BR112013017109A2 - processo para a preparação fermentativa de aminoácidos sulfurosos - Google Patents

Abstract

Patente de Invenção: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO FERMENTATIVA DE AMINOÁCIDOS SULFUROSOS. A presente invenção refere-se a um processo para a preparaçao fermentativa de aminoácidos contendo enxofre, escolhidos de entre o grupo de L-metionina, L-cisteína, L-cistina, L-homocisteina e L-homocistina, que compreende as etapas de: a) fornecimento de um micro-organismo da família Enterobac-teriaceae, ou de um micro-organismo da família Corynebacteriaceae que tem um aumento da atividade de tiossulfato sulfurtransferase em comparação com a cepa de partida em particular; b) fermentação do micro-organismo a partir de a) em um meio que contém uma fonte inorgânica de enxofre escolhida a partir do grupo de sal de ácido ditiossulfúrico ou uma mistura de um sal de ácido ditiossulfúrico e de um sal de ácido sulfúrico, um caldo de fermentação, sendo obtido, e c) concentração de aminoácidos contendo enxofre, no caldo de fermentação a partir de b).

Description

. ' 1/45 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO i PARA A PREPARAÇÃO FERMENTATIVA DE AMINOÁCIDOS SULFU- ROSOS". A presente invenção refere-se a um processo para a preparação fermentativa de aminoácidos contendo enxofre escolhidos de entre o grupo de L-metionina, L-cisteina, L-cistina, L-homocisteína e L-homocistina.

Os aminoácidos contendo enxofre são de grande importância econômica. L-cisteina é usada como um aditivo alimentar, tal como uma substância de partida para os compostos farmacologicamente ativos (por exemplo, N-acetilcisteina), e para os cosméticos. O aminoácido L-metionina desempenha um papel importante na nutrição animal. Pertence aos aminoá- . cidos essenciais que não podem ser produzidos por meio da biossíntese no ' metabolismo dos vertebrados. Na criação de animais deve, portanto, ser ga- rantido que as quantidades adequadas de metionina sejam tomadas com a alimentação. No entanto, uma vez que a L-metionina é muitas vezes presen- te em alimentos para as plantas convencionais (tais como cereais ou soja) em quantidades que são demasiadamente baixas para assegurar a alimen- tação animal ideal, especialmente para suínos e aves, é vantajoso misturar metionina como um aditivo para o animal alimentar. D-metionina pode ser convertida em L-metionina biologicamente ativa por meio dos vertebrados. Um racemato de D- e L- metionina, por conseguinte, é geralmente adiciona- do à ração dos animais. L-homocisteina pode ser convertida em L-metionina em animais por transmetilação e pode, portanto, substituir este.

Na técnica anterior, os aminoácidos tais como a metionina são preparados por meio da síntese química. Nessa preparação, a acroleina e o metilmercaptano são primeiro feitos reagir para dar 3-metiltiopropionaldeído, que por sua vez com cianeto, amoníaco e monóxido de carbono conduz a hidantoína. Isto pode, finalmente, ser hidrolizado para o racemato, uma mis- tura equimolar de dois estereoisômeros D- e L-metionina. Uma vez que a forma biologicamente ativa da molécula representa exclusivamente a forma L, a forma D contida na alimentação tem de ser primeiro convertida na forma L ativa no metabolismo, por de- e transaminação.

" * 2/45 Em contraste com a metionina, a maioria dos outros aminoáci- dos proteinogênicos naturais são principalmente preparados por meio da fermentação por meio dos micro-organismos. Este utiliza o fato de que os micro-organismos têm vias de biossíntese adequadas para a síntese dos aminoácidos naturais. Além disso, muitos processos de fermentação obtêm custos de produção muito favoráveis com os edutos e econômicos, tais co- mo glicose e sais minarais e, além disso, proporcionam a forma L biologica- mente ativa do aminoácido em particular.

No entanto, as vias de biossíntese de aminoácidos são sujeitas aumrigoroso controle metabólico em cepas do tipo selvagem, o que garante que os aminoácidos sejam produzidos apenas por exigência própria da célu- . la. Um pré-requisito importante para os processos de produção mais eficien- tes é, por conseguinte, que os micro-organismos adequados estejam dispo- níveis, que, em contraste com os organismos de tipo selvagem, tenham um aumento drástico da produção de saída para a preparação do aminoácido desejado.

Tais micro-organismos que produzem quantidades excessivas de aminoácidos podem ser produzidos por meio dos processos de muta- ção/seleção convencional e/ou por meio das técnicas recombinantes, seg- —“mentadas modernas (engenharia metabólica). Neste último caso, os genes ou alelos que efetuam uma superprodução de aminoácido por meio da sua modificação, a ativação ou inativação são primeiro identificados. Estes ge- nes/alelos são depois introduzidos em uma cepa de micro-organismo ou ina- tivados por meio das técnicas de biologia molecular, de modo que um ex- cesso de produção ideal seja atingido. No entanto, muitas vezes, apenas a combinação de várias medidas diferentes conduz a uma produção verdadei- ramente eficiente.

Em E. coli e C. glutamicum, a L-cisteina é derivada bioquimica- mente a partir de L-serina. A L-Serina é ativada como O-acetilserina por meio da serina CysE acetiltransferase. A O-acetilserina (tiol) liase então transfere o enxofre reduzido sob a forma de sulfureto, como um resultado do qual a L-cisteina é formada. Em contraste com C. glutamicum, a E. coli tem

, , 3/45 duas diferentes O-acetilserina (tiol)-liases, O-acetilserina (tiol) liase B | ("CysM"), também sendo capaz de transferir tiossulfato de O-acetilserina. Como resultado, a S-sulfocisteina é formada, a qual é então dividida em L- cisteina e de sulfito ou de sulfato de um modo que ainda não foi caracteriza- da (Kredich NM (1996), em Neidhardt FC et al. (Ed.) "Escherichia coli e Sal- monella", 2a edição, p. 514 a 527).

L-metionina, juntamente com lisina e treonina, é derivada de as- partato. O enxofre é introduzido na forma de L-cisteína (via cistationina como um produto intermediário) em L-metionina por meio da transsulfurização (em C. glutamícum e E. coli, única rota em E. coli). Em paralelo com este, por | exemplo, em C. glutamicum existe a rota de sulfidrilação direta, na qual o ' sulfureto é assimilado na forma de L-homocisteina (BJ Hwang, HJ Yeom, Kim Y, HS Lee, 2002, J Bacteriol, 184 (5): 1277 a 1286). O grupo C1 da L- metionina origina do metabolismo C1 e ele é transferido para a L-ho- mocisteína por meio das sintases metionina MetE e Meth (revisão: Greene, RC (1996), em Neidhardt FC et al (ed.);"Escherichia coli e Salmonela", 2a edição, p. 542 a 560). A biossíntese de L-Metionina em C. glutamicum é descrita por Rúckert et al. (Rúckert C, Púhler A, Kalinowski J, 2003, J Biote- chnol., 104 (1-3): 213 a 28). As cepas e processos para a produção fermen- tativa de L-metionina foram descritas, por exemplo, para E. coli (WO2006/001616, WO2009/043803) e C. glutamicum (WO2009/144270).

A utilização de tiossulfato como uma fonte de enxofre permite rendimentos teóricos significativamente mais elevados na produção de ami- noácidos contendo enxofre (em comparação com o sulfato de sódio) (Krômer JO, Wittmann, C, H Schrôder, Heinzle E, Metab Eng.. De 2006, 8 (4), pp 353 a 369, e WO2007/020295). A vantagem de tiossulfato é explica- da como se segue: Em sulfato (SO,2º”) o átomo de enxofre está presente no nível de oxidação +6. Para assimilação, a mesma deve ser reduzida ao nível de oxidação -2 (sulfureto = S2-). Para a redução de um sulfato de sulfureto, a célula deve usar dois ATP e NADPH 4 (= 8 elétrons). Em tiossulfato, o á- tomo de enxofre central tem o nível de oxidação cinco, e o átomo de enxofre terminal tem o nível de oxidação -1 (nível médio de oxidação formal dos dois

» : 4/45 átomos de enxofre: 2). Para a redução de ambos os átomos de enxofre de tiossulfato, apenas 8 elétrons são, portanto, necessários, em comparação com 16 elétrons na redução de 2 sulfatos. A utilização de tiossulfato como uma fonte de S para a produção del-cisteinacoma E. coli é descrita por exemplo em DE 10 2007 007 333 e WO2001/27307. Tem sido demonstrado que, em WO2007/077041 produção de L-metionina em E. coli também pode ser significativamente melhorada pelo uso de tiossulfato em vez de sulfato.

Não tem sido até agora ainda demonstrado experimentalmente que a utilização de tiossulfato também conduz a uma melhoria na produção : de L-metionina em C. glutamicum. É mostrado no WO2007/020295 (pág.

240) que com Tiossulfato de Na como uma fonte de enxofre, C. glutamicum forma mais biomassa. Isto foi avaliado como uma indicação do baixo con- sumo de ATP e NADPH. Produção de L-metionina com tiossulfato não foi investigada na prática. Em E. coli, o tiossulfato é retomado por meio do transportador de sulfato/tiossulfato CysPUWA-SBP (Kredich NM (1996), em Neidhardt FC et al. (Ed.) "Escherichia coli e Salmonella", 2a edição, p. 514 a 527). CysP e PAS são duas proteínas de ligação periplásmicas diferentes. CysP tem uma maior afinidade para tiossulfato e SBP tem uma maior afinidade para o sulfa- to. CysA constitui o componente de ligação ao ATP. CysU e CysW são os componentes transmembranares. Em WO2009/043803, a expressão do ope- rona cysPUWAM foi amplificada em E. coli e uma melhoria na produção de — L-metionina foi assim conseguida. Nada se sabe sobre a captação de tios- sulfato em C. glutamicum. Knock out dos mutantes da captação de sulfato putativo do sistema CysZ (cg3112) ainda pode crescer com tiossulfato como a fonte de S (Rúckert C. et al. (2005), BMC Genomics., Vol. 6 (121)). CysZ portanto, não é (apenas) responsável pelo transporte de tiossulfato.

O-acetilserina (tiol) liase B (= CysM, EC 2.5.1.47), faz com que seja possível para a E. coli, para usar tiossulfato como uma fonte de S para a síntese de L-cisteina e L-metionina. A enzima catalisa a formação de S-

: . 5/45 sulfocisteina (RS-SO3) e acetato a partir de O-acetilserina e tiossulfato. S- | Sulfocisteína é depois clivada em L-cisteína e de sulfito ou de sulfato de um modo que não foi até agora caracterizado (Kredich NM (1996), em Neidhardt FC et al. (Ed.) "Escherichia coli e Salmonella", 2a edição, p. 514 a 527). O sulfato é reduzido a sulfito (SO32-), em três etapas por ATP sulfurilase (CysDN), APS quinase (CysC) e (PAPS sulfotransferase CysH). O sulfito é então reduzido ainda mais pelo sulfito redutase NADPH para dar sulfureto (S2-), o qual pode ser usado por O-acetilserina (tiol)-liase Um (CysK) e O- acetilserina (tiol) liase B (CysM) para a síntese de uma segunda molécula de L-cisteina.

C. glutamicum pode crescer em um meio mínimo com tiossulfato ' como uma fonte de enxofre (Rúckert C. et al. (2005), BMC Genomics., Vol. 6 (121)). No entanto, C. glutamicum não tem O-acetilserina (tiol) liase B ("CysM") (Rúckert e Kalinowski (2008) em A. Burkovski (ed.) "Corynebacteri- a: Biologia Genômica e Molecular", Caister Academic Press). O tiossulfato deve ser assimilado de uma outra maneira.

O objetivo da presente invenção é proporcionar um processo e cepas de micro-organismos que tornem possível um maior excesso de ami- noácidos contendo enxofre, em particular de L-metionina.

