ES2645997T3

ES2645997T3 - Una célula con actividad de ppGppasa reducida

Info

Publication number: ES2645997T3
Application number: ES13701624.2T
Authority: ES
Inventors: Frank Schneider; Caroline Gerth
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2012-02-17
Filing date: 2013-01-28
Publication date: 2017-12-11
Anticipated expiration: 2033-01-28
Also published as: US20170067066A1; WO2013120685A1; JP2015508647A; US20150072382A1; CN104583388A; EP2814945B1; RU2014137392A; MY171544A; PL2814945T3; EP2628792A1; EP2814945B9; EP2814945A1; DK2814945T3

Abstract

Método de preparación de metionina o triptófano, que comprende la etapa de cultivar una célula de E. coli, que ya produce en exceso metionina o triptófano y está adicionalmente genéticamente modificada con respecto a su forma no mutante de tal forma que tiene una actividad de ppGppasa reducida con respecto a su forma no mutante, en el que la célula de E. coli tiene una actividad de (p)ppGpp-sintetasa que es esencialmente invariable con respecto a su forma no mutante y en el que la ppGppasa es al menos una seleccionada del grupo que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6.

Description

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DESCRIPCION

Una celula con actividad de ppGppasa reducida

La presente invencion se refiere a una celula de E. coli que esta geneticamente modificada en su forma no mutada de tal forma que tiene una actividad de ppGppasa reducida con respecto a su forma no mutante y produce en exceso preferentemente un aminoacido esencial, incluso mas preferentemente un aminoacido esencial derivado de serina, lo mas preferentemente metionina o triptofano, y a un metodo de preparacion de un aminoacido esencial del mismo derivado de serina, que comprende las etapas de a) cultivar la celula segun el primer aspecto de la presente invencion o segun cualquiera de sus realizaciones, y b) opcionalmente: purificar el aminoacido.

Los L-aminoacidos que contienen azufre y aromaticos son de gran importancia economica. La L-cistema se usa como aditivo alimentario, como sustancia de partida para compuestos activos farmacologicos (por ejemplo, N- acetilcistema) y para cosmeticos. Los aminoacidos L-metionina y L-triptofano desempenan una funcion muy importante en la nutricion animal. Pertenecen a los aminoacidos esenciales que no pueden ser producidos por biosmtesis en el metabolismo de los vertebrados. En la cna de animales debe, por consiguiente, garantizarse que sean tomadas cantidades suficientes del aminoacido particular con el pienso. Sin embargo, como la L-metionina, por ejemplo, esta frecuentemente presente en plantas para piensos convencionales (tales como soja o cereales) en cantidades que son demasiado bajas para garantizar la nutricion optima del animal, particularmente para cerdos y aves de corral, es ventajoso anadir metionina como aditivo al pienso animal. La D-metionina puede ser convertida en L-metionina biologicamente activa por los vertebrados. Un racemato de D- y L-metionina es, por tanto, normalmente anadido al pienso animal. En animales, la L-homocistema puede convertirse por transmetilacion y asf sustituir a la L- metionina.

En el estado de la tecnica, aminoacidos tales como la metionina se preparan por smtesis qmmica. Esto implica primero hacer reaccionar acrolema y metilmercaptano para dar 3-metiltiopropionaldetndo, que a su vez con cianuro, amoniaco y monoxido de carbono produce hidantoma. La ultima puede finalmente hidrolizarse para dar el racemato, una mezcla equimolar de los dos estereoisomeros, D- y L-metionina. Como solo la forma L constituye la forma biologicamente activa de la molecula, la forma D presente en el pienso debe primero convertirse metabolicamente por desaminacion y transaminacion en la forma L activa.

A diferencia de la metionina, la mayona de los otros aminoacidos naturales proteinogenicos, tales como -triptofano, por ejemplo, se preparan sobre todo por fermentacion de microorganismos, aprovechando el hecho de que los microorganismos tienen vfas biosinteticas apropiadas para sintetizar los aminoacidos naturales. Ademas, muchos procesos de fermentacion logran costes de produccion muy favorables con reactantes economicos tales como glucosa y sales minerales, y ademas administran la forma biologicamente activa del aminoacido particular.

Los aminoacidos de este tipo son conocidos por ser producidos por fermentacion de cepas de Enterobacteriaceae, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Debido a la gran importancia, constantemente esta siendo realizado trabajo para mejorar los procesos de preparacion. Mejoras a los procesos pueden referirse a las medidas de fermentacion, tales como agitacion y suministro de oxfgeno, por ejemplo, o la composicion de medios nutritivos, por ejemplo seleccion del azucar usado y la concentracion de azucar durante la fermentacion, o al tratamiento final hasta la forma de producto, por ejemplo por cromatograffa de intercambio ionico, o a las propiedades de salida intrmsecas del propio microorganismo.

Vfas biosinteticas de aminoacidos se someten a control metabolico estricto en cepas no mutantes, que garantiza que los aminoacidos se producen solo hasta el grado del propio requisito de la celula. Un requisito previo importante para los eficientes procesos de produccion es, por tanto, la disponibilidad de microorganismos adecuados que, a diferencia de los organismos no mutantes, tiene un resultado de produccion drasticamente elevado superior a sus propios requisitos (produccion en exceso) para la preparacion del aminoacido deseado.

Tales microorganismos que producen en exceso aminoacidos pueden ser generados por procesos de mutacion/seleccion convencionales y/o por modernas tecnicas recombinantes espedficas (ingeniena metabolica). El ultimo caso implica identificar en primer lugar genes o alelos que efectuan una produccion en exceso de aminoacidos por su modificacion, activacion o inactivacion. Entonces se usan tecnicas de biologfa molecular para introducir estos genes/alelos en una cepa de microorganismo o inactivarlos, para optimizar la produccion en exceso. Sin embargo, frecuentemente solo la combinacion de varias medidas diferentes produce una produccion ciertamente eficiente. Dichos genes o alelos pueden codificar enzimas, factores de transcripcion, transportadores y otros polipeptidos, cofactores o polipeptidos sintetizadores de cofactores, o componentes capaces de influir en la smtesis del aminoacido de interes. En una realizacion preferida, el termino "componentes", como se entiende en el presente documento, significa una subunidad de un polipeptido tal que influye en la smtesis del aminoacido de interes, subunidad que, aunque mas pequena que el sistema completo codificado por el gen u operon, por ejemplo una subunidad o un dominio de un polipeptido, es funcional con respecto a la tarea del sistema completo.

La L-metionina deriva de aspartato y serina. En E. coli se introduce azufre a modo de L-cistema (mediante cistationina como producto intermedio) en L-metionina por trans-sulfuracion. El grupo CH3 de L-metionina se origina del metabolismo de C1 y se transfiere a L-homocistema por metionina sintasas MetE o MetH (revision: Greene RC

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(1996) en Neidhardt FC et al. (eds) "Escherichia coli and Salmonella", 2a edicion, pp 542-560). Cepas y procesos para la produccion fermentativa de L-metionina se han descrito para E. coli, por ejemplo, en los documentos WO2006/001616 o WO2009/043803.

La via metabolica de shikimato para sintetizar, entre otros, corismato, enterobactina, menaquinona, tetrahidrofolato, ubiquinona y los aminoacidos aromaticos esta asimismo estrechamente regulada. La biosmtesis aromatica en E. coli esta regulada ya sea al nivel genetico por la atenuacion y represion, como por inhibicion de la retroalimentacion de enzimas (Frost y Draths, Annual review of microbiology, 49:557-79 (1995); Pittard, Genes to Cells 1(8):717-25 (1996)). Esta via hace coincidir la produccion de metabolitos aromaticos exactamente con los requisitos de la celula. La via de acido shikfmico se regula sobre todo controlando la reaccion inicial que se cataliza por tres isoenzimas diferentes de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintasa (DAHP sintasa, codificada por los genes aroF, aroG y aroH). El producto genico AroG constituye el 80 % de la actividad total de todas las DAHP sintasas en E. coli (Tribe et al., Journal of Bacteriology 127(3): 1085-1097 (1976); Pittard, Genes to Cells 1(8):717-25 (1996)); AroG es el 95 % inhibido por el aminoacido aromatico L-fenilalanina. Al nivel genetico, el regulador de TyrR, en presencia de fenilalanina y triptofano, reprime la transcripcion de aroG (Baseggio et al., Journal of Bacteriology 172(5):2547-57 (1990); Davies et al., Gene 33(3):323-31 (1985)). Las solicitudes EP 1 270 721 y EP 2 147 972 describen el efecto beneficioso de emplear un alelo de aroG en la produccion y preparacion de los aminoacidos aromaticos L- fenilalanina y L-triptofano usando cepas del genero Escherichia.

El documento EP 2 204 441 A1 ensena que un aumento del nivel de (p)ppGpp en celulas bacterianas conduce a una disminucion de la smtesis de ARN estable y un aumento de la expresion de algunos genes relevantes para la smtesis de aminoacidos y que la atenuacion de la actividad de PSII, es decir, del producto genico completo del gen spoT, conduce a una mejora de la smtesis de genes heterologos por estos.

Gentry y Cashel (D.R. Gentry y M. Cashel, Molecular Microbiology (1996) 19(6), 1373-1384) ensenan esencialmente que el producto genico de spoT contiene una region distinta que es responsable de la actividad de ppGppasa y una region distinta, pero de solapamiento, que es responsable de la actividad de PSII (es decir, (p)ppGpp sintetasa) de este producto genico.

En vista de lo anterior, el objeto en el que se basa la presente invencion es proporcionar una celula que mejore, con respecto a las celulas descritas en el estado de la tecnica, los metodos de preparacion de una celula tal y los metodos de uso de una celula tal para producir en exceso metionina o triptofano, refiriendose dicha mejora a factores tales como la concentracion intracelular obtenida del aminoacido producido en exceso, el rendimiento del aminoacido producido en exceso despues del procesamiento del cultivo, las propiedades de crecimiento de la celula y el tiempo y numero de etapas de metodo requeridas para producir en exceso y procesar dicho aminoacido, y los recursos requeridos por el proceso, por ejemplo con respecto a tiempo, energfa y cantidad de cepas y reactantes usados.

Este objeto se logra por por una celula de E. coli que ya produce en exceso metionina o triptofano,

y en la que la actividad de al menos una ppGppasa del grupo que comprende - las secuencias de aminoacidos - SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6 se reduce como resultado de dicha ppGppasa que tiene las siguientes modificaciones: esta presente una insercion de dos aminoacidos, His y Asn, entre Asp84 y Met85.

En una realizacion adicional, el problema se resuelve por una celula de E. coli, que ya produce en exceso metionina o triptofano, en la que la actividad de la ppGppasa segun SEQ ID NO:2 se reduce como resultado de dicha ppGppasa que tiene las siguientes modificaciones: esta presente una insercion de los dos aminoacidos His y Asn entre Asp84 y Met85 y preferentemente tiene al menos una modificacion del grupo que comprende sustituciones, preferentemente sustituciones no conservativas, en los aminoacidos Gln9, Thr13, Tyr63, Arg109, Gln225,

Cys245, Val248, Asn268, Ser270, Met280, His344, Pro436, Asn501, Gln505, His543, Ala546, Ser547, Ile548, His555, Gly556, His557, Pro559, Lys619, Thr621, Ala622, Thr627, Thr651, Ala669, Ala675, Thr698 y una insercion entre Glu343 y His344.

