PL211169B1 - Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów, drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-aminokwas, plazmid, wyizolowany polinukleotyd, szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, szczepy Escherichia coli - Google Patents

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 362315 (22) Data zgłoszenia: 05.09.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

05.09.2001, PCT/EP01/010209 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

11.04.2002, WO02/29080 (11) 211169 (13) B1 (51) Int.Cl.

C12P 13/04 (2006.01)

C12N 1/21 (2006.01)

C12N 15/60 (2006.01)

C12P 13/08 (2006.01)

C12N 15/11 (2006.01)

C12N 15/31 (2006.01)

Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy

Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów, drobnoustroje z rodziny (54) Enterobacteriaceae wytwarzające L-aminokwas, plazmid, wyizolowany polinukleotyd, szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, szczepy Escherichia coli

(30) Pierwszeństwo: 30.09.2000, DE, 10048605.3	(73) Uprawniony z patentu:
DEGUSSA AG, Dϋsseldorf, DE
09.11.2000, DE, 10055516.0 22.06.2001, DE, 10130192.8	(72) Twórca(y) wynalazku:
	MECHTHILD RIEPING, Bielefeld, DE
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 18.10.2004 BUP 21/04	CHRISTINE BASTUCK, Bielefeld, DE THOMAS HERMANN, Bielefeld, DE GEORG THIERBACH, Bielefeld, DE
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:	(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska
30.04.2012 WUP 04/12

PL 211 169 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów, drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-aminokwas, plazmid, wyizolowany polinukleotyd, szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, szczepy Escherichia coli.

L-aminokwasy stosowane są do żywienia zwierząt, jako leki dla ludzi i w przemyśle farmaceutycznym.

Znane jest wytwarzanie L-aminokwasów w procesie fermentacyjnym z udziałem szczepów z rodziny Enterobacteriaceae, zwłaszcza Escherichia coli i Serratia marcescens. Z powodu wielkiego znaczenia tych procesów, stale czynione są wysiłki zmierzające do polepszenia sposobów wytwarzania. Udoskonalenia wspomnianych procesów mogą dotyczyć: sposobów związanych z technologią fermentacji, na przykład mieszania i dostarczania tlenu, albo składu pożywki odżywczej, na przykład stężenia cukrów podczas fermentacji, albo dalszej obróbki z otrzymaniem odpowiedniej postaci produktu, na przykład, za pomocą chromatografii jonowymiennej, albo wewnętrznej charakterystyki produktywności danego drobnoustroju.

Charakterystyki produktywności tych drobnoustrojów poprawia się przez zastosowanie metod mutaganezy, selekcji i wyboru mutanta, w wyniku czego otrzymuje się szczepy oporne na antymetabolity, na przykład, treoninowe analogi kwasu α-amino-e-hydroksywalerianowego (AHV) lub szczepy auksotroficzne dla metabolitów o znaczeniu regulującym, i produkujące L-aminokwasy, na przykład, L-treoninę.

Od pewnego czasu stosowane są także metody rekombinacji DNA w celu polepszenia właściwości szczepów z rodziny Enterobacteriaceae produkujących L-aminokwasy przez amplifikowanie poszczególnych genów biosyntezy aminokwasów i badanie wpływu na produkcję.

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów, w którym przeprowadza się następujące etapy:

a) fermentację z udziałem drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzających pożądany L-aminokwas, w których ekspresja genu pckA lub sekwencji nukleotydowych kodujących gen produktu pckA jest atenuowana przez mutacje wybrane z grupy obejmującej tranzycje, transwersje, insercje i delecje

b) wzbogacenie podłoża lub komórek bakterii w L-aminokwas, oraz

c) izolację L-aminokwasu, lub

d) składników brzeczki fermentacyjnej i biomasy izolowanych, w całości lub w części, jako produkt stały razem z L-aminokwasem.

Korzystnie w sposobie tym ekspresja polinukleotydu(ów) kodującego produktu genu pckA jest wyłączona.

Korzystnie prowadzi się fermentację z udziałem drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, u których jeden, lub więcej genów wybranych z grupy obejmującej:

a) operon thrABC kodujący kinazę asparaginianową, dehydrogenazę homoserynową, kinazę homoserynową i syntazę treoninową,

b) gen pyc kodujący karboksylazę pirogronianową,

c) gen pps kodujący syntazę fosfoenolopirogronianową,

d) gen rhtB oporności na homoserynę i

e) gen rhtC oporności na treoninę,

f) gen gdhA kodujący dehydrogenazę glutaminianową, jest równocześnie amplifikowanych i ulega nadekspresji.

Korzystnie też fermentację prowadzi się z udziałem drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, u których jeden, lub więcej genów wybranych z grupy obejmującej:

a) gen tdh kodujący dehydrogenazę treoninową,

b) gen produktu otwartej ramki odczytu (orf) yjfA, oraz

c) gen produktu otwartej ramki odczytu (orf) ytfP, jest atenuowanych.

Korzystnie sposobem według wynalazku wytwarza się L-izoleucynę, L-walinę, L-lizynę lub L-treoninę.

Zakres wynalazku obejmuje również drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-aminokwas, charakteryzujące się tym, że ekspresja genu pckA lub sekwencji nukleotydowych kodujących produkt genowy jest atenuowana przez mutacje wybrane z grupy obejmującej tranzycje, transwersje, insercje i delecje, a jeden lub więcej genów wybranych z grupy obejmującej:

PL 211 169 B1

a) gen rhtC oporności na treoninę

b) gen gdhA kodujący dehydrogenazę glutaminianową jest w nich jednocześnie nadwyrażanych, korzystnie przez zwiększanie liczby kopii genu.

Niniejszy wynalazek dotyczy również plazmidu pMAK705ΔpckA, zawartego w szczepie E. coli

MG442ΔpckA zdeponowanego pod numerem DSM 14 289.

Niniejszy wynalazek obejmuje również wyizolowany polinukleotyd pochodzący z drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, zawierający sekwencję polinukleotydową kodującą regiony 5' i 3' genu pckA, jak pokazano w SEK ID Nr 4, do zastosowania jako składnik plazmidów dla specyficznej względem miejsca mutagenezy genu pckA.

W zakres wynalazku wchodzą również szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, które zawierają mutację delecyjną w genie pckA, jak przedstawiono w SEK ID Nr. 4.

Korzystnie szczepy z rodziny Enterobacteriaceae dodatkowo zawierają mutację delecyjną w otwartej ramce odczytu ytfP, jak przedstawiono w SEK ID Nr 6 lub 7, lub w otwartej ramce odczytu yjfA, jak przedstawiono w SEK ID Nr. 6 lub 7.

Niniejszy wynalazek dotyczy również szczepu Escherichia coli K-12 MG442ΔpckA zdeponowanego w Deutsche Sammlung far Mikroorganismen und Zellkulturen pod numerem DSM 13761 oraz szczepu Escherichia coli K-12 B3996kur.\tdhpckA/PVIC40 zdeponowanego w Deutsche Sammlung far Mikroorganismen und Zellkulturen pod numerem DSM 14150.

Stosowane w dalszej części niniejszego opisu określenie „L-aminokwasy lub „aminokwasy oznacza jeden lub większą ilość aminokwasów, włącznie z ich solami, wybranych z grupy obejmującej L-asparaginę, L-treoninę, L-serynę, L-glutaminian, L-glicynę, L-alaninę, L-cysteinę, L-walinę, L-metioninę, L-izoleucynę, L-leucynę, L-tyrozynę, L-fenyloalaninę, L-histydynę, L-lizynę, L-tryptofan, L-homoserynę i L-argininę. Szczególnie korzystna jest L-treonina.

W tym kontekście, termin „atenuacja oznacza zmniejszenie lub wyłączenie, w drobnoustroju, wewnątrzkomórkowej aktywności jednego, lub więcej niż jednego enzymu (białka) kodowanego przez odpowiedni DNA, na przykład, przez użycie słabego promotora albo genu lub allelu, kodującego odpowiedni enzym o niskiej aktywności lub inaktywującego odpowiedni enzym (białko), oraz, ewentualnie, połączenie ze sobą tych sposobów.

Dzięki zastosowaniu atenuacji aktywność lub stężenie odpowiedniego białka ulega na ogół zmniejszeniu do poziomu w zakresie od 0 do 75%, od 0 do 50%, od 0 do 25%, od 0 do 10% lub od 0 do 5% aktywności lub stężenia białka typu dzikiego, albo aktywności lub stężenia białka obecnego w wyjściowym drobnoustroju.

Drobnoustroje według niniejszego wynalazku mogą wytwarzać L-aminokwasy z glukozy, sacharozy, laktozy, fruktozy, maltozy, melasy, ewentualnie ze skrobi lub, ewentualnie, z celulozy, albo z glicerolu i etanolu. Drobnoustroje te są reprezentatami rodziny Enterobacteriaceae wybranymi z rodzajów Escherichia, Erwinia, Providencia i Serratia. Korzystne są rodzaje Escherichia i Serratia. Spośród rodzajów Escherichia i Serratia wyróżnić można zwłaszcza gatunki, odpowiednio, Escherichia coli i Serratia marcescens.

Przykładami odpowiednich szczepów, szczególnie szczepów wytwarzających L-treoninę z rodzaju Escherichia, a zwłaszcza Escherichia coli, są:

Escherichia coli TF427

Escherichia coli H4578

Escherichia coli KY10935

Escherichia coli VNII genetika MG442

Escherichia coli VNII genetika M1

Escherichia coli VNII genetika 472T23

Escherichia coli BKIIM B-3996

Escherichia coli kat 13

Escherichia coli KCCM-10132.

Przykładami odpowiednich szczepów wytwarzających L-treoninę z rodzaju Serratia, zwłaszcza z gatunku Serratia marcescens są następujące szczepy:

Serratia marcescens HNr21

Serratia marcescens TLr156

Serratia marcescens T2000.

Korzystnie, szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę mają, między innymi, jedną lub więcej właściwości genotypowych lub fenotypowych wybranych z grupy obejmującej oporność

PL 211 169 B1 na kwas α-amino-e-hydroksywalerianowy, oporność na tializynę, oporność na etioninę, oporność na α-metyloserynę, oporność na kwas diaminobursztynowy, oporność na kwas α-aminomasłowy, oporność na borelidynę, oporność na ryfampicynę, oporność na analogi waliny, takie jak hydroksamian waliny, oporność na analogi puryny, takie jak 6-dimetyloaminopuryna, zapotrzebowanie na L-metioninę, ewentualnie częściowe i dające się skompensować zapotrzebowanie na L-izoleucynę, zapotrzebowanie na kwas mezodiaminopimelinowy, auksotrofię w odniesieniu do dipeptydów zawierających treoninę, oporność na L-treoninę, oporność na L-homoserynę, oporność na L-lizynę, oporność na L-metioninę, oporność na kwas L-glutaminowy, oporność na L-asparaginian, oporność na L-leucynę, oporność na L-fenyloalaninę, oporność na L-serynę, oporność na L-cysteinę, oporność na L-walinę, wrażliwość na fluoropirogronian, wadliwą dehydrogenazę treoninową, ewentualnie zdolność do wykorzystywania sacharozy, amplifikację operonu treoninowego, amplifikację dehydrogenazy homoserynowej kinazy asparaginianowej I, korzystnie w postaci opornej na mechanizm zwrotny, amplifikację kinazy homoserynowej, amplifikację syntazy treoninowej, amplifikację kinazy asparginianowej, ewentualnie w postaci opornej na mechanizm zwrotny amplifikację dehydrogenazy semialdehydu asparaginianowego, amplifikację karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, ewentualnie w postaci opornej na mechanizm zwrotny, amplifikację syntazy fosfoenolopirogronianowej, amplifikację transhydrogenazy, amplifikację produktu genu rhtB, amplifikację produktu genu rhtC, amplifikację produktu genu yfiK, amplifikację oksydoreduktazy jabłczanowo-chinonowej i amplifikację karboksylazy pirogronianowej oraz atenuację tworzenia się kwasu octowego.