Este objetivo é conseguido por meio de um processo para a pre- paração fermentativa de aminoácidos contendo enxofre, escolhidos de entre o grupo de L-metionina, L-cisteina, L-cistina, L-homocisteina e L-homo- cistina, que compreende as etapas de: a) fornecimento de um micro-organismo da família Enterobacte- —riaceae, ou de um micro-organismo da família Corynebacteriaceae que tem um aumento da atividade de tiossulfato sulfurtransferase em comparação com a cepa de partida em particular; b) fermentação do micro-organismo a partir de a) em um meio que contém um sal de ácido ditiossulfúrico ou uma mistura de um sal de áci- — do ditiossulfúrico e de um sal de ácido sulfúrico, como uma fonte inorgânica de enxofre, um caldo de fermentação, sendo obtido, e c) concentração de aminoácidos contendo enxofre, no caldo de

* * 6/45 fermentação a partir de b). A presente invenção proporciona ainda um processo para a pre- paração fermentativa de aminoácidos contendo enxofre, escolhidos de entre o grupo de L-metionina, L-cisteíina, L-cistina, L-homocisteina e L-homo- cistina, que compreende as etapas de: a) fornecimento de um micro-organismo da família Enterobacte- riaceae, ou de um micro-organismo da família Corynebacteriaceae que su- perexpressam de um gene que codifica para um polipeptídeo com a ativida- de de um tiossulfato sulfurtransferase; b) fermentação do micro-organismo a partir de a) em um meio i que contém um sal de ácido ditiossulfúrico ou uma mistura de um sal de áci- do ditiossulfúrico e de um sal de ácido sulfúrico, como uma fonte inorgânica de enxofre, um caldo de fermentação, sendo obtido, e c) concentração de aminoácidos contendo enxofre, no caldo de fermentação a partir de b).

Tiossulfato sulfurtransferases, também chamados de "rhodane- ses" (EC 2.8.1.1) são enzimas que transferem o átomo de enxofre reduzido a partir de tiossulfato de cianeto (CN-).

Algumas tiossulfato de sulfurtransferases também podem trans- feriro átomo de enxofre reduzido a substratos alternativos, por exemplo, di- hidrolipoato (Alexander K., Volini M, 1987, J. Biol Chem, 262: 6595 a 6604). Na base de dados "Agrupamentos de Grupos de ortólogos de proteínas" (COG), 168 os homólogos sulfurtransferases em todos os três domínios da vida são atualmente verificados na categoria COGO0607" sulfurtransferase relacionada à rodanase" (Tatusov RL, Fedorova ND, Jackson JD, Jacobs AR, Kiryutin B, Koonin EV, Krilov DM, Mazumder R, Mekhedov SL, Nikolska- ya AN, Rao BS, Smirnov S, Sverdlov AV, Vasudevan S, Wolf YI, Yin JJ, Na- tale DA, 2003, BMC Bioinformatics, 04: 41; httpo:// www.ncbi.nlm.nih. gov/COG/). A rodanase tem um ou mais domínios rodanase semelhantes característicos (base de dados PEAM PFOOS81, http: //pfam.sanger.ac.uk/; Gliubich F, M Gazerro, Zanotti G, S Delbono, Bombieri G, R Berni, 1996, J Biol Chem., 271 (35): 21054 a 61).

' h 7/45 O gene RDL2 (proteína do tipo rodanase) a partir de Saccha- romyces cerevisiae códigos S288c Rdl2p para a proteína de 149 aminoáci- dos de comprimento. Ele tem um domínio do tipo rodanase (banco de dados PFAM PFOOS581, http: //pfam.sanger.ac.uk/). Tem sido demonstrado experi- mentalmente que é um Rdl2p tiossulfato sulfurtransferase (rodanase, EC

2.8.1.1; Foster MW, Forrester MT, Stamler JS, 2009, Proc Natl Acad Sci EUA, 106 (45): 18948 a 53). SEQ ID NO: 1 mostra a sequência de DNA do gene RDL2. SEQ ID NO: 2 mostra a sequência de aminoácidos da proteína codificada por Rdl2p RDL2.

A E. coli tem, para além da bem caracterizada rhodaneses GIpE e PSPE (Adams H, Teertstra W, Koster M, Tommassen J, 2002, FEBS Lett. 518: 173 a 6), mais sete enzimas parálogas com domínios semelhantes ro- danase (Cheng H, Donahue JL, Battle SE, Ray WK, Larson TJ, 2008, Open Microbiol J., 2: 18 a 28): YgaP rodanase tem um domínio semelhante no Terminal N e dois domínios transmembranares. Ele mostra em atividade rodanase vitro (Ahmed, F., 2003, Dissertação).

YbbB é um RNAt selenouridina 2-sintase e tem um domínio do tipo rodanase no Terminal N (Wolfe MD, Ahmed F, Lacourciere GM, Lauhon CT,CT Stadtman, Larson TJ, 2004, J Biol Chem, 279 (3): 1,801 a1809).

Thil é necessário para a síntese de tiamina e desempenha um papel na conversão de uridina em tiouridina na posição 8 de RNAt (Palen- char PM, Buck CJ, Cheng H, Larson TJ, Mueller, EG, 2000, J Biol Chem., 275 (12): 8283 a 8286).

SseA é um 3 mercaptopivurato: cianeto sulfurtransferase, que preferencialmente transfere 3-mercaptopivurato em vez de tiossulfato de ci- aneto (R Colnaghi, Cassinalli L, M Drummond, Forlani F, Pagani S, 2001, FEBS Lett, 500 (3): 153 -. 156). A enzima tem dois domínios rodanase se- melhantes.

Os códigos ORF ynjE para uma sulfurtransferase putativa com três domínios do tipo rodanase (hanzelmann P, Dahl JU, Kuper J, Urban A, Múller-Theissen U, Leimkúhler S, Schindelin H., 2009, Proteína Sci, 18 (12).:

x í 8/45 2480 a 2491). Os códigos yibN ORF para uma sulfurtransferase putativa com um domínio do tipo rodanase No terminal C. Os códigos yceA ORF para uma sulfutransferase putativa com umdomínio do tipo rodanase.

Em Corynebacterium glutamicum, pelo menos sete códigos para ORFs presumem sulfurtransferases: ORF Thtr (= cgo0803, NCgl0671) codifica para uma sulfutransfe- rase putativa com dois domínios rodanase semelhantes e um comprimento de301 aminoácidos.

ORF sseA2 (= cg1613, NCgl1369) codifica uma sulfutransferase putativacom dois domínios rodanase semelhantes e um comprimento de 289 aminoácidos.

ORF cg3000 (= NCgl2616) codifica uma sulfutransferase putati- vecom um domínio rodanase semelhante e um comprimento de 96 aminoá- cidos.

ORF cg0oo73 (= NCgl0053) codifica uma sulfutransferase putati- ve com um domínio rodanase semelhante e um comprimento de 97 aminoá- cidos.

ORF cg0o074 (= NCgl0054) codifica uma sulfutransferase putati- ve com um domínio rodanase semelhante e um comprimento de 197 amino- ácidos.

ORF sseA1 (= cg3073, NCgl2678) codifica uma sulfutransferase putative com dois domínios rodanase semelhantes e um comprimento de 274 aminoácidos.

ORF cg3319 (= NCglI2890) codifica uma sulfutransferase putati- ve com um domínio rodanase semelhante e um comprimento de 312 amino- ácidos.

O tiossulfato sulfurtransferase de bovinos (Bos taurus) tem dois —domínios rodanase semelhantes e é bem caracterizado (Cannella C, Costa M, Pensa B, Ricci G, Pecci L, Cavallini D., 1981, Eur J Biochem., 119 (3): 491 a 495).

* ' 9/45 Em uma modalidade preferida do processo, o micro-organismo superexpressa um ou mais gene (s) que codifica para um polipeptídeo com a atividade de um tiossulfato sulfurtransferase, o polipeptídeo com a atividade de um tiossulfato sulfurtransferase sendo escolhido a partir do seguinte a) a d: a) um polipeptídeo que contém ou consite em polipeptídeos R- di2p, GIpE, PSPE, YgaP, ti, YbbB, SSEA, YnjE, YceA, YibN, NCglo671, NCgl1369, NCgI2616, NCgI0053, NCgI0054, NCgl2678, NCgl2890; tiossulfa- to sulfurtransferase de mamíferos, por exemplo, o tiossulfato sulfurtransfera- sea partir do fígado de bovino (Bos taurus), de preferência Rdl2p, GIpE, PSPE e particularmente preferencialmente Rdl2p; : b) um polipeptídeo que consiste em, ou que contém a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2; c) um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é idêntica à excepa de 70% ou mais com a sequência de aminoácidos de a) ou b), o que tem atividade tiossulfato de sulfurtransferase de polipeptídeo; d) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos con- tendo uma eliminação, substituição, inserção e/ou adição de 1 a 45 resíduos de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos mostrada na SEQ IDNO:2,o polipeptídeo tendo a atividade de tiossulfato de sulfurtransferase.

Como mencionado acima na presente invenção, os polipepti- deos com a atividade de um tiossulfato sulfurtransferase também incluem variantes das enzimas mencionadas em a) ou b), com uma sequência de aminoácidos que é idêntica ao ponto de 70% ou mais com a sequência de aminoácidos das sequências mencionadas sob a) ou b), as variantes com atividade tiossulfato de sulfurtransferase. As modalidades preferidas incluem variantes que são pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênti- cas às sequências de aminoácidos descritas acima, isto é, em que pelo me- —nos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% das posições dos aminoácidos são idênticos aos das sequências de aminoácidos descritas acima. A per-

' ' 10/45 centagem de identidade é de preferência calculado sobre o comprimento : total da região de aminoácidos ou de ácido nucleico. Um certo número de programas com base em um grande número de algoritmos está disponível para a pessoa que é versada na técnica para comparação de sequências.

Neste contexto, os algoritmos de Needleman e Wunsch ou Smith e Water- man dão resultados particularmente fiáveis. Para o alinhamento das sequên- cias, o programa PileUp (J. Mol. Evolution, 25, 351 a 360, 1987, de Higgins et al, CABIOS, 5 1989: 151 a 153), ou a programas Gap e BestFit [Needle- man e Wunsch (J. Mol Biol 48, 443 a 453 (1970)) e Smith e Waterman (Adv.

—Appl Math 2, 482 a 489 (1981))], que pertencem ao pacote de software GCG [Genetics Computer Group, 575 Ciência Drive, Madison, Wisconsin, EUA 53711 (1991)] estão disponíveis. Os valores percentuais apresentados aci- ma para a identidade de sequência são de preferência calculados sobre a totalidade da região de sequência com o programa GAP.

Os polipeptídeos com a atividade de um tiossulfato sulfurtransfe- rase, além disso, também incluem os fragmentos das enzimas mencionadas em a) ou b). Estes fragmentos tem a atividade descrita acima. Um fragmento de um polipeptídeo com a atividade de um tiossulfato sulfurtransferase no contexto do presente pedido de patente contém preferivelmente pelo menos —30,pelomenos 50, ou pelo menos 80 resíduos de aminoácidos consecutivos de uma das sequências de aminoácidos mencionadas acima na presente invenção.

Como mencionado acima na presente invenção, os polipepti- deos com a atividade de um tiossulfato sulfurtransferase também incluem as variantes das enzimas mencionadas em a) ou b) que têm uma sequência de aminoácidos contendo uma eliminação, substituição, inserção e/ou adição de 1 a 45 resíduos de aminoácidos no que diz respeito à sequência de ami- noácidos mostrada na SEQ ID NO: 2, o polipeptídeo ao qual tem a atividade tiossulfato de sulfurtransferase. Em modalidades preferidas, a sequência de — aminoácidos contém uma deleção, substituição, inserção e/ou adição de 1 a 40, ainda mais preferivelmente de 1 a 30, ainda mais preferencialmente de 1 a 20, de preferência de 1 a 15, ainda mais preferencialmente desde 1 a 10 e

, t 11/45 mais preferencialmente desde 1 até 5 resíduos de aminoácidos em relação à ] sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2.

Em um outro processo preferido, o polipeptídeo é codificado por meio de um gene que inclui a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, que corresponde à sequência do tipo selvagem do gene RDL2 de Saccha- romyces cerevisiae S288c.

Além disso, é preferível para o polipeptídeo a ser codificado por meio de um gene, que inclui a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3. A utilização de códons é aqui ligeiramente adaptada à do E. coli.

Em um outro processo preferido, o polipeptídeo é de um gene i que inclui a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 4. A utilização de : códons aqui é mais altamente adaptada à de E. coli.

Além disso, é preferível para o polipeptídeo a ser codificado por meio de um gene, que inclui a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 5.

A utilização de códons aqui é completamente adaptada à da E. coli.