La ppGppasa de la celula de E. coli segun la presente invencion puede tener ademas al menos una modificacion del grupo que tiene las siguientes sustituciones o sustituciones de aminoacidos homologos al aminoacido que va a ser sustituido por los mismos aminoacidos:

1. ) sustitucion de Gln9 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Leu, Ile y Val, preferentemente Leu,

2. ) sustitucion de Thr13 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Lys, Arg, His, Gln y Asn, preferentemente Arg o Asn,

3. ) sustitucion de Tyr63 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Lys, Arg y His, preferentemente His,

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4. ) sustitucion de Arg109 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Gln y Asn, preferentemente Gln,

5. ) sustitucion de Gln225 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Ser, Ala y Thr, preferentemente Thr,

6. ) sustitucion de Cys245 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Leu, Ile y Val, preferentemente Leu,

7. ) sustitucion de Val248 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Lys, Arg y His, preferentemente His,

8. ) sustitucion de Asn268 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Lys, Arg y His, preferentemente L-His o Lys,

9. ) sustitucion de Ser270 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Leu, Ile y Val, preferentemente Ala o Val,

10. ) sustitucion de Met280 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Ser, Thr y Ala, preferentemente Ala,

11. ) insercion de los aminoacidos Lys y Glu entre los aminoacidos Glu343 y His344,

12. ) sustitucion de His344 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Gln y Asn,

preferentemente Gln,

13. ) sustitucion de Pro436 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Ser, Ala y Thr, preferentemente Ser,

14. ) sustitucion de Asn501 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Ser, Ala y Thr, preferentemente L-alanina,

15. ) sustitucion de Gln505 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Pro, Ser, Ala y Thr, preferentemente Pro o Ala,

16. ) sustitucion de His543 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Asn y Gln,

preferentemente Gln,

17. ) sustitucion de Ala546 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Asn y Gln,

preferentemente Gln,

18. ) sustitucion de Ser547 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Leu, Ile y Val, preferentemente Ala o Val,

19. ) sustitucion de Ile548 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Asn y Gln,

preferentemente Asn,

20. ) sustitucion de His555 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Leu, Ile y Val, preferentemente Val,

21. ) sustitucion de Gly556 por Lys, Arg y His, preferentemente Arg,

22. ) sustitucion de His557 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Asn y Gln,

preferentemente Gln,

23. ) sustitucion de Pro559 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Ser, Ala y Thr, preferentemente Ala,

24. ) sustitucion de Lys619 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Asn y Gln,

preferentemente Gln,

25. ) sustitucion de Thr621 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Leu, Ile y Val, preferentemente Ile,

26. ) sustitucion de Ala622 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Glu y Asp,

preferentemente Asp,

27. ) sustitucion de Thr627 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Ala y Gly,

preferentemente Ala,

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28. ) sustitucion de Thr651 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Glu y Asp,

preferentemente Glu,

29. ) sustitucion de Ala669 y/o Ala675 por Thr,

30. ) sustitucion de Thr698 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Gln y Asn,

preferentemente Asn.

La celula de E. coli segun la presente invencion preferentemente expresa en exceso, con respecto a su forma no mutante, al menos una secuencia de acidos nucleicos que codifica cualquiera de las siguientes enzimas:

1) sistema de transporte de tiosulfato/sulfato CysPUWA (EC 3.6.3.25),

2) 3'-fosfoadenosina-5'-fosfosulfato reductasa CysH (EC 1.8.4.8),

3) sulfito reductasa CysJI (EC 1.8.1.2),

4) cistema sintasa A CysK (EC 2.5.1.47),

5) cistema sintasa B CysM (EC 2.5.1.47),

6) serina acetiltransferasa CysE (EC 2.3.1.30),

7) sistema de escision de glicina GcvTHP-Lpd (EC 2.1.2.10, EC 1.4.4.2, EC 1.8.1.4),

8) lipoil sintasa LipA (EC 2.8.1.8),

9) lipoil-protema ligasa LipB (EC 2.3.1.181),

10) fosfoglicerato deshidrogenasa serA (EC 1.1.1.95),

11) 3-fosfoserina fosfatasa SerB (EC 3.1.3.3),

12) 3-fosfoserina/fosfohidroxitreonina aminotransferasa SerC (EC 2.6.1.52),

13) serina hidroximetiltransferasa GlyA (EC 2.1.2.1),

14) aspartocinasa I y homoserina deshidrogenasa I ThrA (EC 2.7.2.4, EC 1.1.1.3),

15) aspartato cinasa LysC (EC 2.7.2.4),

16) homoserina deshidrogenasa Hom (EC 1.1.1.3),

17) homoserina O-acetiltransferasa MetX (EC 2.3.1.31),

18) homoserina O-succiniltransferasa MetA (EC 2.3.1.46),

19) cistationina gamma-sintasa MetB (EC 2.5.1.48),

20) p C-S liasa AecD (EC 4.4.1.8, tambien denominada beta-liasa),

21) cistationina beta-liasa MetC (EC 4.4.1.8),

22) homocistema S-metiltransferasa independiente de B12 MetE (EC 2.1.1.14),

23) homocistema S-metiltransferasa dependiente de B12 MetH (EC 2.1.1.13),

24) metilentetrahidrofolato reductasa MetF (EC 1.5.1.20),

25) exportador de L-metionina BrnFE de Corynebacterium glutamicum,

26) exportador de valina YgaZH de Escherichia coli, preferentemente uno representado por los codigos de base de datos b2682, b2683 o variantes de los mismos,

27) supuesto transportador YjeH de Escherichia coli, preferentemente uno representado por el codigo de base de datos b4141 o variantes de los mismos,

28) piridina nucleotido transhidrogenasa PntAB (EC 1.6.1.2),

29) O-succinilhomoserina sulfhidrilasa MetZ (EC 2.5.1.48),

30) fosfoenolpiruvato carboxilasa Pyc (EC 4.1.1.31),

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31) tiosulfato sulfurtransferasa RDL2 (EC 2.8.1.1),

32) tiosulfato-tiol sulfurtransferasa (EC 2.8.1.3),

33) tiosulfato-ditiol sulfurtransferasa (EC 2.8.1.5).

La celula de E. coli segun la presente invencion expresa preferentemente en una escala reducida, con respecto a su forma no mutante, al menos un acido nucleico que codifica cualquiera de las siguientes enzimas:

1) regulador transcripcional de la biosmtesis de L-metionina (MetJ), preferentemente uno representado por los codigos de base de datos b3938, ECK3930 o variantes de los mismos,

2) glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi, EC 5.3.1.9), preferentemente una representada por los codigos de base de datos b4025, ECK4017 o variantes de los mismos,

3) homoserina cinasa (ThrB, EC 2.7.1.39), preferentemente una representada por los codigos de base de datos b0003, ECK0003 o variantes de los mismos,

4) S-adenosilmetionina sintasa (MetK, EC 2.5.1.6), preferentemente una representada por los codigos de base de datos b2942, ECK2937 o variantes de los mismos,

5) dihidrodipicolinato sintasa (DapA, EC 4.2.1.52), preferentemente una representada por los codigos de base de datos b2478, ECK2474 o variantes de los mismos,

6) fosfoenolpiruvato carboxicinasa (Pck, EC 4.1.1.49), preferentemente una representada por los codigos de base de datos b3403, ECK3390 o variantes de los mismos,

7) formiltetrahidrofolato hidrolasa (PurU, EC 3.5.1.10), preferentemente una representada por los codigos de base de datos b1232, ECK1227 o variantes de los mismos,

8) piruvato cinasa II (PykA, EC 2.7.1.40), preferentemente una representada por los codigos de base de datos b1854, ECK1855 o variantes de los mismos,

9) piruvato cinasa I (PykF, EC 2.7.1.40), preferentemente una representada por los codigos de base de datos b1676, ECK1672 o variantes de los mismos,

10) subunidad de transportador de L-metionina (MetQNI), preferentemente una representada por los codigos de base de datos b0197, ECK0197 o variantes de los mismos,

11) subunidad de transportador de L-metionina (MetQNI), preferentemente una representada por los codigos de base de datos b0198, ECK0198 o variantes de los mismos,

12) subunidad de transportador de L-metionina (MetQNI), preferentemente una representada por los codigos de base de datos b0199, ECK0199 o variantes de los mismos,

13) desoxicitidina 5'-trifosfato desaminasa (Dcd, EC 3.5.4.13), preferentemente una representada por los codigos de base de datos b2065, ECK2059 o variantes de los mismos,

14) supuesta N-aciltransferasa (YncA), preferentemente una representada por los codigos de base de datos b1448, ECK1442 o variantes de los mismos,

15) ARNp regulador FnrS, preferentemente uno representado por los codigos de base de datos b4699, ECK4511 o variantes de los mismos,

16) factor sigma RpoS, preferentemente uno representado por los codigos de base de datos b2741, ECK2736 o variantes de los mismos.

La celula de E. coli segun la presente invencion preferentemente expresa en exceso, con respecto a su forma no mutante, al menos una secuencia de acidos nucleicos de las siguientes enzimas:

1) antranilato sintasa (trpDE, EC 4.1.3.27), antranilato fosforribosil-transferasa (trpD, EC 2.4.2.18), fosforribosilantranilato isomerasa (trpC, EC 5.3.1.24), indol-3-glicerol-fosfato sintasa (trpC, EC 4.1.1.48) y triptofano sintasa (trpAB, EC 4.1.2.8 y 4.2.1.122),

2) fosfoglicerato deshidrogenasa serA (EC 1.1.1.95),

3) 3-fosfoserina fosfatasa SerB (EC 3.1.3.3),

4) 3-fosfoserina/fosfohidroxitreonina aminotransferasa SerC (EC 2.6.1.52),

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5) DHAP sintasa sensible a L-tirosina (aroF, EC 2.5.1.54),

6) DHAP sintasa resistente a retroalimentacion de L-fenilalanina (aroG, EC 2.5.1.54),

7) DHAP sintasa sensible a L-triptofano (aroH, EC 2.5.1.54),

8) fosfoeno/piruvato sintasa ppsA (EC 2.7.9.2),

9) fosfoenolpiruvato carboxicinasa pck (EC 4.1.1.49),

10) transcetolasa A tktA (EC 2.2.1.1),

11) transcetolasa B tktB (EC 2.2.1.1),

12) producto genico del marco de lectura abierto (ORF) de E. co/i yddG, preferentemente uno representado por los codigos de base de datos b1473, ECK1467 o variantes de los mismos.

La celula de E. co/i segun la presente invencion preferentemente expresa en una escala reducida, con respecto a su forma no mutante, al menos una secuencia de acidos nucleicos que codifica cualquiera de las siguientes enzimas:

1) triptofanasa (tnaA, EC 4.1.99,1),

2) represor del operon de trp (trpR), preferentemente uno representado por los codigos de base de datos b4393, ECK4385 o variantes de los mismos,

3) corismato mutasa T o prefenato deshidrogenasa (tyrA, EC 1.3.1.12),

4) corismato mutasa P o prefenato deshidrogenasa (pheA, EC 4.2.1.51),

5) protema de transporte espedfica de triptofano mtr, preferentemente una representado por los codigos de base de datos b3161, ECK3149 o variantes de los mismos,

6) triptofano permeasa (tnaB), preferentemente una representada por los codigos de base de datos b3709, ECK3702 o variantes de los mismos,

7) transportador para aminoacidos aromaticos (aroP), preferentemente uno representado por los codigos de base de datos b0112, ECK0111 o variantes de los mismos,

8) L-serina desaminasa (sdaA, EC 4.3.1.17),

9) glucosa-6-fosfato isomerasa (pgi, EC 5.3.1.9),

10) tirosina aminotransferasa (thrB), preferentemente una representada por los codigos de base de datos b4054, ECK4046 o variantes de los mismos,

11) represor del regulon de glp (glpR), preferentemente uno representado por los codigos de base de datos b3423, ECK3409 o variantes de los mismos,

12) factor sigma RpoS (rpoS), preferentemente uno representado por los codigos de base de datos b2741, ECK2736 o variantes de los mismos.

El problema tratado por la presente invencion se resuelve ademas por un metodo de preparacion de metionina o triptofano, que comprende la etapa de cultivar una celula de E. co/i que ya produce en exceso metionina, o triptofano, y esta geneticamente modificada en su forma no mutante de tal forma que tiene una actividad de ppGppasa reducida con respecto a su forma no mutante y en la que la celula de E. co/i tiene una actividad de (p)ppGpp-sintetasa que es esencialmente invariable con respecto a su forma no mutante, en la que dicha ppGppasa esta seleccionada preferentemente del grupo que comprende las secuencias de aminoacidos SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6, esta reducida como resultado de dicha ppGppasa que tiene al menos la siguiente modificacion: esta presente una insercion de los dos aminoacidos His y Asn entre Asp84 y Met85 con purificacion opcional del aminoacido.

Los inventores de la presente invencion han encontrado que el rendimiento de produccion de una celula que produce en exceso metionina o triptofano es sorprendentemente elevado por una situacion en la que dicha celula tiene una actividad de ppGppasa reducida con respecto a su forma no mutante. Sorprendentemente, esto es el caso particularmente si la actividad de (p)ppGpp-sintetasa de la celula es esencialmente invariable con respecto a su forma no mutante.

