ES2519016T3

ES2519016T3 - Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos utilizando cepas de la familia Enterobacteriaceae

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Publication number: ES2519016T3
Application number: ES08708980.1T
Authority: ES
Inventors: Mechthild Rieping; Georg Thierbach; Caroline Kreutzer
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2007-03-05
Filing date: 2008-02-14
Publication date: 2014-11-06
Anticipated expiration: 2028-02-14
Also published as: DE102007051024A1; EP2129786B1; WO2008107277A1; EP2129786A1; PL2129786T3; DK2129786T3

Abstract

Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos, caracterizado por que se llevan a cabo las siguientes etapas: 1.1 fermentación de microorganismos recombinantes secretores de L-aminoácidos de la familia Enterobacteriaceae o de las bacterias corineformes que contienen un gen glpK que codifica un polipéptido con actividad de glicerol quinasa (ATP-dependiente), cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 95% idéntica a la de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6, en donde el polipéptido posee una longitud de 502 aminoácidos, conteniendo el polipéptido en la posición 428 cualquier aminoácido proteinogénico, exceptuada glicina, en un medio a una temperatura deseada, empleándose como fuente de carbono, en esencia, glicerol o, en esencia, glicerol y uno o más de los azúcares seleccionados del grupo de glucosa, sacarosa y fructosa, y 1.2 acumulación en el caldo de fermentación del L-aminoácido producido.

Description

Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos utilizando cepas de la familia Enterobacteriaceae

La invención se refiere a un procedimiento para la preparación fermentativa de L-aminoácidos, en particular L-treonina, L-triptófano, L-lisina, L-valina y L-homoserina, utilizando glicerol como fuente de carbono y con ayuda de microorganismos de la familia Enterobacteriaceae, o de las bacterias corineformes que poseen alelos del gen glpK que codifican variantes de la glicerol quinasa.

Estado conocido de la técnica

L-aminoácidos encuentran aplicación en la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y, de manera muy particular, en la alimentación animal.

Es conocido que los L-aminoácidos se preparan por fermentación de cepas de Enterobacteriaceae, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens, y de cepas de bacterias corineformes, en particular Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum). Debido a la gran importancia, se trabaja constantemente para mejorar el procedimiento de producción. Las mejoras del procedimiento pueden afectar a medidas técnicas de fermentación tales como, por ejemplo, agitación y suministro de oxígeno, o la composición de los medios nutricios tales como, por ejemplo, la elección del azúcar o la concentración del azúcar utilizado durante la fermentación, o el tratamiento para dar la forma del producto, por ejemplo, mediante, cromatografía de intercambio iónico, o las propiedades intrínsecas de rendimiento de los propios microorganismos.

Para mejorar las características de rendimiento de estos microorganismos se utilizan métodos de mutagénesis, selección y selección de mutantes. De esta manera se obtienen cepas que son resistentes frente a antimetabolitos tales como, por ejemplo, el análogo de treonina ácido α-amino-β-hidroxivalérico (AHV), o auxotróficas para metabolitos de importancia reguladora, y que producen L-aminoácidos tales como, por ejemplo, L-treonina. Resistencia frente al análogo de triptófano 5-metil-DL-triptófano (5-MT) distingue, por ejemplo, una cepa productora de L-triptófano.

Desde hace algunos años, también se utilizan métodos de tecnología de ADN recombinante para la mejora de cepas productoras o secretoras cepas de L-aminoácidos de la familia Enterobacteriaceae, amplificando, por ejemplo, genes de la biosíntesis de aminoácidos individuales o alterando las propiedades de genes especiales e investigando el efecto sobre la producción. Informaciones recopilatorias sobre la biología celular y molecular de Escherichia coli y Salmonella se pueden encontrar en Neidhardt (comp.): Escherichia coli and Salmonella, Celular and Molecular Biology, 2ª edición, ASM Press, Washington, D.C., EE.UU., (1996).

Para la preparación de L-aminoácidos, hoy en día se emplea generalmente por la industria de la fermentación glucosa o sacarosa como fuente de carbono. Se está constantemente buscando nuevas y económicas fuentes de materias primas.

El glicerol (propanotriol) está presente en los aceites y grasas en forma químicamente unida. Conecta como un "puente" las moléculas de ácidos grasos en los triglicéridos. En la fabricación de combustible a partir de aceite de colza (biodiesel, éster metílico de colza) se produce glicerol como un producto de acoplamiento (subproducto). Por lo tanto, éste se encuentra en una medida digna de mención como materia prima en la industria de la fermentación.

Es conocido que cepas productoras de L-treonina de Escherichia coli se desarrollan en glicerol como única fuente de carbono (documento US-A-5.175.107).

Exposiciones recopilatorias para el metabolismo del glicerol de Enterobacteriaceae se encuentran en Lin (En: Neidhardt (comp.), Escherichia coli y Salmonella, American Society for Microbiology, Washington, D.C., EE.UU.: 307-342 (1996)).

La glicerol quinasa, que se presenta asociada en su forma enzimáticamente activa con el facilitador de GlpF, se fosforila utilizando ATP de glicerol citoplásmico (Voegele et al., Journal of Bacteriology 175 (4): 1087-94 (1993)) para formar glicerol-3-fosfato. La actividad de la glicerol quinasa GlpK es inhibida alostéricamente por la fructosa-1,6-bisfosfato (FBP) y la enzima IIAGlc, el fosfoportador dependiente de fosfoenolpiruvato específico para la glucosa: sistema de azúcar-fosfotransferasa (PTS). Según Holtman et al. (Journal of Bacteriology 183: 3336-3344 (2001)) FBP domina el control alostérico de la enzima.

La secuencia de nucleótidos de la forma salvaje del gen que codifica la glicerol-quinasa de Escherichia coli fue determinado por Pettigrew et al. (Journal of Biological Chemistry 263: 135-139 (1988)) y está disponible, en general, en el banco de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) de la Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, MD, EE.UU.) bajo el número de acceso (accession number) U00096 (Región: 4113737-4115245).

Además, puede deducirse de la solicitud de patente EP 1715055 como secuencia nº 15.

En el documento EP 1715055 se describe una mejora en la producción fermentativa de L-aminoácidos por 5 microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriaceae mediante la amplificación del gen glpK.

Son conocidos mutantes de glpK de E. coli, en los que está reducida la inhibición de la glicerol quinasa por parte de la enzima IIAGlc del PTS (Liu et al., Biochemistry 33: 10120-10126 (1994); Pettigrew et al., Journal of Bacteriology 178: 2846-2852 (1996); Pettigrew et al., Biochemistry 37: 4875-4883 (1998)) o bien la mutación conduce a una activación

10 de la glicerol quinasa por parte de la enzima IIAGlc (Pawlyk y Pettigrew, Proceedings of the National Academy of Science USA 99 (17): 11115-11120 (2002)).

Además de ello, son conocidos mutantes de glpK de E. coli con (1) actividad incrementada de la glicerol quinasa, en los que (2) está reducida la inhibición por parte de FBP (Herring et al., Nature Genetics 38 (12): 1406-1412 (2006);

15 Pettigrew et al., Journal of Bacteriology 178: 2846-2852 (1996); Honisch et al., Genome Research 14: 2495-2502 (2004)) y en los que (3) adicionalmente está neutralizado el control de la utilización de glicerol por parte del azúcar PTS (Holtman et al., Journal of Bacteriology 183 : 3336-3344 (2001)).

Como azúcares PTS se designan azúcares que son recogidos por el sistema PTS. Éstos inhiben la absorción y la

20 utilización de azúcar no PTS o fuentes de carbono no PTS ("represión catabólica") simultáneamente presentes. A los azúcares PTS en Enterobacteriaceae pertenecen, entre otros, glucosa, sacarosa, fructosa, trehalosa, maltosa, celobiosa, manosa, manitol, N-acetilglucosamina, β-glucósidos y glucitol.

Misión de la invención

25 Los autores de la invención se han propuesto la misión de proporcionar nuevas medidas para la preparación fermentativa mejorada de L-aminoácidos, en particular L-treonina, L-triptófano, L-lisina, L-valina y L-homoserina, usando glicerol.

30 Descripción de la invención

Objeto de la invención es un método para la preparación de L-aminoácidos, preferiblemente L-treonina, L-triptófano, Llisina, L-valina y L-homoserina, caracterizado porque se llevan a cabo las etapas siguientes:

35 a) fermentación de microorganismos recombinantes secretores de L-aminoácidos de la familia Enterobacteriaceae o de las bacterias corineformes que contienen un alelo glpK que codifica un polipéptido con actividad de glicerol quinasa (ATP-dependiente), cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 95% idéntica a la de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, preferiblemente SEQ ID NO: 2, en donde el polipéptido posee una longitud de 502 aminoácidos y en la posición 428 contiene a cualquier aminoácido

40 proteinogénico, preferiblemente ácido L-glutámico, ácido L-aspártico, L-isoleucina, L-histidina, L-triptófano y Lfenilalanina, de manera particularmente preferida ácido L-aspártico, en un medio a una temperatura deseada, empleándose como fuente de carbono, en esencia, glicerol o, en esencia, glicerol y uno o más de los azúcares seleccionados del grupo de glucosa, sacarosa y fructosa, y

45 b) acumulación en el caldo de fermentación del L-aminoácido producido.

Por una glicerol quinasa se entiende una enzima que cataliza la fosforilación de glicerol a glicerol-3-fosfato.

Por aminoácidos proteinogénicos se entienden los aminoácidos que se presentan en proteínas naturales, es decir, en

50 proteínas de microorganismos, plantas, animales y seres humanos. A ellos pertenecen, en particular, L-aminoácidos seleccionados del grupo ácido L-aspártico, L-asparagina, L-treonina, L-serina, ácido L-glutámico, L-glutamina, glicina, Lalanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, Ltriptófano, L-prolina, L-arginina y eventualmente L-selenocisteína.

55 Los alelos empleados para las medidas de la invención del gen glpK codifican polipéptidos con la actividad de una glicerol quinasa y con una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% o al menos 96%, de manera particularmente preferida al menos 97% o al menos 98% y de manera muy particularmente preferida al menos 99% idéntica a la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, preferiblemente SEQ ID NO: 2, y adicionalmente contiene un intercambio de aminoácidos en la posición 428. Los polipéptidos codificados poseen una longitud correspondiente a

60 502 aminoácidos.

Para las medidas de la invención también se pueden emplear polinucleótidos que se hibridan con uno o más de los polinucleótidos seleccionados entre el grupo de polinucleótido complementario a la SEQ ID NO: 1, polinucleótido

complementario a la SEQ ID NO: 3 y polinucleótido complementario a la SEQ ID NO: 5, preferiblemente un polinucleótido complementario a la SEQ ID NO: 1 y que codifican polipéptidos que tienen actividad de glicerol quinasa, y que en la posición 428 contiene a cualquier aminoácido proteinogénico, exceptuada glicina, preferiblemente ácido Lglutámico, ácido L-aspártico, L-isoleucina, L-histidina, L-triptófano y L-fenilalanina, de manera particularmente preferida ácido L-aspártico. Los polipéptidos codificados poseen una longitud correspondiente a 502 aminoácidos.

Instrucciones sobre la hibridación de secuencias de ADN las encuentra el experto, entre otros, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de la razón social Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). La hibridación tiene lugar bajo condiciones rigurosas, es decir, se forman sólo híbridos en los que la sonda y la secuencia diana, es decir, los polinucleótidos tratados con la sonda, son al menos 70% idénticos. Se sabe que la rigurosidad de la hibridación, incluidas las etapas de lavado, se ve influenciada o bien es determinada variando la composición del tampón, la temperatura y la concentración de sal. La reacción de hibridación se lleva a cabo generalmente a una rigurosidad relativamente baja en comparación con las etapas de lavado (Hybaid Hybridization Guide, Hybaid Limited, Teddington, Reino Unido, 1996).

Para la reacción de hibridación, puede emplearse, por ejemplo, un tampón correspondiente a 5x SSC a una temperatura de aprox. 50°C -68°C. En este caso, también pueden hibridarse sondas con polinucleótidos que tienen una identidad de menos del 70% con la secuencia de la sonda. Híbridos de este tipo son menos estables y se eliminan por lavado en condiciones restrictivas. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la reducción de la concentración de sal a 2x SSC y, eventualmente, seguidamente a 0,5x SSC (The DIG System User’s Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995), ajustándose una temperatura de aprox. 50°C -68°C, aprox. 52°C -68°C, aprox. 54°C -68°C, aprox. 56°C -68°C, aprox. 58°C -68°C, aprox. 60°C -68°C, aprox. 62°C -68°C, aprox. 64°C -68°C, aprox. 66°C -68°C. Se prefieren intervalos de temperaturas de aprox. 64°C -68°C o de aprox. 66°C -68°. Eventualmente, es posible disminuir la concentración de sal a una concentración correspondiente a 0,2x SSC o 0,1x SSC. Al aumentar gradualmente la temperatura de hibridación en pasos de aprox. 1 -2°C de 50°C a 68°C se pueden aislar fragmentos de polinucleótidos que poseen, por ejemplo, al menos el 70% o al menos el 80% o al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98 % o al menos el 99% o al menos el 99,9% de identidad con la secuencia de la sonda empleada o bien de las secuencias de nucleótidos representadas en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5. Otras instrucciones para la hibridación están comercialmente disponibles en forma de los denominados kits (por ejemplo DIG Easy Hyb de la razón social Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Nº de Catálogo 1603558).

Para los fines de la invención se emplean, además, alelos del gen glpK que codifican polipéptidos con actividad de glicerol quinasa que comprenden o poseen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, preferiblemente SEQ ID NO: 2, con el intercambio de aminoácido indicado en la posición 428, y con una o más de las características seleccionadas del grupo

a) uno a diez intercambios de aminoácidos conservativos, b) una prolongación en el extremo C de uno (1) a veinte aminoácidos.

Se explica por sí mismo que los intercambios conservativos de aminoácidos mencionados en a) no afectan al intercambio de aminoácido en la posición 428.

El número de intercambios conservadores de aminoácidos es preferiblemente de a lo sumo cinco (5), de manera particularmente preferida de a lo sumo cuatro (4), y de manera muy particularmente preferida de a lo sumo tres (3), o de a lo sumo dos (2).

En el caso de los aminoácidos aromáticos, se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian fenilalanina, triptófano y tirosina. En el caso de los aminoácidos hidrófobos, se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian entre sí leucina, isoleucina y valina. En el caso de los aminoácidos polares, se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian entre sí glutamina y asparagina. En el caso de los aminoácidos de carácter básico, se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian entre sí arginina, lisina e histidina. En el caso de los aminoácidos de carácter ácido, se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian entre sí ácido aspártico y ácido glutámico. En el caso de los aminoácidos con contenido en grupos hidroxilo, se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian entre sí serina y treonina.