Na realização do processo de acordo com a presente invenção, a expressão do gene que codifica para um polipeptídeo com a atividade de um tiossulfato de sulfurtransferase é de preferência um aumento de uma ou mais das seguintes medidas: a) A expressão do gene está sob o controle de um promotor que, no micro-organismo utilizado no processo, conduz a uma expressão amplifi- cada em comparação com a cepa de partida. Neste contexto, por exemplo, um promotor GAPDH constitutivo do gene GAPA de Escherichia coli, ou um induzível lac, tac, tre, lambda, o promotor tet ou ARA podem ser utilizados (revisão: Makrides SC Micro-biol Rev. 1996 setembro, 60 (3): 512 a 38).

b) O número de cópias do gene que codifica para um polipepti- deo com a atividade de um tiossulfato de sulfurtransferase é aumentada em comparação com a cepa de partida. Isto pode ser conseguido, por exemplo, através da inserção do gene para plasmídeos com um aumento do número de cópias, ou integrando o gene no cromossoma do micro-organismo em várias cópias (Baneyx F, 1999, Curr. Opin. Biotechnol. 10, 411 421).

c) A expressão do gene é efetuada utilizando um local de ligação

, ' 12/45 ao ribossoma, o que leva a um aumento da tradução no micro-organismo utilizado no processo em comparação com a cepa de partida (Makrides SC Microbiol Rev. setembro 1996, 60 (3.): 512 a 38). d) A expressão do gene é amplificada por meio da otimização da utilização do códon do gene em relação ao micro-organismo utilizado para o processo (Welch, Villalobos, Gustafsson e Minshull, JR Soe Interface, 2009, 6: S467-76). O índice de adaptação códon (CAI), por exemplo, é apropriada como uma medida da adaptação da utilização de códons de um gene de um organismo (da Sharp PM, Li WH, 1987, Nucleic Acids Res., 15 (3): 1,281 a 95). e) A expressão do gene é amplificada por meio da redução das : estruturas secundárias de MRNA no mRNA transcrito por meio do gene (Ku- dla L, Murray AW, Tollervey D, Plotkin JB, Ciência 2009 Abr 10;. 324 (5924): 255-8, Welch, Villalobos, Gustafsson e Minshull, JR Soc Interface, 2009, 6: S467a76). f) A expressão do gene é amplificada por meio da eliminação da RNA polimerase terminadores no mRNA transcrito por meio do gene (Welch, Villalobos, Gustafsson e Minshull, JR Soe Interface, 2009, 6: S467 a 76). g) A expressão do gene é efetuada utilizando as sequências de —MRNA de estabilização no mMRNA transcrito por meio do gene (TA Carrier, Keasling JD, Biotechnol Prog, 1997, Nov-Dez;. 13 (6): 699 a 708). A sequên- cia MRNAst17 pode ser mencionado como um exemplo para a estabilização do MRNA do gene METF de E. coli (WO2009/043803). Em uma outra modalidade do processo de acordo com a presen- te invenção, é preferível que o sal de ácido ditiossulfúrico seja um sal esco- lhido de entre o grupo de sal de metal alcalino, sal de metal alcalino terroso, sal de amônio e as suas misturas, preferivelmente os sais de amônio.

Além disso, é preferível que o sal do ácido sulfúrico seja um sal escolhido de entre o grupo de sal de metal alcalino, sal de metal alcalino ter- —roso, sal de amônio (e suas misturas), de preferência o sal de amônio.

Preferencialmente, a concentração do sal de ácido ditiossulfúrico no meio ou no caldo de fermentação é de 0,05 g/kg a 100 g/kg, de preferên-

. " 13/45 cia de 0,1 g/kg a 20 g/kg e particularmente de preferência de 0,2 g/kg a 12 g/ i kg.

Em um processo preferido, a concentração do sal de ácido diti- ossulfúrico no meio ou no caldo de fermentação durante a fermentação é —mantidoa pelomenos 0,05 g/kg a 100 g/kg, de preferência de 0,1 g/kg a 20 9/kg e particularmente de preferência de 0,2 g/kg a 12 g/kg.

Em um outro processo preferido, durante a fermentação, o teor de sal de ácido ditiossulfúrico, com base no teor total de enxofre inorgânico no meio e no caldo de fermentação, é mantida a, pelo menos, 5% em mol.

O processo de acordo com a presente invenção pode ser con- cebido como um processo descontínuo, o processo em lote alimentado, re- petindo o processo descontínuo alimentado e o processo contínuo.

O aminoácido contendo enxofre pode, também, ser obtido a par- tir do caldo de fermentação, como um produto sólido ou na forma dissolvida em um produto líquido.

Em um processo preferido da presente invenção, o aminoácido contendo enxofre a ser produzido é a L-metionina.

Além disso, é preferível que o micro-organismo seja do gênero Escherichia, de preferência, particularmente as espécies de Escherichia coli.

Em um processo alternativo, o micro-organismo é o gênero Corynebacterium, em particular de preferência as espécies Corynebacterium glutamicum.

Em um processo particularmente preferido da presente inven- ção, o micro-organismo é escolhido a partir de: - Corynebacterium glutamicum com um aumento da atividade e/ou a expressão de aspartato quinase e atenuação ou eliminação da prote- Ína reguladora McbR em comparação com a cepa de partida; - Escherichia coli com o aumento da atividade e/ou a expressão de aspartato quinase e atenuação ou eliminação da proteína reguladora MetJ em comparação com a cepa de partida.

A presente invenção proporciona ainda um micro-organismo es- colhido a partir de

. f 14/45 - Corynebacterium glutamicum com um aumento da atividade e/ou a expressão de aspartato quinase e atenuação ou eliminação da prote- ina reguladora McbR em comparação com a cepa de partida; - Escherichia coli com o aumento da atividade e/ou a expressão de aspartato quinase e atenuação ou eliminação da proteína reguladora MetJ em comparação com a cepa de partida; em que o micro-organismo produz ou segrega a L-metionina, e em que o micro-organismo tem um aumento da atividade de tiossulfato sul- furtransferase em comparação com a cepa de partida particular.

A presente invenção proporciona, além disso, um micro- organismo escolhido a partir de : - Corynebacterium glutamicum com um aumento da atividade e/ou a expressão de aspartato quinase e atenuação ou eliminação da prote- ina reguladora McbR em comparação com a cepa de partida; - Escherichia coli com o aumento da atividade e/ou a expressão de aspartato quinase e atenuação ou eliminação da proteína reguladora MetJ em comparação com a cepa de partida; em que o micro-organismo produz ou segrega a L-metionina, e em que o micro-organismo superexpressar um gene que codifica para um —polipeptídeo com a atividade de um tiossulfato sulfurtransferase.

A cepa de C. glutamicum, que segrega ou produz a L-metionina, tem de preferência um aumento da atividade enzimática da aspartato quina- se (EC 2.7.2.4), os alelos de feedback resistentes sendo preferidos. Nas Corynebacterium, este aspartato quinase codificado por meio do gene IlysC.

—Devidoà atenuação ou eliminação da McbR proteína reguladora (que é codi- ficada por meio do gene mcbR), um aumento na utilização de enxofre, além disso, tem lugar. McbR é o repressor de toda a cascata de utilização de en- xofre em C. glutamicum (Rey DA, Nentwich SS, Koch DJ, Rúckert C, Púhler A, Tauch A, Kalinowski J., Mol. Microbiol, 2005,56 (4):. 871 a 887).

A cepa de E. coli que produz ou segrega a L-metionina, tem de preferência um aumento da atividade enzimática da aspartato quinase (EC

2.7.2.4), os alelos de feedback resistentes sendo preferidos. Em E. coli, há

. t 15/45 três quinases aspartato diferentes as quais são codificadas por meio dos i genes Thra, metl ou IlysC. Devido à atenuação ou eliminação da proteína reguladora MetJ, que é codificada por meio do gene metJ, um aumento na biossíntese de L-metionina, além disso, tem lugar. MetJ é o principal repres- — sorda biossíntese de L-metionina em E. coli.

Além disso, é preferível que esse micro-organismo venha a su- perexpressar um ou mais gene (s) que codifica para um polipeptídeo com a atividade de um tiossulfato sulfurtransferase, o polipeptídeo com a atividade de um tiossulfato de sulfurtransferase sendo escolhido entre os seguintes: a) ad): a) um polipeptídeo que contém ou consite em polipeptídeos R- di2p, GIpE, PSPE, YgaP, ti, YbbB, SSEA, YnjE, YceA, YibN, NCglo671, NCgl1369, NCgI2616, NCgI0053, NCgIO0S54, NCgl2678, NCgl2890; tiossulfa- to sulfurtransferase de mamíferos, por exemplo, o tiossulfato sulfurtransfera- sea partir do figado de bovino (Bos taurus), de preferência Rdl2p, GIpE, PSPE e particularmente preferencialmente Rdl2p; b) um polipeptídeo que consiste em, ou que contém a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2; c) um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é idêntica à excepa de 70% ou mais com a sequência de aminoácidos de a) ou b), o que tem atividade tiossulfato de sulfurtransferase de polipeptídeo; d) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos con- tendo uma eliminação, substituição, inserção e/ou adição de 1 a 45 resíduos de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos mostrada na SEQ IDNO:2,0o polipeptídeo ao qual tem a atividade tiossulfato de sulfurtransfe- rase.

A cepa de partida do micro-organismo, além disso, é de prefe- rência derivada a partir do grupo que consiste em Escherichia coli MG1655, Escherichia coli N3110, Escherichia coli DH5a, DH10B de Escherichia coli, — Escherichia coli, Escherichia coli BI2952 REL606, Corynebacterium gluta- micum ATCC13032, R Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium glu- tamicum DSM20411 (antigo nome Brevibacterium flavum), Corynebacterium

. : 16/45 glutamicum DSM20412 (antigo nome Brevibacterium lactofermentum), Cory- nebacterium glutamicum DSM1412 (antigo nome Brevibacterium lactofer- mentum), Corynebacterium efficiens YS-314T (= DSM44549), Corynebacte- rium glutamicum ATCC21608, Corynebacterium glutamicum DSM17322.

Uma outra cepa que produz ou segrega a L-metionina é, por e- xemplo, a produção de cepa de E. coli MG1655 AmetJ Ptrc-meth-Ptrc METF PtrcF-cysPUWAM PtreF-cysJIH Ptrco9-gevTHP contendo o plasmídeo de produção pME101-Thra * 1-cysE -Pgap-meta * 11 (WO2009/043803).

A clonagem da produção de E. coli da cepa MG1655AmetJ Ptrc- Meth Ptre-METF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrco9-gcvTHP é descrita no pedido de patente WO2009/043803. A cepa é baseada na cepa do tipo h selvagem de E. coli KI2 MG1655. As seguintes modificações foram introdu- zidas no genoma desta cepa: * O gene para o repressor de biossíntese L-metionina metJ foi e- liminado.

* A montante do gene Meth (codifica para metionina sintase de- pendente de cobalamina), foi inserida o promotor trc potente.

* A montante do gene METF (códigos de 5,10-metileno- redutase), foi inserido o promotor trc potente.

* A montante do operona cysPUWAM, foi inserido o promotor TRCF potente. cysPUWA códigos para um sulfato/tiossulfato de absorção transportador. cysM códigos de cisteína de sintase B.

* A montante do operona cysJIH, foi inserido o promotor TRCF potente. cysJI códigos de sulfito redutase e códigos cysH para 3'-sulfato fos- foadenilil redutase.

* A montante do operona gcvTHP, foi inserido o promotor poten- te trc09. gcvt, gevH e gevP código para os três componentes do sistema de clivagem glicina.

A clonagem do plasmídeo de E. coli de produção pME101-Thra * —1-cysE-Pgap-meta * 11 é descrita nos pedidos de patente WO2007/077041. Trata-se de um plasmídeo com um baixo número de cópias (baixo número de cópias de plasmídeo) com base no vetor pCL 1920 (Lerner, CG e Inouye,

" : 17/45 M., Nucl Acids Res. (1990) 18: 4631 [ PMID: 2201955 ]..). O plasmídeo PME101 vazia tem o gene laclg, que codifica para um alelo altamente ex- presso do repressor lac.

O gene Thra * 1 foi clonado a jusante de um promo- tor de trc potente que pode ser reprimido por meio do repressor lac.

Ele codi- ficauma variante resistente a realimentação da aspartato quinase/Thra ho- moserina desidrogenase de E. coli.

Na mesma orientação depois de ela se encontra o gene cysE juntamente com o seu promotor natural.

Ele codifica a serina acetiltransferase de E. coli.

