CN100443592C - 发酵制备l-苏氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种使用尤其已经生产L-苏氨酸的肠杆菌科细菌发酵生产L-苏氨酸的方法，该细菌中编码thrE基因的棒状细菌的核苷酸序列被增强，尤其是过表达。

Description

发酵制备L-苏氨酸的方法
本发明涉及使用肠杆菌科细菌经发酵制备L-苏氨酸的方法，该细菌中棒状细菌(coryneform bacteria)的thrE基因被增强。
现有技术
L-苏氨酸用于动物营养，人的药物及制药工业。已知L-苏氨酸可通过肠杆菌科菌株，尤其大肠杆菌和粘质沙雷氏菌的发酵而生产。由于它们极其重要，不断进行改良制备方法的尝试。方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形成的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法。以此方法可获得对抗代谢物如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟戊酸(AHV)，或有重要的调节氨基酸营养缺陷的并产生L-苏氨酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于生产L-苏氨酸的肠杆菌科菌株改良，其通过扩增各个苏氨酸生物合成基因，并研究对L-苏氨酸生产的作用而改良。
发明目的
本发明人目的在于提供新的措施以改良L-苏氨酸的发酵制备。
发明描述
本发明提供了使用尤其是已生产L-苏氨酸的肠杆菌科细菌发酵生产L-苏氨酸的方法，在该肠杆菌科细菌中，棒状细菌的编码thrE基因的一或多个核苷酸序列被增强，尤其是过表达。
特别地，所述方法是一种生产L-苏氨酸的方法，其包括以下步骤：
a)发酵肠杆菌科的微生物，其中至少棒状细菌的thrE基因被增强(过表达)，任选地与其它基因组合增强，
b)浓缩培养基或肠杆菌科微生物的细胞中的L-苏氨酸，和
c)分离所述L-苏氨酸。
文中术语“增强”是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性提高，例如通过提高基因的拷贝数，用强启动子或编码高活性相应酶或蛋白质的基因，及任选地组合使用这些方法。
本发明提供的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉，纤维素或从甘油和乙醇中制备L-苏氨酸。所述微生物可以是肠杆菌科的代表菌，尤其是埃希氏菌属和沙雷氏菌属。在埃希氏菌属和沙雷氏菌属中尤其应提及的是粘质沙雷氏菌。
适当的生产L-苏氨酸的埃希氏菌属菌株，尤其大肠杆菌菌株例如是：
大肠杆菌TF427
大肠杆菌H4578
大肠杆菌KY10935
大肠杆菌VNIIgenetika MG-442
大肠杆菌VNIIgenetika M1
大肠杆菌VNIIgenetika 472T23
大肠杆菌BKIIM B-3996
大肠杆菌kat 13
大肠杆菌KCCM-10132
适当的生产L-苏氨酸的沙雷氏菌属菌株，尤其粘质沙雷氏菌菌株例如是：
粘质沙雷氏菌  HNr21
粘质沙雷氏菌  TLr156
粘质沙雷氏菌  T2000
已经发现编码苏氨酸输出的棒状细菌thrE基因过表达后，肠杆菌科以改良的方式产生L-苏氨酸。
棒状细菌thrE基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：3，输出蛋白的所得氨基酸序列示于SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：4。
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示thrE基因可以根据本发明使用。得自遗传密码简并或归因于中性功能有义突变的棒状细菌thrE基因的等位基因也可以使用。
为获得过表达，可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在L-苏氨酸发酵生产期间提高表达也是可能的。延长mRNA寿命的措施也可改良表达。另外，通过防止酶蛋白的降解也可提高酶活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。
以下文献中可发现对此的详述，参见Chang和Cohen(细菌学杂志134：1141-1156(1978))，Hartley和Gregori(基因13：347-353(1981))，Amann和Brosius(基因40：183-190(1985))，Broer等(美国国家科学学报80：21-25(1983))，LaVallie等(生物/技术11，187-193(1993))，PCT/US97/13359，Llosa等(质粒26：222-224(1991))，Quandt和Klipp(基因80：161-169(1989))，Hamilton(细菌学杂志171：4617-4622(1989)，Jensen和Hammer(生物技术和生物工程58，191-195(1998)，及已知的关于遗传和分子生物学的教材中。
可以使用能在肠杆菌科中复制的质粒载体，如衍生自pACYC184(Bartolome等，基因102，75-78(1991))，pTrc99A(Amann等，(基因69：301-315(1988))，或pSC101衍生物(Vocke和Bastia，美国国家科学院院报80(21)：6557-6561(1983)的克隆载体。用一种质粒载体转化的菌株可以用于本发明的方法中，所述质粒载体携带编码棒状细菌thrE基因的核苷酸序列。
另外，除棒状细菌thrE基因之外，过表达已知苏氨酸的生物合成途径的一或多种酶，或补缺代谢的酶或产生还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶，对用肠杆菌科菌株生产L-苏氨酸可以是有益的。因此，例如以下基因可以同时增强，尤其是过表达：
·编码天冬氨酸激酶，高丝氨酸脱氢酶，高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子(US-A-4278765)，或
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19831609)，或
·编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(分子和普通遗传学231：332(1992))，或
·编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(基因31：279-283(1984))，或
·编码转氢酶的pntA和pntB基因(欧洲生物化学杂志158：647-653(1986))，或
·编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因(基因27：193-199(1984))，或
·授予L-高丝氨酸抗性的rhtB基因(EP-A-0994190)。
除过表达thrE基因之外，排除非所需的副反应，例如苏氨酸脱氢酶，对L-苏氨酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦英国，1982，及Bell和Turner，生物化学杂志156，449-458(1976))。根据本发明，可以应用至少部分消除了降低L-苏氨酸形成的代谢途径的细菌。
根据本发明产生的微生物可通过分批法(分批培养)，或补料分批法(补料方法)进行培养。已知培养法见于由Chmiel(生物方法技术学1，生物方法技术入门，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反应器及外周设备，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C..USA，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。可将适当前体加入培养基中。上述物质可以单批形式或在培养期间适当补加。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以控制PH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在25℃～45℃，优选30℃-40℃。持续培养直至L-苏氨酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围内达到。
L-苏氨酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经过如Spackman等(分析化学30，(1958)，1190)所述茚三酮衍生作用进行，或者可以通过反向HPLC进行，如Lindroth等(分析化学(1979)51：1167-1174)所述。
以下微生物根据布达佩斯条约，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)：
·黄色短杆菌菌株DM368-2pZlthrE，保藏号DSM 12840。
质粒pZlthrE含有谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的thrE基因。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详细阐述。
从大肠杆菌中分离质粒DNA，及进行限制，Klenow和碱性磷酸酶处理的所有技术，均是通过Sambrook等(分子克隆实验操作指南(1989)，冷泉港实验室出版社)所述方法进行。转化大肠杆菌是通过Chung等(美国科学院院报(1989)86：2172-2175)所述方法进行。
在制备大肠杆菌菌株和转化体期间的孵育温度是37℃。在Hamilton等所述(细菌学杂志(1989)171：4617-4622)基因置换过程中，使用的温度是30℃和44℃。
实施例1谷氨酸棒杆菌ATCC 14752的thrE基因的克隆和测序
1、转座子诱变和突变体选择
