PL211169B1 - Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów, drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-aminokwas, plazmid, wyizolowany polinukleotyd, szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, szczepy Escherichia coli - Google Patents

Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów, drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-aminokwas, plazmid, wyizolowany polinukleotyd, szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, szczepy Escherichia coli

Info

Publication number
PL211169B1
PL211169B1 PL362315A PL36231501A PL211169B1 PL 211169 B1 PL211169 B1 PL 211169B1 PL 362315 A PL362315 A PL 362315A PL 36231501 A PL36231501 A PL 36231501A PL 211169 B1 PL211169 B1 PL 211169B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
gene
threonine
pcka
gly
thr
Prior art date
Application number
PL362315A
Other languages
English (en)
Other versions
PL362315A1 (pl
Inventor
Mechthild Rieping
Christine Bastuck
Thomas Hermann
Georg Thierbach
Original Assignee
Degussa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10130192A external-priority patent/DE10130192A1/de
Application filed by Degussa filed Critical Degussa
Publication of PL362315A1 publication Critical patent/PL362315A1/pl
Publication of PL211169B1 publication Critical patent/PL211169B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 362315 (22) Data zgłoszenia: 05.09.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
05.09.2001, PCT/EP01/010209 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
11.04.2002, WO02/29080 (11) 211169 (13) B1 (51) Int.Cl.
C12P 13/04 (2006.01)
C12N 1/21 (2006.01)
C12N 15/60 (2006.01)
C12P 13/08 (2006.01)
C12N 15/11 (2006.01)
C12N 15/31 (2006.01)
Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy
Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów, drobnoustroje z rodziny (54) Enterobacteriaceae wytwarzające L-aminokwas, plazmid, wyizolowany polinukleotyd, szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, szczepy Escherichia coli
(30) Pierwszeństwo: 30.09.2000, DE, 10048605.3 (73) Uprawniony z patentu:
DEGUSSA AG, Dϋsseldorf, DE
09.11.2000, DE, 10055516.0 22.06.2001, DE, 10130192.8 (72) Twórca(y) wynalazku:
MECHTHILD RIEPING, Bielefeld, DE
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 18.10.2004 BUP 21/04 CHRISTINE BASTUCK, Bielefeld, DE THOMAS HERMANN, Bielefeld, DE GEORG THIERBACH, Bielefeld, DE
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska
30.04.2012 WUP 04/12
PL 211 169 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów, drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-aminokwas, plazmid, wyizolowany polinukleotyd, szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, szczepy Escherichia coli.
L-aminokwasy stosowane są do żywienia zwierząt, jako leki dla ludzi i w przemyśle farmaceutycznym.
Znane jest wytwarzanie L-aminokwasów w procesie fermentacyjnym z udziałem szczepów z rodziny Enterobacteriaceae, zwłaszcza Escherichia coli i Serratia marcescens. Z powodu wielkiego znaczenia tych procesów, stale czynione są wysiłki zmierzające do polepszenia sposobów wytwarzania. Udoskonalenia wspomnianych procesów mogą dotyczyć: sposobów związanych z technologią fermentacji, na przykład mieszania i dostarczania tlenu, albo składu pożywki odżywczej, na przykład stężenia cukrów podczas fermentacji, albo dalszej obróbki z otrzymaniem odpowiedniej postaci produktu, na przykład, za pomocą chromatografii jonowymiennej, albo wewnętrznej charakterystyki produktywności danego drobnoustroju.
Charakterystyki produktywności tych drobnoustrojów poprawia się przez zastosowanie metod mutaganezy, selekcji i wyboru mutanta, w wyniku czego otrzymuje się szczepy oporne na antymetabolity, na przykład, treoninowe analogi kwasu α-amino-e-hydroksywalerianowego (AHV) lub szczepy auksotroficzne dla metabolitów o znaczeniu regulującym, i produkujące L-aminokwasy, na przykład, L-treoninę.
Od pewnego czasu stosowane są także metody rekombinacji DNA w celu polepszenia właściwości szczepów z rodziny Enterobacteriaceae produkujących L-aminokwasy przez amplifikowanie poszczególnych genów biosyntezy aminokwasów i badanie wpływu na produkcję.
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów, w którym przeprowadza się następujące etapy:
a) fermentację z udziałem drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzających pożądany L-aminokwas, w których ekspresja genu pckA lub sekwencji nukleotydowych kodujących gen produktu pckA jest atenuowana przez mutacje wybrane z grupy obejmującej tranzycje, transwersje, insercje i delecje
b) wzbogacenie podłoża lub komórek bakterii w L-aminokwas, oraz
c) izolację L-aminokwasu, lub
d) składników brzeczki fermentacyjnej i biomasy izolowanych, w całości lub w części, jako produkt stały razem z L-aminokwasem.
Korzystnie w sposobie tym ekspresja polinukleotydu(ów) kodującego produktu genu pckA jest wyłączona.
Korzystnie prowadzi się fermentację z udziałem drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, u których jeden, lub więcej genów wybranych z grupy obejmującej:
a) operon thrABC kodujący kinazę asparaginianową, dehydrogenazę homoserynową, kinazę homoserynową i syntazę treoninową,
b) gen pyc kodujący karboksylazę pirogronianową,
c) gen pps kodujący syntazę fosfoenolopirogronianową,
d) gen rhtB oporności na homoserynę i
e) gen rhtC oporności na treoninę,
f) gen gdhA kodujący dehydrogenazę glutaminianową, jest równocześnie amplifikowanych i ulega nadekspresji.
Korzystnie też fermentację prowadzi się z udziałem drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, u których jeden, lub więcej genów wybranych z grupy obejmującej:
a) gen tdh kodujący dehydrogenazę treoninową,
b) gen produktu otwartej ramki odczytu (orf) yjfA, oraz
c) gen produktu otwartej ramki odczytu (orf) ytfP, jest atenuowanych.
Korzystnie sposobem według wynalazku wytwarza się L-izoleucynę, L-walinę, L-lizynę lub L-treoninę.
Zakres wynalazku obejmuje również drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-aminokwas, charakteryzujące się tym, że ekspresja genu pckA lub sekwencji nukleotydowych kodujących produkt genowy jest atenuowana przez mutacje wybrane z grupy obejmującej tranzycje, transwersje, insercje i delecje, a jeden lub więcej genów wybranych z grupy obejmującej:
PL 211 169 B1
a) gen rhtC oporności na treoninę
b) gen gdhA kodujący dehydrogenazę glutaminianową jest w nich jednocześnie nadwyrażanych, korzystnie przez zwiększanie liczby kopii genu.
Niniejszy wynalazek dotyczy również plazmidu pMAK705ΔpckA, zawartego w szczepie E. coli
MG442ΔpckA zdeponowanego pod numerem DSM 14 289.
Niniejszy wynalazek obejmuje również wyizolowany polinukleotyd pochodzący z drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, zawierający sekwencję polinukleotydową kodującą regiony 5' i 3' genu pckA, jak pokazano w SEK ID Nr 4, do zastosowania jako składnik plazmidów dla specyficznej względem miejsca mutagenezy genu pckA.
W zakres wynalazku wchodzą również szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, które zawierają mutację delecyjną w genie pckA, jak przedstawiono w SEK ID Nr. 4.
Korzystnie szczepy z rodziny Enterobacteriaceae dodatkowo zawierają mutację delecyjną w otwartej ramce odczytu ytfP, jak przedstawiono w SEK ID Nr 6 lub 7, lub w otwartej ramce odczytu yjfA, jak przedstawiono w SEK ID Nr. 6 lub 7.
Niniejszy wynalazek dotyczy również szczepu Escherichia coli K-12 MG442ΔpckA zdeponowanego w Deutsche Sammlung far Mikroorganismen und Zellkulturen pod numerem DSM 13761 oraz szczepu Escherichia coli K-12 B3996kur.\tdhpckA/PVIC40 zdeponowanego w Deutsche Sammlung far Mikroorganismen und Zellkulturen pod numerem DSM 14150.
Stosowane w dalszej części niniejszego opisu określenie „L-aminokwasy lub „aminokwasy oznacza jeden lub większą ilość aminokwasów, włącznie z ich solami, wybranych z grupy obejmującej L-asparaginę, L-treoninę, L-serynę, L-glutaminian, L-glicynę, L-alaninę, L-cysteinę, L-walinę, L-metioninę, L-izoleucynę, L-leucynę, L-tyrozynę, L-fenyloalaninę, L-histydynę, L-lizynę, L-tryptofan, L-homoserynę i L-argininę. Szczególnie korzystna jest L-treonina.
W tym kontekście, termin „atenuacja oznacza zmniejszenie lub wyłączenie, w drobnoustroju, wewnątrzkomórkowej aktywności jednego, lub więcej niż jednego enzymu (białka) kodowanego przez odpowiedni DNA, na przykład, przez użycie słabego promotora albo genu lub allelu, kodującego odpowiedni enzym o niskiej aktywności lub inaktywującego odpowiedni enzym (białko), oraz, ewentualnie, połączenie ze sobą tych sposobów.
Dzięki zastosowaniu atenuacji aktywność lub stężenie odpowiedniego białka ulega na ogół zmniejszeniu do poziomu w zakresie od 0 do 75%, od 0 do 50%, od 0 do 25%, od 0 do 10% lub od 0 do 5% aktywności lub stężenia białka typu dzikiego, albo aktywności lub stężenia białka obecnego w wyjściowym drobnoustroju.
Drobnoustroje według niniejszego wynalazku mogą wytwarzać L-aminokwasy z glukozy, sacharozy, laktozy, fruktozy, maltozy, melasy, ewentualnie ze skrobi lub, ewentualnie, z celulozy, albo z glicerolu i etanolu. Drobnoustroje te są reprezentatami rodziny Enterobacteriaceae wybranymi z rodzajów Escherichia, Erwinia, Providencia i Serratia. Korzystne są rodzaje Escherichia i Serratia. Spośród rodzajów Escherichia i Serratia wyróżnić można zwłaszcza gatunki, odpowiednio, Escherichia coli i Serratia marcescens.
Przykładami odpowiednich szczepów, szczególnie szczepów wytwarzających L-treoninę z rodzaju Escherichia, a zwłaszcza Escherichia coli, są:
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNII genetika MG442
Escherichia coli VNII genetika M1
Escherichia coli VNII genetika 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132.
Przykładami odpowiednich szczepów wytwarzających L-treoninę z rodzaju Serratia, zwłaszcza z gatunku Serratia marcescens są następujące szczepy:
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000.
Korzystnie, szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę mają, między innymi, jedną lub więcej właściwości genotypowych lub fenotypowych wybranych z grupy obejmującej oporność
PL 211 169 B1 na kwas α-amino-e-hydroksywalerianowy, oporność na tializynę, oporność na etioninę, oporność na α-metyloserynę, oporność na kwas diaminobursztynowy, oporność na kwas α-aminomasłowy, oporność na borelidynę, oporność na ryfampicynę, oporność na analogi waliny, takie jak hydroksamian waliny, oporność na analogi puryny, takie jak 6-dimetyloaminopuryna, zapotrzebowanie na L-metioninę, ewentualnie częściowe i dające się skompensować zapotrzebowanie na L-izoleucynę, zapotrzebowanie na kwas mezodiaminopimelinowy, auksotrofię w odniesieniu do dipeptydów zawierających treoninę, oporność na L-treoninę, oporność na L-homoserynę, oporność na L-lizynę, oporność na L-metioninę, oporność na kwas L-glutaminowy, oporność na L-asparaginian, oporność na L-leucynę, oporność na L-fenyloalaninę, oporność na L-serynę, oporność na L-cysteinę, oporność na L-walinę, wrażliwość na fluoropirogronian, wadliwą dehydrogenazę treoninową, ewentualnie zdolność do wykorzystywania sacharozy, amplifikację operonu treoninowego, amplifikację dehydrogenazy homoserynowej kinazy asparaginianowej I, korzystnie w postaci opornej na mechanizm zwrotny, amplifikację kinazy homoserynowej, amplifikację syntazy treoninowej, amplifikację kinazy asparginianowej, ewentualnie w postaci opornej na mechanizm zwrotny amplifikację dehydrogenazy semialdehydu asparaginianowego, amplifikację karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, ewentualnie w postaci opornej na mechanizm zwrotny, amplifikację syntazy fosfoenolopirogronianowej, amplifikację transhydrogenazy, amplifikację produktu genu rhtB, amplifikację produktu genu rhtC, amplifikację produktu genu yfiK, amplifikację oksydoreduktazy jabłczanowo-chinonowej i amplifikację karboksylazy pirogronianowej oraz atenuację tworzenia się kwasu octowego.