A jusante do cysE, o promotor GAPA po- tente de E. coli se segue, o qual controla a expressão do gene da Meta * 11. Meta*11 codifica uma variante de feedback resistente de homosserina O- succiniltransferase de E. coli. . As cepas seguintes podem ser mencionadas como exemplos de outros micro-organismos que segregam ou produzem a L-metionina: - C. glutamicum M1179 (= DSM17322) (WO2007/011939) - E. coli TFA4076BJF Meta n º 10 + metiX (LM) (WO2008/127240, página 46); - E. coli W3110AJ/pKP451 (EP 1 445 310 B1, página 7 4 ex.) - E. coli WAthrBCAmetJmetK32 pMWPthrmetA445A89 (Yoshihiro Usuda e Osamu Kurahashi, 2005, Applied and Environmental Microbiology, vol71,nº6,p3228a3234) - W3110/pHC34 (WO01/27307 página 13, ex 3.). Outros exemplos de vários micro-organismos adequados são descritos por Gomes et al. (Enzyme Microbial Tecnologia e 37 (2005), 3 a 18). Em outras modalidades preferidas, a bactéria que produz a L- metionina tem uma ou mais características escolhidas dentre o grupo de: 1) —polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para um ou mais componentes do sistema de transporte tiossulfato | sulfato CysPU- WA (EC 3.6.3.25), 2) —polinucleotíideo que superexpressa o qual codifica para a redutase de 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosulfato CysH (EC 1.8.4.8), 3) —polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para um

. ' 18/45 ou mais componentes da redutase de sulfito CysJI (EC 1.8.1.2), 4) —polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para a sintase de cisteina A CysK (EC 2.5.1.47), 5) —polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para a sintasede cisteina B CysM (EC 2.5.1.47), 6) —polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para a acetiltransferase de serina CysE (EC 2.3.1.30), 7) —polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para um ou mais componentes do sistema de clivagem de glicina GcvTHP-Lpd (EC

21.210 ,EC1442,EC 18.14), 8) — polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para a . sintase lipoil LipA (EC 2.8.1.8), 9) —polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a proteína lipoil ligase LipB (EC 2.3.1.181), 10) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para um fosfoglicerato de dehidrogenase SerA (EC 1.1.1.95), 11) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a 3- fosfoserina fosfatase SerB (EC 3.1.3.3), 12) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a 3- fosfoserina/fosfohidroxitreonina aminotransferase SerC (EC 2.6.1.52), 13) polinucleotíideo que superexpressa o qual codifica para a serina hidroximetiltransferase GIyA (EC 2.1.2.1), 14) polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para uma aspartoquinase | e homoserina dehidrogenase | ThrA (EC 2.7.2.4, EC 258 1113) 15) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para um aspartato quinase LysC (EC 2.7.2.4), 16) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a homoserina dehidrogenase Hom (EC 1.1.1.3), 17) polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para a homoserina O-acetiltransferase MetX (EC 2.3.1.31), 18) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a

* : 19/45 homoserina O-succiniltransferase MetA (EC 2.3.1.46), 19) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a cistationina gamma-sintase MetB (EC 2.5.1.48), 20) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a B- —C-S-liaseAecD (EC 4.4.1.8, também chamada de beta-liase), 21) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a cistationina beta-liase MetC (EC 4.4.1.8), 22) polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para a Homocisteína independente de B12 de S-metiltransferase MetE (EC

211.14), 23) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a : Homocisteína dependente de B12 de S-metiltransferase MetH (EC 2.1.1.13), 24) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a metilenotetrahidrofolato redutase MetF (EC 1.5.1.20), 25) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para um ou mais componentes do L-metionina exporter BrnFE a partir de Corynebac- terium glutamicum, 26) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para um ou mais componentes da valina exporter YgaZH a partir de Escherichia coli (b2682,b2683), 27) polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para o transportador putativo YjeH a partir de Escherichia coli (Db4141), 28) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para um ou mais componentes do nucleotídeo piridina transhidrogenase PntAB (EC 1612), 29) polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para uma O-succinilhomoserina sulfhidrilase MetZ (EC 2.5.1.48), 30) polinucleotíideo que superexpressa o qual codifica para a fosfoenolpivurato carboxilase Pyc (EC 4.1.1.31).

As características preferidas na presente invenção são uma ou mais escolhidas a partir do grupo: 1) — polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para um

" ' 20/45 ou mais componentes do sistema de transporte tiossulfato | sulfato CysPU- WA (EC 3.6.3.25), 2) —polinucleotíideo que superexpressa o qual codifica para a 3"-fosfoadenosina 5'-fosfosulfato redutase CysH (EC 1.8.4.8), 3) —polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para um ou mais componentes do sulfito redutase CysJI (EC 1.8.1.2), 4) —polinucleotíideo que superexpressa o qual codifica para a sintase de cisteina A CysK (EC 2.5.1.47), 5) —polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a sintase de cisteina B CysM (EC 2.5.1.47), 6) —polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a . acetiltransferase de serina CysE (EC 2.3.1.30), 7) —polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para um ou mais componentes do sistema de clivagem de glicina GcvTHP-Lpd (EC

21.210,EC 1442, EC 1.8.1.4), 8) —polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para a sintase lipoil LipA (EC 2.8.1.8), 9) —polinucleotíideo que superexpressa o qual codifica para a proteína lipoil ligase LipB (EC 2.3.1.181), 10) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para um fosfoglicerato dehidrogenase SerA (EC 1.1.1.95), 11) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a 3- fosfoserina fosfatase SerB (EC 3.1.3.3), 12) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a 3- fosfoserina/fosfohidroxitreonina aminotransferase SerC (EC 2.6.1.52), 13) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a serina hidroximetiltransferase GIyA (EC 2.1.2.1), 14) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para an aspartoquinase | e homoserina dehidrogenase | ThrA (EC 2.724, EC 1113), 15) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para an aspartate quinase LysC (EC 2.7.2.4),

. . 21/45 16) polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para a i homoserina dehidrogenase Hom (EC 1.1.1.3), 17) polinucleotíideo que superexpressa o qual codifica para a homoacetiltransferase de serina MetX (EC 2.3.1.31), 18) polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para a homoserina O-transsuccinilase MetA (EC 2.3.1.46), 19) polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para a cistationina gamma-sintase MetB (EC 2.5.1.48), 20) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a B- —C-S-liase AecD (EC 4.4.1.8, também chamada de beta-liase), 21) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a : cistationina beta-liase MetC (EC 4.4.1.8), 22) polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para a Homocisteina independente de B12 de S-metiltransferase MetE (EC

211.14), 23) polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para a Homocisteína dependente de B12 de S-metiltransferase MetH (EC 21.1.13), 24) polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para a metilenetetrahidrofolate redutase MetF (EC 1.5.1.20).

As características mais particularmente preferidas na presente invenção são escolhidas a partir do grupo: 1) —polinucleotíideo que superexpressa o qual codifica para an aspartoquinase | e homoserina dehidrogenase | ThrA (EC 2.7.24, EC

1.1.1.3), 2) —polinucleotíideo que superexpressa o qual codifica para an aspartate quinase LysC (EC 2.7.2.4), 3) —polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para a homoserina dehidrogenase Hom (EC 1.1.1.3), 4) —polinucleotíideo que superexpressa o qual codifica para a —homoacetiltransferase de serina MetX (EC 23:1:31), 5) —polinucleotíideo que superexpressa o qual codifica para a homoserina O-transsuccinilase MetA (EC 2.3.1.46),

. . 22/45 6) —polinucleotíideo que superexpressa o qual codifica para a cistationina gamma-sintase MetB (EC 2.5.1.48), 7) —polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a B- C-S-liase AecD (EC 4.4.1.8, também chamada de beta-liase), 8) — polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para a cistationina beta-liase MetC (EC 4.4.1.8), 9) —polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a Homocisteína independente de B12 de S-metiltransferase MetE (EC

211.14), 10) polinucleotideo que superexpressa o qual codifica para a i Homocisteíina dependente de B12 de S-metiltransferase MetH (EC 2.1.1.13), : 11) polinucleotídeo que superexpressa o qual codifica para a metilenetetrahidrofolate redutase MetF (EC 1.5.1.20). Tendo em vista melhorar a produção de L-metionina em C. glu- tamicum, é totalmente concebível realçar um ou mais genes selecionados a partir do grupo de: a) um gene pgique codifica para glicose 6-fosfato isomerase (Pgi, EC no. 5.3.1.9), b) um gene thrB que codifica para homoserina quinase (ThrB, ECno 2.7.1.39), c) um gene metK que codifica para S-adenosilmetionina sin- tase (MetK, EC no. 2.5.1.6), d) um gene dapA que codifica para dihidrodipicolinato sintase (DapA, EC no. 4.2.1.52), e) um gene pck que codifica para fosfoenolpivurato carboxi- quinase (Pck, EC no. 4.1.1.49), fi um gene cg3086 que codifica para cistationina y-liase (Cg3086, EC no. 4.4.1.1), 9) um gene cg2344 que codifica para cistationina B-sintase (Cg2344,EC no 4.2.122), h) um gene cg3031 que codifica para a proteína reguladora Cg3031,

" S 23/45 |) —umgenemcbR que codifica para a trascrição reguladora de biosíntese de L-metionina (McbR), )) um gene metQ que codifica para uma subunidade do transportador de L - metionina (MetQNI), k) um gene metN que codifica para uma subunidade do trans- portador de L - metionina (MetQNI), 1) um gene metl que codifica para uma subunidade do trans- portador de L - metionina (MetQNI), m) um gene metP que codifica para o transportador de L - me- tionina(MetP). | Tendo em vista melhorar a produção de L-metionina em E. coli, s é totalmente concebível realçar um ou mais genes selecionados a partir do grupo de: a) um gene metJ(b3938, ECK3930) que codifica para a tras- crição reguladora de biosíntese de L-metionina (MetJ), b) umgene pgi(b4025, ECK4017) que codifica para glicose 6- fosfato isomerase (Pgi, EC no. 5.3.1.9), c) um gene thrB (b0003, ECKOOO3) que codifica para homo- serina quinase (ThrB, EC no. 2.7.1.39), d) um gene metK (b2942, ECK2937) que codifica para S- adenosilmetionina sintase (MetK, EC no. 2.5.1.6), e) um gene dapA (b2478, ECK2474) que codifica para dihi- drodipicolinate sintase (DapA, EC no. 4.2.1.52), fl um gene pck (b3403, ECK3390) que codifica para fosfoe- —nolpivurato carboxiquinase (Pck, EC no. 4.1.1.49), g) um gene purU (b1232, ECK1227) que codifica para formil- tetrahidrofolato hidrolase (PurU, EC no. 3.5.1.10), h) um gene pykA (b1854, ECK1I855) que codifica para pivura- to quinase Il (PykA, EC no. 2.7.1.40), ) um gene pykF (b1676, ECK1I672) que codifica para pivura- to quinase | (PykF, EC no. 2.7.1.40), )) um gene metQ (b0197, ECK0197) que codifica para uma

. ' 24/45 subunidade do transportador de L - metionina (MetQNI), i k) um gene metl (b0198, ECKO0198) que codifica para uma subunidade do transportador de L - metionina (MetQNI), D) um gene metN (b0199, ECKO0199) que codifica para uma —subunidade do transportador de L - metionina (MetQNI), m) um gene dcd (b2065, ECK2059) que codifica para deoxici- tidina 5'-trifosfato deaminase (Dcd, EC no. 3.5.4.13), n) um gene yncA (b1448, ECK1442) que codifica para N- aciltransferase putativa (YncA, Metabolic Explorer WO2010/020681), o) um gene fnrS (b4699, ECK4511) que codifica para o SRNA regulatório FnrS. . Descrição detalhada da presente invenção A presente invenção refere-se a um processo para a preparação fermentativa de aminoácidos contendo enxofre escolhidos de entre o grupo de L-metionina, L-cisteina, L-cistina, L-homocisteina e L-homocistina. O pro- cesso é realizado com um micro-organismo da família Enterobacteriaceae, ou com um micro-organismo da família Corynebacteriaceae que superex- pressa um gene que codifica para um polipeptídeo com a atividade enzimáti- ca de um tiossulfato sulfurtransferase.