Preferiblemente, la prolongación en el extremo C del polipéptido no es superior a 10, 5, 3 ó 2 aminoácidos.

En la posición 428, se prefiere el intercambio de glicina por ácido L-glutámico (G428E), ácido L-aspártico (G428D), Lisoleucina (G428I), L-histidina (G428H), L-triptófano (G428W) y L-fenilalanina (G428F). Se prefiere particularmente el intercambio por ácido L-aspártico (G428D).

En el caso de los microorganismos empleados para las medidas de la invención se trata, en particular, de representantes especialmente recombinantes, secretores de L-aminoácidos, de la familia Enterobacteriaceae o de las bacterias corineformes. Los representantes de las Enterobacteriaceae se eligen preferiblemente de los géneros

5 Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. Los géneros Escherichia y Serratia son especialmente preferidos. En el caso del género Escherichia se ha de mencionar, en particular, la especie Escherichia coli y en el caso del género Serratia, la especie Serratia marcescens.

Entre las bacterias corineformes se prefiere el género Corynebacterium. Particularmente preferidas son cepas que se

10 basan en las especies siguientes: Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum y Corynebacterium ammoniagenes, siendo particularmente preferida la especie Corynebacterium glutamicum.

Algunos representantes de la especie Corynebacterium glutamicum se encuentran en el estado conocido de la técnica también bajo otras denominaciones de especies tales como, por ejemplo, Corynebacterium acetoacidophilum,

15 Corynebacterium lilium, Corynebacterium melassecola, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum y Brevibacterium divaricatum ATCC14020. La expresión “Micrococcus glutamicus” era asimismo habitual para Corynebacterium.

Para la preparación de cepas secretoras de L-aminoácidos de la familia Enterobacteriaceae o de las bacterias

20 corineformes, que contienen alelos glpK, que codifican las variantes indicadas de la glicerol quinasa, se utilizan preferiblemente cepas (cepas de partida o cepas parentales), que ya poseen la capacidad de enriquecer el Laminoácido deseado en la célula y/o en el medio nutricio circundante o bien de acumularse en el caldo de fermentación. Para ello se puede utilizar también el término "producir". En particular, las cepas empleadas para las medidas de la invención poseen la capacidad de enriquecerse o bien de acumularse en la célula y/o en el medio nutricio o bien el

25 caldo de fermentación ≥ en (al menos) 0,25 g/l, ≥ 0,5 g/l, ≥ 1,0 g/l, ≥ 1,5 g/l, ≥ 2,0 g/l, ≥ 4 g/l o ≥ 10 g/l de L-aminoácido ≤ (máximo) 120 horas, ≤ 96 horas, ≤ 48 horas, ≤ 36 horas, ≤ 24 horas o ≤ 12 horas. En este caso se puede tratar de cepas que fueron preparadas por mutagénesis y selección, mediante técnicas de ADN recombinante o mediante una combinación de ambos métodos.

30 Las cepas secretoras de L-aminoácidos mencionadas producen uno o más, preferiblemente un o esencialmente un aminoácido seleccionado del grupo L-asparagina, L-treonina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, Lvalina, L-metionina, L-prolina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptófano, Larginina y L-homoserina, preferiblemente seleccionado del grupo de L-treonina, L-triptófano, L-lisina, L-valina y Lhomoserina. El término L-aminoácido o aminoácido también incluye sus sales.

35 La expresión "un o esencialmente un aminoácido" tiene en cuenta que además del L-aminoácido deseado se pueden producir uno o más de otros de los L-aminoácidos (aminoácidos secundarios) mencionados. La proporción de estos aminoácidos secundarios es ≥ 0 hasta como máximo 40%, preferiblemente ≥ 0 hasta como máximo 20%, de manera particularmente preferida ≥ 0 hasta 10% y de manera muy particularmente preferida ≥ 0 hasta como máximo 5%,

40 referido a la cantidad del L-aminoácido deseado.

Como cepas del género Escherichia, en particular de la especie Escherichia coli, adecuadas como cepas parentales, productoras o bien secretoras de L-treonina, se pueden mencionar, por ejemplo:

45 -Escherichia coli H4581 -Escherichia coli KY10935 -Escherichia coli VNIIgenetika MG442

50 -Escherichia coli VNIIgenetika M1 -Escherichia coli VNIIgenetika 472T23

55 -Escherichia coli BKIIM B-3996 -Escherichia coli kat 13 -Escherichia coli KCCM-10132

(documento EP 0 301 572) (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61 (11): 1877-1882 (1997) (documento US-A-4.278.765) (documento US-A-4.321.325) (documento US-A-5.631.157) (documento US-A-5.175.107) (documento WO 98/04715) (documento WO 00/09660)

Como cepas del género Serratia, en particular de la especie Serratia marcescens, adecuadas como cepas parentales, productoras o bien secretoras de L-treonina, se pueden mencionar, por ejemplo:

-: Serratia marcescens HNr21 (Applied and Environmental Microbiology 38 (6): 1045-1051 (1979))

-: Serratia marcescens TLr156 (Gene 57 (2-3): 151-158 (1987))

5 -Serratia marcescens T-2000 (Applied Biochemistry and Biotechnology 37 (3): 255-265 (1992)).

Cepas de la familia Enterobacteriaceae, productoras o secretoras de L-treonina, poseen preferiblemente, entre otras, una o más de las características genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo: resistencia frente a ácido α-amino-βhidroxivalérico, resistencia frente a tialisina, resistencia frente a etionina, resistencia frente a α-metilserina, resistencia 10 frente a ácido diaminosuccínico, resistencia frente a ácido α-aminobutírico, resistencia frente a borrelidina, resistencia frente a ácido ciclopentano-carboxílico, resistencia frente a rifampicina, resistencia frente a análogos de valina tales como hidroxamato de valina, resistencia frente a análogos de purina tales como, por ejemplo, 6-dimetilaminopurina, necesidad de L-metionina, eventualmente necesidad parcial y compensable de L-isoleucina, necesidad de ácido mesodiaminopimélico, auxotrofia respecto a dipéptidos que contienen treonina, resistencia frente a L-treonina, resistencia 15 frente a refinado de treonina, resistencia frente a L-homoserina, resistencia frente a L-lisina, resistencia frente a Lmetionina, resistencia frente a ácido L-glutámico, resistencia frente a L-aspartato, resistencia frente a L-leucina, resistencia frente a L-fenilalanina, resistencia frente a L-serina, resistencia frente a L-cisteína, resistencia frente a Lvalina, sensibilidad al fluoropiruvato, treonina-deshidrogenasa defectuosa, eventualmente capacidad para la utilización de sacarosa, refuerzo del operón treonina, refuerzo de la homoserina-deshidrogenasa I-aspartato quinasa I, 20 preferiblemente de la forma resistente a la retro-alimentación, refuerzo de la homoserina quinasa, refuerzo de la treonina sintasa, refuerzo de la aspartato quinasa, eventualmente de la forma resistente a la retro-alimentación, refuerzo de la aspartato semialdehído deshidrogenasa, refuerzo de la fosfoenolpiruvato-carboxilasa, eventualmente de la forma resistente a la retro-alimentación, refuerzo de la fosfoenolpiruvato-sintasa, refuerzo de la transhidrogenasa, refuerzo del producto génico RhtB, refuerzo del producto génico RhtC, refuerzo del producto génico YfiK, refuerzo de una piruvato

25 carboxilasa, y atenuación de la formación de ácido acético.

Como cepas del género Escherichia, en particular de la especie Escherichia coli, adecuadas como cepas parentales, productoras o bien secretoras de L-triptófano, se pueden mencionar, por ejemplo:

30: -Escherichia coli JP4735 / pMU3028 (documento US 5.756.345)

-Escherichia coli JP6015 / pMU91: (documento US 5.756.345)

35: -Escherichia coli SV164 (pGH5) -E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) (documento WO 94/08031) (documento US 4.371.614)

-E. coli AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264): (documento US 4.371.614)

40: -Escherichia coli AGX17 / pGX50, pACKG4-pps (documento WO 97/08333)

-Escherichia coli ATCC 31743: (documento CA 1182409)

45: -E. coli C534 / pD2310, pDM136 (ATCC 39795) -Escherichia coli JB102 / p5LRPS2 (documento WO 87/01130) (documento US 5.939.295).

Cepas de la familia Enterobacteriaceae, productoras o secretoras de L-triptófano, poseen preferiblemente, entre otras, una o más de las características genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo: resistencia a 5-metil-DL-triptófano, la 50 resistencia a 5-fluoro-triptófano, resistencia frente a 4-metil-DL-triptófano, resistencia frente a 6-metil-DL-triptófano, resistencia frente a 4-fluoro-triptófano, resistencia frente a 6-fluoro-triptófano, resistencia frente a antranilato, resistencia frente a triptazan, resistencia frente a indol, resistencia frente a ácido indol-acrílico, necesidad de fenilalanina, necesidad de tirosina, eventualmente capacidad para la utilización de sacarosa, refuerzo del operón triptófano, preferiblemente de la antranilato-sintasa, preferiblemente de la forma resistente a la retro-alimentación, una triptofanil-ARN-sintasa

55 parcialmente defectuosa, una absorción atenuada de triptófano, una triptofanasa defectuosa, proteínas represoras inactivadas, refuerzo de la biosíntesis de serina, refuerzo de la síntesis de fosfoenolpiruvato, refuerzo de la síntesis de Deritrosa-4-fosfato, refuerzo de la síntesis de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato (DHAP), refuerzo de la biosíntesis de corismato.

60 Como cepa del género Escherichia, en particular de la especie Escherichia coli, adecuada como cepa parental, productora o bien secretora de L-homoserina, se pueden mencionar, por ejemplo:

Escherichia coli NZ10rhtA23/pAL4 (documento US 6.960.455).

Cepas de la familia Enterobacteriaceae, productoras o secretoras de L-homoserina, poseen preferiblemente, entre otras, una o más de las características genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo: necesidad de L-treonina, necesidad de L-metionina, necesidad de L-isoleucina, una homoserina-quinasa defectuosa, eventualmente capacidad

5 para la utilización de sacarosa, refuerzo de la homoserina-deshidrogenasa I/aspartato quinasa I, preferiblemente de la forma resistente a la retro-alimentación, refuerzo del producto génico RhtA.

Como cepas del género Escherichia, en particular de la especie Escherichia coli, adecuadas como cepas parentales, productoras o bien secretoras de L-lisina, se pueden mencionar, por ejemplo: 10

•: Escherichia coli pDA1/TOC21R (= CNCM I-167) (documento FR-A-2511032),

•: Escherichia coli NRRL B-12199 (documento US 4.346.170)

15 • Escherichia coli NRRL B-12185 (documento US 4.346.170).

Como cepa del género Escherichia, en particular de la especie Escherichia coli, adecuada como cepa parental, productora o bien secretora de L-valina, se pueden mencionar, por ejemplo:

20 • Escherichia coli AJ11502 (NRRL B-12288) (documento US-A-4391907).

Como cepas del género Corynebacterium, en particular de la especie Corynebacterium glutamicum, adecuadas como cepas parentales, productoras o bien secretoras de L-lisina, se pueden mencionar, por ejemplo:

25 • Corynebacterium glutamicum DM58-1 / pDM6 (= DSM4697) descrita en el documento EP 0 358 940,

• Corynebacterium glutamicum MH20-22B (= DSM16835) descrita en Menkel et al. (Applied and Environmental Microbiology 55(3), 684-688 (1989)),

30 • Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= Ferm BP-7382) descrita en el documento EP 1 108 790, y

• Corynebacterium glutamicum NRRL B-11474 descrita en el documento US 4.275.157.

Como cepas del género Corynebacterium, en particular de la especie Corynebacterium glutamicum, adecuadas como 35 cepas parentales, productoras o bien secretoras de L-valina, se pueden mencionar, por ejemplo:

•: Corynebacterium glutamicum FERM BP-3006, descrita en el documento US 5.521-074, y

•: Corynebacterium glutamicum FERM BP-1764, descrita en el documento US 5.188-948.

40 En los trabajos subyacentes a la presente invención se encontró que microorganismos productores de L-aminoácidos de la familia Enterobacteriaceae, después de un intercambio del gen glpK de tipo salvaje por un alelo del gen glpK, que codifica una variante de la glicerol quinasa dependiente de ATP, que contiene el intercambio de aminoácido G428D, producen en medida creciente L-aminoácidos, en particular L-treonina, L-triptófano, L-lisina, L-valina y L-homoserina.

45 En los trabajos subyacentes a la presente invención se encontró, además, que microorganismos productores de Laminoácidos de bacterias corineformes, después de la expresión de un alelo del gen glpK, que codifica una variante de la glicerol quinasa dependiente de ATP, que contiene el intercambio de aminoácido G428D, producen en medida creciente L-aminoácidos.

50 Las secuencias de nucleótidos de los genes o marcos de lectura abiertos (ORF) de Escherichia coli pertenecen al estado conocido de la técnica y pueden ser tomados de la secuencia del genoma de Escherichia coli publicada por Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997)).

55 El gen glpK de Escherichia coli K12 codifica una glicerol quinasa dependiente de ATP (GlpK, EC Nº 2.7.1.30.). La secuencia de nucleótidos del gen de tipo salvaje se encuentra disponible en las bases de datos públicas bajo el número de acceso (Accession No.) U00096 (Región: 4113737-4115245). Se conoce en el estado conocido de la técnica también bajo el nombre de gen alternativo b3926. El polipéptido codificado posee una longitud de 502 aminoácidos. Una vez realizada la traducción, se disocia la metionina N-terminal.

60 De las especies Salmonella typhimurium (Nº de acceso: NC 003197 (secuencia de todo el genoma)) y Shigella flexneri (Nº de acceso: NC 004337 (secuencia de todo el genoma)), que asimismo pertenecen a la familia Enterobacteriaceae se conoce también la secuencia de nucleótidos para el gen glpK de tipo salvaje.

Las secuencias de ácidos nucleicos pueden tomarse de los bancos de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) de la Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, MD, EE.UU.), del banco de datos de la secuencia de nucleótidos de European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemania o bien Cambridge, Reino Unido) o del banco de datos de ADN de Japón (DDBJ, Mishima, Japón).

Para una mejor visión de conjunto, la secuencia conocida del gen glpK del tipo salvaje de Escherichia coli está representada bajo la SEQ ID NO: 1 y las secuencias del gen glpK del tipo salvaje de Salmonella typhimurium o bien Shigella flexneri, asimismo conocidas, están representadas bajo la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 5. Las proteínas codificadas por estos marcos de lectura se representan como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6.

Es conocido que el aminoácido metionina N-terminal puede ser disociado por enzimas propias del hospedante (metionina-aminopeptidasa). Los datos de posición para los residuos de aminoácidos respectivos se desplazan en consecuencia. Por ejemplo, el ácido L-aspártico se mueve desde la posición 11 del polipéptido codificado (véase la SEQ ID NO: 2) después de la separación de la metionina N-terminal a la posición 10.