Stwierdzono, że wytwarzanie L-aminokwasów, szczególnie L-treoniny, przez drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae polepsza atenuacja, a zwłaszcza, wyłączenie genu pckA kodującego karboksykinazę PEP (EC 4.1.1.49).

Sekwencję nukleotydową genu pckA Escherichia coli opublikowali Medina i in. [Journal of Bacteriology, 172, 7151 -7156 (1990)], a zaczerpnąć ją można także z sekwencji genomu Escherichia coli opublikowanej przez Blattnera i in. [Science, 277, 1453 - 1462 (1997)]. Sekwencję nukleotydową genu pckA Escherichia coli przedstawiono w SEK ID NR 1, a sekwencję aminokwasową odpowiedniego produktu genowego przedstawiono w SEK ID NR 2.

Geny pckA opisane we wspomnianych powyższych odnośnikach literaturowych można zastosować zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Możliwe jest także użycie alleli genu pckA, pochodzących z degeneracji kodu genetycznego lub z obojętnych mutacji nonsensownych (ang. neutral sense mutations).

Atenuację można osiągnąć, na przykład, przez zmniejszenie lub wyłączenie ekspresji genu pckA lub katalitycznych właściwości białka enzymatycznego. Można też połączyć oba te sposoby postępowania.

Ekspresję genu można zmniejszyć przez zastosowanie odpowiedniej techniki hodowli, przez modyfikację genetyczną (mutację) struktur sygnałowych ekspresji genu lub za pomocą technologii antysensownego RNA. Przykładami struktur sygnałowych ekspresji genu są: geny represorowe, geny aktywatorowe, operatory, promotory, atenuatory, miejsca wiązania rybosomu, kodon start i terminatory. Specjaliści w tej dziedzinie techniki znajdą odnośne informacje, między innymi, na przykład w: Jensen i Hammer [Biotechnology and Bioengineering, 58, 191 -195 (1998)], Carrier i Keasling [Biotechnology Progress, 15, 58-64 (1999)], Franch i Gerdes [Current Opinion in Microbiology, 3, 159 164 (2000)] i w dobrze znanych podręcznikach z dziedziny genetyki i biologii molekularnej, takich jak, na przykład, podręcznik Knippersa [„Molekulare Genetik („Molecular Genetics), wyd. VI, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Niemcy (1995)] lub podręcznik Winnackera [„Gene und Klone („From Genes to Clones), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Niemcy (1990)].

Z dotychczasowego stanu techniki znane są mutacje powodujące zmianę lub zmniejszenie katalitycznych właściwości białek enzymatycznych. Przykładowo, wymienić tu można badania, które przeprowadzili Qiu i Goodman [Journal of Biological Chemistry, 272, 8611 - 8617 (1997)], Yano i in. [Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 95, 5511 - 5515 (1998)] oraz Wente i Schachmann [Journal of Biological Chemistry, 266, 20833 - 20939 (1991)]. Przeglądy można znaleźć w dobrze znanych podręcznikach z dziedziny genetyki i biologii molekularnej, na przykład, w podręczniku Hagemanna [„Allgemeine Genetik („General Genetics), Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1986)].

Mutacjami branymi tu pod uwagę są: tranzycje, transwersje, insercje i delecje. W zależności od wpływu wymiany aminokwasu na aktywność enzymatyczną, stosowane są określenia: mutacje zmiany sensu (mutacje missens) lub mutacje nonsensowne. Insercje lub delecje co najmniej jednej pary zasad w genie powodują mutacje przesunięcia ramki odczytu (ang. frameshift mutations), w wyniku których wbudowane są fałszywe aminokwasy lub dochodzi do przedwczesnej terminacji translacji. DelePL 211 169 B1 cje kilku kodonów typowo prowadzą do całkowitej utraty aktywności enzymatycznej. Instrukcje dotyczące wytwarzania takich mutacji stanowią część stanu techniki i można je znaleźć w dobrze znanych podręcznikach z dziedziny genetyki i biologii molekularnej, na przykład, w podręczniku Knippersa [Molekulare Genetik (Molecular Genetics), wyd. VI, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Niemcy (1995)], w podręczniku Winnackera [„Gene und Klone („From Genes to Clones), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Niemcy (1990)] lub w podręczniku Hagemanna [„Allgemeine Genetik („General Genetics), Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1986)].

Przykładowym plazmidem, przy pomocy którego można atenuować a w szczególności wyłączyć, gen pckA na drodze mutagenezy specyficznej względem miejsca, jest plazmid pMAK705ΔpckA (Figura 1). Zawiera on tylko część regionu 5' i część regionu 3' genu pckA. Brakuje (delecja) odcinka regionu kodującego o 349 pz. Sekwencję tego DNA, którego można użyć do mutagenezy genu pckA przedstawiono w SEK ID NR. 3.

Mutację delecyjną genu pckA można włączyć do odpowiednich szczepów za pomocą wymiany genu lub allelu.

Zwykłą metodą jest w tym przypadku metoda wymiany genu z zastosowaniem warunkowo replikującej pochodnej pSC101, pMAK705, jak to opisali Hamilton i in. [Journal of Bacteriology, 174, 4617 - 4622 (1989)]. Można wykorzystać też inne metody opisane w stanie techniki, na przykład metodę, którą przedstawili Martinez-Morales i in. [Journal of Bacteriology, 7143-7148 (1999)] lub metodę Boyda i in. [Journal of Bacteriology, 182, 842 - 847 (2000)].

W przypadku przeprowadzania wymiany w szczepie będącym przedmiotem zainteresowania występuje forma allelu ΔpckA, przedstawiona w SEK ID NR. 4, stanowiąca dalszy przedmiot niniejszego wynalazku.

Mutacje w genie pckA lub mutacje obejmujące ekspresję genu pckA można przenosić do rozmaitych szczepów na drodze koniugacji lub transdukcji.

Ponadto, dla wytwarzania L-aminokwasów, szczególnie L-treoniny, z udziałem szczepów z rodziny Enterobacteriaceae, może być korzystna nie tylko atenuacja genu pckA, ale także zamplifikowanie jednego, lub więcej enzymów ze znanego biosyntetycznego szlaku treoniny lub enzymów metabolizmu anaplerotycznego, lub enzymów zaangażowanych w wytwarzanie zredukowanego fosforanu dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego. W tym kontekście, termin „amplifikacja oznacza zwiększenie aktywności wewnątrzkomórkowej (w drobnoustroju) jednego, lub większej ilości enzymów lub białek, kodowanych przez odpowiedni DNA, na przykład przez zwiększenie liczby kopii genu (genów), przy użyciu silnego promotora lub z zastosowaniem kodowania genu dla odpowiedniego enzymu lub białka o wysokiej aktywności, a także połączenie ze sobą tych sposobów.

Dzięki zastosowaniu metod amplifikacji, w szczególności nadekspresji, aktywność lub stężenie odpowiedniego białka ulega, na ogół, zwiększeniu o co najmniej 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% lub 500%, aż do, maksymalnie 1000% lub 2000%, w przeliczeniu na białko typu dzikiego, albo na aktywność lub stężenie białka w drobnoustroju wyjściowym.

Zatem, na przykład, można przeprowadzić jednoczesną amplifikację, i, w szczególności, nadekspresję, jednego, lub więcej genu wybranego z grupy obejmującej:

• operon thrABC kodujący kinazę asparaginianową, dehydrogenazę homoserynową, kinazę homoserynową i syntazę treoninową (US-A-4278765), • gen pyc kodujący karboksylazę pirogronianową (DE-A-19 831 609), • gen pps kodujący syntazę fosfoenolopirogronianową [Molecular and General Genetics, 231,

332 (1992)], • gen ppc kodujący karboksylazę fosfoenolopirogronianową [Gene, 31, 279 - 283 (1984)], • geny pntA i pntB kodujące transhydrogenazę [European Journal of Biochemistry, 158,

647 - 653 (1986)], • gen rhtB nadający oporność na homoserynę (EP-A-0994190) i • gen rhtC nadający odporność na treoninę (EP-A-1013765), • gen gdhA kodujący dehydrogenazę glutaminianową [Gene, 27, 193 - 199 (1984)].

Ponadto, dla produkcji L-aminokwasów, szczególnie L-treoniny, może być korzystna nie tylko atenuacja genu pckA, ale także atenuacja, a zwłaszcza wyłączenie, jednego, lub większej ilości genów wybranych z grupy obejmującej:

• gen tdh kodujący dehydrogenazę treoninową [Ravnikar i Somerville, Journal of Bacteriology,

169, 4716 - 4721 (1987)],

PL 211 169 B1 • gen produktu otwartej ramki odczytu (orf) yjfA [numer dostępu AAC77180 w National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) i SEK ID NR 5], i • gen produktu otwartej ramki odczytu (orf) ytfP [numer dostępu AAC77179 w National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) i SEK ID NR 5], albo zmniejszenie ich ekspresji.

Korzystne jest atenuowanie otwartej ramki odczytu yjfA i/lub otwartej ramki odczytu ytfP.

Przykładem plazmidu, przy pomocy którego można przeprowadzić atenuację, a zwłaszcza wyłączenie, otwartych ramek odczytu yjfA i ytfP z Escherichia coli na drodze mutagenezy specyficznej względem miejsca, jest plazmid pMAK705.\yjfA (Figura 2). Zawiera on tylko część sekwencji flankujących 5' i 3' regionu ytfP-yjfA, obejmując bardzo krótkie reszty otwartych ramek odczytu yjfA i ytfP. Brakuje, (delecja) części regionu ytfP-yjfA o długości 337 pz. Sekwencję tego DNA, którego można użyć do mutagenezy regionu ytfP-yjfA, przedstawiono w SEK ID NR 6.

Dalszym przykładem plazmidu, przy pomocy którego można atenuować, a w szczególności wyłączyć otwarte ramki odczytu yjfA i ytfP Escherichia coli na drodze mutagenezy specyficznej względem miejsca, jest plazmid ρΜΑΚ705Δ90όρ (Figura 5). Zawiera on również tylko część sekwencji flankujących 5' i 3' regionu ytfP-yjfA, obejmując bardzo krótkie reszty otwartych ramek odczytu yjfA i ytfP. Brakuje (delecja) części regionu ytfP-yjfA o długości 90 pz. Sekwencję tego DNA, którego można użyć do mutagenezy regionu ytfP-yjfA przedstawiono w SEK ID NR 7.

Tę mutację delecyjną można włączyć do odpowiednich szczepów za pomocą wymiany genu lub allelu. Możliwe jest także przeniesienie mutacji w otwartych ramkach odczytu yjfA i/lub ytfP, lub mutacji wywołujących ekspresję tych otwartych ramek odczytu do rozmaitych szczepów na drodze koniugacji lub transdukcji.

W przypadku przeprowadzenia zastąpienia, w omawianym szczepie występuje postać alleli .\ytfP i ΔyjfA przedstawionych w SEK ID NR 6 lub SEK ID NR7, stanowiących dalszy przedmiot niniejszego wynalazku.

Ponadto, dla wytwarzania L-aminokwasów, szczególnie L-treoniny, może być korzystne (oprócz indywidualnej atenuacji genu pckA lub łącznej atenuacji genu pckA i otwartych ramek odczytu yjfA i/lub ytfP, wyłączenie niepożądanych reakcji wtórnych [Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms w: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (red.). Academic Press, Londyn, UK (1982)].

Drobnoustroje według niniejszego wynalazku można hodować w procesie okresowym lub w procesie okresowym z zasilaniem.

Podsumowanie znanych metod hodowli drobnoustrojów podane jest w podręczniku Chmiela [Bioprozesstechnik 1. Einfthrung in die Bioverfahrentechnik (Bioprocess Technology 1, Introduction to Bioengineering), Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1991)], lub w podręczniku Storhasa [Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Bioreactors and Peripheral Equipment), Vieweg Verlag, Brunszwik/Wiesbaden (1994)].

Zastosowana pożywka hodowlana musi odpowiednio spełniać wymagania konkretnych szczepów.

