KR20030036199A - Ｌ-트레오닌의 발효 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이미 L-트레오닌을 생산하며 코리네형 세균의 thrE 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)이 증강된, 특히 과발현된 엔테로박테리아세애를 사용하여 L-트레오닌을 발효 제조하는 방법을 제공한다.

Description

Ｌ-트레오닌의 발효 제조 방법 {Process for the fermentative preparation of L-threonine}

L-트레오닌은 동물 영양, 사람 의약 및 제약 산업에서 사용된다. L-트레오닌은 엔테로박테리아세애 균주, 특히 에스케리치아 콜라이 및 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)의 발효에 의해서 제조할 수 있는 것으로 공지되어져 있다. 이의 중요성으로 인해, 제조 방법을 개선시키고자 하는 노력이 계속되고 있다. 방법의 개선은 예를 들면, 교반 및 산소 공급 같은 발효 방법, 또는 예를 들면, 발효 동안 당 농도 같은 영양 배지의 조성, 또는 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물 형태의 후처리, 또는 미생물 자체의 본질적인 산출 특성과 관련될 수 있다.

돌연변이유발, 선택 및 돌연변이체 선택 방법을 사용하여 이러한 미생물의 산출 특성을 개선시킨다. 예를 들면, 트레오닌 유사체 α-아미노-β-하이드록시발레르산(AHV) 같은 항대사산물에 내성이고, 조절성 중요 아미노산에 대해 영양요구성이며 L-트레오닌을 생산하는 균주가 이러한 방식으로 수득된다.

개개의 트레오닌 생합성 유전자들을 증폭시키고 L-트레오닌 생산에 대한 영향을 조사함으로써, L-트레오닌을 생산하는 엔테로박테리아세애 균주들의 균주를 개선시키기 위해서, 수년 동안 재조합 DNA 기술 방법이 또한 사용되어져 왔다.

발명의 목적

본 발명자들은 L-트레오닌의 개선된 발효 제조를 위한 신규한 방법을 제공하고자 하였다.

본 발명은 코리네형 세균의 thrE 유전자가 증강된 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae)를 사용한 L-트레오닌의 발효 제조 방법에 관한 것이다.

하기 도면이 첨부된다.

도 1은 트랜스포존 Tn5531을 함유하는 플라스미드 pCGL0040의 맵이다. 트랜스포존은 음영이 없는 화살표로서 확인된다.

도 2는 thrE 유전자를 함유하는 플라스미드 pZ1thrE의 맵이다.

도 3은 thrE 유전자를 함유하는 플라스미드 pTrc99AthrE의 맵이다.

도 4는 thrE 유전자를 함유하는 플라스미드 pMW218thrE의 맵이다.

길이 데이터는 대략적인 데이터로서 이해되어야 한다. 사용된 약어 및 명칭은 다음의 의미를 갖는다:

Amp: 암피실린 내성 유전자,

Kan: 카나마이신 내성 유전자,

'amp: 암피실린 내성 유전자의 3' 부분,

oriBR322: 플라스미드 pBR322의 복제 영역,

lacI: trc 프로모터의 레프레서 단백질 유전자,

ptrc: trc 프로모터 영역, IPTG-유도성,

5S: 5S rRNA 영역,

rrnBT: rRNA 종결인자 영역.

제한 효소에 대한 약어는 하기 의미를 갖는다:

BamHI: 바실러스 아밀로리퀘패시언스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터의 제한 엔도뉴클레아제,

BglII: 바실러스 글로비기이(Bacillus globigii)로부터의 제한 엔도뉴클레아제,

ClaI: 카리파논 라툼(Caryphanon latum)으로부터의 제한 엔도뉴클레아제,

EcoRI: 에스케리치아 콜라이로부터의 제한 엔도뉴클레아제,

EcoRV: 에스케리치아 콜라이로부터의 제한 엔도뉴클레아제,

HindIII: 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터의 제한 엔도뉴클레아제,

KpnI: 클레브시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)로부터의 제한 엔도뉴클레아제,

PstI: 프로비덴시아 스투아르티이(Providencia stuartii)로부터의 제한 엔도뉴클레아제,

PvuI: 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)로부터의 제한 엔도뉴클레아제,

SacI: 스트렙토마이세스 아치로모게네스(Streptomyces achromogenes)로부터의 제한 엔도뉴클레아제,

SalI: 스트렙토마이세스 알부스(Streptomyces albus)로부터의 제한 엔도뉴클레아제,

SmaI: 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)로부터의 제한 엔도뉴클레아제,

XbaI: 크산토모나스 바드리이(Xanthomonas badrii)로부터의 제한 엔도뉴클레아제,

XhoI: 크산토모나스 홀시콜라(Xanthomonas holcicola)로부터의 제한 엔도뉴클레아제.