Como marco de lectura abierto (ORF, open reading frame) se designa un segmento de una secuencia de nucleótidos que codifica o puede codificar una proteína o bien un polipéptido o ácido ribonucleico, a la o al cual de acuerdo con el estado conocido de la técnica, no se la/le asignar función alguna. Después de asignar una función al segmento correspondiente de la secuencia de nucleótidos, se habla, en general, de un gen. Por alelos se entiende, por lo general, formas alternativas de un gen dado. Las formas se caracterizan por diferencias en la secuencia de nucleótidos.

Químicamente, un gen o alelo es un polinucleótido. Otro término para esto es ácido nucleico, particularmente ácido desoxirribonucleico.

Los términos polipéptido y proteína son intercambiables.

Como producto génico se designa, en general, la proteína codificada o el ácido ribonucleico codificado por una secuencia de nucleótidos, es decir, un ORF, un gen o un alelo.

Para la generación de los alelos glpK, que pasan a emplearse en los microorganismos empleados para el procedimiento de acuerdo con la invención, se utilizan, entre otros, métodos descritos en la técnica para la mutagénesis dirigida.

Pueden utilizarse procedimientos de la mutagénesis dirigida al sitio utilizando oligonucleótidos mutagénicos (T.A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tal como se describen en el manual de Gait: Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) o por Newton y Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994). Las mutaciones generadas pueden determinarse y verificarse mediante secuenciación de ADN, por ejemplo según el método de Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Science USA 74 (12): 5463-5467 (1977)).

Para la construcción de mutaciones puntuales en el gen glpK se utiliza, por ejemplo, el kit Quick Change Site-Directed Mutagenesis de Stratagene (Amsterdam, Holanda). Al utilizar estos métodos, el gen glpK descrito en el estado conocido de la técnica se amplifica a partir de ADN aislado total de una cepa de tipo salvaje con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se clona en vectores de plásmido adecuados y luego el ADN se somete al proceso de mutagénesis. Mediante "GeneSOEing" (término inglés de corte y empalme del gen por extensión y solapamiento, Horton, Molecular Biotechnology 3: 93-98 (1995)), se pueden obtener las mutaciones puntuales ya por PCR.

Los alelos gplK generados pueden incorporarse en cepas adecuadas, por ejemplo mediante transformación y el procedimiento de intercambio de genes o bien alelos.

Un método habitual en Enterobacteriaceae es el método descrito por Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617 -4622 (1989)) del intercambio de genes con ayuda de un derivado pSC101 condicionalmente replicante pMAK705 o pKO3 (Link et al, Journal of Bacteriology 179: 6228-6237). Pueden utilizarse asimismo otros métodos descritos en el estado conocido de la técnica tales como, por ejemplo, el de Martínez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 1999, 7143-7148 (1999)) o el de Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000)).

Asimismo, es posible convertir mediante conjugación o transducción los alelos glpK generados en diversas cepas.

Las mutaciones de glpK pueden llevarse a cabo asimismo en plásmidos de expresión, de tal manera que se pueden producir en exceso las proteínas resultantes.

En un procedimiento de acuerdo con la invención, también se pueden sobre-expresar los alelos glpK que codifican las variantes de glicerol quinasa expuestas.

Así, en el estado conocido de la técnica se describen numerosos promotores que hacen posible ajustar una concentración o actividad deseada de la variante de glicerol quinasa respectiva. Por ejemplo, se puede emplear el promotor lysC del mutante DM58-1, que se describe por Kalinowski et al. (Molecular Microbiology 5(5) 1197-1204 (1991)), o el promotor gap, que se describe en la solicitud de patente con el número de solicitud EP 06007373.1. Además, pueden emplearse los promotores descritos en la solicitud de patente con el número de solicitud EP 06117294.6, los promotores descritos en la revista Research Disclosure (Artículo 512057 en la edición de diciembre de 2006, páginas 1616 a 1618), los promotores descritos por Patek et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 311-323 (2003) o las variantes del promotor dapA descritas por Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)), por ejemplo del promotor A25.

De igual manera, pueden emplearse también los promotores conocidos de la genética de Escherichia coli tales como, por ejemplo, el promotor tac, el promotor trp, el promotor trc y el promotor llp, o el promotor PL y PR del fago λ.

El polinucleótido provisto de esta forma con un promotor puede ser incorporado en forma de una (1) o varias copias en la bacteria corineforme deseada.

Para ello, pueden utilizarse por ejemplo plásmidos que son replicados por bacterias corineformes. Vectores de plásmidos adecuados son, por ejemplo, pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549554) o los vectores pSELF descritos por Tauch et al. (Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002)). Un artículo ilustrativo sobre el tema plásmidos en Corynebacterium glutamicum se encuentra en Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)).

Además, en el cromosoma de una bacteria corineforme se puede introducir una copia del polinucleótido.

En una forma de realización de este tipo se utiliza un plásmido no replicativo en bacterias corineformes. En este caso, en el extremo 5’ y en el extremo 3’ del gen deseado, que codifica un polipéptido con actividad glicerol quinasa, se agrega un fragmento de ADN que representa el sitio diana dentro del cromosoma de la bacteria corineforme en el que se integra el gen correspondiente mediante recombinación homóloga. Sitios diana adecuados para Corynebacterium glutamicum se describen, entre otros, en la Tabla 3 del documento WO 03/040373, en las Tablas 12 y 13 del documento WO 04/069996, en Aham et al. (Applied and Environmental Microbiology 67 (12), 5425-5430 (2001), o Correia et al. (FEMS Microbiology Letters 142, 259-264 (1996)). Después de la conjugación o transformación y recombinación homóloga mediante al menos dos sucesos de recombinación, la cepa resultante contiene al menos dos copias del gen respectivo.

Además, puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácidos, además del empleo de uno de los alelos glpK indicados, reforzar una o más enzimas de la vía específica de la biosíntesis respectiva.

Puede ser ventajoso para la producción de L-treonina con cepas de la familia Enterobacteriaceae, además del empleo de uno de los alelos glpK indicados, reforzar una o más enzimas de la conocida vía de la biosíntesis de treonina o enzimas del metabolismo anaplerótico o enzimas para la producción de nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato reducido o enzimas de la glucólisis o enzimas PTS o enzimas del metabolismo del azufre. En general, se prefiere el uso de genes endógenos.

Puede ser ventajoso para la producción de L-triptófano con cepas de la familia Enterobacteriaceae, además del empleo de uno de los alelos glpK, reforzar una o más enzimas de la conocida vía de la biosíntesis de triptófano o enzimas de la biosíntesis de serina o enzimas para la producción de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato (DHAP) y corismato. En general, se prefiere el uso de genes endógenos.

Por "genes endógenos" o "secuencias de nucleótidos endógenas" se entienden los genes o marcos de lectura abiertos

o alelos o bien secuencias de nucleótidos presentes en la población de una especie.

El término "refuerzo" en este contexto describe el aumento en la actividad intracelular o concentración de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo que son codificadas por el correspondiente ADN, aumentando, por ejemplo, el número de copias del gen o bien de los genes, del ORF o bien de los ORFs en al menos una (1) copia, enlazando funcionalmente un fuerte promotor con el gen, o utilizando un gen o alelo u ORF que codifica una enzima o bien proteína correspondiente con una actividad alta, y opcionalmente combinando estas medidas.

Microorganismos recombinantes con un refuerzo de este tipo se generan, por lo general, mediante transformación, transducción o conjugación, o una combinación de estos métodos, con un vector que contiene el gen deseado, el ORF deseado, un alelo de este gen u ORFs o partes de los mismos, y/o que contiene un promotor que refuerza la expresión del gen o del ORF. En el caso de este promotor se puede tratar del promotor que procede de una mutación reforzante de la propia secuencia reguladora, que se encuentra aguas arriba del gen u ORF, o se fusiona un promotor adecuado o

eficaz con el gen u ORF.

Mediante las medidas de mejora, especialmente la sobre-expresión, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se incrementa, en general, en al menos un 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, como máximo en hasta 1000% o 2000%, referido a la de la proteína de tipo salvaje o bien a la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo no recombinante o cepa parental para la correspondiente enzima o bien proteína. Por microorganismo no recombinante o cepa parental (parent strain) se entiende el microorganismo en el cual se llevan a cabo las medidas de refuerzo.

Para lograr una sobre-expresión, se puede aumentar el número de copias de los genes o marcos de lectura abierta correspondientes, o se puede mutar la región del promotor y de regulación o el sitio de unión al ribosoma, localizado aguas arriba del gen estructural. De la misma manera actúan las casetes de expresión que son incorporadas aguas arriba del gen estructural. Mediante promotores inducibles, es adicionalmente posible aumentar la expresión en el transcurso de la producción fermentativa de L-treonina y L-triptófano, además puede ser ventajoso el uso de promotores para la expresión de genes que posibilita una expresión génica cronológica diferente. En el nivel de la regulación traduccional de la expresión génica, es posible aumentar la frecuencia de iniciación (reacción de adición del ribosoma al ARNm) o la velocidad de la elongación (fase de prolongación). La expresión se mejora asimismo mediante medidas para prolongar la vida útil del ARNm. Además, al impedir la degradación de la proteína enzimática, se potencia asimismo la actividad enzimática. Los ORFs, genes o construcciones génicas pueden estar presentes en plásmidos con diferentes números de copias o pueden estar integrados y amplificados en el cromosoma. Alternativamente, se puede lograr una sobre-expresión de los genes pertinentes mediante la alteración de la composición de los medios y la realización del cultivo.

Métodos para la sobre-expresión se describen suficientemente en el estado conocido de la técnica -por ejemplo en Makrides et al. (Microbiological Reviews 60 (3), 512-538 (1996)) -. Mediante el uso de vectores, se incrementa el número de copias en al menos una (1) copia. En calidad de vectores se pueden utilizar plásmidos tal como se describe, por ejemplo, en el documento US 5.538.873. Como vectores pueden utilizarse asimismo fagos, por ejemplo el fago Mu tal como se describe en el documento EP 0332448, o el fago lambda (λ). Un aumento en el número de copias también se puede lograr incorporando una copia adicional en otro sitio del cromosoma -por ejemplo, en el sitio att del fago λ (Yu y Court, Gene 223, 77-81 (1998)) -. En el documento US 5.939.307 se describe que mediante la incorporación de casetes de expresión o promotores tales como, por ejemplo, el promotor tac, el promotor trp, el promotor lpp o el promotor PL y el promotor PR del fago λ, por ejemplo aguas arriba del operón treonina cromosómico, se puede conseguir un aumento de la expresión. Del mismo modo, se pueden utilizar los promotores del fago T7, los promotores de la caja de cambios o el promotor nar. Casetes de expresión o promotores de este tipo también se pueden utilizar para sobre-expresar, tal como se describe en el documento EP 0 593 792, genes unidos a plásmidos. Mediante el uso del alelo lacIQ se puede controlar de nuevo la expresión de genes unidos a plásmidos (Glascock y Weickert, Gene 223, 221-231 (1998)). Además, es posible que la actividad de los promotores se incremente mediante la modificación de su secuencia por medio de uno o más intercambios de nucleótidos, mediante inserción o inserciones y/o deleción o deleciones. Otra expresión cronológica de genes se puede conseguir, por ejemplo, tal como se describe en Walker, et al. (Journal of Bacteriology 181: 1269-80 (1999)) mediante el uso del promotor fis dependiente de la fase de crecimiento. La velocidad de elongación se ve afectada por el uso del codón, mediante el uso de codones para los ARNts que se presentan con frecuencia en la cepa parental (parent strain) se puede reforzar la expresión génica.

Instrucciones generales las encuentra el experto en la materia, entre otros, en Chang y Cohen (Journal of Bacteriology

134: 1141-1156 (1978)), en Hartley y Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), en Amann y Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), en de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), en LaVallie et al. (BIO / TECHNOLOGY 11: 187-193 (1993)), en el documento PCT/US97/13359, en Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), en Quandt y Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), en Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)) y en libros de texto conocidos de genética y biología molecular.

Se pueden utilizar vectores de plásmidos replicables en Enterobacteriaceae tales como, por ejemplo, vectores de clonación derivados de pACYC184 (Bartolomé et al.; de Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) o derivados de pSC101 (Vocke y Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 (21): 6557-6561 (1983)). En un procedimiento de acuerdo con la invención se puede emplear una cepa transformada con un vector, preferiblemente el vector del plásmido, portando el vector al menos uno o más de los genes que se mencionan en lo que sigue o sus secuencias de nucleótidos o alelos codificadores de productos génicos.

Así, por ejemplo, para la producción de L-treonina, se pueden reforzar, en particular sobre-expresar, al mismo tiempo uno o más de los genes seleccionados del grupo

• al menos un gen del operón thrABC que codifica la aspartato quinasa, la homoserina deshidrogenasa, la homoserina quinasa y la treonina sintasa (documento US-A-4.278.765),

• el gen pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica la piruvato carboxilasa (documento WO 99/18228),

• el gen pps que codifica la fosfoenolpiruvato-sintasa (Molecular and General Genetics 231 (2): 332-336 (1992)), 5

•: el gen ppc que codifica la fosfoenolpiruvato-carboxilasa (documento WO 02/064808),

•: los genes pntA y pntB que codifican las subunidades de la transhidrogenasa (European Journal of

Biochemistry 158: 647-653 (1986)), 10

•: el gen rhtC que codifica la proteína inductora de resistencia frente a treonina (documento EP-A-1 013 765),

•: el gen thrE que codifica la proteína portadora de la exportación de treonina de Corynebacterium glutamicum

(documento WO 01/92545), 15

• el gen gdhA que codifica la glutamato-deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene

23: 199-209 (1983)),

• el gen ptsH del operón ptsHIcrr que codifica la proteína fosfohistidina-hexosa-fosfotransferasa del sistema de 20 fosfotransferasa PTS (documento WO 03/004674),

• el gen ptsI del operón ptsHIcrr que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa PTS (documento WO 03/004674),

25 • el gen crr del operón ptsHIcrr que codifica el componente IIA específico para glucosa del sistema de fosfotransferasa PTS (documento WO 03/004674),

•: el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico para glucosa (documento WO 03/004670), 30 • el gen cysK que codifica la cisteína-sintasa A (documento WO 03/006666),

• el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys (documento WO 03/006666),

•: el gen cysJ del operón cysJIH que codifica la flavoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa (documento WO 35 03/006666),

• el gen cysI del operón cysJIH que codifica la hemoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa (documento WO 03/006666),

40 • el gen cysH del operón cysJIH que codifica la adenilsulfato-reductasa (documento WO 03/006666),

• el gen sucA del operón sucABCD que codifica la subunidad descarboxilasa de la 2-cetoglutarato deshidrogenasa (documento WO 03/008614),

45 • el gen sucB del operón sucABCD que codifica la subunidad E2 dihidrolipolitranssuccinasa de la 2cetoglutarato deshidrogenasa (documento WO 03/008614)

• el gen sucC del operón sucABCD que codifica la subunidad β de la succinil-CoA sintetasa (documento WO

03/008615), 50

•: el gen sucD del operón sucABCD que codifica la subunidad α de la succinil-CoA sintetasa (documento WO 03/008615),

•: el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yibD de Escherichia coli (Número de Acceso AE000439

55 del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), documento WO 05/075627).

