ES2344681T3 - Proceso para la preparacion por fermentacion de l-aminoacidos utilizando cepas de la familia enterobacteriaceas. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para la preparación por fermentación de L-treonina, L-valina o L-lisina, que comprende la realización de los pasos siguientes: a)fermentación de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado y en los cuales al menos el gen poxB o secuencias de nucleótidos que codifican su producto génico están atenuadas, en particular eliminadas, b)concentración del L-aminoácido correspondiente en el medio o en las células de las bacterias y c)aislamiento del L-aminoácido.
Description
Proceso para la preparación por fermentación de
L-aminoácidos utilizando cepas de la familia
enterobacteriáceas.
Esta invención se refiere a un proceso para la
preparación por fermentación de L-treonina,
L-lisina y L-valina utilizando cepas
de la familia Enterobacteriáceas en las cuales el gen poxB está
atenuado.
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Los L-aminoácidos, en particular
L-treonina, L-lisina y
L-valina se utilizan en medicina humana y en la
industria farmacéutica, en la industria alimentaria y muy
particularmente en nutrición animal.
Se conoce el modo de preparar
L-aminoácidos por fermentación de cepas de
Enterobacteriáceas, en particular Escherichia coli (E. coli)
y Serratia marcescens. Debido a su gran importancia, está
trabajándose constantemente para mejorar los procesos de
preparación. Las mejoras de los procesos pueden referirse a las
medidas de fermentación, tales como v.g. agitación y suministro de
oxígeno, o la composición de los medios nutrientes, v.g. la
concentración de azúcar durante la fermentación, o el acabado de la
forma del producto, v.g. por cromatografía de reemplazamiento
iónico, o las características intrínsecas de productividad del
microorganismo propiamente dicho.
Para mejorar las propiedades de productividad de
estos microorganismos se utilizan métodos de mutagénesis, selección
y selección de mutantes. De esta manera se obtienen cepas que son
resistentes a antimetabolitos, tales como v.g. el análogo de
treonina ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico
(AHV), o son auxótrofas para metabolitos de importancia reguladora
y producen L-aminoácido, tal como v.g.
L-treonina.
Se han utilizado también desde hace algunos años
métodos de la técnica del DNA recombinante para mejorar el linaje
de cepas de la familia Enterobacteriáceas productoras de
L-aminoácidos por amplificación de genes
individuales de biosíntesis de aminoácidos e investigación del
efecto sobre la producción.
\vskip1.000000\baselineskip
El objeto que se propusieron los inventores fue
proporcionar nuevas medidas para la preparación mejorada por
fermentación de L-treonina, L-lisina
y L-valina.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona un proceso para la
preparación por fermentación de L-treonina,
utilizando organismos de la familia Enterobacteriáceas que, en
particular, producen ya L-treonina y en los cuales
la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima
piruvato-oxidasa (EC 1.2.2.2) (gen poxB) está
atenuada.
En este contexto, el término "atenuación"
describe la reducción o eliminación, en un microorganismo, de la
actividad intracelular de una o más enzimas (proteínas) que son
codificadas por el DNA correspondiente, por ejemplo por utilización
de un promotor débil o un gen o alelo que codifica una enzima
correspondiente con actividad baja, o elimina la enzima (proteína) o
el gen correspondiente, y opcionalmente combinación de estas
medidas.
El proceso comprende la realización de los pasos
siguientes:
- a)
- fermentación de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los cuales está atenuado al menos el gen poxB,
- b)
- concentración del L-aminoácido correspondiente en el medio o en las células de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas, y
- c)
- aislamiento del L-aminoácido deseado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los microorganismos proporcionados por la
presente invención pueden producir L-aminoácidos a
partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas,
opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa, o a partir de
glicerol y etanol. Dichos microorganismos son representativos de la
familia Enterobacteriáceas seleccionados de los géneros Escherichia,
Erwinia, Providencia y Serratia. Se prefieren los géneros
Escherichia y Serratia. Del género Escherichia puede mencionarse en
particular la especie Escherichia coli, y del género Serratia
la especie Serratia marcescens, respectivamente.
\newpage
Cepas adecuadas del género Escherichia, que
producen en particular L-treonina, particularmente
de la especie Escherichia coli, son, por ejemplo:
\vskip1.000000\baselineskip
Cepas adecuadas productoras de
L-treonina del género Serratia, en particular de la
especie Serratia marcescens, son, por ejemplo:
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas productoras de
L-treonina de la familia Enterobacteriáceas poseen
preferiblemente, entre otras cosas, una o más características
genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo que comprende
resistencia al ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico,
resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a
\alpha-metilserina, resistencia a ácido
diaminosuccínico, resistencia a ácido
\alpha-aminobutírico, resistencia a borrelidina,
resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina tales
como, por ejemplo, hidroxamato de valina, resistencia a análogos de
purina tales como 6-dimetilaminopurina, necesidad de
L-metionina, necesidad opcionalmente parcial y
compensable de L-isoleucina, necesidad de ácido
meso-diaminopimélico, auxotrofia con respecto a
dipéptidos que contienen treonina, resistencia a
L-treonina, resistencia a
L-homoserina, resistencia a
L-lisina, resistencia a L-metionina,
resistencia a ácido glutámico, resistencia a
L-aspartato, resistencia a
L-leucina, resistencia a
L-fenilalanina, resistencia a
L-serina, resistencia a L-cisteína,
resistencia a L-valina, sensibilidad a
fluoropiruvato, insuficiencia de
treonina-deshidrogenasa, capacidad opcional para
utilización de sacarosa, amplificación del operón treonina,
amplificación de la
homoserina-deshidrogenasa-I-aspartato-quinasa-I,
preferiblemente de la forma resistente a la realimentación,
amplificación de homoserina-quinasa, amplificación
de treonina-sintasa, amplificación de
aspartato-quinasa, opcionalmente de la forma
resistente a la realimentación, amplificación de
aspartato-semialdehido-deshidrogenasa,
amplificación de fosfoenolpiruvato-carboxilasa,
opcionalmente de la forma resistente a la realimentación,
amplificación de
fosfoenol-piruvato-sintasa,
amplificación de transhidrogenasa, amplificación del producto del
gen RhtB, amplificación del producto del gen RhtC, amplificación
del producto del gen YfiK, amplificación de una
piruvato-carboxilasa, y atenuación de la formación
de ácido acético.