원본(제출용) - 2001. 04. 04. 02:03:45 PM에 인쇄됨

0-10-1-1	Form-PCT/RO/134(EASY)기탁된 미생물(들) 또는 기타 생물학적 물질에 관한 표시(PCT Rule 13bis)제조에 사용된 것	PCT-EASY Version 2.91(2001.01.01 업데이트됨)
0-2	국제 출원 번호
0-3	출원인 또는 대리인의 파일 참조번호	000225 BT
11-11-2	하기 표시는 하기의 기재와 관련된 기탁된 미생물(들) 또는 기타 생물학적 물질에 관한 것이다:페이지행	81-7
1-31-3-11-3-21-3-31-3-4	기탁 확인기탁기관의 명칭기탁기관의 주소기탁 일자수탁번호	DSMZ-도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하독일 데-38124 브라운슈바이크 마쉐로데르 벡 1b1999년 6월 3일(03.06.1999)DSMZ 12840
1-4	부가적인 표시	없음
1-5	표시를 나타내고자 하는 지정국	모든 지정국
1-6	표시의 개별적 제공이러한 표시는 차후 국제기관에 제출될 것이다.	없음
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국제기관용도만을 위함
0-5	본 형식은 ~일자로 국제기관에 의해 수령되었다:
0-5-1	권한을 부여받은 공무원

본 발명은 특히, 이미 L-트레오닌을 생산하며 코리네형 세균의 thrE 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 증강된, 특히 과발현된 엔테로박테리아세애를 사용하여 L-트레오닌을 발효 제조하는 방법을 제공한다.

특히, 본 방법은,

a) 임의로 추가의 유전자들과 함께, 적어도 코리네형 세균의 thrE 유전자가 증강된(과발현된) 엔테로박테리아세애 과의 미생물을 발효시키는 단계;

b) 배지에서 또는 엔테로박테리아세애 과의 미생물의 세포에서 L-트레오닌을 농축시키는 단계; 및

c) L-트레오닌을 분리하는 단계를 수행함을 포함하는, L-트레오닌의 제조 방법이다.

이와 관련하여, 용어 "증강"은 예를 들면, 강력한 프로모터 또는 고활성의 상응하는 효소 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 사용하고, 임의로 이러한 방법들을 병용하여, 유전자 또는 유전자들의 복사수를 증가시킴으로써, 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 미생물내 효소 또는 단백질 하나 이상의 세포내 활성을 증가시키는 것을 기술한다.

본 발명에서 제공되는 미생물은 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 당밀, 전분, 셀룰로오스로부터, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 L-트레오닌을 제조할 수 있다. 이들 미생물은 엔테로박테리아세애, 특히 에스케리치아 및 세라티아 속으로 대표된다. 에스케리치아 속에서, 에스케리치아 콜라이 종 및 세라티아 속에서 세라티아 마르세센스 종이 특히 언급된다.

에스케리치아 속, 특히 에스케리치아 콜라이 종의 적합한 L-트레오닌 생산 균주는 예를 들면, 에스케리치아 콜라이 TF427, 에스케리치아 콜라이 H4578, 에스케리치아 콜라이 KY10935, 에스케리치아 콜라이 VNIIgenetika MG-442, 에스케리치아 콜라이 VNIIgenetika M1, 에스케리치아 콜라이 VNIIgenetika 472T23, 에스케리치아 콜라이 BKIIM B-3996, 에스케리치아 콜라이 kat 13 및 에스케리치아 콜라이 KCCM-10132가 있다.

세라티아 속, 특히 세라티아 마르세센스 종의 적합한 L-트레오닌 생산 균주는 예를 들면, 세라티아 마르세센스 HNr21, 세라티아 마르세센스 TLr156 및 세라티아 마르세센스 T2000이 있다.

본원에 이르러, 엔테로박테리아세애는 트레오닌 수송을 암호화하는 코리네형 세균의 thrE 유전자의 과발현 후에 L-트레오닌을 개선된 방식으로 생산한다는 것이 확인되었다.

코리네형 세균의 thrE 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1 및 서열 번호 3에 나타내며 상기 수송 단백질의 수득되는 아미노산 서열은 서열 번호 2 및 서열 번호 4에 나타낸다.

서열 번호 1 및 서열 번호 3에 나타낸 thrE 유전자는 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 유전자 암호의 축퇴성 또는 중화 기능의 센스 돌연변이에 기인하는 코리네형 세균의 thrE 유전자의 대립형질을 또한 사용할 수 있다.

과발현을 달성하기 위해서, 상응하는 유전자의 복사수를 증가시키거나, 프로모터 및 조절 영역 또는 구조 유전자의 상류 리보좀 결합 부위를 돌연변이시킬 수 있다. 구조 유전자의 상류에 도입되는 발현 카셋트는 동일한 방식으로 작용한다. 유도성 프로모터에 의해, 또한, 발효성 L-트레오닌 생산 과정에서 발현을 증가시킬 수 있다. 발현은 마찬가지로 mRNA의 반감기를 연장시키기 위한 방법에 의해 개선된다. 추가로, 효소 활성은 또한 효소 단백질의 분해를 예방시켜 증가시킨다. 유전자 또는 유전자 작제물은 다양한 복사수로 플라스미드내에 존재할 수 있거나, 염색체내에 통합되어 증폭될 수 있다. 대안으로, 당해 유전자의 과발현은 추가로 배지 조성 및 배양 과정을 변경시킴으로써 달성할 수 있다.

본 내용에서의 지침들은 전문가에 의해, 특히 문헌[Chang and Cohen, Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978); Hartley and Gregori, Gene 13:347-353 (1981); Amann and Brosius, Gene 40: 183-190 (1985); de Broer et al., Proceedings of the National of Sciences of the United States of America 80: 21-25 9183); LaVallie et al., BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993); 제PCT/US97/13359호; Llosa et al., Plasmid 26: 222-224 (1991); Quandt and Klipp, Gene 80: 161-169 (1989); Hamilton, Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989); Jensen and Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)], 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교재들에서 확인할 수 있다.