Stwierdzono, że wytwarzanie L-aminokwasów, szczególnie L-treoniny, przez drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae polepsza atenuacja, a zwłaszcza, wyłączenie genu pckA kodującego karboksykinazę PEP (EC 4.1.1.49).
Sekwencję nukleotydową genu pckA Escherichia coli opublikowali Medina i in. [Journal of Bacteriology, 172, 7151 -7156 (1990)], a zaczerpnąć ją można także z sekwencji genomu Escherichia coli opublikowanej przez Blattnera i in. [Science, 277, 1453 - 1462 (1997)]. Sekwencję nukleotydową genu pckA Escherichia coli przedstawiono w SEK ID NR 1, a sekwencję aminokwasową odpowiedniego produktu genowego przedstawiono w SEK ID NR 2.
Geny pckA opisane we wspomnianych powyższych odnośnikach literaturowych można zastosować zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Możliwe jest także użycie alleli genu pckA, pochodzących z degeneracji kodu genetycznego lub z obojętnych mutacji nonsensownych (ang. neutral sense mutations).
Atenuację można osiągnąć, na przykład, przez zmniejszenie lub wyłączenie ekspresji genu pckA lub katalitycznych właściwości białka enzymatycznego. Można też połączyć oba te sposoby postępowania.
Ekspresję genu można zmniejszyć przez zastosowanie odpowiedniej techniki hodowli, przez modyfikację genetyczną (mutację) struktur sygnałowych ekspresji genu lub za pomocą technologii antysensownego RNA. Przykładami struktur sygnałowych ekspresji genu są: geny represorowe, geny aktywatorowe, operatory, promotory, atenuatory, miejsca wiązania rybosomu, kodon start i terminatory. Specjaliści w tej dziedzinie techniki znajdą odnośne informacje, między innymi, na przykład w: Jensen i Hammer [Biotechnology and Bioengineering, 58, 191 -195 (1998)], Carrier i Keasling [Biotechnology Progress, 15, 58-64 (1999)], Franch i Gerdes [Current Opinion in Microbiology, 3, 159 164 (2000)] i w dobrze znanych podręcznikach z dziedziny genetyki i biologii molekularnej, takich jak, na przykład, podręcznik Knippersa [„Molekulare Genetik („Molecular Genetics), wyd. VI, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Niemcy (1995)] lub podręcznik Winnackera [„Gene und Klone („From Genes to Clones), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Niemcy (1990)].
Z dotychczasowego stanu techniki znane są mutacje powodujące zmianę lub zmniejszenie katalitycznych właściwości białek enzymatycznych. Przykładowo, wymienić tu można badania, które przeprowadzili Qiu i Goodman [Journal of Biological Chemistry, 272, 8611 - 8617 (1997)], Yano i in. [Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 95, 5511 - 5515 (1998)] oraz Wente i Schachmann [Journal of Biological Chemistry, 266, 20833 - 20939 (1991)]. Przeglądy można znaleźć w dobrze znanych podręcznikach z dziedziny genetyki i biologii molekularnej, na przykład, w podręczniku Hagemanna [„Allgemeine Genetik („General Genetics), Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1986)].
Mutacjami branymi tu pod uwagę są: tranzycje, transwersje, insercje i delecje. W zależności od wpływu wymiany aminokwasu na aktywność enzymatyczną, stosowane są określenia: mutacje zmiany sensu (mutacje missens) lub mutacje nonsensowne. Insercje lub delecje co najmniej jednej pary zasad w genie powodują mutacje przesunięcia ramki odczytu (ang. frameshift mutations), w wyniku których wbudowane są fałszywe aminokwasy lub dochodzi do przedwczesnej terminacji translacji. DelePL 211 169 B1 cje kilku kodonów typowo prowadzą do całkowitej utraty aktywności enzymatycznej. Instrukcje dotyczące wytwarzania takich mutacji stanowią część stanu techniki i można je znaleźć w dobrze znanych podręcznikach z dziedziny genetyki i biologii molekularnej, na przykład, w podręczniku Knippersa [Molekulare Genetik (Molecular Genetics), wyd. VI, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Niemcy (1995)], w podręczniku Winnackera [„Gene und Klone („From Genes to Clones), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Niemcy (1990)] lub w podręczniku Hagemanna [„Allgemeine Genetik („General Genetics), Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1986)].
Przykładowym plazmidem, przy pomocy którego można atenuować a w szczególności wyłączyć, gen pckA na drodze mutagenezy specyficznej względem miejsca, jest plazmid pMAK705ΔpckA (Figura 1). Zawiera on tylko część regionu 5' i część regionu 3' genu pckA. Brakuje (delecja) odcinka regionu kodującego o 349 pz. Sekwencję tego DNA, którego można użyć do mutagenezy genu pckA przedstawiono w SEK ID NR. 3.
Mutację delecyjną genu pckA można włączyć do odpowiednich szczepów za pomocą wymiany genu lub allelu.
Zwykłą metodą jest w tym przypadku metoda wymiany genu z zastosowaniem warunkowo replikującej pochodnej pSC101, pMAK705, jak to opisali Hamilton i in. [Journal of Bacteriology, 174, 4617 - 4622 (1989)]. Można wykorzystać też inne metody opisane w stanie techniki, na przykład metodę, którą przedstawili Martinez-Morales i in. [Journal of Bacteriology, 7143-7148 (1999)] lub metodę Boyda i in. [Journal of Bacteriology, 182, 842 - 847 (2000)].
W przypadku przeprowadzania wymiany w szczepie będącym przedmiotem zainteresowania występuje forma allelu ΔpckA, przedstawiona w SEK ID NR. 4, stanowiąca dalszy przedmiot niniejszego wynalazku.
Mutacje w genie pckA lub mutacje obejmujące ekspresję genu pckA można przenosić do rozmaitych szczepów na drodze koniugacji lub transdukcji.
Ponadto, dla wytwarzania L-aminokwasów, szczególnie L-treoniny, z udziałem szczepów z rodziny Enterobacteriaceae, może być korzystna nie tylko atenuacja genu pckA, ale także zamplifikowanie jednego, lub więcej enzymów ze znanego biosyntetycznego szlaku treoniny lub enzymów metabolizmu anaplerotycznego, lub enzymów zaangażowanych w wytwarzanie zredukowanego fosforanu dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego. W tym kontekście, termin „amplifikacja oznacza zwiększenie aktywności wewnątrzkomórkowej (w drobnoustroju) jednego, lub większej ilości enzymów lub białek, kodowanych przez odpowiedni DNA, na przykład przez zwiększenie liczby kopii genu (genów), przy użyciu silnego promotora lub z zastosowaniem kodowania genu dla odpowiedniego enzymu lub białka o wysokiej aktywności, a także połączenie ze sobą tych sposobów.
Dzięki zastosowaniu metod amplifikacji, w szczególności nadekspresji, aktywność lub stężenie odpowiedniego białka ulega, na ogół, zwiększeniu o co najmniej 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% lub 500%, aż do, maksymalnie 1000% lub 2000%, w przeliczeniu na białko typu dzikiego, albo na aktywność lub stężenie białka w drobnoustroju wyjściowym.
Zatem, na przykład, można przeprowadzić jednoczesną amplifikację, i, w szczególności, nadekspresję, jednego, lub więcej genu wybranego z grupy obejmującej:
• operon thrABC kodujący kinazę asparaginianową, dehydrogenazę homoserynową, kinazę homoserynową i syntazę treoninową (US-A-4278765), • gen pyc kodujący karboksylazę pirogronianową (DE-A-19 831 609), • gen pps kodujący syntazę fosfoenolopirogronianową [Molecular and General Genetics, 231,
332 (1992)], • gen ppc kodujący karboksylazę fosfoenolopirogronianową [Gene, 31, 279 - 283 (1984)], • geny pntA i pntB kodujące transhydrogenazę [European Journal of Biochemistry, 158,
647 - 653 (1986)], • gen rhtB nadający oporność na homoserynę (EP-A-0994190) i • gen rhtC nadający odporność na treoninę (EP-A-1013765), • gen gdhA kodujący dehydrogenazę glutaminianową [Gene, 27, 193 - 199 (1984)].
Ponadto, dla produkcji L-aminokwasów, szczególnie L-treoniny, może być korzystna nie tylko atenuacja genu pckA, ale także atenuacja, a zwłaszcza wyłączenie, jednego, lub większej ilości genów wybranych z grupy obejmującej:
• gen tdh kodujący dehydrogenazę treoninową [Ravnikar i Somerville, Journal of Bacteriology,
169, 4716 - 4721 (1987)],
PL 211 169 B1 • gen produktu otwartej ramki odczytu (orf) yjfA [numer dostępu AAC77180 w National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) i SEK ID NR 5], i • gen produktu otwartej ramki odczytu (orf) ytfP [numer dostępu AAC77179 w National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) i SEK ID NR 5], albo zmniejszenie ich ekspresji.
Korzystne jest atenuowanie otwartej ramki odczytu yjfA i/lub otwartej ramki odczytu ytfP.
Przykładem plazmidu, przy pomocy którego można przeprowadzić atenuację, a zwłaszcza wyłączenie, otwartych ramek odczytu yjfA i ytfP z Escherichia coli na drodze mutagenezy specyficznej względem miejsca, jest plazmid pMAK705.\yjfA (Figura 2). Zawiera on tylko część sekwencji flankujących 5' i 3' regionu ytfP-yjfA, obejmując bardzo krótkie reszty otwartych ramek odczytu yjfA i ytfP. Brakuje, (delecja) części regionu ytfP-yjfA o długości 337 pz. Sekwencję tego DNA, którego można użyć do mutagenezy regionu ytfP-yjfA, przedstawiono w SEK ID NR 6.
Dalszym przykładem plazmidu, przy pomocy którego można atenuować, a w szczególności wyłączyć otwarte ramki odczytu yjfA i ytfP Escherichia coli na drodze mutagenezy specyficznej względem miejsca, jest plazmid ρΜΑΚ705Δ90όρ (Figura 5). Zawiera on również tylko część sekwencji flankujących 5' i 3' regionu ytfP-yjfA, obejmując bardzo krótkie reszty otwartych ramek odczytu yjfA i ytfP. Brakuje (delecja) części regionu ytfP-yjfA o długości 90 pz. Sekwencję tego DNA, którego można użyć do mutagenezy regionu ytfP-yjfA przedstawiono w SEK ID NR 7.
Tę mutację delecyjną można włączyć do odpowiednich szczepów za pomocą wymiany genu lub allelu. Możliwe jest także przeniesienie mutacji w otwartych ramkach odczytu yjfA i/lub ytfP, lub mutacji wywołujących ekspresję tych otwartych ramek odczytu do rozmaitych szczepów na drodze koniugacji lub transdukcji.
W przypadku przeprowadzenia zastąpienia, w omawianym szczepie występuje postać alleli .\ytfP i ΔyjfA przedstawionych w SEK ID NR 6 lub SEK ID NR7, stanowiących dalszy przedmiot niniejszego wynalazku.
Ponadto, dla wytwarzania L-aminokwasów, szczególnie L-treoniny, może być korzystne (oprócz indywidualnej atenuacji genu pckA lub łącznej atenuacji genu pckA i otwartych ramek odczytu yjfA i/lub ytfP, wyłączenie niepożądanych reakcji wtórnych [Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms w: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (red.). Academic Press, Londyn, UK (1982)].
Drobnoustroje według niniejszego wynalazku można hodować w procesie okresowym lub w procesie okresowym z zasilaniem.
Podsumowanie znanych metod hodowli drobnoustrojów podane jest w podręczniku Chmiela [Bioprozesstechnik 1. Einfthrung in die Bioverfahrentechnik (Bioprocess Technology 1, Introduction to Bioengineering), Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1991)], lub w podręczniku Storhasa [Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Bioreactors and Peripheral Equipment), Vieweg Verlag, Brunszwik/Wiesbaden (1994)].
Zastosowana pożywka hodowlana musi odpowiednio spełniać wymagania konkretnych szczepów.
Opis pożywek hodowlanych dla rozmaitych drobnoustrojów można znaleźć w podręczniku: „Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology [(Washington
DC, USA (1981)].
Źródłami węgla, które można zastosować, są cukry i węglowodany, na przykład, glukoza, sacharoza, laktoza, fruktoza, maltoza, melasa, skrobia i, ewentualnie, celuloza, oleje i tłuszcze, na przykład, olej sojowy, olej słonecznikowy, olej arachidowy i olej kokosowy, kwasy tłuszczowe, na przykład kwas palmitynowy, kwas stearynowy i kwas linolowy, alkohole, na przykład glicerol i etanol, lub kwasy organiczne, na przykład, kwas octowy. Substancje te można stosować pojedynczo lub jako mieszaninę.
