磷酸盐依赖性释放，留下甲胺模块。所述甲胺模块被转移至H蛋白的硫辛酸基团，其在甘氨酸脱羧反应之前结合至P蛋白。T蛋白催化NH₃自甲胺基团的释放和转移剩余的C1基团至THF，形成亚甲基-THF。L蛋白随后氧化H蛋白的硫辛酸组分并将电子转移至NAD⁺，形成NADH；

·metF，其编码亚甲基四氢叶酸还原酶，如专利申请WO 2007/077041中所述；

涉及丝氨酸生物合成的至少一个如下基因的过表达还减少副产物异亮氨酸的产生：

·serA，其编码磷酸甘油酸脱氢酶，如WO 2007/077041和WO 2009/043803中所述，

·serB，其编码磷酸丝氨酸磷酸酶，如WO 2007/077041和WO 2009/043803中所述，

·serC，其编码磷酸丝氨酸氨基转移酶，如WO 2007/077041和WO 2009/043803中所述。

已显示如下基因的过表达改进甲硫氨酸生产：

·cysE编码丝氨酸氨基转移酶；其过表达允许甲硫氨酸生产的增加，如WO 2007/077041中所述；

·metA编码高丝氨酸琥珀酰转移酶。等位基因metA*编码具有降低的针对S-腺苷甲硫胺酸和/或甲硫氨酸的反馈敏感性的酶。优选地，使用描述于专利申请WO 2005/111202中的等位基因metA*；

·thrA编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶；thrA*等位基因编码具有降低的针对苏氨酸的反馈抑制的酶，如WO 2005/111202中所述。

在本发明的一个具体实施方案中，基因可以受诱导型启动子的控制。在本发明的一个优选实施方案中，这些基因的至少一个受温度诱导型启动子的控制。优选地，如下基因的至少一个的表达直接或间接地受诱导型启动子的控制：thrA、cysE、metA。更优选地，基因thrA、cysE和metA在诱导型启动子的直接或间接控制下。在本发明的一个优选实施方案中，thrA基因的表达受诱导型启动子的直接控制，而cysE基因的表达受thrA基因的诱导型表达的极性效应(polar effect)。在本发明的另一个优选实施方案中，thrA基因的表达受诱导型启动子的直接控制，而cysE和metA基因的表达受thrA基因的诱导型表达的极性效应。

在最优选的实施方案中，温度诱导型启动子属于P_R启动子家族。在专利申请WO2011/073122中描述了具有受诱导型启动子控制的基因的产甲硫氨酸菌株。

在本发明的另一个具体实施方案中，进一步修饰微生物，并且如下基因的至少一个的表达是减弱的：metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、yncA、metE、dgsA或udhA。

·metJ基因编码阻遏蛋白MetJ(GenBank 1790373)，其负责甲硫氨酸调节子的下调，如专利申请JP 2000/157267中所提示的，

·pykA和pykF基因编码酶‘丙酮酸激酶’。所述丙酮酸激酶的一者或二者的表达的减弱降低磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的消耗。PEP的增加的利用度能增加草酰乙酸的生产，草酰乙酸是天冬氨酸的重要前体，其又是甲硫氨酸的前体，如WO 2007/077041和WO 2009/043803中所述，

·purU编码甲酰四氢叶酸脱甲酰酶，其是一种催化甲酰-THF脱甲酰反应的酶。脱甲酰酶活性的减弱增加甲酰-THF的生产，这是高半胱氨酸的甲基化所需的。通过脱甲酰反应的C1代谢物的损失导致增加的高半胱氨酸的生产，所述高半胱氨酸不能转化为甲硫氨酸。高半胱氨酸随后可以作为酶胱硫醚γ合成酶(MetB)的底物，所述酶能催化O-琥珀酰高丝氨酸和高半胱氨酸之间的反应，导致高羊毛硫氨酸的产生，如WO 2007/077041和WO2009/043803中所述，

·ybdL编码氨基转移酶，如专利申请WO 2012/090021中所述，

·yncA编码N-酰基转移酶，如专利申请WO 2010/020681中所述，

·metE编码钴胺素独立性甲硫氨酸合酶，如专利申请WO 2013/190343中所述，

·dgsA，更常称为Mlc，编码转录双重调节因子，其控制编码磷酸转移酶(PTS)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)系统的酶的基因表达，如专利申请WO 2013/001055中所述，

·udhA编码可溶的吡啶核苷酸转氢酶，如专利申请WO 2012/055798中所述。

在本发明更优选的实施方案中，通过重组微生物从作为主要碳源的葡萄糖发酵生产甲硫氨酸和/或其衍生物(甲硫氨酸排出是增强的)，可以通过所述微生物中的上述修饰的组合来实现，例如：

·基因metJ的表达减弱，且metA*等位基因(其编码具有降低的针对S-腺苷甲硫胺酸和/或甲硫氨酸的反馈敏感性的酶(MetA*))的表达增强；

·基因metJ的表达减弱；metA*等位基因(其编码具有降低的针对S-腺苷甲硫胺酸和/或甲硫氨酸的反馈敏感性的酶(MetA*))的表达增强；且thrA*等位基因(其编码具有降低的针对苏氨酸的反馈抑制的酶(thrA*))的表达增强；

·基因metJ的表达减弱；metA*等位基因(其编码具有降低的针对S-腺苷甲硫胺酸和/或甲硫氨酸的反馈敏感性的酶(MetA*))的表达增强；thrA*等位基因(其编码具有降低的针对苏氨酸的反馈抑制的酶(thrA*))的表达增强；且基因cysE的表达增强；

·基因metJ的表达减弱；metA*等位基因(其编码具有降低的针对S-腺苷甲硫胺酸和/或甲硫氨酸的反馈敏感性的酶(MetA*))的表达增强；thrA*等位基因(其编码具有降低的针对苏氨酸的反馈抑制的酶(thrA*))的表达增强；基因cysE的表达增强；且基因metF的表达增强。

在本发明的一个具体方面，重组微生物包含如下遗传修饰：

·过表达ygaZH同源基因，其源自克氏柠檬酸杆菌、弗氏志贺氏菌、解鸟氨酸柔武氏菌、肠杆菌属菌种、小肠结肠炎耶尔森氏菌、发光光杆状菌、杨氏柠檬酸杆菌或弗氏柠檬酸杆菌；条件是该过表达既不与来自大肠杆菌的metH和任选的fldA和fpr或来自谷氨酸棒状杆菌的同源基因的过表达组合，也不与选自metN、metI或metQ的至少一个基因的表达减弱组合，

·基因metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*、ptsG和pyc的表达增强，和

·基因metJ、pykA、pykF、purU、metE、dgsA和yncA的表达减弱。

在本发明的另一个具体方面，重组微生物包含如下遗传修饰：

·过表达ygaZH同源基因，其源自克氏柠檬酸杆菌、弗氏志贺氏菌、解鸟氨酸柔武氏菌、肠杆菌属菌种、小肠结肠炎耶尔森氏菌、发光光杆状菌、杨氏柠檬酸杆菌或弗氏柠檬酸杆菌；

·基因metJ、pykA、pykF、purU、metE、dgsA和yncA的表达减弱。

·基因metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE和thrA*的表达增强，和

·基因metJ、pykA、pykF和purU的表达减弱。

·基因metJ、pykA、pykF、metE、yncA和purU的表达减弱。

·基因metJ、pykA、pyk、metE、yncA和purU的表达减弱。

·基因metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*和pyc的表达增强，和

·基因metJ、pykA、pykF、metE、yncA和purU的表达减弱。

·基因metJ、pykA、pyk、metE、yncA和purU的表达减弱。

最优选地，ygaZH同源基因源自克氏柠檬酸杆菌、杨氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌或肠杆菌属菌种。

在本发明的一个具体实施方案中，重组微生物来自细菌科肠杆菌科或棒状杆菌科。

优选地，重组微生物是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。最优选地，本发明的重组微生物是大肠杆菌。

培养条件

在本发明的第二方面，优化了用于甲硫氨酸和/或其衍生物的发酵生产的方法。其包括如下步骤：

-在包含可发酵的碳源和硫源的适当培养基中培养重组微生物，其中通过过表达ygaZH同源基因来增强甲硫氨酸排出，条件是该过表达既不与来自大肠杆菌的基因metH和任选的fldA和fpr或它们的来自谷氨酸棒状杆菌的同源基因的过表达组合，也不与metN、metI或metQ中至少一个基因的表达减弱组合，所述ygaZH同源物基因选自下组：柠檬酸杆菌属菌种、志贺氏菌属菌种、柔武氏菌属菌种、肠杆菌属菌种、耶尔森氏菌属菌种和光杆状菌属菌种，和

-从所述培养基回收甲硫氨酸和/或其衍生物。

在一个具体实施方案中，本发明的方法是针对甲硫氨酸和/或其衍生物的发酵生产优化的方法，包括如下步骤：

-在包含可发酵的碳源和硫源的适当培养基中培养重组微生物，其中通过过表达来自大肠杆菌的ygaZH基因的ygaZH同源基因来增强甲硫氨酸排出，所述ygaZH同源物基因选自下组：柠檬酸杆菌属菌种、志贺氏菌属菌种、柔武氏菌属菌种、肠杆菌属菌种、耶尔森氏菌属菌种和光杆状菌属菌种，和

-从所述培养基回收甲硫氨酸和/或其衍生物。

本领域技术人员能够定义根据本发明的微生物培养条件。具体而言，细菌在20℃至55℃，优选为25℃至40℃的温度发酵，更具体地对于谷氨酸棒状杆菌约为30℃，对于大肠杆菌为约37℃。