Una propiedad esencial de la celula segun la invencion es la de estar geneticamente modificada en su forma no mutante de tal forma que tiene una actividad de ppGppasa reducida con respecto a su forma no mutante. En una realizacion preferida, el termino "actividad de ppGppasa", como se usa en el presente documento, significa la

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actividad enzimatica de una guanosina-3',5'-bis(difosfato) 3'-difosfatasa (EC 3.1.7.2), es dedr, la capacidad para catalizar la rotura de guanosina-3',5'-bis(difosfato) (=ppGpp) para dar GDP y pirofosfato. En una realizacion preferida, el termino "ppGppasa", como se usa en el presente documento, significa una enzima que tiene actividad de ppGppasa, enzima que puede tener actividad de ppGppasa sola o una pluralidad de actividades, que incluye actividad de ppGppasa. ppGpp se produce con la accion de una guanosina-5'-trifosfato, 3'-difosfato pirofosfatasa (EC 3.6.1.40), a partir de guanosina-3'-difosfato 5'-trifosfato (=pppGpp), un compuesto que a su vez se produce por GTP difosfocinasas (EC 2.7.6.5, frecuentemente abreviada PSI y PSII en la bibliograffa) a partir de ATP y GTP. En una realizacion preferida, el termino "actividad de (p)ppGpp-sintetasa" comprende la capacidad, como se usa en el presente documento, de producir al menos uno, preferentemente ambos, de los dos compuestos pppGpp y ppGpp, preferentemente con hidrolisis de ATP. El estado de la tecnica describe numerosas ppGppasas y genes que codifican ppGppasas, por ejemplo en Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997)) y en bases de datos, por ejemplo NC_003197 (REGION: 3934070-3936181), NC_009832 (REGION: (5391421-5393532), NC_007613, NC_0o4741, NC_013971 y NC_009648. En una realizacion preferida, la expresion que una celula que esta geneticamente modificada en su forma no mutante de tal forma que tiene una actividad de ppGppasa reducida con respecto a su forma no mutante y "produce en exceso metionina o triptofano", como se usa en el presente documento, significa que la cepa de partida en la que se basa la celula ya produce un aumento de la cantidad del aminoacido relevante en comparacion con su cepa no mutante original, incluso antes e independientemente de la reduccion en la actividad de ppGppasa.

Un experto en la materia puede determinar la actividad de una enzima, por ejemplo de una ppGppasa o una (p)ppGpp sintetasa, basandose en ensayos de actividad, como aquellos que han descrito conjuntamente con metodos de evaluacion de experto e interpretacion de los parametros cineticos obtenidos con tales determinaciones en el estado de la tecnica, por ejemplo Cornish-Bowden, Fundamentals of Enzym Kinetics, Portland Press Limited, 1995. El estado de la tecnica describe ademas ensayos espedficos para determinar la actividad de (p)ppGpp sintetasas (Mechold et al., 1996, J. Bact. 178, 1401-1411) y ppGppasa (Gallant et al., 1970, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 35, 397). Brevemente, esto implica marcar las celulas que tienen la actividad que va a determinarse con nucleotidos radiomarcados, privarlas con respecto a isoleucina anadiendo 400 pg/ml de valina, seguido de extraer el conjunto de nucleotidos de la celula despues de 15 minutos de inhibicion de valina en acido formico 0,66 N y posterior fraccionamiento de pppGpp, ppGpp, pppG y pppA por medio de cromatograffa de capa fina en placas de PEI-celulosa en dihidrogenofosfato de potasio 1,5 M y visualizacion usando autorradiograffa. En una realizacion preferida, "una celula que esta geneticamente modificada en su forma no mutante de tal forma que tiene una actividad de ppGppasa reducida con respecto a su forma no mutante" significa que una celula tal bajo condiciones comparables tiene menos actividad de ppGppasa, medida a modo del numero de moleculas de ppGpp hidrolizadas por unidad tiempo, que una celula no mutante, es decir, en el orden de preferencia creciente, inferior al 70, 60, 40, 20, 10 o 5 % de la actividad de una celula no mutante. En una realizacion preferida adicional, "una celula que tiene una actividad de (p)ppGpp-sintetasa que es esencialmente invariable con respecto a su forma no mutante" significa que dicha celula en condiciones comparables tiene al menos el 90, 95, 99, 101, 105, 110 % de actividad de una celula no mutante, medida a modo del numero de moleculas de (p)ppGpp sintetizadas por unidad de tiempo. En una realizacion particularmente preferida, la celula es una cepa de E. coli, cuya actividad de ppGppasa de la secuencia SEQ ID NO. 2 o una variante se reduce, mientras que la actividad de la (p)ppGpp sintetasa de dicha celula es esencialmente invariable.

La introduccion de mutaciones espedficas en macromoleculas biologicas, a tanto niveles de acido nucleico como de aminoacido, es hoy en dfa parte de los metodos convencionales rutinariamente usados de biologfa molecular, microbiologfa y bioqmmica. Por ejemplo, pueden usarse metodos de mutagenesis dirigida al sitio que usan oligonucleotidos mutagenicos (T. A. Brown: Gentechnologie fur Einsteiger [Ingeniena genetica para principiantes], Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1993) o la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), como se describe en the manual por Gait: Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) o por Newton y Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994). Para manipular las mutaciones, puede usarse, por ejemplo, el kit de mutagenesis dirigida al sitio Quick Change de Stratagene (Amsterdam, Los Pafses bajos). El usar estos metodos implica amplificar la secuencia de partida, por ejemplo una secuencia codificante de ppGppasa descrita en el estado de la tecnica, con la ayuda de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de ADN total aislado de una cepa no mutante, clonacion de dicha secuencia en vectores plasmfdicos adecuados y luego someter el ADN al proceso de mutagenesis. Por medio de "GeneSOEing" (Gene Splicing by Overlap Extension, Horton, Molecular Biotechnology 3: 93-98 (1995)), las mutaciones puntuales pueden incluso obtenerse por PCR. Tambien puede usarse una smtesis genica de novo (por ejemplo, por GENEART AG, Regensburgo, Alemania) de las secuencias de nucleotidos para producir mutaciones en el gen spoT. Las mutaciones generadas pueden determinarse y comprobarse por secuenciacion de ADN, por ejemplo por el metodo de Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (12): 5463-5467, 1977). Los alelos generados pueden incorporarse en el cromosoma de cepas apropiadas, por ejemplo por transformacion y el metodo de sustitucion genica o de alelos.

Un metodo habitual, descrito por Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171, 4617 - 4622 (1989)), es el metodo de sustitucion genica con la ayuda de un derivado de pSC101 condicionalmente replicante pMAK705 o con pKO3 (Link et al., Journal of Bacteriology 179: 6228-6237). Asimismo, pueden utilizarse otros metodos descritos en el estado de la tecnica, por ejemplo aquellos de Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 1999, 7143-7148 (1999)) o aquellos de Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000)).

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Otro metodo habitual consiste en incorporar mediante secuencias flanqueantes homologas cortas un fragmento de ADN generado por PCR o smtesis genica directamente en el cromosoma con la ayuda de recombinasa Lambda Red, o llevar a cabo una sustitucion (Proc. Natl. Acad. Sci. 97(12), 6640-6645 (2000); Nature Genetics 20, 123 - 128, 1998).

Es asimismo posible transferir, por conjugacion o transduccion, los alelos generados en diversas cepas.

Aunque es tecnicamente factible introducir en macromoleculas biologicas numerosos nucleotidos o aminoacidos artificiales que no se producen naturalmente en secuencias de acido nucleico o de aminoacidos, por ejemplo en el transcurso de una smtesis qmmica completa o alterando el aparato de traduccion celular, la presente invencion, en una realizacion preferida, solo proporciona L-aminoacidos proteinogenicos para sustituciones para sustituir uno o mas de un aminoacido originalmente presente en el polipeptido particular. En una realizacion preferida, el termino aminoacido "proteinogenico" significa cualquier aminoacido de todas las formas L de los aminoacidos alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistema, glutamina, acido glutamico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina. En una realizacion preferida, el termino aminoacido "homologo" de un aminoacido en la secuencia no mutante de un polipeptido, como se usa en el presente documento, significa un aminoacido que se identifica en una secuencia de aminoacidos diferente, que esta relacionada con la secuencia no mutante con respecto a la estructura primaria, sin embargo, basandose en un alineamiento de las dos secuencias como que es el aminoacido correspondiente al aminoacido en la secuencia no mutante o que ocupa su posicion correspondiente en la secuencia de aminoacidos relacionada. Se han descrito metodos de realizacion de un alineamiento de dos o mas secuencias de aminoacidos en el estado de la tecnica, por ejemplo en Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 3a edicion, y comprenden el uso de paquetes de software tales como Clustal W (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22, 4637-4680, 1994) o MAFFT (Katoh et al., Genome Information, 16(1), 22-33, 2005). Por ejemplo, Arg26 en el polipeptido codificado por el gen Pax6 humano es homologo a Arg59 del gen de Drosophila eyeless, vease Lesk (2008), p. 36.

Los metodos geneticos de preparacion de los mutantes segun la invencion tambien comprenden, ademas de los metodos de ingeniena genetica, metodos geneticos tradicionales tales como metodos de mutagenesis in vivo usando poblaciones de celulas de cepas de Enterobacteriaceae y mutagenos tales como, por ejemplo, N-metil-N'- nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanosulfonato de etilo (EMS), 5-bromouracilo o luz ultravioleta. Los metodos de mutagenesis se describen, por ejemplo, en Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard et al. (Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981) o en Tosaka et al. (Agricultural and Biologial Chemistry 42(4), 745-752 (1978)) o en Konicek et al. (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)). Reacciones de mutagenesis tfpicas usando MNNG comprenden concentraciones de 50 a 500 mg/l o incluso concentraciones mas altas de hasta no mas de 1 g/l, y un periodo de incubacion de 1 a 30 minutos a pH 5,5 a 7,5. En estas condiciones, el numero de celulas viables se reduce una proporcion de aprox. del 50 % al 90 % o aprox. 50 % al 99 % o aprox. 50 % al 99,9 % o mas.

Se eliminan mutantes o celulas de la poblacion de celulas mutagenizadas y se propagan. En una etapa adicional, se investiga preferentemente su capacidad para secretar aminoacidos, preferentemente metionina o triptofano, en un cultivo discontinuo usando un medio nutritivo adecuado. En el caso de usos de sistemas roboticos adecuados como se describe, por ejemplo, en Zimmermann et al. (VDI Berichte No. 1841, VDI-Verlag, Dusseldorf, Alemania 2004, 439-443) o Zimmermann (Chemie Ingenenieur Technik 77 (4), 426-428 (2005)), pueden investigarse numerosos mutantes en un corto tiempo. En general, se investigan no mas de 3000, no mas de 10.000, no mas de 30.000 o incluso no mas de 60.000 mutantes, cuando corresponda tambien mas. De esta forma se identifican mutantes que, en comparacion con la cepa parental o cepa de partida no mutagenizada, presentan elevada secrecion de aminoacidos en el medio nutritivo o en el interior de la celula. Estos incluyen, por ejemplo, mutantes cuya secrecion de aminoacidos se aumenta al menos el 0,5 %.

Entonces se prepara o afsla ADN de los mutantes, y el polinucleotido correspondiente se sintetiza con la ayuda de la reaccion en cadena de la polimerasa usando pares de cebadores que permiten la amplificacion del gen spoT o del alelo spoT segun la invencion o de las mutaciones segun la invencion. El ADN se afsla preferentemente de mutantes que secretan aminoacidos a un grado elevado.

En una realizacion preferida, el termino "gen", como se usa en el presente documento, significa una seccion en el acido desoxirribonucleico (ADN), que contiene la informacion sobre la produccion (transcripcion) de principalmente un acido ribonucleico (ARN), conteniendo el ultimo la informacion sobre la produccion (traduccion) de una protema (polipeptido), en este caso un polipeptido que tiene la actividad de una (p)ppGpp sintetasa II. El hecho de que un gen o un polinucleotido contenga la informacion sobre la produccion de una protema tambien se denomina codificacion de una protema o polipeptido por el gen o por el ARN. Expresion genica indica la biosmtesis de ARN y protemas a partir de la informacion genetica contenida en ADN y genes. Se entiende que genes endogenos o polinucleotidos significa los marcos de lectura abiertos (ORF), genes o alelos o sus polinucleotidos presentes en la poblacion de una especie. Los terminos "gen" y "ORF" (marco de lectura abierto) se usan sinonimamente en la presente invencion.

En una realizacion preferida, el termino "polinucleotido", como se usa en el presente documento, significa un polirribonucleotido y polidesoxirribonucleotido, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado, siendo el termino polinucleotido usado sinonimamente e indistintamente con el termino "acido nucleico".