Se ha encontrado que microorganismos de la
familia Enterobacteriáceas producen L-aminoácidos,
particularmente L-treonina, de manera mejorada
después de atenuación, en particular eliminación del gen poxB, que
codifica piruvato-oxidasa (EC 1.2.2.2).
Adicionalmente, se ha encontrado que los
microorganismos de la familia Enterobacteriáceas forman
concentraciones menores del subproducto indeseable ácido acético
después de atenuación, en particular eliminación, del gen poxB, que
codifica piruvato-oxidasa (número EC 1.2.2.2).
La secuencia de nucleótidos del gen poxB de
Escherichia coli ha sido publicada por Grabau y Cronan
(Nucleic Acids Research, 14 (13), 5449-5460 (1986))
y puede tomarse también de la secuencia del genoma de Escherichia
coli publicada por Blattner et al. (Science 277,
1453-1462 (1997), bajo el Número de Acceso AE000188.
La secuencia de nucleótidos del gen poxB de Escherichia coli
se representa en SEQ ID No. 1 y la secuencia de aminoácidos del
producto del gen asociado se representa en SEQ ID No. 2.
Los genes poxB descritos en las referencias de
textos anteriores pueden utilizarse de acuerdo con la invención.
Adicionalmente, pueden utilizarse alelos del gen poxB que son
resultado de la degeneración del código genético o de "mutaciones
sentido" de función neutra.
Para conseguir una atenuación, por ejemplo,
puede reducirse o eliminarse la expresión del gen poxB o las
propiedades catalíticas de la proteína enzimática. Ambas medidas
pueden combinarse opcionalmente.
La reducción de la expresión génica puede
conseguirse por cultivo adecuado, por modificación genética
(mutación) de las estructuras de señal de la expresión génica, o
también por la técnica del DNA antisentido. Ejemplos de estructuras
de señal de la expresión génica son genes represores, genes
activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de
fijación de ribosoma, el codón inicial y terminadores. Los expertos
en la técnica encontrarán información a este respecto entre otros
lugares en, v.g. Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering
58, 191-195 (1998)), en Carrier y Keasling
(Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999)), Franch y
Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3, 159-164
(2000)) y en libros de texto conocidos sobre genética y biología
molecular, por ejemplo el libro de texto de Knippers ("Molekulare
Genetik" [Molecular Genetics]", 6ª edición, Georg Thieme
Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995) o el de Winnacker ("Gene und
Klone ["Genes and Clones]", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim,
Alemania, 1990).
Mutaciones que causan un reemplazamiento o
reducción en las propiedades catalíticas de las proteínas
enzimáticas se conocen por la técnica anterior. Ejemplos que pueden
mencionarse son los trabajos de Qiu y Goodman (Journal of
Biological Chemistry 272, 8611-8617 (1997)), Yano
et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences,
EE.UU. 95, 5511-5515 (1998)) Wente y Schachmann
(Journal of Biological Chemistry 266; 20833-20839
(1991). Pueden encontrarse descripciones resumidas en libros de
texto conocidos sobre genética y biología molecular, tales como
v.g. el de Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1986).
Mutaciones posibles son transiciones,
transversiones, inserciones y deleciones. Dependiendo del efecto del
reemplazamiento de aminoácidos sobre la actividad enzimática, se
hace referencia a "mutaciones de sentido erróneo" o
"mutaciones sin sentido". Las inserciones o deleciones de al
menos un par de bases en un gen causan "mutaciones de
desplazamiento de marco", que conducen a la incorporación de
aminoácidos incorrectos o a la interrupción prematura de la
traducción. Las deleciones de varios codones conducen típicamente a
una pérdida completa de la actividad enzimática. Instrucciones para
la generación de tales mutaciones forman parte de la técnica
anterior y pueden encontrarse en libros de texto conocidos sobre
genética y biología molecular, v.g. el libro de texto de Knippers
("Molekulare Genetik [Molecular Genetics]", 6ª edición,
GeorgThieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995), el de Winnacker
("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania,
1990) o el de Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1986).