Źródłami azotu, które można zastosować są związki organiczne zawierające azot, takie jak peptony, ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny, ekstrakt słodowy, namok kukurydziany, mąka sojowa i mocznik lub związki nieorganiczne, takie jak siarczan amonu, chlorek amonu, fosforan amonu, węglan amonu i azotan amonu. Związki azotowe można stosować osobno lub jako mieszaninę.
Źródłami fosforu, które można zastosować są kwas fosforowy, diwodorofosforan potasu lub wodorofosforan dipotasu, lub odpowiednie sole sodu. Pożywka hodowlana musi zawierać także sole metali, na przykład, siarczan magnezu lub siarczan żelaza, które są niezbędne dla wzrostu drobnoustroju. W końcu, oprócz substancji powyżej wymienionych, użyć można podstawowych substancji stymulujących wzrost, takich jak aminokwasy i witaminy. Do pożywki hodowlanej dodać można także
PL 211 169 B1 odpowiednie prekursory. Wspomniane substancje odżywcze można dodać do hodowli od razu wszystkie, albo można zasilać odpowiednio podczas hodowli.
Poziom pH hodowli reguluje się za pomocą odpowiedniego stosowania związków zasadowych, takich jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, amoniak lub uwodniony amoniak, albo związków kwasowych, takich jak kwas fosforowy lub kwas siarkowy. Pienienie można kontrolować przy użyciu środków przeciwpieniących, takich jak estry poliglikoli z kwasami tłuszczowymi. Stabilność plazmidów można utrzymać przez dodanie do pożywki odpowiednich substancji o działaniu wybiórczym, takich jak, na przykład, antybiotyki. Warunki aerobowe utrzymuje się przez wprowadzanie do hodowli tlenu lub zawierających tlen mieszanin gazowych, na przykład, powietrza. Temperatura hodowli normalnie wynosi od 25°C do 45°C, korzystnie od 30°C do 40°C. Hodowlę kontynuuje się do momentu, w którym tworzenie się L-aminokwasów, lub L-treoniny, osiągnęło poziom maksymalny. Normalnie, cel ten osiąga się w ciągu 10 do 160 godzin.
L-aminokwasy można analizować z wykorzystaniem metody chromatografii anionowymiennej, z póżniejszą derywatyzacją ninhydrynową jak to opisali Spackman i in. [Analytical Chemistry, 30, 1190 (1958)] lub metody HPLC z odwróconymi fazami, jak to opisali Lintroth i in. [Analytical Chemistry, 51, 1167 - 1174 (1979)].
Wynalazek niniejszy objaśniają bardziej szczegółowo poniższe przykłady.
Wyodrębnianie plazmidowego DNA z Escherichia coli i wszystkie techniki związane z restrykcją i obróbką Klenowa oraz traktowanie fosfatazą alkaliczną przeprowadzano tak, jak to opisali Sambrook i in. [„Molecular cloning - a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]. Jeżeli nie wskazano inaczej, transformację Escherichia coli przeprowadzano sposobem opisanym przez Chunga i in. [Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 86, 2172 - 2175 (1989)].
Temperatura inkubacji przy otrzymywaniu szczepów i transformantów wynosiła 37°C. Temperatury wynoszące 30°C i 44°C stosowano w procesie wymiany genów według Hamiltona i in.
P r z y k ł a d 1
Konstruowanie mutacji delecyjnej w genie pckA
Części regionów 5' i 3' genu pckA Escherichia coli szczep K12 amplifikowano z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i oligonukleotydów syntetycznych. Sekwencji nukleotydowej genu pckA w E. coli K12 MG1655 (SEK ID NR. 1) użyto do zsyntetyzowania następujących starterów PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Niemcy):
pckA'5'-1: 5' - GATCCGAGCCTGACAGGTTA - 3' pckA'5'-2: 5' - GCATGCGCTCGGTCAGGTTA - 3' pckA'3'-1: 5' - AGGCCTGAAGATGGCACTATCG - 3' pckA'3'-2: 5' -CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA - 3'.
Chromosomowy DNA E. coli K12 MG1655 użyty do PCR wyizolowano z zastosowaniem „Qiagen Genomic-tips 100/G (Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z instrukcjami wytwórcy. Fragment DNA o wielkości około 500 pz z regionu 5' genomu pckA (oznaczony jako pck1) i fragment DNA o wielkości około 600 pz z regionu 3' genu pckA (oznaczony jako pck2) można było zamplifikować przy użyciu specyficznych starterów w standardowych warunkach przeprowadzania PCR [Innis i in.: „PCR Protocols. A guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)] z zastosowaniem polimerazy DNA Tag (Gibco-BRL, Eggenstein, Niemcy). Każdy z produktów PCR zligowano z wektorem pCR2.1TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Holandia), zgodnie z instrukcjami wytwórcy, i transformowano do E. coli szczep TOP10F'. Komórki z plazmidem wyselekcjonowano na agarze LB zawierającym 50 μg/ml ampicyliny. Po wyizolowaniu plazmidowego DNA, wektor pCR2.1TOPOpck2 pocięto enzymami restrykcyjnymi Stul i Xbal i po rozdzieleniu w 0,8% żelu agarozowym wyizolowano fragment pck2 z zastosowaniem zestawu QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy). Po wyizolowaniu plazmidowego DNA, wektor pCR2.1TOPOpck1 pocięto enzymami EcoRV i Xbal i zligowano do wyizolowanego fragmentu pck2. E. coli szczep DH5a stransformowano mieszaniną ligacyjną, a komórki niosące plazmid wyselekcjonowano na agarze LB zawierającym 50 μg/ml ampicyliny. Po wyizolowaniu plazmidowego DNA, zastosowano kontrolne cięcie przy użyciu enzymów Spel i Xbal w celu wykrycia plazmidów, zawierających, w formie sklonowanej, mutagenną sekwencję DNA przedstawioną w SEK ID NR3. Jeden z plazmidów oznaczono jako pCR2.1TOPOΔpckA.
P r z y k ł a d 2
Konstruowanie wektora wymiany pMAK705ΔpckA
Po restrykcji przy użyciu enzymów Spel i Xbal oraz rozdzieleniu w 0,8% żelu sacharozowym, allel pckA opisany w Przykładzie 1 wyizolowano z wektora pCR2.1TOPOΔpckA i zligowano do plazmidu
PL 211 169 B1 pMAK705 [Hamilton i in., Journal of Bacteriology, 174, 4617 - 4622 (1989)], który poddano trawieniu enzymem Xbal. DH5a transformowano mieszaniną ligacyjną, a komórki niosące plazmid wyselekcjonowano na agarze LB zawierającym 20 μg/ml chloramfenikolu. Po wyizolowaniu plazmidowego DNA i pocięciu enzymami Hpal, KpnI, Hindlll, Sall i Pstl, wykryto udane sklonowanie. Utworzony tak wektor wymiany (ang. exchange vector) pMAK705ΔpckA (= pMAK705deltapckA), pokazano na Figurze 1.
P r z y k ł a d 3
Specyficzna względem miejsca mutageneza genu pckA w E. coli szczep MG422
E. coli szczep MG442 wytwarzający L-treoninę opisano w US-A-4278765 i zdeponowano w Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, Moskwa, Rosja) jako CMIM B-1628. Szczep MG442 wykazuje oporność na kwas α-amino-e-hydroksywalerianowy i zapotrzebowanie, ewentualnie częściowe i dające się skompensować, na L-izoleucynę.
W celu wymiany chromosomalnego genu pckA na kodowany plazmidem konstrukt delecyjny, MG442 transformowano plazmidem pMAK705ΔpckA. Wymianę genową przeprowadzono metodą selekcyjną opisaną przez Hamiltona i in. [Journal of Bacteriology, 174, 4617 - 4622 (1989)] zweryfikowano standardowymi metodami PCR [Innis i in.: „PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)], z zastosowaniem następujących starterów oligonukleotydowych:
pckA'5'-1: 5' - GATCCGAGCCTGACAGGTTA - 3' pckA'3'-2: 5' - CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA - 3'
Otrzymany szczep oznaczono jako MG442ΔpckA.
P r z y k ł a d 4
Wytwarzanie L-treoniny przy użyciu szczepu MG442ΔpckA
MG442ΔpckA hodowano na pożywce minimalnej o następującym składzie: 3,5 g/litr Na2HPO4 ·
H2O, 1,5 g/litr KH2PO4, 1 g/litr NH4Cl, 0,1 g/litr MgSO4 • 7H2O, 2 g/litr glukozy i 20 g g/litr agaru. Tworzenie L-treoniny sprawdzano w 10 ml hodowlach okresowych znajdujących się w 100 ml kolbach Erlenmeyera. Były one inokulowane 10 ml pożywki do hodowli wstępnej o następującym składzie: 2 g/litr ekstraktu drożdżowego, 10 g/litr (NH4)2SO4, 1 g/litr KH2PO4, 0,5 g/litr MgSO4 • 7 H2O, 15 g/litr CaCO3 i 20 g/litr glukozy, i inkubowane w ciągu 16 godzin, w temperaturze 37°C i przy 180 obr/min, w inkubatorze ESR z firmy Kiihner AG (Birsfelden, Szwajcaria). 250 μl tej hodowli wstępnej przeniesiono do 10 ml pożywki produkcyjnej (25 g/litr ((NH4)2SO4, 2 g/litr KH2PO4, 1 g/litr MgSO4 • 7 H2O, 0,03 g/litr FeSO4 • 7 H2O, 0,018 g/litr MnSO4 • 1 H2O, 30 g/litr CaCO3, 20 g/litr glukozy) i inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37°C. Po inkubacji oznaczono gęstość optyczną (OD) zawiesiny hodowlanej przy użyciu fotometru LP2W z firmy Dr. Lange (Berlin, Niemcy), przy długości fali 660 nm.
Następnie, oznaczono stężenie L-treoniny w supernatancie przesączonej w warunkach jałowych hodowli, przy użyciu analizatora aminokwasów z firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Niemcy) z zastosowaniem chromatografii jonowymiennej oraz pokolumnowej reakcji z detekcją ninhydrynową.
Wynik eksperymentu przedstawiono w Tabeli 1.
T a b e l a 1
Szczep OD (660 nm) L-Treonina (g/litr)
MG442 6,0 1,5
MG442ApckA 5,4 3,7
P r z y k ł a d 5
Wytwarzanie L-treoniny przy użyciu szczepu MG442ΔpckA/pMW218gdhA
5.1 Amplifikacja i klonowanie genu gdhA:
Gen dehydrogenzy glutaminianowej z Escherichia coli K12 amplifikuje się z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i oligonukleotydów syntetycznych. Wychodząc z sekwencji nukleotydowej dla genu gdhA w E. coli K12 MG1655 (biblioteka genów: nr nr dostępu AE000270 i AE000271) zsyntetyzowano startery PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Niemcy):
Gdh1: 5' - TGAACACTTCTGGCGGTACG - 3'
Gdh2: 5' - CCTCGGCGAAGCTAATATGG - 3'
Chromosomowy DNA E. coli K12 MG1655 stosowany w reakcji PCR izoluje się zgodnie z instrukcjami wytwórcy „QIAGEN Genomic-tips 100/G (QIAGEN, Hilden, Niemcy). Fragment DNA o wielkości około 2150 pz, zawierający region kodujący gdhA oraz sekwencję 5'-flankującą (o wielkości około 350 pz) i sekwencję 3'-flankującą (o wielkości około 450 pz) można amplifikować ze specyficznymi starterami w standardowych warunkach PCR [Innis i in.: „PCR Protocols. A Guide to Methods
PL 211 169 B1 and Applications, Academic Press (1990)] z udziałem polimerazy Pfu-DNA (Promega Corporation, Madison, USA). Produkt PCR klonuje się w plazmidzie pCR2.1TOPO i transformuje w E. coli szczep TOP10 (Invitrogen, Leek, Holandia, Product Description TOPO TA Cloning Kit, nr katalogowy K4500-01). Udane sklonowanie wykazuje się przez pocięcie plazmidu pCR2.1TOPOgdhA enzymami restrykcyjnymi EcoRI i EcoRV. W tym celu, plazmidowy DNA izoluje się za pomocą „QIAprep Spin Plasmid Kits (QIAGEN, Hilden, Niemcy) i po pocięciu, rozdziela w 0,8% żelu agarozowym.
5.2 Klonowanie genu gdhA w wektorze plazmidowym pMW218
Plazmid pCR2.1TOPOgdhA tnie się enzymem EcoRI, porcję po pocięciu rozdziela się na 0,8% żelu agarozowym i wyodrębnia fragment gdhA o wielkości 2,1 kpz za pomocą „QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Niemcy). Plazmid pMW218 (Nippon Gene, Toyama, Japonia) tnie się i enzymem EcoRI i liguje z fragmentem gdhA. E. coli szczep DH5a transformuje się porcją po pocięciu, a komórki niosące pMW218 selekcjonuje się przez przeprowadzenie hodowli na agarze LB [Lennox, Virology, 1, 190 (1955)], do którego dodano 20 μg/ml kanamycyny.