对于大肠杆菌，培养基可以与M9培养基(Anderson,1946)、M63培养基(Miller,1992)，或如Schaefer等,(1999)定义的培养基的组成相同或相似。

对于谷氨酸棒状杆菌，培养基可以与BMCG培养基(Liebl等,1989)或如Riedel等,(2001)描述的培养基的组成相同或相似。

根据本发明的一个具体方面，该方法用重组微生物来进行，所述重组微生物包含来自大肠杆菌的ygaZH基因的ygaZH同源基因，特别是编码表1和表2中的YgaZH蛋白的那些的过表达。

在本发明的方法中，重组微生物中过表达的ygaZH同源基因优选选自下组：来自柠檬酸杆菌属菌种、志贺氏菌属菌种、柔武氏菌属菌种、肠杆菌属菌种、耶尔森氏菌属菌种和光杆状菌属菌种的同源基因，并且更优选地源自克氏柠檬酸杆菌、弗氏志贺氏菌、解鸟氨酸柔武氏菌、肠杆菌属菌种、小肠结肠炎耶尔森氏菌、发光光杆状菌、杨氏柠檬酸杆菌或弗氏柠檬酸杆菌的同源基因。

根据本发明的方法的另一具体方面，所述方法中待培养的重组微生物中过表达的ygaZH同源基因选自下组：来自克氏柠檬酸杆菌、杨氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌或肠杆菌属菌种的同源基因。

在本发明的一些实施方案中，重组微生物在培养基中的生长受到一种或多种无机底物的限制或饥饿，特别是磷酸盐和/或钾。其指的是其中微生物的生长受到仍允许弱生长的供给的无机化学物质的量控制的条件。微生物生长中的这种限制已描述于专利申请WO2009/043372中。在本发明的一个优选实施方案中，培养受到磷酸盐限制。

在本发明方法的一个具体实施方案中，重组微生物来自细菌的肠杆菌科或棒状杆菌科。优选地，重组微生物是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌，更优选地本发明的重组微生物是大肠杆菌。

“从培养基回收甲硫氨酸和/或其衍生物”的行为表示回收L-甲硫氨酸和/或其衍生物之一的行为，特别是N-乙酰甲硫氨酸(NAM)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和所有其它可能有用的衍生物，如羟基甲硫氨酸(或甲硫氨酸羟基类似物或MHA)。“从培养基回收甲硫氨酸”的行为是指从发酵培养基回收甲硫氨酸的行为，而无论其纯度为何。“回收”是指回收从发酵过程(必须发酵)直接获得的第一产品，其含有目的产品(在此情况下是甲硫氨酸)和发酵的其他副产物，因此具有或多或少可接受的纯度。

“纯化”步骤由特异性纯化目的产物(在这种情况下是甲硫氨酸)以获得具有改进的纯度的所述目的产品组成。

可以通过本领域技术人员已知的技术和手段来回收和纯化甲硫氨酸，如蒸馏、离子交换色谱法、沉淀、结晶或与盐络合，特别是与钙盐或铵盐络合。用于回收和纯化所生产的化合物的这些方法具体公开于WO 2005/007862和WO 2005/059155中。优选地，回收甲硫氨酸和/或其衍生物的步骤包括在发酵液中浓缩甲硫氨酸和/或其衍生物的步骤。

可使用本领域已知的多种方法，例如高效液相色谱(HPLC)或气相色谱(GC)来确定发酵培养基中产物的量。例如，使用L-甲硫氨酸(Fluka,Ref 64319)作为标准物的OPA/Fmoc衍生化后通过HPLC测量培养基中获得的甲硫氨酸的量。使用以NAM(Sigma,Ref 01310)作为标准物的折光HPLC确定NAM的量。

实施例

以下实验证明了编码来自不同大肠杆菌重组L-甲硫氨酸生产菌株作为背景的各种微生物的L-甲硫氨酸排出系统的基因的过表达的益处。

在下文给出的实施例中，用本领域已知的方法来构建含有复制载体和/或各种染色体插入、缺失和取代的大肠杆菌菌株，其采用Datsenko&Wanner,(2000)详述的同源重组来进行。

以同样的方式，使用质粒或载体在重组微生物中表达或过表达一种或多种基因是本领域技术人员所已知的。

合适的大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc、pACYC184n pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236等……

实验方案

使用了一些实验方案来构建下文实施例中所述的产甲硫氨酸菌株。

本发明中使用的实验方案1(通过同源重组的染色体修饰，重组子的选择和抗生素盒切除)和实验方案2(噬菌体P1的转导)已在专利申请WO2013/001055中充分描述。

实验方案3：重组质粒的构建

重组DNA技术是本领域技术人员所已知且充分描述的。

简言之，使用寡核苷酸(本领域技术人员能够设计)和MG1655基因组DNA作为基质将DNA片段进行PCR扩增。将DNA片段和选择的质粒用相容的限制性内切酶消化，连接，然后在感受态细胞中转化。分析转化体，通过DNA测序验证目的重组质粒。

表3：下文实施例中引述的序列

实施例1：大肠杆菌L-甲硫氨酸过量生产重组菌株中的内源性L-甲硫氨酸分泌系统的过量生产–菌株1的描述及菌株2至7的构建

菌株1–参考菌株

描述于专利申请WO2013/001055(其通过提述并入本申请)的甲硫氨酸生产菌株17在本申请中被重命名为菌株1。为了提醒，这种菌株过表达metH，这是由于在其内源性基因座上整合在metH基因前面的人造启动子和核糖体结合位点(详见专利申请WO2007/077041)。该菌株还含有专利申请WO2013/190343中公开的metE基因中的突变。

菌株6的构建

编码钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶的基因metH，以及编码MetH的再活化系统的基因fldA和fpr，均在菌株1的遗传背景中过表达。

在使用菌株1之前，使用如Datsenko&Wanner,2000(根据实验方案1)所述的Flp重组酶从ΔdgsA修饰除去抗生素盒。选择卡那霉素敏感性转化体，并通过使用适当寡核苷酸的PCR分析证实ΔdgsA基因座处不存在抗生素盒。将保留的菌株命名为菌株2。

为了实现metH的过表达，使用Datsenko&Wanner,2000(根据实验方案1)所述的同源重组策略。与专利申请WO2007/077041中所述相同的启动子和核糖体结合位点可操作地连接的基因metH整合在染色体上的两个不同的基因座ybeM和ypjC处(选自专利申请WO2011/073122中公开的列表中，且其缺失不影响甲硫氨酸生产)。

为了两个染色体整合，将携带连接至其人工启动子的metH基因和两侧均有与靶向整合基因座ybeM或ypjC同源的DNA序列的抗性标记的片段通过重叠PCR技术(重叠寡核苷酸)进行PCR扩增。用于重组进入ybeM和ypjC的序列对于ybeM和ypjC分别称为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，以及SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24(列于表3中)。然后将得到的PCR产物“ΔybeM::metH::Km”和“ΔypjC::metH::Cm”分别通过电穿孔引入菌株MG1655metA*11(pKD46)中。选择抗生素抗性转化体，并用适当的寡核苷酸通过PCR分析验证metH基因与抗性盒在靶向基因座的处插入。保留的菌株称为MG1655metA*11ΔybeM::metH::Km和MG1655metA*11ΔypjC::metH::Cm。最后，通过P1噬菌体转导依次(根据方案2)将ΔybeM::metH::Km和ΔypjC::metH::Cm染色体整合物从MG1655metA*11ΔybeM::metH::Km和MG1655metA*11ΔypjC::metH转移至菌株2。选择氯霉素或卡那霉素抗性转导体，并用适当寡核苷酸通过PCR分析验证ΔybeM::metH::Km和ΔypjC::metH::Cm染色体整合物的存在。保留的菌株命名为菌株3。

使用如Datsenko&Wanner,2000(根据实验方案1)所述的Flp重组酶将抗生素盒从菌株3中于ybeM和ypjC基因座处形成的染色体整合物中除去。选择卡那霉素和氯霉素敏感性转化体，并用适当的寡核苷酸通过PCR分析来验证在两个位点处不存在抗生素盒。保留的菌株命名为菌株4。

为了过表达fldA和fpr，这些基因与人工启动子和人工核糖体结合位点可操作地连接，并在ytfA基因座处整合到染色体上(选择标准与ybeM和ypjC基因座相同，参见上文)。用于fldA的人工启动子用SEQ ID NO:25构建。对于fpr，针对专利申请WO2009/043803中的cysPUWAM操纵子的过表达描述了菌株中使用的人工启动子。对于两个基因，人工核糖体结合位点与专利申请WO2013/001055中公开的菌株17中过表达ptsG基因所述的是相同的。

为了将fldA和fpr过表达的拷贝引入至染色体上，使用Datsenko&Wanner,2000(根据实验方案1)描述的同源重组策略。将携带具有其各自启动子的fldA和fpr基因和两侧均有与整合基因座ytfA同源的DNA序列的抗性标记的片段通过重叠PCR技术(重叠寡核苷酸)进行PCR扩增。重组到ytfA基因座中的序列称为SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27(列于表3)。然后将获得的PCR产物“ΔytfA::fldA-fpr::Km”通过电穿孔引入MG1655metA*11(pKD46)菌株中。然后选择抗生素抗性转化体，并用适当的寡核苷酸通过PCR分析检查带有抗性盒的fldA-fpr基因在ytfA基因座处的插入。保留的菌株称为MG1655metA*11ΔytfA::fldA-fpr::Km。最后，通过P1噬菌体转导(根据方案2)将ΔytfA::fldA-fpr::Km染色体整合物从MG1655metA*11ΔytfA::fldA-fpr::Km转移到菌株4。选择卡那霉素抗性转导体，并用适当的寡核苷酸通过PCR分析验证了ΔytfA::fldA-fpr::Km染色体整合物的存在。保留的菌株称为菌株5。

然后使用如Datsenko&Wanner,2000(根据方案1)所述的Flp重组酶，从菌株5中于ytfA基因座处形成的染色体整合物中除去抗生素盒。选择卡那霉素敏感性转化体，用适当的寡核苷酸通过PCR分析验证ytfA基因座处没有抗生素盒。保留的菌株被命名为菌株6，并且会对应于下文实施例的遗传背景A.