O termo"gene" significa uma seção no ácido desoxirribonucleico (DNA), que contém a informação para a produção (transcrição), primeiro de um ácido ribonucleico (RNA), e a esta informação para a produção (tradu- ção) de uma proteína (polipeptídeo), aqui um polipeptídeo com a atividade de um tiossulfato sulfurtransferase. O fato de um gene ou de um polinucleo- tídeo contém a informação para a produção de uma proteina é também chamado de codificação de uma proteína ou polipeptídeo por meio do gene ou do RNA. Os genes endógenos ou polinucleotídeos são entendidos como significando que as estruturas de leitura aberta (ORF), genes ou alelos des- tes ou polinucleotídeos presentes na população de uma espécie. Os ter- —mos"gene" e"”ORF" (moldura de leitura aberta) são usados como sinônimos na presente invenção.

O termo"polinucleotídeo" refere-se, em geral, e polidesoxirribo-

é . 25/45 nucleotídeos, polirribonucleotídeos, que pode ser RNA não modificado ou DNA ou RNA ou DNA modificado. O termo "polipeptídeo" indica que os peptídeos ou proteínas que contêm dois ou mais aminoácidos unidos através de ligações peptídicas. Os termos de polipeptídeos e proteínas são usados como sinônimos. As proteí- nas pertencem às unidades de base de todas as células. Eles não só confe- rem à estrutura celular, mas são as "máquinas" moleculares que transportam as substâncias, catalisam as reações químicas e reconhecer substâncias sinal.

"Aminoácidos proteinogênicos" são entendidos como significan- do que os aminoácidos que ocorrem em proteínas naturais, isto é, de proteí- nas em micro-organismos, plantas, animais e seres humanos. Estes inclu- em, em particular, os ácidos L-aminoácido escolhido de entre o grupo de ácido L-aspártico, L-asparagina, L-treonina, L-serina, L-ácido glutâmico, L- glutamina, glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptofano, L-prolina e L-arginina, bem como a selenocisteína. Neste contexto, os aminoácidos ácidos são sempre a-amino proteinogênico. Para além do aminoácido glici- na, para todos os aminoácidos proteinogênico o átomo de carbono a é assi- métrico (as moléculas são quirais): Existem dois enantiômeros de cada um destes aminoácidos. Neste contexto, apenas um dos dois enantiômeros é proteinogênicos, e, de fato, o ácido L-aminoácido: o aparelho necessário para a constituição das proteínas - no ribossoma, o RNAt, a aminoacil-RNAt- sintetase (carrega o RNAt com aminoácidos) e outros - também são eles próprios quirais e podem reconhecer apenas as variantes de L-.

O termo "expressão do gene" ("expressão" para abreviar), em geral, indica a expressão da informação genética para formar um fenótipo. No sentido mais restrito, a expressão do gene indica a transcrição de um gene para um RNA e a tradução subsequente do RNA para um polipeptídeo, —oqualpode ter uma atividade enzimática.

O termo "sobre-expressão" é geralmente entendido como signifi- cando um aumento da concentração intracelular ou atividade de um ácido

* ] 26/45 ribonucleico, uma proteina ou uma enzima em comparação com a cepa de partida (cepa parental) ou de tipo selvagem da cepa. No caso da presente invenção, os genes de tiossulfato sulfurtransferase ou polinucleotídeos que codificam para um polipeptídeo de tiossulfato sulfurtransferase são superex- pressados.

Uma "cepa de partida" (cepa parental) é entendida como signifi- cando a cepa de micro-organismo em que as medidas para aumentar a pro- dutividade de um ou mais aminoácidos, peptídeos ou proteínas, ou outras medidas para aumentar a atividade de uma ou mais enzimas (por exemplo, uma medida que leva a superexpressão), são executadas. Uma cepa de par- tida pode ser uma cepa de tipo selvagem, mas também a uma cepa que já tenha sido modificada previamente (por exemplo, uma cepa de produção).

Um "tipo selvagem" de uma célula indica de preferência uma cé- lula cujo genoma está em um estado tal como está formado naturalmente pormeio da evolução. O termo é utilizado tanto para a totalidade da célula e para os genes individuais. Assim, em especial as células ou os genes cujo gene sequências foram pelo menos parcialmente modificada pelos seres humanos por meio de métodos recombinantes não cair sob o termo "tipo selvagem".

Os mutantes obtidos no quadro da presente invenção mostram um aumento da secreção ou da produção do aminoácido desejado em um processo de fermentação em comparação com a cepa de partida ou a cepa- mãe utilizada. Neste contexto, os aminoácidos são libertados para o meio envolvente ou eles se acumulam dentro da célula (de acumulação).

O termo "aumentar" ou "aumento da atividade", neste contexto, descreve o aumento na atividade enzimática intracelular de uma ou mais enzimas em um micro-organismo que são codificados por meio do DNA cor- respondente.

Em princípio, um aumento da atividade enzimática pode ser al- —cançado, por exemplo, através do aumento do número de cópias da se- quência do gene ou sequências de genes que codificam para a enzima, u- sando um promotor forte ou o uso de um gene ou alelo que codifica para um

* ' 27/45 correspondente enzima com um aumento da atividade e, opcionalmente, a i combinação dessas medidas.

As células que foram geneticamente modifica- das de acordo com a presente invenção são produzidas, por exemplo, por transformação, transdução, conjugação ou uma combinação destes méto- dos, com um vetor que contém o gene desejado, um alelo deste gene ou partes do mesmo e um vetor que torna possível a expressão do gene.

A ex- pressão heteróloga é conseguida, em particular, através da integração do gene ou dos alelos no cromossoma da célula ou um vetor replicar extracro- mossomicamente.

Uma visão geral das possibilidades de aumentar a atividade en- zimática em células por meio do exemplo da carboxilase do piruvato é dada na DE-A-100 31 999, que está incorporada por referência aqui descrito e o teor cuja divulgação com respeito às possibilidades de aumentar a atividade enzimática em células forma uma parte da divulgação da presente invenção.

O aumento da atividade enzimática pode ser alcançado, por e- xemplo, através do aumento do número de cópias dos polinucleotídeos cor- respondentes cromossomicamente ou extracromossomicamente em pelo menos uma cópia.

Um método amplamente usado para aumentar o número de có- pias do polinucleotideo compreende a incorporação correspondente a um vetor, de preferência um plasmídeo, que é replicado por meio de uma bacté- ria.

Os vetores plasmídicos adequados para Enterobacteriaceae são, por exemplo, os vetores de clonagem derivados de pACYC184 (Barto- loméetal, Gene 102:.75 a 78 (1991)), pTrc99A (Amann et al, Gene 69: 301 a 315 (1988)) ou derivados de pPSC101 (Vocke e Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 80 (21): 6557 a 6561 (1983)). Os plas- mídeos derivados de pCL1920 (Lerner, CG e Inouye, M., Nucl Acids Res. (1990) 18: 4631 [ PMID: 2201955 ].). São, além disso, particularmente ade- —quados.

Os vetores plasmidicos derivados de cromossomas artificiais bacte- rianos (BAC), tais como, por exemplo pCC1BAC (Biotechnologies Epicentre, Madison, EUA), são também adequados para aumentar o número de cópias

" ' 28/45 dos polinucleotídeos correspondentes em E. coli. Vetores plasmídicos adequados para C. glutamicum são, por exemplo, PZ1 (Menkel et al, Applied and Environmental Microbiology 64: 549 a 554 (1989)), pEKEx1 (Eikmanns et al, Gene 107:. 69 a 74 (1991)) ou pHS2-1 (Sonnen et al, Gene 107: 69 a 74 (1991)). Eles baseiam-se nos plasmídeos críptica pHM1519, pBL1 ou PGA1. Outros vetores de plasmídeo, tal como, por exemplo, aqueles que se baseiam em pCG4 (EUA 4.489.160), ou pNG2 (Senwold-Davis et al, FEMS Microbiology Letters 66: 119 a 124 (1990)) ou pAG1 (EUA 5.158.891), podem ser empregue da mesma manei- ra. Um artigo de visão geral sobre o assunto de plasmídeos em C. glutami- cum pode ser encontrado em Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104, 27- 40 (2003)).

Os transposons, elementos de inserção (elementos IS) ou fagos podem, também, ser empregados como vetores. Tais sistemas genéticos são descritos, por exemplo, nas especificações da patente EUA 4.822.738, EUA 5.804.414 e 5.804.414 EUA. O IS ISaB1 elemento descrito na WO 92/02627 ou do transposona Tn 45 do pXZ10142 plasmídeo (referidos no "Handbook of Corynebacterium glutamicum" (editores: L. e M. Eggeling Bott)) podem ser usados da mesma maneira.

Um outro método generalizado para alcançar a superexpressão é o método de amplificação do gene cromossômico. Neste método, pelo menos uma cópia adicional do polinucleotídeo de interesse é inserido no cromossoma de uma bactéria. Tais métodos de amplificação são descritos, por exemplo, em WO 03/014330 ou WO 03/040373.

Um outro método para conseguir uma superexpressão compre- ende a ligação do correspondente gene ou alelo de um modo funcional (ope- racionalmente ligado) com um promotor ou uma cassete de expressão. Os promotores adequados para C. glutamicum são descritos, por exemplo, na FIG. 1 do artigo visão por Patek et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 311a323(2003)). As variantes do promotor DAPA, por exemplo, o promotor de A25, descrito por Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181, 6188 a 6191 (1999)), pode ser empregue da mesma maneira. O promotor de lacuna

" | 29/45 de C. glutamicum (EP 06007373), além disso, pode ser utilizado. Para E. coli, por exemplo, os promotores T3, T7, SP6, M13, lac, tac e tre descritos por Amann et al. (Gene 69 (2), 301 a 315 (1988)) e Amann e Brosius (Gene 40 (2-3), 183 a 190 (1985)) são conhecidos, alguns dos quaispodem também ser usados para C. glutamicum. Tal promotor pode ser inserido, por exemplo, a montante do gene em questão, tipicamente a uma distância de cerca de 1 a 500 nucleobases a partir do códon de iniciação. US 5939307 relata que por incorporação de cassetes de expressão ou de pro- motores, tais como, por exemplo, o promotor tac, promotor trp, promotor Ipp ou promotor PL e PR promotor do fago A, por exemplo, a montante do ope- rona treonina cromossômico, foi possível para atingir um aumento na ex- pressão. Os promotores do fago T7, o promotor da caixa de velocidades ou o promotor nar pode ser usado da mesma maneira. Tais cassetes de ex- pressão ou promotores podem também ser usados para superexpressar os genes ligados a plasmídeos, tal como descrito na EP 0 593 792. Ao utilizar o alelo lacla, a expressão de genes ligados a plasmídeos por sua vez pode ser controlado (Glascock e Weickert, Gene 223, 221-231 (1998)). Além disso, é possível que a atividade dos promotores de ser aumentados através da mo- dificação da sua sequência, por meio de uma ou mais trocas de nucleotí- deos,pormeio da inserção (ões) e/ou deleção (ões).

Com as medidas de superexpressão, a atividade ou concentra- ção do polipeptídeo correspondente é, em geral aumentados de pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500% , por um período máximo de até 1,000% ou 2,000%, com base na atividade ou con- — centração do polipeptídeo na cepa de partida correspondente (tipo selvagem ou micro-organismo de partida), antes da medida levando a superexpressão. Os métodos para a determinação da atividade enzimática de ti- ossulfato sulfurtransferase são descritos, por exemplo, por Cheng H, Dona- hue JL, Battle SE, Ray WK, Larson TJ, 2008, Open Microbiol J., 2: 18 a28e por Alexander (K., Volini M, 1987, J. Biol. Chem, 262: 6595 a 6604. A expressão das enzimas ou dos genes acima mencionados po- de ser detectada com a ajuda de uma - e separação em gel de proteína de 2

* * 30/45 dimensões e subsequente identificação óptica da concentração de proteína i no gel com o software de avaliação adequado.

Se o aumento de uma ativi- dade enzimática baseia-se exclusivamente em um aumento na expressão do gene correspondente, o aumento da atividade da enzima pode ser quantifi- cadade uma maneira simples através de uma comparação da 1 - ou duas separações de proteínas tridimensionais entre a do tipo selvagem e a célula geneticamente modificada.

Um método convencional para a preparação dos géis de proteínas no caso das bactérias e para a identificação das proteínas é o procedimento descrito por Hermann et al. (Eletroforese, 22: 1.712,23 (2001)). A concentração de proteina pode também ser analisada por meio da hibridação de Western blot com um anticorpo específico para a proteína a : ser detectada (Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2 ? ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI, EUA, 1989) e subsequente avaliação óptica com software apropriado para a determina- ção da concentração (Lohaus e Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32 a 39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630 a 2647). A atividade das proteínas de ligação de DNA pode ser medida por meio de ensaios de des- vio de bandas de DNA (também chamada de retardamento em gel, Wilson et al (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151 a 2155). A ação de proteínas de ligaçãode DNA sobre a expressão de outros genes pode ser detectada atra- vés de vários métodos bem descritos de ensaio do gene repórter (Sambrook et al, Molecular Cloning: a.