用转座子Tn5531诱变谷氨酸棒杆菌菌株ATCC14752ΔilvA，其序列存于国立生物技术信息中心(Bethesda，USA)的核苷酸数据库，登录号为U53587。通过Schafer等所述的基因交换系统，在谷氨酸棒杆菌菌株ATCC14752的ilvA基因中掺入一个缺失(基因(1994)145：69-73)。为此，使用Sahm等(应用及环境微生物学(1999)65：1973-1979)构建的灭活载体pK19mobsacBΔilvA进行缺失。首先用200ng载体pK19mobsacBΔilvA转化得自Stratagene(德国海德堡)的甲基化酶缺陷的大肠杆菌菌株SCS110(Jerpseth和Kretz，分子生物学策略6，22(1993))。在含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上借助于其卡那霉素抗性，鉴别转化株。所述质粒pK19mobsacBΔilvA是从所述转化株之一中制备的。通过电穿孔法(Haynes等，FEMS微生物学通信(1989)61：329-334)，将这个灭活的质粒导入谷氨酸棒杆菌菌株ATCC14752中。在含有15μg/ml卡那霉素的LBHIS琼脂平板上借助于其卡那霉素抗性，鉴别其中所述灭活质粒整合入基因组中的克隆(Liebl等，FEMS微生物学通信(1989)65：＜＜299-304)。为选择所述载体的切除，将卡那霉素抗性克隆铺板于含有蔗糖的LBG培养基上(具有15g/L琼脂，2％葡萄糖和10％蔗糖的LB培养基)。这提供了通过二次重组再一次丧失所述载体的菌落(Jager等，细菌学杂志(1992)174：5462-5465)。通过转移接种于具有和不具有300mg/LL-异亮氨酸，或者具有和不具有50μg/ml卡那霉素的基本培养基平板上(具有15g/L琼脂的CGXII培养基(Keilhauer等，细菌学杂志(1993)175：5595-5603))，分离6个由于所述载体的切除所致的卡那霉素敏感性和异亮氨酸营养缺陷型克隆，其中基因组中目前存在不完整的ilvA基因(ΔilvA等位基因)。将这些克隆之一称为菌株ATCC14752ΔilvA，并用于转座子诱变。
含有组合的转座子Tn5531的质粒pCGL0040(图1)(Ankri等，细菌学杂志(1996)178：4412-4419)是从甲基化酶缺陷的大肠杆菌菌株GM2929pCGL0040(大肠杆菌GM2929：Palmer等，基因(1994)143：1-12)中分离的。经电穿孔法(Haynes等，FEMS微生物学通信(1989)61：329-334)用质粒pCGL0040转化谷氨酸棒杆菌菌株ATCC14752ΔilvA。通过在含有15μg/ml卡那霉素的LBHIS琼脂板(Liebl等，FEMS微生物学通信(1989)65：299-304)上的卡那霉素抗性鉴别转座子Tn5531已整合进基因组的克隆。以此方式获得2000个克隆，研究它们在苏氨酰-苏氨酰-苏氨酸存在下的延迟生长。为此，将所有克隆单独转移至具有和不具有2mM苏氨酰-苏氨酰-苏氨酸的CGXII基本培养基琼脂板上。该培养基与Keilhauer等(细菌学杂志(1993)175：5593-5603)所述的CGXII培养基相同，但另外含有25μg/ml卡那霉素，300mg/L L-异亮氨酸和15g/L琼脂。Keilhauer等所述的该培养基的组成见表1。
表1培养基CGXII的组成
  组分   浓度
  NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>   20g/L
  尿素   5g/L
  KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>   1g/L
  K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>   1g/L
  MgSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O   0.25g/L
  3-吗啉丙磺酸   42g/L
  CaCl<sub>2</sub>   10mg/L
  FeSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O   10mg/L
  MnSO<sub>4</sub>xH<sub>2</sub>O   10mg/L
  ZnSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O   1mg/L
  CuSO<sub>4</sub>   0.2mg/L
  NiCl<sub>2</sub>x6H<sub>2</sub>O   0.02mg/L
  生物素   0.2mg/L
  葡萄糖   40g/L
  原儿茶酸   30mg/L
琼脂板在30℃保温，并在12、18和24小时后检查生长。获得一转座子突变体，其在缺少苏氨酰-苏氨酰-苏氨酸时以与起始菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 14752ΔilvA相比相当的方式生长，但在存在2mM苏氨酰-苏氨酰-苏氨酸时生长延迟。将其命名为ATCC14752ΔilvAthrE::Tn5531。
2、ATCC14752ΔilvA thrE::Tn5531中Tn5531插入位点的克隆和测序
为克隆实施例1.1中所述的突变体的转座子Tn5531上游的插入位点，首先如Schwarzer等(生物/技术(1990)9：84-87)所述分离这一突变体菌株的染色体DNA，并用限制性内切酶EcoRI切割400ng该染色体DNA。将完全限制酶切的产物连接进同样用EcoRI线性化的载体pUC18(Norander等，基因(1983)26：101-106，RocheDiagnostics，Mannheim，德国)。然后将连接混合物经电穿孔(Dower等，核酸研究(1988)16：6127-6145)转化进大肠杆菌菌株DH5αmcr(Grant等，1990，美国科学院院报87：4645-4649)。经在含有50μg/ml羧苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上的羧苄青霉素和卡那霉素抗性，鉴别转化株，其中转座子Tn5531的插入位点克隆于载体pUC18上。从3个转化体中制备质粒并经限制分析确定克隆插入的大小。用Sanger等的双脱氧链终止法(美国科学院院报(1977)74：5463-5467)确定具有约5.7kb大小插入片段的一个质粒上的插入位点的核苷酸序列。为此，从下列寡核苷酸引物开始测序2.2kb插入片段：5′-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3′。
为鉴别转座子下游的插入位点，用限制性内切酶XbaI切割突变体的染色体DNA并连接进已用XbaI线性化的载体pUC18中。其余的克隆操作如上所述。用Sanger等的双脱氧链终止法(美国科学院院报(1977)74：5463-5467)确定具有约8.5kb大小插入片段的一个质粒上的插入位点的核苷酸序列。为此，从下列寡核苷酸引物开始测序0.65kb插入片段：5′-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3′。
用Lasergene软件包(用于Windows的生物计算软件，DNASTAR，Madison，USA)分析和组装获得的核苷酸序列。这一核苷酸序列再现为SEQ ID NO：1。分析鉴别了长度为1467bp的一个开放阅读框架。相应的基因命名为thrE。相关的基因产物包括489个氨基酸并再现为SEQ ID NO：2。
实施例2从谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中克隆和测序thrE基因
将thrE基因克隆进大肠杆菌克隆载体pUC18(Norrander等，基因(1983)26：101-106，Roche Diagnostic，曼海姆，德国)中。克隆以两步进行，首先用衍生自SEQ ID NO：1的下述寡核甘酸引物经聚合酶链反应(PCR)扩增来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因。
thrE-正向：
5′-CCC CTT TGA CCT GGT GTT ATT G-3′
thrE-反向：
5′-CGG CTG CGG TTT CCT CTT-3′
PCR反应在存在200μM脱氧核苷酸三磷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，1μM相应寡核苷酸，100ng谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA，1/10体积的10×反应缓冲液和2.6单位的热稳定Taq/PwoDNA聚合酶混合物(来自Roche Diagnostics的延伸高保真性PCR系统，曼海姆，德国)下，在一热循环仪(PTC-100，MJ研究公司，Watertown，USA)中在如下条件下进行30个循环：94℃30秒，58℃30秒和72℃2分钟。
然后用SureClone连接试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)，根据厂商指导将约1.9kb大小的扩增片段连接进载体pUC18的SmaI限制位点中。用连接混合物转化大肠杆菌菌株DH5αmcr(Grant等，1990，美国科学院院报87：4645-4649)。经在含有50ug/ml羧苄青霉素的LB琼脂板上的羧苄青霉素抗性鉴别转化体。从8个转化子中制备质粒并经限制分析确定1.9kb PCR片段的插入片段的存在。以下将以此得到的重组质粒命名为pUC18thrE。
用Sanger等的双脱氧链终止法(美国科学院院报(1977)74：5463-5467)确定质粒pUC18thrE中的1.9kb PCR片段的核苷酸序列。为此，用Roche Diagnostics(曼海姆，德国)的下述引物测序pUC18thrE的完整插入片段。
通用引物：
5′-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3′
反向引物：
5′-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3′
所得核苷酸序列再现为SEQ ID NO：3。用Lasergene软件包(用于Windows的生物计算软件，DNASTAR，Madison，USA)分析所获得的核苷酸序列。数据分析的结果是鉴别了一个长度为1467bp的开放阅读框架，将其命名为thrE基因。其编码一个489个氨基酸的多肽，再现为SEQ ID NO：4。
实施例3谷氨酸棒杆菌thrE基因的表达
将实施例2所述的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的thrE基因克隆在载体pZ1中表达(Menkel等，应用和环境微生物学(1989)64：549-554)。为此，用限制酶SacI和XbaI将质粒pUC18thrE切割为含有thrE基因的大小为1881bp的一个DNA片段。将此片段的5’和3’末端用Klenow酶处理。将所得DNA片段在载体pZ1中连接，所述载体预先用ScaI线性化并去磷酸化。将大肠杆菌菌株DH5αmcr(Grant等，美国科学院院报(1990)87：4645-4649)用全部连接混合物转化。经在含有50ug/ml卡那霉素的LB琼脂板上的卡那霉素抗性鉴别转化体。从2个转化体中制备质粒并经限制分析确定1881bp的ScaI/XbaI片段的插入片段的存在。以此方式形成的重组质粒命名为pZ1thrE(图2)。