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En una realizacion preferida, el termino "polipeptido", como se usa en el presente documento, significa peptidos o protemas que incluyen dos o mas aminoacidos conectados mediante enlaces peptidicos. Los terminos polipeptido y protema se usan sinonimamente. Las protemas son uno de los elementos estructurales basicos de todas las celulas. No solo dan estructura a la celula, sino que tambien son las "maquinas" moleculares que transportan sustancias, catalizan reacciones qmmicas y reconocen agentes de senalizacion.

preferentemente, la forma L del aminoacido. En una realizacion preferida, la celula segun la invencion o el metodo segun la invencion se emplean para preparar un aminoacido esencial y/o derivado de serina y/o aromatico. En una realizacion preferida, el termino aminoacido "esencial" significa un aminoacido que no puede ser producido independientemente por un eucariota superior, preferentemente un eucariota superior de sangre caliente, incluso mas preferentemente un ave o mairnfero. En una realizacion mas preferida, esto tambien incluye aminoacidos que el organismo puede producir por sf mismo, pero solo si se internaliza en un precursor adecuado, lo mas preferentemente otro aminoacido, con la comida. En una realizacion preferida, el termino "un aminoacido derivado de serina", como se usa en el presente documento, significa un aminoacido que se produce mediante una via biosintetica que comprende al menos una reaccion que consume serina como reactante, incluyendo dicha via biosintetica preferentemente solo aquellas reacciones que contribuyen directamente a la tarea de la estructura del aminoacido que va a producirse, pero no reacciones que regeneran simplemente cofactores.

La celula segun la invencion o la celula producida o empleada en un metodo segun la invencion puede ser una celula de numerosos organismos que puede emplearse en biotecnologfa. En una realizacion preferida, es una celula procariota o eucariota inferior. En una realizacion preferida, el termino "celula eucariota inferior", como se usa en el presente documento, significa una celula eucariota unicelular, preferentemente una celula de levadura. Ejemplos de celulas eucariotas inferiores incluyen levaduras de los generos Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Picchia y Yarrowia. En otra realizacion preferida, la celula es una celula procariota, mas preferentemente una bacteria Gram-negativa, incluso mas preferentemente una celula seleccionada del grupo de generos que comprende Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia, incluso mas preferentemente una celula del genero Escherichia, y lo mas preferentemente E. coli. En una realizacion preferida, es una celula aislada mantenida a modo de un cultivo puro. Una realizacion adicional hace uso de una mezcla de cultivos. En una realizacion mas preferida, la celula es una bacteria de la cepa EMC1_spoT1849, vease el Ejemplo 4.

La celula segun la invencion para preparar al menos un aminoacido esta preferentemente intacta, con actividad metabolica no alterada. Sin embargo, la ensenanza segun la invencion tambien puede implementarse usando celulas parcialmente lisadas y parcialmente purificadas cuyo metabolismo es todavfa capaz de producir el (los) aminoacido(s) de interes. Si se da preferencia particular segun la invencion a aquellas celulas de E. coli que producen metionina o triptofano en una elevada cantidad de aminoacido particular con respecto a su forma no mutante tomada de la naturaleza, incluso antes de la modificacion genetica que causa una actividad de ppGppasa reducida, es decir, en forma de la cepa de partida correspondiente. En una realizacion preferida, el termino "cepa de partida", usada indistintamente con el termino "cepa parental", como se usa en el presente documento, significa la cepa de microorganismo en la que se Ilevan a cabo medidas de aumento de la productividad de uno o mas aminoacidos, peptidos o protemas, o medidas de aumento de la actividad de una o mas enzimas, por ejemplo una medida que produce la expresion en exceso. Una cepa de partida puede ser una cepa no mutante, pero tambien una cepa previamente modificada, por ejemplo una cepa que produce en exceso de al menos un L-aminoacido, que puede usarse como cepa productora.

El estado de la tecnica ha desvelado numerosas cepas que producen en exceso aminoacidos relevantes y tambien medidas y modificaciones por las que puede lograrse tal produccion en exceso. En una realizacion preferida, la cepa de E. coli que secreta o que produce L-metionina tiene preferentemente actividad enzimatica de aspartato cinasa (EC 2.7.2.4) potenciada, siendo preferidos alelos resistentes a la retroalimentacion. En E. coli hay tres aspartato cinasas diferentes, codificadas por los genes thrA, metL y lysC. En otra realizacion preferida, la biosmtesis de L- metionina aumenta debido a la atenuacion o delecion de la protema reguladora MetJ que esta codificada por el gen metJ. MetJ es el principal represor de la biosmtesis de L-metionina en E. coli.

En una realizacion preferida adicional, la cepa de partida de la celula deriva de una cepa del grupo que comprende MG1655 de Escherichia coli, W3110 de Escherichia coli, DH5a de Escherichia coli, DH10B de Escherichia coli, BW2952 de Escherichia coli, REL606 de Escherichia coli.

Todos los numeros de acceso y codigos de acceso usados para citar secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos del estado de la tecnica en la presente solicitud son numeros de acceso y codigos de acceso de la base de datos BioCyc de ISR, CA, EE.UU., en la version disponible en lmea el 1 de diciembre de 2011.

En una realizacion preferida adicional, la celula deriva de la cepa productora de E. coli que produce en exceso metionina MG1655 AmetJ metA*11 Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ApykF ApykA Ptrc09- gcvTHP ApurU Ptrc36-ARNmst17-metF que comprende los plasmidos de produccion pME101-thrA*1-cysE-Pgap- metA*11 y pCC1 BAC-serB-glyA-serA-serC (documento WO2009/043803).

En una realizacion preferida adicional, la celula deriva de la cepa productora de E. coli que produce en exceso metionina MG1655 AmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP que comprende el

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plasmido de produccion pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11. Esta cepa puede ser clonada por varias transducciones P1 y tratamiento, como se describen en la solicitud WO2009/043803. La cepa se basa en la cepa no mutante de E. coli K12 MG1655. Las siguientes modificaciones se introdujeron en el genoma de esta cepa: delecion del gen para el represor de la biosmtesis de L-metionina, metJ; insercion del promotor trc fuerte en la direccion 5' del gen metH que codifica la metionina sintasa dependiente de cobalamina; insercion del promotor trc fuerte en la direccion 5' del gen metF que codifica 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa; insercion del promotor trc fuerte en la direccion 5' del operon cysPUWAM, codificando cysPUWA un transportador de la captacion de sulfato/tiosulfato y codificando cysM la cistema sintasa B; insercion del promotor trc fuerte en la direccion 5' del operon cysJIH, codificando cysJI sulfito reductasa y codificando cysH 3'-fosfo-adenilil-sulfato reductasa; insercion del promotor trc09 fuerte en la direccion 5' del operon gcvTHP, codificando gcvT, gcvH y gcv P tres componentes del sistema de escision de glicina.

La clonacion del plasmido de produccion de E. coli pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11 se describe en las solicitudes WO2007/077041 y WO2009/043803. Es un plasmido de baja copia basado en el vector pCL1920 (Lerner, C.G. e Inouye, M., Nucl. Acids Res. (1990) 18:4631 [pMiD: 2201955]). El plasmido vado, pME101, aloja el gen lacf que codifica un alelo fuertemente expresado del represor lac. El gen thrA*1 se clono en la direccion 3' de un promotor trc fuerte que puede ser reprimido por el represor Lac. Codifica un variante resistente a la retroalimentacion de la aspartato cinasa / homoserina deshidrogenasa de E. coli ThrA. El gen cysE, que incluye su promotor natural, esta localizado en la direccion 3' del mismo, en la misma orientacion. Codifica la serina acetiltransferasa de E. coli. Despues de la direccion 3' de cysE esta el promotor de gapA de E. coli fuerte que controla la expresion del gen metA*11. metA*11 codifica una variante resistente a la retroalimentacion de la homoserina O-succiniltransferasa de E. coli.

Ejemplos de otros microorganismos secretores y productores de L-metionina que pueden mencionarse son las siguientes cepas: TF4076BJF metA#10 + metYX(Lm) de E. coli (documento WO2008/127240); W3110AJ/pKP451 de E. coli (documento EP 1 445 310 B1, pagina 7, ejemplo 4); WAthrBCAmetJmetK32 pMWPthrmetA4A5A9 de E. coli (Yoshihiro Usuda y Osamu Kurahashi, 2005, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 71, No. 6, p. 3228-3234); y W3110/pHC34 (documento WO01/27307 pagina 13, Ejemplo 3). Ejemplos adicionales de diversos microorganismos adecuados se describen en Gomes et al. (Enzyme and Microbial Technology 37, 2005, 3-18).

El estado de la tecnica tambien describe cepas que producen en exceso triptofano y tambien medidas y modificaciones por las que la produccion en exceso de este aminoacido puede lograrse, por ejemplo JP4735/pMU3028 de E. coli (documento US5.756.345), JP6015/pMU91 de E. coli (documento US5.756.345), SV164(pGH5) de E. coli (documento WO94/08031), AGX17(pGX44) de E. coli (NRRL B-12263) (documento US4.371.614), AGX6(pGX50)aroP de E. coli (NRRL B-12264) (documento US4.371.614), AGX17/pGX50,pACKG4- pps de E. coli (documento WO97/08333), ATCC 31743 de E. coli (CA1182409), C534/pD2310,pDM136 de E. coli (ATCC 39795) (documento WO87/01130), JB102/p5LRPS2 de E. coli (documento US5.939.295).

En una realizacion preferida, las cepas que producen en exceso L-triptofano de la familia Enterobacteriaceae tienen una o mas de una caractenstica fenotfpica genetica seleccionada del grupo que comprende resistencia a 5-metil-DL- triptofano, resistencia a 5-fluorotriptofano, resistencia a 4-metil-DL-triptofano, resistencia a 6-metil-DL-triptofano, resistencia a 4-fluorotriptofano, resistencia a 6-fluorotriptofano, resistencia a antranilato, resistencia a triptazano, resistencia a indol, resistencia a acido indolacnlico, necesidad de fenilalanina, necesidad de tirosina, opcionalmente capacidad para utilizar sacarosa, potenciamiento del operon de triptofano, preferentemente de antranilato sintasa, preferentemente de la forma resistente a la retroalimentacion, una triptofanoil-ARNt sintasa parcialmente defectuosa, una captacion de triptofano atenuada, una triptofanasa defectuosa, protemas represoras inactivadas, potenciamiento de la biosmtesis de serina, potenciamiento de la smtesis de fosfoeno/piruvato, potenciamiento de la smtesis de D- eritrosa-4-fosfato, potenciamiento de la smtesis de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato (DHAP) y potenciamiento de la biosmtesis de corismato.

Ademas de al menos una modificacion genetica que causa una reduccion en la actividad de ppGppasa, la celula segun la invencion puede tener modificaciones adicionales con respecto a la cepa de partida que efectuan un aumento en la produccion de aminoacido(s) de interes, en particular alterando la expresion genica. En una realizacion preferida, la expresion que la celula esta geneticamente modificada en su forma no mutante de tal forma que se "expresa a un grado reducido o expresa en exceso al menos una secuencia de acidos nucleicos o una variante de los mismos", con respecto a su forma no mutante, como se usa en el presente documento, significa que la celula geneticamente modificada produce una cantidad mas baja o una cantidad mas alta de producto de transcripcion y/o de traduccion de la secuencia de acidos nucleicos que hana la celula geneticamente no modificada, en condiciones comparables, por ejemplo temperatura, suministro de nutrientes y densidad celular.

La expresion de un acido nucleico puede aumentarse, por ejemplo, aumentando el numero de copias de los polinucleotidos correspondientes cromosomicamente o extracromosomicamente por al menos una copia. Un metodo ampliamente usado de aumento del numero de copias consiste en insertar el polinucleotido relevante en un vector, preferentemente un plasmido, que es replicado por una bacteria. Ejemplos de vectores plasmfdicos adecuados para Enterobacteriaceae son vectores de clonacion derivados de pACYC184 (Bartolome et al.; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315, 1988) o derivados de pSC101 (Vocke y Bastia; Proc. Natl. Acad. Sci. 80(21): 6557-6561, 1983). Tambien son particularmente adecuados plasmidos derivados de pCL1920 (Lerner, C.G.

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e Inouye, M., Nucl. Acids Res., 1990, 18:4631 [PMID: 2201955]). Vectores plasirndicos derivados de "cromosomas artificiales bacterianos" (BAC), por ejemplo pCC1BAC (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, EE.UU.), son asimismo adecuados para aumentar el numero de copias de los polinucleotidos relevantes en E. coli.

Vectores que pueden ademas emplearse son transposones, elementos de insercion (elementos IS) o fagos. Estos tipos de sistemas geneticos se ilustran, por ejemplo, en las patentes US 4.822.738, US 5.804.414 y US 5.804.414. Similarmente, puede usarse el elemento IS ISaBI descrito en el documento WO 92/02627 o el transposon Tn 45 del plasmido pXZ10142 (citado en "Handbook of Corynebacterium glutamicum" (editores: L. Eggeling y M. Bott)).