Udane klonowanie genu gdhA można zademonstrować po wyizolowaniu plazmidowego DNA i kontrolnym cięciu EcoRI i EcoRV. Otrzymany plazmid został nazwany pMW218gdhA (Figura 3).
5.3 Otrzymywanie szczepu MG442ΔpckA/pMW218gdhA
Szczep MG442ΔpckA otrzymany w Przykładzie 3 i szczep MG442 transformuje się plazmidem pMW218gdhA, a transformanty selekcjonuje się na agarze LB, uzupełnionym 20 μg/ml kanamycyny. W ten sposób otrzymuje się szczepy MG442ΔpckA/pMW218gdhA i MG442/pMW218gdhA.
5.4 Wytwarzanie L-treoniny
Wytwarzanie L-treoniny przez szczepy MG442ΔpckA/pMW218gdhA i MG442/pMW218gdhA testuje się sposobem opisanym w Przykładzie 4. Pożywkę minimalną i pożywkę do hodowli wstępnej dodatkowo uzupełnia się 20 μg/ml kanamycyny.
Otrzymane wyniki eksperymentu podsumowano w poniższej Tabeli 2.
T a b e l a 2
Szczep OD (660 nm) L-Treonina (g/litr)
MG442 6,0 1,5
MG442ApckA 5,4 3,7
MG442/pMW218gdhA 5,6 2,6
MG442ApckA/pMW218ghdhA 5,5 4,0
P r z y k ł a d 6
Wytwarzanie L-treoniny ze szczepem MG442ΔpckA/pMW219rhtC
6.1 Amplifikacja genu rhtC
Gen rhtC z Escherichia coli K12 amplifikuje się stosując reakcję łańcuchowej polimerazy i syntetyczne oligonukleotydy. Wychodząc od sekwencji nukleotydowej dla genu rhtC w E. coli K12 MG1665 {biblioteka genów: nr dostępu AE000458, Zakataeva i in. [FEBS Letters, 452, 228 - 232 (1999)]}, syntetyzuje się startery PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Niemcy):
RhtC1: 5' - CTGTTAGCATCGGCGAGGCA - 3'
RhtC2: 5' - GCATGTTGATGGCGATGACG - 3'
Chromosomowy DNA E. coli K12 MG1655 stosowany w reakcji PCR izoluje się zgodnie z instrukcjami wytwórcy „QIAGEN Genomic-tips 100/G (QIAGEN, Hilden, Niemcy). Fragment DNA o wielkości około 800 pz, można amplifikować ze swoistymi starterami w standardowych warunkach PCR [Innis i in.: „PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)] z udziałem polimerazy Pfu-DNA (Promega Corporation, Madison, USA).
6.2 Klonowanie genu rhtC w wektorze plazmidowym pMW219
Plazmid pMW219 (Nippon Gene, Toyama, Japonia) tnie się enzymem Sam I i liguje z fragmentem rhtC-PCR. Szczep DH5a E. coli transformuje się porcją po cięciu, a komórki niosące pMW219 selekcjonuje się na agarze LB, uzupełnionym 20 μg/ml kanamycyny.
Udane klonowanie można zademonstrować po wyizolowaniu plazmidowego DNA i kontrolnym cięciu KpnI, Hindlll i Ncol. Otrzymany plazmid pMW219rhtC przedstawiono na Figurze 4;
6.3 Otrzymywanie szczepu MG442ΔpckA/pMW219rhtC
Szczep MG442ΔpckA otrzymany w Przykładzie 3 i szczep MG442 transformuje się plazmidem pMW219rhtC, a transformanty selekcjonuje się na agarze LB, uzupełnionym 20 μg/ml kanamycyny.
PL 211 169 B1
W ten sposób tworzą się szczepy MG442ΔpckA/pMW219rhtC i MG442/pMW219rhtC.
6.4 Wytwarzanie L-treoniny
Wytwarzanie L-treoniny przez szczepy MG442ΔpckA/pMW219rhtC i MG442/pMW219rhtC testuje się, jak opisano w Przykładzie 4. Pożywkę minimalną i pożywkę do hodowli wstępnej dodatkowo wzbogaca się 20 μg/ml kanamycyny.
Wyniki eksperymentu podsumowano w Tabeli 3.
T a b e l a 3
Szczep OD (660 nm) L-Treonina (g/litr)
MG442 6,0 1,5
MG442ApckA 5,4 3,7
MG442/pMW219rhtC 5,2 2,9
MG442ApckA/pMW219rhtC 4,8 4,4
P r z y k ł a d 7
Wytwarzanie L-treoniny przy użyciu szczepu B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40
Szczep E. coli B-3996 wytwarzający L-treoninę opisano w US-A-5175107 i zdeponowano w Russian National Collection for Industrial Microorganisms (VKPM, Moskwa, Rosja) pod numerem dostępu CMIM B-1628.
Szczep B-3996 wykazuje, między innymi, oporność na kwas a-amino-e-hydroksywalerianowy, zawiera atenuowaną, zwłaszcza wyłączoną, lub defektywną dehydrogenzę treoninową, wzmocnioną dehydrogenazę homoserynową I - kinazę asparaginianową I w postaci opornej na mechanizm zwrotny i ewentualnie częściowe i dające się skompensować zapotrzebowanie na L-izoleucynę, oraz zdolność do wykorzystywania sacharozy.
7.1 Otrzymywanie szczepu B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40
Po hodowli w wolnej od antybiotyków kompletnej pożywce przez około 10 pokoleń, izoluje się pochodną szczepu B-3996 niezawierającą już dłużej plazmidu pVIC40. Powstały szczep jest wrażliwy na streptomycynę. Został on oznaczony B-3996kur.
Do włączenia delecji do genu tdh użyto metody opisanej przez Hamiltona i in. [Journal of Bacteriology, 171, 4617 - 4622 (1989)], opartej na zastosowaniu plazmidu pMAK705 z termowrażliwym replikonem. Plazmid pDR121 [Ravnikar i Sommerville, Journal of Bacteriology, 169, 4716 - 4721 (1987)] zawiera fragment DNA z E. coli o wielkości 3,7 kilo par zasad (kpz), na którym kodowany jest gen tdh. W celu wytworzenia delecji regionu genu tdh, pDR121 tnie się enzymami restrykcyjnymi Clal i EcoRV i wyizolowany fragment DNA o wielkości 5 kpz poddaje ligowaniu po obróbce enzymem Klonowa. Porcją po ligowaniu transformuje się komórki E. coli szczep DH5a, a komórki niosące plazmid selekcjonuje się na agarze LB, do którego dodano 50 μg/ml ampicyliny.
Udaną delecję genu tdh można zademonstrować po wyizolowaniu plazmidowego DNA i kontrolnym pocięciu przez EcoRI. Izoluje się fragment EcoRI o wielkości 1,7 kpz i liguje z plazmidem pMAK705, częściowo strawionym EcoRI. Porcję po licowaniu transformuje się w DH5a, a komórki niosące plazmid selekcjonuje na agarze LB, do którego dodano 20 μg/ml chloramfenikolu. Udane klonowanie demonstruje się po wyizolowaniu plazmidowego DNA i pocięciu EcoRI. Utworzoną tak pochodną pMAK705 oznaczono pDM32.
W celu zastąpienia genu, B-3996kur transformuje się plazmidem pDM32. Zastąpienie chromosomowego genu tdh kodowanym przez plazmid konstruktem delecyjnym przeprowadza się na drodze procesu selekcyjnego opisanego przez Hamiltona i in. i weryfikuje typowymi metodami PCR [Innis i in.:PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)], z następującymi starterami oligonukleotydowymi:
Tdh1: 5'-TCGCGACCTATAAGTTTGGG - 3'
Tdh2: 5'-AATACCAGCCCTTGTTCGTG - 3'.
Utworzony tak szczep testuje się pod względem wrażliwości na kanamycynę I oznacza się B-3996kur.\tdh.
W celu przeprowadzenia specyficznej względem miejsca mutagenezy genu pckA, B-3996kur.\tdh transformuje się wektorem zastąpienia pMAK705ΔpckA opisanym w powyższym Przykładzie 2. Zastąpienie chromosomowego genu pckA kodowaną przez plazmid konstrukcją delecyjną przeprowadza się sposobem opisanym w Przykładzie 3. Otrzymany szczep został nazwany B-3996kurΔtdhΔpckA.
PL 211 169 B1
B-3996kur.\tdh i B-3996kurΔtdhΔpckA transformuje się plazmidem pVIC40 wyizolowanym z B-3996, a komórki niosące plazmid selekcjonuje się na agarze LB, do którego dodano 20 μg/ml streptomycyny.
W każdym przypadku, wyselekcjonowaną pojedynczą kolonię nazywa się B-3996kurAtdh/pVIC40 i B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40.
7.2 Wytwarzanie L-treoniny
Wytwarzanie L-treoniny przez szczepy B-3996kurAtdh/pVIC40 i B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40 testuje się sposobem opisanym w Przykładzie 4. Pożywkę minimalną, pożywkę do hodowli wstępnej i pożywkę produkcyjną dodatkowo uzupełniono 20 μg/ml streptomycyny.
Otrzymane wyniki eksperymentu podsumowano w Tabeli 4.
T a b e l a 4
Szczep OD (660 nm) L-Treonina (g/litr)
B-3996kurAdth/pVIC40 4,7 6,26
B-399kurAtdhApckA/pVIC40 4,9 8,92
P r z y k ł a d 8
Wytwarzanie L-lizyny przy użyciu szczepu TOC21RΔpckA
Szczep pDA1/TOC21R E. coli wytwarzający L-lizynę opisano w zgłoszeniu patentowym F-A-2511032 i zdeponowano w Collection Nationale de Culture de Microorganisme (CNCM = National Microorganism Culture Collection, Pasteur Institute, Paryż, Francja) pod numerem dostępu I-167. Szczep i nie zawierający plazmidu gospodarz zostali także opisani przez Dauce-Le Reverend i in. [European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 15, 227 - 231 (1982)] pod nazwą TOCR21/PDA1 tj. TOCR21/pDA1.
8.1 Specyficzna względem miejsca mutageneza genu pckA w szczepie TOC21R E. coli
Po hodowli w niezawierającej antybiotyków kompletnej pożywce LB przez mniej więcej 6 pokoleń, izoluje się pochodną szczepu pDA1/TOC21R niezawierającą już więcej plazmidu pDA1. Powstały szczep jest wrażliwy na tetracyklinę i został nazwany TOC21R. W celu zastąpienia chromosomowego genu pckA kodowany plazmidem konstrukt delecyjny, TOC21R transformuje się plazmidem pMAK705ΔpckA (Przykład 2). Zastąpienie genu przeprowadza się metodą selekcyjną opisaną przez Hamiltona i in. [Journal of Bacetriology, 174, 4617 - 4622) (1989)] i weryfikuje standardowymi metodami PCR [Innis i in.: „PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)], z następującymi starterami oligonukleotydowymi:
pckA'5'-1: 5' - GATCCGAGCCTGACAGGTTA - 3' pckA'3'-2: 3' -CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA - 3'
Otrzymany szczep został nazwany TOC21RΔpckA.
8.2 Wytwarzanie L-lizyny przy użyciu szczepu TOC21RΔpckA
Tworzenie L-lizyny przez szczepy TOC21RΔpckA i TOC21R sprawdza się w 10 ml hodowlach okresowych znajdujących się w 100 ml kolbach stożkowych. W tym celu, inokuluje się 10 ml pożywki do hodowli wstępnej o następującym składzie: 2 g/litr ekstraktu drożdżowego, 10 g/litr (NH4)2SO4, 1 g/litr KH2PO4, 0,5 g/litr MgSO4 • 7 H2O, 15 g/litr CaCO3 i 20 g/litr glukozy i przeprowadza inkubację w ciągu 16 godzin, w temperaturze 37°C i przy 180 obr/min, w inkubatorze ESR z firmy Kiihner AG (Birsfelden, Szwajcaria). 250 μl tej hodowli wstępnej przeszczepia się do 10 ml pożywki produkcyjnej o następującym składzie: 25 g/litr (NH4)2SO4, 2 g/litr KH2PO4, 1 g/litr MgSO4 • 7 H2O, 0,03 g/litr FeSO4 • 7 H2O, 0,018 g/litr MnSO4 • 1 H2O, 30 g/litr CaCO3, 20 g/litr glukozy, 25 mg/litr L-izoleucyny i 5 mg/litr tiaminy i przeprowadza inkubację w ciągu 72 godzin w temperaturze 37°C. Po zakończeniu inkubacji, oznacza się gęstość optyczną (OD) zawiesiny hodowli przy użyciu fotometru LP2W z firmy Dr. Lange (Berlin, Niemcy), przy długości fali 660 nm.