Laboratory manual, 2 ? ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring.

Harbor, NI EUA, 1989). As atividades enzi- máticas intracelulares pode ser determinadas por meio dos vários métodos que têm sido descritos (Donahue et al (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624 a 5627; Ray et al (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277 a 2284; Freedberg et al (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816 a 823). Se não há métodos concretos para a determinação da atividade de uma enzima particular é dada a seguir, a determinação do aumento na atividade enzimá- ticae também a determinação da redução da atividade de uma enzima é preferencialmente realizada por meio dos métodos descritos em Hermann et al, Electoforesis, 22: 1712 a 1723 (2001), Lohaus et al, Biospektrum 5 32-39

; . 31/45 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630 a 2647 (1999) e Wilson et al, Journal of Bacteriology 183: 2151 a 2155 (2001). Se o aumento na atividade enzimática é efetuado por meio da mutação do gene endógeno, essas mutações podem ser geradas através de métodos convencionais de uma forma não específica, tal como, por exem- plo, por irradiação com UV ou por produtos químicos indutores de mutação, ou em uma alvo maneira por meio de métodos de engenharia genética, tais como deleção (ões), inserção (ões) e/ou troca de nucleotídeo (s). As células modificadas geneticamente são obtidas por essas mutações. Mutantes parti- cularmente preferido de enzimas são, em particular, também as enzimas que já não pode ser inibida de feedback, ou, pelo menos, pode ser inibida a rea- limentação em menor excepa em comparação com a enzima do tipo selva- gem.

Se o aumento na atividade da enzima é efetuado através do aumento da expressão de uma enzima, o número de cópias, por exemplo, dos genes correspondentes é aumentado ou a região do promotor e a regu- lação ou o local de ligação ao ribossoma a montante do gene estrutural são mutados. Os cassetes de expressão, que são incorporados a montante do gene estrutural no acto da mesma maneira. Por promotores indutíveis é adi- cionalmente possível aumentar a expressão em qualquer ponto no tempo desejado. Além disso, contudo, os chamados intensificadores podem ser atribuídos ao gene da enzima como sequências reguladoras, os quais tam- bém têm o efeito de um aumento da expressão do gene através de uma me- lhor interação entre a polimerase de RNA e DNA. A expressão é também melhorada através de medidas para o prolongamento da vida do MRNA. A atividade da enzima é, além disso, do mesmo modo aumentada através da prevenção da degradação da proteina de enzima. Neste contexto, os genes ou construções de genes são ou presentes em plasmídeos com um diferente número de cópias ou integrados no cromossoma e amplificado. Alternativa- mente, uma superexpressão dos genes em causa, além disso, pode ser conseguido através da modificação da composição do meio e processo de cultura. Instruções sobre este são encontradas pela pessoa que é versada y . 32/45 na técnica, nomeadamente, em Martin et al. (Bio/Technology 5, 137 a 146 i (1987)), em Guerrero et al. (Gene 138, 35 a 41 (1994)), Tsuchiya e Morinaga (Bio/Technology 6, 428 a 430 (1988)), em Eikmanns et al. (Gene 102, 93 a 98 (1991)), na EP-A-O 472 869, nos EUA 4.601.893, em Schwarzer e Púhler (Bio/Technology 9,84 a387 (1991)), em Reinscheid et al. (Applied and Envi- ronmental Microbiology 60, 126 a 132 (1994)), em LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001 a1007 (1993)), em WO-A-96/15246, em Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), em JP-A-10-229891, em Jensen e Hammer (Biotechnology and Bioenginaering 58, 191 a195 (1998)) e em manuais co- —nhecidos de genética e da biologia molecular. As medidas descritas acima, como as mutações, para levar as células geneticamente modificadas.

. Esses vetores de plasmídeo com o auxílio da qual o método de amplificação de genes por integração no cromossoma podem ser utilizados, além disso, são também apropriados, tal como foi descrito, por exemplo, por Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60: 126-132 (1994)) para a duplicação ou a amplificação do operon hom-thrB. Neste mé- todo, o gene completo foi clonado num vetor de plasmídeo que pode ser re- plicado num hospedeiro (tipicamente Escherichia coli), mas não em Coryne- bacterium glutamicum. Vetores possíveis são, por exemplo, pSUP301 (Si- mon et al Bio/Technology 1:. 784-791 (1983)), ou pK18mob pK19mob (Schãfer et al, Gene 145:. 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, EUA), pCR2.1-TOPO (Shuman, Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84 (1994)), a PCR-Bluntll-TOPO (Invitrogen, Gronin- gen, Holanda), pEM1 (Schrumpf et al, Journal of Bacteriology 173:. 4510- 4516)) ou pBGS8 (Spratt et al, Gene 41:. 337-342 (1986)). O vetor plasmídi- co que contém o gene a ser amplificado é então convertido na cepa deseja- da de Corynebacterium glutamicum por meio da conjugação ou da transfor- mação. O método de conjugação é descrito, por exemplo, de Schafer et al, Applied and Environmental Microbiology 60:. 756-759 (1994). Métodos para a transformação são descritas, por exemplo, por Tierbach et al, Applied Mi- crobiology and Biotechnology 29:. 356-362 (1988), e Dunican Shivnan, Bi- o/Technology 7: 1067-1070 (1989) e Tauch et al, FEMS. Microbiology Letters

. ' 33/45 123: 343-347 (1994). Após a recombinação homóloga, através de um evento i Ccross-over, a cepa resultante contém pelo menos duas cópias do gene em questão.

Um método semelhante para a E. coli está descrito, por exemplo, através da ligação, AJ, Phillips, D. e Church, GM (1997), J.

Bacteriology 179: 6228-6237. Para a inserção ou deleção do DNA nos cromossomas, os mé- todos da recombinase mediada também podem ser utilizados, tais como fo- ram descritas, por exemplo, por Datsenko KA, Wanner, BL, 2000, Proc Nat! Acad Sci EUA, 97 (12)..: 6640-5. A expressão"uma atividade de uma enzima que é aumentada em comparação com a cepa de tipo selvagem ou a cepa de partida" utilizada - acima e no que se segue é sempre de preferência para ser entendido no sentido de uma atividade da enzima em particular que foi aumentado por um fator de pelo menos 2, especialmente de preferência de pelo menos 10, por — outro lado, de preferência de pelo menos 100, por outro lado ainda mais pre- ferencialmente de pelo menos 1000 e ainda mais preferencialmente de pelo menos 10.000. A célula de acordo com a presente invenção, o qual tem"uma atividade de uma enzima que é aumentada em comparação com a cepa de tipo selvagem ou a cepa de partida" também inclui, além disso, em particular uma célula de tipo selvagem ou cuja cepa de partida não tem nenhuma ou pelo menos nenhuma atividade detectável de esta enzima, e que mostra uma atividade detectável desta enzima única após o aumento da atividade da enzima, por exemplo, por superexpressão.

Neste contexto, o ter- mo"superexpressão" ou"aumento da expressão" utilizada na formulação que se segue inclui igualmente o caso em que uma célula de partida, por exem- plo, uma célula de tipo selvagem, não tem ou tem, pelo menos, não há ex- pressão detectável e uma expressão detectável da enzima é induzida ape-

nas por métodos recombinantes.

As bactérias isoladas obtidas pelas medidas da presente inven- — ção mostram um aumento da secreção ou da produção do aminoácido dese- jado em um processo de fermentação em comparação com a cepa de parti-

da ou a cepa-mãe utilizada.

. ' 34/45 As bactérias isoladas são para serem entendidas como signifi- cando que as bactérias mutantes e recombinantes de acordo com a presen- te invenção, que têm sido isoladas ou produzidas, em particular da família Enterobacteriaceae ou Corynebacteriaceae e que têm uma atividade aumen- tada de uma tiossulfato sulfurtransferase em comparação com a cepa de partida.

A saída das bactérias isoladas e do processo de fermentação usando o mesmo em relação a um ou mais dos parâmetros escolhidos a partir do grupo de concentração de produto (por volume), o rendimento do — produto (produto formado por fonte de carbono consumido) e a formação do produto ( produto formado por unidade de volume e tempo), ou também de outros parâmetros do processo e suas combinações, é melhorada em pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 1,5%, ou, pelo menos, 2%, com base na cepa de partida, ou a cepa progenitora ou processo de fermentação usandoomesmo.

No processo de acordo com a presente invenção, as bactérias podem ser cultivadas de forma contínua - tal como descrito, por exemplo, em PCT/EP2004/008882 - ou descontínua no processo batch (cultura batch) ou em fed batch (processo feed) ou repetido alimentados processo em lotes (processo de alimentação repetitivo) com o objetivo de produção de L- aminoácidos. Um resumo de natureza geral de métodos de cultivo conheci- dos está disponível no livro por Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfúhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)), ou no livro didático por Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

O meio de cultura ou meio de fermentação a ser utilizado deve satisfazer os requisitos das cepas particulares de um modo adequado. Des- crições de meios de cultura para vários micro-organismos estão contidas no manual"Manual de Métodos de Bacteriologia Geral" da Sociedade America- —nade Bacteriologia (Washington DC, EUA, 1981). Os termos meio de cultura e meio de fermentação ou médio são mutuamente intercambiáveis.

Os açúcares e os carboidratos, tais como, por exemplo, glicose,

. ' 35/45 sacarose, lactose, frutose, maltose, melaços, sacarose contendo soluções a partir da beterraba de açúcar ou de produção de açúcar de cana, amido, hi- drolisado de amido e celulose, óleos e gorduras, tais como, por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e gordura de coco, ácidos graxos,tais como, por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido lino- leico, álcois, tais como, por exemplo, glicerol, metanol e etanol, e ácidos or- gânicos, tais como, por exemplo, ácido acético, pode ser utilizado como fon- te de carbono.

Estas substâncias podem ser utilizadas individualmente ou como uma mistura.

Os compostos contendo nitrogênio orgânicos, tais como pepto- l nas, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, licor de infusão - de milho, farinha de feijão de soja e ureia, ou compostos inorgânicos, como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amô- nio e de nitrato de amônio, pode ser usado como fonte de nitrogênio.

As fon- tes de nitrogênio podem ser utilizadas individualmente ou como uma mistura.

Ácido fosfórico, fosfato monopotássico e o fosfato dipotássico, ou os correspondentes sais contendo sódio podem ser usados como fonte de fósforo.

De acordo com a presente invenção, a fonte de enxofre é em- pregue um sal de ácido ditiossulfúrico (tiossulfato), opcionalmente em con- junto com outras fontes de enxofre, tais como, por exemplo, sulfato, sulfito ou ditionito.

O meio de cultura deve ainda conter sais, por exemplo, sob a forma de cloretos de metais, tais como, por exemplo, sódio, potássio, mag- —nésio, cálcio e ferro, tais como, por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são necessários para o crescimento.

Finalmente, as substân- cias essenciais de crescimento, tais como aminoácidos, por exemplo, homo- e vitaminas, por exemplo, tiamina, biotina e ácido pantotênico, podem ser empregados para além das substâncias acima referidas.

Os precursores adequados do aminoácido particular pode, tam- bém, ser adicionado ao meio de cultura.

As substâncias de partida mencionadas podem ser adicionadas

- é 36/45 r à cultura sob a forma de um único lote, ou pode ser alimentadas durante o ' cultivo de uma maneira adequada.

Os compostos básicos, tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amoníaco ou amoníaco aquoso, ou compostos, tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, o ácido pode ser empregue de um modo ade- quado para controlar o pH da cultura. O pH é em geral ajustado para um va- lor de 6,0-9,0, de preferência 6,5 a 8. Antiespumantes, tais como, por exem- plo, ésteres de poliglicol de ácidos graxos, podem ser empregados para con- trolar o desenvolvimento da espuma. Substâncias adequadas que têm uma . 10 ação seletiva, tais como, por exemplo, os antibióticos, podem ser adiciona- das ao meio para manter a estabilidade dos plasmídeos. Para manter condi- ' ções aeróbias, o oxigênio ou misturas gasosas contendo oxigênio, tais co- mo, por exemplo, o ar, são introduzidos na cultura. A utilização de líquidos que são enriquecidas com peróxido de hidrogênio é também possível. A fermentação é, opcionalmente, realizada sob pressão aumentada, por e- xemplo sob uma pressão de 0,03-0,2 MPa. A temperatura da cultura é ge- ralmente de 20ºC a 45ºC, e de preferência de 25ºC a 40ºC. No processo descontínuo a cultura é continuada até um máximo de o aminoácido deseja- do foi formado. Esta meta geralmente é alcançada dentro de 10 horas a 160 horas. Nos processos contínuos tempos mais longos de cultivo são possí- veis.