Un ejemplo de un plásmido con ayuda del cual
puede atenuarse, en particular eliminarse, el gen poxB de
Escherichia coli, por mutagénesis específica de la posición
es el plásmido pMAK705\DeltapoxB (figura 1). Además de residuos
de secuencias polienlazadoras, el mismo contiene solamente una parte
de la región 5' y parte de la región 3' del gen poxB. Falta una
sección de 340 pb de la región codificante (deleción). La secuencia
de este DNA, que puede utilizarse para mutagénesis del gen poxB, se
representa en SEQ ID No. 3.
La mutación por deleción del gen poxB puede
incorporarse en cepas adecuadas por reemplazamiento de genes o
alelos.
Un método convencional es el método, descrito
por Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174,
4617-4622 (1989)) de reemplazamiento de genes con
ayuda de un derivado condicionalmente replicante de pSC101, pMAK705.
Pueden utilizarse análogamente otros métodos descritos en la técnica
anterior, por ejemplo los de Martínez-Morales et
al. (Journal of Bacteriology, (1999) 7143-7148)
o los de Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182,
842-847 (2000)).
Después que ha tenido lugar el reemplazamiento,
la cepa en cuestión contiene la forma del alelo \DeltapoxB
representada en SEQ ID No. 4, que es proporcionada adicionalmente
por la invención.
Es también posible transferir mutaciones en el
gen poxB o mutaciones que afectan a la expresión del gen poxB en
diversas cepas por conjugación o transducción.
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la
producción de los L-aminoácidos anteriores, en
particular L-treonina, con cepas de la familia
Enterobacteriáceas, amplificar una o más enzimas del camino de
biosíntesis conocido de la treonina, o enzimas del metabolismo
anaplerótico, o enzimas para la producción de
nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato
reducido, además de la atenuación del gen poxB.
En este contexto, el término
"amplificación" describe el aumento en la actividad
intracelular de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo,
que son codificadas por el DNA correspondiente, por ejemplo por
aumento del número de copias del o de los genes, utilizando un
promotor fuerte o utilizando un gen que codifica una enzima o
proteína apropiada con una actividad alta, y combinación opcional de
estas medidas.
\newpage
Así, por ejemplo, uno o más genes seleccionados
del grupo que comprende:
- \bullet
- el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa (US-A-4.278.765),
- \bullet
- el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa (DE-A-19831609),
- \bullet
- el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato-sintasa (Molecular and General Genetics 231, 332 (1992)),
- \bullet
- el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato-carboxilasa (Gene 31, 279-283 (1984)),
- \bullet
- los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158, 647-653 (1986)),
- \bullet
- el gen rhtB para resistencia a homoserina (EP-A-0994190),
- \bullet
- el gen mqo que codifica malato:quinona-oxidorreductasa (DE 100 348 33.5),
- \bullet
- el gen rhtC que imparte resistencia a treonina (EP-A-1013765), y
- \bullet
- el gen thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica la exportación de treonina (DE 100 264 94.8) y
- \bullet
- el gen gdhA que codifica glutamato-deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11:5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983)
pueden intensificarse, en particular
sobreexpresarse, simultáneamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, para la producción de los
L-aminoácidos anteriores, en particular
L-treonina, puede ser ventajoso no sólo atenuar el
gen poxB sino también atenuar y, en particular, eliminar o reducir
la expresión de uno o más genes seleccionados del grupo constituido
por:
- \bullet
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa (Ravnikar y Somerville, Journal of Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)),
- \bullet
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.37) (Vogel et al., Archives in Microbiology 149, 36-42 (1987)),
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) yjfA (Número de Acceso AAC 77180 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.),
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) ytfP (Número de Acceso AAC77179 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.) y
- \bullet
- el gen pckA que codifica la enzima fosfoenol-piruvato-carboxiquinasa (Medina et al. (Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990)
\vskip1.000000\baselineskip
Además de la atenuación del gen poxB puede ser
ventajoso, para la producción de L-aminoácidos, en
particular L-treonina, eliminar reacciones
secundarias indeseables (Nakayama: "Breeding of Amino Acid
Producing Microorganisms", en: Overproduction of Microbial
Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (compiladores), Academic Press,
Londres, Reino Unido, 1982).
Los microorganismos producidos de acuerdo con la
invención pueden cultivarse en el proceso de lotes (cultivo por
lotes), el proceso de lote alimentado (proceso de alimentación) o el
proceso de lote alimentado (proceso de alimentación) repetido. Un
sumario de métodos de cultivo conocidos se proporciona en el libro
de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to
Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en
el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere
Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a utilizar debe satisfacer
adecuadamente las demandas de las cepas particulares. Descripciones
de medios de cultivo para diversos microorganismos se encuentran en
el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la
American Society for Bacteriology (Washington DC, EE.UU., 1981).
Fuentes de carbono que pueden utilizarse son
azúcares y carbohidratos, v.g. glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa,
maltosa, melazas, almidón y opcionalmente celulosa, aceites y
grasas, tales como v.g. aceite de soja, aceite de girasol, aceite de
cacahuete y aceite de coco, ácidos grasos, tales como v.g. ácido
palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, v.g.
glicerol y etanol, y ácidos orgánicos, tales como v.g. ácido
acético. Estas sustancias pueden utilizarse individualmente o en
forma de mezclas.