Opis pożywek hodowlanych dla rozmaitych drobnoustrojów można znaleźć w podręczniku: „Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology [(Washington

DC, USA (1981)].

Źródłami węgla, które można zastosować, są cukry i węglowodany, na przykład, glukoza, sacharoza, laktoza, fruktoza, maltoza, melasa, skrobia i, ewentualnie, celuloza, oleje i tłuszcze, na przykład, olej sojowy, olej słonecznikowy, olej arachidowy i olej kokosowy, kwasy tłuszczowe, na przykład kwas palmitynowy, kwas stearynowy i kwas linolowy, alkohole, na przykład glicerol i etanol, lub kwasy organiczne, na przykład, kwas octowy. Substancje te można stosować pojedynczo lub jako mieszaninę.

Źródłami azotu, które można zastosować są związki organiczne zawierające azot, takie jak peptony, ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny, ekstrakt słodowy, namok kukurydziany, mąka sojowa i mocznik lub związki nieorganiczne, takie jak siarczan amonu, chlorek amonu, fosforan amonu, węglan amonu i azotan amonu. Związki azotowe można stosować osobno lub jako mieszaninę.

Źródłami fosforu, które można zastosować są kwas fosforowy, diwodorofosforan potasu lub wodorofosforan dipotasu, lub odpowiednie sole sodu. Pożywka hodowlana musi zawierać także sole metali, na przykład, siarczan magnezu lub siarczan żelaza, które są niezbędne dla wzrostu drobnoustroju. W końcu, oprócz substancji powyżej wymienionych, użyć można podstawowych substancji stymulujących wzrost, takich jak aminokwasy i witaminy. Do pożywki hodowlanej dodać można także

PL 211 169 B1 odpowiednie prekursory. Wspomniane substancje odżywcze można dodać do hodowli od razu wszystkie, albo można zasilać odpowiednio podczas hodowli.

Poziom pH hodowli reguluje się za pomocą odpowiedniego stosowania związków zasadowych, takich jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, amoniak lub uwodniony amoniak, albo związków kwasowych, takich jak kwas fosforowy lub kwas siarkowy. Pienienie można kontrolować przy użyciu środków przeciwpieniących, takich jak estry poliglikoli z kwasami tłuszczowymi. Stabilność plazmidów można utrzymać przez dodanie do pożywki odpowiednich substancji o działaniu wybiórczym, takich jak, na przykład, antybiotyki. Warunki aerobowe utrzymuje się przez wprowadzanie do hodowli tlenu lub zawierających tlen mieszanin gazowych, na przykład, powietrza. Temperatura hodowli normalnie wynosi od 25°C do 45°C, korzystnie od 30°C do 40°C. Hodowlę kontynuuje się do momentu, w którym tworzenie się L-aminokwasów, lub L-treoniny, osiągnęło poziom maksymalny. Normalnie, cel ten osiąga się w ciągu 10 do 160 godzin.

L-aminokwasy można analizować z wykorzystaniem metody chromatografii anionowymiennej, z póżniejszą derywatyzacją ninhydrynową jak to opisali Spackman i in. [Analytical Chemistry, 30, 1190 (1958)] lub metody HPLC z odwróconymi fazami, jak to opisali Lintroth i in. [Analytical Chemistry, 51, 1167 - 1174 (1979)].

Wynalazek niniejszy objaśniają bardziej szczegółowo poniższe przykłady.

Wyodrębnianie plazmidowego DNA z Escherichia coli i wszystkie techniki związane z restrykcją i obróbką Klenowa oraz traktowanie fosfatazą alkaliczną przeprowadzano tak, jak to opisali Sambrook i in. [„Molecular cloning - a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]. Jeżeli nie wskazano inaczej, transformację Escherichia coli przeprowadzano sposobem opisanym przez Chunga i in. [Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 86, 2172 - 2175 (1989)].

Temperatura inkubacji przy otrzymywaniu szczepów i transformantów wynosiła 37°C. Temperatury wynoszące 30°C i 44°C stosowano w procesie wymiany genów według Hamiltona i in.

P r z y k ł a d 1

Konstruowanie mutacji delecyjnej w genie pckA

Części regionów 5' i 3' genu pckA Escherichia coli szczep K12 amplifikowano z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i oligonukleotydów syntetycznych. Sekwencji nukleotydowej genu pckA w E. coli K12 MG1655 (SEK ID NR. 1) użyto do zsyntetyzowania następujących starterów PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Niemcy):

pckA'5'-1: 5' - GATCCGAGCCTGACAGGTTA - 3' pckA'5'-2: 5' - GCATGCGCTCGGTCAGGTTA - 3' pckA'3'-1: 5' - AGGCCTGAAGATGGCACTATCG - 3' pckA'3'-2: 5' -CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA - 3'.

Chromosomowy DNA E. coli K12 MG1655 użyty do PCR wyizolowano z zastosowaniem „Qiagen Genomic-tips 100/G (Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z instrukcjami wytwórcy. Fragment DNA o wielkości około 500 pz z regionu 5' genomu pckA (oznaczony jako pck1) i fragment DNA o wielkości około 600 pz z regionu 3' genu pckA (oznaczony jako pck2) można było zamplifikować przy użyciu specyficznych starterów w standardowych warunkach przeprowadzania PCR [Innis i in.: „PCR Protocols. A guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)] z zastosowaniem polimerazy DNA Tag (Gibco-BRL, Eggenstein, Niemcy). Każdy z produktów PCR zligowano z wektorem pCR2.1TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Holandia), zgodnie z instrukcjami wytwórcy, i transformowano do E. coli szczep TOP10F'. Komórki z plazmidem wyselekcjonowano na agarze LB zawierającym 50 μg/ml ampicyliny. Po wyizolowaniu plazmidowego DNA, wektor pCR2.1TOPOpck2 pocięto enzymami restrykcyjnymi Stul i Xbal i po rozdzieleniu w 0,8% żelu agarozowym wyizolowano fragment pck2 z zastosowaniem zestawu QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy). Po wyizolowaniu plazmidowego DNA, wektor pCR2.1TOPOpck1 pocięto enzymami EcoRV i Xbal i zligowano do wyizolowanego fragmentu pck2. E. coli szczep DH5a stransformowano mieszaniną ligacyjną, a komórki niosące plazmid wyselekcjonowano na agarze LB zawierającym 50 μg/ml ampicyliny. Po wyizolowaniu plazmidowego DNA, zastosowano kontrolne cięcie przy użyciu enzymów Spel i Xbal w celu wykrycia plazmidów, zawierających, w formie sklonowanej, mutagenną sekwencję DNA przedstawioną w SEK ID NR3. Jeden z plazmidów oznaczono jako pCR2.1TOPOΔpckA.

P r z y k ł a d 2

Konstruowanie wektora wymiany pMAK705ΔpckA

Po restrykcji przy użyciu enzymów Spel i Xbal oraz rozdzieleniu w 0,8% żelu sacharozowym, allel pckA opisany w Przykładzie 1 wyizolowano z wektora pCR2.1TOPOΔpckA i zligowano do plazmidu

PL 211 169 B1 pMAK705 [Hamilton i in., Journal of Bacteriology, 174, 4617 - 4622 (1989)], który poddano trawieniu enzymem Xbal. DH5a transformowano mieszaniną ligacyjną, a komórki niosące plazmid wyselekcjonowano na agarze LB zawierającym 20 μg/ml chloramfenikolu. Po wyizolowaniu plazmidowego DNA i pocięciu enzymami Hpal, KpnI, Hindlll, Sall i Pstl, wykryto udane sklonowanie. Utworzony tak wektor wymiany (ang. exchange vector) pMAK705ΔpckA (= pMAK705deltapckA), pokazano na Figurze 1.

P r z y k ł a d 3

Specyficzna względem miejsca mutageneza genu pckA w E. coli szczep MG422

E. coli szczep MG442 wytwarzający L-treoninę opisano w US-A-4278765 i zdeponowano w Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, Moskwa, Rosja) jako CMIM B-1628. Szczep MG442 wykazuje oporność na kwas α-amino-e-hydroksywalerianowy i zapotrzebowanie, ewentualnie częściowe i dające się skompensować, na L-izoleucynę.

W celu wymiany chromosomalnego genu pckA na kodowany plazmidem konstrukt delecyjny, MG442 transformowano plazmidem pMAK705ΔpckA. Wymianę genową przeprowadzono metodą selekcyjną opisaną przez Hamiltona i in. [Journal of Bacteriology, 174, 4617 - 4622 (1989)] zweryfikowano standardowymi metodami PCR [Innis i in.: „PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)], z zastosowaniem następujących starterów oligonukleotydowych:

pckA'5'-1: 5' - GATCCGAGCCTGACAGGTTA - 3' pckA'3'-2: 5' - CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA - 3'

Otrzymany szczep oznaczono jako MG442ΔpckA.

P r z y k ł a d 4

Wytwarzanie L-treoniny przy użyciu szczepu MG442ΔpckA

MG442ΔpckA hodowano na pożywce minimalnej o następującym składzie: 3,5 g/litr Na₂HPO₄ ·

H2O, 1,5 g/litr KH2PO4, 1 g/litr NH4Cl, 0,1 g/litr MgSO4 • 7H2O, 2 g/litr glukozy i 20 g g/litr agaru. Tworzenie L-treoniny sprawdzano w 10 ml hodowlach okresowych znajdujących się w 100 ml kolbach Erlenmeyera. Były one inokulowane 10 ml pożywki do hodowli wstępnej o następującym składzie: 2 g/litr ekstraktu drożdżowego, 10 g/litr (NH4)2SO4, 1 g/litr KH2PO4, 0,5 g/litr MgSO4 • 7 H2O, 15 g/litr CaCO3 i 20 g/litr glukozy, i inkubowane w ciągu 16 godzin, w temperaturze 37°C i przy 180 obr/min, w inkubatorze ESR z firmy Kiihner AG (Birsfelden, Szwajcaria). 250 μl tej hodowli wstępnej przeniesiono do 10 ml pożywki produkcyjnej (25 g/litr ((NH4)2SO4, 2 g/litr KH2PO4, 1 g/litr MgSO4 • 7 H2O, 0,03 g/litr FeSO4 • 7 H2O, 0,018 g/litr MnSO4 • 1 H2O, 30 g/litr CaCO3, 20 g/litr glukozy) i inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37°C. Po inkubacji oznaczono gęstość optyczną (OD) zawiesiny hodowlanej przy użyciu fotometru LP2W z firmy Dr. Lange (Berlin, Niemcy), przy długości fali 660 nm.

Następnie, oznaczono stężenie L-treoniny w supernatancie przesączonej w warunkach jałowych hodowli, przy użyciu analizatora aminokwasów z firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Niemcy) z zastosowaniem chromatografii jonowymiennej oraz pokolumnowej reakcji z detekcją ninhydrynową.

Wynik eksperymentu przedstawiono w Tabeli 1.

T a b e l a 1

Szczep	OD (660 nm)	L-Treonina (g/litr)
MG442	6,0	1,5
MG442ApckA	5,4	3,7

P r z y k ł a d 5

Wytwarzanie L-treoniny przy użyciu szczepu MG442ΔpckA/pMW218gdhA

5.1 Amplifikacja i klonowanie genu gdhA:

Gen dehydrogenzy glutaminianowej z Escherichia coli K12 amplifikuje się z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i oligonukleotydów syntetycznych. Wychodząc z sekwencji nukleotydowej dla genu gdhA w E. coli K12 MG1655 (biblioteka genów: nr nr dostępu AE000270 i AE000271) zsyntetyzowano startery PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Niemcy):

Gdh1: 5' - TGAACACTTCTGGCGGTACG - 3'

Gdh2: 5' - CCTCGGCGAAGCTAATATGG - 3'

Chromosomowy DNA E. coli K12 MG1655 stosowany w reakcji PCR izoluje się zgodnie z instrukcjami wytwórcy „QIAGEN Genomic-tips 100/G (QIAGEN, Hilden, Niemcy). Fragment DNA o wielkości około 2150 pz, zawierający region kodujący gdhA oraz sekwencję 5'-flankującą (o wielkości około 350 pz) i sekwencję 3'-flankującą (o wielkości około 450 pz) można amplifikować ze specyficznymi starterami w standardowych warunkach PCR [Innis i in.: „PCR Protocols. A Guide to Methods

PL 211 169 B1 and Applications, Academic Press (1990)] z udziałem polimerazy Pfu-DNA (Promega Corporation, Madison, USA). Produkt PCR klonuje się w plazmidzie pCR2.1TOPO i transformuje w E. coli szczep TOP10 (Invitrogen, Leek, Holandia, Product Description TOPO TA Cloning Kit, nr katalogowy K4500-01). Udane sklonowanie wykazuje się przez pocięcie plazmidu pCR2.1TOPOgdhA enzymami restrykcyjnymi EcoRI i EcoRV. W tym celu, plazmidowy DNA izoluje się za pomocą „QIAprep Spin Plasmid Kits (QIAGEN, Hilden, Niemcy) i po pocięciu, rozdziela w 0,8% żelu agarozowym.