엔테로박테리아세애에서 복제할 수 있는 플라스미드 벡터, 예를 들면, pACYC184[Bartolome et al., Gene 102, 75-78 (1991)], pTrc99A[Amann et al., Gene 69: 301-315 (1988)] 또는 pSC101 유도체[Vocke and Bastia, Proceedings of the National Academy of Science USA 80 (21): 6557-6561 (1983)]로부터 유도된 클로닝 벡터가 사용될 수 있다. 코리네형 세균의 thrE 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 갖는 플라스미드 벡터로 형질전환된 균주를 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다.

또한, 코리네형 세균의 thrE 유전자 이외에, 공지된 트레오닌 생합성 경로의효소 또는 보충 대사(anaplerotic metabolism)의 효소 또는 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트의 생산을 위한 효소 하나 이상을 과발현하는 엔테로박테리아세애 과의 균주를 사용하여 L-트레오닌을 생산하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 예를 들면,

ㆍ 동시에, 아스파르테이트 키나제, 호모세린 데하이드로게나제, 호모세린키나제 및 트레오닌 신타제를 암호화하는 thrABC 오페론[미국 특허 제4,278,765호],

ㆍ 동시에, 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자[독일 특허원 제19 831 609호],

ㆍ 동시에, 포스포에놀 피루베이트 신타제를 암호화하는 pps 유전자[Molecular and General Genetics 231: 332 (1992)],

ㆍ 동시에, 포스포에놀 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 ppc 유전자[Gene 31: 279-283 (1984)],

ㆍ 동시에, 트랜스하이드로게나제를 암호화하는 유전자 pntA 및 pntB [European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)],

ㆍ 동시에, 글루타메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gdhA 유전자[Gene 27: 193-199 (1984)], 또는

ㆍ 동시에, L-호모세린 내성을 부여하는 rhtB 유전자[유럽 특허원 제0994190호]를 증강, 특히 과발현시킬 수 있다.

thrE 유전자를 과발현시키는 것 이외에, L-트레오닌을 생산하기 위해서, 추가로 예를 들면, 트레오닌 데하이드로게나제 같은 바람직하지 않은 부반응을 제거하는 것이 유리할 수 있다[Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982 and Bell and Turner, Biochemical Journal 156, 449-458 (1976)]. L-트레오닌 형성을 감소시키는 대사경로가 적어도 부분적으로 제거된 세균을 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 미생물은 배치 방법(배치 배양) 또는 페드 배치 방법(피드 방법)으로 배양시킬 수 있다. 공지된 배양 방법들에 대한 요약은 교재[Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology) Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991] 또는 교재[Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Bioreactors and Peripheral Equipment) Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994]에서 기술되어져 있다.

사용되는 배양 배지는 적합한 방식으로 특정 균주의 필요조건에 부합시켜야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지에 대한 기술은 핸드북["Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981]에 포함된다. 예를 들면, 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 당밀, 전분 및 셀룰로오스 같은 당 및 탄수화물; 예를 들면, 대두 오일, 해바라기유, 낙화생유 및 코코넛 지방 같은 오일 및 지방; 예를 들면, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산 같은 지방산; 예를 들면, 글리세롤 및 에탄올 같은 알콜; 및 예를 들면, 아세트산 같은 유기산이 탄소원으로서 사용될 수 있다. 이러한 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 우레아 같은 유기 질소-함유 화합물, 및 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카보네이트 및 암모늄 니트레이트 같은 무기 화합물이 질소원으로서 사용될 수 있다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염들이 인 공급원으로서 사용될 수 있다. 배양 배지는 추가로 금속 염, 예를 들면, 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철 같은 금속 염을 포함해야 한다. 최종적으로, 아미노산 및 비타민 같은 필수 성장 물질들이 상기 언급된 물질들에 부가하여 사용될 수 있다. 적합한 전구체들이 또한 배양 배지에 부가될 수 있다. 언급된 출발 물질들은 단일 배치의 형태로 배양물에 부가될 수 있거나, 적합한 방식으로 배양 동안 공급될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아 수용액 같은 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산 같은 산성 화합물을 적합한 방식으로 사용하여 pH를 조절할 수 있다. 예를 들면, 지방산 폴리글리콜 에스테르 같은 소포제를 사용하여 발포체의 생성을 조절할 수 있다. 예를 들면, 항생제 같은 선택 작용을 갖는 적합한 물질을 배지에 부가하여 플라스미드의 안정성을 유지시킬 수 있다. 호기성 조건을 유지시키기 위해서, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물, 예를 들면 공기를 배양물내로 도입시킨다. 배양물의 온도는 일반적으로 25℃ 내지 45℃이며 바람직하게는 30℃ 내지 40℃이다. 배양은 L-트레오닌이 최대로 형성될 때까지 계속된다. 이러한 목적은 일반적으로 10시간 내지 160시간내에 달성된다.

L-트레오닌의 분석은 문헌[Spackman et al., Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]에 기술된 바와 같이, 음이온 교환 크로마토그래피 이후 후속적인 닌하이드린 유도체화에 의해 수행될 수 있거나, 문헌[Lindroth et al., AnalyticalChemistry (1979) 51: 1167-1174]에 기술된 바와 같이 역상 HPLC로 수행할 수 있다.

하기 미생물은 부다페스트 조약에 따라서 도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌(DSMZ-German Collection of Microorganismz and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)에 기탁되었다:

DSM 12840으로서 브레비박테리움 플라붐 균주 DM368-2 pZ1thrE.

플라스미드 pZ1thrE는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 thrE 유전자를 함유한다.

본 발명은 구체적인 실시예를 통해 하기에서 보다 상세히 설명된다.