Fuentes de nitrógeno que pueden utilizarse son
compuestos orgánicos que contiene nitrógeno tales como peptonas,
extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de
maceración de maíz, harina de soja y urea, o compuestos
inorgánicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio,
fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las
fuentes de nitrógeno pueden utilizarse individualmente o en forma de
mezclas.
Fuentes de fósforo que pueden utilizarse son
ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato
dipotásico, o las sales de sodio correspondientes. El medio de
cultivo debe contener también sales metálicas, tales como v.g.
sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el
crecimiento. Finalmente, sustancias de crecimiento esenciales tales
como aminoácidos y vitaminas pueden utilizarse además de las
sustancias arriba mencionadas. Pueden añadirse también al medio de
cultivo precursores adecuados. Dichas sustancias de partida pueden
añadirse al cultivo de una vez o alimentarse adecuadamente durante
el cultivo.
El pH del cultivo puede controlarse por el uso
apropiado de compuestos básicos tales como hidróxido de sodio,
hidróxido de potasio, amoniaco o amoniaco acuoso, o compuestos
ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. La formación
de espuma puede controlarse utilizando agentes antiespumantes tales
como v.g. poliglicol-ésteres de ácidos grasos. La estabilidad de
los plásmidos puede mantenerse por adición de sustancias adecuadas
de acción selectiva, v.g. antibióticos, al medio. Para mantener
condiciones aerobias, se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas
gaseosas que contienen oxígeno, v.g. aire. La temperatura del
cultivo es normalmente 25ºC a 45ºC y preferiblemente 30ºC a 40ºC.
El cultivo se continúa hasta que la formación de
L-aminoácidos o L-treonina ha
alcanzado un máximo. Este objetivo se consigue normalmente dentro de
10 horas a 160 horas.
El análisis de L-aminoácidos
puede realizarse por cromatografía de reemplazamiento aniónico
seguida por derivatización con ninhidrina, como ha sido descrito
por Spackman et al. (Analytical Chemistry 30, (1958), 1190),
o puede tener lugar por HPLC en fase inversa, como ha sido descrito
por Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51,
1167-1174).
Un cultivo puro de la cepa de Escherichia
coli K-12 DH5\alpha/pMAK705 fue depositado
como DSM 13720 en fecha 8 de septiembre de 2000 en la Deutsche
Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German
Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig,
Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest.
Un cultivo puro de la cepa de Escherichia
coli K-12 MG442\DeltapoxB fue depositado como
DSM 13762 en fecha 2 de octubre de 2000 en la Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of
Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Alemania) de acuerdo
con el Tratado de Budapest.
El proceso de acuerdo con la invención se
utiliza para la preparación por fermentación de los
L-aminoácidos L-treonina,
L-valina o L-lisina, en particular
L-treonina.
La presente invención se ilustra con mayor
detalle a continuación con ayuda de ejemplos de realización.
El aislamiento del DNA plasmídico de
Escherichia coli y todas las técnicas para restricción,
tratamiento Klenow y tratamiento con fosfatasa alcalina se llevan a
cabo como ha sido descrito por Sambrook et al. (Molecular
Cloning - A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory
Press). A no ser que se indique otra cosa, la transformación de
Escherichia coli se lleva a cabo por el método de Chung et
al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the
EE.UU. (1989) 86, 2172-2175).
La temperatura de incubación para la preparación
de cepas y transformantes es 37ºC. En el proceso de reemplazamiento
génico de Hamilton et al. se utilizan temperaturas de 30ºC y
44ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Partes de las regiones 5' y 3' del gen poxB se
amplifican a partir de Escherichia coli K12 utilizando la
región en cadena de polimerasa (PCR) y oligonucleótidos sintéticos.
Partiendo de la secuencia de nucleótidos del gen poxB en E.
coli K12 MG1655 (SEQ ID No. 1) se sintetizan los iniciadores PCR
siguientes (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania):
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
utilizado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones de
los fabricantes con "Qiagen Genomics-tips
100/G" (QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA de un
tamaño aproximado de 500 pares de bases (pb) de la región 5' del
gen poxB (designado poxB1) y un fragmento de DNA de un tamaño
aproximado de 750 pb de la región 3' del gen poxB (designado poxB2)
pueden amplificarse con los iniciadores específicos en condiciones
PCR estándar (Innis et al. (1990), PCR Protocols. A Guide to
Methods and Applications, Academic Press) utilizando
DNA-polimerasa Taq (Gibco-BRL,
Eggenstein, Alemania). Los productos PCR se ligan cada uno con el
vector pCR2.1TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen,
Países Bajos) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes y
se transforman en la cepa TOP10F' de E. coli.