Además, por ejemplo para la producción de L-triptófano, se pueden reforzar, en particular sobre-expresar, al mismo tiempo uno o más de los genes seleccionados del grupo 60

• al menos un gen del operón triptófano que codifica la antranilato-sintasa, la antranilato fosforribosiltransferasa, la fosforribosilantranilato-isomerasa, la indol-3-glicerolfosfato-sintasa y la triptófano-sintasa (Applied and Environmental Microbiology 38 (2): 181-190 (1979)),

• el gen serA que codifica la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa (documento WO 87/01130),

• el gen serB que codifica la fosfoserinafosfatasa (documento WO 87/01130), 5

•: el gen serC que codifica la fosfoserina-aminotransferasa (documento WO 87/01130),

•: el gen aroF que codifica la DHAP-sintasa sensible a L-tirosina (documento WO 87/01130; documento EP

1270721), 10

• el gen aroG que codifica la DHAP-sintasa sensible a L-fenilalanina (documento WO 87/01130; documento EP 1270721),

•: el gen aroH que codifica la DHAP-sintasa sensible a L-triptófano (documento WO 87/01130; documento EP 15 1270721),

• el gen pps que codifica la fosfoenolpiruvato-sintasa (documento WO 96/08567)

•: el gen pckA que codifica la fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (documento WO 2004/090125), 20

•: el gen tktA que codifica la transcetolasa A (documento US 5.168.056),

•: el gen tktB que codifica la transcetolasa B (documento US 5.168.056),

25 • el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yddG de Escherichia coli (Número de Acceso NC000913 (Región 1544312-1545193) del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), documento EP 1449918).

Además, para la preparación de los L-aminoácidos se fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriaceae, en

30 los que para optimizar el metabolismo del glicerol, se pueden reforzar, en particular sobre-expresar, al mismo tiempo uno o más de los genes seleccionados del grupo además simultáneamente uno o más de los genes seleccionados del grupo (documento EP 1715055):

•: el gen glpA que codifica la subunidad grande de la sn-glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa (anaerobia), 35

• el gen glpB que codifica la subunidad para el anclaje a membrana de la sn-glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa (anaerobia),

•: el gen glpC que codifica la subunidad pequeña de la sn-glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa (anaerobia), 40

• el gen glpD que codifica la glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa (aerobia),

•: el gen glpE que codifica la azufre-transferasa, 45 • el gen glpF que codifica el facilitador del glicerol GlpF,

• el gen glpG,

•: el gen glpQ que codifica la glicerolfosfodiesterasa periplasmática, 50

• el gen glpT que codifica la glicerol-3-fosfato-permeasa,

•: el gen glpX que codifica la fructosa-1,6-bisfosfatasa II, 55 • el gen tpiA que codifica la triosafosfato-isomerasa,

• el gen gldA que codifica la glicerol-deshidrogenasa (NAD-dependiente),

•: el gen dhaK que codifica el dominio N-terminal de la dihidroxiacetona-quinasa, 60

•: el gen dhaL que codifica el dominio C-terminal de la dihidroxiacetona-quinasa,

•: el gen dhaM que codifica la subunidad de la proteína PTS de la dihidroxiacetona-quinasa,

•: el gen dhaR que codifica el activador del operón dha,

•: el gen fsa que codifica la fructosa-6-fosfato aldolasa I, y

•: el gen talC que codifica la fructosa-6-fosfato aldolasa II.

Además, para la preparación de los L-aminoácidos se fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriaceae, en los que para optimizar el metabolismo del glicerol, se atenúa, en particular, se elimina o se reduce adicionalmente al mismo tiempo el gen glpR que codifica el represor del regulón glp (documento EP 1715056).

El término "atenuación" en este contexto describe la reducción o eliminación de la actividad o concentración intracelular de una o más enzimas o bien proteínas en un microorganismo que son codificadas por el ADN correspondiente, utilizando, por ejemplo, un promotor más débil que en el microorganismo o cepa parental no recombinante para la enzima o bien proteína correspondiente, o un gen o bien alelo que codifica una enzima o bien proteína correspondiente con una baja actividad o bien inactiva la enzima o la proteína correspondiente, o el marco de lectura abierto o el gen, y eventualmente se combinan estas medidas.

Mediante las medidas de atenuación, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se reduce, por lo general, a 0 hasta 75%, a 0 hasta 50%, a 0 hasta 25%, a 0 hasta 10% o a 0 hasta 5% de la actividad o concentración de la proteína de tipo salvaje, o bien de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo no recombinante o cepa parental. Por microorganismo no recombinante o cepa parental (parent strain) se entiende el microorganismo para el que se lleven a cabo las medidas de atenuación.

Para lograr una atenuación se pueden reducir o eliminar, por ejemplo, la expresión de los genes o marcos de lectura abiertos o las propiedades catalíticas de las proteínas enzimáticas. Eventualmente pueden combinarse ambas medidas.

La reducción en la expresión génica puede tener lugar mediante una realización adecuada del cultivo, por modificación genética (mutación) de las estructuras de señal de la expresión génica o también mediante la técnica de ARN antisentido. Estructuras de señal de la expresión génica son, por ejemplo, genes represores, genes activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de unión a ribosoma, el codón de iniciación y terminadores. Datos al respecto los encuentra el experto en la materia, entre otros, por ejemplo en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)), en Carrier y Keasling (Biotechnology Progress 15: 58-64 (1999)), Franch y Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159-164 (2000)) y en libros de texto conocidos de genética y biología molecular tales como, por ejemplo, el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6ª Edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995) o de Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990).

Una reducción de la expresión génica también se puede lograr mediante la incorporación de una mutación en el codón de terminación la región codificadora de un gen deseado con la supresión simultánea de la mutación en el codón de terminación de un supresor de ARNt adecuado. Este modo de proceder se describe en el documento WO 03/074719.

Mutaciones que conducen a un cambio o bien una reducción de las propiedades catalíticas de proteínas enzimáticas son conocidas del estado de la técnica. Como ejemplos se pueden mencionar los trabajos de Qiu y Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 5511-5515 (1998)), Wente y Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 2083320839 (1991)). Presentaciones recopilatorias se pueden tomar de libros de texto de genética y biología molecular conocidos tales como, por ejemplo, del de Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

En calidad de mutaciones entran en consideración transiciones, transversiones, inserciones y deleciones de al menos un (1) par de bases o bien nucleótidos. Dependiendo del efecto del intercambio de aminoácidos causado por la mutación sobre la actividad enzimática, se habla de mutaciones de sentido erróneo (“missense mutations”) o mutaciones sin sentido ("nonsense mutations"). La mutación sin sentido conduce a un intercambio de un aminoácido dado en una proteína por otro, tratándose, en particular, de un intercambio no conservador de aminoácido. Con ello se perjudica la funcionalidad o bien actividad de la proteína y se reduce a un valor de 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10%

o 0 a 5%. La mutación sin sentido conduce a un codón de terminación en la región codificante del gen y, con ello, a una interrupción prematura de la traducción. Inserciones o deleciones de al menos un par de bases en un gen conducen a mutaciones de desplazamiento de marco ("frame shift mutations"), que conducen a que se incorporen aminoácidos incorrectos o a que se interrumpa de forma prematura la traducción. Si como consecuencia de la mutación se forma un codón de terminación en la región codificante, entonces esto conduce asimismo a una interrupción prematura de la traducción. Deleciones de al menos uno (1) o más codones conducen típicamente asimismo a una pérdida completa de la actividad enzimática. Las medidas mencionadas se llevan a cabo preferiblemente en la parte 5'-terminal de la región codificadora, que codifica el extremo N del polipéptido. Si la longitud total de un polipéptido (medida como el número de

L-aminoácidos unidos químicamente) se designa con 100%, entonces pertenecen – en el marco de las medidas de atenuación de la presente invención – al extremo N del polipéptido la parte de la secuencia de aminoácidos, que, calculada a partir del aminoácido de partida L-formil-metionina contiene 80% de los siguientes L-aminoácidos.

5 Instrucciones para generar mutaciones de este tipo pertenecen al estado conocido de la técnica y pueden tomarse de libros de texto de genética y biología molecular conocidos tales como, por ejemplo, del libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6ª Edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995), del de Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o del de Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

10 Mutaciones adecuadas en los genes pueden incorporarse en cepas adecuadas mediante intercambio de genes o alelos.

Un método habitual es el método descrito por Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)) del

15 intercambio de genes con ayuda de un derivado de pSC101 pMAK705 condicionalmente replicante. Asimismo pueden utilizarse otros métodos descritos en el estado conocido de la técnica tales como el de Martínez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 181: 7143-7148 (1999)) o el de Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182: 842-847 (2000)).

Es asimismo posible transferir por conjugación o transducción en diversas cepas mutaciones en los genes respectivos o 20 mutaciones que afectan a la expresión de los respectivos genes o marcos de lectura abiertos.

Explicaciones más detalladas sobre los términos y expresiones de la genética y la biología molecular se puede encontrar en los libros de texto de genética y biología molecular conocidos tales como, por ejemplo, el libro de texto de Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4ª ed., Springer Verlag, Nueva York (EE.UU.), 2000) o el libro de texto de Berg,

25 Tymoczko y Stryer (Biochemistry, 5ª ed., Freeman and Company, Nueva York (EE.UU.), 2002) o el manual de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (conjunto de 3 volúmenes), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EE.UU.), 2001).

Además, para la producción de L-treonina puede ser ventajoso atenuar, en particular eliminar o reducir la expresión, 30 adicionalmente al empleo de uno de los alelos de glpK indicados, uno o más de los genes seleccionados del grupo

• el gen tdh que codifica la treonina-deshidrogenasa (Journal of Bacteriology 169: 4716-4721 (1987)),

• el gen mdh que codifica la malato-deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149: 36-42 35 (1987)),

• el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yjfA de Escherichia coli (Número de Acceso AAC77180 del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), documento WO 02/29080),

• el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) ytfP de Escherichia coli (Número de Acceso AAC77179 del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), documento WO 02/29080),

45 • el gen pckA que codifica la enzima fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (documento WO 02/29080),

• el gen poxB que codifica la piruvato-oxidasa (documento WO 02/36797),

• el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa (documento WO 02/081721), que 50 también se conoce bajo la denominación gen mlc,

• el gen fruR que codifica el represor de fructosa (documento WO 02/081698), que también se conoce bajo la denominación gen cra,

55 • el gen rpoS que codifica el factor sigma38 (documento WO 01/05939), que también se conoce bajo la denominación gen katF, y

• el gen aspA que codifica para la aspartato amonio-liasa (documento WO 03/008603).

Estas medidas se llevan a cabo eventualmente, además de o en combinación apropiada con las medidas indicadas 60 para reforzar la producción de treonina y las medidas para optimizar el metabolismo del glicerol.

Además, para la producción de L-triptófano puede ser ventajoso atenuar, en particular eliminar o reducir la expresión, adicionalmente al empleo de uno de los alelos de glpK indicados, uno o más de los genes seleccionados del grupo

• el gen tnaA que codifica triptofanasa (documento US 4.371.614),

• el gen trpR que codifica el represor del operón trp (documento US 4.371.614), 5

•: el gen tyrA que codifica la corismato-mutasa T y la prefenato-deshidrogenasa (documento US 4.371.614),

•: el gen pheA que codifica la corismato-mutasa P y la prefenato-deshidrogenasa (documento US 4.371.614),

10 • el gen mtr que codifica la proteína de transporte específica para triptófano (documento US 5.756.345),

• el gen tnaB que codifica la triptófano-permeasa (documento US 5.756.345),

• el gen aroP que codifica el transportador para aminoácidos aromáticos (documento US 5.756.345), 15

•: el gen sdaA que codifica la L-serina deaminasa (documento EP 0149539),

•: el gen pgi que codifica la glucosa-6-fosfato-isomerasa (documento WO 87/01130),

20 • el gen tyrB que codifica la tirosina-aminotransferasa (documento WO 87/01130).

Estas medidas se llevan a cabo eventualmente, además de o en combinación apropiada con las medidas indicadas para reforzar la producción de triptófano y las medidas para optimizar el metabolismo del glicerol.

25 Además, para la producción de L-aminoácidos, puede ser ventajoso, además del empleo de uno de los alelos glpK indicados, eliminar reacciones secundarias indeseadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (comps.), Academic Press, Londres, Reino Unido, 1982).

30 El rendimiento de las bacterias aisladas o del proceso de fermentación utilizando el mismo con respecto a uno o más de los parámetros elegidos del grupo de la concentración del producto (producto por volumen), del rendimiento del producto (producto formado por fuente de carbono consumida) y la formación de producto (producto formado por volumen y tiempo) o también otros parámetros del proceso y combinaciones de los mismos, se incrementa en al menos 0,5%, al menos 1%, al menos 1,5% o al menos 2% referido al microorganismo o cepa parental no recombinante o bien

35 al proceso de fermentación utilizando el mismo.

De acuerdo con la invención, los microorganismos producidos se cultivan en un procedimiento por lotes (cultivo por lotes), en un procedimiento por lotes alimentados (proceso de alimentación), en un procedimiento por lotes alimentados repetidos (proceso de alimentación repetitivo) o en un procedimiento continuo. Compendios sobre este tipo de métodos

40 están disponibles en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

En un procedimiento por lotes, con unas pocas excepciones tales como, por ejemplo, oxígeno y agentes correctores

45 del pH, todos los materiales de partida se disponen en forma de una tanda y el microorganismo se cultiva en el medio obtenido.

En el caso de un procedimiento por lotes alimentados se cultiva primero el microorganismo por medio de un proceso por lotes (fase de lotes). A continuación de ello, se añade al cultivo una sustancia de partida esencial para la

50 preparación del producto, eventualmente también varias sustancias de partida, de forma continua o discontinua (fase de alimentación, feed-phase). En el caso de la preparación de L-aminoácidos, en este caso se trata de una fuente de carbono.

En el caso de un procedimiento por lotes alimentados repetidos se trata de un procedimiento por lotes alimentados, en

55 el que, después de finalizada la fermentación, una parte del caldo de fermentación sirve como inóculo para iniciar un procedimiento por lotes alimentados repetidos renovado. Eventualmente, este ciclo se puede repetir varias veces. Procedimientos por lotes alimentados repetidos se describen, por ejemplo, en el documento WO 02/18543 y WO 05/014843.

