ES2343944T3 - Proceso para la preparacion de l-aminoacidos usando cepas de la familia enterobacteriaceae con sobreexpresion fba. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para la preparación de L-aminoácidos seleccionados a partir del grupo que consiste en L-treonina, L-lisina y L-valina, donde los pasos siguientes son llevados a cabo: a) fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriaceae que producen el L-aminoácido deseado y en el que el gen fba de Escherichia coli está sobre-expresado, donde la sobreexpresión se logra aumentando el número de copias del gen o colocando dicho gen bajo un promotor fuerte, b) concentración del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos, y c) aislamiento del L-aminoácido deseado, constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o porciones (> 0 a 100%) de las mismas que permanecen opcionalmente en el producto.
Description
Proceso para la preparación de
L-aminoácidos usando cepas de la familia
Enterobacteriaceae con sobreexpresión fba.
Esta invención se relaciona con un proceso para
la preparación de L-aminoácidos, en particular
L-treonina, usando cepas de la familia
Enterobacteriaceae en la que al menos el gen fba está
sobreexpresado.
Los L-aminoácidos, en particular
L-treonina, son usados en la medicina humana y en la
industria farmacéutica, en la industria de la alimentación y muy
particularmente en la nutrición animal.
Es conocido preparar
L-aminoácidos por fermentación de las cepas de
Enterobacteriaceae, en particular Escherichia coli (E.
Coli) y Serratia marcescens. Debido a su gran
importancia, se experimenta constantemente para mejorar los
procesos de preparación. El mejoramiento del proceso puede
relacionarse con medidas de fermentación, tales como por ejemplo
agitación y suministro de oxígeno, o la composición del medio
nutriente, tales como por ejemplo la concentración de azúcar
durante la fermentación, o la preparación de la forma de producto,
por ejemplo cromatografía de intercambio iónico, o propiedades de
rendimiento intrínseco del propio microorganismo.
Los métodos de mutagénesis, selección y
selección de mutante son usados para mejorar las propiedades de
rendimiento de éstos microorganismos. Las cepas que son resistentes
a los antimetabolitos, son obtenidas de esta manera tales como por
ejemplo el análogo de treonina ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico
(AHV), o son autotróficos para los metabolitos de importancia
regulatoria y produce L-aminoácido, tal como por
ejemplo L-treonina.
Los métodos de la técnica de ADN recombinante
han sido también empleados durante algunos años para mejorar la
cepa de las cepas de la familia de Enterobacteriacea que produce
L-aminoácidos, amplificando genes individuales de
la biosíntesis de aminoácidos e investigando el efecto en la
producción.
El objeto de la invención es proporcionar nuevas
medidas para la preparación fermentativa mejorada de
L-aminoácidos, en particular de
L-treonina.
La invención proporciona un proceso para la
preparación de L-aminoácidos, en particular de
L-treonina, usando microorganismos de la familia
Enterobacteriacea que en particular ya producen
L-aminoácidos y en que la secuencia nucleotídica
que codifica para el gen fba está incrementado.
Donde los L-aminoácidos o
aminoácidos son mencionados en lo que sigue, esto significa uno o
más aminoácidos, que incluyen sus sales, seleccionados del grupo
que consiste en L-treonina,
L-valina, y L-lisina.
L-treonina es particularmente preferido.
El término "incremento" en este contexto
describe el aumento en la actividad intracelular de una o más
enzimas o proteínas en un microorganismo que están codificadas por
el correspondiente ADN, por ejemplo aumentando el número de copias
de el gen o genes, usando un potente promotor o un gen o alelo que
codifica para una correspondiente enzima o proteína con una alta
actividad, y opcionalmente combinando estas medidas.
Mediante las medidas de incremento, en
particular la sobre-expresión, la actividad o
concentración de la correspondiente proteína es en general
aumentada en al menos l0%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%,
400% ó 500%, hasta un máximo de 1000% ó 2000%, basado en la
proteína del tipo-salvaje o la actividad o
concentración de la proteína en el microorganismo de partida.