Otro metodo comun de aumento de la expresion es el metodo de amplificacion genica cromosomica. Este metodo implica insertar al menos una copia adicional del polinucleotido de interes en el cromosoma de una celula. Procesos de amplificacion de este tipo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 03/014330 o WO 03/040373.

Otro metodo de aumento de la expresion consiste en enlazar funcionalmente el gen o alelo relevante a un promotor o un casete de expresion (operativamente unido). Promotores adecuados para E. coli son, por ejemplo, los promotores descritos por Amann et al. (Gene 69(2), 301-315, 1988) y Amann y Brosius (Gene 40(2-3), 183-190, 1985), T3, T7, SP6, M13, lac, tac y trc. Un promotor de este tipo puede insertarse, por ejemplo, en la direccion 5' del gen en cuestion, normalmente a una distancia de aproximadamente 1 - 500 bases de nucleotidos desde el codon de iniciacion. El documento US 5.939.307 informa que la incorporacion de casetes de expresion o promotores tales como, por ejemplo, promotor tac, promotor trp, promotor Ipp o promotor PL y promotor PR de A fago, por ejemplo en la direccion 5' del operon de treonina cromosomico, logro un aumento en la expresion. Los promotores del fago T7, los promotores gear-box, los promotores nar o los promotores de los genes rrsG, rnpB, csrA, csrB, ompA, fusA, pepQ, rplX y rpsG pueden usarse de un modo similar. Estos tipos de casetes de expresion o promotores tambien pueden usarse con el fin de expresar en exceso genes unidos a plasmido, como se describe en el documento EP 0 593 792. Usando el alelo laclQ, puede a su vez controlarse la expresion de genes (Glascock y Weickert, Gene 223, 221-231, 1998). Un experto en la materia puede ademas aumentar la actividad de dichos promotores modificando su secuencia por medio de una o mas sustituciones de nucleotido, por insercion (inserciones) y/o delecion (deleciones).

El grado de expresion de un acido nucleico o una variante del mismo puede reducirse por tratamiento del cultivo adecuado, por modificacion (mutacion) genetica de las estructuras senal de expresion genica o incluso por tecnologfa de ARN antisentido. Las estructuras senal de expresion genica son, por ejemplo, genes represores, genes activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de union al ribosoma, codon de iniciacion y terminadores. El experto en la materia encuentra informacion de estos, entre otros, por ejemplo en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195, 1998), en Carrier y Keasling (Biotechnology Progress 15: 58-64, 1999), Franch y Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159-164, 2000), Kawano et al. (Nucleic Acids Research 33(19), 6268-6276, 2005) y en libros de texto conocidos de genetica y biologfa molecular tales como, por ejemplo, el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik" [Genetica Molecular], 6a edicion, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995) o el de Winnacker ("Gene und Klone" [Genes y clones], VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990). En una realizacion preferida, el termino "inactivacion" de un gen, como se usa en el presente documento, significa que el gen o la maquinaria celular requerida para su expresion o acidos nucleicos requeridos o partes de los mismos, por ejemplo promotores, han sido geneticamente modificados, por ejemplo, por mutacion, delecion o insercion, de tal forma que la expresion se reduce, en el orden de preferencia creciente, el 50, 75, 80, 85, 90, 95 o el 99 %. Es posible, por ejemplo, para la expresion del gen que se ponga bajo el control de un promotor que conduce a la expresion reducida en el microorganismo usado para el metodo en comparacion con la cepa de partida. La expresion puede ademas reducirse delecionando el gen o partes de los mismos en el microorganismo usado para el metodo. Tambien es posible usar transiciones, transversiones o inserciones que conducen a mutaciones de aminoacido o mutaciones terminadoras. La expresion puede ademas reducirse usando un sitio de union al ribosoma que conduce a traduccion reducida en el microorganismo usado para el metodo en comparacion con la cepa de partida. Un experto en la materia puede ademas reducir la expresion del gen, empeorando el uso de codones con respecto al microorganismo usado para el metodo. Finalmente, la expresion genica puede ser, se reduce suprimiendo una mutacion de codon de parada en la region codificante del gen por medio de supresores de ARNt adecuados.

La celula segun la invencion o usada segun la invencion presenta elevada secrecion o produccion del aminoacido deseado en un proceso de fermentacion en comparacion con la cepa de partida o cepa parental empleada, siendo los aminoacidos liberados en el medio circundante o acumulados dentro de la celula.

El rendimiento de la celula segun la invencion o del proceso de fermentacion usando el mismo con respecto a uno o mas de los parametros seleccionados del grupo que consiste en concentracion de producto (producto por volumen), rendimiento de producto (producto formado por fuente de carbono consumida) y formacion de producto (producto formado por volumen y tiempo), o incluso otros parametros de proceso y combinaciones de los mismos, mejora al menos el 0,5 %, al menos el 1 %, al menos el 1,5 % o al menos el 2 % basado en la cepa de partida o cepa parental o el proceso de fermentacion usando el mismo.

La celula puede cultivarse en el metodo segun la invencion continuamente - como se describe, por ejemplo, en el documento PCT/EP2004/008882 - o discontinuamente en un proceso discontinuo (cultivo discontinuo) o un proceso de alimentacion de lotes o un proceso de alimentacion de lotes repetido, con el fin de producir L-aminoacidos. Un

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sumario general de metodos de cultivo conocido esta disponible en el libro de texto por Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Tecnolog^a de bioprocesos 1. Introduccion a la tecnologfa de bioprocesos] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto por Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Biorreactores y equipo periferico] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo o el medio de fermentacion que va a usarse debe cumplir adecuadamente los requisitos de las cepas particulares. Descripciones de medios de cultivo de diferentes microorganismos se dan, por ejemplo, en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" publicado por la Sociedad Americana de Bacteriologfa (Washington D.C., EE.UU., 1981). Los terminos medio de cultivo, medio de fermentacion y medio son mutuamente intercambiables.

La fuente de carbono empleada puede ser azucares e hidratos de carbono, por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, disoluciones que contienen sacarosa derivadas de la produccion de remolacha azucarera o cana de azucar, almidon, hidrolizado de almidon y celulosa, aceites y grasas, por ejemplo aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco, acidos grasos, por ejemplo acido palmftico, acido estearico y acido linoleico, alcoholes, por ejemplo glicerol, metanol y etanol, y acidos organicos, por ejemplo acido acetico. Estas sustancias pueden usarse individualmente o como mezclas.

La fuente de nitrogeno empleada puede ser compuestos que contienen nitrogeno organicos, tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, extracto soluble de mafz, harina de soja y urea, o compuestos inorganicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio, nitrato de amonio, amoniaco y tiosulfato de amonio. Las fuentes de nitrogeno pueden usarse individualmente o como mezclas.

La fuente de fosforo empleada puede ser acido fosforico, dihidrogenofosfato de potasio o dihidrogenofosfato de dipotasio o las sales que contienen sodio correspondientes.

La fuente de azufre empleada puede ser una sal de acido ditiosulfurico (tiosulfato), tanto sola como junto con otras fuentes de azufre, por ejemplo sulfato, sulfito, sulfuro, hidrogenosulfuro, metanotiolato o ditionito, vease tambien la solicitud EP 11151526.8.

El medio de cultivo debe ademas contener sales, por ejemplo en forma de cloruros, de metales, por ejemplo sodio, potasio, magnesio, calcio y hierro, por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, pueden usarse sustancias de crecimiento tales como aminoacidos, por ejemplo homoserina, y vitaminas, por ejemplo cobalamina, tiamina, biotina o acido pantotenico, ademas de las sustancias mencionadas anteriormente.

Ademas de estos, pueden anadirse precursores adecuados del aminoacido particular al medio de cultivo.

Las sustancias empleadas mencionadas pueden anadirse al cultivo en forma de una mezcla de una sola vez o alimentarse en un modo adecuado durante el cultivo.

Se emplean compuestos basicos tales como hidroxido sodico, hidroxido potasico, amoniaco o amoniaco acuoso, o compuestos de acido tales como acido fosforico o acido sulfurico, en un modo adecuado para controlar el pH del cultivo. En general, el pH se ajusta a un valor de 6,0 a 9,0, preferentemente de 6,5 a 8. Es posible usar antiespumantes, tales como esteres de poliglicol de acido graso, para controlar la formacion de espuma. Pueden anadirse sustancias adecuadas que actuan selectivamente, por ejemplo antibioticos, al medio con el fin de mantener la estabilidad de los plasmidos. Con el fin de mantener las condiciones aerobias, se pasa oxfgeno o mezclas de gas que contiene oxfgeno, tales como aire, al cultivo. Tambien es posible usar lfquidos que estan enriquecidos con peroxido de hidrogeno. Cuando corresponda, la fermentacion se realiza a presion positiva, por ejemplo bajo una presion de 0,03 a 0,2 MPa. La temperatura del cultivo normalmente es de 20 °C a 45 °C, y preferentemente de 25 °C a 40 °C. En el caso de procesos discontinuos, el cultivo continua hasta que se ha producido un maximo del aminoacido deseado. Este objetivo normalmente se logra en el plazo de 10 horas a 160 horas. Son posibles tiempos de cultivo mas largos en el caso de procesos continuos.

Medios de fermentacion adecuados se describen, entre otros, en los documentos US 6.221.636, US 5.840.551, US 5.770.409, US 5.605.818, US 5.275.940 y US 4.224.409.

El caldo de fermentacion preparado de esta forma se somete entonces a procesamiento adicional en un producto solido o lfquido.

En una realizacion preferida, un "caldo de fermentacion", como se usa en el presente documento, se entiende como que significa un medio de fermentacion en el que un microorganismo se ha cultivado durante un cierto tiempo y una cierta temperatura. El medio de fermentacion, o el medio empleado durante la fermentacion, contiene todas las sustancias o componentes que se requieren para la propagacion del microorganismo y formacion del aminoacido deseado.

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Al final de la fermentacion, el caldo de fermentacion resultante contiene por consiguiente a) la biomasa del microorganismo que ha sido producido debido a la propagacion de las celulas de dicho microorganismo, b) el aminoacido deseado formado durante la fermentacion, c) los subproductos formados durante la fermentacion, y d) los constituyentes del medio de fermentacion/medios de fermentacion empleados, o de las sustancias empleadas, por ejemplo vitaminas, tales como biotina, aminoacidos tales como homoserina, o sales tales como sulfato de magnesio, constituyentes que no fueron consumidos por la fermentacion.

Los subproductos incluyen sustancias que se generan por los microorganismos empleados en la fermentacion, ademas del L-aminoacido deseado particular, y que pueden ser secretadas. Incluyen L-aminoacidos que ascienden a menos del 30 %, 20 % o 10 % en comparacion con el aminoacido deseado, ademas de acidos organicos que tienen de uno a tres grupos carboxilo, por ejemplo acido acetico, acido lactico, acido cftrico, acido malico o acido fumarico, y tambien azucares, por ejemplo trehalosa.

Caldos de fermentacion ffpicos que son adecuados para fines industriales tienen un contenido de aminoacidos de 40 g/kg a 180 g/kg o de 50 g/kg a 150 g/kg. En general, el contenido de biomasa (a modo de biomasa seca) es de 20 a 50 g/kg.

El estado de la tecnica ha descrito numerosos procesos para purificar el aminoacido a partir del caldo de cultivo o caldo de fermentacion producido, incluyendo cromatograffa de intercambio ionico, cristalizacion, procesos de extraccion y tratamiento con carbono activo. Esto produce L-aminoacidos ampliamente puros que tienen un contenido de > 90 % en peso, > 95 % en peso, > 96 % en peso, > 97 % en peso, > 98 % en peso o > 99 % en peso.

Es asimismo posible purificar un aminoacido a partir del caldo de fermentacion producido eliminando la biomasa de las bacterias contenidas en el caldo de fermentacion completamente (100 %) o casi completamente, es decir, mas de o superior a (>) 90 %, > 95 %, > 97 %, > 99 %, y dejar los otros constituyentes del caldo de fermentacion en gran medida, es decir, 30 % -100 %, 40 % -100 %, 50 % -100 %, 60 % -100 %, 70 % -100 %, 80 % -100 %, o 90 % - 100 % de los mismos, preferentemente mas de o superior a (>) 50 %, > 60 %, > 70 %, > 80 %, > 90 % o > 95 %, o incluso completamente (100 %) en el producto.