60 En el caso de un procedimiento continuo, a continuación de un procedimiento por lotes o por lotes alimentados, se añaden continuamente al cultivo una o varias, eventualmente todas las sustancias de partida y, al mismo tiempo, se retira caldo de fermentación. Procedimientos continuos se describen, por ejemplo, en los documentos de patente US 5.763.230, WO 05/014840, WO 05/014841 y WO 05/014842.

El medio de cultivo o bien el medio de fermentación a utilizar debe satisfacer de una manera adecuada los requisitos de las cepas respectivas. Descripciones de medios de cultivo de diversos microorganismos están contenidas en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociedad Americana de Bacteriología (Washington D.C., EE.UU., 1981). Los términos medio de cultivo, medio de fermentación y medio nutricio son intercambiables entre sí.

En general, un medio de cultivo contiene, entre otros, una o más fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y fuentes de fósforo.

El medio de cultivo debe comprender, además, sales de metales, tales como sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, además de las sustancias arriba mencionadas, pueden emplearse sustancias de crecimiento esenciales tales como aminoácidos y vitaminas.

Por fuente de carbono se entienden en el marco de esta invención compuestos que únicamente contienen carbono, oxígeno e hidrógeno en la molécula y que se aprovechan por los microorganismos para la formación de su biomasa (masa celular) y para la producción de los L-aminoácidos. En un procedimiento de acuerdo con la invención, en un aspecto la fuente de carbono se compone esencialmente de glicerol, y en otro aspecto se compone esencialmente de glicerol y de uno o más de los azúcares seleccionados del grupo de glucosa, sacarosa, fructosa, trehalosa, maltosa, celobiosa, manosa, manitol, N-acetilglucosamina, -glucósidos y glucitol, preferiblemente se compone en esencia de uno o más de los azúcares seleccionados del grupo de glucosa, sacarosa y fructosa.

La expresión "en esencia" tiene en cuenta en este contexto, por una parte, el hecho de que en los procesos industriales de fermentación para la producción de L-aminoácidos se utilizan sustancias de partida no sólo químicamente puras, sino también sustancias de partida eventualmente contaminadas de calidad técnica o inferior. Además, la expresión tiene en cuenta la composición de componentes de medios típicos complejos microbiológicos, la modificación química de las sustancias de partida como consecuencia de la esterilización por el calor y, finalmente, la transmisión de componentes de medios o componentes del caldo de fermentación que resulta de la inoculación de un medio nutricio por medio de un cultivo previo (un inóculo).

En un procedimiento de acuerdo con la invención puede utilizarse no sólo glicerol químicamente puro, sino también glicerol de calidad técnica (glicerol bruto). Glicerol de calidad técnica contiene pequeñas concentraciones de compuestos que resultan en el proceso de preparación y que no fueron separados por completo. A ellos pertenecen, entre otros, agua, diversas sales y compuestos orgánicos.

El glicerol bruto, que se obtiene a partir de aceite de colza, contiene, por ejemplo, como impurezas, compuestos tales como ácido linoleico, ácido linolénico, ácido oleico y sus ésteres metílicos o también ácido glicerol-monoacético, mono-, di-y tri-glicéridos, que eventualmente pueden utilizarse como fuente de carbono. El contenido de este tipo de compuestos que sirven como fuente de carbono es generalmente  (a lo sumo) 7,5% en peso, preferiblemente  5% en peso, de manera particularmente preferida  2,5% en peso (referido al glicerol bruto anhidro). El glicerol empleado para las medidas de la invención tiene un contenido de  (al menos) 90% en peso, preferiblemente  92,5% en peso, y de manera particularmente preferida de  95% en peso (basado en la sustancia de partida anhidra).

Una fuente importante de glucosa es hidrolizados de almidón. Típicamente, sustancias acompañantes son, de manera correspondiente, por ejemplo, maltosa y/o isomaltosa en concentraciones de aproximadamente 0,1 a 2% en peso. La glucosa utilizada para las medidas de la invención tiene un contenido de  (al menos) 90% en peso, preferiblemente  95% en peso (referido a la sustancia seca).

Es conocido que, en disoluciones de sacarosa, la sacarosa a temperatura elevada, como ocurre, por ejemplo, durante la esterilización por calor, se invierte en una pequeña proporción en glucosa y fructosa. En la sacarosa o disolución de sacarosa utilizada para las medidas de la invención, la proporción de glucosa y fructosa asciende a  (máximo) 10% en peso, preferiblemente  5% en peso (referido a la sustancia seca).

La melaza (melaza de remolacha) en la producción de sacarosa a partir de remolacha azucarera contiene una mezcla de azúcares que consiste sustancialmente en sacarosa.

En el mundo científico son conocidas disoluciones concentradas que contienen glucosa y fructosa, por ejemplo, bajo la denominación "isojarabe", "jarabe de maíz de alto contenido en fructosa" o "jarabe de glucosa con contenido en fructosa". Éstas se preparan mediante hidrólisis de almidón con subsiguiente tratamiento de la glucosa con isomerasa. Contienen una mezcla de azúcares, que es generalmente de aproximadamente 50 -55% en peso de glucosa y 40 45% en peso de fructosa (referido a la materia seca). En virtud del proceso de preparación, estos jarabes de maltosa contienen, entre otros, generalmente maltosa en una concentración de cómo máximo aproximadamente 6% en peso (referido a la sustancia seca).

Disoluciones concentradas, que esencialmente contienen una mezcla de azúcares que se compone en partesequimolares de glucosa y fructosa, son asimismo conocidas en el mundo científico. Éstas se preparan, por ejemplo, mediante tratamiento de sacarosa con invertasa y, en consecuencia, contienen pequeñas proporciones de sacarosa ( 5% en peso referido a la sustancia seca).

En el mundo científico se conocen, además, disoluciones concentradas que contienen una mezcla de azúcares que consiste en sacarosa, glucosa y fructosa. Éstas se preparan por inversión parcial de sacarosa. Un concentrado conocido se compone de 38,5% en peso de sacarosa, 38,5% en peso de azúcar invertido (es decir, glucosa y fructosa en la relación 1: 1) y 23% en peso de agua.

La melaza (melaza de caña de azúcar) que resulta en la producción de sacarosa a partir de la caña de azúcar contiene una mezcla de azúcares que consiste esencialmente en sacarosa, glucosa y fructosa.

La expresión "en esencia" tiene en cuenta, además, el hecho de que en componentes de medios complejos empleados en medios de fermentación tales como, por ejemplo, extracto de levadura o líquido de maceración de maíz contienen, en proporciones variables, compuestos que pueden servir como fuente de carbono. Así, el extracto de levadura contiene, entre otros, trehalosa y/o glucosa. El líquido de maceración de maíz contiene alrededor de 10 a 20% en peso (referido a la sustancia seca) de ácido láctico. Componentes de medios complejos de este tipo se emplean, por lo general, en una concentración de 0,5 a 20 g/l y también en concentraciones mayores en el medio de fermentación.

Informaciones para la preparación de glucosa, sacarosa y fructosa y para la composición de componentes de medios complejos se encuentran, entre otros, en los libros de texto de Bartens (Zuckertechnologie, Rüben und Rohrzuckerherstellung, Verlag Dr. Albert Bartens KG, Berlín (Alemania)), McGinnis (Beet-Sugar Tecnnology, tercera edición, Studio of Printcraft, Fort Collins, Colorado, EE.UU. (1982)), Drews (Mikrobiologisches Praktikum, 3ª Edición, Springer Verlag, Berlin (Alemania), 1976), Rehm (Industrielle Mikrobiologie, 2ª Edición, Springer Verlag, Berlin (Alemania), 1980) y Crueger y Crueger (Lehrbuch der Angewandten Mikrobiologie, Akademische Verlagsgesellschaft, Wiesbaden (Alemania), 1982).

Finalmente, la expresión "en esencia" tiene en cuenta el hecho de que mediante la inoculación de un medio nutricio utilizando un denominado precultivo (inóculo), las fuentes de carbono no consumidas o formadas durante el precultivo se transfieren al cultivo utilizado para la preparación del L-aminoácido correspondiente. La proporción del precultivo en el cultivo resultante de la inoculación asciende, por lo general, a 2 hasta 20%, eventualmente también como máximo a 50%.

En un procedimiento de acuerdo con la invención, el glicerol o glicerol bruto empleado se compone, por lo general, de hasta ≥ (al menos) 90% en peso, preferiblemente de al menos 92,5% en peso y de manera particularmente preferida de ≥ 95% en peso de glicerol (referido al material de partida anhidro). Asimismo se puede emplear glicerol con una pureza de ≥ 97% en peso, ≥ 98% en peso o ≥ 99% en peso.

En un procedimiento de acuerdo con la invención, el azúcar empleado preferiblemente o bien las mezclas de azúcares empleadas preferiblemente se compone o bien componen, en general de ≥ (al menos) 90% en peso, eventualmente de manera preferida de ≥ 95% en peso de uno o varios de los azúcares indicados, seleccionados del grupo de glucosa, sacarosa y fructosa (referido a la sustancia seca).

Si en un procedimiento de acuerdo con la invención se emplean mezclas a base de glicerol y glucosa o mezclas a base de glicerol y sacarosa, la proporción de glicerol en la mezcla asciende a ≥ (al menos) 10% en peso, ≥ 20% en peso, ≥ 40% en peso, ≥ 50% en peso, ≥ 60% en peso o ≥ 80% en peso y ≤ (a lo sumo) 90% en peso.

Si en un procedimiento de acuerdo con la invención se emplean mezclas a base de glicerol y una mezcla de azúcares a base de glucosa y fructosa, entonces la proporción de glicerol en la mezcla asciende a ≥ (al menos) 10% en peso, ≥ 20% en peso, ≥ 40% en peso, ≥ 50% en peso, ≥ 60% en peso o ≥ 80% en peso y ≤ (a lo sumo) 90% por ciento en peso. La proporción de glucosa en la mezcla de azúcares consistente en glucosa y fructosa asciende a ≥ (al menos) 10% en peso, ≥ 20% en peso, ≥ 40% en peso, ≥ 50% en peso, ≥ 60% en peso o ≥ 80% en peso y ≤ (a lo sumo) 90% en peso, preferiblemente 45 a 65% en peso, 50 a 65% en peso, 50 a 60% en peso , 55 a 65% en peso o 55 a 60% en peso.

Si en un procedimiento de acuerdo con la invención se emplean mezclas a base de glicerol y una mezcla de azúcares a base de sacarosa, glucosa y fructosa, la proporción de glicerol en la mezcla asciende a ≥ (al menos) 10% en peso, ≥ 20% en peso, ≥ 40% en peso, ≥ 50% en peso, ≥ 60% en peso o ≥ 80% en peso y ≤ (a lo sumo) 90% en peso. La proporción de sacarosa, glucosa y fructosa en la mezcla de azúcares asciende en cada caso a > (mayor que) 10% en peso y menos de 80% en peso.

Si en un procedimiento de acuerdo con la invención se emplea glicerol o bien glicerol bruto y uno o varios de los

azúcares seleccionados del grupo de glucosa, sacarosa y fructosa como fuente de carbono, entonces el medio contiene, en el caso del procedimiento por lotes, de manera correspondiente, glicerol o glicerol y el o los azúcares indicados.

5 En el caso de un procedimiento por lotes alimentados, la fuente de carbono se puede introducir de distintas formas en el procedimiento.

En un primer aspecto, para la fase por lotes se dispone uno o varios de los azúcares indicados. En la fase de alimentación subsiguiente se emplea 10 a) glicerol o glicerol bruto, o

b) una mezcla a base de glicerol y uno o más de los azúcares indicados.

15 En un segundo aspecto, para la fase por lotes se dispone glicerol. En la fase de alimentación subsiguiente se emplea

a) glicerol o glicerol bruto, o

b) una mezcla a base de glicerol y uno o más de los azúcares indicados.

20 En un tercer aspecto, para la fase por lotes se dispone una mezcla a base de glicerol y uno o varios de los azúcares indicados. En la fase de alimentación subsiguiente se emplea

a) glicerol o glicerol bruto, o 25 b) una mezcla a base de glicerol y uno o más de los azúcares indicados.

En un cuarto aspecto, para la fase por lotes se dispone una fuente de carbono seleccionada del grupo

30 a) glicerol o glicerol bruto,

b) uno o varios de los azúcares indicados, y

c) una mezcla a base de glicerol y uno o varios de los azúcares, seleccionados preferiblemente del grupo de sacarosa, 35 glucosa y fructosa.

En la fase de alimentación subsiguiente,

d) en al menos un período continuo de al menos una (1) hora y como máximo 100, preferiblemente como máximo 50,

40 de manera particularmente preferida como máximo 30 horas se emplea glicerol y, a continuación, en al menos un período continuo de al menos una (1) hora y como máximo 100, preferiblemente como máximo 50, de manera particularmente preferida como máximo 30 horas se emplea uno o varios de los azúcares indicados, o

e) en al menos un período continuo de al menos una (1) hora y como máximo 100, preferiblemente como máximo 50,

45 de manera particularmente preferida como máximo 30 horas se emplea uno o varios de los azúcares indicados y, a continuación, en al menos un período continuo de al menos una (1) hora y como máximo 100, preferiblemente como máximo 50, de manera particularmente preferida como máximo 30 horas se emplea glicerol,

en donde la proporción de glicerol en la fuente de carbono empleada asciende a ≥ (al menos) 10% en peso, ≥ 20% en 50 peso, ≥ 40% en peso, ≥ 50% en peso, ≥ 60% en peso o ≥ 80% en peso y ≤ (a lo sumo) 90% en peso.

En el caso de un procedimiento por lotes alimentados repetidos, para las fases por lotes repetidos y las fases de alimentación se emplean las mismas fuentes de carbono a las descritas para el procedimiento por lotes y por lotes alimentados (véase más arriba).

55 En el caso de un cultivo continuo, se añaden continuamente glicerol o glicerol y uno o varios de los azúcares seleccionados del grupo de sacarosa, glucosa y fructosa.

Como fuente de nitrógeno pueden utilizarse mezclas de sustancias nitrogenadas orgánicas tales como peptonas,

60 extracto de levadura, extracto de carne, líquido de maceración de maíz o harina de soja, compuestos orgánicos tales como urea, o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse individualmente o en forma de una mezcla.

Como fuente de fósforo pueden utilizarse ácido fosfórico, dihidrógeno-fosfato de potasio, hidrógeno-fosfato dipotásico o las sales correspondientes que contienen sodio, individualmente o en forma de mezcla.