菌株7的构建–内源性ygaZH基因的过表达

使用ygaZ的天然启动子将来自大肠杆菌的ygaZH基因(其编码甲硫氨酸排出蛋白)克隆于中等拷贝数质粒pCL1920(Lerner和Inouye,1990)上。该质粒命名为pME1247。最后，将质粒pME1247转化至菌株6中，产生菌株7。

实施例2：来自各种微生物的不同L-甲硫氨酸分泌系统在过度生产钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶(MetH)的大肠杆菌L-甲硫氨酸生产菌株中的过度生产–菌株8至15的构建

来自柠檬酸杆菌属菌种、柔武氏菌属菌种、克雷伯氏菌属菌种、肠杆菌属菌种、耶尔森氏菌属菌种和光杆状菌属菌种的ygaZH同源基因在遗传背景A中过表达，以与携带ygaZH大肠杆菌基因的菌株7相比较。

菌株8至15的构建–来自表4中列出的属和种的ygaZH同源基因的过表达

为了在L-甲硫氨酸生产菌株中过表达编码表4中列出的蛋白的ygaZH同源基因，如上文已经针对大肠杆菌的ygaZH基因已经描述的那样将各对基因克隆了于中等拷贝数质粒pCL1920(Lerner&Inouye,1990)上，其使用大肠杆菌ygaZ基因的天然启动子和核糖体结合位点。如表5所示，ygaZH同源基因或扩增自相应菌株的基因组DNA或化学合成，具有或不具有针对大肠杆菌的密码子使用的优化(如采用

软件-Lifetechnologies的

基因合成服务所提出的)。包含ygaZH同源基因的扩增的DNA片段公开在表5中所示的SEQ ID中。所得质粒如表5中所提及的命名。最后将每个质粒转化到菌株6中，产生菌株8至15，如表5中所提及的。

表4：YgaZH同源蛋白

表5：携带ygaZH同源基因的质粒和菌株

实施例3：来自多种微生物的不同L-甲硫氨酸分泌系统在数种L-甲硫氨酸过度生产菌株中的过表达–菌株16和17，及菌株18至53的构建

在专利中先前描述的不同背景中评估了同源ygaZH基因的过表达对L-甲硫氨酸生产的有益效果。它们如下：

-遗传背景B：MG1655metA*11ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPΔpykAΔpykFΔpurU::Km(pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)(pCC1BAC-serB-serA-serC)在本申请中称为菌株17。

其没有pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11载体的母本在本申请中称为菌株16，且MG1655metA*11ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPΔpykAΔpykFΔpurU::Km(pME101-thrA*1-cysE)(pCC1BAC-serB-serA-serC)描述于专利申请WO 2009/043803中。为了获得菌株17，更准确为质粒pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11，将metA*11基因连同gapA基因的启动子(Thouvenot,等2004)于cysE基因的下游克隆至pME101-thrA*1-cysE质粒中，方法学与专利申请WO 2011/073122中描述的用于构建质粒pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11的情况相似。然后将pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11载体引入菌株16，产生菌株17。

-遗传背景C：专利申请WO2012/055798中所述的菌株10

-遗传背景D：专利申请WO2012/090021中所述的菌株3

-遗传背景E：专利申请WO2013/001055中所述的菌株17，并在本申请中命名为菌株1。

用作过表达的ygaZH同源基因的接受者的一些L-甲硫氨酸过量生产菌株已经携带pCL1920型质粒(之前的(ex)背景B和D)。因此，克隆与大肠杆菌的PygaZ启动子连接的内源或异源ygaZH操纵子的策略根据接受者遗传背景进行适应。准确地说，(i)对于遗传背景C和E，将内源或异源ygaZH操纵子克隆到空的pCL1920质粒中，(ii)对于遗传背景B，将内源或异源ygaZH操纵子克隆到pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11质粒中，和(iii)对于遗传背景D，将内源或异源ygaZH操纵子克隆到pCL1920-PgapA-pycRe-TT07质粒中。所得质粒命名如表6中所提及的。

如表6所见，对于携带来自相同物种的ygaZH操纵子的质粒，质粒的数字引述是相同的，命名的唯一变化是根据用于克隆ygaZH操纵子的pCL1920的类型的字母后缀(b或c)。

对于在此实施例中测试的不同的L-甲硫氨酸过量生产大肠杆菌菌株，ygaZH同源基因或者扩增自相应菌株的基因组DNA或是化学合成的，其具有或不具有针对大肠杆菌的密码子使用的优化(如采用

软件-Lifetechnologies的

基因合成服务所提出的)，如针对菌株6遗传背景所述，并详明于表5中。

表6：携带ygaZH内源或同源基因的质粒

最终通过将表6列出的不同质粒引入如下背景而获得菌株18至53：

-对于遗传背景B：将pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11-PygaZ-ygaZH质粒型引入菌株16，产生菌株18至26，

-对于遗传背景C：将pCL1920-PygaZ-ygaZH质粒型引入申请WO 2012/055798的菌株10，产生菌株27至35，

-对于遗传背景D：将pCL1920-PgapA-pycre-TT07-PygaZ-ygaZH质粒型引入申请WO2012/090021的菌株3，产生菌株36至44，及

-对于遗传背景E：将pCL1920-PygaZ-ygaZH质粒型引入菌株1，产生菌株45至53。

所得的菌株，其将用于L-甲硫氨酸生产的特定遗传背景与携带同源ygaZH基因的具体对的过表达的特定质粒组合，列于下表7中。

表7：所得的携带ygaZH内源或同源基因的菌株

实施例4：来自多种微生物的不同L-甲硫氨酸分泌系统在不含metH和fldA和fpr基因过表达的几种L-甲硫氨酸过量生产菌株中的过量生产–菌株54至73的构建

同源ygaZH基因过表达对L-甲硫氨酸生产的有益效果也独立于metH和fldA和fpr基因的过表达进行了评估。将metH的天然低水平表达恢复为背景B和E，并通过延伸恢复至菌株17至26，至菌株1和菌株45至53中。

为了恢复metH的天然表达水平，其天然启动子在metH基因前面被置换，因此使用实验方案1中描述的Datsenko和Wanner,2000描述的同源重组策略同时去除人工启动子。首先，将抗生素抗性基因于metH基因的下游添加至具有非修饰的处于其自身的启动子控制下的metH的野生型菌株中。更准确地说，产生了携带抗生素抗性基因(针对四环素的Tc)的PCR产物，所述抗生素抗性基因伴有FRT位点，由与metH基因的下游和yjbB基因的上游区域同源的序列(SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29)包围，并将所述PCR产物导入MG1655metA*11中，其中pKD46载体是先前已被转化的。用适当的寡核苷酸验证抗生素抗性转化体，保留的菌株为MG1655metA*11metH::Tc。最后，通过P1噬菌体转导(根据实验方案2)从MG1655metA*11metH::Tc将metH::Tc染色体修饰转移至菌株17至26并转移至菌株1中和菌株45至53中。选择四环素抗性转导体并用适当的寡核苷酸通过PCR分析验证了metH::Tc染色体整合的存在以及接受者菌株的染色体修饰完整性，其接近metH基因座。保留的菌株命名为菌株54至73，如下表8中所列。

表8：所得的携带内源或同源ygaZH基因且没有metH过表达的菌株

实施例5：L-甲硫氨酸的生产

在小锥形瓶中评价生产菌株。对于菌株17及其名为18至26和54至63的衍生菌株，培养条件描述于专利EP2573189A1中，对于WO 2012/055798申请的菌株10及其名为27至35的衍生菌株和对于WO2012/090021申请的菌株3及其名为36至44的衍生菌株，培养条件描述于各自专利中。

对于其他菌株(菌株1及其名为45至53和64至73的衍生菌株)，将5.5mL预培养物在混合培养基(10％LB培养基(Sigma 25％)与2.5g.L^-1葡萄糖和90％基本培养基PC1，表8)中于30℃生长21小时。将其用于将50mL培养物接种至培养基PC1中至OD₆₀₀为0.2。当需要时，加入浓度为50mg.L^-1的壮观霉素和卡那霉素、浓度为10mg.L^-1的庆大霉素和浓度为5mg.L^-1的四环素。当需要时，加入浓度为0.0048g.L^-1的IPTG。培养物的温度为37℃，搅拌速度为200RPM。当培养物达到5至7的OD₆₀₀时，在OPA/Fmoc衍生化后通过HPLC定量细胞外氨基酸，并且在甲硅烷基化(silylation)后使用带有折光检测(有机酸和葡萄糖)的HPLC和GC-MS分析其他相关代谢物。

表9：基本培养基(Minimal medium)组成(PC1)

化合物	浓度(g.L<sup>-1</sup>)
		ZnSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O	0.0040
CuCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O	0.0020
		MnSO<sub>4</sub>.H<sub>2</sub>O	0.0200
CoCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O	0.0080
		H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>	0.0010
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O	0.0004
		MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O	1.00
柠檬酸	6.00
		CaCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O	0.04
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	8.00
		Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	2.00
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	8.00
		NH<sub>4</sub>Cl	0.13
NaOH 4M	调整至pH 6.8
		FeSO<sub>4.</sub>7H<sub>2</sub>O	0.04
硫胺素	0.01
		葡萄糖	20.00
硫代硫酸铵	5.61
		维生素B12	0.01
MOPS	20.00