에스케리치아 콜라이로부터의 플라스미드 DNA의 분리 및 모든 제한 기술들, 클레나우 및 알칼리 포스파타제 처리 등은 문헌[Sambrook et al. Molecular cloning - A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press]의 방법으로 수행되었다. 에스케리치아 콜라이의 형질전환은 문헌[Chung et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1989) 86: 2172-2175]의 방법으로 수행하였다.

이. 콜라이 균주 및 형질전환체의 제조 동안 배양 온도는 37℃이었다. 문헌[Hamilton et al., Journal of Bacteriology (1989) 171: 4617-4622]의 유전자 대체 방법에서는 30℃ 및 44℃의 온도를 사용하였다.

실시예 1

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14752의 thrE 유전자의 클로닝 및 서열분석

1. 트랜스포존 돌연변이유발 및 돌연변이체 선택

균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14752△ilvA를 이의 서열이 NCBI(the National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA)의 뉴클레오타이드 데이터뱅크에 승인 번호 U53587로 수탁된 트랜스포존 Tn5531로 돌연변이유발시켰다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14752의 ivA 유전자내 결실의 도입은 문헌[Schafer et al., Gene (1994) 145: 69-73]에 기술된 유전자 교환 시스템을 사용하여 수행하였다. 이를 위해서, 문헌[Applied and Environmental Microbiology (1999) 65: 1973-1979]에서 작제된 불활성화 벡터 pK19mobsacB△ilvA를 결실에 사용하였다. 문헌[Jerpseth and Kretz, STRATEGIES in molecular biology 6, 22 (1993)]의 메틸라제-결핍된 에스케리치아 콜라이 균주 SCS110(제조원: Stratagene, Heidelberg, Germany)을 우선 벡터 pK19mobsacB△ilvA 200ng으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 카나마이신 50㎍/㎖를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 카나마이신 내성의 도움으로 확인하였다. 플라스미드 pK19mobsacB△ilvA는 형질전환체 중 하나로부터 제조하였다. 전기천공법[Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334]을 사용하여, 이후, 상기 불활성화 플라스미드를 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14752에 도입시켰다. 불활성화 벡터가 게놈내에 통합되어 존재하는 클론을 카나마이신 15㎍/㎖를 함유하는 LBHIS 아가 플레이트 상에서 카나마이신 내성의 도움으로 확인하였다[Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304]. 벡터의 절개를 위한 선택을 위해서, 카나마이신-내성 클론을 슈크로오스-함유 LBG 배지(아가 15g/ℓ, 2% 글루코오스 및 10% 슈크로오스를 갖는 LB 배지)에 플레이팅하였다. 이는 제2 재조합 사건으로 다시 벡터를 상실한 콜로니를 제공하였다[Jager et al., Journal of Bacteriology (1992) 174: 5462-5465]. L-이소루이신의 부재 또는 300㎎/ℓ의 존재하에서, 또는 카나마이신의 부재 또는 50㎍/㎖의 존재하에서, 최소 배지(15g/ℓ 아가를 갖는 CGXII 배지) 플레이트 상으로의 트랜스접종 (transinoculation)[Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603]에 의해, 벡터의 절개로 인해 카나마이신-감수성이며 이소루이신-영양요구성이고 불완전한 ilvA 유전자(△ilvA 대립형질)가 게놈내에 존재하지 않는 6개 클론을 분리하였다. 이러한 클론 중 하나를 균주 ATCC14752△ilvA로 명명하고 트랜스포존 돌연변이유발에 사용하였다.

메틸라제-결핍된 이. 콜라이 균주 GM2929pCGL0040[이. 콜라이 GM2929: Palmer et al., Gene (1994) 143: 1-12]으로부터 플라스미드 pCGL0040(도 1)을 분리하였으며, 이는 결합된 트랜스포존 Tn5531[Ankri et al., Journal of Bacteriology (1996) 178: 4412-4419]을 함유한다. 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14752△ilvA를 전기천공법[Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334]을 사용하여 플라스미드 pCGL0040으로 형질전환시켰다. 트랜스포존 Tn5531이 게놈내에 통합되어져 있는 클론을 카나마이신 15㎍/㎖를 함유하는 LBHIS 아가 플레이트 상에서 카나마이신 내성의 도움으로 확인하였다[Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304]. 2000개 클론을 이러한 방식으로 수득하고, 이를 트레오닐-트레오닐-트레오닌의 존재하에서 지연된 성장에대해서 연구하였다. 이를 위해서, 모든 클론을 개별적으로 2mM 트레오닐-트레오닐-트레오닌의 존재 또는 부재하에서 CGXII 최소 배지 아가 플레이트로 옮겼다. 상기 배지는 문헌[Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603]에 기술된 CGXII 배지와 동일하지만, 부가적으로 카나마이신 25㎍/㎖, L-이소루이신 300㎎/ℓ 및 아가 15g/ℓ를 함유하였다. 문헌[상기 Keilhauer et al.]에 기술된 배지의 조성은 표 1에 나타낸다.