5.2 Klonowanie genu gdhA w wektorze plazmidowym pMW218

Plazmid pCR2.1TOPOgdhA tnie się enzymem EcoRI, porcję po pocięciu rozdziela się na 0,8% żelu agarozowym i wyodrębnia fragment gdhA o wielkości 2,1 kpz za pomocą „QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Niemcy). Plazmid pMW218 (Nippon Gene, Toyama, Japonia) tnie się i enzymem EcoRI i liguje z fragmentem gdhA. E. coli szczep DH5a transformuje się porcją po pocięciu, a komórki niosące pMW218 selekcjonuje się przez przeprowadzenie hodowli na agarze LB [Lennox, Virology, 1, 190 (1955)], do którego dodano 20 μg/ml kanamycyny.

Udane klonowanie genu gdhA można zademonstrować po wyizolowaniu plazmidowego DNA i kontrolnym cięciu EcoRI i EcoRV. Otrzymany plazmid został nazwany pMW218gdhA (Figura 3).

5.3 Otrzymywanie szczepu MG442ΔpckA/pMW218gdhA

Szczep MG442ΔpckA otrzymany w Przykładzie 3 i szczep MG442 transformuje się plazmidem pMW218gdhA, a transformanty selekcjonuje się na agarze LB, uzupełnionym 20 μg/ml kanamycyny. W ten sposób otrzymuje się szczepy MG442ΔpckA/pMW218gdhA i MG442/pMW218gdhA.

5.4 Wytwarzanie L-treoniny

Wytwarzanie L-treoniny przez szczepy MG442ΔpckA/pMW218gdhA i MG442/pMW218gdhA testuje się sposobem opisanym w Przykładzie 4. Pożywkę minimalną i pożywkę do hodowli wstępnej dodatkowo uzupełnia się 20 μg/ml kanamycyny.

Otrzymane wyniki eksperymentu podsumowano w poniższej Tabeli 2.

T a b e l a 2

Szczep	OD (660 nm)	L-Treonina (g/litr)
MG442	6,0	1,5
MG442ApckA	5,4	3,7
MG442/pMW218gdhA	5,6	2,6
MG442ApckA/pMW218ghdhA	5,5	4,0

P r z y k ł a d 6

Wytwarzanie L-treoniny ze szczepem MG442ΔpckA/pMW219rhtC

6.1 Amplifikacja genu rhtC

Gen rhtC z Escherichia coli K12 amplifikuje się stosując reakcję łańcuchowej polimerazy i syntetyczne oligonukleotydy. Wychodząc od sekwencji nukleotydowej dla genu rhtC w E. coli K12 MG1665 {biblioteka genów: nr dostępu AE000458, Zakataeva i in. [FEBS Letters, 452, 228 - 232 (1999)]}, syntetyzuje się startery PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Niemcy):

RhtC1: 5' - CTGTTAGCATCGGCGAGGCA - 3'

RhtC2: 5' - GCATGTTGATGGCGATGACG - 3'

Chromosomowy DNA E. coli K12 MG1655 stosowany w reakcji PCR izoluje się zgodnie z instrukcjami wytwórcy „QIAGEN Genomic-tips 100/G (QIAGEN, Hilden, Niemcy). Fragment DNA o wielkości około 800 pz, można amplifikować ze swoistymi starterami w standardowych warunkach PCR [Innis i in.: „PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)] z udziałem polimerazy Pfu-DNA (Promega Corporation, Madison, USA).

6.2 Klonowanie genu rhtC w wektorze plazmidowym pMW219

Plazmid pMW219 (Nippon Gene, Toyama, Japonia) tnie się enzymem Sam I i liguje z fragmentem rhtC-PCR. Szczep DH5a E. coli transformuje się porcją po cięciu, a komórki niosące pMW219 selekcjonuje się na agarze LB, uzupełnionym 20 μg/ml kanamycyny.

Udane klonowanie można zademonstrować po wyizolowaniu plazmidowego DNA i kontrolnym cięciu KpnI, Hindlll i Ncol. Otrzymany plazmid pMW219rhtC przedstawiono na Figurze 4;

6.3 Otrzymywanie szczepu MG442ΔpckA/pMW219rhtC

Szczep MG442ΔpckA otrzymany w Przykładzie 3 i szczep MG442 transformuje się plazmidem pMW219rhtC, a transformanty selekcjonuje się na agarze LB, uzupełnionym 20 μg/ml kanamycyny.

PL 211 169 B1

W ten sposób tworzą się szczepy MG442ΔpckA/pMW219rhtC i MG442/pMW219rhtC.

6.4 Wytwarzanie L-treoniny

Wytwarzanie L-treoniny przez szczepy MG442ΔpckA/pMW219rhtC i MG442/pMW219rhtC testuje się, jak opisano w Przykładzie 4. Pożywkę minimalną i pożywkę do hodowli wstępnej dodatkowo wzbogaca się 20 μg/ml kanamycyny.

Wyniki eksperymentu podsumowano w Tabeli 3.

T a b e l a 3

Szczep	OD (660 nm)	L-Treonina (g/litr)
MG442	6,0	1,5
MG442ApckA	5,4	3,7
MG442/pMW219rhtC	5,2	2,9
MG442ApckA/pMW219rhtC	4,8	4,4

P r z y k ł a d 7

Wytwarzanie L-treoniny przy użyciu szczepu B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40

Szczep E. coli B-3996 wytwarzający L-treoninę opisano w US-A-5175107 i zdeponowano w Russian National Collection for Industrial Microorganisms (VKPM, Moskwa, Rosja) pod numerem dostępu CMIM B-1628.

Szczep B-3996 wykazuje, między innymi, oporność na kwas a-amino-e-hydroksywalerianowy, zawiera atenuowaną, zwłaszcza wyłączoną, lub defektywną dehydrogenzę treoninową, wzmocnioną dehydrogenazę homoserynową I - kinazę asparaginianową I w postaci opornej na mechanizm zwrotny i ewentualnie częściowe i dające się skompensować zapotrzebowanie na L-izoleucynę, oraz zdolność do wykorzystywania sacharozy.

7.1 Otrzymywanie szczepu B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40

Po hodowli w wolnej od antybiotyków kompletnej pożywce przez około 10 pokoleń, izoluje się pochodną szczepu B-3996 niezawierającą już dłużej plazmidu pVIC40. Powstały szczep jest wrażliwy na streptomycynę. Został on oznaczony B-3996kur.

Do włączenia delecji do genu tdh użyto metody opisanej przez Hamiltona i in. [Journal of Bacteriology, 171, 4617 - 4622 (1989)], opartej na zastosowaniu plazmidu pMAK705 z termowrażliwym replikonem. Plazmid pDR121 [Ravnikar i Sommerville, Journal of Bacteriology, 169, 4716 - 4721 (1987)] zawiera fragment DNA z E. coli o wielkości 3,7 kilo par zasad (kpz), na którym kodowany jest gen tdh. W celu wytworzenia delecji regionu genu tdh, pDR121 tnie się enzymami restrykcyjnymi Clal i EcoRV i wyizolowany fragment DNA o wielkości 5 kpz poddaje ligowaniu po obróbce enzymem Klonowa. Porcją po ligowaniu transformuje się komórki E. coli szczep DH5a, a komórki niosące plazmid selekcjonuje się na agarze LB, do którego dodano 50 μg/ml ampicyliny.

Udaną delecję genu tdh można zademonstrować po wyizolowaniu plazmidowego DNA i kontrolnym pocięciu przez EcoRI. Izoluje się fragment EcoRI o wielkości 1,7 kpz i liguje z plazmidem pMAK705, częściowo strawionym EcoRI. Porcję po licowaniu transformuje się w DH5a, a komórki niosące plazmid selekcjonuje na agarze LB, do którego dodano 20 μg/ml chloramfenikolu. Udane klonowanie demonstruje się po wyizolowaniu plazmidowego DNA i pocięciu EcoRI. Utworzoną tak pochodną pMAK705 oznaczono pDM32.

W celu zastąpienia genu, B-3996kur transformuje się plazmidem pDM32. Zastąpienie chromosomowego genu tdh kodowanym przez plazmid konstruktem delecyjnym przeprowadza się na drodze procesu selekcyjnego opisanego przez Hamiltona i in. i weryfikuje typowymi metodami PCR [Innis i in.:PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)], z następującymi starterami oligonukleotydowymi:

Tdh1: 5'-TCGCGACCTATAAGTTTGGG - 3'

Tdh2: 5'-AATACCAGCCCTTGTTCGTG - 3'.

Utworzony tak szczep testuje się pod względem wrażliwości na kanamycynę I oznacza się B-3996kur.\tdh.

W celu przeprowadzenia specyficznej względem miejsca mutagenezy genu pckA, B-3996kur.\tdh transformuje się wektorem zastąpienia pMAK705ΔpckA opisanym w powyższym Przykładzie 2. Zastąpienie chromosomowego genu pckA kodowaną przez plazmid konstrukcją delecyjną przeprowadza się sposobem opisanym w Przykładzie 3. Otrzymany szczep został nazwany B-3996kurΔtdhΔpckA.

PL 211 169 B1

B-3996kur.\tdh i B-3996kurΔtdhΔpckA transformuje się plazmidem pVIC40 wyizolowanym z B-3996, a komórki niosące plazmid selekcjonuje się na agarze LB, do którego dodano 20 μg/ml streptomycyny.

W każdym przypadku, wyselekcjonowaną pojedynczą kolonię nazywa się B-3996kurAtdh/pVIC40 i B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40.

7.2 Wytwarzanie L-treoniny

Wytwarzanie L-treoniny przez szczepy B-3996kurAtdh/pVIC40 i B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40 testuje się sposobem opisanym w Przykładzie 4. Pożywkę minimalną, pożywkę do hodowli wstępnej i pożywkę produkcyjną dodatkowo uzupełniono 20 μg/ml streptomycyny.

Otrzymane wyniki eksperymentu podsumowano w Tabeli 4.

T a b e l a 4

Szczep	OD (660 nm)	L-Treonina (g/litr)
B-3996kurAdth/pVIC40	4,7	6,26
B-399kurAtdhApckA/pVIC40	4,9	8,92

P r z y k ł a d 8

Wytwarzanie L-lizyny przy użyciu szczepu TOC21RΔpckA

Szczep pDA1/TOC21R E. coli wytwarzający L-lizynę opisano w zgłoszeniu patentowym F-A-2511032 i zdeponowano w Collection Nationale de Culture de Microorganisme (CNCM = National Microorganism Culture Collection, Pasteur Institute, Paryż, Francja) pod numerem dostępu I-167. Szczep i nie zawierający plazmidu gospodarz zostali także opisani przez Dauce-Le Reverend i in. [European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 15, 227 - 231 (1982)] pod nazwą TOCR21/PDA1 tj. TOCR21/pDA1.