La fermentación se lleva a cabo, por lo general, a un valor del pH de 5,5 a 9,0, en particular de 6,0 a 8,0. Para controlar el pH del cultivo, se emplean de manera adecuada compuestos de carácter básico tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o bien agua amoniacal, o compuestos de carácter ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para controlar la formación de espuma pueden emplearse agentes antiespumantes tales como, por ejemplo, ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Para mantener la estabilidad de los plásmidos pueden añadirse al medio sustancias adecuadas, que actúan selectivamente, por ejemplo antibióticos. Para mantener las condiciones aerobias, se incorporan en el cultivo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno tales como, por ejemplo, aire. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente en 25°C a 45ºC y preferiblemente a 30°C a 40ºC. A través de la actividad de los microorganismos, se produce un enriquecimiento o bien una acumulación del L-aminoácido en la fermentación o bien caldo de cultivo. El cultivo se prolonga hasta que se forme un máximo en el L-aminoácido deseado. Este objetivo se alcanza normalmente en el espacio de 10 horas a 160 horas. En el caso de los procesos continuos, son posibles tiempos de cultivo más largos.

Por un caldo de fermentación o bien caldo de cultivo se entiende un medio de fermentación en el que un microorganismo ha sido cultivado durante un tiempo determinado y a una determinada temperatura.

Al término de la fermentación, el caldo de fermentación resultante contiene de manera correspondiente a) la biomasa (masa celular) del microorganismo que resulta como consecuencia de la multiplicación de las células del microorganismo, b) el L-aminoácido formado en el transcurso de la fermentación, c) los productos secundarios orgánicos formados en el transcurso de la fermentación y d) los componentes del medio de fermentación / de los medios de fermentación no consumidos o bien de las sustancias de partida tales como, por ejemplo, vitaminas tales como tiamina o sales tales como sulfato de magnesio.

El caldo de cultivo o bien caldo de fermentación preparado se puede recoger a continuación y se puede obtener o aislar el L-aminoácido o bien el producto con contenido en L-aminoácido.

En una variante del procedimiento, el caldo de fermentación se concentra eventualmente y, a continuación, se purifica el L-aminoácido o bien se aísla en una forma pura o casi pura. Métodos típicos para la purificación de L-aminoácidos son la cromatografía de intercambio de iones, la cristalización, procedimientos de extracción y el tratamiento con carbón activado. Con ello se obtienen L-aminoácidos ampliamente puros con un contenido de ≥ 90% en peso, ≥ 95% en peso, ≥ 96% en peso, ≥ 97% en peso, ≥ 98% en peso o ≥ 99% en peso.

También es posible, en otra variante del procedimiento, preparar un producto a partir del caldo de fermentación producido, separando la biomasa de la bacteria contenida en el caldo de fermentación por completo (100%) o casi por completo, es decir, más de o mayor que (>) 90%, > 95%, > 97%, > 99% y dejando en el producto los componentes restantes del caldo de fermentación en gran parte, es decir en 30% -100%, 40% -100%, 50% -100%, 60% -100%, 70% -100%, 80% -100% o 90% -100%, preferiblemente mayor que igual a (≥) 50%, ≥ 60%, ≥ 70%, ≥ 80%, ≥ 90% o ≥ 95%, o también por completo (100%).

Para la eliminación o separación de la biomasa se emplean métodos de separación tales como, por ejemplo, centrifugación, filtración, decantación, floculación o una combinación de éstos.

El caldo obtenido se espesa o bien se concentra a continuación por métodos conocidos tales como con ayuda de un evaporador rotatorio, evaporador de capa delgada, evaporador de película descendente, por ósmosis inversa, a través de nanofiltración o una combinación de los mismos.

Este caldo concentrado se elabora a continuación por métodos de liofilización, secado por pulverización, granulación por pulverización o por otros procedimientos para dar un polvo finamente dividido, capaz de fluir. Este polvo finamente dividido, capaz de fluir puede entonces transformarse de nuevo, por procedimientos de compactación o granulación adecuados, en un producto de grano grueso, que fluye bien, almacenable y ampliamente libre de polvo fino. El agua es separada con ello en total en más de 90%, de modo que el contenido de agua en el producto es menor que 10% en peso, menor que 5% en peso, menor que 4% en peso o menor que 3% en peso.

El análisis de los L-aminoácidos para la determinación de la concentración en uno o varios instantes puede tener lugar en el transcurso de la fermentación o en los diferentes productos mediante separación de los L-aminoácidos por medio de cromatografía de intercambio de aniones, preferiblemente cromatografía de intercambio de cationes, con subsiguiente derivatización en columna posterior utilizando ninhidrina tal como se describe por Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)). En lugar de ninhidrina puede utilizarse también orto-ftadialdehído para la derivatización en columna posterior. Un artículo resumido para la cromatografía de intercambio de iones se encuentra en Fickering (LC+GC (Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989)).

Asimismo, es posible realizar una derivatización en antecolumna, por ejemplo utilizando orto-ftadialdehído o fenilisotiocianato y separar los derivados de aminoácidos resultantes mediante cromatografía de fase inversa (RP), preferiblemente en forma de la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). Un método de este tipo se describe, por

5 ejemplo, por Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).

La detección tiene lugar fotométricamente (absorción, fluorescencia).

Una exposición recopilatoria respecto al análisis de aminoácidos se encuentra, entre otros, en el libro de texto 10 “Bioanalytik” de Lottspeich y Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1998).

La presente invención se explica con mayor detalle en lo que sigue con ayuda de ejemplos de realización.

Los medios mínimos (M9) y completos (LB) utilizados para Escherichia coli se describen por J. H. Miller (A Short Course

15 in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press). El aislamiento del ADN del plásmido a partir de Escherichia coli, así como todas las técnicas para la restricción, ligamiento, tratamiento con Klenov y fosfatasa alcalina se llevan a cabo según Sambrook et al. (Molecular Cloning – A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). La transformación de Escherichia coli se lleva a cabo, si no se describe de otro modo, según Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, USA (1989) 86: 2172-2175).

20 La temperatura de incubación en la producción de cepas y transformantes es, si no se describe de otro modo, 37ºC.

Ejemplo 1

25 Construcción del intercambio de aminoácido (G428D) en el gen glpK

Partes de las regiones de genes situadas aguas arriba y aguas abajo de las posiciones 1282-1284 de la secuencia codificadora del gen glpK, correspondientes a la posición de aminoácido 428, y una parte de la región 3’ del gen glpK se amplificaron a partir de Escherichia coli K12 utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de “gene 30 SOEing” (Gene Splicing by Overlap Extension (corte y empalme del gen por extensión y solapamiento), Horton, Molecular Biotechnology 3: 93-98 (1995)), así como oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de nucleótidos del gen glpK y de las secuencias situadas aguas abajo en E. coli K12 MG1655 (SEQ ID No. 7, Número de Acceso U00096 (región: 3557870-3558628)), se sintetizaron cebadores de PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania). Los cebadores posibilitan la amplificación de un segmento de ADN de aprox. 1,5 kb de longitud que porta la mutación

35 glpK(G427D). Las secuencias de los cebadores glpK_4_SOEing y glpk_5_SOEing se modificaron de manera que se suprime un lugar de reconocimiento para HaeII y, en su lugar, se forma un lugar de reconocimiento para la enzima de restricción BspE1, sin modificar la secuencia de aminoácidos de la proteína en esta zona de la secuencia (en la secuencia de nucleótidos representada a continuación marcada mediante subrayado):

40 glpK_3: 5’ -CGATTACACCAACGCCTCTC -3’ (SEQ ID No. 9)

glpK_6: 5’ -GCCCGACAATCAGCTTCTCC -3’ (SEQ ID No. 12)

45 Los cebadores glpK_4_SOEing y glpk_5_SOEing son inversamente complementarios entre sí a lo largo de 27 nucleótidos, y en esta zona portan la mutación GC → AT, que determina el intercambio de aminoácido G428D.

El ADN cromosómico de E. coli K12 MG1655, empleado para la PCR, se aisló según los datos del fabricante con

50 “Qiagen Genomic-tips 100/G” (QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de ADN 759 pb de tamaño procedente de la zona 5’ de la mutación glpK (designado glpK1, producto de la PCR de los cebadores glpK_3 y glpK_4_SOEing) y un fragmento de ADN de 745 pb de tamaño procedente de la zona 3’ de la mutación glpK (incluidas las secuencias situadas aguas abajo, designado glpK2, producto de la PCR de los cebadores glpK_6 y glpK_5_SOEing) puede ser amplificado con los cebadores específicos bajo condiciones de PCR estándares (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A

55 Guide to Methods and Applications, Academic Press) con la ADN polimerasa de fusion de alta fidelidad (New England Biolabs, Frankfurt, Alemania). Los dos productos de la PCR, glpK1 y glpK2, se purificaron según métodos habituales

después de un control en gel de agarosa al 0,8% (kit High Pure PCR Product Purification, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y luego se emplearon juntos como moldes en otra PCR utilizando los cebadores glpK_3 y glpK_6. De este modo se obtiene una casete de mutación de glpK de 1477 pares de bases que comprende el extremo 3’ del gen glpK con la mutación, así como la zona limítrofe procedente de la región situada aguas abajo del gen glpK y

5 presenta la secuencia representada en SEQ ID No. 13.

El alelo glpK descrito se aisló después de la separación en gel de agarosa al 0,8% (kit QIAGEN QIAquick Gel Extraction, Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y se ligó con el vector pCR-BluntII-TOPO según los datos del fabricante (TOPO Cloning Kit Manual, Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania).

10 La tanda de ligamiento se transformó en células TOP10 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania), y células portadoras de plásmidos se seleccionaron en agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª ed., Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989), que está mezclado con 25 μg/ml de canamicina, a 37ºC.

15 La clonación eficaz se detectó después del aislamiento del ADN del plásmido (kit QIAprep Spin Miniprep, Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) mediante disociación con la enzima HaeII. El vector resultante se denominó pCRBluntIIglpK(G428D) y se examinó mediante secuenciación (AGOWA GmbH, Berlín, Alemania).

Después, el vector pCRBluntII-glpK(G428D) se disoció con las endonucleasas de restricción XbaI y SpeI, se separó

20 mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%, y el fragmento glpK(G428D) de aprox. 1,57 kb de tamaño se aisló del gel, se purificó con los métodos habituales (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden) y se ligó con el plásmido pKO3 (Link et al., Journal of Bacteriology 179: 6228-6237 (1997)), que ha sido digerido asimismo con la enzima XbaI y ha sido tratado con fosfatasa alcalina (Alkaline Phosphatase, Boehringer, Mannheim, Alemania), mediante T4 ADN ligasa Ready To-Go (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania).

25 La tanda de ligamiento se transformó en DH5α (Grant et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649) (Hanahan, En. DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) y se seleccionaron a 30ºC células portadoras de plásmido en agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) que está mezclada con 20 μg/ml de cloranfenicol.

30 La clonación eficaz se detectó después del aislamiento del ADN del plásmido (kit QIAprep Spin Miniprep, Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y disociación con la enzima AvaII y AlwNI. El vector de intercambio pKO3-glpK(G428D) resultante está representado en la Figura 1.

35 Ejemplo 2 Construcción del intercambio de aminoácido (G231D) en el gen glpK

Regiones de genes situadas aguas arriba y aguas abajo de las posiciones 691-693 de la secuencia codificadora del gen glpK, correspondientes a la posición de aminoácido 231 se amplificaron a partir de Escherichia coli K12 utilizando la

40 reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de “gene SOEing” (Gene Splicing by Overlap Extension (corte y empalme del gen por extensión y solapamiento), Horton, Molecular Biotechnology 3: 93-98 (1995)), así como oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de nucleótidos del gen glpK en E. coli K12 MG1655 (SEQ ID No. 7, Número de Acceso U00096 (región: 3557870-3558628)), se sintetizaron cebadores de PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania). Los cebadores posibilitan la amplificación de un segmento de ADN de aprox. 1,55 kb de longitud que porta el gen o

45 bien alelo glpK(G231D). Las secuencias de los cebadores glpK_7_SOEing y glpk_8_SOEing se modificaron de manera que se suprime un lugar de reconocimiento para MluI y, en su lugar, se forma un lugar de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI, sin modificar la secuencia de aminoácidos de la proteína en esta zona de la secuencia (en la secuencia de nucleótidos representada a continuación marcada mediante subrayado):

50 glpK_1 5’ -CGGTCGAC ATGACTACGG GACAATTAAAC -3’ (SEQ ID No. 14)

55 glpFK_2 5’ -CGGTCGAC TTATTCGTCG TGTTCTTCCC -3’ (SEQ ID No. 17) 5

Los cebadores glpK_7_SOEing y glpk_8_SOEing son inversamente complementarios entre sí a lo largo de 29 nucleótidos, y en esta zona portan la mutación GC → AT, que determina el intercambio de aminoácido G231D.

El ADN cromosómico de E. coli K12 MG1655, empleado para la PCR, se aisló según los datos del fabricante con “Qiagen Genomic-tips 100/G” (QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de ADN 744 pb de tamaño procedente de la zona 5’ de la mutación glpK (designado glpK5, producto de la PCR de los cebadores glpK_1 y glpK_7_SOEing) y un fragmento de ADN de 827 pb de tamaño procedente de la zona 3’ de la mutación glpK (designado glpK6, producto de la PCR de los cebadores glpFK_2 y glpK_8_SOEing) puede ser amplificado con los cebadores específicos bajo condiciones de PCR estándares (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con la ADN polimerasa de fusion de alta fidelidad (New England Biolabs, Frankfurt, Alemania). Los dos productos de la PCR, glpK5 y glpK6, se purificaron según métodos habituales después de un control en gel de agarosa al 0,8% (kit High Pure PCR Product Purification, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y luego se emplearon juntos como moldes en otra PCR utilizando los cebadores glpK_1 y glpFK_2. De este modo se obtiene una casete de mutación de glpK de 1546 pares de bases que comprende el gen glpK con la mutación G231D y presenta la secuencia representada en SEQ ID No. 18.

La tanda de ligamiento se transformó en células TOP10 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania), y células portadoras de plásmidos se seleccionaron en agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratoy Manual. 2ª ed., Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989), que está mezclado con 25 μg/ml de canamicina, a 37ºC.

La clonación eficaz se detectó después del aislamiento del ADN del plásmido (kit QIAprep Spin Miniprep, Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) mediante disociación con la enzima MluI. El vector resultante se denominó pCRBluntIIglpK(G231D) y se examinó mediante secuenciación (AGOWA GmbH, Berlín, Alemania).

Después, el vector pCRBluntII-glpK(G231D) se disoció con la endonucleasa de restricción SalI, se separó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%, y el fragmento glpK(G231D) de 1536 pb de tamaño se aisló del gel, se purificó con los métodos habituales (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden) y se ligó con el plásmido pKO3 (Link et al., Journal of Bacteriology 179: 6228-6237 (1997)), que ha sido digerido asimismo con la enzima SalI y ha sido tratado con fosfatasa alcalina (Alkaline Phosphatase, Boehringer, Mannheim, Alemania), mediante T4 ADN ligasa Ready To-Go (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania).