Następnie, oznacza się stężenie L-lizyny w supernatancie przesączonej w warunkach jałowych hodowli, przy użyciu analizatora aminokwasów z firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Niemcy) z zastosowaniem chromatografii jonowymiennej oraz pokolumnowej reakcji z detekcją ninhydrynową.
Otrzymane wyniki eksperymentu przedstawiono w poniższej Tabeli 5:
T a b e l a 5
Szczep OD (660 nm) L-Treonina (g/litr)
TOC21R 1,0 1,14
TOC21RApckA 1,0 1,27
PL 211 169 B1
P r z y k ł a d 9
Wytwarzanie L-izoleucyny przy użyciu szczepu B-3996kurΔtdhilvaA+ΔpckA/pVIC40
9.1 Wytwarzanie szczepu B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA/pVIC40
Szczep B-3996kur.\tdh, wykazujący zapotrzebowanie na L-izoleucynę, otrzymany w Przykładzie 7.1, poddaje się transdukcji przy pomocy faga P1kc [Lennox, Virology, 1, 190 -206 (1955); Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)], po czym wyodrębnia się transduktanty L-izoleucynoprototrofowe.
W tym celu, faga P1kc namnaża się na szczepie MG1655 [Guer i in..Cold Spring Harbor Symposium of Quantitative Biology, 45, 135 - 140 (1981); Blattner i in., Science, 277, 1453 -1462 (1997)] lizat fagowy wykorzystuje się do transdukcji szczepu B-3996kur.\tdh. Wielokrotność zakażenia wynosi w przybliżeniu 0,2. Selekcję na transduktanty L-izoleucynoprototropowe przeprowadza się na agarze minimalnym, zawierającym 2 g/litr glukozy i 10 mg/litr L-treoniny. Wyodrębnia się transduktant L-izoleucynoprototrofowy, po czym rozprowadza (rozsmarowuje) na agarze LB w celu oczyszczenia i izolacji. Został on nazwany B-3996kur.\tdhilvA7
Następnie, gen pckA szczepu B-3996kur.\tdhilvA' zastępuje się, jak opisano w Przykładzie 3, allelem ΔpckA, wytworzonym w Przykładzie 1 i 2. Otrzymany tak szczep został nazwany B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA.
Szczepy B-3996kur.\tdhilvA' i B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA transformuje się plazmidem pVIC40 wyizolowanym ze szczepu B-3996, a komórki niosące plazmid selekcjonuje się na agarze LB, uzupełnionym 20 μg/ml streptomycyny. W każdym przypadku wyselekcjonowana pojedyncza kolonia jest nazwana B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA/pVIC40 i B-3996kur.\tdhilvA7pVIC40.
9.2 Wytwarzanie L-izoleucyny
Wytwarzanie L-izoleucyny przy użyciu szczepów B-3996kur.\tdhilvA7pVIC40 i B-3996kur.\tdhilvA+Δpck-A/pVIC40 przetestowano sposobem opisanym w powyższym Przykładzie 4. Pożywkę minimalną, pożywkę do hodowli wstępnej i pożywkę produkcyjną dodatkowo uzupełniono 20 μg/ml streptomycyny.
Otrzymane wyniki eksperymentu przedstawiono w poniższej Tabeli 6.
T a b e l a 6
Szczep OD (660 nm) L-Treonina (g/litr)
B-3996kurAtdhilvA+/pVIC40 5,8 57
B-3996kurAtdhilvA+ApckA/pVIC40 5,7 70
P r z y k ł a d 10
Wytwarzanie L-waliny przy użyciu szczepu B-12288ΔpckA
E. coli szczep AJ 11502 wytwarzający L-walinę jest opisany w dokumencie patentowym US-A4391907 i zdeponowany w National Center for Agricultural Utilization Research (Peoria, Illinois, USA) jako NRRL B-12288.
10.1 Specyficzna względem miejsca mutageneza genu pckA w E. coli szczep B-12288
Po hodowli w niezawierającej antybiotyków pożywce LB przez w przybliżeniu 6 pokoleń, izoluje się niezawierającą plazmidu pochodną szczepu AJ 11502. Powstały szczep jest wrażliwy na ampicylinę. Został on nazwany AJ11502kur. W celu zastąpienia chromosomowego genu pckA kodowanym plazmidem konstruktem delecyjnym, AJ11502kur transformuje się plazmidem pMAK705ΔpckA (patrz Przykład 2). Zastąpienie genu przeprowadza się metodą selekcyjną opisaną przez Hamiltona i in. [Journal of Bacteriology, 174, 4617 - 4622) (1989)] i weryfikuje standardowymi metodami PCR [Innis i in.: „PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)], z następującymi starterami oligonukleotydowymi:
pckA'5'-1: 5' - GATCCGAGCCTGACAGGTTA - 3' pckA'3'-2: 5' - CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA - 3'
Otrzymany szczep został nazwany AJ11502kur.\pckA.
Ze szczepu NRRL B-12288 izoluje się plazmid opisany w US-A-4391907, niosący informację genetyczną dotyczącą wytwarzania waliny. Plazmidem tym transformuje się szczep AJ11502kur.\pckA. Jeden z otrzymanych transformantów został nazwany B-12288ΔpckA.
10.2 Wytwarzanie L-waliny przy użyciu szczepu B-12288ΔpckA Tworzenie L-waliny przez szczepy B-12288ΔpckA i NRRL B-12288 sprawdzano w 10 ml hodowlach okresowych znajdujących się w 100 ml kolbach stożkowych. W tym celu, zainokulowano 10 ml pożywki do hodowli wstępnej o następującym skłaPL 211 169 B1 dzie: 2 g/litr ekstraktu drożdżowego, 10 g/litr (NH4)2SO4, 1 g/litr KH2PO4, 0,5 g/litr MgSO4 • 7H2O, 15 g/litr CaCO3, 20 g/litr glukozy i 50 mg/litr ampicyliny, i przeprowadzono inkubację w ciągu 16 godzin, w temperaturze 37°C i przy 180 obr/min, w inkubatorze ESR z firmy Kiihner AG (Birsfelden, Szwajcaria). 250 μl tej hodowli wstępnej przeszczepiono do 10 ml pożywki produkcyjnej o następującym składzie: 25 g/litr (NH4)2SO4, 2 g/litr KH2PO4, 1 g/litr MgSO4 • 7H2O, 0,03 g/litr FeSO4 • 7 H2O, 0,018 g/litr MnSO4 • 1 H2O, 30 g/litr CaCO3, 20 g/litr glukozy, 5 mg/litr tiaminy i 50 mg/litr ampicyliny) i przeprowadzono inkubację w ciągu 72 godzin w temperaturze 37°C. Po inkubacji, oznaczono gęstość optyczną (OD) zawiesiny hodowli przy użyciu fotometru LP2W z firmy Dr. Lange (Berlin, Niemcy), przy długości fali 660 nm.
Następnie, oznaczono stężenie L-lizyny w supernatancie przesączonej warunkach jałowych hodowli, przy użyciu analizatora aminokwasów z firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Niemcy) z zastosowaniem chromatografii jonowymiennej oraz pokolumnowej reakcji z detekcją ninhydrynową.
Wyniki eksperymentu przedstawiono w Tabeli 7.
T a b e l a 7
Szczep OD (660 nm) L-Treonina (g/litr)
NRRL B-12288 5,6 0,93
B-12299ApckA 5,5 1,12
P r z y k ł a d 11
Wytwarzanie L-treoniny przy użyciu szczepu MG442Δ90yjfAΔpckA
11.1 Otrzymywanie szczepu MG442Δ90yjfAΔpckA
Gen pckA szczepu MG442Δ90yjfA zastępuje się, jak opisano w powyższym Przykładzie 3, allelem ΔpckA (patrz Przykłady 1 i 2 powyżej). Otrzymany szczep został nazwany MG442Δ90yjfAΔpckA
11.2 Wytwarzanie L-treoniny
Wytwarzanie L-treoniny przy użyciu szczepu MG442Δ90yjfAΔpckA przeprowadza się, jak opisano w powyższym Przykładzie 4.
Wynik przedstawiono w poniższej Tabeli 8.
T a b e l a 8
Szczep OD (660 nm) L-Treonina (g/litr)
MG442A90yjfA 5,7 2,1
MG442A90yjfAApckA 5,3 3,9
Krótki opis figur • Figura 1: pMAK705ΔpckA ( = pMAK705deltapckA) • Figura 3: pMW218gdhA • Figura 4: pMW2 1 9rhtC • Figura 5: pMAK705Δ90bp ( = pMAK705delta90bp)
Dane dotyczące długości należy rozumieć jako dane przybliżone.
Użyte skróty i oznaczenia mają następujące znaczenie:
• cat: gen oporności na chloramfenikol • rep-ts: termowrażliwy region replikacji plazmidu pSC101 • pck1: część regionu 5' genu pckA • pck2: część regionu 3' genu pckA • ytfP'-yjfA': sekwencja DNA zawierająca skrócone regiony kodujące ytfP i yjfA • kan: gen oporności na kanamycynę • gdhA: gen dehydrogenzy glutaminianowej • rhtC: gen nadający odporność na treoninę
Skróty odnoszące się do enzymów restrykcyjnych mają następujące znaczenie:
• BamHI: endonukleaza restrykcyjna z Bacillus amyloliquefaciens • Bglll: endonukleaza restrykcyjna z Bacillus globigii • Clal: endonukleaza restrykcyjna z Caryphanon latum • EcoRI: endonukleaza restrykcyjna z Escherichia coli • EcoRV: endonukleaza restrykcyjna z Escherichia coli • Hindlll: endonukleaza restrykcyjna z Haemophilus influenzae
PL 211 169 B1 • KpnI: endonukleaza restrykcyjna z Klebsiella pneumoniae • Pstl: endonukleaza restrykcyjna z Providencia stuartii • Pvul: endonukleaza restrykcyjna z Proteus vulgaris • SacI: endonukleaza restrykcyjna ze Streptomyces achromogenes • Sall: endonukleaza restrykcyjna ze Streptomyces albus • Smal: endonukleaza restrykcyjna z Serratia marcescens • Xbal: endonukleaza restrykcyjna z Xanthomonas badrii • Hhol: endonukleaza restrykcyjna z Xanthomonas holcicola
Wykaz sekwencji <110> Degussa AG <120> Proces fermentacyjny przeznaczony do wytwarzania L aminokwasów przy użyciu szczepów z rodziny Enterobacteriaceae <130> 000425 BT <140>
<141>
<160> 19 <170> Patentln Ver. 2.1
PL 211 169 B1
<210> 1
<211> 1622
<212> DNA
<213> Escherichi a
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1620)
<22 3 > pckA
<jOC> 1 atg cgc gtt aac aat ggt ttg acc oog oaa gaa ctc gag gct tat ggt 48
Itat Arg Val Aan Aan Gly Laa Thr pro Gin Glu Leu Gla Me Tyr Gly
5 10 15 atc agt gac gta cat gat atc gtt tac aac coa agc tac gac ctg ctg 96
Ha Ser .Aap Tal Kia Aap Ile Val Tyr Aan Pro Ser Tyr Am Laa Leu
25 30 tat cag gaa gag ctc gat ccg agc ctg aca ggt tat gag cgc ggg gtg 144
Tyr Gin Glu Glu Lau Aap Pro Sar Lau Thr Gly Tyr Glu Ara Gly T*1
40 45 tta act aat ctg ggt gcc gtt gcc gte gat acc ggg ato ttc acc ggt 192
Lau Thr Aan Lau Gly Ala Tal Ala Tal Aap Thr Gly Ile Pha Thr Gly
55 60 cgt tca cca aa* gat aag tat atc gte cgt gac gat acc act ogc gat 240
Arg Sar Pro Lya Aap Ly* Tyr Ile Tal Arg Aap Aap Thr Thr Arg Aap «5 70 75 B0 ct tto tgg tgg gca gac aa* ggc aaa ggt aag aac gac aac aaa cct 288
Thr Pba Trp Trp Ala Aap Lya Gly Lya Gly Lya Aan Aap Aan Lya Pm
BS 90 95 ctc tct oog gaa aoo tgg oag cat ctg aa* ggc ctg gtg aca agg oag 356
Lau Sar Pro Gin Thr Trp Gin Kia Lau Lya Gly Lau Tal Thr Arg Gla
100 105 no ctt .toc ggc aaa cgt ctg ttc gtt gte gac get ttc tgt ggt gog ano 384
Lau Sar Gly Lya Arg Lau Pha Tal Tai Aap Ala Pha Cya GlyAla Aaa
115 120 125
PL 211 169 B1
ccg gat act' cgt ctt tcc gtc cgt ttc
Pro Aep 130 Thr Arg Leu Ser Tal 135 Arg Phe
gcg cat ttt gtc aaa aac atg ttt •tt
Ala 145 His Phe Tal Lys Asn 150 Met Phe ile
gca ggt ttc aaa cca gac ttt atc gtt
Ala Gly Phe Lys Pro 165 Asp Phe Ile Tal
aac ccg cag tgg aaa gaa cag ggt ctc
Aen Pro Gin Trp 1B0 Lys Glu Gin Gly Leu 185
ttt aac ctg acc gag cgc atg cag ctg
Phe Aen Leu 195 Thr Glu Arg Met Glu 200 Leu
ggc gea atg e&g aaa ggg atg ttc tcg
Gly Glu 210 Met Lys Lys Gly Met 215 Phe Ser
ctg aaa ggt atc gct tct •tg cac tgc
Lec 225 Lye Gly Ile Ala Ser 230 Met Bis Cye
ggc gat gtt gcg gtg ttc ttc ggc ctt
Sly Aep Tal Ala Tal 245 Phe Phe Gly Leu
Ctt te» acc gac cag aaa cgt cgc ctg
Leu Ser Thr Asp 260 Pro Lys Arg Arg Leu 265
tgg gac gat gac ggc gtg ttt aaa ttc
Trp Aep Aep 275 Aep Gly Tal Phe Asn 280 Phe
act atc aag ctg tcg aaa g*« gcg gu
Thr U* 290 Lya Leu Ser Lys Glu Ala 295 Glu
egt cgt gat gag ttg ctg gaa aac ctc
Arg 305 Arg Asp Ala Leu Leu 310 Glu Aon Tal
atc gac ttt g»t gat ggt tca aaa aca
11« A*p Phe Asp Asp Gly Ser Lys 325 Thr
oog atc tat cac atc gat aaa •tt gtt
Pro 11« Tyr His 340 Ile A*p Asa Ile Tal 345
caa ,gcg act aag gtt atc tto atg «ct
Bi· Ala Thr 355 Lys Tal Ile Phe Leu 360 Thr
atc acc Ile Thr gaa gtg gcc tgg cag 432
Glu Tal 140 Ale Trp Gin
cgc cog agc gat gaa gaa ctg 480
Arg Pro Ser Asp Glu Glu Leu
155 160
atg aac ggc gcg aag tgc act 528
Ket Asn Gly Ala Lys Cys Thr
170 175
aac tcc gaa aac ttc gtg gcg 576
Asn Ser Glu Asn Phe Tal Ala
190
att ggc ggc acc tgg tac ggc 624
Ile Gly Gly Thr Trp Tyr Gly
205
atg atg aac tac ctg ctg ccg 672
Met Met Aen Tyr Leu Leu Pro
220
tcc gcc aac gtt ggt gag aaa 720
ser Ala Aen Tal Gly Glu Lya
235 240
tcc ggc aoo ggt aaa acc acc 768
Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr
250 255
•tt ggc gat gac g*« cac ggc 816
Ile Gly Asp Asp Glu Bis Gly
270
g*· gga ggc tgc tac gca aaa 864
Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys
285
OCt gaa atc tac aac gct ata 912
Pro Glu Ile 300 Tyr Asn Ala Ile
acc gtg cgt gaa gat ggc «ct »60
Thr Tal Arg Glu Aep Gly Thr.