8.1 Specyficzna względem miejsca mutageneza genu pckA w szczepie TOC21R E. coli

Po hodowli w niezawierającej antybiotyków kompletnej pożywce LB przez mniej więcej 6 pokoleń, izoluje się pochodną szczepu pDA1/TOC21R niezawierającą już więcej plazmidu pDA1. Powstały szczep jest wrażliwy na tetracyklinę i został nazwany TOC21R. W celu zastąpienia chromosomowego genu pckA kodowany plazmidem konstrukt delecyjny, TOC21R transformuje się plazmidem pMAK705ΔpckA (Przykład 2). Zastąpienie genu przeprowadza się metodą selekcyjną opisaną przez Hamiltona i in. [Journal of Bacetriology, 174, 4617 - 4622) (1989)] i weryfikuje standardowymi metodami PCR [Innis i in.: „PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)], z następującymi starterami oligonukleotydowymi:

pckA'5'-1: 5' - GATCCGAGCCTGACAGGTTA - 3' pckA'3'-2: 3' -CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA - 3'

Otrzymany szczep został nazwany TOC21RΔpckA.

8.2 Wytwarzanie L-lizyny przy użyciu szczepu TOC21RΔpckA

Tworzenie L-lizyny przez szczepy TOC21RΔpckA i TOC21R sprawdza się w 10 ml hodowlach okresowych znajdujących się w 100 ml kolbach stożkowych. W tym celu, inokuluje się 10 ml pożywki do hodowli wstępnej o następującym składzie: 2 g/litr ekstraktu drożdżowego, 10 g/litr (NH4)2SO4, 1 g/litr KH2PO4, 0,5 g/litr MgSO4 • 7 H2O, 15 g/litr CaCO3 i 20 g/litr glukozy i przeprowadza inkubację w ciągu 16 godzin, w temperaturze 37°C i przy 180 obr/min, w inkubatorze ESR z firmy Kiihner AG (Birsfelden, Szwajcaria). 250 μl tej hodowli wstępnej przeszczepia się do 10 ml pożywki produkcyjnej o następującym składzie: 25 g/litr (NH4)2SO4, 2 g/litr KH2PO4, 1 g/litr MgSO4 • 7 H2O, 0,03 g/litr FeSO4 • 7 H2O, 0,018 g/litr MnSO4 • 1 H2O, 30 g/litr CaCO3, 20 g/litr glukozy, 25 mg/litr L-izoleucyny i 5 mg/litr tiaminy i przeprowadza inkubację w ciągu 72 godzin w temperaturze 37°C. Po zakończeniu inkubacji, oznacza się gęstość optyczną (OD) zawiesiny hodowli przy użyciu fotometru LP2W z firmy Dr. Lange (Berlin, Niemcy), przy długości fali 660 nm.

Następnie, oznacza się stężenie L-lizyny w supernatancie przesączonej w warunkach jałowych hodowli, przy użyciu analizatora aminokwasów z firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Niemcy) z zastosowaniem chromatografii jonowymiennej oraz pokolumnowej reakcji z detekcją ninhydrynową.

Otrzymane wyniki eksperymentu przedstawiono w poniższej Tabeli 5:

T a b e l a 5

Szczep	OD (660 nm)	L-Treonina (g/litr)
TOC21R	1,0	1,14
TOC21RApckA	1,0	1,27

PL 211 169 B1

P r z y k ł a d 9

Wytwarzanie L-izoleucyny przy użyciu szczepu B-3996kurΔtdhilvaA+ΔpckA/pVIC40

9.1 Wytwarzanie szczepu B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA/pVIC40

Szczep B-3996kur.\tdh, wykazujący zapotrzebowanie na L-izoleucynę, otrzymany w Przykładzie 7.1, poddaje się transdukcji przy pomocy faga P1kc [Lennox, Virology, 1, 190 -206 (1955); Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)], po czym wyodrębnia się transduktanty L-izoleucynoprototrofowe.

W tym celu, faga P1kc namnaża się na szczepie MG1655 [Guer i in..Cold Spring Harbor Symposium of Quantitative Biology, 45, 135 - 140 (1981); Blattner i in., Science, 277, 1453 -1462 (1997)] lizat fagowy wykorzystuje się do transdukcji szczepu B-3996kur.\tdh. Wielokrotność zakażenia wynosi w przybliżeniu 0,2. Selekcję na transduktanty L-izoleucynoprototropowe przeprowadza się na agarze minimalnym, zawierającym 2 g/litr glukozy i 10 mg/litr L-treoniny. Wyodrębnia się transduktant L-izoleucynoprototrofowy, po czym rozprowadza (rozsmarowuje) na agarze LB w celu oczyszczenia i izolacji. Został on nazwany B-3996kur.\tdhilvA7

Następnie, gen pckA szczepu B-3996kur.\tdhilvA' zastępuje się, jak opisano w Przykładzie 3, allelem ΔpckA, wytworzonym w Przykładzie 1 i 2. Otrzymany tak szczep został nazwany B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA.

Szczepy B-3996kur.\tdhilvA' i B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA transformuje się plazmidem pVIC40 wyizolowanym ze szczepu B-3996, a komórki niosące plazmid selekcjonuje się na agarze LB, uzupełnionym 20 μg/ml streptomycyny. W każdym przypadku wyselekcjonowana pojedyncza kolonia jest nazwana B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA/pVIC40 i B-3996kur.\tdhilvA7pVIC40.

9.2 Wytwarzanie L-izoleucyny

Wytwarzanie L-izoleucyny przy użyciu szczepów B-3996kur.\tdhilvA7pVIC40 i B-3996kur.\tdhilvA+Δpck-A/pVIC40 przetestowano sposobem opisanym w powyższym Przykładzie 4. Pożywkę minimalną, pożywkę do hodowli wstępnej i pożywkę produkcyjną dodatkowo uzupełniono 20 μg/ml streptomycyny.

Otrzymane wyniki eksperymentu przedstawiono w poniższej Tabeli 6.

T a b e l a 6

Szczep	OD (660 nm)	L-Treonina (g/litr)
B-3996kurAtdhilvA+/pVIC40	5,8	57
B-3996kurAtdhilvA+ApckA/pVIC40	5,7	70

P r z y k ł a d 10

Wytwarzanie L-waliny przy użyciu szczepu B-12288ΔpckA

E. coli szczep AJ 11502 wytwarzający L-walinę jest opisany w dokumencie patentowym US-A4391907 i zdeponowany w National Center for Agricultural Utilization Research (Peoria, Illinois, USA) jako NRRL B-12288.

10.1 Specyficzna względem miejsca mutageneza genu pckA w E. coli szczep B-12288

Po hodowli w niezawierającej antybiotyków pożywce LB przez w przybliżeniu 6 pokoleń, izoluje się niezawierającą plazmidu pochodną szczepu AJ 11502. Powstały szczep jest wrażliwy na ampicylinę. Został on nazwany AJ11502kur. W celu zastąpienia chromosomowego genu pckA kodowanym plazmidem konstruktem delecyjnym, AJ11502kur transformuje się plazmidem pMAK705ΔpckA (patrz Przykład 2). Zastąpienie genu przeprowadza się metodą selekcyjną opisaną przez Hamiltona i in. [Journal of Bacteriology, 174, 4617 - 4622) (1989)] i weryfikuje standardowymi metodami PCR [Innis i in.: „PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)], z następującymi starterami oligonukleotydowymi:

pckA'5'-1: 5' - GATCCGAGCCTGACAGGTTA - 3' pckA'3'-2: 5' - CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA - 3'

Otrzymany szczep został nazwany AJ11502kur.\pckA.

Ze szczepu NRRL B-12288 izoluje się plazmid opisany w US-A-4391907, niosący informację genetyczną dotyczącą wytwarzania waliny. Plazmidem tym transformuje się szczep AJ11502kur.\pckA. Jeden z otrzymanych transformantów został nazwany B-12288ΔpckA.

10.2 Wytwarzanie L-waliny przy użyciu szczepu B-12288ΔpckA Tworzenie L-waliny przez szczepy B-12288ΔpckA i NRRL B-12288 sprawdzano w 10 ml hodowlach okresowych znajdujących się w 100 ml kolbach stożkowych. W tym celu, zainokulowano 10 ml pożywki do hodowli wstępnej o następującym skłaPL 211 169 B1 dzie: 2 g/litr ekstraktu drożdżowego, 10 g/litr (NH4)2SO4, 1 g/litr KH2PO4, 0,5 g/litr MgSO4 • 7H2O, 15 g/litr CaCO3, 20 g/litr glukozy i 50 mg/litr ampicyliny, i przeprowadzono inkubację w ciągu 16 godzin, w temperaturze 37°C i przy 180 obr/min, w inkubatorze ESR z firmy Kiihner AG (Birsfelden, Szwajcaria). 250 μl tej hodowli wstępnej przeszczepiono do 10 ml pożywki produkcyjnej o następującym składzie: 25 g/litr (NH4)2SO4, 2 g/litr KH2PO4, 1 g/litr MgSO4 • 7H2O, 0,03 g/litr FeSO4 • 7 H2O, 0,018 g/litr MnSO4 • 1 H2O, 30 g/litr CaCO3, 20 g/litr glukozy, 5 mg/litr tiaminy i 50 mg/litr ampicyliny) i przeprowadzono inkubację w ciągu 72 godzin w temperaturze 37°C. Po inkubacji, oznaczono gęstość optyczną (OD) zawiesiny hodowli przy użyciu fotometru LP2W z firmy Dr. Lange (Berlin, Niemcy), przy długości fali 660 nm.

Następnie, oznaczono stężenie L-lizyny w supernatancie przesączonej warunkach jałowych hodowli, przy użyciu analizatora aminokwasów z firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Niemcy) z zastosowaniem chromatografii jonowymiennej oraz pokolumnowej reakcji z detekcją ninhydrynową.

Wyniki eksperymentu przedstawiono w Tabeli 7.

T a b e l a 7

Szczep	OD (660 nm)	L-Treonina (g/litr)
NRRL B-12288	5,6	0,93
B-12299ApckA	5,5	1,12

P r z y k ł a d 11

Wytwarzanie L-treoniny przy użyciu szczepu MG442Δ90yjfAΔpckA

11.1 Otrzymywanie szczepu MG442Δ90yjfAΔpckA

Gen pckA szczepu MG442Δ90yjfA zastępuje się, jak opisano w powyższym Przykładzie 3, allelem ΔpckA (patrz Przykłady 1 i 2 powyżej). Otrzymany szczep został nazwany MG442Δ90yjfAΔpckA

11.2 Wytwarzanie L-treoniny

Wytwarzanie L-treoniny przy użyciu szczepu MG442Δ90yjfAΔpckA przeprowadza się, jak opisano w powyższym Przykładzie 4.

Wynik przedstawiono w poniższej Tabeli 8.

T a b e l a 8

Szczep	OD (660 nm)	L-Treonina (g/litr)
MG442A90yjfA	5,7	2,1
MG442A90yjfAApckA	5,3	3,9

Krótki opis figur • Figura 1: pMAK705ΔpckA ( = pMAK705deltapckA) • Figura 3: pMW218gdhA • Figura 4: pMW2 1 9rhtC • Figura 5: pMAK705Δ90bp ( = pMAK705delta90bp)

Dane dotyczące długości należy rozumieć jako dane przybliżone.