El proceso para la preparación de
L-aminoácidos seleccionados a partir del grupo que
consiste en L-treonina, L-lisina y
L-valina se caracteriza porque los pasos siguientes
son llevados a cabo:
- a)
- fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriacea que producen el L-aminoácido deseado y en el cual el gen fba de Escherichia coli está sobreexpresado, donde la sobreexpresión se logra aumentando el número de copias del gen o colocando dicho gen bajo un promotor fuerte.
- b)
- la concentración del correspondiente L-aminoácido en el medio o en las células de los microorganismos de la familia Enterobacteriacea, y
- c)
- aislamiento del L-aminoácido deseado, constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o porciones (> 0 a 100%) de los mismos que permanecen opcionalmente en el producto.
\vskip1.000000\baselineskip
Los microorganismos que proporciona la presente
invención pueden producir los L-aminoácidos a partir
de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas,
opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa o de glicerol y
etanol. Estos son representativos de la familia de Enterobacteriacea
seleccionados a partir del género de Escherichia, Erwinia,
Providencia y Serratia. Los géneros Escherichia, y Serratia son
preferidos. Del género Escherichia las especies Escherichia
coli y del género Serratia las especies Serratia
marcescens serán mencionadas en particular.
Las cepas apropiadas, que producen
L-treonina en particular, del género Escherichia, en
particular de las especies Escherichia coli, son, por
ejemplo
Las cepas apropiadas que producen
L-treonina del género Serratia, en particular de las
especies Serratia marcenscens, son, por ejemplo
Las cepas de la familia Enterobacteriaceae que
producen L-treonina tienen preferentemente, entre
otras, una o más características genéticas o fenotípicas
seleccionadas a partir del grupo que consiste en: resistencia al
ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico,
resistencia a la tialisina, resistencia a etionina, resistencia a
\alpha-metilserina, resistencia al ácido
diaminosuccínico, resistencia al ácido
\alpha-aminobutírico, resistencia a la
borrelidina, resistencia al rifampicina, resistencia a los análogos
de valina, tales como, por ejemplo, el hidroxamato de valina,
resistencia a los análogos de purina, tales como, por ejemplo,
6-dimetilaminopurina, una necesidad para
L-metionina, opcionalmente una necesidad parcial y
compensable para L-isoleucina, una necesidad para
el ácido meso-diaminopimélico, autotropía con
respecto a los dipéptidos que contienen treonina, resistencia a
L-treonina, resistencia a
L-homoserina, resistencia a
L-lisina, resistencia a
L-metionina, resistencia al ácido de
L-glutámico, resistencia a
L-aspartato, resistencia a
L-leucina, resistencia a
L-fenilalanina, resistencia a
L-serina, resistencia a L-cisteína,
resistencia a L-valina, sensibilidad al
fluoropiruvato, treonina dehidrogenasa defectivo, opcionalmente una
habilidad para la utilización de sacarosa, incremento del operón
treonina, incremento de la homoserina dehidrogenasa
I-aspartato quinasa I, preferiblemente la forma
resistente a la retroalimentación, incremento de la homoserina
quinasa, incremento de la treonina sintasa, incremento de la
aspartato quinasa, opcionalmente de la forma resistente a la
retroalimentación, incremento de aspartato semialdehído
dehidrogenasa, incremento del fosfoenol piruvato carboxilasa,
opcionalmente de la forma resistente a la retroalimentación,
incremento de la fosfoenolpiruvato sintasa, incremento de la
transhidrogenasa, incremento del producto del gen RhtB, incremento
del producto del gen RhtC, incremento del producto del gen YfiK,
incremento de la piruvato carboxilasa y atenuación de la formación
de ácido acético.
Se ha encontrado que los microorganismos de la
familia Enterobacteriaceae producen L-aminoácidos,
en particular L-treonina, de una manera mejorada
después de la sobreexpresión, del gen fba.
El uso de genes endógenos es en general
preferido. "Genes endógenos" o "secuencias nucleotídicas
endógenas" son entendidas como los genes o secuencias
nucleotídicas presentes en la población de una especie.
Las secuencias nucleotídicas de los genes de
Escherichia coli pertenecen al arte anterior y también pueden
encontrarse en la secuencia genómica de Escherichia coli
publicada por Blattner y otros (Science 277:
1453-1462 (1997)).