CGXII 배지의 조성

성분	농도
(NH4)2SO4	20g/ℓ
우레아	5g/ℓ
KH2PO4	1g/ℓ
K2HPO4	1g/ℓ
MgSO4x 7 H2O	0.25g/ℓ
3-모르폴리노프로판설폰산	42g/ℓ
CaCl2	10㎎/ℓ
FeSO4x 7 H2O	10㎎/ℓ
MnSO4x H2O	10㎎/ℓ
ZnSO4x 7 H2O	1㎎/ℓ
CuSO4	0.2㎎/ℓ
NiCl2x 6 H2O	0.02㎎/ℓ
바이오틴	0.2㎎/ℓ
글루코오스	40g/ℓ
프로토카테츄산	30㎎/ℓ

아가 플레이트를 30℃에서 배양한 후 성장을 12, 18 및 24시간 후에 조사하였다. 트레오닐-트레오닐-트레오닌의 부재하에서 출발 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14752△ilvA와 비교할만한 방식으로 성장하지만 2mM 트레오닐-트레오닐-트레오닌의 존재하에서는 지연된 성장을 나타내는 트랜스포존돌연변이체를 수득하였다. 이를 ATCC14752△ilvAthrE::Tn5531로 명명하였다.

2. ATCC14752△ilvAthrE::Tn5531 중 Tn5531의 삽입 부위의 클로닝 및 서열분석

실시예 1.1에 기술된 돌연변이체에서 트랜스포존 Tn5531의 상류에 위치하는 삽입 부위를 클로닝하기 위해서, 상기 돌연변이체 균주의 염색체성 DNA를 우선 문헌[Schwarzer et al., Bio/Technology (1990) 9: 84-87]에 기술된 바와 같이 분리하고 이의 400ng을 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI으로 절단하였다. 완전한 제한 배치를 또한 EcoRI으로 선형화시킨 벡터 pUC18[Norander et al., Gene (1983) 26: 101-106, 제조원: Roche Diagnotics, Mannheim, Germany]에 연결시켰다. 이. 콜라이 균주 DH5αmcr[Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649]을 전기천공법[Dower et al., Nucleic Acid Research (1988) 16: 6127-6145]으로 전체 연결 배치를 사용하여 형질전환시켰다. 트랜스포존 Tn5531의 삽입 부위가 벡터 pUC18 상에 클론되어 존재하는 형질전환체를 카르베니실린 50㎍/㎖ 및 카나마이신 25㎍/㎖를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 카르베니실린 및 카나마이신 내성의 도움으로 확인하였다. 상기 플라스미드를 형질 전환체 3개로부터 제조하고 클로닝된 삽입물의 크기를 제한 분석으로 결정하였다. 약 5.7kb 크기의 삽입물을 갖는 플라스미드 중 하나 상에서 삽입 부위의 뉴클레오타이드 서열은 문헌[Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467]의 디데옥시 쇄 종결 방법으로 결정하였다. 이를 위해서,삽입물 2.2kb를 하기 올리고뉴클레오타이드 프라이머로부터 출발하여 서열분석하였다: 5'-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3'.

트랜스포존의 하류에 위치하는 삽입 부위의 확인을 위해서, 돌연변이체의 염색체성 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 XbaI으로 절단하고 XbaI으로 선형화시킨 벡터 pUC18에 연결시켰다. 추가의 클로닝은 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 약 8.5kb 크기의 삽입물을 갖는 플라스미드 중 하나 상에서 삽입 부위의 뉴클레오타이드 서열을 문헌[Sanger et al., Proceddings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467]의 디데옥시 쇄 종결 방법으로 결정하였다. 이를 위해서, 삽입물 0.65kb를 하기 올리고뉴클레오타이드 프라이머로부터 출발하여 서열분석하였다: 5'-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3'.

수득된 뉴클레오타이드 서열을 분석하고 Lasergene 프로그램 팩키지(Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA)로 함께 연결시켰다. 상기 뉴클레오타이드 서열을 서열 번호 1로서 기술하였다. 분석 결과는 1467bp 길이의 개방 판독 프레임을 확인시켜 주었다. 상응하는 유전자를 thrE 유전자로 명명하였다. 연관된 유전자 생성물은 489개 아미노산을 포함하며 서열 번호 2로서 기술하였다.

실시예 2

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 thrE 유전자의 클로닝 및 서열분석

thrE 유전자를 이. 콜라이 클로닝 벡터 pUC18[Norrander et al., Gene(1983) 26: 101-106: 제조원: Roche Diagnotics, Mannheim, Germany]에 클로닝하였다. 상기 클로닝은 두 단계로 수행되었다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 상기 유전자를 우선 서열 번호 1로부터 유도된 하기 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시켰다.

thrE-정방향:

5'-CCC CTT TGA CCT GGT GTT ATT G-3'

thrE-역방향:

5'-CGG CTG CGG TTT CCT CTT-3'

PCR 반응은 각각의 경우 상응하는 올리고뉴클레오타이드 1uM인 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200uM, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 염색체성 DNA 100ng, 1/10 용적의 10배 반응 완충액 및 열-안정성 Taq-/Pwo-DNA 폴리머라제 혼합물(Expand High Fidelity PCR System, 제조원: Roche Diagnotics, Mannheim, Germany) 2.6 유니트의 존재 중에서 써모사이클러(PTC-100, 제조원: MJ Research, Inc., Watertown, USA)내에서 30초 동안 94℃, 30초 동안 58℃ 및 2분 동안 72℃의 조건 하에서 30회 사이클로 수행하였다.