Os meios de fermentação adequados são descritos, inter alia, nos EUA 6.221.636, EUA 5.840.551 em, nos EUA 5.770.409, nos EUA

5.605.818, EUA 5.275.940 e em EUA 4.224.409.

Os métodos para a determinação de L-aminoácidos são conhe- cidos da técnica anterior. A análise pode ser realizada, por exemplo, tal co- mo descrito por Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) por meio de cromatografia de permuta iônica, com posterior derivatização com ninidrina, ou pode ser realizada por HPLC de fase reversa, tal como descrito —porLindroth et al. (Química Analítica (1979) 51: 1167-1174).

O caldo de fermentação produzido desta forma é então proces- sado para um produto sólido ou líquido.

. t 37/45 Um caldo de fermentação é entendido como significando um ' meio de fermentação em que um micro-organismo é cultivado durante um certo tempo e a uma determinada temperatura. O meio de fermentação e/ou os meios de comunicação utilizados durante a fermentação contém (êm) de todas as substâncias e componentes que garante uma multiplicação do mi- cro-organismo e a formação do aminoácido desejado.

No final da fermentação, o caldo de fermentação formado senti- do contém a) a biomassa do micro-organismo formado como resultado da multiplicação das células do micro-organismo, b) do aminoácido desejado formado no decurso da fermentação, c) os subprodutos orgânicos formados Í no decurso da fermentação e d) os constituintes do meio/fermentação meio : de fermentação utilizado ou das substâncias de partida que não foram con- sumidos a partir da fermentação, tais como, por exemplo, as vitaminas, tais como biotina, aminoácidos, tais como homosserina, ou sais, tais como sulfa- tode magnésio.

Os subprodutos orgânicos incluem as substâncias que são pro- duzidas possivelmente, para além do L-aminoácido particular desejada, e, possivelmente, segregada pelos micro-organismos utilizados na fermenta- ção. Estes incluem a L-aminoácidos que constituem menos de 30%, 20% ou 10%, em comparação com o amino ácido desejado. Eles incluem, além dis- so, ácidos orgânicos que transportam um a três grupos carboxila, tais como, por exemplo, ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido málico ou ácido fumárico. Por fim, elas também incluem açúcares, tais como, por exemplo, a trealose.

Os caldos de fermentação típicos que são adequados para fins industriais, têm um teor de aminoácidos de entre 40 g/kg a 180 g/kg ou de 50 g/Kkg a 150 g/Kkg. O teor de biomassa (como biomassa seca) é, em geral, de 20 a 50 g/kg.

Exemplos: Exemplo 1: Síntese e clonagem do gene RDL2 Para a expressão da ORF RDL2 (SEQ ID NO: 1) de S. cerevisi- ae, uma sequência de nucleotídeos (GeneArt AG, Regensburg, Alemanha),

* * 38/45 que compreende uma sequência a montante ("a montante", SEQ ID NO: 6), : a sequência de ORF RDL2 ("RDL2", SEQ ID NO: 1) e uma sequência de jusante ("a jusante", SEQ ID NO: 7) foi sintetizada de novo. A sequência a montante contém as sequências de reconhecimento para as enzimas de res- triçãoPacle Fsele um local de ligação ao ribossoma. A sequência a jusante contém um segundo códon de terminação TAA seguido por meio do T1 ter- minador do gene rnpB de E. coli MG1655. As sequências de reconhecimento para as enzimas de restrição Pmel e SBFI seguem depois disso. Após a sin- tese, a sequência de nucleotídeos foi clivado com Saci e Kpnl e clonado no —plasmídeo pMA (ampR), do mesmo modo clivados com Saci e Kpnl. O plas- Ú mídeo resultante foi designado por "PMA-RDL2" (SEQ ID NO: 8, Figura 1).

& A partir da sequência de aminoácidos da proteína codificada por Rdl2p da ORF RDL?2 (sequência"RDL2p", SEQ ID NO: 2), três sequências de DNA diferentes que codificam para proteínas Rdl2p com a sequência de aminoácidos de tipo selvagem foram gerados. As sequências foram desig- nadas "RDL2a" (SEQ ID NO: 3), "RDL2b" (SEQ ID NO: 4) e "RDL2c" (SEQ ID NO: 5). Cada uma destas três sequências foi sintetizada de novo, junta- mente com as sequências a montante e a jusante descritas acima e clona- dasno plasmídeo pMA como descrito acima (GeneArt AG, Regensburg, A- lemanha). Os plasmídeos resultantes foram designados por PMA-RDL2a, PMA-RDL2b e PMA-RDL2c. As variantes diferem na mencionada otimização da utilização do códon do micro-organismo utilizado para o processo. Os valores para a adaptação à utilização de códons são, portanto, como se se- gue: RDL2:0o uso de códon não adaptado (índice do códon de adaptação CAI = 0,27) RDL2a: o uso de códon ligeiramente adaptado para E. coli (CAI = 0,38) RDL2b: uso de códon mais altamente adaptado para E. coli (CAI = 0,72) RDL2c: o uso de códon completamente adaptado para E. coli (CAI = 1) Exemplo 2: Clonagem de ORFs RDL2, RDL2a, RDL2b e R- DL2c no plasmídeo pME101-thra * 1-cysE-Pgap-metA * 11.

Para a expressão em E. coli, as quatro variantes de genes que

. * 39/45 codificam para a proteina RDL2 foram cada um clonado no plasmídeo de E. i coli de produção pME101-Thra * 1-cysE-Pgap-meta * 11 (WO2007/077041) a jusante de meta * 11. Para isso, os genes amplificados foram, cada um com os inicia- dores RDL2-t4-f (SEQ ID NO: 11) e RDL2-r (SEQ ID NO: 12), utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) com Phusion DNA Polymerase (Finnzymes Oy Espoo, Finlândia). Os plasmídeos pMA-RDL2, pMA-RDL?2a, PMA-RDL2b e PMA-RDL2c do Exemplo 1 servido como modelos.

RDL2-t4-f (SEQ ID NO: 11): —S5'aggacagtcgacggtaccgcaagetteggettegcACTGEGAAMAGCGGGCAGTGAG 3' i RDL2-r (SEQ ID NO: 12): : 5 'AGCGCGACGTAATACGACTEC 3' Os produtos de PCR 804 pb de tamanho e o plasmídeo PME101-Thra * 1-cysE-PgapA-meta * 11 foram clivados com as enzimas de restrição Sall e SBFI, ligados e transformados para a cepa de E. coli DH5a.

As células de plasmídeo condutoras foram selecionadas por meio da cultura em placas de ágar LB com 50 ug/ml de estreptomicina.

Após o isolamento do DNA do plasmídeo, a clonagem bem sucedida foi detectada por meio da clivagem controle com a enzima de restrição Agel.

Finalmente, os fragmen- tosde DNA clonado foram sequenciados com os seguintes iniciadores: PME-RDL2-Segf (SEQ ID NO: 13): 5 'ATGTGGAAGCCGGACTAGAC 3' PME-RDL2-Segr (SEQ ID NO: 14): 5 TCEGGATTATCCCGTGACAGG 3' Os plasmídeos formados desta maneira foram designados PME- RDL2, PME-RDL2a, PME-RDL2b e PME-RDL?2c.

Exemplo 3: Transformação de E. coli MG1655AmetJ Ptrc- metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP A cepa de E. coli MG1655AmetJ metA * 11 Ptre-metH-Ptrc metF —PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH (designado DM2219 na seguinte), que pro- duz a L-metionina é descrita na especificação da patente WO 2009/043803 A2.

. * 40/45 A cepa se transformou em cada caso, com os plasmídeos PME- ] RDL2, PME-RDL2a, PME-RDL2b e PME-RDL2c e com o plasmídeo PME101-Thra * 1-cysE-PgapA-meta * 11 (WOZ2009/043803 A2) e células plasmídeo que transportam foram selecionadas em LB ágar com 50 ug/ml! de estreptomicina.

Os transformantes foram transinoculados em cada caso em ml de meio líquido LB com 1% de glicose e 50 ug/ml de estreptomicina, e foram cultivados a 37ºC durante 16 horas.

O glicerol foi então adicionado a uma concentração final de 10% e as culturas foram congeladas a -70ºC.

Exemplo 4: Avaliação das cepas de produção de L-metio- 10 ninadee.coli i A capacidade de saída de cepas de produção de L-metionina de . E. coli foi avaliada por meio das experiências de produção em frascos côni- cos de 100 ml.

Como pré-culturas, em cada caso, 10 ml do meio de pré- cultura (10% de meio LB com 2,5 g/l de glicose e 90% PC1 meio mínimo) foram inoculados com 100 ul da cultura de células e as culturas foram culti- vadas a 37ºC durante 10 horas.

Em cada caso, 10 ml de meio mínimo de PC1 (Tabela 1) foram então inoculados com estas para um OD 600 nm de 0,2 (Bio-Eppendorf Fotômetro; Eppendorf AG, Hamburg, Alemanha) e culti- vadas a 37 º C durante 24 horas.

A concentração de L-metionina extracelular foideterminada com um analisador de aminoácidos (Sykam GmbH, Eresing, Alemanha) por meio da cromatografia de troca iônica e derivatização pós coluna com ninidrina detecção.

A concentração de glicose extracelular foi determinada com um YSI Glucose Analyzer 2700 Select (Life Sciences YSI, Yellow Springs, Ohio, EUA). Os dados mostram que a expressão da ORF RDL2, RDL2a, RDL2b RDL2c ou aumenta significativamente a concentração de L-metionina (Tabela 2). Tabela 1: Meio mínimo PC1 LEBOL a mgg

: ' 41/45 i ' 42/45 Tabela 1: Meio mínimo PC1 (Continuação) sstâneia Concentração = —=— | MgSO, * 7 HO 19 Ácido cítrico * 1 HO 6,569 = " CaCl, * 2 HO NS 40 mg/l K2HPO, 8,02 gl NazHPO, NH;)2HPO, NH,CI 0,139 NH,)2SO; 5,6 g/l

MOPS NaOH a 10 M Ajustado a pH 6,8 FeSO, * 7 HO — Ja4omgn Cloridrato de Tiamina 10 mg/l . Vitamina B12 10 mg/l = Glicose 109 Isopropil tio-B-galactosídeo (IPTG 2,4 mg/l ú Espectinomicina 50 mg/l Tabela 2: Concentrações de L-Metionina nos caldos de fermen- tação das cepas de E. coli DM2219 condutoras de vários plasmídeos Exemplo 5: Clonagem de ORFs RDL2, RDL2a, RDL2b e R- DL2cno plasmídeopEC-XT99A. Como o vetor de base para a expressão da ORF RDL2, RDL2a, RDL2b e RDL2c em C. glutamicum, a E. coli-C. glutamicum shuttle plasmí- deo de expressão PEC-XT99A (EP1085094B1) foi usado. Os plasmídeos PMA-RDL2, pMA-RDL2a, pMA-RDL2b e PMA-RDL2c do Exemplo 1 foram, cada um cortado com as enzimas de restrição Stul e Nael e separado num gel de ágarose a força de 0,8%. Os fragmentos de DNA de 638 pb de tama- nho foram cortadas do gel e o DNA foi extraído (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden, Alemanha). A expressão do plasmídeo pEC-XT99A foi cliva- do com a enzima de restrição Ecl136Il. A ligação foi, em seguida, em cada caso, realizado com o fragmentos de DNA de 638 pb de tamanho, utilizando o Ready-To-Go ligation kit (Amersham GE Healthcare Europe GmbH, Frei-

. * 43/45 burg, Alemanha). A cepa de E. coli DH5a (Invitrogen GmbH, Darmstadt, A- ' lemanha) foi transformada com os lotes de ligação e as células do plasmídeo condutoras foram selecionadas em LB ágar com 5 ug/ml de tetraciclina.