La información siguiente sobre el gen de fba es
conocida, entre otros, a partir del arte anterior:
- Descripción:
- Fructosa bisfosfato aldolasa (clase II)
- EC No.:
- 4.1.2.13
- Referencia:
- Alefounder y otros; Biochemical Journal 257(2): 529-34 (1989) Zgiby y otros; European Journal of Biochemistry 267(6): 1858-1868 (2000) Baldwin y otros; Biochemical Journal 169(3): 633-641 (1978)
- No de acceso:
- AE000376
- Nombres de genes alternativos:
- fda, ald.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de ácidos nucleicos pueden
encontrarse en los bancos de datos del Centro Nacional para la
Información de la Biotecnología (NCBI) de la Biblioteca Nacional de
Medicina (Bethesda, MD, E.U.), las bases de datos de secuencias
nucleotídicas de los Laboratorios de Biología Molecular Europeo
(EMBL, Heidelberg, Alemania o Cambridge, Reino Unido) o las bases
de datos de ADN de Japón (DDBJ, Mishima, Japón).
Alelos del gen fba que resulta de la
degeneración del código genético o debido a las "mutaciones con
sentido" de la función neutral además pueden ser usados.
Para lograr un incremento, pueden ser
aumentadas, por ejemplo, la expresión de los genes o las propiedades
catalíticas de las proteínas. Las dos medidas pueden ser
opcionalmente combinadas.
Para lograr una sobreexpresión, el número de
copias de los genes correspondientes pueden aumentarse, o el
promotor y la región de la regulación o el sitio de unión del
ribosoma aguas arriba del gen estructural puede mutarse. Los
casetes de expresión que son incorporados aguas arriba del gen
estructural actúan de la misma manera. Mediante promotores
inducibles, es posible adicionalmente incrementar la expresión en el
curso de la producción fermentativa de L-treonina.
La expresión se mejora igualmente mediante medidas para prolongar
la vida del ARN-m. Además, la actividad enzimática
es también incrementada previniendo la degradación de la proteína
enzimática. Los genes o construcciones de genes pueden estar
presentes en los plásmidos con un número diverso de copias, o puede
integrarse y amplificarse en el cromosoma.
Alternativamente, una sobreexpresión de los
genes en cuestión además puede lograrse cambiando la composición de
los medios y el procedimiento de cultivo.
Las instrucciones en este contexto pueden ser
encontradas por el experto, entre otros, en Chang y Cohen (Journal
of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), en Hartley
y Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), en Amann y
Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), en de Broer y
otros (Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 80: 21-25 (1983)), en
LaVallie y otros (BIO/TECHNOLOGY 11: 187-193
(1993)), en PCT/US97/13359, en Llosa y otros (Plasmid 26:
222-224 (1991)), en Quandt y Klipp (Gene 80:
161-169 (1989)), en Hamilton (Journa1 of
Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), en Jensen y
Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58:
191-195 (1998)) y en los libros de texto conocidos
de genéticas y biología molecular.
Los vectores plasmídicos que son capaces de la
replicación en Enterobacteriaceae, tales como por ejemplo los
vectores de clonaje derivados del pACYC184 (Bartolomé y otros; Gene
102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann y otros; Gene
69: 301-315 (1988)) o derivados de pSC101 (Vocke y
Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA
80(21): 6557-6561 (1983)) pueden ser usados.
Una cepa transformada con un vector plasmídico, donde el vector
plasmídico porta al menos una secuencia nucleotídica que codifica
para el gen fba, puede emplearse en un proceso de acuerdo con la
invención.
También es posible transferir mutaciones que
afectan la expresión del gen particular en varias cepas por
intercambio de secuencia (Hamilton y otros (Journal of Bacteriology
171: 4617-4622 (1989)), conjugación o
transducción.
Esto puede ser además ventajoso para la
producción de L-treonina, con cepas de la familia
Enterobacteriaceae para incrementar una o más enzimas de la ruta
conocida de la biosíntesis de la treonina o enzimas del metabolismo
anaplerótico o enzimas para la producción de fosfato dinucleótido
adenina nicotinamida reducido, además del incremento del gen
fba.