表10：甲硫氨酸得率(Y_met)以如下表示：产生的甲硫氨酸的克数/瓶培养物中的葡萄糖的％克数，其通过过表达内源或同源ygaZH基因且与metH的过表达组合的菌株进行。甲硫氨酸/葡萄糖得率的精确定义见下文。“n”表示重复的数目。

如上表10中所示，携带来自不同微生物的同源YgaZH对的测试菌株的L-甲硫氨酸生产性能等于或甚至高于其携带来自大肠杆菌的内源YgaZH的等同菌株(菌株8至15，与菌株7相比)。此外，无论何种用于过量生产同源L-甲硫氨酸分泌系统的遗传背景，例如菌株15、26、35、44和53，分别与菌株7、18、27、36和45相比，都获得了这些结果。来自克氏柠檬酸杆菌，肠杆菌属菌种，杨氏柠檬酸杆菌和弗氏柠檬酸杆菌的ygaZH基因都达到了L-甲硫氨酸生产的最佳结果，并在L-甲硫氨酸过量产生菌株中是过表达的。

甲硫氨酸得率表示如下：

表11：甲硫氨酸得率(Y_met)，以如下表示：产生的甲硫氨酸的克数/瓶培养物中的葡萄糖的％克数，其通过过表达内源或同源ygaZH基因且没有metH的过表达的菌株进行。甲硫氨酸/葡萄糖得率的精确定义见下文。“n”表示重复的数目。

如上表11中所示，携带来自不同微生物的同源YgaZH对的测试菌株的L-甲硫氨酸生产性能等于或甚至高于其携带来自大肠杆菌的内源YgaZH的等同菌株(参见例如菌株56至63，与菌株55相比)。此外，无论遗传背景如何，例如菌株63和73分别与菌株55和65相比较，更具体地没有metH的过表达，都获得了这些结果。用来自克氏柠檬酸杆菌，肠杆菌属菌种，杨氏柠檬酸杆菌和弗氏柠檬酸杆菌的ygaZH基因达到了L-甲硫氨酸生产的最佳结果，并在L-甲硫氨酸过量产生菌株中是过表达的。

总之，同源YgaZH蛋白在重组L-甲硫氨酸生产菌株中的过量产生对于氨基酸生产是有益的，而不管metH和fldA-frp基因是否过表达。来自克氏柠檬酸杆菌、肠杆菌属菌种、杨氏柠檬酸杆菌和弗氏柠檬酸杆菌的ygaZH基因过表达(所致)的生产的增加高于来自大肠杆菌的内源性ygaZH基因的过表达。

参考文献

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<150> EP14306346.9

<151> 2014-09-01

<160> 37

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 245

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

Met Glu Ser Pro Thr Pro Gln Pro Ala Pro Gly Ser Ala Thr Phe Met

1 5 10 15

Glu Gly Cys Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val

20 25 30

Ala Phe Ala Phe Gly Leu Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Ser Pro Leu

35 40 45

Glu Ser Val Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe

50 55 60

Val Ile Thr Ala Met Leu Ala Ala Gly Ser Ser Leu Trp Ile Ala Ala

65 70 75 80

Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser

85 90 95

Leu Arg Ser Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Lys Ser Lys Thr Ala Leu

100 105 110

Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys

115 120 125

Leu Val Arg Asn Asn Arg Arg Trp Ser Glu Asn Trp Met Ile Gly Ile

130 135 140

Ala Phe Ser Ser Trp Ser Ser Trp Val Phe Gly Thr Val Ile Gly Ala

145 150 155 160

Phe Ser Gly Ser Gly Leu Leu Gln Gly Tyr Pro Ala Val Glu Ala Ala

165 170 175

Leu Gly Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser Phe Leu Leu Ala Ser

180 185 190

Phe Gln Arg Lys Gln Ser Leu Cys Val Thr Ala Ala Leu Val Gly Ala

195 200 205

Leu Ala Gly Val Thr Leu Phe Ser Ile Pro Val Ala Ile Leu Ala Gly

210 215 220

Ile Val Cys Gly Cys Leu Thr Ala Leu Ile Gln Ala Phe Trp Gln Gly

225 230 235 240

Ala Pro Asp Glu Leu

245

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

Met Ser Tyr Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Val Ala Asn

1 5 10 15

Tyr Cys Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Arg Val Gly Asn Ala Arg

20 25 30

Pro Thr Lys Arg Gly Ala Val Gly Ile Leu Leu Asp Thr Ile Gly Ile

35 40 45

Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Thr Ala Pro Glu Val Met

50 55 60

His Asp Thr Arg Arg Phe Val Pro Thr Leu Val Gly Phe Ala Val Leu

65 70 75 80

Gly Ala Ser Phe Tyr Lys Thr Arg Ser Ile Ile Ile Pro Thr Leu Leu

85 90 95

Ser Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Ala Trp Lys Val Met Ala Ile Ile

100 105 110

<210> 3

<211> 244

<212> PRT

<213> 克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)

<400> 3

Met Glu Ser Pro Ala Pro Gln Ser Glu Pro Arg Pro Ala Thr Leu Thr

1 5 10 15

Glu Gly Phe Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val

20 25 30

Ala Phe Ala Phe Gly Leu Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Thr Pro Leu

35 40 45

Glu Ser Val Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe

50 55 60

Val Ile Thr Thr Met Leu Ala Ala Gly Ser Thr Leu Trp Val Ala Ala

65 70 75 80

Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser

85 90 95

Leu Arg Ser Arg Ile Ser Gln Arg Leu Ser Lys Pro Lys Thr Ala Leu

100 105 110

Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys

115 120 125

Leu Val Arg Asp Asn Arg Arg Trp Ser Glu Trp Met Ile Gly Ile Ala

130 135 140

Phe Cys Ser Trp Ala Ser Trp Val Leu Gly Thr Val Ile Gly Ala Phe

145 150 155 160

Ser Gly Ser Gly Leu Leu Lys Gly Phe Pro Ala Val Glu Ala Ala Leu

165 170 175

Gly Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser Phe Leu Leu Ala Ser Phe

180 185 190

Gln Arg Lys Gln Thr Leu Cys Val Thr Ala Ala Leu Ile Gly Ala Leu

195 200 205

Ala Gly Val Thr Leu Phe Ser Ile Pro Ala Ala Ile Leu Ala Gly Ile

210 215 220

Ala Ser Gly Cys Leu Thr Ala Leu Ile Gln Ser Phe Trp Gln Gly Ala

225 230 235 240

Pro Asp Glu Leu

<210> 4

<211> 111

<212> PRT

<213> 克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)

<400> 4

Met Ser Tyr Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Cys Ala Asn

1 5 10 15

Tyr Cys Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Arg Met Gly Asn Thr Arg

20 25 30

Pro Ala Arg Arg Gly Ala Thr Gly Val Leu Leu Asp Thr Ile Gly Ile

35 40 45

Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Thr Ala Pro Glu Val Met

50 55 60

His Asp Ala Ser Arg Phe Ile Pro Thr Leu Val Gly Phe Ala Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ser Phe Tyr Lys Thr Arg Ser Ile Ile Ile Pro Thr Leu Leu

85 90 95

Ser Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Ala Trp Lys Ile Glu Val Ile Leu

100 105 110

<210> 5

<211> 245

<212> PRT

<213> 弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)

<400> 5

Met Glu Ser Pro Val Pro Gln Ser Glu Ser Arg Ser Ala Thr Leu Thr

1 5 10 15

Glu Gly Phe Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val

20 25 30

Ala Phe Ala Phe Gly Met Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Thr Pro Val

35 40 45

Glu Ser Val Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe

50 55 60

Val Ile Thr Thr Met Leu Ala Ala Gly Ser Ser Leu Trp Val Ala Ala

65 70 75 80

Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser

85 90 95

Leu Arg Ser Arg Ile Ala Arg Gln Leu Ser Lys Pro Lys Ser Ala Leu

100 105 110

Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys

115 120 125

Leu Val Arg Asp Asn Arg Arg Trp Ser Glu Asn Trp Met Ile Gly Ile

130 135 140

Ala Leu Cys Ser Trp Ala Ser Trp Val Leu Gly Thr Val Ile Gly Ala

145 150 155 160

Phe Ser Gly Thr Gly Leu Leu Lys Gly Phe Pro Ala Val Glu Ala Ala

165 170 175

Leu Gly Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser Phe Leu Leu Ala Ser

180 185 190

Phe Gln Arg Asn Gln Thr Leu Cys Val Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala

195 200 205

Leu Ala Gly Val Thr Leu Phe Ser Ile Pro Ala Ala Ile Leu Ala Gly

210 215 220

Ile Val Cys Gly Cys Leu Thr Ala Leu Ile Gln Ser Phe Trp Gln Gly

225 230 235 240

Gly Pro Asp Glu Leu

245

<210> 6

<211> 111

<212> PRT

<213> 弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)

<400> 6

Met Ser Tyr Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Cys Val Asn

1 5 10 15

Tyr Cys Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Arg Met Gly Asn Val Arg

20 25 30

Pro Thr Lys Arg Gly Ala Thr Gly Ile Leu Leu Asp Thr Ile Gly Ile

35 40 45

Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Thr Ala Pro Glu Val Met

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Ser Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Ala Trp Lys Met Leu Phe Val Leu

100 105 110

<210> 7

<211> 242

<212> PRT

<213> 解鸟氨酸柔武氏菌(Raoultella ornithinolytica)