Se seleccionan células portadoras de plásmido en
agar LB al que se añaden 50 \mug/ml de ampicilina. Después de
aislamiento del DNA plasmídico, se escinde el vector pCR2.1TOPOpoxB1
con las enzimas de restricción Ecl136II y XbaI y, después de
separación en gel de agarosa al 0,8%, el fragmento poxB1 se aísla
con ayuda del Kit de Extracción de Gel QIAquick (QIAGEN, Hilden,
Alemania). Después de aislamiento del DNA plasmídico, se escinde el
vector pCR2.1TOPOpoxB2 con las enzimas EcoRV y XbaI y se liga con el
fragmento poxB1 aislado. La cepa DH5\alpha de E. coli se
transforma con el lote de ligación y las células portadoras del
plásmido se seleccionan en agar LB al que se añaden 50 \mug/ml de
ampicilina. Después de aislamiento del DNA plasmídico, los plásmidos
en los que se ha clonado la secuencia mutágena de DNA representada
en SEQ ID No. 3 se detectan por escisión de control con las enzimas
HindIII y XbaI. Uno de los plásmidos se designa
pCR2.1TOPO\DeltapoxB.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de restricción con las enzimas HindIII y
XbaI y separación en gel de agarosa al 0,8%, el alelo poxB descrito
en el Ejemplo 1 se aísla del vector pCR2.1TOPO\DeltapoxB y se liga
al plásmido pMAK705 (Hamilton et al., (1989) Journal of
Bacteriology 174, 4617-4622) que se ha digerido con
las enzimas HindIII y XbaI. El lote de ligación se transforma en
DH5\alpha y las células portadoras del plásmido se seleccionan en
agar LB al que se añaden 20 \mug/ml de cloranfenicol. La
clonación con éxito se demuestra después del aislamiento del DNA
plasmídico y escisión con las enzimas HindIII y SalI. El vector de
reemplazamiento formado, pMAK705\DeltapoxB (= pMAK705deltapoxB),
se muestra en la Figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa MG442 de E. coli productora de
L-treonina se describe en la memoria descriptiva de
la Patente US-A-4.278.765 y ha sido
depositada como CMIM B-1628en la Colección Nacional
Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia).
Para el reemplazamiento del gen poxB cromosómico
con el constructo de deleción codificado por el plásmido, se
transforma MG442 con el plásmido pMAK705\DeltapoxB. El
reemplazamiento génico se lleva a cabo por el método de selección
descrito por Hamilton et al. (1989) (Journal of Bacteriology
174, 4617-4622) y se comprueba por métodos PCR
estándar (Innis et al. (1990), PCR Protocols. A Guide to
Methods and Applications, Academic Press) utilizando los iniciadores
oligonucleotídicos siguientes:
La cepa obtenida se designa
MG442\DeltapoxB.
\vskip1.000000\baselineskip
Se multiplica MG442\DeltapoxB en medio mínimo
con la composición siguiente: 3,5 g/l de
Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O, 1,5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l de
NH_{4}Cl, 0,1 g/l de MgSO_{4}.7H_{2}O, 2 g/l de glucosa y 20
g/l de agar. La formación de L-treonina se
comprueba en cultivos de lotes de 10 ml contenidos en matraces
cónicos de 100 ml. Para ello se inoculan 10 ml de un medio de
precultivo de la composición siguiente: 2 g/l de extracto de
levadura, 10 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l de
KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l de MgSO_{4}.7H_{2}O, 15 g/l de
CaCO_{3} y 20 g/l de glucosa, y se incuba el lote durante 16 horas
a 37ºC y 180 rpm en una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden,
Suiza). Se transinoculan 250 \mul de este precultivo en 10 ml de
medio de producción (25 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2
g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,03
g/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,018 g/l de
MgSO_{4}\cdot1H_{2}O, 30 g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de
glucosa) y se incuba el lote durante 48 horas a 37ºC. Después de la
incubación, se determina la densidad óptica (DO) de la suspensión de
cultivo con un fotómetro LP2W del Dr. Lange (Berlín, Alemania) a una
longitud de onda de medida de 660 nm.
La concentración de L-treonina
formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en
condiciones estériles con un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de reemplazamiento iónico y reacción
post-columna con detección por ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El gen de
glutamato-deshidrogenasa de Escherichia coli
K12 se amplifica utilizando la reacción en cadena de polimerasa
(PCR) y oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de
nucleótidos para el gen gdhA en E. coli K12 MG1655
(biblioteca de genes: No. de Acceso AE000270 y No. AE000271) se
sintetizan los iniciadores PCR (MWG Biotech, Ebersberg,
Alemania):
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones de
los fabricantes con "QIAGEN Genomic-tips 100/G"
(QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA con un tamaño de
aproximadamente 2150 pb, que comprende la región codificante de gdhA
y aprox. 350 pb de la secuencia flanqueante 5' y aprox. 450 pb de
la secuencia flanqueante 3', puede amplificarse con los iniciadores
específicos en condiciones estándar de PCR (Innis et al.:
PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic
Press) con la DNA-polimerasa Pfu (Promega
Corporation: Madison, EE.UU.). El producto PCR se clona en el
plásmido pCR2.1TOPO y se transforma en la cepa TOP10 de E.
coli (Invitrogen, Leek, Países Bajos, Descripción del Producto
TOPO TA Cloning Kit, Cat. No. K4500-01). La
clonación con éxito se demuestra por escisión del plásmido
pCR2.1TOPOgdhA con las enzimas de restricción EcoRI y EcoRV. Para
ello, se aísla el DNA plasmídico por medio de los "QIAprep Spin
Plasmid Kit" (QIAGEN, Hilden, Alemania) y, después de la
escisión, se separa en un gel de agarosa al 0,8%.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pCR2.1TOPOgdhA se escinde con la
enzima EcoRI, se separa el lote de escisión en gel de agarosa al
0,8% y el fragmento gdhA de 2,1 kpb de tamaño se aísla con la ayuda
del "QIAquick Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Hilden, Alemania).