La tanda de ligamiento se transformó en DH5α (Grant et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649) (Hanahan, En. DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) y se seleccionaron a 30ºC células portadoras de plásmido en agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) que está mezclada con 20 μg/ml de cloranfenicol.

La clonación eficaz se detectó después del aislamiento del ADN del plásmido (kit QIAprep Spin Miniprep, Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y disociación con la enzima EcoRI y AvaII. El vector de intercambio pKO3-glpK(G231D) resultante está representado en la Figura 2.

Ejemplo 3

Mutagénesis específica del lugar del gen glpK en la cepa MG442 de E. coli

La cepa MG442 de E. coli productora de L-treonina está descrita en el documento de patente US-A-4.278.765 y está depositada en la Asamblea Nacional Rusa para Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia) como CMIM B1628 y en la Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares) (DSMZ, Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest como DSM 16574.

Para el intercambio del gen glpK cromosómico por las construcciones de mutación codificadoras de plásmidos, se transformó MG442 con los plásmidos pKO3-glpK(G428D) y pKO3-glpK(G231D). El intercambio de genes tiene lugar con el procedimiento de selección descrito por Link et al. (Journal of Bacteriology 179: 6228-6237 (1997)) y se verificó mediante métodos de PCR estándares (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con los siguientes cebadores de oligonucleótidos y subsiguiente restricción con BspE1 o bien SpeI:

Para glpK(G428D):

glpK_3: 5’ -CGATTACACCAACGCCTCTC -3’ (SEQ ID No. 9)

glpK_6: 5’ -GCCCGACAATCAGCTTCTCC -3’ (SEQ ID No. 12) Para glpK(G231D) :

Después de realizado el intercambio, en MG442 se presenta la forma representada en la SEQ ID No. 20 del alelo glpK(G428D) o bien la forma representada en la SEQ ID No. 19 del alelo glpK(G231D) (secuenciación por parte de 10 AGOWA GmbH, Berlín, Alemania). Las cepas obtenidas se designan MG442glpK(G428D) o bien MG442glpK(G231D).

Ejemplo 4

Preparación de L-treonina con las cepas MG442glpK(G428D) y MG442glpK(G231D)

15 Las cepas MG442glpK(G428D) y MG442glpK(G231D) y MG442 se multiplicaron en medio mínimo con la siguiente composición: 3,5 g/l de Na2HPO4* 2H2O, 1,5 g/l de KH2PO4, 1 g/l de NH4Cl, 0,1 g/l de MgSO4* 7H2O, 2 g/l de glucosa, 20 g/l de agar. La formación de L-treonina se examinó en cultivos por lotes de 10 ml que están contenidos en matraces Erlenmeyer de 100 ml. Para ello, se inoculan 10 ml de medio de precultivo de la siguiente composición: 2 g/l de extracto

20 de levadura, 10 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de MgSO4* 7H2O, 15 g/l de CaCO3, 20 g/l de glicerol y se incuban durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en una incubadora ESR de la razón social Kühner AG (Birsfelden, Suiza). 250 μl de este precultivo se sobreinoculan en 10 ml de medio de producción (25 g/l de (NH4)2SO4, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4* 7H2O, 0,03 g/l FeSO4* 7H2O, 0,018 g/l de MnSO4* 1H2O, 30 g/l de CaCO3, 20 g/l de glicerol) y se incuban durante 48 horas a 37ºC. Después de la incubación, se determina la densidad óptica (DO) de la suspensión de

25 cultivo con un fotómetro LP2W de la razón social Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) a una longitud de onda de medición de 660 nm.

A continuación, se determinó la concentración de L-treonina formada en el sobrenadante del cultivo filtrado en condiciones estériles con un analizador de aminoácidos de la razón social Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Alemania) 30 mediante cromatografía de intercambio de iones y reacción en columna posterior con detección de ninhidrina.

En la Tabla 1 se representa el resultado del ensayo.

Tabla 1 35

Cepa: DO (660 nm) L-treonina g/l

MG442: 6,0 1,8

MG442glpK(G428D): 5,9 2,8

MG442glpK(G231D): 6,3 2,7

Ejemplo 5

40 Mutagénesis específica del lugar del gen glpK en la cepa DM1831/pMU91 de E. coli

La cepa DM1831/pMU91 de E. coli productora de L-triptófano es un derivado trpS* obtenible mediante transducción P1 de la cepa JP6015/pMU91 de Escherichia coli K-12 descrita en el documento de patente US-A-5.756.345. pMU91 es un plásmido derivado de pSC101 (Cohen et al., Journal of Bacteriology 132: 734-737 (1977)) que porta TetR,

45 trpE476DCBA y serA+. JP6015/pMU91 está depositada como DSM 10123 en la Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares) (DSMZ, Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest.

Después de la multiplicación en medio LB exento de antibióticos durante aproximadamente seis generaciones se aisló

50 un derivado de la cepa DM1831/pMU91 que ya no porta el plásmido pMU91. La cepa obtenida es sensible a tetraciclina y se designa DM1831.

Para el intercambio del gen glpK cromosómico por las construcciones de mutación codificadoras de plásmidos, se transformó DM1831 con los plásmidos pKO3-glpK(G428D) y pKO3-glpK(G231D). El intercambio de genes tiene lugar 55 con el procedimiento de selección descrito por Link et al. (Journal of Bacteriology 179: 6228-6237 (1997)) y se verificó mediante métodos de PCR estándares (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications,

Academic Press) con los siguientes cebadores de oligonucleótidos y subsiguiente restricción con BspE1 o bien SpeI: Para glpK(G428D):

5 glpK_3: 5’ -CGATTACACCAACGCCTCTC -3’ (SEQ ID No. 9) glpK_6: 5’ -GCCCGACAATCAGCTTCTCC -3’ (SEQ ID No. 12) Para glpK(G231D) :

15 Después de realizado el intercambio, en DM1831 se presenta la forma representada en la SEQ ID No. 20 del alelo glpK(G428D) o bien la forma representada en la SEQ ID No. 19 del alelo glpK(G231D) (secuenciación por parte de AGOWA GmbH, Berlín, Alemania). Las cepas obtenidas se designan DM1831glpK(G428D) o bien DM1831glpK(G231D).

20 El plásmido pMU91 descrito en el documento de patente US-A-5.756.345, que porta las informaciones genéticas para la producción de triptófano, se aisló de la cepa JP6015/pMU91. El plásmido está representado en la Figura 3. Las cepas DM1831glpk(G428D) y DM1831glpk(G231D) se transformaron con este plásmido. En cada caso uno de los transformantes obtenidos se designa DM1831glpk(G428D) / pMU91 o bien DM1831glpk(G231D) / pMU91.

25 Ejemplo 6

Preparación de L-triptófano con las cepas DM1831glpK(G428D) / pMU91 y DM1831glpK(G231D) / pMU91

Las cepas DM1831glpK(G428D) / pMU91, DM1831glpK(G231D) / pMU91 y DM1831 / pMU91 se continuaron

30 multiplicando en medio LB con la siguiente composición: 10 g/l de Bacto-triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl (ajuste del pH a 7,5 con NaOH), 2 g/l de glucosa, 20 g/l de agar y 5 mg/l de tetraciclina a 30ºC. La formación de Ltriptófano se examinó en cultivos por lotes de 10 ml que están contenidos en matraces Erlenmeyer de 100 ml. Para ello, se inoculan 10 ml de medio de cultivo previo de la siguiente composición: 1 g/l de extracto de levadura, 100 ml/l de tampón MOPS (10x), 10 g/l de glicerol y 5 mg/l de tetraciclina y se incuban durante 16 horas a 30ºC y 150 rpm en un

35 incubadora ESR de la razón social Kühner AG (Birsfelden, Suiza).

Tampón 10x MOPS se prepara a partir de las disoluciones A y B de manera correspondiente a las Tablas 2 a 4, dos volúmenes de disolución A se añaden en condiciones estériles a tres volúmenes de la disolución B.

Tabla 2: Disolución A para tampón 10xMOPS (filtrada en condiciones estériles)

Componente: Concentración

MOPS (ácido morfolinopropanosulfónico): 419 g/L

KOH (sólido): Para el ajuste del valor del pH a 7,4

Tabla 3: Disolución B para tampón 10xMOPS. Esterilizada mediante autoclave (30 minutos, 121ºC)

Componente: Concentración

Citrato de Na3 x 2H2O: 2,35 g/l

FeSO4 x 7 H2O: 0,22 g/l

NH4Cl: 32,0 g/l

MgSO4 x 7 H2O: 6,7 g/l

KCl: 4,0 g/l

CaCl2 x 2 H2O: 0,25 mg/l

Oligoelementos de la solución madre (Tabla 4): 3,33 ml/l

Tabla 4: Solución madre de los oligoelementos (en agua desmineralizada) para tampón 10xMOPS.

Componente: Concentración

(NH4)6Mo7O24 x 4H2O: 3,7 mg/l

H3BO3: 24,0 mg/l

CoCl2 x 6 H2O: 7,1 mg/l

ZnSO4 x 7 H2O: 28,7 mg/l

MnCl2 x 4H2O: 15,8 mg/l

CuSO4 x 5 H2O: 2,5 mg/l

10 En cada caso 250 μl de este precultivo se sobreinoculan en 10 ml de medio de producción PM1 de manera correspondiente a la Tabla 5 y se incuban durante 72 horas a 30ºC y 150 rpm. Después de la incubación se determina la densidad óptica (DO) de la suspensión del cultivo con un fotómetro LP2W de la razón social Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) a una longitud de onda de medición de 660 nm.

15 Tabla 5: Medio PM1: para ensayos de producción en matraces Erlenmeyer de 100 ml

Componente: Concentración

Tampón 10xMOPS: 100 ml/l

Tiamina HCl (0,01%): 1,0 ml/l

KH2PO4 (15 mM): 10 ml/l

Glicerol: 10 g/l

Tetraciclina: 5 mg/l

A continuación se determinó la concentración de L-triptófano formado en el material sobrenadante del cultivo, filtrado en 20 condiciones estériles mediante HPLC de fase inversa, tal como se describe por Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

En la Tabla 6 está representado el resultado del ensayo.

25 Tabla 6

Cepa: DO (660 nm) L-triptófano g/l

DMpMU91: 1,5 0,85

DM1831glpK(G428D) / pMU91: 1,6 1,2

DM1831glpK(G231D) / pMU91: 1,7 1,0

Ejemplo 7

30 Construcción del plásmido de expresión pMW218glpK

El gen glpK de E. coli K12 se amplificó empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), así como oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de nucleótidos del gen glpK en E. coli K12 MG1655 (Número de Acceso U00096 (región: 4113737-4115245)) se sintetizaron cebadores de PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania).

Las secuencias de los cebadores se modificaron de manera que resultaban lugares de reconocimiento para enzimas de restricción. Para los dos cebadores se eligió la secuencia de reconocimiento para SalI que está marcada mediante subrayado en la secuencia de nucleótidos representada a continuación:

5 glpK_1 5’ -CGGTCGAC ATGACTACGG GACAATTAAAC -3’ (SEQ ID No. 14)

glpFK 2 5’ -CGGTCGAC TTATTCGTCG TGTTCTTCCC -3’ (SEQ ID No. 17)

10 “Qiagen Genomic-tips 100/G” (QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de ADN 1546 pb de tamaño pudo ser amplificado con los cebadores específicos bajo condiciones de PCR estándares (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con la polimerasa de fusion de alta fidelidad (New England Biolabs, Frankfurt, Alemania).

15 El producto de la PCR (la secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente corresponde a la SEQ ID No. 2) se disoció con la enzima de restricción SalI y se ligó con el vector pMW218 (Nippon Gene, Toyama, Japón), que asimismo había sido digerido con la enzima SalI. La cepa TOP10 de E. coli (Invitrogen, Groningen, Holanda) se transformó con la tanda de ligamiento, y se seleccionaron células portadoras de plásmido en agar LB que estaba mezclado con 50 μg/ml de canamicina. La clonación eficaz pudo detectarse después del aislamiento del ADN del plásmido mediante la

20 disociación control con las enzimas BamHI y SalI. El plásmido se designa pMW218glpK (Figura 4).

Ejemplo 8

Construcción del plásmido de expresión pMW219glpK(G428D)

25 El gen glpK de E. coli K12 se amplificó empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), así como oligonucleótidos sintéticos, de manera que porta la mutación glpK(G427D). Partiendo de la secuencia de nucleótidos del gen glpK en E. coli K12 MG1655 (Número de Acceso U00096 (región: 4113737-4115245)) se sintetizaron cebadores de PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania).

30 Las secuencias de los cebadores glpK_1 y glpFK_2 se modificaron de manera que resultaban lugares de reconocimiento para enzimas de restricción. Las secuencias de los cebadores glpK_4_SOEing y glpK_5_SOEing se modificaron de manera que se suprime un lugar de reconocimiento para HaeII y, en su lugar, se forma un lugar de reconocimiento para la enzima de restricción BspE1( marcada mediante subrayado en la secuencia de nucleótidos

35 representada a continuación):

glpK_1 5’ -CGGTCGAC ATGACTACGG GACAATTAAAC -3’ (SEQ ID No. 14)

glpFK_2 5’ -CGGTCGAC TTATTCGTCG TGTTCTTCCC -3’ (SEQ ID No. 17)

Los cebadores glpK_4_SOEing y glpK_5_SOEing son inversamente complementarios entre sí a lo largo de 27 45 nucleótidos, y en esta zona portan la mutación GC → AT, que determina el intercambio de aminoácido G428D.

“Qiagen Genomic-tips 100/G” (QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de ADN 1333 pb de tamaño procedente de la

zona 5’ de la mutación glpK (designado glpK3, producto de la PCR de los cebadores glpK_1 y glpK_4_SOEing) y un 50 fragmento de ADN de 240 pb de tamaño procedente de la zona 3’ de la mutación glpK (designado glpK4, producto de

la PCR de los cebadores glpFK_2 y glpK_5_SOEing) puede ser amplificado con los cebadores específicos bajo

condiciones de PCR estándares (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic

Press) con la ADN polimerasa de fusion de alta fidelidad (New England Biolabs, Frankfurt, Alemania). Los dos

productos de la PCR, glpK3 y glpK4, se purificaron según métodos habituales después de un control en gel de agarosa 55 al 0,8% (kit High Pure PCR Product Purification, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y luego se

emplearon juntos como moldes en otra PCR utilizando los cebadores glpK_1 y glpFK_2. De este modo se obtiene un

alelo glpK de 1546 pares de bases.