<400> 7

Met Glu Lys Pro Ala Pro Ala Ser Glu Ala Thr Leu Pro Glu Gly Ile

1 5 10 15

Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val Ala Phe Ala

20 25 30

Phe Gly Leu Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Thr Pro Leu Glu Ser Leu

35 40 45

Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe Val Ile Thr

50 55 60

Ala Met Leu Ala Ala Gly Ser Ser Leu Trp Val Ala Ala Leu Thr Val

65 70 75 80

Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser Leu Arg Ser

85 90 95

Arg Ile His Arg Ala Leu Asp Lys Arg Lys Thr Ala Leu Trp Ala Phe

100 105 110

Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys Leu Val Arg

115 120 125

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130 135 140

Ser Trp Ile Ser Trp Val Phe Gly Thr Leu Ile Gly Ala Tyr Ser Gly

145 150 155 160

Ser Gly Leu Leu Val Gly Phe Pro Ala Val Glu Ala Ala Leu Ser Phe

165 170 175

Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser Phe Leu Leu Ala Ser Phe Gln Arg

180 185 190

Lys Gln Ser Leu Ser Val Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Leu Gly Gly

195 200 205

Ile Ile Leu Phe Ser Ile Pro Ala Ala Ile Leu Ala Gly Ile Val Cys

210 215 220

Gly Cys Leu Ala Ala Leu Ile Gln Ala Ser Ile Gln Gly Met Pro Asp

225 230 235 240

Glu Gln

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> 解鸟氨酸柔武氏菌(Raoultella ornithinolytica)

<400> 8

Met Asn Asn Asn Val Leu Ile Ile Gly Ile Val Val Gly Cys Val Asn

1 5 10 15

Tyr Leu Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Arg Ala Gly Asn Ala Arg

20 25 30

Pro Thr Arg Arg Gly Pro Leu Ser Val Leu Leu Asp Thr Ile Gly Ile

35 40 45

Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Ile Val Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu

50 55 60

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Gly Leu Ala Phe Trp Lys Thr Arg Ser Ile Ile Met Pro Thr Leu Leu

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Phe

<210> 9

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<212> PRT

<213> 肠杆菌属菌种(Enterobacter sp.)(R4-368)

<400> 9

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Ser Ala Thr Phe Leu Glu Gly Ile Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Leu

20 25 30

Ser Tyr Val Pro Val Ala Phe Ala Phe Gly Met Asn Ala Thr Lys Leu

35 40 45

Gly Phe Thr Pro Leu Glu Ser Val Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala

50 55 60

Gly Ala Ser Gln Phe Val Ile Thr Thr Met Leu Ala Ala Gly Ser Ala

65 70 75 80

Leu Trp Val Ala Ala Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val

85 90 95

Leu Tyr Gly Pro Ser Leu Arg Ser Arg Ile Leu Gln Pro Leu Lys Asn

100 105 110

Arg Lys Thr Ala Val Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala

115 120 125

Ala Ala Thr Ala Lys Leu Val Arg Asp Asn Arg Arg Trp Ser Glu Asn

130 135 140

Trp Met Ile Gly Ile Ala Leu Phe Ser Trp Leu Ser Trp Val Ala Gly

145 150 155 160

Thr Val Leu Gly Ala Phe Ser Gly Asp Gly Leu Leu Asp Gly Tyr Pro

165 170 175

Ala Val Glu Ser Ala Leu Gly Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser

180 185 190

Phe Leu Leu Ala Ser Phe Gln Arg Arg Gln Ile Ser Ala Val Thr Ala

195 200 205

Ala Leu Leu Gly Ala Leu Ala Gly Val Thr Leu Phe Ser Ile Pro Ala

210 215 220

Ala Ile Leu Ala Gly Ile Phe Ala Gly Cys Leu Ala Ala Leu Val Gln

225 230 235 240

Ala Phe Tyr Gln Gly Ala Ser Asp Ala Gln

245 250

<210> 10

<211> 111

<212> PRT

<213> 肠杆菌属菌种(Enterobacter sp.) (R4-368)

<400> 10

Met Arg Asn Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Cys Val Asn

1 5 10 15

Phe Leu Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Ile Arg Ala Gly Gln Ser Arg

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Pro Ala Lys Arg Gly Val Ser Gly Val Phe Leu Asp Thr Ile Gly Ile

35 40 45

Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Cys Val Pro Glu Ile Ala

50 55 60

Ala Asp Ser Arg Arg Leu Leu Pro Thr Leu Ala Gly Phe Ala Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ser Phe Trp Lys Thr Arg Ser Ile Ile Leu Pro Thr Leu Leu

85 90 95

Ser Ala Phe Ala Tyr Gly Ile Val Trp Lys Leu Leu Ala Asp Ala

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<210> 11

<211> 257

<212> PRT

<213> 小肠结肠炎耶尔森氏菌小肠结肠炎亚种(Yersinia enterocolitica subsp.Enterocolitica)

<400> 11

Met Gln Ser Gln Thr Thr Asp Ser Pro Ser Thr Ala Gln Pro Thr Ala

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Leu Pro Val Ala Phe Ala Phe Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Gly Phe

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Val Ser Ala Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Ile Leu Tyr

85 90 95

Gly Pro Ala Leu Lys His Arg Ile Val Thr Arg Leu Ser Gly Lys Lys

100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Leu Gly Ile Ala Phe Thr Ser Trp Leu Ser Trp Val Ala Gly Thr Ala

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165 170 175

Glu Ala Ser Leu Ser Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Leu Ser Phe Leu

180 185 190

Leu Ala Ser Phe Lys Arg Gln Tyr Ser Leu Thr Val Ile Ala Ser Leu

195 200 205

Thr Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Leu Phe Ser Ile Pro Val Ala Ile

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Leu Ala Gly Ile Gly Gly Gly Cys Leu Ala Ala Leu Leu Gln Pro Val

225 230 235 240

Pro Glu Thr Val Ile Glu Asn Asn Glu Ser Asp Lys Glu Glu Pro Lys

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Pro

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<400> 12

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85 90 95

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130 135 140

Leu Gly Ile Ala Phe Thr Ser Trp Leu Ser Trp Val Ala Gly Thr Ala

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165 170 175

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180 185 190

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Thr Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Leu Phe Ser Ile Pro Val Ala Ile

210 215 220

Leu Ala Gly Ile Gly Gly Gly Cys Leu Ala Ala Leu Leu Gln Pro Val

225 230 235 240

Pro Glu Thr Val Ile Glu Asn Asn Glu Ser Asp Lys Glu Glu Pro Lys

245 250 255

Pro

<210> 13

<211> 113

<212> PRT

<400> 13

Met Asn Met Asp Val Val Ile Ile Gly Leu Val Val Gly Thr Val Asn

1 5 10 15

Tyr Leu Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Gly Pro Ala Arg Lys Gln

20 25 30

Ala Gly Leu Gln Arg Gly Lys Val Ser Leu Leu Leu Asp Ser Ile Gly

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Ile Cys Gly Cys Phe Tyr Lys Thr Asn Ser Ile Ile Phe Ala Thr Leu

85 90 95

Leu Gly Ala Leu Ser Tyr Gly Leu Thr Phe Lys Leu Leu Met Ile Leu

100 105 110

Ala

<210> 14

<211> 113

<212> PRT

<400> 14

Met Asn Met Asp Val Val Ile Ile Gly Leu Val Val Gly Thr Val Asn

1 5 10 15

Tyr Leu Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Gly Pro Ala Arg Lys Gln

20 25 30

Ala Gly Leu Gln Arg Gly Lys Val Ser Leu Leu Leu Asp Ser Ile Gly

35 40 45

Ile Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Ser Thr Pro Glu Ile

50 55 60

Val His Asn Pro Gln Lys Leu Ile Pro Thr Leu Ile Gly Phe Leu Val

65 70 75 80

Ile Cys Gly Cys Phe Tyr Lys Thr Asn Ser Ile Ile Phe Ala Thr Leu

85 90 95

Leu Gly Ala Leu Ser Tyr Gly Leu Thr Phe Lys Leu Leu Met Ile Leu

100 105 110

Ala

<210> 15

<211> 252

<212> PRT

<213> 发光光杆状菌洛氏亚种(Photorhabdus luminescens subsp. Laumondii)

<400> 15

Met Pro Val Ser Asp Thr Ser Ser Pro Leu Thr Ser Lys Lys Ser Ser

1 5 10 15

Phe Thr Glu Gly Ile Ile Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Gly Tyr Ile

20 25 30

Pro Val Ala Phe Ala Phe Gly Leu Asn Ala Val Lys Leu Gly Phe Asn

35 40 45

Pro Met Glu Ala Ile Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser

50 55 60

Gln Phe Val Ile Thr Ala Leu Leu Ser Ala Gly Thr Ser Leu Trp Ile

65 70 75 80

Ser Ala Leu Thr Ile Met Ala Met Asp Val Arg His Ile Leu Tyr Gly

85 90 95

Pro Ser Leu Arg His Arg Ile Lys Asp Lys Leu Thr Glu Lys Lys Thr

100 105 110

Val Ile Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr

115 120 125

Ala Lys Leu Ile Lys Asn His Arg Ser Trp Ser Glu Asn Trp Met Val

130 135 140

Ala Ile Ala Ile Cys Ser Trp Leu Ala Trp Gly Ala Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160

Gly Ala Phe Leu Gly Asn Gly Tyr Leu Glu Ser Tyr Pro Ala Ile Glu

165 170 175

Ala Ala Met Ile Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Leu Ser Phe Leu Leu