经电穿孔(Haynes等，FEMS微生物学通信(1989)61：329-334)，将质粒pZ1thrE导入形成苏氨酸的黄色短杆菌菌株DM368-2中。菌株DM368-2的描述见EP-B-0385940，保藏号为DSM5399。通过在含有15μg/ml卡那霉素的LBHIS琼脂平板上的卡那霉素抗性(Liebl等，FEMS微生物学通信(1989)65：299-304)鉴别转化体。以此方式获得黄色短杆菌菌株DM368-pZ1thrE。
实施例4：构建表达质粒pTrc99AthrE
将实施例2所述的谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032的thrE基因克隆在载体pTrc99A中以在大肠杆菌中表达，其得自Pharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)。为此，将载体pUC18thrE用酶SalI切割，并用Klenow酶处理突出的3’末端。在用酶KpnI限制后，将切割物在0.8％琼脂糖凝胶中分离，并借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)分离大小为1.9kbp的thrE片段。将载体pTrc99A用酶EcoRI切割，将3’末端用Klenow酶处理，用酶KpnI切割并和分离的thrE片段连接。将连接物转化入大肠杆菌菌株DH5α中。在加入了50ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox，病毒学1：190(1995))上选择携带pTrc99A的细胞。在质粒DNA分离及用XbaI，BamHI，EcoRI，HindIII和SspI对照切割之后，可以表明thrE基因的成功克隆。将所得质粒命名为pTrc99AthrE(图3)。
实施例5：用菌株MG442/pTrc99AthrE制备L-苏氨酸
产生L-苏氨酸的大肠杆菌菌株MG442见于专利说明书US-A-4278765所述，并保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM，Moscow，俄罗斯)，保藏号为CMIM B-1628。
将菌株MG442用质粒pTrc99AthrE转化，并在具有50ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。然后将选择的各个菌落在基本培养基上进一步增殖，所述培养基具有以下组分：3.5g/lNa2HPO4*2H2O，1.5g/l KH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/l MgSO4*7H2O，2g/l葡萄糖，20g/l琼脂，50mg/l氨苄青霉素。在100ml的锥形瓶中含有的10ml分批培养物中检测L-苏氨酸的形成。为此，接种含有以下组分的10ml预培养基：2g/l酵母提取物，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4*7H2O，15g/l CaCO3，20g/l葡萄糖，50mg/l氨苄青霉素，并在得自Kuhner AG(Birsfelden，Switzerland)的ESR孵育器上，在37℃和180rpm孵育16小时。将250ul此预培养物转接种于10ml生产培养基中(25g/l(NH4)2SO4，2g/l KH2PO4，1g/l MgSO4*7H2O，0.03g/lFeSO4*7H2O，0.018g/l MnSO4*1H2O，30g/l CaCO3，20g/l葡萄糖)，并将此混合物在37℃孵育48小时。为诱导thrE基因表达，将200mg/l异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入平行分批培养物中。在孵育后，用Dr.Lange(德国柏林)的LP2W光度计，在660nm测定波长测定培养物悬浮液的光密度(OD)。
然后在过滤灭菌的培养上清中，用Eppendorf-BioTronik(德国Hamburg)的氨基酸分析仪，通过离子交换层析和具有茚三酮检测的后柱反应，测定形成的L-苏氨酸的浓度。
该实验结果示于表2。
表2
  菌株   添加剂   OD   L-苏氨酸g/l
  MG442   -   5.6   1.38
  MG442/pTrc99AthrE   -   4.6   1.65
  MG442/pTrc99AthrE   IPTG   3.6   3.5
实施例6：用菌株B-3996kurΔtdh/pVIC40，pMW218thrE制备L-苏氨 酸
产生L-苏氨酸的大肠杆菌菌株B-3996见于US-A-5175107所述，并保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM，Moscow，俄罗斯)。
6.1在质粒载体pMW218中克隆thrE基因
将实施例4所述的质粒pTrc99AthrE用酶SspI切割，将切割产物在0.8％琼脂糖凝胶中分离，并借助于“QIAquick凝胶提取试剂盒”(QIAGEN，Hilden，德国)分离大小为2.5kbp的DNA片段，其除了thrE基因之外还含有trc启动子区域和rRNA终止子区域。将质粒pMW218(Nippon基因，Toyama，日本)用酶SmaI切割，并与所述thrE片段连接。将大肠杆菌菌株DH5α用连接产物转化，并通过铺板于加入20ug/ml卡那霉素的LB琼脂上选择携带pMW218的细胞。在分离质粒DNA及用HindIII和ClaI对照切割后，可以证实所述thrE基因的成功克隆。所述质粒称为pMW218thrE(图4)。
6.2制备菌株B-3996kurΔtdh/pVIC40，pMW21gthrE
在无抗生素的完全培养基中培养大约10个子代后，分离不再包含质粒pVIC40的菌株B-3996的衍生物。所形成的菌株是对链霉素敏感的，并称为B-3996kur。
使用Hamilton等所述方法(细菌学杂志(1989)171：4617-4622)将一个缺失掺入tdh基因，所述方法是基于使用具有温度敏感性复制子的质粒pMAK705。质粒pDR121(Ravnikar和Somerville，细菌学杂志(1987)169：4716-4721)含有一个来自大肠杆菌的大小为3.7kbp的DNA片段，所述DNA片段编码tdh基因。为在tdh基因区域产生一个缺失，将pDR121用限制酶ClaI和EcoRV切割，及在用Klenow酶处理后连接分离的大小为5kbp的DNA片段。将连接产物在大肠杆菌菌株DH5α中转化，并在加入50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。
tdh基因的成功缺失可以在分离质粒DNA及用EcoRI对照切割后证实。分离大小为1.7kbp的EcoRI片段，并与用EcoRI部分消化的质粒pMAK705连接。将连接产物在DH5α中转化，并在加入20ug/ml氯霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。成功的克隆在分离质粒DNA和用EcoRI切割后得以证实。所形成的pMAK705衍生物称为pDM32。
针对基因置换，将B-3996kur用质粒pDM32转化。通过Hamilton等所述选择方法进行用质粒编码的缺失构建体置换染色体tdh基因，并通过标准PCR方法证实(Innis等，(1990)PCR方案，方法和应用指导，科学出版社)，使用以下寡核苷酸引物：
tdh1：5’-TCGCGACCTATAAGTTTGGG-3’
tdh2：5’-AATACCAGCCCTTGTTCGTG-3’
测试形成的菌株的卡那霉素敏感性并称为B-3996kurΔtdh。
将B-3996kurΔtdh用分离自B-3996的质粒pVIC40转化，并在补加20ug/ml链霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。将一个选择的单独菌落称为B-3996kurΔtdh/pVIC40，并用质粒pMW218thrE转化。在加入20μg/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上进行选择。以此方式形成的菌株称为B-3996kurΔtdh/pVIC40，pMW218thrE。
6.3制备L-苏氨酸
如实施例5所述测试由菌株B-3996kurΔtdh/pVIC40及B-3996kurΔtdh/pVIC40，pMW218thrE制备的L-苏氨酸情况。针对B-3996kurΔtdh/pVIC40，将基本培养基，预培养基和生产培养基补加20μg/ml链霉素，针对B-3996kurΔtdh/pVIC40，pMW218thrE，加入20ug/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素。
这个实验结果示于表3。
表3
  菌株   OD(660nm)   L-苏氨酸g/l
  B-3996kurΔtdh/pVIC40   4.7   6.26
  B-3996kurΔtdh/pVIC40，pMW218thrE   4.8   7.57
本发明包括以下附图：
图1：含有转座子Tn5531的质粒pCGL0040图。所述转座子以无暗带的箭头表示。
图2：含有thrE基因的质粒pZ1thrE图。
图3：含有thrE基因的质粒pTrc99AthrE图。
图4：含有thrE基因的质粒pMW218thrE图。
应知晓所述长度数值是大约值。所采用的缩写和符号有如下含义：
Amp：氨苄青霉素抗性基因。
Kan：卡那霉素抗性基因。
′amp：氨苄青霉素抗性基因的3’部分。
oriBR322：质粒pBR322的复制区。
lacI：trc启动子的阻抑物蛋白基因。
Ptrc：trc启动子区域，IPTG可诱导性的。
5S：5S rRNA区域
rrnBT：rRNA终止子区域。
限制酶的缩写具有以下含义：
BamHI：来自解淀粉芽孢杆菌的限制性内切酶
BglII：来自Bacillus globigii的限制性内切酶
ClaI：来自Caryphanon latum的限制性内切酶
EcoRI：来自大肠杆菌的限制性内切酶
EcoRV：来自大肠杆菌的限制性内切酶
HindIII：来自流感杆菌的限制性内切酶
KpnI：来自肺炎杆菌的限制性内切酶
PstI：来自斯氏普罗威登斯菌的限制性内切酶
PvuI：来自普通变形杆菌的限制性内切酶
SacI：来自Streptomyces achromogenes的限制性内切酶
SalI：来自白色链霉菌的限制性内切酶
SmaI：来自粘质沙雷氏菌的限制性内切酶
XbaI：来自Xanthomonas badrii的限制性内切酶
XhoI：来自Xanthomonas holcicola的限制性内切酶
序列表
<110>德古萨股份公司
<120>发酵制备L-苏氨酸的方法
<130>000225BT
<140>
<141>
<160>4