약 1.9kb 크기의 증폭된 단편은 이후, SureClone Ligation Kit(제조원: Amersham Pharmacia Bioteh, Uppsala, Sweden)의 도움으로 제조원의 지침에 따라서 벡터 pUC18의 SmaI 절단 부위내로 연결시켰다. 이. 콜라이 균주 DH5αmcr[Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America USA (1990) 87: 4645-4649]을 전체 연결 배치를 사용하여 형질전환시켰다. 형질전환체를 카르베니실린 50㎍/㎖를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 카르베니실린 내성의 도움으로 확인하였다. 플라스미드를 형질전환체 중 8개로부터 제조하고 제한 분석으로 삽입물로서 1.9kb PCR 단편의 존재를 조사하였다. 이러한 방식으로 제조된 상기 재조합 플라스미드를 하기에서 pUC18thrE로 명명하였다.

플라스미드 pUC18thrE 중 1.9kb PCR 단편의 뉴클레오타이드 서열은 문헌[Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467]의 디데옥시 쇄 종결 방법으로 결정하였다. 이를 위해서, pUC18thrE의 완전한 삽입물을 제조원(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)의 하기 프라이머의 도움으로 서열분석하였다:

보편적 프라이머:

5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'

역방향 프라이머:

5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3'

상기 뉴클레오타이드 서열을 서열 번호 3으로서 기술하였다. 수득된 뉴클레오타이드 서열을 Lasergene 프로그램 팩키지(Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA)를 사용하여 분석하였다. 분석 결과, 1467bp 길이의 개방 판독 프레임을 확인하였으며, 이는 thrE 유전자로 명명되었다. 이는 489개 아미노산의 폴리펩타이드를 암호화하며, 이는 서열 번호 4로서 기술되었다.

실시예 3

코리네박테리움 글루타미쿰에서 thrE 유전자의 발현

실시예 2에서 기술된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 thrE 유전자를 벡터 pZ1[Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554]에 발현을 위해서 클로닝하였다. 이를 위해서, thrE 유전자를 함유하는 1881bp 크기의 DNA 단편을 제한 효소 SacI 및 XbaI으로 플라스미드 pUC18thrE로부터 절단하였다. 상기 단편의 5' 및 3' 말단을 클레나우 효소로 처리하였다. 수득되는 DNA 단편을 SacI으로 선형화하고 미리 탈인산화시킨 벡터 pZ1에 연결시켰다. 이. 콜라이 균주 DH5αmcr[Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649]을 전체 연결 배치로 형질전환시켰다. 형질전환체는 카나마이신 50㎍/㎖를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 카나마이신 내성의 도움으로 확인하였다. 플라스미드를 2개의 형질전환체로부터 제조하고 제한 분석에 의해 삽입물로서 1881bp ScaI/XbaI 단편의 존재를 조사하였다. 이러한 방식으로 형성된 재조합 플라스미드를 pZ1thrE로 명명하였다(도 2).

전기천공법[Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334]을 사용하여, 플라스미드 pZ1thrE를 트레오닌-형성 균주 브레비박테리움 플라붐 DM368-2내로 도입시켰다. 균주 DM368-2는 문헌[유럽 특허 제0 385 940호]에 기술되어져 있고 DSM5399로서 기탁되어져 있다. 형질전환체를 카나마이신 15㎍/㎖를 함유하는 LBHIS 아가 플레이트 상에서 카나마이신 내성의 도움으로확인하였다[Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304]. 균주 브레비박테리움 플라붐 DM368-2 pZ1thrE를 이러한 방식으로 제조하였다.

실시예 4

발현 벡터 pTrc99AthrE의 작제

실시예 2에서 기술된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 thrE 유전자를 에스케리치아 콜라이에서의 발현을 위해 에스케리치아 콜라이에서의 발현을 위한 제조원(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)으로부터 수득된 벡터 pTrc99A내로 클로닝시켰다. 이를 위해서, 플라스미드 pUC18thrE를 효소 SalI으로 절단하고 돌출성 3' 말단을 클레나우 효소로 처리하였다. 효소 KpnI으로 제한 절단한 후, 절단 배치를 0.8% 아가로오스 겔에서 분리하고 1.9kb 크기의 thrE 단편을 QIAquick Gel Extraction Kit(제조원: QIAGEN, Hilden, Germany)의 도움으로 분리하였다. 벡터 pTrc99A를 효소 EcoRI으로 절단하고, 3' 말단을 클레나우 단편으로 처리한 후, 효소 KpnI으로 절단시키고 분리된 thrE 단편과 연결시켰다. 연결 배치를 이. 콜라이 균주 DH5α에 형질전환시켰다. pTrc99A를 갖는 세포의 선택을 암피실린 50㎍/㎖를 부가시킨 LB 아가[Lennox, Virology 1: 190 (1955)] 상에서 수행하였다. thrE 유전자의 성공적인 클로닝은 플라스미드 DNA 분리 및 XbaI, BamHI, EcoRI, HindIII 및 SspI을 사용한 제어 절단으로 입증될 수 있었다. 상기 플라스미드는 pTrc99AthrE로 명명되었다(도 3).

실시예 5

균주 MG442/pTrc99AthrE를 사용한 L-트레오닌의 제조

L-트레오닌 생산성 이. 콜라이 균주 MG442는 문헌[미국 특허 제4,278,765호]에 기술되어져 있으며 CMIM B-1628로서 기탁기관(the Russian National Collection of Industrial Microorganisms, VKPM, Moscow, Russia)에 기탁되었다.