De esta manera, por ejemplo, uno o más de los
genes seleccionados a partir del grupo que consiste en
- \bullet
- el operón thrABC que codifica para la aspartato quinasa, homoserina dehidrogenasa, homoserina quinasa y treonina sintasa (US-A-4,278,765),
- \bullet
- el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa (DE-A-19 831 609),
- \bullet
- el gen pps que codifica para la fosfoenol piruvato sintasa (Molecular and General Genetics 231 (2): 332-336 (1992),
- \bullet
- el gen ppc que codifica para fosfoenol piruvato carboxilasa (Gene 31: 279-283 (1984)),
- \bullet
- los genes pntA y pntB que codifican para la transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
- \bullet
- el gen rhtB que imparte resistencia a la homoserina (EP-A-0 994 190),
- \bullet
- el gen mqo que codifica para la malato:quinona oxidoreductasa (WO 02/06459),
- \bullet
- el gen rhtC que imparte resistencia a la treonina(EP-A-1 013 765),
- \bullet
- el gen thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica para la proteína exportadora de treonina (WO 01/92545),
- \bullet
- el gen gdhA que codifica para la glutamato dehidrogenasa (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983)),
- \bullet
- el gen dps que codifica para el regulador global Dps (Genes & Development 6 (12B):2646-2654 (1992); No de Acceso AE000183),
- \bullet
- el gen ptsG que codifica para el componente IIBC glucosa-específico del sistema PTS de la fosfotransferasa (Journal of Biological Chemistry 269 (35): 16398-16403 (1986), No de Acceso AE000210),
- \bullet
- el gen lrp que codifica para el regulador del regulón Lrp leucina y sistemas de transporte de alta-afinidad de aminoácidos de cadena-ramificada (Journal of Biological Chemistry 266 (17): 10768-10774 (1991). No de Acceso AE000191),
- \bullet
- el gen ptsH de el operón ptsHIcrr que codifica para la proteína fosfohistidina hexosa fosfotransferasa del sistema PTS de la fosfotransferasa (Journal of Biological Chemistry 262 (33): 16241-16253 (1987). No de Acceso AE000329),
- \bullet
- el gen ptsI del operón ptsHIcrr que codifica para la enzima I del sistema PTS de la fosfotransferasa (Journal of Biological Chemistry 262 (33): 16241-16253 (1987). No de Acceso AE000329),
- \bullet
- el gen crr del operón ptsHIcrr que codifica para el componente IIA glucosa-específico del sistema PTS de la fosfotransferasa (Journal of Biological Chemistry 262 (33):16241-16253 (1987), No de Acceso. AE000329),
- \bullet
- el gen mopB que codifica para la chaperona GroES (Journal of Biological Chemistry 261 (26):12414-12419 (1986), No de Acceso. AE000487),
- \bullet
- el gen ahpC del operón ahpCF que codifica para la subunidad menor de la alquil hidroperóxido reductasa (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92 (17): 7617-7621 (1995),No de Acceso AE000166),
- \bullet
- el gen ahpF del operón ahpCF que codifica para la subunidad mayor de la alquil hidroperóxido reductasa (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92 (17): 7617-7621 (1995),No de Acceso AE000166),
pueden ser sobre-expresados,
donde la sobreexpresión es lograda aumentando el número de copias
del gen o colocando dicho gen bajo un promotor fuerte.
\vskip1.000000\baselineskip
El uso de genes endógenos es en general
preferido.