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>2817
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌ATCC14752
<220>
<221>CDS
<222>(398)..(1864)
<223>thrE基因
<400>1
aatgaaataa tcccctcacc aactggcgac attcaaacac cgtttcattt ccaaacatcg 60
agccaaggga aaagaaagcc cctaagcccc gtgttattaa atggagactc tttggagacc 120
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attggactct ttttccttgc aaaatgtttt ccagcgg atg ttg agt ttt gcg acc  415
                                         Met Leu Ser Phe Ala Thr
                                           1               5
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Leu Arg Gly Arg Ile Ser Thr Val Asp Ala Ala Lys Ala Ala Pro Pro
             10                  15                  20
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Pro Ser Pro Leu Ala Pro Ile Asp Leu Thr Asp His Ser Gln Val Ala
         25                  30                  35
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Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg Ile Gly Asp Ile Leu Leu Ser Ser
     40                  45                  50
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Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gln Val Arg Ala Val Thr Ser
 55                  60                  65                  70
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Thr Ile Phe Thr Asn Ile Gly Val Glu Arg Lys Met Pro Val Asn Val
             90                  95                 100
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Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn Phe Ser Lys Leu Ser Glu
        105                 110                 115
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    120                 125                 130
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Val Ala Glu Lys Ile Leu Asp Glu Leu Glu Gln Ser Pro Ala Ser Tyr
135                 140                 145                 150
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Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala Met Met Gly Gly Ala Val
                155                 160                 165
gct gtg ctg ttg ggt ggt gga tgg cag gtt tcc cta att gct ttt att  943
Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gln Val Ser Leu Ile Ala Phe Ile
            170                 175                 180
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Thr Ala Phe Thr Ile Ile Ala Thr Thr Ser Phe Leu Gly Lys Lys Gly
        185                 190                 195
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Leu Pro Thr Phe Phe Gln Asn Val Val Gly Gly Phe Ile Ala Thr Leu
    200                 205                 210
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Pro Ala Ser Ile Ala Tyr Ser Leu Ala Leu Gln Phe Gly Leu Glu Ile
215                 220                 225                 230
aaa ccg agc cag atc atc gca tct gga att gtt gtg ctg ttg gca ggt  1135
Lys Pro Ser Gln Ile Ile Ala Ser Gly Ile Val Val Leu Leu Ala Gly
                235                 240                 245
ttg aca ctt gtg caa tct ctg cag gac ggc atc acg ggc gct ccg gtg  1183
Leu Thr Leu Val Gln Ser Leu Gln Asp Gly Ile Thr Gly Ala Pro Val
            250                 255                 260
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Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu Leu Phe Thr Gly Gly Ile
        265                 270                 275
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Val Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile Gln Leu Ser Glu Ile Leu His Val
    280                 285                 290
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Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala Pro Asn Tyr Ser Ser Thr
295                 300                 305                 310
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Phe Ala Arg Ile Ile Ala Gly Gly Val Thr Ala Ala Ala Phe Ala Val
                315                 320                 325
ggt tgt tac gcg gag tgg tcc tcg gtg att att gcg ggg ctt act gcg  1423
Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val Ile Ile Ala Gly Leu Thr Ala
            330                 335                 340
ctg atg ggt tct gcg ttt tat tac ctc ttc gtt gtt tat tta ggc ccc    1471
Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe Val Val Tyr Leu Gly Pro
        345                 350                 355
gtc tct gcc gct gcg att gct gca aca gca gtt ggt ttc act ggt ggt    1519
Val Ser Ala Ala Ala Ile Ala Ala Thr Ala Val Gly Phe Thr Gly Gly
    360                 365                 370
ttg ctt gcc cgt cga ttc ttg att cca ccg ttg att gtg gcg att gcc    1567
Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu Ile Pro Pro Leu Ile Val Ala Ile Ala