균주 MG442는 플라스미드 pTrc99AthrE로 형질전환시키고 플라스미드 함유 세포를 암피실린 50㎍/㎖를 함유하는 LB 아가 상에서 선택하였다. 이후, 선택된 개별 콜로니를 하기 조성을 갖는 최소 배지(Na₂HPO₄*2H₂O 3.5g/ℓ, KH₂PO₄1.5g/ℓ, NH₄Cl 1g/ℓ, MgSO₄*7H₂O 0.1g/ℓ, 글루코오스 2g/ℓ, 아가 20g/ℓ, 암피실린 50㎎/ℓ) 상에서 추가로 증식시켰다. L-트레오닌의 형성은 100㎖ 원추형 플라스크 중 10㎖ 배치 배양물에서 조사하였다. 이를 위해서, 하기 조성의 10㎖ 예비배양 배지(효모 추출물 2g/ℓ, (NH₄)₂SO₄10g/ℓ, KH₂PO₄1g/ℓ, MgSO₄*7H₂O 0.5g/ℓ, CaCO₃15g/ℓ, 글루코오스 20g/ℓ, 암피실린 50㎎/ℓ)에 접종하고 37℃에서 16시간 동안 제조원(Kuhner AG, Birsfelden, Switzerland)으로부터의 ESR 배양기 상에서 180rpm으로 배양하였다. 상기 예비배양물 250㎕ 분획을 생산 배지((NH₄)₂SO₄25g/ℓ, KH₂PO₄2g/ℓ, MgSO₄*7H₂O 1g/ℓ, FeSO₄*7H₂O 0.03g/ℓ, MnSO₄*1H₂O 0.018g/ℓ, CaCO₃30g/ℓ, 글루코오스 20g/ℓ) 10㎖에 트랜스접종시키고 혼합물을 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. thrE 유전자의 발현을 유도하기 위해서, 이소프로필 β-D-티오갈락토사이드(IPTG) 200㎎/ℓ를 병렬 배치에 부가하였다. 항온처리 후, 배양 현탁액의 광학밀도(OD)를 제조원(Dr. Lange, Berlin, Germany)의 LP2W 광도계로 660㎚ 측정 파장에서 측정하였다.

이후, 형성된 L-트레오닌의 농도는 제조원(Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Germany)의 아미노산 분석기를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출을 사용한 컬럼 후 반응으로 멸균-여과된 배양 상등액에서 측정하였다.

실험 결과를 표 2에 나타낸다.

균주	부가제	OD	L-트레오닌 (g/ℓ)
MG442	-	5.6	1.38
MG442/pTrc99AthrE	-	4.6	1.65
MG442/pTrc99AthrE	IPTG	3.6	3.5

실시예 6

균주 B-3996kur△tdh/pVIC40, pMW218thrE를 사용한 L-트레오닌의 제조

L-트레오닌 생산성 이. 콜라이 균주 B-3996은 문헌[미국 특허 제5,175,107호]에 기술되어져 있으며 기탁기관(the Russian National Collection for Industrial Microorganisms, VKPM, Moscow, Russia)에 기탁되었다.

6.1 플라스미드 벡터 pMW218에서 thrE 유전자의 클로닝

실시예 4에서 기술된 플라스미드 pTrc99AthrE를 효소 SspI으로 절단시키고, 절단 배치를 0.8% 아가로오스 겔에서 분리하고 thrE 유전자 이외에 trc 프로모터영역 및 rRNA 종결인자 영역을 함유하는 2.5kbp 크기의 DNA 단편을 "QIAquick Gel Extraction Kit"(제조원: QIAGEN, Hilden, Germany)의 도움으로 분리시켰다. 플라스미드 pMW218(제조원: Nippon Gene, Toyama, Japan)을 효소 SmaI으로 절단하고 thrE 단편과 연결시켰다. 이. 콜라이 균주 DH5α를 상기 연결 배치로 형질전환시키고 pMW218-함유 세포를 카나마이신 20㎍/㎖를 부가시킨 LB 아가 상에 플레이팅하여 선택하였다. thrE 유전자의 성공적인 클로닝은 플라스미드 DNA 분리 및 HindIII 및 ClaI을 사용한 제어 절단 이후 입증될 수 있었다. 상기 플라스미드를 pMW218thrE로 명명하였다(도 4).

6.2 균주 B-3996kur△tdh/pVIC40, pMW218thrE의 제조

대략 10세대 동안 항생제 비함유 완전 배지에서 배양시킨 후, 플라스미드 pVIC40을 더 이상 함유하지 않는 균주 B-3996의 유도체를 분리하였다. 형성된 균주는 스트렙토마이신-감수성이며 B-3996kur로 명명되었다.

온도-감수성 레플리콘을 갖는 플라스미드 pMAK705의 사용에 기초하는 문헌[Hamilton et al., Journal of Bacteriology (1989) 171: 4617-4622]에 기술된 방법을 사용하여 tdh 유전자내로 결실을 도입시켰다. 플라스미드 pDR121[Ravnikar and Somerville, Journal of Bacteriology (1987) 169: 4716-1721]은 tdh 유전자를 암호화하는 3.7kbp 크기의 이. 콜라이로부터의 DNA 단편을 함유한다. tdh 유전자 영역의 결실을 생성시키기 위해서, pDR121을 제한 효소 ClaI 및 EcoRV로 절단시키고 클레나우 효소로 처리한 후 분리된 5kbp 크기의 DNA 단편을 연결시켰다. 연결배치를 이. 콜라이 균주 DH5α에 형질전환시키고 플라스미드 함유 세포를 암피실린 50㎍/㎖를 부가시킨 LB 아가 상에서 선택하였다.

tdh 유전자의 성공적인 결실은 플라스미드 DNA 분리 및 EcoRI을 사용한 제어 절단 이후 입증될 수 있었다. 1.7kbp 크기의 EcoRI 단편을 분리시키고, EcoRI으로 부분적으로 절단시킨 플라스미드 pMAK705와 연결시켰다. 연결 배치를 DH5α에 형질전환시키고 플라스미드-함유 세포를 클로람페니콜 20㎍/㎖를 부가시킨 LB 아가 상에서 선택하였다. 성공적인 클로닝은 플라스미드 DNA의 분리 및 EcoRI을 사용한 절단으로 입증되었다. 형성된 pMAK705 유도체는 pDM32로 명명되었다.