Además puede ser ventajoso para la producción de
L-treonina, además del incremento del gen fba, para
uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en
- \sqbullet
- el gen tdh que codifica para la treonina dehidrogenasa (Journal of Bacteriology 169: 4716-4721 (1987)),
- \sqbullet
- el gen mdh que codifica para malato dehidrogenasa (E.C. 1.1.1.37 (Archives in Microbiology 149: 36-42 (1987)),
- \sqbullet
- el producto del gen yjfA del marco de lectura abierto (orf) (Número de Acceso AAC77180 del Centro Nacional para la Información de Biotecnología (NCBI, Bethesda, MD, E.U.)),
- \sqbullet
- el producto del gen ytfP del marco de lectura abierto (orf) (Número de Acceso AAC77179 del Centro Nacional para la Información de Biotecnología (NCBI, Bethesda, MD, E.U.)),
- \sqbullet
- el gen pckA que codifica para la enzima fosfoenol piruvato carboxiquinasa (Journal of Bacteriology 172;7151-7156 (1990)),
- \sqbullet
- el gen poxB que codifica para la piruvato oxidasa (Nucleic Acids Research 14 (13): 5449-5460 (1986)),
- \sqbullet
- el gen aceA que codifica para la enzima isocitrato liasa (Journal of Bacteriology 170: 4528-4536 (1988)),
- \sqbullet
- el gen dgsA que codifica para el regulador DgsA del sistema de la fosfotransferasa (Bioscience; Biotecnology and Biochemistry 59: 256-251 (1995)) y es también conocido bajo el nombre del gen mlc,
- \sqbullet
- el gen fruR que codifica para el represor de la fructosa (Molecular and General Genetics 226: 332-336 (1991)) y es también conocido bajo el nombre del gene cra, y
- \sqbullet
- el gen rpoS que codifica para el factor sigma^{38} (WO 01/05939) y es también conocido bajo el de nombre del gen katF
para ser eliminada o para que la expresión de
los mismos sea reducida.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "atenuación" en este contexto
describe la reducción o la eliminación de la actividad intracelular
de una o más enzimas (proteínas) en un microorganismo que son
codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo usando un
promotor débil o un gen o alelo que codifica para una enzima
correspondiente con una baja actividad o desactiva la enzima
correspondiente (proteína) o el gen, y opcionalmente combinando
estas medidas.
Mediante las medidas de atenuación, la actividad
o concentración de la proteína correspondiente es, en general
reducida de 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5% de la
actividad o concentración de la proteína tipo salvaje o de la
actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de
partida.
Esto puede ser además ventajoso para la
producción de L-aminoácidos, en particular,
L-treonina, además para el incremento del gen fba,
para eliminar las reacciones colaterales indeseables (Nakayama:
"Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", en:
Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek
(eds.). Academic Press, Londres, Reino Unido, 1982).
Los microorganismos producidos de acuerdo con la
invención pueden cultivarse en el proceso por lotes (cultivo por
lotes), alimentación por lotes (proceso de alimentación) o proceso
reiterado de alimentación por lotes (proceso reiterado de
alimentación). Un resumen de métodos de cultivo conocidos es
descrito en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1.
Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Tecnología de
Bioprocesadores 1. Introducción a la Tecnología de Bioprocesadores
(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de
Storhas (Biozeaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactores y
Equipamiento Periférico] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden,
1994)).
El medio de cultivo a ser usado debe reunir los
requerimientos de las cepas particulares en una manera apropiada.
Las descripciones del medio de cultivo para varios microorganismos
están contenidas en el libro de texto "Manual of Methods for
General Bacteriology" de la Sociedad Americana de Bacteriología
(Washington D.C., E.U., 1981).
Los azúcares y carbohidratos, tales como por
ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza,
almidón y opcionalmente celulosa, aceites y grasas, tales como por
ejemplo aceite de soya, aceite de girasol, aceite de maní y grasa
de coco, ácidos grasos, tales como por ejemplo ácido palmítico,
ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, tales como por
ejemplo glicerol y etanol, y ácidos orgánicos, tales como por
ejemplo ácido acético, pueden usarse como fuente de carbón. Estas
sustancias pueden usarse individualmente o como una mezcla.
Los compuestos que contienen nitrógeno orgánico,
tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne,
extracto de malta, licor de maíz macerado, harina del frijol de soja
y urea, o compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio,
cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato
de amonio, pueden usarse como fuente de nitrógeno. Las fuentes de
nitrógeno pueden usarse individualmente o como una mezcla.
El ácido fosfórico, fosfato de dihidrógeno
potasio o fosfato hidrógeno de dipotasio o las sales
correspondientes que contienen sodio pueden usarse como fuente de
fósforo. El medio de cultivo además debe comprender sales de
metales, tales como por ejemplo el sulfato de magnesio o el sulfato
de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente,
sustancias esenciales para el crecimiento, tales como los
aminoácidos y las vitaminas, pueden emplearse además de las
sustancias anteriormente citadas. Precursores apropiados además
pueden adicionarse al medio de cultivo. Las sustancias de partida
mencionadas pueden adicionarse al cultivo en forma de un solo lote,
o pueden introducirse durante el cultivo de una manera
apropiada.