Após o isolamento do DNA do plasmídeo, a clonagem bem su- cedida foidetectada por meio de uma clivagem controle com as enzimas de restrição Pmel e Sacll. Finalmente, os plasmídeos foram sequenciados com os iniciadores seguintes: PECf (SEQ ID NO: 9): 5 'TACTGCCGCCAGGCAAATTC 3' pECr(SEQID NO: 10): 5 'TTTGCGCCGACATCATAACG 3' . Os construtos de plasmídeo em que o próprio promotor trc de plasmídeo e as ORFs que codificam para RDL2 possuem a mesma orienta- ção foram designados como se segue: PEC-RDL2, PEC-RDL2a, PEC-e R- DL2bpEC-RDL2c.

Exemplo 6: Transformação de C. glutamicum M1179 A cepa de Corynebacterium glutamicum M1179 é uma produtora etionina resistente de L-metionina (WO2007/011939). Ela foi depositada na Deutsche Sammlung fuúr Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Brauns- chweig, Alemanha), em 18.5.2005 como DSM17322 sob os termos do Tra- tado de Budapeste.

Os plasmídeos pEC-RDL2, PEC-RDL2a, PEC-RDL2b, PEC-e RDL2c pEC-XT99A foram electroporadas para a cepa M1179 de acordo com as condições de electroporação de Tauch et al. (1994, FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347).

A seleção de células condutoras de plasmídeo foi realizada em placas de ágar LB com 5 ug/ml de tetraciclina. O DNA de plasmídeo dos transformantes foi isolado (Peters-Wendisch et al. De 1998, Microbiology 144, 915-927) e verificados por clivagem de restrição e electroforese em gel.

As cepas formadas deste modo foram designadas M1179/pEC-RDL?2, M1179/pEC-RDL2a, M1179/pEC-RDL2b, M1179/pEC-RDL2c e M1179/pEC- XT99A.

: t 44/45 Exemplo 7: Avaliação das cepas de produção de L-metio- nina de C. glutamicum As cepas de C. glutamicum M1179/pEC-RDL2, M1179/pEC- RDL2a, M1179/pEC-RDL2b, M1179/pEC-RDL2c e M1179/pEC-XT99A pro- —duzidas foram cultivadas num meio nutriente adequado para a produção de L-metionina e o teor de L-metionina no sobrenadante da cultura foi determi- nada.

Por isso, as cepas foram semeadas em placas de ágar primeiro (ágar de cérebro e coração com canamicina (25 mg/I)) e incubou-se a 33 º C durante 24 horas.

A partir dessas culturas da placa de ágar, as células foram transinoculated para, em cada caso 10 ml de BH médio (Hirn-Herz Bouillon, : Merck, Darmstadt, Alemanha), com 5 mg/l de tetraciclina e as culturas foram agitadas em 100 ml, frascos cónicos de 33 º C e a 240 rpm durante 24 ho- ras.

Em cada caso, 10 ml! de PM médio (Tabela 3) foram então inoculados com estas para um OD 660 nm de 0,1 (Genios, Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Alemanha) e cultivadas a 33 º C em 100 ml de frascos cônicos com chicanas durante 24 horas.

Tabela 3: Meio PM [Substância a Concentração | NH4)2S2O; 109 MgSO, * 7 HO 0,4 g/l KH2PO, 0,6 gl Extrato de levedura (Difco FeSO, * 7 HO MnSO, * H;O Ajustado a pH 7,8 Tiamina * HCI 0,2 mg/l Piridoxina * HCI (vitamina B6 Isopropil tio-B-galactosídeo (IPTG) Após 24 horas, a densidade óptica a 660 nm foi determinada

. : 45/45 (Genios, Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Alemanha) e a concentra- ' ção de L-metionina formado foi medida.

L-metionina foi determinada com um analisador de aminoácidos (Sykam GmbH, Eresing, Alemanha) por meio da cromatografia de troca iônica e derivatização pós coluna com ninidrina de- tecção A Tabela 4 mostra as densidades ópticas e as concentrações de L- metionina das culturas.

A expressão da ORF RDL2, RDL2a, RDL2b ou resul- tados RDL2c em um aumento significativo na concentração de L-metionina.

Tabela 4: Concentrações de metionina nos caldos de fermenta- ção das cepas de C. glutamicum M1179 condutoras de vários plasmídeos OD (600 nm é M1179/pEC-XT99A 0,47 | M1179/pEC-RDL2 0,50 . [M1179/pEC-RDL2a 0,50 M1179/pEC-RDL2b 0,55 [M11789/pEC-RDL2c Pr) 0,54

Claims (15)

. : 15 REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a preparação fermentativa de aminoácidos contendo enxofre, escolhidos dentre o grupo de L-metionina, L-cisteína, L- cistina, L-homocisteina e L-homocistina, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) fornecimento de um micro-organismo da família Enterobac- teriaceae, ou de um micro-organismo da família Corynebacteriaceae que tem um aumento da atividade de tiossulfato sulfurtransferase em compara- ção com a cepa de partida em particular; b) fermentação do micro-organismo a partir de a) em um meio i que contém uma fonte inorgânica de enxofre a partir do grupo de sal de áci- do ditiossulfúrico ou uma mistura de um sal de ácido ditiossulfúrico e de um sal de ácido sulfúrico, um caldo de fermentação, sendo obtido, e c) concentração de aminoácidos contendo enxofre, no caldo de fermentação a partir de b).

2. Processo para a preparação fermentativa de aminoácidos contendo enxofre, escolhidos dentre o grupo de L-metionina, L-cisteína, L- cistina, L-homocisteina e L-homocistina, de preferência, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) fornecimento de um micro-organismo da família Enterobac- teriaceae, ou de um micro-organismo da família Corynebacteriaceae que superexpressam um gene que codifica um polipeptídeo com a atividade de um tiossulfato sulfurtransferase; b) fermentação do micro-organismo a partir de a) em um meio que contém uma fonte inorgânica de enxofre a partir do grupo de sal de áci- do ditiossulfúrico ou uma mistura de um sal de ácido ditiossulfúrico e de um sal de ácido sulfúrico, um caldo de fermentação sendo obtido, e c) concentração de aminoácidos contendo enxofre, no caldo de fermentação a partir de b).

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo superexpressa um ou mais genes que codificam um polipeptídeo com a atividade de um tiossulfato sulfurtransfera-

ã ' 2/5 : se, o polipeptídeo com a atividade de um tiossulfato sulfurtransferase sendo escolhido entre os seguintes: a) a d): a) um polipeptídeo que consiste em, ou que contém os polipep- tídeos Rdl2p, GIpE, PspE, YgaP, Thil, YbbB, SseA, YnjE, YceA, YibN, NC- —glo671, NCgl1369, NCgl2616, NCgI0053, NCgIO054, NCgl2678, NCgl2890, um tiossulfato sulfurtransferase de mamíferos, por exemplo, o tiossulfato sulfurtransferase a partir do fígado bovino (Bos taurus), de preferência R- di2p, GIpE, PspE e particularmente preferencialmente Rdl2p; b) um polipeptídeo que consiste em, ou que contém a sequên- ciade aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2; | c) um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos que é idêntica à extensão de 70% ou mais da sequência de aminoácidos de a) ou . b), o polipeptídeo tendo atividade de tiossulfato de sulfurtransferase; d) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos ' 15 contendo uma eliminação, uma substituição, uma inserção e/ou uma adição de 145 resíduos de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2, o polipeptídeo ao qual tem a atividade tiossulfa- to sulfurtransferase.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene que codifica um poli- peptídeo com a atividade de um tiossulfato sulfurtransferase é aumentada por meio de um ou mais meios escolhidos a partir do grupo seguinte: a) a expressão do gene está sob o controle de um promotor que, no micro-organismo utilizado no processo, conduz a uma expressão amplificada em comparação com a cepa de partida; b) aumentar o número de cópias do gene que codifica um poli- peptídeo com a atividade de um tiossuifato sulfurtransferase em comparação com a cepa de partida, de preferência, através da inserção do gene em um plasmídeo ou por meio da integração do gene no cromossoma do micro- organismo em várias cópias ; c) a expressão do gene é efetuada utilizando um local de liga- ção ao ribossoma, o que leva a um aumento da tradução no micro-

. , 3/5 * organismo utilizado no processo em comparação com a cepa de partida; ' d) a expressão do gene é amplificada por meio de uma otimi- zação da utilização de códons com relação ao micro-organismo utilizado no processo; e) a expressão do gene é amplificada por meio da redução das estruturas secundárias de MRNA no mRNA transcrito por meio do gene; f) a expressão do gene é amplificada por meio da eliminação de terminadores de RNA polimerase no mRNA transcrito por meio do gene; g) a expressão do gene é efetuada utilizando as sequências de estabilização de MRNA no mRNA transcrito por meio do gene.

:

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o sal de ácido ditiossulfúrico é um sal esco- : lhido dentre o grupo de sal de metal alcalino, sal de metal alcalinoterroso, sal de amônio (e misturas), de preferência o sal de amônio.

f 15

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o sal do ácido sulfúrico é um sal escolhido do grupo de sal de metal alcalino, sal de metal alcalinoterroso, sal de amônio (e misturas), de preferência o sal de amônio.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que, durante a fermentação, o teor de sal de ácido ditiossulfúrico, com base no teor total de enxofre inorgânico no meio e no caldo de fermentação, é mantido a, pelo menos, 5% em mol.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o aminoácido contendo enxofre é a L- metionina.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é do gênero Escherichi- a, de preferência as espécies Escherichia coli.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ag, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é do gênero Coryne- bacterium, de preferência, as espécies de Corynebacterium glutamicum.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1

: E 4/5 - a 10, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é escolhido a partir ' de - Corynebacterium glutamicum com um aumento da atividade e/ou a expressão de aspartato quinase e a atenuação ou eliminação da pro- teína reguladora McbR em comparação com a cepa de partida; - Escherichia coli com o aumento da atividade e/ou a expressão de aspartato quinase e a atenuação ou a eliminação da proteína reguladora MetJ em comparação com a cepa de partida.

12. Micro-organismo escolhido a partir de - Corynebacterium glutamicum com um aumento da atividade , e/ou da expressão de aspartato quinase e atenuação ou eliminação da pro- , teína reguladora McbR em comparação com a cepa de partida; . - Escherichia coli com o aumento da atividade e/ou a expressão de aspartato quinase e a atenuação ou a eliminação da proteína reguladora ' 15 MetJ em comparação com a cepa de partida; em que o micro-organismo produz ou segrega L-metionina, ca- racterizado pelo fato de que o micro-organismo tem um aumento da ativida- de de tiossulfato sulfurtransferase em comparação com a cepa de partida particular.

13. Micro-organismo escolhido a partir de - Corynebacterium glutamicum com um aumento da atividade e/ou da expressão de aspartato quinase e atenuação ou eliminação da pro- teína reguladora McbR em comparação com a cepa de partida; - Escherichia coli com o aumento da atividade e/ou da expressão de aspartato quinase e atenuação ou eliminação da proteina reguladora MetJ em comparação com a cepa de partida; em que o micro-organismo produz ou segrega a L-metionina, ca- racterizado pelo fato de que o micro-organismo superexpressa um gene que codifica um polipeptídeo com a atividade de uma tiossulfato sulfurtransfera- se.

14. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que este micro-organismo superexpressa um ge-

. , 5/5 : ne que codifica um polipeptídeo com a atividade de um tiossulfato sulfur- ' transferase, o polipeptídeo com a atividade de um tiossulfato sulfurtransfera- se sendo como definido na reivindicação 3.

15. Micro-organismo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações12a14,caracterizado pelo fato de que a cepa de partida é derivada de um micro-organismo a partir do grupo que consiste em Escherichia coli MG1655, Escherichia coli W3110, Escherichia coli DH5a, Escherichia coli DH10B, Escherichia coli BWIV2952, Escherichia coli REL6O6, Corynebacteri- um glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum R, Corynebacte- rium glutamicum DSM20411 (antigo nome Brevibacterium flavum), Coryne- ' bacterium glutamicum DSM20412 (antigo nome Brevibacterium lactofermen- ' tum), Corynebacterium glutamicum DSM1412 (antigo nome de Brevibacteri- : um lactofermentum), Corynebacterium efficiens YS-314" (= DSM44549) Corynebacterium glutamicum ATCC21608, Corynebacterium glutamicum * 15 DSM17322.

Fig. 1 Stul 361 Sacl 378 | Sbfl 384 LÊ Pmel 398 É 3000 >» É A jusante “ || APR pMA-RDL2 | | 3010 pbs RDI? | N — 2000 1000 rj A montantes ; 1500 Fsel 998 | Nael 999 Pacl 1016 Kpnl 1024 Pacl 1032