유전자 대체를 위해서, B-3996kur을 플라스미드 pDM32로 형질전환시켰다. 염색체성 tdh 유전자의 플라스미드 암호화된 결실 작제물로의 대체는 문헌[Hamilton et al.]에 기술된 선택 방법으로 수행하였으며 하기 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 표준 PCR 방법[Innis et al., (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]으로 확인하였다:

Tdh1: 5'-TCGCGACCTATAAGTTTGGG-3'

Tdh2: 5'-AATACCAGCCCTTGTTCGTG-3'.

형성된 균주는 카나마이신 내성에 대해서 시험하고 B-3996kur△tdh로 명명되었다.

B-3996kur△tdh를 B-3996으로부터 분리된 플라스미드 pVIC40으로 형질전환시키고 플라스미드 함유 세포를 스트렙토마이신 20㎍/㎖로 보충된 LB 아가 상에서 선택하였다. 선택된 개별적인 콜로니를 B-3996kur△tdh/pVIC40으로 명명하고 플라스미드 pMW218thrE로 형질전환시켰다. 선택은 스트렙토마이신 20㎍/㎖ 및 카나마이신 50㎍/㎖를 부가시킨 LB 아가 상에서 수행한다. 이러한 방식으로 형성된 균주는 B-3996kur△tdh/pVIC40, pMW218thrE로 명명하였다.

6.3 L-트레오닌의 제조

균주 B-3996kur△tdh/pVIC40 및 B-3996kur△tdh/pVIC40, pMW218thrE에 의한 L-트레오닌의 제조를 실시예 5에 기술된 바와 같이 시험하였다. 최소 배지, 예비배양 배지 및 생산 배지는 B-3996kur△tdh/pVIC40에 대해서는 스트렙토마이신 20㎍/㎖ 및 B-3996kur△tdh/pVIC40, pMW218thrE에 대해서는 카나마이신 50㎍/㎖로 보충시켰다.

상기 실험의 결과는 표 3에 요약한다.

균주	OD (660㎚)	L-트레오닌 (g/ℓ)
B-3996kur△tdh/pVIC40	4.7	6.26
B-3996kur△tdh/pVIC40,pMW218thrE	4.8	7.57

Claims (18)

1. 엔테로박테리아세애 세균, 특히 이미 L-트레오닌을 생산하며 코리네형 세균의 thrE 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)이 증강된, 특히 과발현된 세균을 사용함을 포함하는, L-트레오닌의 발효 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, thrE 유전자 이외에 추가의 유전자들이 증강된 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 엔테로박테리아세애 과의 미생물이 에스케리치아 및 세라티아 속으로부터의 것들인 방법.
4. 제3항에 있어서, 미생물이 에스케리치아 속으로부터의 것, 특히 에스케리치아 콜라이 종인 방법.
5. 제1항에 있어서, 아스파르테이트 키나제, 호모세린 데하이드로게나제, 호모세린 키나제 및 트레오닌 신타제를 암호화하는 thrABC 오페론이 동시에 증강된 방법.
6. 제1항에 있어서, 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자가 동시에 증강된 방법.
7. 제1항에 있어서, 포스포에놀 피루베이트 신타제를 암호화하는 pps 유전자가 동시에 증강된 방법.
8. 제1항에 있어서, 포스포에놀 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 ppc 유전자가 동시에 증강된 방법.
9. 제1항에 있어서, 트랜스하이드로게나제를 암호화하는 유전자 pntA 및 pntB가 동시에 증강된 방법.
10. 제1항에 있어서, L-트레오닌의 형성을 감소시키는 대사 경로가 적어도 부분적으로 제거된 세균을 사용하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 코리네형 세균의 thrE 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 플라스미드 벡터로 형질전환된 균주를 사용하는 방법.
12. 제1항에 있어서, 플라스미드 pZ1thrE로 형질전환된 세균을 사용하는 방법.
13. 제1항에 있어서, thrE 유전자의 발현이 특히 이소프로필 β-D-티오갈락토사이드로 유도된 방법.
14. 제1항에 있어서, 글루타메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gdhA 유전자가 동시에 증강되는 방법.
15. 제1항에 있어서, 호모세린 내성을 부여하는 rhtB 유전자가 동시에 증강되는 방법.
16. a) 임의로 추가의 유전자들과 함께, 적어도 코리네형 세균의 thrE 유전자가 증강된(과발현된) 엔테로박테리아세애 과의 미생물을 발효시키는 단계, b) 배지에서 또는 엔테로박테리아세애 과의 미생물의 세포에서 L-트레오닌을 농축시키는 단계, 및 c) L-트레오닌을 분리하는 단계를 포함하는, L-트레오닌의 제조 방법.
17. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 thrE 유전자를 함유하는 플라스미드 pZ1thrE.
18. 기탁기관[DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany]에 DSM 12840으로 기탁된 브레비박테리움 플라붐 균주 DM368-2 pZ1thrE.