375                 380                 385                 390
ggc atc aca cca atg ctt cca ggt cta gca att tac cgc gga atg tac    1615
Gly Ile Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala Ile Tyr Arg Gly Met Tyr
                395                 400                 405
gcc acc ttg aat gat caa aca ctc atg ggt ttc acc aac att gcg gtt    1663
Ala Thr Leu Asn Asp Gln Thr Leu Met Gly Phe Thr Asn Ile Ala Val
            410                 415                 420
gct tta gcc act gct tca tca ctt gcc gct ggc gtg gtt ttg ggt gag    1711
Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala Gly Val Val Leu Gly Glu
        425                 430                 435
tgg att gcc cgc agg cta cgt cgt cca cca cgc ttc aac cca tac cgt    1759
Trp Ile Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro Arg Phe Asn Pro Tyr Arg
    440                 445                 450
gca ttt acc aag gcg aat gag ttc tcc ttc cag gag gaa gct gag cag    1807
Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe Gln Glu Glu Ala Glu Gln
455                 460                 465                 470
aat cag cgc cgg cag aga aaa cgt cca aag act aat caa aga ttc ggt    1855
Asn Gln Arg Arg Gln Arg Lys Arg Pro Lys Thr Asn Gln Arg Phe Gly
                475                 480                 485
aat aaa agg taaaaatcaa cctgcttagg cgtctttcgc ttaaatagcg            1904
Asn Lys Arg
tagaatatcg ggtcgatcgc ttttaaacac tcaggaggat ccttgccggc caaaatcacg  1964
gacactcgtc ccaccccaga atcccttcac gctgttgaag aggaaaccgc agccggtgcc  2024
cgcaggattg ttgccaccta ttctaaggac ttcttcgacg gcgtcacttt gatgtgcatg  2084
ctcggcgttg aacctcaggg cctgcgttac accaaggtcg cttctgaaca cgaggaagct  2144
cagccaaaga aggctacaaa gcggactcgt aaggcaccag ctaagaaggc tgctgctaag  2204
aaaacgacca agaagaccac taagaaaact actaaaaaga ccaccgcaaa gaagaccaca  2264
aagaagtctt aagccggatc ttatatggat gattccaata gctttgtagt tgttgctaac  2324
cgtctgccag tggatatgac tgtccaccca gatggtagct atagcatctc ccccagcccc  2384
ggtggccttg tcacggggct ttcccccgtt ctggaacaac atcgtggatg ttgggtcgga  2444
tggcctggaa ctgtagatgt tgcacccgaa ccatttcgaa cagatacggg tgttttgctg  2504
caccctgttg tcctcactgc aagtgactat gaaggcttct acgagggctt ttcaaacgca  2564
acgctgtggc ctcttttcca cgatttgatt gttactccgg tgtacaacac cgattggtgg  2624
catgcgtttc gggaagtaaa cctcaagttc gctgaagccg tgagccaagt ggcggcacac 2684
ggtgccactg tgtgggtgca ggactatcag ctgttgctgg ttcctggcat tttgcgccag 2744
atgcgccctg atttgaagat cggtttcttc ctccacattc ccttcccttc ccctgatctg 2804
ttccgtcagc tgc                                                    2817
<210>2
<211>489
<212>PRT
<213>谷氨酸棒状杆菌ATCC14752
<400>2
Met Leu Ser Phe Ala Thr Leu Arg Gly Arg Ile Ser Thr Val Asp Ala
  1               5                  10                  15
Ala Lys Ala Ala Pro Pro Pro Ser Pro Leu Ala Pro Ile Asp Leu Thr
             20                  25                  30
Asp His Ser Gln Val Ala Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg Ile Gly
         35                  40                  45
Asp Ile Leu Leu Ser Ser Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gln
     50                  55                  60
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp
 65                  70                  75                  80
Ile Thr Leu Asn Thr Ile Thr Ile Phe Thr Asn Ile Gly Val Glu Arg
                 85                  90                  95
Lys Met Pro Val Asn Val Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn
            100                 105                 110
Phe Ser Lys Leu Ser Glu Val Asp Arg Leu Ile Arg Ser Ile Gln Ala
        115                 120                 125
Gly Ala Thr Pro Pro Glu Val Ala Glu Lys Ile Leu Asp Glu Leu Glu
    130                 135                 140
Gln Ser Pro Ala Ser Tyr Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala
145                 150                 155                 160
Met Met Gly Gly Ala Val Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gln Val
                165                 170                 175
Ser Leu Ile Ala Phe Ile Thr Ala Phe Thr Ile Ile Ala Thr Thr Ser
            180                 185                 190
Phe Leu Gly Lys Lys Gly Leu Pro Thr Phe Phe Gln Asn Val Val Gly
        195                 200                 205
Gly Phe Ile Ala Thr Leu Pro Ala Ser Ile Ala Tyr Ser Leu Ala Leu
    210                 215                 220
Gln Phe Gly Leu Glu Ile Lys Pro Ser Gln Ile Ile Ala Ser Gly Ile
225                 230                 235                 240
Val Val Leu Leu Ala Gly Leu Thr Leu Val Gln Ser Leu Gln Asp Gly
                245                 250                 255
Ile Thr Gly Ala Pro Val Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu
            260                 265                 270