El plásmido pMW218 (Nippon Gene, Toyama, Japón) se escinde con la
enzima EcoRI y se liga con el fragmento gdhA. La cepa de E.
coli DH5\alpha se transforma con el lote de ligación y las
células portadoras de pMW218 se seleccionan por extensión en placas
sobre agar LB (Lennox, Virology 1955, 1:190), al que se añaden 20
\mug/ml de kanamicina.
La clonación con éxito del gen gdhA puede
demostrarse después del aislamiento del DNA plasmídico y escisión
del control con EcoRI y EcoRV. El plásmido se designa pMW218gdhA
(Figura 3).
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa MG442\DeltapoxB obtenida en el Ejemplo
3 y la cepa MG442 se transforman con el plásmido pMW218gdhA, y los
transformantes se seleccionan en agar LB, que se complementa con 20
\mug/ml de kanamicina. De este modo se forman las cepas
MG442\DeltapoxB/pMW218gdhA y MG442/pMW218gdhA.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de L-treonina por
las cepas MG442\DeltapoxB/pMW218gdhA y MG442/pMW218gdhA se testa
como se describe en el Ejemplo 4. El medio mínimo y el medio de
precultivo se complementan adicionalmente con 20 \mug/ml de
kanamicina para estas dos cepas.
El resultado del experimento se resume en la
Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El gen rhtC de Escherichia coli K12 se
amplifica utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y
oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de
nucleótidos para el gen rhtC en E. coli K12 MG1655
(biblioteca de genes: No. de Acceso AE000458, Zakataeva et
al. (FEBS Letters 452, 228-232 (1999)), se
sintetizan los iniciadores PCR (MWG Biotech, Ebersberg,
Alemania):
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones de
los fabricantes con "QIAGEN Genomic-tips 100/G"
(QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA de un tamaño aprox.
de 800 pb puede amplificarse con los iniciadores específicos en
condiciones PCR estándar (Innis et al.: PCR Protocols. A
Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) con
DNA-polimerasa Pfu (Promega Corporation, Madison,
USA).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pMW219 (Nippon Gene, Toyama, Japón)
se escinde con la enzima SamI y se liga con el fragmento
rhtC-PCR. La cepa de E. coli DH5\alpha se
transforma con el lote de ligación y las células portadoras de
pMW219 se seleccionan en agar LB, que se complementa con 20
\mug/ml de kanamicina. La clonación con éxito puede demostrarse
después de aislamiento del DNA plasmídico y escisión del control con
KpnI, HindIII y NcoI. El plásmido pMW219rhtC se muestra en la figura
3.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa MG442\DeltapoxB obtenida en el Ejemplo
3 y la cepa MG442 se transforman con el plásmido pMW219rhtC y los
transformantes se seleccionan en agar LB, que se complementa con 20
\mug/ml de kanamicina. De esta manera se forman las cepas
MG442\DeltapoxB/pMW219rhtC y MG442/pMW219rhtC.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de L-treonina por
las cepas MG442\DeltapoxB/pMW219rhtC y MG442/pMW219rhtC se testa
como se describe en el Ejemplo 4. El medio mínimo y el medio de
cultivo se complementan adicionalmente con 20 \mug/ml de
kanamicina.
El resultado del experimento se resume en la
Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de E. coli pDA1/TOC21R productora
de L-lisina se describe en la solicitud de patente
F-A-2511032 y ha sido depositada en
la Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM =
National Microorganism Culture Collection, Pasteur Institute,
París, Francia) bajo el número I-167. La cepa y el
hospedador exento de plásmido han sido descritos también por
Dauce-Le Reverend et al. (European Journal of
Applied Microbiology and Biotechnology 15: 227-231
(1982)) bajo el nombre TOC21R/pDA1.
Después de cultivo en el medio LB exento de
antibióticos durante aproximadamente seis generaciones, se aísla un
derivado de la cepa pDA1/TOC21R que no contiene ya el plásmido pDA1.
La cepa formada es sensible a la tetraciclina y se designa
TOC21R.
Para el reemplazamiento del gen cromosómico poxB
con el constructo de deleción codificado por el plásmido, se
transforma TOC21R con el plásmido pMAK705\DeltapoxB (Ejemplo 2).
El reemplazamiento del gen se lleva a cabo por el método de
selección descrito por Hamilton et al. (1989), Journal of
Bacteriology 174, 4617-4622) y se comprueba por
métodos PCR estándar (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A
guide to Methods and Applications, Academic Press) con los
iniciadores oligonucleotídicos siguientes:
La cepa obtenida se designa
TOC21R\DeltapoxB.
\vskip1.000000\baselineskip
La formación de L-lisina con la
cepa TOC21R\DeltapoxB y TOC21R se comprueba en cultivos de lotes
de 10 ml contenidos en matraces cónicos de 100 ml. Para esto, se
inoculan 10 ml de medio de precultivo de la composición siguiente:
2 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l
de MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de glucosa y
se incuba el lote durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en una
incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza). Se transinoculan
250 \mul de este precultivo en 10 ml de medio de producción (25
g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}*7H_{2}O, 0,018 g/l
MnSO_{4}\cdot1H_{2}O, 30 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 25
mg/l L-isoleucina y 5 mg/l tiamina) y se incuba el
lote durante 72 horas a 37ºC. Después de la incubación, se
determina la densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo con un
fotómetro LP2W del Dr. Lange (Berlín, Alemania) a una longitud de
onda de medida de 660 nm.