Los compuestos básicos, tales como el hidróxido
de sodio, el hidróxido de potasio, el amoníaco o el amoníaco
acuoso, o los compuestos ácidos, tales como el ácido fosfórico o el
ácido sulfúrico, pueden emplearse de una manera apropiada para
controlar el pH del cultivo. Los antiespumantes, tales como por
ejemplo ésteres de ácidos grasos de poliglicol, pueden emplearse
para controlar el desarrollo de la espuma. Las sustancias apropiadas
que tienen una acción selectiva, por ejemplo antibióticos, pueden
adicionarse al medio para mantener la estabilidad de los plásmidos.
Para mantener las condiciones aeróbicas, oxígeno o mezclas gaseosas
que contienen oxígeno, tales como por ejemplo aire, son
introducidas dentro del cultivo. La temperatura del cultivo es
usualmente de 25ºC a 45ºC, y preferiblemente de 30ºC a 40ºC. El
cultivo es continuado hasta que el máximo de
L-aminoácidos o L-treonina se ha
formado. Este objetivo usualmente es alcanzado dentro de 10 horas a
160 horas.
El análisis de los L-aminoácidos
puede ser llevado a cabo mediante cromatografía de intercambio
aniónico con la posterior derivatización de la ninidrina, como es
descrito por Spackman y otros (Analytical Chemistry 30:
1190-1206 (1958), o esto puede tener lugar mediante
HPLC en fase reversa como es descrito por Lindroth y otros
(Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).
El proceso de acuerdo con la invención es usado
para la preparación fermentativa de L-aminoácidos,
L-treonina, L-valina, y
L-lisina, en particular
L-treonina.
La presente invención es explicada con más
detalle seguidamente con ayuda de los ejemplos de realización.
Los medios mínimo (M9) y completo (LB) para
Escherichia coli usados son descritos por J.H. Miller (A
Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor
Laboratory Press). El aislamiento del ADN plasmídico a partir de
Escherichia coli, y todas las técnicas de restricción,
ligazón, Klenow y el tratamiento con fosfatasa alcalina son
llevados a cabo por el método de Sambrook y otros (Molecular
Cloning- A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory
Press). A menos que se describa lo contrario, la transformación de
Escherichia coli es llevada a cabo por el método de Chung y
otros (Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 86: 2172-2175 (1989)).
La temperatura de incubación para la preparación
de las cepas y los transformantes es de 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen fba a partir de E. coli K12 es
amplificado usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y
oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia nucleotídica
del gen fba en E. coli K12 MG1655 (Número de Acceso AE000376,
Blattner y otros (Science 277: 1453-1462 (1997)),
los cebadores del PCR son sintetizados (MWG Biotech, Ebersberg,
Alemania):
El ADN cromosómico de E. coli K12 MG1655
empleado para el PCR es aislado de acuerdo con las instrucciones
del fabricante con "Qiagen Genomic-tips 100/G"
(QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de ADN de aproximadamente
1100 pb en tamaño puede amplificarse con los cebadores específicos
bajo condiciones estándares para el PCR (Innis y otros (1990) PCR
Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con
Pfu-ADN polimerasa (Promega Corporation, Madison,
E.U.). El producto PCR se liga con el vector
pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO
PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Países Bajos) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante y se transforma en la cepa de
E. coli TOP10. La selección de las células portadoras de
plásmido tiene lugar sobre agar LB, al que se añaden 50 \mug/ml
de kanamicina. Después de aislamiento del DNA plasmídico, el vector
pCR-Blunt
II-TOPO-fba se escinde con las
enzimas de restricción SpeI y XbaI y, después de separación en gel
de agarosa al 0,8% con ayuda del Kit de Extracción de Gel QIAquick
(QIAGEN, Hilden, Alemania), se aísla el fragmento fba. El vector
pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) se escinde con la
enzima XbaI y se lleva a cabo la ligación con el fragmento fba
aislado. La cepa de E. coli XL1-Blue MRF
(Stratagene, La Jolla, E.U.) es transformada con el lote de ligazón
y las células portadoras de plásmido son seleccionadas en
agar-LB, a las que son adicionadas 50 \mug/ml de
ampicilina. La clonación exitosa puede demostrarse después del
aislamiento del ADN plasmídico mediante el corte controlado con las
enzimas HindIII y PvuII. El plásmido es denominado pTrc99Afba
(figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de E. coli MG442 productora de
L-treonina es descrita en la especificación de la
patente US-A-4,278,765 y depositada
como CMIM B-1628 en la Colección Nacional Rusa de
Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia).