Leu Phe Thr Gly Gly Ile Val Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile Gln Leu
        275                 280                 285
Ser Glu Ile Leu His Val Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala
    290                 295                 300
Pro Asn Tyr Ser Ser Thr Phe Ala Arg Ile Ile Ala Gly Gly Val Thr
305                 310                 315                 320
Ala Ala Ala Phe Ala Val Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val Ile
                325                 330                 335
Ile Ala Gly Leu Thr Ala Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe
            340                 345                 350
Val Val Tyr Leu Gly Pro Val Ser Ala Ala Ala Ile Ala Ala Thr Ala
        355                 360                 365
Val Gly Phe Thr Gly Gly Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu Ile Pro Pro
    370                 375                 380
Leu Ile Val Ala Ile Ala Gly Ile Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala
385                 390                 395                 400
Ile Tyr Arg Gly Met Tyr Ala Thr Leu Asn Asp Gln Thr Leu Met Gly
                405                 410                 415
Phe Thr Asn Ile Ala Val Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala
            420                 425                 430
Gly Val Val Leu Gly Glu Trp Ile Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro
        435                 440                 445
Arg Phe Asn Pro Tyr Arg Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe
    450                 455                 460
Gln Glu Glu Ala Glu Gln Asn Gln Arg Arg Gln Arg Lys Arg Pro Lys
465                 470                 475                 480
Thr Asn Gln Arg Phe Gly Asn Lys Arg
                485
<210>3
<211>1909
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌ATCC13032
<220>
<221>CDS
<222>(280)..(1746)
<223>thrE基因
<400>3
agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatccccccc ctttgacctg gtgttattga 60
gctggagaag agacttgaac tctcaaccta cgcattacaa gtgcgttgcg ctgccaattg 120
cgccactcca gcaccgcaga tgctgatgat caacaactac gaatacgtat cttagcgtat 180
gtgtacatca caatggaatt cggggctaga gtatctggtg aaccgtgcat aaacgacctg  240
tgattggact ctttttcctt gcaaaatgtt ttccagcgg atg ttg agt ttt gcg     294
                                           Met Leu Ser Phe Ala
                                             1               5
acc ctt cgt ggc cgc att tca aca gtt gac gct gca aaa gcc gca cct    342
Thr Leu Arg Gly Arg Ile Ser Thr Val Asp Ala Ala Lys Ala Ala Pro
                 10                  15                  20
ccg cca tcg cca cta gcc ccg att gat ctc act gac cat agt caa gtg    390
Pro Pro Ser Pro Leu Ala Pro Ile Asp Leu Thr Asp His Ser Gln Val
             25                  30                  35
gcc ggt gtg atg aat ttg gct gcg aga att ggc gat att ttg ctt tct    438
Ala Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg Ile Gly Asp Ile Leu Leu Ser
         40                  45                  50
tca ggt acg tca aat agt gac acc aag gta caa gtt cga gca gtg acc    486
Ser Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gln Val Arg Ala Val Thr
     55                  60                  65
tct gcg tac ggt ttg tac tac acg cac gtg gat atc acg ttg aat acg    534
Ser Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp Ile Thr Leu Asn Thr
 70                  75                  80                  85
atc acc atc ttc acc aac atc ggt gtg gag agg aag atg ccg gtc aac    582
Ile Thr Ile Phe Thr Asn Ile Gly Val Glu Arg Lys Met Pro Val Asn
                 90                  95                 100
gtg ttt cat gtt gta ggc aag ttg gac acc aac ttc tcc aaa ctg tct    630
Val Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn Phe Ser Lys Leu Ser
            105                 110                 115
gag gtt gac cgt ttg atc cgt tcc att cag gct ggt gcg acc ccg cct    678
Glu Val Asp Arg Leu Ile Arg Ser Ile Gln Ala Gly Ala Thr Pro Pro
        120                 125                 130
gag gtt gcc gag aaa atc ctg gac gag ttg gag caa tcc cct gcg tct    726
Glu Val Ala Glu Lys Ile Leu Asp Glu Leu Glu Gln Ser Pro Ala Ser
    135                 140                 145
tat ggt ttc cct gtt gcg ttg ctt ggc tgg gca atg atg ggt ggt gct    774
Tyr Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala Met Met Gly Gly Ala
150                 155                 160                 165
gtt gct gtg ctg ttg ggt ggt gga tgg cag gtt tcc cta att gct ttt    822
Val Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gln Val Ser Leu Ile Ala Phe
                170                 175                 180
att acc gcg ttc acg atc att gcc acg acg tca ttt ttg gga aag aag    870
Ile Thr Ala Phe Thr Ile Ile Ala Thr Thr Ser Phe Leu Gly Lys Lys