Se determina luego la concentración de
L-lisina formada en el sobrenadante de cultivo
filtrado en condiciones estériles con un analizador de aminoácidos
de Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de reemplazamiento iónico y reacción
post-columna con detección por ninhidrina.
Los resultados del experimento se muestran en la
Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa AJ 11502 de E. coli productora de
L-valina se describe en la memoria descriptiva de
patente US-A-4.391.907 y ha sido
depositada en el Centro Nacional para Investigación de Utilización
en Agricultura (Peoria, Illinois, EE.UU.) como NRRL
B-12288.
Después de cultivo en medio LB exento de
antibióticos durante aproximadamente SEIS generaciones, se aísla un
derivado exento de plásmido de la cepa AJ 11502. La cepa formada es
sensible a LA ampicilina y se designa AJ11502kur.
Para reemplazamiento del gen cromosómico poxB
con el constructo de deleción codificado por el plásmido, se
transforma AJ11502kur con el plásmido pMAK705\DeltapoxB (véase el
Ejemplo 2). El reemplazamiento del gen se lleva a cabo por el método
de selección descrito por Hamilton et al. (1989) Journal of
Bacteriology 174, 4617-4622) y se comprueba por
métodos PCR estándar (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A
Guide to Methods and Applications, Academic Press) con los
iniciadores oligonucleotídicos siguientes:
La cepa obtenida se designa
AJ11502kur\DeltapoxB. El plásmido descrito en la memoria
descriptiva de patente
US-A-4.391.907, que lleva la
información genética con respecto a la producción de valina, se
aísla de la cepa NRRL B-12288. La cepa
AJ11502kur\DeltapoxB se transforma con este plásmido. Uno de los
transformantes obtenidos se designa
B-12288\DeltapoxB.
\vskip1.000000\baselineskip
La formación de L-valina por las
cepas B-12288\DeltapoxB y NRRL
B-12288 se comprueba en cultivos de lotes de 10 ml
contenidos en matraces cónicos de 100 ml. Para esto, se inoculan 10
ml de medio de precultivo de la composición siguiente: 2 g/l
extracto de levadura, 10 g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l
KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l CaCO_{3},
20 g/l glucosa y 50 mg/l ampicilina, y el lote se incuba durante 16
horas a 37ºC y 180 rpm en una incubadora ESR de Kühner AG
(Birsfelden, Suiza). Se transinoculan 250 \mul de este precultivo
en 10 ml de medio de producción (25 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}*7H_{2}O, 0,018 g/l
MnSO_{4}\cdot1H_{2}O, 30 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 5
mg/l tiamina y 50 mg/ml ampicilina) y el lote se incuba durante 72
horas a 37ºC. Después de la incubación, se determina la densidad
óptica (DO) de la suspensión de cultivo con un fotómetro LP2W del
Dr. Lange (Berlín, Alemania) a una longitud de onda de medida de 660
nm.
La concentración de L-valina
formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en
condiciones estériles con un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de reemplazamiento iónico y reacción
post-columna con detección por ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Figura 1: pMAK705\DeltapoxB (=
pMAK705deltapoxB)
\bullet Figura 2: pMW218gdhA
\bullet Figura 3: pMW219rhtC
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos de longitud deben entenderse como
datos aproximados. Las abreviaturas y designaciones utilizadas
tienen el significado siguiente:
- \bullet cat:
- gen de resistencia a cloranfenicol
- rep-ts:
- región de replicación sensible a la temperatura del plásmido pSC101
- poxB1:
- parte de la región 5' del gen poxB
- poxB2:
- parte de la región 3' del gen poxB
- kan:
- gen de resistencia a kanamicina
- gdhA:
- gen de glutamato-deshidrogenasa
- rhtC:
- gen que imparte resistencia a treonina
\newpage
Las abreviaturas para las enzimas de restricción
tienen el significado siguiente:
- \bullet BamHI:
- endonucleasa de restricción de Bacillus amyloliquefaciens
- \bullet BglII:
- endonucleasa de restricción de Bacillus globigii
- \bullet ClaI:
- endonucleasa de restricción de Caryphanon latum
- \bullet Ecl136II:
- endonucleasa de restricción de Enterobacter cloacae RFL136 (= Ecl136)
- \bullet EcoRI:
- endonucleasa de restricción de Escherichia coli
- \bullet EcoRV:
- endonucleasa de restricción de Escherichia coli
- \bullet HindIII:
- endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae
- \bullet KpnI:
- endonucleasa de restricción de Klebsiella pneumoniae
- \bullet PstI:
- endonucleasa de restricción de Providencia stuartii
- \bullet PvuI:
- endonucleasa de restricción de Proteus vulgaris
- \bullet SacI:
- endonucleasa de restricción de Streptomyces achromogenes
- \bullet SalI:
- endonucleasa de restricción de Streptomyces albus
- \bullet SmaI:
- endonucleasa de restricción de Serratia marcescens
- \bullet XbaI:
- endonucleasa de restricción de Xanthomonas badrii
- \bullet XhoI:
- endonucleasa de restricción de Xanthomonas holcicola
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para |a preparación por
fermentación de L-aminoácidos utilizando cepas de la
familia Enterobacteriáceas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 000613 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver, 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1719
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1716)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> poxB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 572
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1454
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1454)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutagenic DNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(56)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Technical DNA/residues of the
polylinker sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mis_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (57)..(577)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Part of the 5' región (poxB1) of the
poxB gene
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica_mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (578)..(646)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA técnico/residuos de la secuencia
polienlazadora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica_mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (647)..(1398)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Parte de la región 3' (poxB2) del