Użyte skróty i oznaczenia mają następujące znaczenie:

• cat: gen oporności na chloramfenikol • rep-ts: termowrażliwy region replikacji plazmidu pSC101 • pck1: część regionu 5' genu pckA • pck2: część regionu 3' genu pckA • ytfP'-yjfA': sekwencja DNA zawierająca skrócone regiony kodujące ytfP i yjfA • kan: gen oporności na kanamycynę • gdhA: gen dehydrogenzy glutaminianowej • rhtC: gen nadający odporność na treoninę

Skróty odnoszące się do enzymów restrykcyjnych mają następujące znaczenie:

• BamHI: endonukleaza restrykcyjna z Bacillus amyloliquefaciens • Bglll: endonukleaza restrykcyjna z Bacillus globigii • Clal: endonukleaza restrykcyjna z Caryphanon latum • EcoRI: endonukleaza restrykcyjna z Escherichia coli • EcoRV: endonukleaza restrykcyjna z Escherichia coli • Hindlll: endonukleaza restrykcyjna z Haemophilus influenzae

PL 211 169 B1 • KpnI: endonukleaza restrykcyjna z Klebsiella pneumoniae • Pstl: endonukleaza restrykcyjna z Providencia stuartii • Pvul: endonukleaza restrykcyjna z Proteus vulgaris • SacI: endonukleaza restrykcyjna ze Streptomyces achromogenes • Sall: endonukleaza restrykcyjna ze Streptomyces albus • Smal: endonukleaza restrykcyjna z Serratia marcescens • Xbal: endonukleaza restrykcyjna z Xanthomonas badrii • Hhol: endonukleaza restrykcyjna z Xanthomonas holcicola

Wykaz sekwencji <110> Degussa AG <120> Proces fermentacyjny przeznaczony do wytwarzania L aminokwasów przy użyciu szczepów z rodziny Enterobacteriaceae <130> 000425 BT <140>

<141>

<160> 19 <170> Patentln Ver. 2.1

PL 211 169 B1

<210>	1
<211>	1622
<212>	DNA
<213>	Escherichi a
<220>
<221>	CDS
<222>	(1)..(1620)
<22 3 >	pckA

<jOC> 1 atg cgc gtt aac aat ggt ttg acc oog oaa gaa ctc gag gct tat ggt 48

Itat Arg Val Aan Aan Gly Laa Thr pro Gin Glu Leu Gla Me Tyr Gly

5 10 15 atc agt gac gta cat gat atc gtt tac aac coa agc tac gac ctg ctg 96

Ha Ser .Aap Tal Kia Aap Ile Val Tyr Aan Pro Ser Tyr Am Laa Leu

25 30 tat cag gaa gag ctc gat ccg agc ctg aca ggt tat gag cgc ggg gtg 144

Tyr Gin Glu Glu Lau Aap Pro Sar Lau Thr Gly Tyr Glu Ara Gly T*1

40 45 tta act aat ctg ggt gcc gtt gcc gte gat acc ggg ato ttc acc ggt 192

Lau Thr Aan Lau Gly Ala Tal Ala Tal Aap Thr Gly Ile Pha Thr Gly

55 60 cgt tca cca aa* gat aag tat atc gte cgt gac gat acc act ogc gat 240

Arg Sar Pro Lya Aap Ly* Tyr Ile Tal Arg Aap Aap Thr Thr Arg Aap «5 70 75 _B0 ct tto tgg tgg gca gac aa* ggc aaa ggt aag aac gac aac aaa cct 288

Thr Pba Trp Trp Ala Aap Lya Gly Lya Gly Lya Aan Aap Aan Lya Pm

BS 90 95 ctc tct oog gaa aoo tgg oag cat ctg aa* ggc ctg gtg aca agg oag 356

Lau Sar Pro Gin Thr Trp Gin Kia Lau Lya Gly Lau Tal Thr Arg Gla

100 105 no ctt .toc ggc aaa cgt ctg ttc gtt gte gac get ttc tgt ggt gog ano 384

Lau Sar Gly Lya Arg Lau Pha Tal Tai Aap Ala Pha Cya GlyAla Aaa

115 120 125

PL 211 169 B1

ccg	gat	act'	cgt	ctt	tcc	gtc	cgt	ttc
Pro	Aep 130	Thr	Arg	Leu	Ser	Tal 135	Arg	Phe
gcg	cat	ttt	gtc	aaa	aac	atg	ttt	•tt
Ala 145	His	Phe	Tal	Lys	Asn 150	Met	Phe	ile
gca	ggt	ttc	aaa	cca	gac	ttt	atc	gtt
Ala	Gly	Phe	Lys	Pro 165	Asp	Phe	Ile	Tal
aac	ccg	cag	tgg	aaa	gaa	cag	ggt	ctc
Aen	Pro	Gin	Trp 1B0	Lys	Glu	Gin	Gly	Leu 185
ttt	aac	ctg	acc	gag	cgc	atg	cag	ctg
Phe	Aen	Leu 195	Thr	Glu	Arg	Met	Glu 200	Leu
ggc	gea	atg	e&g	aaa	ggg	atg	ttc	tcg
Gly	Glu 210	Met	Lys	Lys	Gly	Met 215	Phe	Ser
ctg	aaa	ggt	atc	gct	tct	•tg	cac	tgc
Lec 225	Lye	Gly	Ile	Ala	Ser 230	Met	Bis	Cye
ggc	gat	gtt	gcg	gtg	ttc	ttc	ggc	ctt
Sly	Aep	Tal	Ala	Tal 245	Phe	Phe	Gly	Leu
Ctt	te»	acc	gac	cag	aaa	cgt	cgc	ctg
Leu	Ser	Thr	Asp 260	Pro	Lys	Arg	Arg	Leu 265
tgg	gac	gat	gac	ggc	gtg	ttt	aaa	ttc
Trp	Aep Aep 275	Aep Gly	Tal	Phe	Asn 280	Phe
act	atc	aag	ctg	tcg	aaa	g*«	gcg	gu
Thr	U* 290	Lya	Leu	Ser	Lys	Glu Ala 295	Glu
egt	cgt	gat	gag	ttg	ctg	gaa	aac	ctc
Arg 305	Arg	Asp	Ala	Leu	Leu 310	Glu Aon	Tal
atc	gac	ttt	g»t	gat	ggt	tca	aaa	aca
11«	A*p	Phe	Asp	Asp Gly Ser Lys 325	Thr
oog	atc	tat	cac	atc	gat aaa	•tt	gtt
Pro	11«	Tyr	His 340	Ile	A*p Asa	Ile	Tal 345
caa	,gcg	act	aag	gtt	atc	tto	atg	«ct
Bi·	Ala	Thr 355	Lys	Tal	Ile Phe	Leu 360	Thr

atc acc Ile Thr	gaa gtg gcc tgg cag	432
Glu Tal 140	Ale Trp Gin
cgc	cog	agc	gat	gaa	gaa ctg	480
Arg	Pro	Ser	Asp	Glu	Glu Leu
	155			160
atg	aac	ggc	gcg	aag	tgc act	528
Ket	Asn	Gly	Ala	Lys	Cys Thr
170				175
aac	tcc	gaa	aac	ttc	gtg gcg	576
Asn	Ser	Glu	Asn	Phe	Tal Ala
				190
att	ggc	ggc	acc	tgg	tac ggc	624
Ile	Gly	Gly	Thr	Trp	Tyr Gly
			205
atg	atg	aac	tac	ctg	ctg ccg	672
Met	Met	Aen	Tyr	Leu	Leu Pro
		220
tcc	gcc	aac	gtt	ggt	gag aaa	720
ser	Ala	Aen Tal	Gly Glu Lya
	235				240
tcc	ggc	aoo	ggt	aaa	acc acc	768
Ser	Gly	Thr	Gly	Lys	Thr Thr
250				255
•tt	ggc	gat	gac	g*«	cac ggc	816
Ile	Gly	Asp Asp	Glu	Bis Gly
				270
g*·	gga	ggc tgc	tac	gca aaa	864
Glu	Gly	Gly Cys	Tyr	Ala Lys
			285
OCt	gaa	atc	tac	aac	gct ata	912
Pro	Glu	Ile 300	Tyr	Asn	Ala Ile
acc	gtg	cgt	gaa	gat	ggc «ct	»60
Thr	Tal	Arg Glu Aep Gly Thr.
	315				320
g*g	aaa	acc	cgc	gtt	tct tat	1008
Glu	Asn	thr	Arg	Tal	Sar Tyr
330				335
aag	ccg	gtt	taa	aa*	gog gga	105«
Lys	Pro	Tal	Ser	Lye Ala Gly 350
gct gat	gct	ttc	ggc gtg ttg	1104
Ala Asp Ala	Ehe	Gly Tal Leu

365

PL 211 169 B1

ccg ccg gtt tet ega	ctg act gcc gat
Pro Pro v*l 370	Ser	Arg	Leu	Thr Ala Asp 375
tet	ggc	ttc	acc	gcc	aaa	ctg	gcc	ggt
Ser	Gly	Phe	Thr	Ala	Lya	Leu	Ala	Gly
305					390
ccg	acg	cca	acc	ttc	tcc	get	tgc	ttc
Pro	Thr	Pro	Thr	Phe 405	Ser	Ala	cys	Phe
cac	ccg	act	cag	tac	gca	gaa	ctg ctg
flis	Pro	Thr	Gln	Tyr	Ala	Glu	Val	Leu
			420					425
ggc	gcg	cag	get	tat	ctg	gtt	aac	act
Gly	Ala	Gln Ala	Tyr	Leu	Val	Aan	Thr
		435				440
ogt	atc	teg att	aaa	gat	acc	ege	gcc
Arg	Ile	Sar	Ile	Lys	Aap	Thr	Arg	AU
	«50				455
ggt	teg	ctg gat	aat	gca	«aa	aca	ttc
Gly	Sar	Leo	Λαρ	Asn	Ala	Glu	Thr	Phe
465				470
gcg	atc	cca	acc	gaa	ctg	cag ggc	eta
Ala	Ile	Pro	Thr	Glu	Leu	Pro	Gly	Val
				483
ogt	aac	acc	t*c	get	tat	ccg	gaa	cag
Arg	Aaa	Thr	Tyr Ala	Ser	Pro	Glu	Gln
			500					505
ctg	gcg	aaa	atg ttt	atc	gaa	aac	ttc
Leo Ala	Lys	Len	Phe	Ile	Asp	Aan	Phe
		515				520
gag ggt	gcc	gag	ctg gta	gag	get	ggt
Ala Gly	Ala	Ala	ira	Val Ala	AU	Gly
	530					533

caa acc cag tat	cac ttc ctc	1152
Gin	Thr	Gln 380	Tyr	His	Phe Lau
act	gag	cgt	ggc	ate	acc gaa	1200
Thr	Glu	Arg Gly	Ile	Thr Glu
	395				400
ggc	gcg	gca	ttc	ctg	tog ctg	1248
Gly	Ala	AU	Phe	Lau	Ser Leu
410					415
gtg	aaa	ogt	atg	cag	gcg gag	1296
Val	Lys Arg	Met	Gln	Ala Ala
				430
ggc	tgg	aac	ggc	act	ggc eaa	1344
siy	Trp	Aan	Gly	Thr	Gly Lys
			445
att	ato	gac	gcc	atc	eta aec	1392
Ile	He	Αβρ	AU	Ile	Leu Asa.
		460
act	ctg	ccg	atg ttt	esc ctg	1440
Thr	Leo	Pro	Met	Phe	Asn Leu
	475				480
gac	aog	aag	att	ctc	gat ccg	1488
Asp	Thr	Lys	Ile	Leu Asp pro
490					495
tgg	cag	gaa	aea	goc	gaa soo	1536
Trp	Gln	Olu	Lys	AU	Glu Thr
				510
gat	aaa	tac	acc	gac	acc oet	1584
Aep	Lya	Tyr	Thr	Asp	Thr Pro
			52S
oog	aaa	ctg	ta*			1623
Pro	Lys	Leu
		540