315 320
g*g aaa acc cgc gtt tct tat 1008
Glu Asn thr Arg Tal Sar Tyr
330 335
aag ccg gtt taa aa* gog gga 105«
Lys Pro Tal Ser Lye Ala Gly 350
gct gat gct ttc ggc gtg ttg 1104
Ala Asp Ala Ehe Gly Tal Leu
365
PL 211 169 B1
ccg ccg gtt tet ega ctg act gcc gat
Pro Pro v*l 370 Ser Arg Leu Thr Ala Asp 375
tet ggc ttc acc gcc aaa ctg gcc ggt
Ser Gly Phe Thr Ala Lya Leu Ala Gly
305 390
ccg acg cca acc ttc tcc get tgc ttc
Pro Thr Pro Thr Phe 405 Ser Ala cys Phe
cac ccg act cag tac gca gaa ctg ctg
flis Pro Thr Gln Tyr Ala Glu Val Leu
420 425
ggc gcg cag get tat ctg gtt aac act
Gly Ala Gln Ala Tyr Leu Val Aan Thr
435 440
ogt atc teg att aaa gat acc ege gcc
Arg Ile Sar Ile Lys Aap Thr Arg AU
«50 455
ggt teg ctg gat aat gca «aa aca ttc
Gly Sar Leo Λαρ Asn Ala Glu Thr Phe
465 470
gcg atc cca acc gaa ctg cag ggc eta
Ala Ile Pro Thr Glu Leu Pro Gly Val
483
ogt aac acc t*c get tat ccg gaa cag
Arg Aaa Thr Tyr Ala Ser Pro Glu Gln
500 505
ctg gcg aaa atg ttt atc gaa aac ttc
Leo Ala Lys Len Phe Ile Asp Aan Phe
515 520
gag ggt gcc gag ctg gta gag get ggt
Ala Gly Ala Ala ira Val Ala AU Gly
530 533
caa acc cag tat cac ttc ctc 1152
Gin Thr Gln 380 Tyr His Phe Lau
act gag cgt ggc ate acc gaa 1200
Thr Glu Arg Gly Ile Thr Glu
395 400
ggc gcg gca ttc ctg tog ctg 1248
Gly Ala AU Phe Lau Ser Leu
410 415
gtg aaa ogt atg cag gcg gag 1296
Val Lys Arg Met Gln Ala Ala
430
ggc tgg aac ggc act ggc eaa 1344
siy Trp Aan Gly Thr Gly Lys
445
att ato gac gcc atc eta aec 1392
Ile He Αβρ AU Ile Leu Asa.
460
act ctg ccg atg ttt esc ctg 1440
Thr Leo Pro Met Phe Asn Leu
475 480
gac aog aag att ctc gat ccg 1488
Asp Thr Lys Ile Leu Asp pro
490 495
tgg cag gaa aea goc gaa soo 1536
Trp Gln Olu Lys AU Glu Thr
510
gat aaa tac acc gac acc oet 1584
Aep Lya Tyr Thr Asp Thr Pro
52S
oog aaa ctg ta* 1623
Pro Lys Leu
540
<210> Z
<211> 540
<212> PRT
<213> Escherichia
<4C0> 2
Met Arg V*1 Am Am CJy Lea Thr Pro 1 5
II· Bar Asp Vel pis ASp II· Tal Tyr
25
Tyr fiin Olu Glu hen Asp PrP Sar Leu 35 40
Gln Glu Aaa βία Ala Tyr Gly 10 15
Am Pro Sar Tyr Asp Ira tra 30
Thr Gly Tyr βία Arg Sly Tal 45
PL 211 169 B1
Leu Thr Asn 50 Leu Gly Ais Yal Ais Yal 55 Asp Thr Gly Ile Phe 80 Thr Gly
Arg Ser Pro Lys Aap Lye Tyr Ile Val Arg Asp Asp Thr Thr Arg Aap
os 70 75 80
Thr Phe Trp Trp Ais Asp Lys Gly Lys Gly Lys Asn Asp Asn Lya Pro
05 90 95
Leu Ser Pro Glu Thr Trp Gin His Len Lya Gly Len Yal Thr Arg Gin
100 105 110
Leu Ser Gly Lys Arg Leu Phe Yal Yal Asp Ala Phs Cys Gly Ala Asn
115 120 125
Pro Asp Thr Arg Len Ser Ysl Arg Phe Ile Thr Glu Ysl Ais Trp Gin
130 135 140
Ala His Phe Val Lys Asn Met Phe lis Arg Pro Ser Asp Glu Glu Leu
145 150 155 180
Ala Gly Phe Lys Pro Asp Phs ile Ysl Met Asn Gly Ais Lye Cys Thr
1SS 170 17S
Asa Pro Gin Trp Lys Glu Gin Gly Leu Asn Ser Gin Asn Phs Ysl Ala
180 105 190
Phe Asn Len Thr Glu Arg Mat Gin Len II* Gly Gly Thr Trp Tyr Gly
195 200 205
Gly Gin Met Lys Lys Gly Mat Phe Ser Met Met Asn Tyr Lec Leu Pro
210 215 220
Leu Lys Gly Ile Ala Ser Mat Bis Cys Ser Ais Asn Ysl Gly Glu Ly·
225 230 23$ 240
Gly Asp val Ais Yal Phe Phe Gly Len Ser Gly nar Gly Lys Thr Thr
245 250 255
Leu Ser Thy Asp Pro Lys Arg Arg Leo lis Gly Aap Asp Glu Bis Gly
280 285 270
Trp Aap Asp Asp dy v<l Pha Asn Phe Siu Gly dy Cys Tyr Al· Lys 275 280 285
Thr II· Ly» L»u α·κ Lys Gin Al· Gin Pro Gin Ile Tyr Asn Ais 11« 290 285 300
Arg Arg Aap Ais Leu Lsa Gin Asn Yal Thr Yhl Atu Gin Jto Gly Thr
W 310 315 320
II· Asp Ehe Asp Asp Gly B«r Lys Thr Gin Asa Thr Arg Ysl Ser Tyr
325 330 335
Pro II· Tyr ais il· Aap Asn lis Yal Ly· Pro vai Sar Lys Ala Gly 340 345 350
Hia Ais Thr ly» Ysl II· Pb· Ln Thr Ala Aap Ais Pha Gly Yal Len 355 380 385
PL 211 169 B1
Pro ETO Vnl 310 Ser Arg Leu Thr Ala Aap Gln Thr Gln Tyr Sie Phe Leu
375 380
Ser Gly Phe 385 Thr Ale Lys Leu 390 Ala Gly Thr Glu Arg Gly Ile Thr Glu 395 400
Pro Thr Pro Thr Phe 405 Ser Ala Cys Phe Gly Ala Ala Phe Leu Ser Leu 410 415
Kie Pro Thr Glu Tyr 420 Ala Glu Tal Leu Val Lys Arg Met Gln Ala Ala 425 430
Gly Ala Gln 435 Ala Tyr Leu Vel Asn Thr Gly Trp Aen Gly Thr Gly Lys 440 445
Arg Ile Ser 450 Ile Lye Aap Thr 455 Arg Ala Ila Ile Asp Ala Zle Leu Aaa 4€0
Gly Ser Leu US Aap Am Ala Glu 410 Thr Phe Thr Leu Pro Met Pbe Aen Leu 475 490
Ala XI· Ρ» Thr Glu 485 Leu Pro Gly Val Aap Thr Lys Ile Leu Asp Pro 490 495
Arg Am Thr Tyr Ale 500 Ser Pro Olu Sin Trp Gln Glu Lys Ale Glu Thr 50S 510
Leu Al* Lye Leu Phe 515 Ala Gly Ale Ala Leu Ile Aap Am Phe Aep Lys Tyr Thr Aap Thr Pro 520 525 Val Ala Ala Gly Pro Lye Leu
530 535 540 <210> 3 <211> 1156 <212> DNA <213> Escherichia coli <22 0?· (221> misc_featnre <22ϋ> (1) . . (1156) <2 23> DNA rnuLagenny <220>
(221> misc_feature <22 02> (1)..(35) <223.< DNA techniczny / res ety sekwencji polilinkera <220??
(221?? misc__feature <220> (36)..(522) <223> część regionu 5' (pckl) genu pckA <2 2 0??