El producto de la PCR (la secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente corresponde a la SEQ ID No. 20) se disoció con la enzima de restricción SalI y se ligó con el vector pMW219 (Nippon Gene, Toyama, Japón), que asimismo había sido digerido con la enzima SalI. La cepa TOP10 de E. coli (Invitrogen, Groningen, Holanda) se transformó con la tanda de ligamiento, y se seleccionaron células portadoras de plásmido en agar LB que está mezclado con 50 μg/ml de canamicina. La clonación eficaz pudo detectarse después del aislamiento del ADN del plásmido mediante la disociación control con las enzimas BamHI y SalI. El plásmido se designa pMW219glpK(G428D) (Figura 5).

Ejemplo 9

Construcción del plásmido de expresión pMW219glpK(G231D)

El fragmento glpK(G231D) de aprox. 1,54 kb de tamaño, cortado con SalI (la secuencia se representa en la SEQ ID No. 18, la secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente en la SEQ ID No. 19) del Ejemplo 2 se ligó con el vector pMW219 (Nippon Gene, Toyama, Japón) que asimismo ha sido digerida con la enzima SalI. La cepa TOP10 de

E. coli (Invitrogen, Groningen, Holanda) se transformó con la tanda de ligamiento y se seleccionaron células portadoras de plásmidos en agar LB que está mezclado 50 μg/ml de canamicina. La clonación eficaz pudo detectarse después del aislamiento del ADN del plásmido mediante la disociación control con las enzimas BamHI y SalI. El plásmido se designa pMW219glpK(G231D) (Figura 6).

Ejemplo 10

Preparación de L-treonina con las cepas MG442/pMW218glpK, MG442/pMW219glpK(G428D) y MG442/pMW219glpK(G231D)

La cepa MG442 se transformó con los plásmidos de expresión pMW218glpK, pMW219glpK(G428D), pMW219glpK(G231D) descritos en los Ejemplos 7, 8 y 9, y con los vectores pMW218 y pMW219 (se diferencian únicamente en la orientación del sitio de clonación múltiple) y se seleccionaron en agar LB con 50 μg/ml de canamicina en células portadoras de plásmidos. La transformación eficaz pudo detectarse después del aislamiento del ADN del plásmido mediante la disociación control con las enzimas BamHI y SalI. De esta manera resultan las cepas MG442/pMW218glpK, MG442/pMW219glpK(G428D), MG442/pMW219glpK(G231D), MG442/pMW219 y MG442/pMW218. Colonias individuales elegidas se continuaron multiplicando a continuación en medio mínimo con la siguiente composición: 3,5 g/l de Na2HPO4* 2H2O, 1,5 g/l de KH2PO4, 1 g/l de NH4Cl, 0,1 g/l de MgSO4* 7H2O, 2 g/l de glucosa, 20 g/l de agar y 50 mg/l de canamicina. La formación de L-treonina se determinó tal como se describe en el Ejemplo 4.

En la Tabla 7 se representa el resultado del ensayo. Tabla 7

Cepa: DO (660 nm) L-treonina g/l

MG442 / pMW218: 6,0 1,8

MG442 / pMW219: 5,9 1,8

MG442 / pMW218glpK: 4,6 2,0

MG442 / pMW219glpK(G428D): 5,8 3,1

MG442 / pMW219glpK(G231D): 6,1 2,8

Ejemplo 11

Preparación de L-triptófano con las cepas DM1831/pMU91/pMW218glpK, DM1831/pMU91/pMW219glpK(G428D) y DM1831/pMU91/pMW219glpK(G231D)

La cepa DM1831/pMU91se transformó con los plásmidos de expresión pMW218glpK, pMW219glpK(G428D), pMW219glpK(G231D) descritos en los Ejemplos 7, 8 y 9, y con los vectores pMW218 y pMW219 (se diferencian únicamente en la orientación del sitio de clonación múltiple) y se seleccionaron en agar LB con 50 μg/ml de canamicina en células portadoras de plásmidos. La transformación eficaz pudo detectarse después del aislamiento del ADN del plásmido mediante la disociación control con la enzima HindIII. De esta manera resultan las cepas DM1831/pMU91/pMW218glpK, DM1831/pMU91/pMW219glpK(G428D), DM1831/pMU91/pMW219glpK(G231D), DM1831/pMU91/pMW218 y DM1831/pMU91/pMW219. Colonias individuales elegidas se continuaron multiplicando a continuación en medio LB con la siguiente composición: 10 g/l de Bacto-triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl (ajuste del pH a 7,5 con NaOH), 2 g/l de glucosa, 20 g/l de agar, 5 mg/l de tetraciclina y 50 mg/l de canamicina a 30ºC. La formación de L-triptófano se determinó tal como se describe en el Ejemplo 6.

En la Tabla 8 se representa el resultado del ensayo. Tabla 8

Cepa: DO (660 nm) L-treonina g/l

DM1831 / pMU91 / pMW218: 1,2 0,7

DM1831 / pMU91 / pMW219: 1,1 0,7

DM1831 / pMU91 / pMW218glpK: 1,1 0,9

DM1831 / pMU91 / pMW219glpK (G428D): 1,0 1,1

DM1831 / pMU91 / pMW219glpK (G231D): 1,3 1,1

5 Breve descripción de las figuras:

● Figura 1: mapa del plásmido pKO3-glpK(G428D)

● Figura 2: mapa del plásmido pKO3-glpK(G231D) 10 ● Figura 3: mapa del plásmido pMU91

●: Figura 4: mapa del plásmido pMW218glpK que contiene el gen glpK

●: Figura 5: mapa del plásmido pMW219glpK(G428D) que contiene el gen glpK

●: Figura 6: mapa del plásmido pMW219glpK(G231D) que contiene el gen glpK

15 Los datos de longitud están recogidos como datos aproximados. Las abreviaturas y denominaciones utilizadas tienen el siguiente significado:

●: cat: gen de resistencia a cloranfenicol

●: M13 ori: origen de replicación

●: rep-ts: región de replicación sensible a la temperatura del plásmido pSC101 20 ● glpK1: parte de la región 5’ del gen glpK

●: glpK2: parte de la región 3’ del gen glpK y de la región situada aguas abajo

●: sacB: gen sacB

●: pSC101: fragmento de plásmido pSC101

●: serA: región codificadora del gen serA que codifica la D-3-fosfoglicerato-deshidrogenasa 25 ● trpE476DCBA: parte del operón de triptófano trpLEDCBA con alelo trpE476

●: tetA: gen de resistencia a tetraciclina

●: kan: gen que codifica la resistencia a canamicina

●: glpK: región codificadora del gen glpK

●: lacZ’: fragmento de gen que codifica el péptido α de la β-galactosidasa

30 Las abreviaturas de las enzimas de restricción tienen el siguiente significado

● HindIII: endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae

●: AvaII: endonucleasa de restricción de Anabaena variabilis 35 ● AlwNI: endonucleasa de restricción de Acinetobacter lwoffii

●: BspE1: endonucleasa de restricción de una especie de Bacillus

●: SalI: endonucleasa de restricción de Streptomyces albus

●: XhoI: endonucleasa de restricción de Xanthomonas holcicola

●: BamHI: endonucleasa de restricción de Bacillus amyloliquefaciens H 40 ● HaeII: endonucleasa de restricción de Haemophilus aegyptius

●: SpeI: endonucleasa de restricción de una especie de Sphaerotilus

●: MluI: endonucleasa de restricción de Micrococcus luteus

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Evonik Degussa GmbH

5 <120> Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos utilizando cepas mejoradas de la familia Enterobacteriaceae

<130> 2007P00111

10 <160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 15 <211> 1509

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220> 20 <221> CDS

<222> (1) ….. (1509)

<223> región codificadora de glpK

<210>: 2

<211>: 502

<212>: PRT

5: <213> Escherichia coli

5: <210> <211> <212> <213> 3 1509 ADN Salmonella typhimurium

10: <220> <221> <222> <223> CDS (1) ….. (1509) región codificadora de glpK

<210>: 4

<211>: 502

<212>: PRT

5: <213> Salmonella typhimurium

5: <210> <211> <212> <213> 5 1509 ADN Shigella flexneri

<210>: 6

<211>: 502

<212>: PRT

5: <213> Shigella flexneri

5: <210> <211> <212> <213> 7 2150 ADN Escherichia coli

10: <220> <221> <222> <223> CDS (109) ….. (1617) región codificadora de glpK

<210>: 8

<211>: 502

<212>: PRT

5: <213> Escherichia coli

5: <210> <211> <212> <213> 9 20 ADN Escherichia coli

10: <220> <221> <222> <223> cebador (1) ….. (20) glpK_3

<210>: 10

<211>: 40

15: <212> ADN

<213>: secuencia artificial

<220>

<223>: cebador “gene-SOEing”

20

<220>

<221>: cebador

<222>: (1) ….. (40)

<223>: glpK_4_SOEing

25

30: <210> 11

<211>: 40

<212>: ADN

<213>: secuencia artificial

<220> <223>: cebador “gene-SOEing”

5: <220> <221> <222> <223> cebador (1) ….. (40) glpK_5_SOEing

<210>: 12

<211>: 20

<212>: ADN

<213>: Escherichia coli

15

<220>

<221>: cebador

<222>: (1) ….. (20)

<223>: glpK_6

20

25: <210> <211> <212> <213> 13 1477 ADN Escherichia coli

30: <220> <221> <222> <223> mutación (738) ….. (739) transiciones gc → at

5: <210> <211> <212> <213> 14 29 ADN secuencia artificial

<220> <223>: cebador con sitio de reconocimiento de sales

10: <220> <221> <222> <223> cebador (1) ….. (29) glpK_1

20: <210> <211> <212> <213> 15 40 ADN secuencia artificial

<220> <223>: cebador “gene-SOEing”

25: <220> <221> <222> <223> cebador (1) ….. (40) glpK_7_SOEing

<210>: 16

<211>: 40

<212>: ADN

<213>: secuencia artificial

35

<220>

<223>: cebador “gene-SOEing”

40

<220>

<221>: cebador

<222> (1) ….. (40)

<223> glpK_8_SOEing

5: <210> <211> <212> <213> 17 28 ADN secuencia artificial

10: <220> <223> cebador con sitio de reconocimiento de sales

15: <220> <221> <222> <223> cebador (1) ….. (28) glpFK_2

20: <210> <211> <212> <213> 18 1546 ADN Escherichia coli

25: <220> <221> <222> <223> CDS (30) … (1538) región codificadora de glpK

30: <220> <221> <222> <223> mutación (721) ….. (722) transiciones gc → at

<210>: 19

<211>: 502

<212>: PRT

5: <213> Escherichia coli

<210>: 20

<211>: 502

<212>: PRT

5: <213> Escherichia coli

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos, caracterizado por que se llevan a cabo las siguientes etapas:

1.1 fermentación de microorganismos recombinantes secretores de L-aminoácidos de la familia

5 Enterobacteriaceae o de las bacterias corineformes que contienen un gen glpK que codifica un polipéptido con actividad de glicerol quinasa (ATP-dependiente), cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 95% idéntica a la de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6, en donde el polipéptido posee una longitud de 502 aminoácidos, conteniendo el polipéptido en la posición 428 cualquier aminoácido proteinogénico, exceptuada glicina, en un medio a una temperatura deseada, empleándose como

10 fuente de carbono, en esencia, glicerol o, en esencia, glicerol y uno o más de los azúcares seleccionados del grupo de glucosa, sacarosa y fructosa, y

1.2 acumulación en el caldo de fermentación del L-aminoácido producido.

15 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que el aminoácido proteinogénico en la posición 428 es ácido L-glutámico, ácido L-aspártico, L-isoleucina, L-histidina, L-triptófano o L-fenilalanina.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que en el caso del aminoácido proteinogénico en la

posición 428 se trata de ácido L-aspártico. 20
4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el polipéptido codificado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO: 6, incluido el intercambio de aminoácidos mencionado en la posición 428, teniendo la secuencia de aminoácidos adicionalmente una o varias de las características elegidas del grupo uno o a lo sumo 10 intercambios de aminoácidos conservativos, una prolongación en

25 el extremo C de uno hasta a lo sumo 20 aminoácidos.
5. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que el polipéptido codificado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO: 6, incluido el intercambio de aminoácidos mencionado en la posición 428.
6.

Procedimiento según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado por que el polipéptido codificado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, incluido el intercambio de aminoácidos mencionado en la posición 428.
7.

Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que para la preparación de los L-aminoácidos se

35 fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriaceae, en los que adicionalmente se debilita al mismo tiempo el gen glpR que codifica el represor del regulón glp.
8. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que para la preparación de los L-aminoácidos se fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriaceae, en los que se refuerzan, en particular sobre-expresan, al

40 mismo tiempo uno o más de los genes seleccionados del grupo: a) el gen glpA que codifica la subunidad grande de la sn-glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa (anaerobia),

b) el gen glpB que codifica la subunidad para el anclaje a membrana de la sn-glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa (anaerobia), 45 c) el gen glpC que codifica la subunidad pequeña de la sn-glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa (anaerobia),

d) el gen glpD que codifica la glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa (aerobia),

50 e) el gen glpE que codifica la azufre-transferasa,

f) el gen glpF que codifica el facilitador del glicerol GlpF,

g) el gen glpG,

55 h) el gen glpQ que codifica la glicerolfosfodiesterasa periplasmática,

i) el gen glpT que codifica la glicerol-3-fosfato-permeasa,

60 j) el gen glpX que codifica la fructosa-1,6-bisfosfatasa II,

k) el gen tpiA que codifica la triosafosfato-isomerasa,

l) el gen gldA que codifica la glicerol-deshidrogenasa (NAD-dependiente), m) el gen dhaK que codifica el dominio N-terminal de la dihidroxiacetona-quinasa,

5 n) el gen dhaL que codifica el dominio C-terminal de la dihidroxiacetona-quinasa, o) el gen dhaM que codifica la subunidad de la proteína PTS de la dihidroxiacetona-quinasa, p) el gen dhaR que codifica el activador del operón dha,

10 q) el gen fsa que codifica la fructosa-6-fosfato aldolasa I, y r) el gen talC que codifica la fructosa-6-fosfato aldolasa II.

15 9. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que en el caso de los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae se trata de un microorganismo seleccionado de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia.
10. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que como fuente de carbono se emplea 20 esencialmente glicerol.
11. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que como fuente de carbono se emplea esencialmente glicerol y uno o varios de los azúcares seleccionados del grupo de glucosa, sacarosa y fructosa, ascendiendo la proporción de glicerol a al menos 10%.
12. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que se trata de un procedimiento por lotes, un procedimiento por lotes alimentados, un procedimiento por lotes alimentados repetidos o un procedimiento continuo.

30 13. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que se purifica y aísla el L-aminoácido deseado.
14. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por que se obtiene un producto con contenido en Laminoácidos, en el que los componentes del caldo de fermentación y/o la biomasa permanecen en el producto en su totalidad o en proporciones (> 0 a 100%) del mismo.

61 62