180 185 190

Ala Ser Cys Arg Lys Gln Asn Ser Tyr Cys Val Ala Thr Ala Leu Thr

195 200 205

Gly Ala Leu Leu Gly Ile Thr Phe Phe Ser Ile Pro Val Ala Ile Leu

210 215 220

Ala Gly Ile Val Gly Gly Cys Ile Ala Ala Leu Leu Gln Pro Gln Asn

225 230 235 240

Asn Cys Asn Asp Ser Ser Glu Gln Lys Glu Thr Pro

245 250

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 发光光杆状菌洛氏亚种(Photorhabdus luminescens subsp. Laumondii)

<400> 16

Met Ile Asp Ser Lys Ile Leu Leu Ile Gly Leu Phe Val Gly Leu Ala

1 5 10 15

Asn Phe Ser Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Phe Gly Lys Ala Arg Gln

20 25 30

Ser Ala Gly Arg Lys Ala Gly Lys Thr Ser Ile Ile Leu Asp Ser Ile

35 40 45

Gly Ile Ala Ser Ile Cys Ser Leu Leu Ile Val Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Val Met Arg Glu Ser Gln Lys Leu Leu Pro Thr Leu Ile Gly Cys Leu

65 70 75 80

Thr Ile Cys Leu Val Phe Tyr Lys Thr Lys Gln Ile Ile Leu Ala Thr

85 90 95

Leu Phe Gly Ala Leu Leu Phe Gly Leu Thr Phe Lys Ile Phe Met Asn

100 105 110

<210> 17

<211> 245

<212> PRT

<213> 杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)

<400> 17

Met Asp Ser Pro Ile Pro Gln Ser Gly Ser Arg Ser Ala Thr Leu Thr

1 5 10 15

Glu Gly Phe Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val

20 25 30

Ala Phe Ala Phe Gly Leu Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Thr Pro Val

35 40 45

Glu Ser Val Phe Leu Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe

50 55 60

Val Ile Thr Thr Met Leu Ala Ala Gly Ser Ser Leu Trp Val Ala Ala

65 70 75 80

Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser

85 90 95

Leu Arg Ser Arg Ile Ala Gln Arg Leu Ser Lys Pro Lys Ser Ala Leu

100 105 110

Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys

115 120 125

Leu Val Arg Asp Asn Arg Arg Trp Ser Glu Asn Trp Met Ile Gly Ile

130 135 140

Ala Leu Cys Ser Trp Ala Ser Trp Val Phe Gly Thr Ala Ile Gly Ala

145 150 155 160

Phe Ser Gly Ser Gly Leu Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Val Glu Ala Ala

165 170 175

Leu Gly Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser Phe Leu Leu Ala Ser

180 185 190

Phe Gln Arg Lys Gln Ala Leu Cys Val Thr Val Ala Leu Thr Gly Ala

195 200 205

Leu Ala Gly Val Ile Leu Phe Ser Ile Pro Ala Ala Ile Leu Leu Gly

210 215 220

Ile Val Cys Gly Cys Leu Thr Ala Leu Leu Gln Ser Phe Trp Gln Gly

225 230 235 240

Gly Pro Asp Glu Leu

245

<210> 18

<211> 111

<212> PRT

<213> 杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)

<400> 18

Met Ser Tyr Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Cys Val Asn

1 5 10 15

Tyr Cys Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Gly Ala Gly Asn Val Arg

20 25 30

Pro Ala Arg Arg Gly Ala Thr Gly Ile Leu Leu Asp Thr Ile Gly Ile

35 40 45

Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Thr Ala Pro Glu Val Met

50 55 60

His Asp Ala Arg Arg Phe Val Pro Thr Leu Val Gly Phe Val Ile Leu

65 70 75 80

Gly Ala Ser Phe Tyr Lys Thr Arg Ser Ile Ile Ile Pro Thr Leu Leu

85 90 95

Ser Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Ala Trp Lys Met Leu Val Gly Leu

100 105 110

<210> 19

<211> 245

<212> PRT

<213> 弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)

<400> 19

Met Glu Ser Pro Val Pro Gln Ser Glu Ser Ser Ser Ala Thr Leu Thr

1 5 10 15

Glu Gly Phe Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val

20 25 30

Ala Phe Ala Phe Gly Leu Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Thr Pro Val

35 40 45

Glu Ser Val Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe

50 55 60

Val Ile Thr Thr Met Leu Ala Ala Gly Ser Ser Leu Trp Val Ala Ala

65 70 75 80

Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser

85 90 95

Leu Arg Ser Arg Ile Ala Gln Arg Leu Ser Lys Pro Lys Ser Ala Leu

100 105 110

Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys

115 120 125

Leu Val Arg Asp Asn Arg Arg Trp Ser Glu Asn Trp Met Ile Gly Ile

130 135 140

Ala Leu Cys Ser Trp Ala Ser Trp Val Phe Gly Thr Val Leu Gly Ala

145 150 155 160

Phe Ser Gly Ser Gly Leu Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Val Glu Ala Ala

165 170 175

Leu Gly Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser Phe Leu Leu Ala Ser

180 185 190

Phe Gln Arg Lys Gln Ala Leu Cys Val Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala

195 200 205

Leu Ala Gly Val Met Leu Phe Ser Ile Pro Ala Ala Ile Leu Ala Gly

210 215 220

Ile Val Cys Gly Cys Leu Thr Ala Leu Ile Gln Ser Phe Trp Gln Gly

225 230 235 240

Gly Pro Asp Glu Leu

245

<210> 20

<211> 111

<212> PRT

<213> 弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)

<400> 20

Met Ser Tyr Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Cys Val Asn

1 5 10 15

Tyr Cys Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Gly Val Gly Asn Val Arg

20 25 30

Pro Thr Lys Arg Gly Ala Thr Gly Ile Leu Leu Asp Thr Ile Gly Ile

35 40 45

Thr Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Thr Ala Pro Glu Val Met

50 55 60

His Asp Ala Arg Arg Phe Val Pro Thr Leu Val Gly Phe Val Ile Leu

65 70 75 80

Gly Ala Ser Phe Tyr Lys Thr Arg Ser Ile Ile Ile Pro Thr Leu Leu

85 90 95

Ser Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Ala Trp Lys Met Leu Val Val Leu

100 105 110

<210> 21

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 寡核苷酸YbeM

<400> 21

aacactgcaa aatcctgcta tttgatttgt atgagtgata agtgtaacgc cgaataatcg 60

tcgttggcga attttacgac tctgacagga ggtggcaatg 100

<210> 22

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 寡核苷酸YbeM

<400> 22

gagaaagtaa acgtaacatg atgacgacaa ttctgacgat tcatgttcct tcaacgccgg 60

ggcgcgcatg gaatatgctg gtggcacttc aggcaggaaa 100

<210> 23

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 寡核苷酸YpjC

<400> 23

tgaggaatag acaatgttag ttagtaaaag caacggattt aacgctagcg cagttttggg 60

tagtggaagt tataatgaaa ataaatcttc taaacacatg 100

<210> 24

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 寡核苷酸YpjC

<400> 24

tgcgctaaaa gaaatgaata gaaccttttc gataatataa gaaaaagtga ttttcatgtt 60

ggtttactta agccaagtag tacgcgtagt gttattttag 100

<210> 25

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 寡核苷酸FldA

<400> 25

aaattattct tgtatctttg ttataatatg ggaaagtgca accat 45

<210> 26

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 寡核苷酸YtfA

<400> 26

cgttaatcag caggttagcc agccacaaaa agccattgag aaaattattg attttacatg 60

ggattattat attgctaatc cttggttttt aaaaattgtg 100

<210> 27

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 寡核苷酸YtfA

<400> 27

tcatctaccg cgcacgaata aaactgccat ccggctggcg ggtgaacagg acctgttgat 60

tattccccgt atcaatggtt aagcccgtca ccacgccgct 100

<210> 28

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 寡核苷酸YjbB

<400> 28

ttgagcgctg gctggcaccg aatctggggt atgacgcgga ctgattcaca 50

<210> 29

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 寡核苷酸YjbB

<400> 29

aatctgtcac ttttccttac aacaaacagg gcgctcaatg agtgccctgt 50

<210> 30

<211> 1063

<212> DNA

<213> 克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)

<400> 30

atggaaagcc ctgcacccca gtctgagccc cgtccggcaa cattaacgga aggattcaaa 60

gacagtttac cgatagtcat aagttatatt ccggtggcgt ttgcgtttgg ccttaacgcc 120

acccgtctgg gctttactcc cctcgaaagc gtttttttct cctgcattat ttacgcaggc 180

gccagccagt tcgtcatcac caccatgctc gcggcgggca gcacattatg ggtcgccgcg 240

ctgaccgtga tggcgatgga cgtgcgtcat gtgctgtacg gcccttccct gcgtagtcgc 300

atcagccaac ggctcagtaa acctaaaacc gccctgtggg catttggcct caccgatgaa 360

gtgtttgctg ccgccacggc caaactggtg cgggataacc gccgctggag tgaaaactgg 420

atgatcggca tcgcgttctg ctcctgggcc tcctgggtgc tcggcacggt cattggcgca 480

ttttccggga gcggattgct gaaaggcttc cccgccgttg aggcggcatt aggttttatg 540

ctgccagccc tgtttatgag ctttttgctc gcttcttttc aacgcaaaca aacgctgtgc 600

gtcacggcgg cgttaatcgg cgcgctggca ggcgtcacgc tgttttccat tcctgcggct 660

atcctggcgg gtatcgccag cgggtgtctg accgccttga tccagtcgtt ctggcaagga 720

gcgcccgatg agttatgagg ttctgctgct gggactgctg gtcggctgcg ccaattattg 780

ttttcgttat ttaccgcttc gtctgcgaat gggaaacacc cgccccgcca ggcgcggcgc 840

aacgggcgtg ttgctcgaca ccattggcat cgcgtccatc tgcgccctgc tggtggtgtc 900

tacggctccc gaagtgatgc acgacgccag ccggttcatt ccgacgctgg tcgggtttgc 960

cgtcctgggc gtcagtttct acaagacgcg cagcatcatc atcccaacgc tactgagcgc 1020

tctgggctat ggactcgcct ggaagataga ggtcatttta taa 1063

<210> 31

<211> 1063

<212> DNA

<213> 弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)