La cepa MG442 es transformada con el plásmido de
expresión pTrc99Afba descrito en el ejemplo 1 y con el vector
pTrc99A y las células portadoras de plásmido son seleccionadas en
agar LB con 50 \mug/ml de ampicilina. Las cepas MG442/pTrc99Afba
y MG442/pTrc99A son formadas de esta manera. Las colonias
individuales seleccionadas son entonces multiplicadas además en
medio mínimo con la siguiente composición: 3.5 g/l de
Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O, 1.5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l de
NH_{4}Cl, 0.1 g/l de MgSO_{4}*7H_{2}O, 2 g/l de glucosa, 20
g/l de agar, 50 mg/l de ampicilina. La formación de
L-treonina es chequeada en los cultivos por lotes de
10 ml contenidos en frascos cónicos de 100 ml. Para ello, 10 ml del
medio de precultivo de la siguiente composición: 2 g/l de extracto
de levadura, 10 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l de
KH_{2}PO_{4}, 0.5 g/l de MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l de
CaCO_{3}, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina son inoculados
y el lote es incubado durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en una
incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza). Porciones de 250
\mul de este precultivo son transinoculadas dentro de 10 ml del
medio de producción (25 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l de MgSO_{4}*7H_{2}O, 0.03 g/l de FeS0_{4}*7H_{2}O, 0.018 g/l de MnSO_{4}*lH_{2}O, 30 g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina) y el lote es incubado durante 48 horas a 37ºC. La formación de L-treonina por la cepa de partida MG442 es investigada de la misma manera, pero sin que ocurra la adición de la ampicilina al medio. Después de la incubación la densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo es determinada con un fotómetro LP2W del Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) a una medida de longitud de onda de 660 nm.
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l de MgSO_{4}*7H_{2}O, 0.03 g/l de FeS0_{4}*7H_{2}O, 0.018 g/l de MnSO_{4}*lH_{2}O, 30 g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina) y el lote es incubado durante 48 horas a 37ºC. La formación de L-treonina por la cepa de partida MG442 es investigada de la misma manera, pero sin que ocurra la adición de la ampicilina al medio. Después de la incubación la densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo es determinada con un fotómetro LP2W del Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) a una medida de longitud de onda de 660 nm.
La concentración de L-treonina
formada es entonces determinada en el sobrenadante de cultivo
estéril filtrado con un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Alemania) mediante
cromatografía de intercambio iónico y una reacción
post-columna con la detección de ninidrina.
El resultado del experimento es mostrado en la
Tabla 1.
\bullet Figura 1: Mapa del plásmido pTrc99Afba
que contiene el gen fba.
Los datos de longitud pueden ser comprendidos
como datos aproximados. Las abreviaturas y designaciones usadas
tienen los significados siguientes:
- \bullet
- Amp: Gen de la resistencia a la ampicilina
- \bullet
- lacI: Gen de la proteína represora del promotor trc
- \bullet
- Ptrc: Región del promotor trc, inducible a IPTG
- \bullet
- fba: Región codificadora del gen fba
- \bullet
- 5S: Región 5S del ARNr
- \bullet
- rrnBT: región terminal del ARNr
\vskip1.000000\baselineskip
Las abreviaturas para las enzimas de restricción
tienen el significado siguiente:
- \bullet
- HindIII: Endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae R_{d}
- \bullet
- PuvII: Endonucleasa de restricción de Proteus vulgaris
- \bullet
- SpeI: Endonucleasa de restricción de la especie Sphaerotilus ATCC 13923
- \bullet
- XbaI: Endonucleasa de restricción de Xanthomonas campestris.