Se emplean metodos de separacion tales como, por ejemplo, centrifugacion, filtracion, decantacion, floculacion o una combinacion de los mismos, para eliminar o separar la biomasa.

El caldo obtenido se espesa o concentra entonces usando metodos conocidos tales como, por ejemplo, con la ayuda de un evaporador rotatorio, evaporador de capa fina, evaporador de pelfcula descendente, por osmosis inversa, por nanofiltracion o una combinacion de los mismos.

Este caldo concentrado se procesa entonces por metodos de liofilizacion, secado por pulverizacion, granulacion por pulverizacion o por otros procesos para dar un polvo finamente dividido preferentemente vertible. Este polvo finamente dividido vertible puede entonces a su vez convertirse en un producto de grano grueso, facilmente vertible, almacenable y en gran medida libre de polvo por procesos de compactacion o granulacion adecuados. Esto implica eliminar en conjunto mas del 90 % de agua, de manera que el contenido de agua en el producto sea inferior al 10 % en peso, inferior al 5 % en peso, inferior al 4 % en peso o inferior al 3 % en peso.

El analisis de L-aminoacidos para determinar la concentracion en uno o mas momentos durante la fermentacion puede llevarse a cabo separando los L-aminoacidos por medio de cromatograffa de intercambio ionico, preferentemente cromatograffa de intercambio cationico, con posterior derivatizacion post-columna usando ninhidrina, como se describe en Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)). Tambien es posible emplear orfo-ftalaldetffdo en vez de ninhidrina para la derivatizacion post-columna. Un arffculo de resumen sobre la cromatograffa de intercambio ionico puede encontrarse en Pickering (LC-GC (Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989)).

Es asimismo posible llevar a cabo una derivatizacion pre-columna, por ejemplo usando orfo-ftalaldetffdo o isotiocianato de fenilo, y fraccionar los derivados de aminoacido resultantes por cromatograffa de fase inversa (RP), preferentemente en forma de cromatograffa de lfquidos de alta resolucion (HPLC). Un metodo de este tipo se describe, por ejemplo, en Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).

La deteccion se lleva a cabo fotometricamente (absorbancia, fluorescencia).

Una revision referente al analisis de aminoacidos puede encontrarse, entre otros, en el libro de texto "Bioanalytik" por Lottspeich y Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania 1998).

La presente invencion se ilustra ademas por las figuras y ejemplos no limitantes, a continuacion, a partir de los cuales pueden sacarse caracteffsticas, realizaciones, aspectos y ventajas adicionales de la presente invencion.

La Fig. 1 muestra un mapa del plasmido pMAK-ligB que contiene una seccion del gen ligB.

La Fig. 2 muestra un mapa del plasmido pCC3.

La Fig. 3 muestra un mapa del plasmido pME-RDL2a.

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La informacion de longitud debe tomarse como valores aproximados. Las abreviaturas y nombres de referencia usados tienen el siguiente significado:

aadA1: gen de resistencia a estreptomicina/espectinomicina

laclq: gen para la protema represora del promotor trc

repAts: protema de replicacion de plasmidos (ts); tambien repA

oriV: origen de replicacion

ori2: origen de replicacion

cam/Cm: gen de resistencia a cloranfenicol

insercion ligB: parte de la region codificante del gen ligB

serC: region codificante del gen serC

serA: region codificante del gen serA

glyA: region codificante del gen glyA

serB: region codificante del gen serB

thrA*1: region codificante del gen thrA(alelo resistente a la retroalimentacion) cysE: region codificante del gen cysE PgapA: promotor gap

metA*11: region codificante del gen metA(alelo resistente a la retroalimentacion)

RDL2a: region codificante del alelo RDL2 que codifica tiosulfato sulfurtransferasa

Las abreviaturas para las enzimas de restriccion se definen como sigue:

Agel: endonucleasa de restriccion de Ruegeria gelatinovora

HindIII: endonucleasa de restriccion de Haemophilus influenzae Rd

Xbal: endonucleasa de restriccion de Xanthomonas campestris

Kpnl: endonucleasa de restriccion de Klebsiella pneumoniae

La presente invencion se ilustra mas abajo en mas detalle basandose en realizaciones a modo de ejemplo.

Medios mmimos (M9) y completos (LB) usados para E. coli se han descrito por J.H. Miller (A Short Course in Bacteriol Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press). El aislamiento de ADN de plasmido de E. coli y todas las tecnicas referentes a la restriccion, ligacion, tratamiento con Klenow y con fosfatasa alcalina se llevan a cabo segun Sambrook et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press), a menos que se establezca de otro modo. La transformacion de E. coli se lleva a cabo segun Chung et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 2172-2175, 1989), a menos que se establezca de otro modo.

A menos que se establezca de otro modo, la temperatura de incubacion para la produccion de cepas y transformantes es 37 °C.

Ejemplo 1

Clonacion de pMAK-ligB

Se clono el plasmido pMAK-ligB como un marcador de seleccion para la transduccion de alelos spoT y se inserto en el gen ligB en el cromosoma de DM1849 de E. coli. El gen ligB esta localizado en el cromosoma aproximadamente 1,2 kbp en la direccion 5' de spoT. La cepa DM1849 de E. coli tiene un alelo spoT segun la invencion.

Los cebadores de PCR ligB-up y ligB-down tienen en sus extremos 5' en cada caso 6 nucleotidos aleatoriamente seleccionados, seguido de secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restriccion Xbal (tctaga) y Kpnl (ggtacc), respectivamente. Los nucleotidos 13 a 32 de ligB-up se unen desde las posiciones 3817496 a 3817516 en

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el genoma de MG1655 de E. coli. Los nucleotidos 13 a 32 de ligB-down se unen desde las posiciones 3818519 a 3818498 en el genoma de MG1655 de E. coli.

ligB-up (SEQ ID NO:9)

5' CAGTACtctagaAGCCACGAAGGACACTAAGG 3' ligB-down (SEQ ID NO:10)

5' TTAGTTggtaccCGGATGGACCGCAGTTAATG 3'

Se usaron estos dos cebadores y ADN genomico de MG1655 de E. coli como molde para llevar a cabo una PCR. El producto de PCR fue 1045 pb de longitud e incluyo la secuencia desde las posiciones 3817496 a 3818519 del genoma de MG1655 (SEQ ID NO:11).

Dicho producto de PCR se purifico usando un kit de purificacion QIAquick PCR (Qiagen, Hilden, Alemania), se escindio por las enzimas de restriccion XbaI y KpnI y se purifico otra vez. El plasmido pMAK705 (Hamilton CM, Aldea M, Washburn BK, Babitzke P, Kushner SR (1989); J Bacteriol.; 171(9): 4617-4622) se escindio por las enzimas de restriccion XbaI y KpnI, se desfosforilo por fosfatasa alcalina (fosfatasa alcalina, intestinal de ternero, New England Biolabs, Frankfurt a.M., Alemania) y se purifico usando un kit de purificacion por PCR QIAquick (Qiagen, Hilden). El producto de PCR se ligo entonces con pMAK705, y la mezcla de ligacion se transformo en DH5a de E. coli. Se seleccionaron clones de plasmido correctos por 20 mg/l de cloranfenicol y se identificaron por escision con restriccion y posterior secuenciacion de las inserciones. El plasmido obtenido de esta forma se llamo pMAK-ligB.

Ejemplo 2

Integracion de pMAK-ligB en la cepa donante DM1849

La cepa DM1849 de E. coli lleva tres mutaciones en el gen spoT que codifican ppGppasa: una insercion de los seis nucleotidos CATGAT en la direccion 3' de la posicion de nucleotido 252 (correspondiente a la posicion 3820674 en el genoma de MG1655), la sustitucion g520t (basada en el gen spoT no mutante, correspondiente a la posicion 3820942 en el genoma de MG1655) y la sustitucion c1585t (basada en el gen spoT no mutante, correspondiente a la posicion 3822007 en el genoma de MG1655).

La cepa DM1849 se transformo con el plasmido pMAK-ligB por electroporacion. pMAK-ligB tiene un gen de resistencia a cloranfenicol y un origen de replicacion sensible a la temperatura. El plasmido se replica por E. coli a 30 °C pero no a 44 °C. La mezcla de transformacion se sembro en placa sobre agar LB que contema 20 mg/l de cloranfenicol y se incubo a 30 °C durante 40 horas. Entonces, las celulas se recogieron usando un bucle de inoculacion, se resuspendieron en medio LB y se diluyeron 1 en 10.000 con medio LB. Se sembraron 100 pl de la dilucion en placa sobre agar LB que contema 20 mg/l de cloranfenicol y se incubaron a 44 °C durante otras 24 horas. Como resultado, se seleccionaron colonias donde el plasmido pMAK-ligB se habfa integrado cromosomicamente en el gen ligB. Una de estas colonias se aclaro usando un bucle de inoculacion sobre agar LB que contema 20 mg/l de cloranfenicol y se incubo a 44 °C durante 24 horas. La cepa resultante se llamo DM1849::pMAK-ligB.

Ejemplo 3

Generacion de una biblioteca de fagos P1 a partir de DM1849::pMAK-ligB

Primero, se inocularon 10 ml de medio LB con la cepa DM1849::pMAK-ligB y se cultivaron a 44 °C durante 18 horas. Posteriormente, se transfirieron 100 pl del cultivo a 10 ml de medio LB y se cultivaron a 44 °C a una densidad optica (a 600 nm) de 0,5. Entonces se anadieron cloruro de calcio, hasta una concentracion final de 5 mM, y glucosa, hasta una concentracion final de 2 g/l. Esto fue seguido de anadir 100 pl de una suspension de fago P1 e incubar las celulas a 37 °C. Despues de 4 horas, el cultivo se centrifugo y el sobrenadante se esterilizo por filtracion dos veces.

Ejemplo 4

Transduccion de ECM1 de E. coli productora de metionina con la biblioteca de fagos P1 a partir de DM1849::pMAK- ligB para transferir las tres mutaciones de DM1849

La cepa ECM1 de E. coli productora de L-metionina lleva un alelo metA resistente a retroalimentacion, una delecion del gen metJ y una copia del promotor trc fuerte en la direccion 5' de cada uno de los genes metH, metF, cysP y cysJ. Se basa en la cepa de K12 no mutante MG1655.

Se inocularon 10 ml de medio LB con la cepa aceptora ECM1 y se cultivaron a 37 °C durante 18 horas. Esto fue seguido de eliminacion de 2 ml del cultivo por centrifugacion y resuspension del sedimento de celulas en 1 ml de medio LB que contema MgSO410 mM y CaCl2 5 mM. A 300 pl de la suspension de celulas se anadieron 100 pl de la biblioteca de fagos P1 a partir de DM1849::pMAK-ligB y la mezcla se incubo a 37 °C durante 30 min. Esto fue seguido de anadir 200 pl de citrato de trisodio 1 M y agitar con vortex brevemente. Entonces se anadio 1 ml de medio LB y las celulas se cultivaron a 44 °C durante una hora. Posteriormente, las celulas se lavaron dos veces con

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en cada caso 1 ml de LB que contema citrato de trisodio 100 mM y finalmente se resuspendieron en 100 |jl de LB que contema citrato de trisodio 100 mM. Se extendio sobre agar LB que contema 20 mg/l de cloranfenicol y se incubo a 44 °C durante 48 horas. Se aclararon diez colonias sobre agar LB que contema 20 mg/l de cloranfenicol y se incubo otra vez a 44 °C durante 48 horas. En estos clones, se habfa transducido un fragmento genomico que comprendfa la region ligB que incluye el plasmido pMAK-ligB integrado. Por secuenciacion de ADN posterior de las secciones relevantes del gen spoT, se identificaron cinco clones en los que el alelo spoT de DM1849 se habfa co- traducido.

La escision del plasmido pMAK-ligB del cromosoma y el tratamiento se llevaron a cabo como se describe en Hamilton et al. (Cm Hamilton, Aldea M, Washburn BK, Babitzke P, Kushner SR (1989); J Bacteriol.; 171(9); 46174622). Uno de los clones libres de plasmido obtenido de esta forma se llamo ECM1_spoT1849.

Las cepas ECM1 y ECM1_spoT1849 se depositaron segun el Tratado de Budapest en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstraUe 7B, 38124 Brunswick, Alemania) con los numeros de DSM DSM 25066 (= ECM1) y DSM 25067 (= EMC1_spoT1849) el 3 de agosto de 2011.

Ejemplo 5

Clonacion del gen serC en el plasmido pUC18

Se amplifico el gen serC de MG1655 de E. coli con la ayuda de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y posteriormente se clono en el plasmido pUC18 (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Alemania).