<210>	Z
<211>	540
<212>	PRT
<213>	Escherichia
<4C0>	2

Met Arg V*1 Am Am CJy Lea Thr Pro 1 5

II· Bar Asp Vel pis ASp II· Tal Tyr

25

Tyr fiin Olu Glu hen Asp PrP Sar Leu 35 40

Gln Glu Aaa βία Ala Tyr Gly 10 15

Am Pro Sar Tyr Asp Ira tra 30

Thr Gly Tyr βία Arg Sly Tal 45

PL 211 169 B1

Leu Thr Asn 50	Leu Gly	Ais Yal Ais Yal 55	Asp Thr Gly Ile Phe 80	Thr	Gly
Arg Ser Pro Lys Aap	Lye Tyr Ile Val	Arg Asp Asp Thr Thr	Arg Aap
os		70	75		80
Thr Phe Trp Trp Ais	Asp Lys Gly Lys	Gly Lys Asn Asp Asn	Lya	Pro
	05		90	95
Leu Ser Pro	Glu Thr	Trp Gin His Len	Lya Gly Len Yal Thr	Arg	Gin
	100	105	110
Leu Ser Gly Lys Arg	Leu Phe Yal Yal	Asp Ala Phs Cys Gly	Ala	Asn
115		120	125
Pro Asp Thr	Arg Len	Ser Ysl Arg Phe	Ile Thr Glu Ysl Ais	Trp	Gin
130		135	140
Ala His Phe	Val Lys	Asn Met Phe lis	Arg Pro Ser Asp Glu	Glu	Leu
145		150	155		180
Ala Gly Phe	Lys Pro	Asp Phs ile Ysl	Met Asn Gly Ais Lye	Cys	Thr
	1SS		170	17S
Asa Pro Gin	Trp Lys	Glu Gin Gly Leu	Asn Ser Gin Asn Phs	Ysl	Ala
	180	105	190
Phe Asn Len	Thr Glu	Arg Mat Gin Len	II* Gly Gly Thr Trp	Tyr Gly
195		200	205
Gly Gin Met	Lys Lys Gly Mat Phe Ser	Met Met Asn Tyr Lec	Leu	Pro
210		215	220
Leu Lys Gly	Ile Ala	Ser Mat Bis Cys	Ser Ais Asn Ysl Gly	Glu	Ly·
225		230	23$		240
Gly Asp val	Ais Yal	Phe Phe Gly Len	Ser Gly nar Gly Lys	Thr	Thr
	245		250	255
Leu Ser Thy	Asp Pro	Lys Arg Arg Leo	lis Gly Aap Asp Glu	Bis	Gly
	280	285	270

Trp Aap Asp Asp dy v<l Pha Asn Phe Siu Gly dy Cys Tyr Al· Lys 275 280 285

Thr II· Ly» L»u α·κ Lys Gin Al· Gin Pro Gin Ile Tyr Asn Ais 11« 290 285 300

Arg Arg Aap Ais Leu Lsa Gin Asn Yal Thr Yhl Atu Gin Jto Gly Thr

W 310 315 320

II· Asp Ehe Asp Asp Gly B«r Lys Thr Gin Asa Thr Arg Ysl Ser Tyr

325 330 335

Pro II· Tyr ais il· Aap Asn lis Yal Ly· Pro vai Sar Lys Ala Gly 340 345 350

Hia Ais Thr ly» Ysl II· Pb· Ln Thr Ala Aap Ais Pha Gly Yal Len 355 380 385

PL 211 169 B1

Pro ETO Vnl 310	Ser Arg	Leu Thr Ala Aap Gln Thr Gln Tyr Sie Phe Leu
375	380
Ser Gly Phe 385	Thr Ale	Lys Leu 390	Ala Gly Thr Glu Arg Gly Ile Thr Glu 395 400
Pro Thr Pro	Thr Phe 405	Ser Ala	Cys Phe Gly Ala Ala Phe Leu Ser Leu 410 415
Kie Pro Thr	Glu Tyr 420	Ala Glu	Tal Leu Val Lys Arg Met Gln Ala Ala 425 430
Gly Ala Gln 435	Ala Tyr	Leu Vel	Asn Thr Gly Trp Aen Gly Thr Gly Lys 440 445
Arg Ile Ser 450	Ile Lye Aap Thr 455	Arg Ala Ila Ile Asp Ala Zle Leu Aaa 4€0
Gly Ser Leu US	Aap Am Ala Glu 410	Thr Phe Thr Leu Pro Met Pbe Aen Leu 475 490
Ala XI· Ρ»	Thr Glu 485	Leu Pro	Gly Val Aap Thr Lys Ile Leu Asp Pro 490 495
Arg Am Thr	Tyr Ale 500	Ser Pro	Olu Sin Trp Gln Glu Lys Ale Glu Thr 50S 510
Leu Al* Lye Leu Phe 515 Ala Gly Ale Ala Leu	Ile Aap Am Phe Aep Lys Tyr Thr Aap Thr Pro 520 525 Val Ala Ala Gly Pro Lye Leu

530 535 540 <210> 3 <211> 1156 <212> DNA <213> Escherichia coli <22 0?· (221> misc_featnre <22ϋ> (1) . . (1156) <2 23> DNA rnuLagenny <220>

(221> misc_feature <22 02> (1)..(35) <223.< DNA techniczny / res ety sekwencji polilinkera <220??

(221?? misc__feature <220> (36)..(522) <223> część regionu 5' (pckl) genu pckA <2 2 0??

(221> misc feature <22 0> ( 52 ;£)..( 5 4 2 )

PL 211 169 B1 <223> i.echuiczny DNA/reszty sekwencji polilinkera <2 20<

(221> miso feature <222< GO . . (1105) <223> część regionu 3' (pck2) genu pckA <220 <221 > rr.isc feature <220 ' 1106! - - : U 56/ <223> DNA techniczny/roszty sekwencji polilinkera citagtaacgg cegceagtgt gctggaattc ggcttgatcc gagcetga.ee ggttatgage 60 gcggggtgtt aactaatctg ggtgccgttg ccgtcgatac cgggatcttc accggtcgtt 120 caccaaaaga taagtatatc gtccgtgaog ataecactcg egataettte tggtgggeag 160 acaaaggcaa aggtaagaac gacaacaaac etctctctec ggaaacctgg cageatetga 240 aaggcetggt gaccaggcag ctttccggca aaogtctgtt cgttgtcgac gctttctgtg 300 gtgogaacce ggatactcgt ctttcegtee gttteatcac cgaagtggcc tggcaggcgo 360 ®ttttgtcaa aaacatgttt attegeoega gcgatgaaga actggeaggt ttcaaaoeag 420 actttatcgt tatgaaoggc gegaagtgca ctaacccgca gtggaaagaa eagggtctca 460 aetccg&aaa ettcgtggeg tttaacctga cogagcgeat gcaagocgaa ttctgeagat 540 cctgaagatg gcactatega etętgatgat ggtteaaaaa cogagaacac cegcgtttct 600 tatccgatct atcacatcga taacattgtt aagccggttt ccaaagoggg ccaogcgact 660 aaggttatct tcctgactge tgatgctttc ggcgtgttgc cgceggtttc tegectgaet 720 gccgateaaa cecagtatca cttcctctct ggcttcaeeg ccaaactggc cggtaetgag 760 cgtggcatc* cogaacegae gccaaocttc tccgcttgct teggegegge attcotgtcg 040 etgcacecga ctcagrtacge agaagtgctg gtgaaacgta t gca ggc ggc gggcgcgcag 900 gcttatctgg ttaacactgg ctggaacggc aetggaaaae gtatetegat taaagataec 960 cgcgccatta -togacgceat cetcaaeggt tegctggata atgeagaaac ettcaotctg 1020 ccgatgttta acctggegat cccaacegaa ctgeegggcg tagacacgaa gattetegat 1000 ccgogtaaca cctacgcttc tccggaagcc gaattctgc* gatatocatc acactggcgg 1140 ccgctegagc atgeat 1156 <21U> 2 (211> 1294 <212> DNA <213> Escherichia coli <221> misc “eature <2 2 2 <22?

(1)..(3) koden inicjacyjny allelu delta pckA

<2 2 0

Iz- misc_feature s <_ _ 2 > (1)..(598) <223> region 5' allelu delta pckA <220>

<221> n.isc feature

PL 211 169 B1 <?.?.?.> (599)..(618) <223> DNA zechniczny/reszty sekwencji polilinkera <220>

<221> :msc_ feature <2223- (619)’. . (1291) <223> regicn 3' allelu delta pckA <2 2 0>

<2213· misc feature <222> (1232) . . (1234) <223> kodon stop alle_u delta pckA <402) 4 ntgcgcgtta catgatateg ctgacaggtt atcttcaccg actttctggt aoctggcagc gtcgacgctt gtggcctggc geaggtttca aaagaacagg geegaattet gaacacccgc agogggccac ggtttćtcgc actggccggt cgcggcattc ggeggcgggc ctcgafctaaa agaaaaette cacgaagakt cgaaaccctg tgccgcgctg acaatggttt tttacaaccc atgagcgcgg gtcgttcacc gggcagacaa atctgaaagg tctgtggtgc aggcgcattt aaccagacbt gtctcaactc gcagatcctg gtttcttatc gcgactaagg

Ctgactgocg actgagcgtg ctgtcgctgc gcgcaggctt gatacccgtsg actctgcoga ctcgatccgc gcg aa act gt gtagcggctg gacccogcaa aagctaogac ggtgttaact aaaagataag aggcaaaggt cctggtgacc gaacccggat tgtcaaaaac tatogttatg cgaaaacttc aagatggcac egatetatea ttatcttcct atcaaaccca gcatcaccga acccgactca atctggttaa ccattatcga tgtttaacct gtaacaecta ttatcgacaa gtcogaaact gaactogagg etgctgtatc aatctgggtg tatatogtcc aagaacgaca aggcagcttt actcgtcttt atgtttattc aacggcgcga gtggcgttta tntcgaettt catcgataac gactgctgat gtateactte accgacgcca gtacgcagaa cactggctgg cgccatcctc ggogatcaca cgcttctccg Cttcgataaa gtaa cttatggtat aggaagagct ccgttgcegt gtgacgatae acaaacctct ccggcaaacg cogtccgttt gcccgaycga agtgcaotaa acctgaccga gatgatggtt attgtta&gc gctttcggcg ctctctggct a ccttctccg gtgctggtga aacggeaetg aacggttegc accgaactgc gaacagtggc tacacogaca cagtgacgta egatoogage cgataacggg cactcgcgat ctctccgga* tctgttcgtt catcaccga* tgaagaactg cccgcagtgg gogeatgeaa caaaaaccga cggtttocaa tgttgeogee tcaoogccaa cttgettcgg aacgtatgca gcaaacgtat tggataatgc cgggcgtaga aggaaaaagc cocctgcggg

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

300

960

1020

1080

1140

1200

1260

1294

<2103-	Γ7 .3
(211>	2248
<212 3>	DNA
<2133·	Escherichia
<220>
( 2 2 1 >	qer:
< 2 2 0 >	( 3 3 6) . . (714
<22 3>	ORF yLlP
( 2 2 i >	gen
<1' 2 0 >	komplemer.z
<2 2 3>	ORF yjfA

PL 211 169 B1 <4Ω0> 5 ggcgatgtcg caacaagctg tcagagcgac agtgcggcaa ccagattgtg ggtaaaatog gggagtagge gaetcctcac gaaatacggc gtgggtatat gccta&gcta tatctggaag gttcgagttt tagcaatgcg agtcactgga tgaccaatgc tatagcctgg gccactatcc tatcgtattg acaacgccac tacgcgcgoc agttgattea cccgtcgatg gattaaagct tatgeatacg ocaccttcgg taattccctc accttttgct aaactctgct ggcattcaca atactttgta taacttaagg tgcaggtatg gtcattccca cgtggaggcg caagtgagea gcttgatgaa ctgctggcae ctggggtaaa tceaccoetg ggagacattg tgctggttgg ccttgtctta tttgctacgt tgacctcgat gctgattggt gcgegacgtt tggcgtaagc aggtagtggt cagcggctat ttgactctat agcaacacte ccgtgtctgg tgtagaccag aatatttgte tacggcagtt ccagttactg ggcgatttca aggcgoagtt coggggaacg gctggccgaa cttgatgoct gacgccgtac gggagtgcat aattgaaagc ggegactggt gtggcgttgt tttttgcgag tttctctccg agccgctttc aatgogcagg ggtaaaaegt aggtgcagat gcgtattaoc atatcgtaat gaaagaaett aeaateaact gattctgaca agtgtgacat gaaogcogcg cgggtgacga aatatggtea ctttgatoea gcaagcggcc ggacaaggge tggagagoga 60 ttgggggttg cgcaaagtgg 120 aatttagogc tcgacaocca ISO gtattgccag gtctgcaagt 240 acgttacgtt atcgcctgat 300 gcaetggatt tgctctatca 360 tacgecacaa acaaggeaae 420 gtatcgataa ctaocagttg 480 gaacggtaca cggtgaagtt S40 tgcgcaccag gggcggtgaa 600 ggatgtacgt ttatcaaoga 660 tagaeaggga taagtaaooa 720 acgactcgca ttctgttttg 760 oatatetatt aacgeataaa 640 ttoctgtagc accgtgagtt 900 ataaaaagat gggggaacag 960 aaettacage cggggcagag 1020 cccatctcca ggogotaotc 1060 gaacttagcg agcaggatgt 1140 *ga*aagtga atttgaaogg 1200 atgaacag 124· <210:? 6 <211> 911 <212> DNA <213> Escherichia coli <22 O <222> misc_feature <222> (11.7(911) <223:? region ytfP-yjiA z deiecją <22 0>