            185                 190                 195
ggt ttg cct act ttc ttc caa aat gtt gtt ggt ggt ttt att gcc acg    918
Gly Leu Pro Thr Phe Phe Gln Asn Val Val Gly Gly Phe Ile Ala Thr
        200                 205                 210
ctg cct gca tcg att gct tat tct ttg gcg ttg caa ttt ggt ctt gag    966
Leu Pro Ala Ser Ile Ala Tyr Ser Leu Ala Leu Gln Phe Gly Leu Glu
    215                 220                 225
atc aaa ccg agc cag atc atc gca tct gga att gtt gtg ctg ttg gca    1014
Ile Lys Pro Ser Gln Ile Ile Ala Ser Gly Ile Val Val Leu Leu Ala
230                 235                 240                 245
ggt ttg aca ctc gtg caa tct ctg cag gac ggc atc acg ggc gct ccg    1062
Gly Leu Thr Leu Val Gln Ser Leu Gln Asp Gly Ile Thr Gly Ala Pro
                250                 255                 260
gtg aca gca agt gca cga ttt ttc gaa aca ctc ctg ttt acc ggc ggc    1l10
Val Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu Leu Phe Thr Gly Gly
            265                 270                 275
att gtt gct ggc gtg ggt ttg ggc att cag ctt tct gaa atc ttg cat    1158
Ile Val Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile Gln Leu Ser Glu Ile Leu His
        280                 285                 290
gtc atg ttg cct gcc atg gag tcc gct gca gca cct aat tat tcg tct    1206
Val Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala Pro Asn Tyr Ser Ser
    295                 300                 305
aca ttc gcc cgc att atc gct ggt ggc gtc acc gca gcg gcc ttc gca    1254
Thr Phe Ala Arg Ile Ile Ala Gly Gly Val Thr Ala Ala Ala Phe Ala
310                 315                 320                 325
gtg ggt tgt tac gcg gag tgg tcc tcg gtg att att gcg ggg ctt act    1302
Val Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val Ile Ile Ala Gly Leu Thr
                330                 335                 340
gcg ctg atg ggt tct gcg ttt tat tac ctc ttc gtt gtt tat tta ggc    1350
Ala Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe Val Val Tyr Leu Gly
            345                 350                 355
ccc gtc tct gcc gct gcg att gct gca aca gca gtt ggt ttc act ggt    1398
Pro Val Ser Ala Ala Ala Ile Ala Ala Thr Ala Val Gly Phe Thr Gly
        360                 365                 370
ggt ttg ctt gcc cgt cga ttc ttg att cca ccg ttg att gtg gcg att    1446
Gly Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu Ile Pro Pro Leu Ile Val Ala Ile
    375                 380                 385
gcc ggc atc aca cca atg ctt cca ggt cta gca att tac cgc gga atg    1494
Ala Gly Ile Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala Ile Tyr Arg Gly Met
390                 395                 400                 405
tac gcc acc ctg aat gat caa aca ctc atg ggt ttc acc aac att gcg    1542
Tyr Ala Thr Leu Asn Asp Gln Thr Leu Met Gly Phe Thr Asn Ile Ala
                410                 415                 420
gtt gct tta gcc act gct tca tca ctt gcc gct ggc gtg gtt ttg ggt    1590
Val Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala Gly Val Val Leu Gly
            425                 430                 435
gag tgg att gcc cgc agg cta cgt cgt cca cca cgc ttc aac cca tac    1638
Glu Trp Ile Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro Arg Phe Asn Pro Tyr
        440                 445                 450
cgt gca ttt acc aag gcg aat gag ttc tcc ttc cag gag gaa gct gag    1686
Arg Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe Gln Glu Glu Ala Glu
    455                 460                 465
cag aat cag cgc cgg cag aga aaa cgt cca aag act aat cag aga ttc    1734
Gln Asn Gln Arg Arg Gln Arg Lys Arg Pro Lys Thr Asn Gln Arg Phe
470                 475                 480                 485
ggt aat aaa agg taaaaatcaa cctgcttagg cgtctttcgc ttaaatagcg       1786
Gly Asn Lys Arg
tagaatatcg ggtcgatcgc ttttaaacac tcaggaggat ccttgccggc caaaatcacg 1846
gacactcgtc ccaccccaga atcccttcac gctgttgaag aggaaaccgc agccggggta 1906
ccg                                                               1909
<210>4
<211>489
<212>PRT
<213>谷氨酸棒状杆菌ATCC13032
<400>4
Met Leu Ser Phe Ala Thr Leu Arg Gly Arg Ile Ser Thr Val Asp Ala
  1               5                  10                  15
Ala Lys Ala Ala Pro Pro Pro Ser Pro Leu Ala Pro Ile Asp Leu Thr
             20                  25                  30
Asp His Ser Gln Val Ala Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg Ile Gly
         35                  40                  45
Asp Ile Leu Leu Ser Ser Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gln
     50                  55                  60
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp
 65                  70                  75                  80
Ile Thr Leu Asn Thr Ile Thr Ile Phe Thr Asn Ile Gly Val Glu Arg