gen poxB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica_mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1399)..(1454)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA técnico/residuos de la secuencia
polienlazadora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1448
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica_mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón inicial del alelo delta
poxB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica_mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(605)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región 5' del alelo delta poxB
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica_mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (606)..(674)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA técnico/residuos de la secuencia
polienlazadora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica_mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (675)..(1445)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región 3' del alelo delta poxB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica_mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1446)..(1448)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón de parada del alelo delta
poxB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (26)
1. Un proceso para la preparación por
fermentación de L-treonina, L-valina
o L-lisina, que comprende la realización de los
pasos siguientes:
- a)
- fermentación de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado y en los cuales al menos el gen poxB o secuencias de nucleótidos que codifican su producto génico están atenuadas, en particular eliminadas,
- b)
- concentración del L-aminoácido correspondiente en el medio o en las células de las bacterias y
- c)
- aislamiento del L-aminoácido.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, que comprende emplear microorganismos en los cuales otros genes
del camino de biosíntesis del L-aminoácido deseado
se amplifican adicionalmente.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, que comprende emplear microorganismos en los cuales los caminos
metabólicos que reducen la formación del
L-aminoácido deseado se eliminan al menos
parcialmente.
4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, que comprende atenuar, en particular eliminar, la expresión del o
de los polinucleótidos que codifica(n) el producto del gen
poxB.
5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, que comprende reducir las propiedades reguladoras y/o catalíticas
del polipéptido (proteína enzimática) codificado por el
polinucleótido poxB.
6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, que comprende fermentar, para la preparación de
L-treonina, microorganismos de la familia
Enterobacteriáceas en los cuales uno o más genes seleccionados del
grupo constituido por:
- 6.1
- el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa,
- 6.2
- el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa,
- 6.3
- el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato-sintasa,
- 6.4
- el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato-carboxilasa,
- 6.5
- los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa,
- 6.6
- el gen rhtB que imparte resistencia a homoserina,
- 6.7
- el gen mqo que codifica resistencia a malato:quinona-oxidorreductasa,
- 6.8
- el gen rhtC para resistencia a treonina,
- 6.9
- el gen thrE que codifica exportación de treonina y
- 6.10
- el gen gdhA que codifica glutamato-deshidrogenasa
se intensifica(n), en particular se
sobreexpresan, simultáneamente.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, que comprende fermentar, para la preparación de
L-treonina, microorganismos de la familia
Enterobacteriáceas en los cuales uno o más genes seleccionados del
grupo constituido por:
- 7.1
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa,
- 7.2
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa,
- 7.3
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) yjfA,
- 7.4
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) ytfP, y
- 7.5
- el gen pckA que codifica la enzima fosfoenol-piruvato-carboxiquinasa
se atenúan, en particular se eliminan, o se
reduce la expresión de los mismos, simultáneamente.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Un microorganismo de la familia
Enterobacteriáceas que produce L-treonina, en el
cual el gen poxB o secuencias de nucleótidos que codifican su
producto génico están atenuados, en particular eliminados, y que
tienen una resistencia al ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico
y opcionalmente una necesidad parcial compensable de
L-isoleucina.
9. La cepa MG442\DeltapoxB de Escherichia
coli K-12, depositada bajo el número DSM 13762
en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ =
Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células,
Braunschweig, Alemania).
10. Un polinucleótido aislado de microorganismos
de la familia Enterobacteriáceas, que contiene la secuencia
polinucleotídica de SEQ ID No. 4, adecuado en particular como
constituyente de plásmidos para la mutagénesis específica de
posición del gen poxB.
11. Una cepa de la familia Enterobacteriáceas
que produce L-treonina y contiene SEQ ID No. 4.
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10054748 | 2000-11-04 | ||
| DE10054748 | 2000-11-04 | ||
| US24821000P | 2000-11-15 | 2000-11-15 | |
| US248210P | 2000-11-15 | ||
| DE10112107A DE10112107A1 (de) | 2000-11-04 | 2001-03-14 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE10112107 | 2001-03-14 | ||
| US28361201P | 2001-04-16 | 2001-04-16 | |
| US283612P | 2001-04-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2344681T3 true ES2344681T3 (es) | 2010-09-03 |
Family
ID=7662166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01992788T Expired - Lifetime ES2344681T3 (es) | 2000-11-04 | 2001-09-28 | Proceso para la preparacion por fermentacion de l-aminoacidos utilizando cepas de la familia enterobacteriaceas. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE10112107A1 (es) |
| ES (1) | ES2344681T3 (es) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007119881A1 (en) * | 2006-04-13 | 2007-10-25 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of the ybda gene |
-
2001
- 2001-03-14 DE DE10112107A patent/DE10112107A1/de not_active Withdrawn
- 2001-09-28 ES ES01992788T patent/ES2344681T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE10112107A1 (de) | 2002-05-08 |
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