<222> misc feature <222> (11) .. (33 3;

<223> sekwencja flankująca 5' regionu ytfP-yjiA <220>

<222l misc feature <222> (334)..(911) <223?· sekwencja flankująca 3' regionu ycfP-yjfA <220>

<22 2? irh sc feature <222> (3/6)..(J/g) <223> keden ATG skróconej ORF ytfp

PL 211 169 B1

<22C>
<221>	misc feature
<222>	komplement ( (388) . .	(390)
< 2 2 3 >	kodon ATG skróconej	ORF
<TOO>	6

ggcg*tgtcg caacaagctg ccttgtctta teagagcgac agtgcggoa* tgacctcgat ccagattgtg ggtftaaatcg gcgagacgtt «JSgagtaggc gactcctccc aggtagtggt gaaatacggc gtgggtatat ttgactetat gcctaagct* tatctggaag ccgtgtctgg gttegagfctt tagcaatgcg aattatgoat gagacgactc gcattctgtt ttgtaattoc ttccatatct attaacgcat aaaaaactct cgtttcctgt agcaccgtga gttatacttt aecataaaaa gatgggggaa cagtgcaggt cttaacttac agccggggca gagcgtggag acaccoatct ceaggogeta otegettgat goggaactta gcgagcagga tgtetggggt taaagaaaag tgaatttgaa cggggagaoa gooatgaaca g tttgctaogt ggaoaaggge tggagagoga €0 getgattggt ttgggggttg ogcaaagtgg 120 tggcgtaage aatttagagc tcgacaaco· 1B0 cageggetat gtattgccag gtctgcaagt 240 agoaaoacto acgttaegrtt atcgćctgfct 300 tgtagaccag gcactggatt tgctctatca 340 acgccacctt egggtggogt tgttttttgc <20 ctoacctttt gcttttotct oegageegot 480 gctggcatta acaaatgogc aggggtaaaa S40 gtataactta aggaggtgca gatgegtatt 600 atggtoattc ocaatatcgt aatgaaagaa 660 gcgeaagtga gcaacaatca actgattctg 720 gaactgctgg cacagtgtga catgaacgoe 780 aaatccaooc ctgcgggtga cgaaatatgg 8441 ttgtgctggt tggctttgat ocagcaagog 900

Ul

< 2 2 C >

<221> miscfeaLure <222> <376?. .(378) <223> kodon. ATG skróconej ORF ytfP

PL 211 169 B1 <22Q>

<2 21> risc eature <222> komplement ((635)..(637)) <223> kodon ATG skróconej ORF yjzA ggcgatgtcg caacaagctg ccttgtctta tttgctaogt ggacaagggc tggagagsga 60 tcagagcgac agtgcggcaa tgacctcgat gctgattggt ttgggggttg cgeaaagtgg 120 ccagattgtg ggtaaaatog gcg&gacgtt tggcgtaagc aatttagegg togacaccca 180 gggagtaggc gactectefle aggtagtggt cagcggetat gtattgceag gtctęcaagt 240 gaaatacggc gtgggtatat ttgactctat agcaacacto acgttacgtt atogcctgat 300 gcctaagcta tatctggaag ccgtgtctgg tgtagaccag gcactggatt tgctctatca 360 gttcgagttt tagcaatgcg aatatttgtc tacggcagtt tacgacacaa acaaggcaae 420 agtcactgga tgaccaatgc ccagttactg ggogatttca gtatcgataa ctacoagttg 480 tatagcctgg gccactatcc aggcgcagtt ccggggaacg gaacggtaca oggtgaagtt 540 tatcgtattg aeaacgceae gctggccgaa cttgatgcct tgogcaecag gggcggtgaa 600 tacgcgcgcc agttgattca gacgcogtac tatgcataog ccaoettcgg gtggcgttgt 660 tttttgcgag acg&ctcgca ttctgttttg taattocctc accttttget tttctctcćg 720 egccgcttto catatctatt aacgcataaa aaaetctgct ggeattcaca aatgcgeagg 780 ggtaeaaogt ttactgtagc acogtgagtt atactttgta taecttaagg aggtgcagat 640 gcgtattacc ataaaaagat gggggaacag tgcaggtatg gtcattccca atatcgtaat 900 gaaagaactt aacttacagc cggggcagag agtggaggcg caegtgagca acaatcaact 960 gattctgaca cccatctcca ggcgctactc gcttgatgaa ctgctggcac agtgtgaoat 1020 gaaegccgeg gaacttagcg agcaggatgt ctggggtaaa tccaccectg egggtgacga 1080 aatatggtaa agaaaagtga etttgaacgg ggagacattg tgctggttgg ctttgatoca 1140 gcaagcggoc atgaaoag 1158 <2'3> 8 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja szruczna < 2 2 0 >

<'223> opis sekwencji sztucznej: starter pckA'5'-l < 4 0 0 >8 20 gatccqagcc tgacaggrta < 210 > 9 <211> 20 <212> DNA <213> .sekwencja sztuczna <2 2 0.>

<223> opis sekwencji sztucznej: starter pckA'5'-2 < 4 O· 0 > 9 .? 0 gcatgcgetc gctcaggtta

PL 211 169 B1 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<22 3>	opis	sekwencji sztucznej:	starter	pckA'	3' -1
<400>	10					22
aggcctgaag	atggcactat cg
<210>	11
<211>	20
<212>	DNA
<213>	sekwencja sztuczna
<22 0>
<223>	opis	sekwencji sztucznej:	starter	pckA'	5' -2
<400>	11					20

ccggagaagc gtaggtgtta

<210>	12
<211>	20
<21 2>	DNA
<213>	sekwencja sztuczna
<220>
<223>	opis sekwencji sztucznej: starter Gdhl
<400>	12	20

tgaacacttc tggcggtacg

<210>	13
<211 >	20
<212>	DNA
<213>	sekwencja sztuczna
<220>
<223>	opis sekwencji sztucznej: starter Gdh2
<400>	13	20

ccLcggcgaa gctaatatgg

<210>	14
<211>	20
<212>	DNA
<2? 3>	sekwencja sztuczna
<220>
<223>	opis sekwencji sztucznej: starter RhtCl

PL 211 169 B1 <4C0> 14 ctgttagcat cgccgaggca <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<223>	opis	sekwencji sztucznej:	starter	RhtC2
<400>	15
gcatgttgac	ggcgaLgacg
<210>	16
<211>	20
<212>	DNA
<213>	sekwencja sztuczna
<2 2 0> <223>	opis	sekwencji sztucznej:	starter	Tdhl

<400> 16

Lcgcgaccta taagtttggg

<21 0>	17
<211>	20
<212>	DNA
<213>	sekwencja szLuuzrięi
<220>
<223>	opis sekwencjo sztucznej: starter Tph2

<4 00> 17 aataccagcc cttgttcgtg

2C

<210>	18
<211>	20
<212>	DNA
<213>	sekwencja sztuczna
< 2 2 0 >
<2 2 3??	opis sekwencji sztucznej: szarter yl. P-

<400> 18 ggcgatgtcg caacaagctg

<210>	19
<211>	20
<212??	DNA
<213>	sekwencja sztuczna
<220>
<223>	opis sekwencji sztucznej: starter ytfP-
<400>	19
ctgttcatgg ccgcttgctg

PL 211 169 B1

Claims (13)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów, znamienny tym, że przeprowadza się następujące etapy:

   a) fermentację z udziałem drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzających pożądany L-aminokwas, w których ekspresja genu pckA lub sekwencji nukleotydowych kodujących produkt genu pckA jest atenuowana przez mutacje wybrane z grupy obejmującej tranzycje, transwersje, insercje i delecje

   b) wzbogacenie podłoża lub komórek bakterii w L-aminokwas, oraz

   c) izolację L-aminokwasu, lub

   d) składników brzeczki fermentacyjnej i biomasy izolowanych, w całości lub w części, jako produkt stały razem z L-aminokwasem.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekspresja polinukleotydu(ów) kodującego produkt genu pckA jest wyłączona.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się fermentację z udziałem drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, u których jeden lub więcej genów wybranych z grupy obejmującej:

   a) operon thrABC kodujący kinazę asparaginianową, dehydrogenzę homoserynową, kinazę homoserynową i syntazę treoninową,

   b) gen pyc kodujący karboksylazę pirogronianową,

   c) gen pps kodujący syntazę fosfoenolopirogronianową,

   d) gen rhtB oporności na homoserynę i

   e) gen rhtC oporności na treoninę,

   f) gen gdhA kodujący dehydrogenazę glutaminianową, jest równocześnie amplifikowanych i ulega nadekspresji.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeprowadza się fermentację z udziałem drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, u których jeden, lub więcej genów wybranych z grupy obejmującej:

   a) gen tdh kodujący dehydrogenazę treoninową,

   b) gen produktu otwartej ramki odczytu (orf) yjfA, oraz

   c) gen produktu otwartej ramki odczytu (orf) ytfP, jest atenuowanych.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, że wytwarza się L-izoleucynę, L-walinę, L-lizynę lub L-treoninę.
6. 6. Drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-aminokwas, znamienne tym, że ekspresja genu pckA lub sekwencji nukleotydowych kodujących produkt genowy jest atenuowana przez mutacje wybrane z grupy obejmującej tranzycje, transwersje, insercje i delecje, a jeden lub więcej genów wybranych z grupy obejmującej:

   a) gen rhtC oporności na treoninę

   b) gen gdhA kodujący dehydrogenazę glutaminianową jest w nich jednocześnie nadwyrażanych, korzystnie przez zwiększanie liczby kopii genów.
7. 7. Plazmid pMAK705ΔpckA, zawarty w szczepie E. coli MG442ΔpckA zdeponowany pod numerem DSM 14 289.
8. 8. Wyizolowany polinukleotyd pochodzący z drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, zawierający sekwencję polinukleotydową kodującą regiony 5' i 3' genu pckA, jak pokazano w SEK ID Nr 4, do zastosowania jako składnik plazmidów dla specyficznej względem miejsca mutagenezy genu pckA.
9. 9. Szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, znamienne tym, że zawierają mutację delecyjną w genie pckA, jak przedstawiono w odpowiadającej SEK ID NR 4.
10. 10. Szczepy z rodziny Enterobacteriaceae według zastrz. 9, znamienne tym, że dodatkowo zawierają mutację delecyjną w otwartej ramce odczytu ytfP, jak przedstawiono w odpowiadającej SEK ID NR 6 lub 7.
11. 11. Szczepy z rodziny Enterobacteriaceae według zastrz. 9, znamienne tym, że dodatkowo zawierają mutację delecyjną w otwartej ramce odczytu yjfA, jak przedstawiono w odpowiadającej SEK ID NR 6 lub 7.
12. 12. Szczep Escherichia coli K-12 MG442ΔpckA zdeponowany w Deutsche Sammlung far Mikroorganismen und Zellkulturen pod numerem DSM 13761.
13. 13. Szczep Escherichia coli K-12 B3996kur.\tdhpckA/PVIC40 zdeponowany w Deutsche Sammlung far Mikroorganismen und Zellkulturen pod numerem DSM 14150.