Los cebadores de PCR serCF(Xbal) y serCR(HindIII) tienen en sus extremos 5' en cada caso nucleotidos aleatoriamente seleccionados, seguido de secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restriccion XbaI (TCTAGA) y HindIII (AAGCTT), respectivamente. Los nucleotidos 13 a 38 de serCF(XbaI) se unen desde las posiciones 956619 a 956644 en el genoma MG1655 de E. coli. Los nucleotidos 13 a 37 de serCR(HindIII) se unen desde las posiciones 958028 a 958004 en el genoma MG1655 de E. coli.

serCF(XbaI) (SEQ ID NO: 12)

5' AGGTGCTCTAGAGTCCGCGCTGTGCAAATCCAGAATGG 3' serCR(HindIII) (SEQ ID NO: 13)

5' TACACCAAGCTTAACTCTCTACAACAGAAATAAAAAC 3'

Se amplifico el gen serC por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando los cebadores serCF(XbaI) y serCR(HindIII) y la ADN polimerasa Phusion (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia). ADN genomico de MG1655 de E. coli sirvio de molde. El fragmento de ADN resultante tuvo 1434 pb de tamano. Se escindio por las endonucleasas de restriccion XbaI y HindIII y se purifico con ayuda de un kit de purificacion por PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). Se escindio ADN de plasmido pUC18 no metilado por las endonucleasas de restriccion Xbal y HindIII y se purifico con la ayuda de un kit de purificacion por PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). El plasmido escindido se ligo entonces con el producto de PCR y se transformo en DH5a de E. coli. Se identificaron clones de plasmido que conteman el gen serC por restriccion con escision y secuenciacion de ADN. El plasmido resultante se llamo pUC18-serC.

Ejemplo 6

Clonacion del gen serA en el plasmido pUC18-serC

Se amplifico el gen serA de MG1655 de E. coli con la ayuda de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y posteriormente se clono en el plasmido pUC18-serC.

El cebador de PCR serAF(XbaI) tiene en su extremo 5' 6 nucleotidos aleatoriamente seleccionados, seguido de una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restriccion Xbal (TCTAGA). Los nucleotidos 12 a 33 se unen desde las posiciones 3055199 a 3055220 en el genoma de MG1655 de E. coli. El cebador de PCR serAR(SHSSNB) tiene en su extremo 5' 6 nucleotidos aleatoriamente seleccionados, seguido de secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restriccion SacI, HindIII, SphI, SmaI, NotI y BglII. Los nucleotidos 49 a 58 se unen desde las posiciones 3056880 a 3056861 en el genoma de MG1655 de E. coli.

serAF(XbaI) (SEQ ID NO: 14)

5' CTGTAGTCTAGATTAGTACAGCAGACGGGCGCG 3' serAR(SHSSNB) (SEQ ID NO: 15)

5

10

15

20

25

30

35

40

CAAGAGCTCMGCTTGCATGCGATTCCCGGGCGGCCGCAATAAGATCTCCGTC AGGGCGTGGTGACCG 3'

Se amplifico el gen serA por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando los cebadores serAF(Xbal) y serAR(SHSSNB) y la ADN polimerasa Phusion (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia). El ADN genomico de MG1655 de E. coli sirvio de molde. El fragmento resultante de ADN tema 1731 pb de tamano.

Se escindio por las endonucleasas de restriccion Xbal y SacI y se purifico con la ayuda de un kit de purificacion por PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). El plasmido pUC18-serC se escindio asimismo por las endonucleasas de restriccion Xbal y SacI y se purifico con la ayuda de un kit de purificacion por PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). Entonces, el plasmido escindido se ligo con el producto de PCR y se transformo en DH5a de E. coli. Se identificaron clones de plasmido que conteman el gen serA por escision con restriccion y secuenciacion de ADN. El plasmido resultante se llamo pUC18-serAC.

Ejemplo 7

Clonacion del gen serB en el plasmido pUC18-serAC

Se amplifico el gen serB de MG1655 de E. coli con la ayuda de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y posteriormente se clono en el plasmido pUC18-serAC.

El cebador de PCR serB(Sphl) tiene en su extremo 5' 6 nucleotidos aleatoriamente seleccionados, seguido de una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restriccion Sphl (GCATGC). Los nucleotidos 13 a 34 se unen desde las posiciones 4622816 a 4622837 en el genoma M1655 de E. coli.

El cebador de PCR serB(Smal) tiene en su extremo 5' 6 nucleotidos aleatoriamente seleccionados, seguido de secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restriccion SalI (GTCGAC) y SmaI (CCCGGG). Los nucleotidos 54 a 75 se unen desde las posiciones 4623887 a 4623866 en el genoma MG1655 de E. coli.

serB(Sphl) (SEQ ID NO: 16)

5' CCATGCGCATGCCCACCCTTTGAAAATTTGAGAC 3' serB(SmaI) (SEQ ID NO: 17)

5' CCGCATGTCGACATCCCGGGGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGTGTG

ATTACTTCTGATTCAGGCTGGC 3'

Se amplifico el gen serB por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando los cebadores serB(SphI) y serB(SmaI) y la ADN polimerasa Phusion (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia). El ADN genomico de MG1655 de E. coli sirvio de molde. El fragmento de ADN resultante tema 1137 pb de tamano.

Se escindio por las endonucleasas de restriccion SphI y Smal y se purifico con la ayuda de un kit de purificacion por PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). El plasmido pUC18-serAC se escindio asimismo por las endonucleasas de restriccion Sphl y Smal, se desfosforilo por fosfatasa alcalina y se purifico con la ayuda de un kit de purificacion por PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). Entonces, el plasmido escindido se ligo con el producto de PCR y se transformo en DH5a de E. coli. Se identificaron clones de plasmido que conteman el gen serB por escision por restriccion y secuenciacion de ADN. El plasmido resultante se llamo pUC18-serBAC.

Ejemplo 8

Clonacion del gen glyA en el plasmido pUC18-serBAC

Se amplifico el gen glyA de MG1655 de E. coli con la ayuda de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y posteriormente se clono en el plasmido pUC18-serBAC.

El cebador de PCR glyA-en la direccion 3' tiene en su extremo 5' 6 nucleotidos aleatoriamente seleccionados, seguido de una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restriccion BglII (AGATCT). Los nucleotidos 13 a 35 se unen desde las posiciones 2682063 a 2682085 en el genoma de MG1655 de E. coli.

El cebador de PCR glyA-en la direccion 5' tiene en su extremo 5' nucleotidos aleatoriamente seleccionados, seguido de secuencias de reconocimiento para la endonucleasa de restriccion NotI (GCGGCCGC). Los nucleotidos 15 a 33 se unen desde las posiciones 2683762 a 2683744 en el genoma de M1655 de E. coli.

glyA-en la direccion 3' (SEQ ID NO: 18)

5' ATCTAAAGATCTGTTACGACAGATTTGATGGCGCG 3' glyA-en la direccion 5' (SEQ ID NO: 19)

5' TTCATCGCGGCCGCGAAAGAATGTGATGAAGTG 3'

El gen glyA se amplifico por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores glyA-en la direccion 3' y 5 glyA-en la direccion 5' y la ADN polimerasa Phusion (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia). El ADN genomico de MG1655 de E. coli sirvio de molde. El fragmento de ADN resultante tuvo 1726 pb de tamano.

Se escindio por las endonucleasas de restriccion BglII y Notl y se purifico con la ayuda de un kit de purificacion por PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania). El plasmido pUC18-serBAC se escindio asimismo por las endonucleasas de restriccion BglII y Notl y se purifico con la ayuda de un kit de purificacion por PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, 10 Alemania). Entonces, el plasmido escindido se ligo con el producto de PCR y se transformo en DH5a de E. coli. Se identificaron clones de plasmido que conteman el gen glyA por escision con restriccion y secuenciacion de ADN. El plasmido resultante se llamo pUCl8-serB-glyA-serAC.

Ejemplo 9

Clonacion de los genes serB-glyA-serAC de pUC18-serB-glyA-serAC con pCC1-BAC

15 Se escindio el plasmido pUC18-serB-glyA-serAC por la endonucleasa de restriccion HindIII y los fragmentos de ADN se fraccionaron por electroforesis en gel de agarosa. Se aislo un fragmento de ADN de 5,9 kb que contema los genes serB, glyA, serA y serC del gel. El fragmento se ligo con el plasmido pCC1BAC Cloning-Ready Vector (Hind III) de Epicentre / Madison, EE.UU, que habfa sido previamente escindido por HindIII, y se transformo en EPI300 de E. coli. Los clones de plasmido que conteman el fragmento de ADN de serB, glyA, serA y serC se identificaron por 20 escision con restriccion y secuenciacion de ADN. El plasmido de produccion resultante se llamo pCC3.

Ejemplo 10

Clonacion del plasmido de produccion pME-RDL2a

Se llevo a cabo la clonacion del plasmido de produccion pME-RDL2a como se describe en la solicitud EP 11151526.8. Incluye el gen cysE de E. coli, alelos resistentes a la retroalimentacion de los genes thrA y metA de 25 E. coli y el gen RDL2a que codifica la tiosulfato sulfurtransferasa de Saccharomyces cerevisiae RDL2p. Ademas, incluye un gen de resistencia a estreptomicina.

Ejemplo 11

Transformacion de las cepas ECM1 y ECM1 spoT1849 con los plasmidos de produccion

Las cepas ECM1 y ECM1_spoT1849 se transformaron con el vector de produccion pCC3 del Ejemplo 9, y los 30 transformantes se seleccionaron usando 20 mg/l de cloranfenicol. Las celulas se transformaron entonces con el plasmido pME-RDL2a del Ejemplo 10 y los transformantes resultantes se seleccionaron usando 20 mg/l de cloranfenicol + 100 mg/l de estreptomicina. Las cepas resultantes se llamaron ECM1/pCC3/pME-RDL2a y ECM1_spoT1849/pCC3/pME-RDL2a.

Ejemplo 12

35 Ensayo de rendimiento en un experimento de matraz agitador

Se evaluo el rendimiento de las cepas productoras de L-metionina de E. coli por pruebas de produccion en matraces conicos de 100 ml. Precultivos de en cada caso 10 ml de medio de pre-cultivo (10 % de medio LB que contema 2,5 g/l de glucosa y 90 % de medio mmimo PC1) inoculados con 100 pl de cultivo celular se cultivaron a 37 °C durante 10 horas. Estos se usaron entonces para inocular en cada caso 10 ml de medio mmimo PC1 (Tabla 1) a una 40 DO 600 nm de 0,2 (bio-fotometro de Eppendorf; Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) y los cultivos se cultivaron a 37 °C durante 24 horas. La concentracion de L-metionina extracelular se determino por cromatograffa de intercambio ionico y derivatizacion post-columna con deteccion de ninhidrina usando un analizador de aminoacidos (Sykam GmbH, Eresing, Alemania). La concentracion de glucosa extracelular se determino usando un analizador de glucosa YSI 2700 Select (YSI Life Sciences, Yellow Springs, Ohio, EE.UU.). Los resultados se enumeran en la Tabla 2. 45 Despues de 24 horas la glucosa habfa sido usada completamente en ambos cultivos. La concentracion de metionina en el sobrenadante de cultivo de ECM1_spoT1849/pCC3/pME-RDL2a fue, a 1,56 g/l, claramente superior a en la cepa comparativa (1,01 g/l). La modificacion del gen que codifica ppGppasa mediante la introduccion de las mutaciones Gly174, Leu529 y una insercion entre Asp84 y Met85 produjo asf un aumento en el rendimiento de metionina con respecto a la cepa de partida del 10,1 % (gramos de metionina por gramo de glucosa) al 15,6 %.