<400> 31

atggaaagcc ctgttcccca gtctgaatcc cgttctgcaa cgttaactga aggattcaaa 60

gacagcctac cgatagttat cagttatatt ccggtcgcat ttgcatttgg tatgaatgcg 120

actcgcctgg gctttactcc cgttgaaagc gtttttttct cctgcatcat ttacgctggc 180

gccagccagt ttgtcatcac aaccatgctc gccgcaggca gctcactgtg ggtcgcggct 240

ctgaccgtca tggcgatgga tgttcgccat gttttgtacg gcccttctct gcgcagccgt 300

atcgcccgac agctgagcaa acctaaaagc gcgctatggg cctttggcct caccgacgaa 360

gtctttgccg cggcaacggc caagctggtg cgggataacc ggcgctggag tgaaaactgg 420

atgatcggca tcgcgctatg ctcctgggct tcctgggtac ttggtacggt tatcggcgca 480

ttttccggca ctggcttact gaagggattc ccggcggtag aagcggcgct ggggtttatg 540

ctcccggcgc tgtttatgag ttttctgctg gcctctttcc agcgtaatca aacgctatgc 600

gtcacggcgg ctttagccgg tgcgctggct ggcgtgacgc tgttttctat cccggcagcc 660

atcctcgcag gcatagtctg cggatgcctg accgcgctca ttcagtcgtt ctggcaggga 720

ggtcctgatg agttatgagg ttctgctgct cggcctgctg gtcggctgcg tcaattactg 780

ttttcgctat ttaccactgc gtctgcgaat ggggaatgtg cgcccgacaa aacgcggagc 840

cactggaata ctactcgaca ccatcggtat tgcatcaatt tgcgccctgc tagtggtgtc 900

tactgcgcca gaagtgatgc acgatgcccg tcgttttgtg cctacgctgg tggggtttgt 960

ggtactgggt gcaagcttct ataagacccg cagcatcatc attccgacct tactgagtgc 1020

cctgggctat ggattagcct ggaaaatgct gtttgtctta tag 1063

<210> 32

<211> 1060

<212> DNA

<213> 解鸟氨酸柔武氏菌(Raoultella ornithinolytica)

<400> 32

atggaaaaac cggcaccggc aagcgaagca accctgccgg aaggtattaa agatagcctg 60

ccgattgtga ttagctatat tccggttgca tttgcctttg gtctgaatgc aacccgtctg 120

ggttttacac cgctggaaag cctgtttttt agctgtatta tctatgccgg tgcaagccag 180

tttgttatta ccgcaatgct ggcagcaggt agcagcctgt gggttgcagc actgaccgtt 240

atggcaatgg atgttcgtca tgttctgtat ggtccgagcc tgcgtagccg tattcatcgt 300

gcactggata aacgtaaaac cgcactgtgg gcatttggcc tgaccgatga agtttttgca 360

gcagcaaccg caaaactggt tcgtgataat cgtcgttgga gcgaaagctg gatgctgggt 420

attgcattta ccagctggat tagctgggtt tttggcaccc tgattggtgc atatagcggt 480

agcggtctgc tggttggttt tccggcagtt gaagcagccc tgagctttat gctgcctgca 540

ctgtttatga gttttctgct ggcaagcttt cagcgtaaac agagcctgag cgttaccgca 600

gcactggcag gcgcactggg tggtattatt ctgtttagca ttccggcagc aattctggca 660

ggtattgttt gtggttgtct ggcagcgctg attcaggcaa gcattcaggg tatgccggat 720

gaacaataac gttctgatta ttggtattgt ggtgggctgt gtgaattacc tgtttcgtta 780

tctgccgctg cgtctgcgtg caggtaatgc acgtccgacc cgtcgtggtc cgctgagcgt 840

tctgctggat accattggca ttgcaagcat ttgtgcactg ctgattgtta gcagcgttcc 900

ggaaattctg agcgatagcc gtcgtctgct gccgaccctg gttggtttta ccgttctggg 960

tctggcattt tggaaaaccc gtagcattat tatgccgaca ctgctgagcg cactggccta 1020

tggtattgca tggaaaatta ccacctttct gtatttttga 1060

<210> 33

<211> 1078

<212> DNA

<213> 肠杆菌属菌种(Enterobacter sp.) (R4-368)

<400> 33

atggatatgg atagcagcgt taccgcaacc aaaagcacca gcgatcagag cgcaaccttt 60

ctggaaggta ttaaagatag cctgccgatt gttctgagct atgttccggt tgcatttgcc 120

tttggtatga atgcaaccaa actgggtttt acaccgctgg aaagcgtgtt ttttagctgt 180

attatctatg ccggtgcaag ccagtttgtt attaccacca tgctggcagc aggtagcgca 240

ctgtgggttg cagcactgac cgttatggca atggatgttc gtcatgttct gtatggtccg 300

agcctgcgta gccgtattct gcagccgctg aaaaatcgta aaaccgcagt gtgggcattt 360

ggtctgaccg atgaagtttt tgcagcagca accgcaaaac tggttcgtga taatcgtcgt 420

tggagcgaaa attggatgat tggtattgca ctgtttagct ggctgagctg ggttgccggt 480

acagttctgg gtgcatttag cggtgatggt ctgctggatg gttatccggc agttgaaagt 540

gcactgggct ttatgctgcc tgccctgttt atgagctttc tgctggcaag ctttcagcgt 600

cgtcagatta gcgcagttac cgcagcactg ctgggtgcac tggcaggcgt taccctgttt 660

agcattccgg cagcaattct ggcaggcatt tttgcaggtt gtctggcagc actggttcag 720

gccttttatc agggtgcaag tgatgcgcaa tgaggttctg ctgctgggcc tgctggttgg 780

ttgtgttaat tttctgtttc gttatctgcc gctgcgtatt cgtgcaggtc agagccgtcc 840

ggcaaaacgt ggtgttagcg gtgtttttct ggataccatt ggcattgcaa gcatttgtgc 900

cctgctggta gttagctgtg ttccggaaat tgcagcagat agccgtcgtc tgctgccgac 960

cctggcaggt tttgcagtgc tgggtgttag cttttggaaa acccgtagca ttattctgcc 1020

gacactgctg agcgcatttg cgtatggtat tgtttggaaa ctgctggcag atgcctaa 1078

<210> 34

<211> 1112

<212> DNA

<400> 34

atgcaaagcc aaaccaccga ctccccctcg acggcccagc cgaccgccac ctttattgaa 60

ggaataaccg atagcctacc gattgttatc ggttatctac ccgttgcttt tgcctttggt 120

ttgagttcgg taaaacttgg ctttactccg tgggaagcta ttttcttttc ttgcattatt 180

tatgccggag ccagccaatt cgttattacc gccctgctca gcgcggggat gtcattgtgg 240

gtttccgcct tgaccgtgat ggctatggat gtccgccata tcttgtacgg gccagcactg 300

aaacaccgca ttgtaaccag gttatctggc aaaaaaacgg cgctgtgggc ctttggtctt 360

actgatgaag tgtttgccgc cgcaacaacc aagctaatga aagatcaacg gcgctggagt 420

gaaaactgga tgcttggcat cgcgttcacc tcttggttgt cttgggtagc tggcaccgct 480

atcggcgcga tgtttggtca tgggccgctg gaaaattacc cggcgattga agcatcactc 540

tcctttatgc tcccggcgct attcctcagc ttcttattgg cctcgttcaa acgccaatac 600

agccttaccg ttattgcttc actgaccgga gccttgctgg gcgtgctgct gttctctatt 660

ccggtggcta ttttagccgg tattggcggc ggatgcctgg cagccctgct ccaacccgtc 720

cccgagaccg ttatagaaaa taacgagagt gataaagagg agccgaagcc atgaatatgg 780

atgttgtgat cattggtttg gtggtgggaa cggtcaatta cctgtttcgt tatctgccgc 840

tgcgcctggg gcctgcccgt aaacaagcag gcctgcaacg agggaaagtc tccctgttgc 900

tagacagcat cgggatcgcc tctatctgtg cgttgttggt ggtttccagt accccggaga 960

tagtgcataa cccacagaaa ttaattccta cactaattgg ttttttagtt atctgtggat 1020

gcttttataa aaccaacagt attatcttcg ccaccttact gggagcactc agttacggtc 1080

tgacattcaa attactgatg attttggcat aa 1112

<210> 35

<211> 1094

<212> DNA

<213> 发光光杆状菌洛氏亚种(Photorhabdus luminescens subsp. Laumondii)