                 85                  90                  95
Lys Met Pro Val Asn Val Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn
            100                 105                 110
Phe Ser Lys Leu Ser Glu Val Asp Arg Leu Ile Arg Ser Ile Gln Ala
        115                 120                 125
Gly Ala Thr Pro Pro Glu Val Ala Glu Lys Ile Leu Asp Glu Leu Glu
    130                 135                 140
Gln Ser Pro Ala Ser Tyr Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala
145                 150                 155                 160
Met Met Gly Gly Ala Val Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gln Val
                165                 170                 175
Ser Leu Ile Ala Phe Ile Thr Ala Phe Thr Ile Ile Ala Thr Thr Ser
            180                 185                 190
Phe Leu Gly Lys Lys Gly Leu Pro Thr Phe Phe Gln Asn Val Val Gly
        195                 200                 205
Gly Phe Ile Ala Thr Leu Pro Ala Ser Ile Ala Tyr Ser Leu Ala Leu
    210                 215                 220
Gln Phe Gly Leu Glu Ile Lys Pro Ser Gln Ile Ile Ala Ser Gly Ile
225                 230                 235                 240
Val Val Leu Leu Ala Gly Leu Thr Leu Val Gln Ser Leu Gln Asp Gly
                245                 250                 255
Ile Thr Gly Ala Pro Val Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu
            260                 265                 270
Leu Phe Thr Gly Gly Ile Val Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile Gln Leu
        275                 280                 285
Ser Glu Ile Leu His Val Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala
    290                 295                 300
Pro Asn Tyr Ser Ser Thr Phe Ala Arg Ile Ile Ala Gly Gly Val Thr
305                 310                 315                 320
Ala Ala Ala Phe Ala Val Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val Ile
                325                 330                 335
Ile Ala Gly Leu Thr Ala Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe
            340                 345                 350
Val Val Tyr Leu Gly Pro Val Ser Ala Ala Ala Ile Ala Ala Thr Ala
        355                 360                 365
Val Gly Phe Thr Gly Gly Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu Ile Pro Pro
    370                 375                 380
Leu Ile Val Ala Ile Ala Gly Ile Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala
385                 390                 395                 400
Ile Tyr Arg Gly Met Tyr Ala Thr Leu Asn Asp Gln Thr Leu Met Gly
                405                 410                 415
Phe Thr Asn Ile Ala Val Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala
            420                 425                 430
Gly Val Val Leu Gly Glu Trp Ile Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro
        435                 440                 445
Arg Phe Asn Pro Tyr Arg Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe
    450                 455                 460
Gln Glu Glu Ala Glu Gln Asn Gln Arg Arg Gln Arg Lys Arg Pro Lys
465                 470                 475                 480
Thr Asn Gln Arg Phe Gly Asn Lys Arg
                485
Figure C0181019800291

Claims (21)

1.一种发酵生产L-苏氨酸的方法，包括采用肠杆菌科细菌，而且其中编码thrE基因的棒状细菌的核苷酸序列被过表达，其中所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3。
2.权利要求1的方法，其中采用已经生产L-苏氨酸的那些肠杆菌科细菌。
3.权利要求1的方法，其中除了thrE基因之外，还有一些基因被增强。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述肠杆菌科的微生物来自埃希氏菌属和沙雷氏菌属。
5.权利要求4的方法，其中所述微生物来自埃希氏菌属。
6.权利要求5的方法，其中所述微生物来自大肠杆菌。
7.权利要求1的方法，其中编码天冬氨酸激酶，高丝氨酸脱氢酶，高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子被同时增强。
8.权利要求1的方法，其中编码丙酮酸羧化酶的pyc基因是同时增强的。
9.权利要求1的方法，其中编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因被同时增强。
10.权利要求1的方法，其中编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因被同时增强。
11.权利要求1的方法，其中编码转氢酶的pntA和pntB基因被同时增强。
12.权利要求1的方法，其中采用这样的细菌，该细菌中降低L-苏氨酸形成的代谢途径至少部分被消除。
13.权利要求1的方法，其中采用用一质粒载体转化的菌株，所述质粒载体携带编码棒状细菌的thrE基因的核苷酸序列。
14.权利要求1的方法，其中采用通过质粒pZ1thrE转化的细菌，所述质粒包含于保藏在德国不伦瑞克的德意志微生物保藏中心的保藏号为DSM 12840的黄色短杆菌菌株DM368-2pZ1thrE中。
15.权利要求1的方法，其中thrE基因的表达是被诱导的。
16.权利要求14的方法，其中thrE基因的表达是通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导的。
17.权利要求1的方法，其中编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因被同时增强。
18.权利要求1的方法，其中授予高丝氨酸抗性的rhtB基因被同时增强。
19.一种生产L-苏氨酸的方法，其包括进行以下步骤：
a)发酵肠杆菌科的微生物，其中至少棒状细菌的thrE基因被过表达，所述thrE基因编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，
b)浓缩培养基或肠杆菌科微生物的细胞中的L-苏氨酸，及
c)分离所述L-苏氨酸。
20.含有谷氨酸棒杆菌ATCC13032的thrE基因的质粒pZ1thrE，所述质粒包含于保藏在德国不伦瑞克的德意志微生物保藏中心的保藏号为DSM 12840的黄色短杆菌菌株DM368-2pZ1thrE中。
21.黄色短杆菌菌株DM368-2pZ1thrE，保藏在德国不伦瑞克的德意志微生物保藏中心，保藏号为DSM12840。
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