(221> misc feature <22 0> ( 52 ;£)..( 5 4 2 )
PL 211 169 B1 <223> i.echuiczny DNA/reszty sekwencji polilinkera <2 20<
(221> miso feature <222< GO . . (1105) <223> część regionu 3' (pck2) genu pckA <220 <221 > rr.isc feature <220 ' 1106! - - : U 56/ <223> DNA techniczny/roszty sekwencji polilinkera citagtaacgg cegceagtgt gctggaattc ggcttgatcc gagcetga.ee ggttatgage 60 gcggggtgtt aactaatctg ggtgccgttg ccgtcgatac cgggatcttc accggtcgtt 120 caccaaaaga taagtatatc gtccgtgaog ataecactcg egataettte tggtgggeag 160 acaaaggcaa aggtaagaac gacaacaaac etctctctec ggaaacctgg cageatetga 240 aaggcetggt gaccaggcag ctttccggca aaogtctgtt cgttgtcgac gctttctgtg 300 gtgogaacce ggatactcgt ctttcegtee gttteatcac cgaagtggcc tggcaggcgo 360 ®ttttgtcaa aaacatgttt attegeoega gcgatgaaga actggeaggt ttcaaaoeag 420 actttatcgt tatgaaoggc gegaagtgca ctaacccgca gtggaaagaa eagggtctca 460 aetccg&aaa ettcgtggeg tttaacctga cogagcgeat gcaagocgaa ttctgeagat 540 cctgaagatg gcactatega etętgatgat ggtteaaaaa cogagaacac cegcgtttct 600 tatccgatct atcacatcga taacattgtt aagccggttt ccaaagoggg ccaogcgact 660 aaggttatct tcctgactge tgatgctttc ggcgtgttgc cgceggtttc tegectgaet 720 gccgateaaa cecagtatca cttcctctct ggcttcaeeg ccaaactggc cggtaetgag 760 cgtggcatc* cogaacegae gccaaocttc tccgcttgct teggegegge attcotgtcg 040 etgcacecga ctcagrtacge agaagtgctg gtgaaacgta t gca ggc ggc gggcgcgcag 900 gcttatctgg ttaacactgg ctggaacggc aetggaaaae gtatetegat taaagataec 960 cgcgccatta -togacgceat cetcaaeggt tegctggata atgeagaaac ettcaotctg 1020 ccgatgttta acctggegat cccaacegaa ctgeegggcg tagacacgaa gattetegat 1000 ccgogtaaca cctacgcttc tccggaagcc gaattctgc* gatatocatc acactggcgg 1140 ccgctegagc atgeat 1156 <21U> 2 (211> 1294 <212> DNA <213> Escherichia coli <221> misc “eature <2 2 2 <22?
(1)..(3) koden inicjacyjny allelu delta pckA
<2 2 0
Iz- misc_feature s <_ _ 2 > (1)..(598) <223> region 5' allelu delta pckA <220>
<221> n.isc feature
PL 211 169 B1 <?.?.?.> (599)..(618) <223> DNA zechniczny/reszty sekwencji polilinkera <220>
<221> :msc_ feature <2223- (619)’. . (1291) <223> regicn 3' allelu delta pckA <2 2 0>
<2213· misc feature <222> (1232) . . (1234) <223> kodon stop alle_u delta pckA <402) 4 ntgcgcgtta catgatateg ctgacaggtt atcttcaccg actttctggt aoctggcagc gtcgacgctt gtggcctggc geaggtttca aaagaacagg geegaattet gaacacccgc agogggccac ggtttćtcgc actggccggt cgcggcattc ggeggcgggc ctcgafctaaa agaaaaette cacgaagakt cgaaaccctg tgccgcgctg acaatggttt tttacaaccc atgagcgcgg gtcgttcacc gggcagacaa atctgaaagg tctgtggtgc aggcgcattt aaccagacbt gtctcaactc gcagatcctg gtttcttatc gcgactaagg
Ctgactgocg actgagcgtg ctgtcgctgc gcgcaggctt gatacccgtsg actctgcoga ctcgatccgc gcg aa act gt gtagcggctg gacccogcaa aagctaogac ggtgttaact aaaagataag aggcaaaggt cctggtgacc gaacccggat tgtcaaaaac tatogttatg cgaaaacttc aagatggcac egatetatea ttatcttcct atcaaaccca gcatcaccga acccgactca atctggttaa ccattatcga tgtttaacct gtaacaecta ttatcgacaa gtcogaaact gaactogagg etgctgtatc aatctgggtg tatatogtcc aagaacgaca aggcagcttt actcgtcttt atgtttattc aacggcgcga gtggcgttta tntcgaettt catcgataac gactgctgat gtateactte accgacgcca gtacgcagaa cactggctgg cgccatcctc ggogatcaca cgcttctccg Cttcgataaa gtaa cttatggtat aggaagagct ccgttgcegt gtgacgatae acaaacctct ccggcaaacg cogtccgttt gcccgaycga agtgcaotaa acctgaccga gatgatggtt attgtta&gc gctttcggcg ctctctggct a ccttctccg gtgctggtga aacggeaetg aacggttegc accgaactgc gaacagtggc tacacogaca cagtgacgta egatoogage cgataacggg cactcgcgat ctctccgga* tctgttcgtt catcaccga* tgaagaactg cccgcagtgg gogeatgeaa caaaaaccga cggtttocaa tgttgeogee tcaoogccaa cttgettcgg aacgtatgca gcaaacgtat tggataatgc cgggcgtaga aggaaaaagc cocctgcggg
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
300
960
1020
1080
1140
1200
1260
1294
<2103- Γ7 .3
(211> 2248
<212 3> DNA
<2133· Escherichia
<220>
( 2 2 1 > qer:
< 2 2 0 > ( 3 3 6) . . (714
<22 3> ORF yLlP
( 2 2 i > gen
<1' 2 0 > komplemer.z
<2 2 3> ORF yjfA
PL 211 169 B1 <4Ω0> 5 ggcgatgtcg caacaagctg tcagagcgac agtgcggcaa ccagattgtg ggtaaaatog gggagtagge gaetcctcac gaaatacggc gtgggtatat gccta&gcta tatctggaag gttcgagttt tagcaatgcg agtcactgga tgaccaatgc tatagcctgg gccactatcc tatcgtattg acaacgccac tacgcgcgoc agttgattea cccgtcgatg gattaaagct tatgeatacg ocaccttcgg taattccctc accttttgct aaactctgct ggcattcaca atactttgta taacttaagg tgcaggtatg gtcattccca cgtggaggcg caagtgagea gcttgatgaa ctgctggcae ctggggtaaa tceaccoetg ggagacattg tgctggttgg ccttgtctta tttgctacgt tgacctcgat gctgattggt gcgegacgtt tggcgtaagc aggtagtggt cagcggctat ttgactctat agcaacacte ccgtgtctgg tgtagaccag aatatttgte tacggcagtt ccagttactg ggcgatttca aggcgoagtt coggggaacg gctggccgaa cttgatgoct gacgccgtac gggagtgcat aattgaaagc ggegactggt gtggcgttgt tttttgcgag tttctctccg agccgctttc aatgogcagg ggtaaaaegt aggtgcagat gcgtattaoc atatcgtaat gaaagaaett aeaateaact gattctgaca agtgtgacat gaaogcogcg cgggtgacga aatatggtea ctttgatoea gcaagcggcc ggacaaggge tggagagoga 60 ttgggggttg cgcaaagtgg 120 aatttagogc tcgacaocca ISO gtattgccag gtctgcaagt 240 acgttacgtt atcgcctgat 300 gcaetggatt tgctctatca 360 tacgecacaa acaaggeaae 420 gtatcgataa ctaocagttg 480 gaacggtaca cggtgaagtt S40 tgcgcaccag gggcggtgaa 600 ggatgtacgt ttatcaaoga 660 tagaeaggga taagtaaooa 720 acgactcgca ttctgttttg 760 oatatetatt aacgeataaa 640 ttoctgtagc accgtgagtt 900 ataaaaagat gggggaacag 960 aaettacage cggggcagag 1020 cccatctcca ggogotaotc 1060 gaacttagcg agcaggatgt 1140 *ga*aagtga atttgaaogg 1200 atgaacag 124· <210:? 6 <211> 911 <212> DNA <213> Escherichia coli <22 O <222> misc_feature <222> (11.7(911) <223:? region ytfP-yjiA z deiecją <22 0>
<222> misc feature <222> (11) .. (33 3;
<223> sekwencja flankująca 5' regionu ytfP-yjiA <220>
<222l misc feature <222> (334)..(911) <223?· sekwencja flankująca 3' regionu ycfP-yjfA <220>
<22 2? irh sc feature <222> (3/6)..(J/g) <223> keden ATG skróconej ORF ytfp
PL 211 169 B1
<22C>
<221> misc feature
<222> komplement ( (388) . . (390)
< 2 2 3 > kodon ATG skróconej ORF
<TOO> 6
ggcg*tgtcg caacaagctg ccttgtctta teagagcgac agtgcggoa* tgacctcgat ccagattgtg ggtftaaatcg gcgagacgtt «JSgagtaggc gactcctccc aggtagtggt gaaatacggc gtgggtatat ttgactetat gcctaagct* tatctggaag ccgtgtctgg gttegagfctt tagcaatgcg aattatgoat gagacgactc gcattctgtt ttgtaattoc ttccatatct attaacgcat aaaaaactct cgtttcctgt agcaccgtga gttatacttt aecataaaaa gatgggggaa cagtgcaggt cttaacttac agccggggca gagcgtggag acaccoatct ceaggogeta otegettgat goggaactta gcgagcagga tgtetggggt taaagaaaag tgaatttgaa cggggagaoa gooatgaaca g tttgctaogt ggaoaaggge tggagagoga €0 getgattggt ttgggggttg ogcaaagtgg 120 tggcgtaage aatttagagc tcgacaaco· 1B0 cageggetat gtattgccag gtctgcaagt 240 agoaaoacto acgttaegrtt atcgćctgfct 300 tgtagaccag gcactggatt tgctctatca 340 acgccacctt egggtggogt tgttttttgc <20 ctoacctttt gcttttotct oegageegot 480 gctggcatta acaaatgogc aggggtaaaa S40 gtataactta aggaggtgca gatgegtatt 600 atggtoattc ocaatatcgt aatgaaagaa 660 gcgeaagtga gcaacaatca actgattctg 720 gaactgctgg cacagtgtga catgaacgoe 780 aaatccaooc ctgcgggtga cgaaatatgg 8441 ttgtgctggt tggctttgat ocagcaagog 900
Ul
< 2 2 C >
<221> miscfeaLure <222> <376?. .(378) <223> kodon. ATG skróconej ORF ytfP
PL 211 169 B1 <22Q>
<2 21> risc eature <222> komplement ((635)..(637)) <223> kodon ATG skróconej ORF yjzA ggcgatgtcg caacaagctg ccttgtctta tttgctaogt ggacaagggc tggagagsga 60 tcagagcgac agtgcggcaa tgacctcgat gctgattggt ttgggggttg cgeaaagtgg 120 ccagattgtg ggtaaaatog gcg&gacgtt tggcgtaagc aatttagegg togacaccca 180 gggagtaggc gactectefle aggtagtggt cagcggetat gtattgceag gtctęcaagt 240 gaaatacggc gtgggtatat ttgactctat agcaacacto acgttacgtt atogcctgat 300 gcctaagcta tatctggaag ccgtgtctgg tgtagaccag gcactggatt tgctctatca 360 gttcgagttt tagcaatgcg aatatttgtc tacggcagtt tacgacacaa acaaggcaae 420 agtcactgga tgaccaatgc ccagttactg ggogatttca gtatcgataa ctacoagttg 480 tatagcctgg gccactatcc aggcgcagtt ccggggaacg gaacggtaca oggtgaagtt 540 tatcgtattg aeaacgceae gctggccgaa cttgatgcct tgogcaecag gggcggtgaa 600 tacgcgcgcc agttgattca gacgcogtac tatgcataog ccaoettcgg gtggcgttgt 660 tttttgcgag acg&ctcgca ttctgttttg taattocctc accttttget tttctctcćg 720 egccgcttto catatctatt aacgcataaa aaaetctgct ggeattcaca aatgcgeagg 780 ggtaeaaogt ttactgtagc acogtgagtt atactttgta taecttaagg aggtgcagat 640 gcgtattacc ataaaaagat gggggaacag tgcaggtatg gtcattccca atatcgtaat 900 gaaagaactt aacttacagc cggggcagag agtggaggcg caegtgagca acaatcaact 960 gattctgaca cccatctcca ggcgctactc gcttgatgaa ctgctggcac agtgtgaoat 1020 gaaegccgeg gaacttagcg agcaggatgt ctggggtaaa tccaccectg egggtgacga 1080 aatatggtaa agaaaagtga etttgaacgg ggagacattg tgctggttgg ctttgatoca 1140 gcaagcggoc atgaaoag 1158 <2'3> 8 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja szruczna < 2 2 0 >
<'223> opis sekwencji sztucznej: starter pckA'5'-l < 4 0 0 >8 20 gatccqagcc tgacaggrta < 210 > 9 <211> 20 <212> DNA <213> .sekwencja sztuczna <2 2 0.>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter pckA'5'-2 < 4 O· 0 > 9 .? 0 gcatgcgetc gctcaggtta
PL 211 169 B1 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<22 3> opis sekwencji sztucznej: starter pckA' 3' -1
<400> 10 22
aggcctgaag atggcactat cg
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> sekwencja sztuczna
<22 0>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter pckA' 5' -2
<400> 11 20
ccggagaagc gtaggtgtta
<210> 12
<211> 20
<21 2> DNA
<213> sekwencja sztuczna
<220>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter Gdhl
<400> 12 20
tgaacacttc tggcggtacg
<210> 13
<211 > 20
<212> DNA
<213> sekwencja sztuczna
<220>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter Gdh2
<400> 13 20
ccLcggcgaa gctaatatgg
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<2? 3> sekwencja sztuczna
<220>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter RhtCl
PL 211 169 B1 <4C0> 14 ctgttagcat cgccgaggca <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter RhtC2
<400> 15
gcatgttgac ggcgaLgacg
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> sekwencja sztuczna
<2 2 0> <223> opis sekwencji sztucznej: starter Tdhl
<400> 16
Lcgcgaccta taagtttggg
<21 0> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> sekwencja szLuuzrięi
<220>
<223> opis sekwencjo sztucznej: starter Tph2
<4 00> 17 aataccagcc cttgttcgtg
2C
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> sekwencja sztuczna
< 2 2 0 >
<2 2 3?? opis sekwencji sztucznej: szarter yl. P-
<400> 18 ggcgatgtcg caacaagctg
<210> 19
<211> 20
<212?? DNA
<213> sekwencja sztuczna
<220>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter ytfP-
<400> 19
ctgttcatgg ccgcttgctg
PL 211 169 B1

Claims (13)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów, znamienny tym, że przeprowadza się następujące etapy:
    a) fermentację z udziałem drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzających pożądany L-aminokwas, w których ekspresja genu pckA lub sekwencji nukleotydowych kodujących produkt genu pckA jest atenuowana przez mutacje wybrane z grupy obejmującej tranzycje, transwersje, insercje i delecje
    b) wzbogacenie podłoża lub komórek bakterii w L-aminokwas, oraz
    c) izolację L-aminokwasu, lub
    d) składników brzeczki fermentacyjnej i biomasy izolowanych, w całości lub w części, jako produkt stały razem z L-aminokwasem.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekspresja polinukleotydu(ów) kodującego produkt genu pckA jest wyłączona.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się fermentację z udziałem drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, u których jeden lub więcej genów wybranych z grupy obejmującej:
    a) operon thrABC kodujący kinazę asparaginianową, dehydrogenzę homoserynową, kinazę homoserynową i syntazę treoninową,
    b) gen pyc kodujący karboksylazę pirogronianową,
    c) gen pps kodujący syntazę fosfoenolopirogronianową,
    d) gen rhtB oporności na homoserynę i
    e) gen rhtC oporności na treoninę,
    f) gen gdhA kodujący dehydrogenazę glutaminianową, jest równocześnie amplifikowanych i ulega nadekspresji.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeprowadza się fermentację z udziałem drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, u których jeden, lub więcej genów wybranych z grupy obejmującej:
    a) gen tdh kodujący dehydrogenazę treoninową,
    b) gen produktu otwartej ramki odczytu (orf) yjfA, oraz
    c) gen produktu otwartej ramki odczytu (orf) ytfP, jest atenuowanych.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, że wytwarza się L-izoleucynę, L-walinę, L-lizynę lub L-treoninę.