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para la preparación de
L-aminoácidos usando cepas de la familia
Enteriobacteriaceae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 020097 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fba1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgacgataca ggacaagaga c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fba2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagaaagga atatcttaca c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (36)
1. Un proceso para la preparación de
L-aminoácidos seleccionados a partir del grupo que
consiste en L-treonina, L-lisina y
L-valina, donde los pasos siguientes son llevados a
cabo:
- a)
- fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriaceae que producen el L-aminoácido deseado y en el que el gen fba de Escherichia coli está sobre-expresado, donde la sobreexpresión se logra aumentando el número de copias del gen o colocando dicho gen bajo un promotor fuerte,
- b)
- concentración del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos, y
- c)
- aislamiento del L-aminoácido deseado, constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o porciones (> 0 a 100%) de las mismas que permanecen opcionalmente en el producto.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, donde la expresión del polinucleótido que codifica para el gen
fba es aumentada.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, donde para la preparación de L-treonina los
microorganismos de la familia Enterobacteriaceae son fermentados en
el cual además al mismo tiempo uno o más genes seleccionados a
partir del grupo que consiste en:
- 3.1
- el operón thrABC que codifica para la aspartato quinasa, homoserina dehidrogenasa, homoserina quinasa y treonina sintasa,
- 3.2
- el gen pyc que codifica para piruvato carboxilasa,
- 3.3
- el gen pps que codifica para fosfoenol piruvato sintasa,
- 3.4
- el gen ppc que codifica para fosfoenol piruvato carboxilasa,
- 3.5
- los genes pntA y pntB que codifican para transhidrogenasa,
- 3.6
- el gen rhtB que imparte resistencia a la homoserina,
- 3.7
- el gen mqo que codifica para malato:quinona oxidoreductasa,
- 3.8
- el gen rhtC que imparte resistencia a la treonina,
- 3.9
- el gen thrE que codifica para la proteína exportadora de treonina,
- 3.10
- el gen gdhA que codifica para glutamato dehidrogenasa,
- 3.11
- el gen dps que codifica para el regulador global Dps,
- 3.12
- el gen lrp que codifica para el regulador del regulón Lrp de la leucina,
- 3.13
- el gen ptsG que codifica para el componente IIBC glucosa-específico,
- 3.14
- el gen ptsH que codifica para la proteína fosfohistidina hexosa fosfotransferasa,
- 3.15
- el gen ptsI que codifica para la enzima I del sistema de la fosfotransferasa,
- 3.16
- el gen crr que codifica para el componente IIA glucosa-específico,
- 3.17
- el gen mopB que codifica para la chaperona GroES,
- 3.18
- el gen ahpC que codifica para la subunidad menor de la alquil hidroperóxido reductasa,
- 3.19
- el gen ahpF que codifica para subunidad mayor de la alquil hidroperóxido reductasa,
es o son sobre-expresados, donde
la sobreexpresión es lograda aumentando el número de copias del gen
o colocando dicho gen bajo un promotor fuerte.
4. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
donde para la preparación de L-treonina los
microorganismos de la familia Enterobacteriaceae son fermentados en
el cual además al mismo tiempo uno o más genes seleccionados a
partir del grupo que consiste en:
- 4.1
- el gen tdh que codifica para la treonina dehidrogenasa,
- 4.2
- el gen mdh que codifica para la malato dehidrogenasa,
- 4.3
- el producto del gen yjfA del marco de lectura abierto (orf),
- 4.4
- el producto del gen ytfP del marco de lectura abierto (orf),
- 4.5
- el gen pckA que codifica para fosfoenol piruvato carboxiquinasa,
- 4.6
- el gen poxB que codifica para piruvato oxidasa,
- 4.7
- el gen aceA que codifica para isocitrato liasa,
- 4.8
- el gen dgsA que codifica para el regulador DgsA del sistema de la fosfotransferasa,
- 4.9
- el gen fruR que codifica para el represor de la fructosa,
- 4.10
- el gen rpoS que codifica para el factor sigma^{38}
es o son eliminados o reducidos en la
expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Microorganismos que producen
L-treonina de la familia Enterobacteriaceae, donde
el gen fba de E. coli y el operón thrABC, cuyos genes
codifican para la aspartato quinasa, homoserina dehidrogenasa,
homoserina quinasa y treonina sintasa; son sobreexpresados.
6. Microorganismos de acuerdo con la
reivindicación 5, donde los microorganismos son originados a partir
del género Escherichia.
7. Microorganismos de acuerdo con la
reivindicación 6, donde los microorganismos son originados a partir
de la especie E. coli.
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