Tabla 1: Medio mmimo PC1

Sustancia: Concentracion

ZnSO4 * 7 H2O: 4 mg/l

CuCl2 * 2 H2O: 2 mg/l

MnSO4 * H2O: 20 mg/l

H3BO3: 1 mg/l

Na2MoO4 * 2 H2O: 0,4 mg/l

MgSO4 * 7 H2O: 1 g/l

Acido cttrico * 1 H2O: 6,56 g/l

CaCl2 * 2 H2O: 40 mg/l

K2HPO4: 8,02 g/l

Na2HPO4: 2 g/l

(NH4)2HPO4: 8 g/l

NH4Cl: 0,13 g/l

(NH4)2SO3: 5,6 g/l

MOPS: 5 g/l

NaOH 10M: ajustado a pH 6,8

FeSO4 * 7 H2O: 40 mg/l

Clorhidrato de tiamina: 10 mg/l

Vitamina B12: 10 mg/l

Glucosa: 10 g/l

Isopropil-tio-U-galactosido (IPTG): 2,4 mg/l

Espectinomicina: 50 mg/l

Cloranfenicol: 20 mg/l

Tabla 2: Concentraciones de L-metionina en los caldos de fermentacion de cepas de E. coli ECM1/pCC3/pME-

RDL2a y ECM1_spoT1849/pCC3/pME-RDL2a

Cepa: DO (600 nm) L-Metionina (g/l)

ECM1/pCC3/pME-RDL2a: 6,36 1,01

ECM1_spoT1849/pCC3/pME-RDL2a: 7,46 1,56

Las caractensticas de la invencion desveladas en la descripcion anterior y en las reivindicaciones pueden ambas individualmente y en cualquier combinacion ser esenciales para implementar la invencion en sus diversas realizaciones.

Claims

10

15

20

25

30

35

40

REIVINDICACIONES

1. Metodo de preparacion de metionina o triptofano, que comprende la etapa de cultivar una celula de E. coli, que ya produce en exceso metionina o triptofano y esta adicionalmente geneticamente modificada con respecto a su forma no mutante de tal forma que tiene una actividad de ppGppasa reducida con respecto a su forma no mutante, en el que la celula de E. coli tiene una actividad de (p)ppGpp-sintetasa que es esencialmente invariable con respecto a su forma no mutante y en el que la ppGppasa es al menos una seleccionada del grupo que comprende las secuencias de aminoacidos SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6.

2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la actividad en la celula de E. coli cultivada de al menos una ppGppasa del grupo que comprende las secuencias de aminoacidos SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6 se reduce como resultado de dicha ppGppasa que tiene al menos la siguiente modificacion: esta presente una insercion de los dos aminoacidos His y Asn entre Asp84 y Met85.

3. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, que comprende ademas la etapa de purificar el aminoacido esencial.

4. Celula de E. coli, que ya produce en exceso metionina o triptofano, en la que la actividad de al menos una ppGppasa del grupo que comprende las secuencias de aminoacidos SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6 se reduce como resultado de dicha ppGppasa que tiene la siguiente modificacion: esta presente una insercion de los dos aminoacidos His y Asn entre Asp84 y Met85, y en la que la celula de E. coli tiene una actividad de (p)ppGpp- sintetasa que es esencialmente invariable con respecto a su forma no mutante.

5. Celula de E. coli segun la reivindicacion 4, en la que la actividad de al menos una ppGppasa que comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:2 se reduce como resultado de dicha ppGppasa que tiene las siguientes modificaciones: esta presente una insercion de los dos aminoacidos His y Asn entre Asp84 y Met85 y en la que la celula de E. coli tiene una actividad de (p)ppGpp-sintetasa que es esencialmente invariable con respecto a su forma no mutante.

6. Celula de E. coli segun la reivindicacion 5, en la que la ppGppasa tiene ademas al menos una modificacion del grupo que comprende sustituciones en los aminoacidos Gln9, Thr13, Tyr63, Arg109, Gln225, Cys245, Val248, Asn268, Ser270, Met280, His344, Pro436, Asn501, Gln505, His543, Ala546, Ser547, Ile548, His555, Gly556, His557, Pro559, Lys619, Thr621, Ala622, Thr627, Thr651, Ala669, Ala675, Thr698 y una insercion entre Glu343 y His344.

7. Celula de E. coli segun cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que la ppGppasa tiene al menos una modificacion del grupo que tiene las siguientes sustituciones:

1. ) sustitucion de Gln9 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Leu, Ile y Val,

2. ) sustitucion de Thr13 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Lys, Arg, His, Gln y Asn,

3. ) sustitucion de Tyr63 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Lys, Arg y His,

4. ) sustitucion de Arg109 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Gln y Asn,

5. ) sustitucion de Gln225 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Ser, Ala y Thr,

6. ) sustitucion de Cys245 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Leu, Ile y Val,

7. ) sustitucion de Val248 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Lys, Arg y His,

8. ) sustitucion de Asn268 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Lys, Arg y His,

9. ) sustitucion de Ser270 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Leu, Ile y Val,

10. ) sustitucion de Met280 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Ser, Thr y Ala,

13. ) sustitucion de Pro436 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Ser, Ala y Thr,

14. ) sustitucion de Asn501 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Ser, Ala y Thr,

15. ) sustitucion de Gln505 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Pro, Ser, Ala y Thr,

5

10

15

20

25

30

35

18. ) sustitucion de Ser547 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Leu, Ile y Val,

20. ) sustitucion de His555 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Leu, Ile y Val,

21. ) sustitucion de glicina en la posicion 556 por Lys, Arg y His,

23. ) sustitucion de Pro559 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Ser, Ala y Thr,

25. ) sustitucion de Thr621 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Leu, Ile y Val,

29. ) sustitucion de Ala669 y/o Ala675 por Thr,

30. ) sustitucion de Thr698 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Gln y Asn.

8. Celula de E. coli segun cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en la que la celula de E. coli expresa en exceso, con respecto a su forma no mutante, al menos una secuencia de acidos nucleicos que codifica cualquiera de las siguientes enzimas

1. ) sistema de transporte de tiosulfato/sulfato CysPUWA (EC 3.6.3.25),

2. ) 3'-fosfoadenosina-5'-fosfosulfato reductasa CysH (EC 1.8.4.8),

3. ) sulfito reductasa CysJI (EC 1.8.1.2),

4. ) cistema sintasa A CysK (EC 2.5.1.47),

5. ) cistema sintasa B CysM (EC 2.5.1.47),

6. ) serina acetiltransferasa CysE (EC 2.3.1.30),

7. ) sistema de escision de glicina GcvTHP-Lpd (EC 2.1.2.10, EC 1.4.4.2, EC 1.8.1.4),

8. ) lipoil sintasa LipA (EC 2.8.1.8),

9. ) lipoil-protema ligasa LipB (EC 2.3.1.181),

10. ) fosfoglicerato deshidrogenasa serA (EC 1.1.1.95),

11. ) 3-fosfoserina fosfatasa SerB (EC 3.1.3.3),

12. ) 3-fosfoserina/fosfohidroxitreonina aminotransferasa SerC (EC 2.6.1.52),

13. ) serina hidroximetiltransferasa GlyA (EC 2.1.2.1),

14. ) aspartocinasa I y homoserina deshidrogenasa I ThrA (EC 2.7.2.4, EC 1.1.1.3),

15. ) aspartato cinasa LysC (EC 2.7.2.4),

16. ) homoserina deshidrogenasa Hom (EC 1.1.1.3),

17. ) homoserina O-acetiltransferasa MetX (EC 2.3.1.31),

18. ) homoserina O-succiniltransferasa MetA (EC 2.3.1.46),

19. ) cistationina gamma-sintasa MetB (EC 2.5.1.48),

20. ) C-S liasa AecD (EC 4.4.1.8, tambien denominada beta-liasa),

21. ) cistationina beta-liasa MetC (EC 4.4.1.8),

5

10

15

20

25

30

35

22. ) homocistema S-metiltransferasa independiente de B12 MetE (EC 2.1.1.14),

23. ) homocistema S-metiltransferasa dependiente de B12 MetH (EC 2.1.1.13),

24. ) metilentetrahidrofolato reductasa MetF (EC 1.5.1.20),

25. ) exportador de L-metionina BrnFE de Corynebacterium glutamicum,

26. ) exportador de valina YgaZH de Escherichia coli (b2682, b2683),

27. ) supuesto transportador YjeH de Escherichia coli (b4141),

28. ) piridina nucleotido transhidrogenasa PntAB (EC 1.6.1.2),

29. ) O-succinilhomoserina sulfhidrilasa MetZ (EC 2.5.1.48),

30. ) fosfoenolpiruvato carboxilasa Pyc (EC 4.1.1.31),

31. ) tiosulfato sulfurtransferasa RDL2p (EC 2.8.1.1),

32. ) tiosulfato-tiol sulfurtransferasa (EC 2.8.1.3),

33. ) tiosulfato-ditiol sulfurtransferasa (EC 2.8.1.5).

9. Celula de E. coli segun cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en la que la celula de E. coli expresa en una escala reducida, con respecto a su forma no mutante, al menos una secuencia de acidos nucleicos que codifica cualquiera de las siguientes enzimas:

1. ) regulador transcripcional de la biosmtesis de L-metionina (MetJ) (b3938, ECK3930),

2. ) glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi, EC 5.3.1.9) (b4025, ECK4017),

3. ) homoserina cinasa (ThrB, EC 2.7.1.39) (b0003, ECK0003),

4. ) S-adenosilmetionina sintasa (MetK, EC 2.5.1.6) (b2942, ECK2937),

5. ) dihidrodipicolinato sintasa (DapA, EC 4.2.1.52) (b2478, ECK2474),

6. ) fosfoenolpiruvato carboxicinasa (Pck, EC 4.1.1.49) (b3403, ECK3390),

7. ) formiltetrahidrofolato hidrolasa (PurU, EC 3.5.1.10) (b1232, ECK1227),

8. ) piruvato cinasa II (PykA, EC 2.7.1.40) (b1854, ECK1855),

9. ) piruvato cinasa I (PykF, EC 2.7.1.40) (b1676, ECK1672),

10. ) subunidad de transportador de L-metionina (MetQNI) (b0197, ECK0197),

11. ) subunidad de transportador de L-metionina (MetQNI) (b0198, ECK0198),

12. ) subunidad de transportador de L-metionina (MetQNI) (b0199, ECK0199),

13. ) desoxicitidina 5'-trifosfato desaminasa (Dcd, EC 3.5.4.13) (b2065, ECK2059),

14. ) supuesta N-aciltransferasa (YncA),

15. ) ARNp regulador FnrS,

16. ) factor sigma RpoS.

10. Celula de E. coli segun cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en la que la celula de E. coli expresa en exceso, con respecto a su forma no mutante, al menos una secuencia de acidos nucleicos que codifica cualquiera de las siguientes enzimas:

1. ) antranilato sintasa (trpDE, EC 4.1.3.27), antranilato fosforribosiltransferasa (trpD, EC 2.4.2.18), fosforribosilantranilato isomerasa (trpC, EC 5.3.1.24), indol-3-glicerol-fosfato sintasa (trpC, EC 4.1.1.48) y triptofano sintasa (trpAB, EC 4.1.2,8 y 4.2.1.122),

2. ) fosfoglicerato deshidrogenasa serA (EC 1.1.1.95),

3. ) 3-fosfoserina fosfatasa SerB (EC 3.1.3.3),

5

10

15

20

25

4. ) 3-fosfoserina/fosfohidroxitreonina aminotransferasa SerC (EC 2.6.1.52),

5. ) DHAP sintasa sensible a L-tirosina (aroF, EC 2.5.1.54),

6. ) DHAP sintasa resistente a retroalimentacion de L-fenilalanina (aroG, EC 2.5.1.54),

7. ) DHAP sintasa sensible a L-triptofano (aroH, EC 2.5.1.54),

8. ) fosfoenolpiruvato sintasa ppsA (EC 2.7.9.2),

9. ) fosfoenolpiruvato carboxicinasa pck (EC 4.1.1.49),

10. ) transcetolasa A tktA (EC 2.2.1.1),

11. ) transcetolasa B tktB (EC 2.2.1.1),

12. ) producto genico del marco de lectura abierto de E. coli (ORF) yddG.

11. Celula de E. coli segun cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en la que la celula de E. coli expresa en una escala reducida, con respecto a su forma no mutante, al menos una secuencia de acidos nucleicos que codifica cualquiera de las siguientes enzimas:

1. ) triptofanasa (tnaA, EC 4.1.99.1),

2. ) represor del operon de trp (trpR),

3. ) corismato mutasa T o prefenato deshidrogenasa (tyrA, EC 1.3.1.12),

4. ) corismato mutasa P o prefenato deshidrogenasa (pheA, EC 4.2.1.51),

5. ) protema de transporte espedfica de triptofano (mtr),

6. ) triptofano permeasa (tnaB),

7. ) transportador para aminoacidos aromaticos (aroP),

8. ) L-serina desaminasa (sdaA, EC 4.3.1.17),

9. ) glucosa-6-fosfato isomerasa (pgi, EC 5.3.1.9),

10. ) tirosina aminotransferasa (tyrB),

11. ) represor del regulon de glp (glpR);

12. ) factor sigma RpoS (rpoS).

12. Metodo de preparacion de metionina o triptofano, que comprende la etapa de cultivar una celula de E. coli como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11.