<400> 35

atgcctgttt ctgatacatc atccccctta acgagtaaaa aatcttcttt tactgaagga 60

ataatagata gtttacccat tgttatcggt tatattcccg tcgcctttgc ttttggtctc 120

aatgccgtca aacttggctt caacccaatg gaagccattt tcttttcatg catcatctac 180

gccggtgcaa gccagttcgt catcacagct ttactgagtg cggggacatc attatggatt 240

tctgccctaa caattatggc aatggatgtc cgccatattc tttatggtcc atctttaagg 300

caccgtatca aagataagct aacggagaaa aaaaccgtta tctgggcttt cggcctgaca 360

gatgaagttt ttgccgccgc gactgcaaaa ctcattaaaa accaccggag ctggagtgaa 420

aactggatgg ttgctattgc aatctgttct tggctggcct ggggcgcagg taccgcagcc 480

ggtgcatttc ttggtaacgg ttatttggaa tcctatcccg ctatagaagc tgccatgatt 540

ttcatgttac cagcactatt tctcagtttt cttcttgctt cttgtagaaa acaaaatagt 600

tattgtgttg caaccgcact aaccggagca cttttaggga ttacattttt ctcaattcca 660

gttgctattc tggcaggtat tgtcggtggt tgtatcgcgg cactgttaca accgcaaaac 720

aattgcaatg actcttcaga acaaaaggaa acaccatgat tgatagcaag attttgctga 780

ttggactatt tgttgggtta gctaactttt catttcgcta tctgccacta cgatttggga 840

aagcacgcca atctgccggc agaaaagctg gaaaaacaag cattatcctt gacagtattg 900

gtattgcatc catttgttct ttactcatcg tatcaggtgt acctgatgtg atgagagaaa 960

gtcaaaaact acttcctacc ctcataggtt gtctgaccat ctgtttagtc ttttacaaaa 1020

caaagcaaat tatactcgca acactatttg gcgcactgct ttttggacta acattcaaaa 1080

tatttatgaa ttag 1094

<210> 36

<211> 1063

<212> DNA

<213> 杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)

<400> 36

atggatagcc cgattccgca gagcggtagc cgtagcgcaa ccctgaccga aggttttaaa 60

gatagcctgc cgattgtgat tagctatatt ccggttgcat ttgcctttgg tctgaatgca 120

acccgtctgg gttttacacc ggttgaaagc gtttttctga gctgtattat ctatgccggt 180

gcaagccagt ttgttattac caccatgctg gcagcaggta gcagcctgtg ggttgcagca 240

ctgaccgtta tggcaatgga tgttcgtcat gttctgtatg gtccgagcct gcgtagccgt 300

attgcacagc gtctgagcaa accgaaaagc gcactgtggg catttggcct gaccgatgaa 360

gtttttgcag cagcaaccgc aaaactggtt cgtgataatc gtcgttggag cgaaaattgg 420

atgattggta ttgcactgtg tagctgggca agctgggttt ttggcaccgc aattggtgca 480

tttagcggta gcggtctgct gaaagattat ccggcagttg aagcagcact gggctttatg 540

ctgcctgcac tgtttatgag ctttctgctg gcgagctttc agcgtaaaca ggcactgtgt 600

gttaccgttg ccctgaccgg tgcactggca ggcgttattc tgtttagcat tccggcagca 660

attctgctgg gtattgtttg tggttgtctg accgcactgc tgcagagctt ttggcagggt 720

ggtccggatg agctatgagg ttctgctgct gggtctgctg gttggttgtg tgaattattg 780

ttttcgttat ctgccgctgc gtctgggtgc aggtaatgtt cgtccggcac gtcgtggtgc 840

aaccggtatc ctgctggata caattggcat tgcaagcatt tgtgcactgc tggtagttag 900

caccgcaccg gaagttatgc atgatgcacg tcgttttgtt ccgaccctgg tgggttttgt 960

tattctgggt gccagcttct ataaaacccg tagcattatt atcccgaccc tgctgagcgc 1020

actgggttat ggtctggcat ggaaaatgct ggtaggtctg taa 1063

<210> 37

<211> 1063

<212> DNA

<213> 弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)

<400> 37

atggaaagtc cggttccgca gagcgaaagc agcagcgcaa ccctgaccga aggttttaaa 60

gatagcctgc cgattgtgat tagctatatt ccggttgcat ttgcctttgg tctgaatgca 120

acccgtctgg gttttacacc ggttgaaagc gtgtttttta gctgcattat ctatgccggt 180

gcaagccagt ttgttattac caccatgctg gcagcaggta gcagcctgtg ggttgcagca 240

ctgaccgtta tggcaatgga tgttcgtcat gttctgtatg gtccgagcct gcgtagccgt 300

attgcacagc gtctgagcaa accgaaaagc gcactgtggg catttggcct gaccgatgaa 360

gtttttgcag cagcaaccgc aaaactggtt cgtgataatc gtcgttggag cgaaaattgg 420

atgattggta ttgcactgtg tagctgggca agctgggttt ttggcaccgt tctgggtgca 480

tttagcggta gcggtctgct gaaagattat ccggcagttg aagcagcact gggctttatg 540

ctgcctgcac tgtttatgag ctttctgctg gcgagctttc agcgtaaaca ggcactgtgt 600

gttaccgcag ccctggcagg cgcactggct ggtgttatgc tgtttagcat tccggcagca 660

attctggcag gtattgtttg tggttgtctg accgcactga ttcagagctt ttggcagggt 720

ggtccggatg agctatgaag ttctgctgct gggtctgctg gttggttgtg tgaattattg 780

ttttcgttat ctgccgctgc gtctgggtgt tggtaatgtt cgtccgacca aacgtggtgc 840

aaccggtatt ctgctggata ccattggtat taccagcatt tgtgcactgc tggtagttag 900

caccgcaccg gaagttatgc atgatgcacg tcgttttgtt ccgaccctgg tgggttttgt 960

tatcctgggt gccagcttct ataaaacccg tagcattatt atcccgaccc tgctgagcgc 1020

actgggttat ggtctggcat ggaaaatgct ggttgttctg taa 1063

Claims

1.用于甲硫氨酸的发酵生产的重组大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，其中与非修饰大肠杆菌菌株相比，在所述重组菌株中，来自大肠杆菌的ygaZ和ygaH基因的ygaZH同源基因的表达增加，条件是其既不与来自大肠杆菌的基因metH和任选的fldA和fpr的过表达组合，也不与metN、metI或metQ基因中至少一个基因的表达减弱组合，且

所述ygaZH同源物基因选自编码YgaZH同源物对的基因的组，所述YgaZH同源物对分别由如下所定义：来自克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、来自肠杆菌属菌种(Enterobacter sp.)R4-368的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、来自杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)的SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、来自弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；且

其中所述表达增加通过以下实现：

i)增加所述菌株中基因的拷贝数，

ii)使用引起基因高水平表达的启动子，和/或

iii)减弱转录抑制子的活性或表达。

2.权利要求1的重组大肠杆菌菌株，其中ygaZH同源基因在诱导型启动子的控制下表达。

3.权利要求1的重组大肠杆菌菌株，其中与非修饰大肠杆菌菌株相比，如下基因的至少一个的表达也是增加的：ptsG、pyc、pntAB、cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、cysE、metF、metA、metA*等位基因，其编码具有降低的针对S-腺苷甲硫胺酸和/或甲硫氨酸的反馈敏感性的酶、thrA、或thrA*等位基因，其编码具有降低的针对苏氨酸的反馈抑制的酶。

4.权利要求3的重组大肠杆菌菌株，其中所述基因的至少一个在诱导型启动子控制下。

5.权利要求1的重组大肠杆菌菌株，其中如下基因的至少一个的表达也是减弱的：metJ、pykA、pykF、purU、ybdL、yncA、metE、dgsA或udhA。

6.权利要求1的重组大肠杆菌菌株，其中：

a.ygaZ和ygaH同源基因的表达增加，

b.基因metA*、cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP、metF、serA、serB、serC、cysE、thrA*、ptsG和pyc的表达是增强的；且

c.基因metJ、pykA、pykF、purU、dgsA、metE和yncA的表达是减弱的。

7.用于甲硫氨酸的发酵生产的方法，其包括如下步骤：

a.培养如权利要求1-6任一项中的重组大肠杆菌菌株，所述培养在包含可发酵的碳源和硫源的适当培养基中进行；和

b.从所述培养基回收甲硫氨酸，

其中所述表达增加通过以下实现：

i)增加所述菌株中基因的拷贝数，

ii)使用引起基因高水平表达的启动子，和/或

iii)减弱转录抑制子的活性或表达。

8.权利要求7的方法，其中使所述重组大肠杆菌菌株在培养基中的生长受到针对一种或数种无机底物的限制或缺乏，所述无机底物是磷酸盐和/或钾。

9.权利要求7的方法，其中所述回收甲硫氨酸的步骤包括浓缩发酵液中的甲硫氨酸的步骤。

10.用于甲硫氨酸的发酵生产的经遗传修饰的大肠杆菌菌株，其中在所述经遗传修饰的大肠杆菌菌株中，对来自大肠杆菌的ygaZ和ygaH基因的ygaZH同源基因进行过表达，所述ygaZH同源物基因选自编码YgaZH同源物对的基因的组，所述YgaZH同源物对分别由如下所定义：来自克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、来自肠杆菌属菌种(Enterobacter sp.)R4-368的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、来自杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)的SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、来自弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。

11.用于甲硫氨酸的发酵生产的方法，其包括如下步骤：

a.培养经遗传修饰的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，其中在所述大肠杆菌菌株中，对来自大肠杆菌的ygaZ和ygaH基因的ygaZH同源基因进行过表达，所述培养在包含可发酵的碳源和硫源的适当培养基中进行，所述ygaZH同源物基因选自编码YgaZH同源物对的基因的组，所述YgaZH同源物对分别由如下所定义：来自克氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、来自肠杆菌属菌种(Enterobacter sp.)R4-368的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、来自杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)的SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、来自弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的SEQ ID NO:19和SEQID NO:20，和

b.从所述培养基回收甲硫氨酸。

12.权利要求11的方法，其中使所述经遗传修饰的大肠杆菌菌株在培养基中的生长受到磷酸盐和/或钾的限制或缺乏。