  6. 6. Drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-aminokwas, znamienne tym, że ekspresja genu pckA lub sekwencji nukleotydowych kodujących produkt genowy jest atenuowana przez mutacje wybrane z grupy obejmującej tranzycje, transwersje, insercje i delecje, a jeden lub więcej genów wybranych z grupy obejmującej:
    a) gen rhtC oporności na treoninę
    b) gen gdhA kodujący dehydrogenazę glutaminianową jest w nich jednocześnie nadwyrażanych, korzystnie przez zwiększanie liczby kopii genów.
  7. 7. Plazmid pMAK705ΔpckA, zawarty w szczepie E. coli MG442ΔpckA zdeponowany pod numerem DSM 14 289.
  8. 8. Wyizolowany polinukleotyd pochodzący z drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, zawierający sekwencję polinukleotydową kodującą regiony 5' i 3' genu pckA, jak pokazano w SEK ID Nr 4, do zastosowania jako składnik plazmidów dla specyficznej względem miejsca mutagenezy genu pckA.
  9. 9. Szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, znamienne tym, że zawierają mutację delecyjną w genie pckA, jak przedstawiono w odpowiadającej SEK ID NR 4.
  10. 10. Szczepy z rodziny Enterobacteriaceae według zastrz. 9, znamienne tym, że dodatkowo zawierają mutację delecyjną w otwartej ramce odczytu ytfP, jak przedstawiono w odpowiadającej SEK ID NR 6 lub 7.
  11. 11. Szczepy z rodziny Enterobacteriaceae według zastrz. 9, znamienne tym, że dodatkowo zawierają mutację delecyjną w otwartej ramce odczytu yjfA, jak przedstawiono w odpowiadającej SEK ID NR 6 lub 7.
  12. 12. Szczep Escherichia coli K-12 MG442ΔpckA zdeponowany w Deutsche Sammlung far Mikroorganismen und Zellkulturen pod numerem DSM 13761.
  13. 13. Szczep Escherichia coli K-12 B3996kur.\tdhpckA/PVIC40 zdeponowany w Deutsche Sammlung far Mikroorganismen und Zellkulturen pod numerem DSM 14150.
PL362315A 2000-09-30 2001-09-05 Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów, drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-aminokwas, plazmid, wyizolowany polinukleotyd, szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, szczepy Escherichia coli PL211169B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10048605 2000-09-30
DE10055516 2000-11-09
DE10130192A DE10130192A1 (de) 2000-09-30 2001-06-22 Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
PCT/EP2001/010209 WO2002029080A2 (en) 2000-09-30 2001-09-05 Fermentation process for the preparation of l-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL362315A1 PL362315A1 (pl) 2004-10-18
PL211169B1 true PL211169B1 (pl) 2012-04-30

Family

ID=27214091

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL362315A PL211169B1 (pl) 2000-09-30 2001-09-05 Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów, drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-aminokwas, plazmid, wyizolowany polinukleotyd, szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, szczepy Escherichia coli

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP1320626B1 (pl)
CN (2) CN1246468C (pl)
AU (1) AU2001293795A1 (pl)
MX (1) MXPA03002639A (pl)
PL (1) PL211169B1 (pl)
WO (1) WO2002029080A2 (pl)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10157721A1 (de) * 2001-11-24 2003-06-05 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht aromatischen L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE10303571A1 (de) 2003-01-30 2004-08-12 Degussa Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE10314618A1 (de) * 2003-04-01 2004-10-14 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
KR100498971B1 (ko) * 2003-04-04 2005-07-04 씨제이 주식회사 염색체 내 ｔｄｃＢＣ 및 ｐｃｋＡ 유전자가 불활성화된 미생물 및 이를 이용하여 Ｌ-쓰레오닌을 제조하는 방법
RU2268300C2 (ru) * 2003-04-07 2006-01-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНА pckA
DE10316109A1 (de) 2003-04-09 2004-10-21 Degussa Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102004003411A1 (de) 2004-01-23 2005-09-01 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
KR100576342B1 (ko) * 2004-02-05 2006-05-03 씨제이 주식회사 ｇａｌＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌 생성 미생물,그를 제조하는 방법 및 상기 미생물을 이용한Ｌ-쓰레오닌의 제조방법
DE102004005836A1 (de) 2004-02-06 2005-09-15 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
CA2562208A1 (en) * 2004-04-09 2006-03-30 Genencor International, Inc. Pcka modifications and enhanced protein expression in bacillus
DE102005018835A1 (de) 2005-04-22 2006-11-02 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung verbesserter Stämme der Familie Enterobacteriaceae
DE102005019040A1 (de) 2005-04-23 2006-10-26 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung verbesserter Stämme der Familie Enterobacteriaceae
EP1710317A3 (en) 2006-07-13 2007-02-21 Degussa AG Method for producing L-threonine and L-homoserine
DE102006041168A1 (de) * 2006-09-01 2008-03-06 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102007051024A1 (de) 2007-03-05 2008-09-11 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP1975241A1 (de) 2007-03-29 2008-10-01 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102007044134A1 (de) 2007-09-15 2009-03-19 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102007052270A1 (de) 2007-11-02 2009-05-07 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP2060636A1 (de) 2007-11-14 2009-05-20 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP2098597A1 (de) 2008-03-04 2009-09-09 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102008002309A1 (de) 2008-06-09 2009-12-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102008044768A1 (de) 2008-08-28 2010-03-04 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP2267145A1 (de) 2009-06-24 2010-12-29 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
RU2015120052A (ru) * 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
WO2018007565A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Metabolic Explorer Method for the fermentative production of methionine or its hydroxy analog form by microorganisms comprising genes coding sugar phosphotransferase system (pts)
CN107267541A (zh) * 2017-07-21 2017-10-20 徐州工程学院 利用galT基因缺失菌株通过发酵生产L‑氨基酸的方法
CN107267568A (zh) * 2017-07-21 2017-10-20 徐州工程学院 利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L‑氨基酸的方法
CN107267567A (zh) * 2017-07-21 2017-10-20 徐州工程学院 利用pspG基因缺失菌株通过发酵生产L‑氨基酸的方法
CN107267543A (zh) * 2017-07-21 2017-10-20 徐州工程学院 利用lpoA基因缺失菌株通过发酵生产L‑氨基酸的方法
CN107267542A (zh) * 2017-07-21 2017-10-20 徐州工程学院 利用rhsA基因缺失菌株通过发酵生产L‑氨基酸的方法
EP3608409A1 (en) 2018-08-09 2020-02-12 Evonik Operations GmbH Process for preparing l amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family
US11053526B2 (en) 2018-08-09 2021-07-06 Evonik Operations Gmbh Process for preparing L amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family
CN110079566B (zh) * 2019-05-16 2020-08-04 黑龙江伊品生物科技有限公司 用改变ppc启动子的细菌发酵生产L-赖氨酸的方法
CN110195087B (zh) * 2019-05-16 2020-12-01 黑龙江伊品生物科技有限公司 用改变ppc基因的细菌发酵生产L-赖氨酸的方法
CN110846333B (zh) * 2019-09-27 2022-04-12 内蒙古伊品生物科技有限公司 一种deoB基因改造的重组菌株及其构建方法与应用
CN111471638B (zh) * 2020-05-22 2021-11-23 江南大学 一株产l-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株的构建与应用
CN118406630B (zh) * 2024-06-26 2024-09-24 哈尔滨象柏生物科技有限公司 一种生产l-苏氨酸的基因工程菌及其制备方法和发酵工艺

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19950409A1 (de) * 1999-10-20 2001-04-26 Degussa Neue für das pck-Gen codierende Nukleotidsequenzen

Also Published As

Publication number Publication date
CN1466630A (zh) 2004-01-07
EP1320626B1 (en) 2009-11-04
WO2002029080A2 (en) 2002-04-11
CN1246468C (zh) 2006-03-22
WO2002029080A3 (en) 2002-09-26
PL362315A1 (pl) 2004-10-18
MXPA03002639A (es) 2003-06-19
CN1680547A (zh) 2005-10-12
AU2001293795A1 (en) 2002-04-15
EP1320626A2 (en) 2003-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL211169B1 (pl) Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów, drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-aminokwas, plazmid, wyizolowany polinukleotyd, szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, szczepy Escherichia coli
US7256021B2 (en) Enterobacteriaceae strains with an attenuated aspA gene for the fermentative production of amino acids
CN100485028C (zh) 生产氨基酸的细菌及制备l-氨基酸的方法
EP1330526B1 (en) Process for the fermentative preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
EP1373541B1 (en) Process for the production of l-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae in which the frur gene is deleted
US6916637B2 (en) Fermentation process for the preparation of L-amino acids using strains of the family Enterobacteriaceae
CN100443592C (zh) 发酵制备l-苏氨酸的方法
US7052883B2 (en) Process for the production of L-amino acids using strains of the family Enterobacteriaceae that contain an attenuated fruR gene
CN1910274B (zh) 使用肠杆菌科菌株制备l-氨基酸的方法
EP1711593B1 (en) Process for the preparation of l-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae
KR20040099299A (ko) 아미노산 생성 박테리아 및 ｌ-아미노산의 제조 방법
US20040191885A1 (en) Process for the fermentative preparation of L-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
US20030059903A1 (en) Process for the production of L-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae that contain an attenuated aceA gene
US20030017554A1 (en) Process for the fermentative preparation of L-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
ES2336192T3 (es) Proceso de fermentacion para la preparacion de l-aminoacidos utilizando cepas de la familia enterobacteriaceas.
US20050221448A1 (en) Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an attenuated aceb gene
US20030054503A1 (en) Process for the production of L-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae that contain an attenuated dgsA gene
ES2344681T3 (es) Proceso para la preparacion por fermentacion de l-aminoacidos utilizando cepas de la familia enterobacteriaceas.
ZA200302409B (en) Fermentation process for the preparation of L-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae.

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification