ES2269712T3 - Proceso para la preparacion de l-aminoacidos que utiliza cepas de la familia enterobacteriaceas. - Google Patents
Proceso para la preparacion de l-aminoacidos que utiliza cepas de la familia enterobacteriaceas. Download PDFInfo
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Abstract
Un proceso para la preparación de L¿treonina, que comprende la realización de los pasos siguientes: a) fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen L¿treonina y en los cuales al menos el gen cysB del camino de biosíntesis de la cisteína, o secuencias de nucleótidos que codifican el producto génico de dicho gen está (están) sobreexpresado(s), b) concentración de L¿treonina en el medio o en las células de los microorganismos, y c) aislamiento de dicho L¿aminoácido, constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o porciones (> 0 a 100%) de la misma que quedan opcionalmente en el producto.
Description
Proceso para la preparación de
L-aminoácidos que utiliza cepas de la familia
Enterobacteriáceas.
Esta invención se refiere a un proceso para la
preparación de L-treonina, que utiliza cepas de la
familia Enterobacteriáceas en las cuales al menos el gen cysB y
opcionalmente uno o más de los genes del camino de biosíntesis de la
cisteína (camino de cisteína biosintética) seleccionado del grupo
constituido por cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP,
cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE y sbp está(n)
sobreexpresado(s).
Los L-aminoácidos, en particular
L-treonina, se utilizan en medicina humana y en la
industria de los productos farmacéuticos, en la industria
alimentaria y muy particularmente en nutrición animal.
Es conocida la preparación de
L-aminoácidos por fermentación de cepas de
Enterobacteriáceas, en particular Escherichia coli (E.
coli) y Serratia marcescens. Debido a su gran
importancia, se está realizando constantemente trabajo para mejorar
los procesos de preparación. Las mejoras en el proceso pueden
referirse a medidas de fermentación, tales como v.g. agitación y
suministro de oxígeno, o a la composición de los medios nutrientes,
tales como v.g. la concentración de azúcar durante la fermentación,
o a la elaboración de la forma del producto, mediante v.g.
cromatografía de intercambio iónico, o a las propiedades intrínsecas
de producción del microorganismo propiamente dicho.
Para mejorar las propiedades de producción de
estos microorganismos se utilizan métodos de mutagénesis, selección
y selección de mutantes. De esta manera se obtienen cepas que son
resistentes a antimetabolitos, tales como v.g. el análogo de
treonina ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico
(AHV), o son auxótrofas para metabolitos de importancia reguladora
y producen L-aminoácidos, tales como v.g.
L-treonina.
Se han empleado también desde hace varios años
métodos de la técnica del DNA recombinante para aumentar la variedad
de cepas de la familia Enterobacteriáceas que producen
L-aminoácidos, por amplificación de los genes de
biosíntesis de aminoácidos individuales e investigación del efecto
sobre la producción.
El objeto de la invención es proporcionar nuevas
medidas para mejorar la preparación de L-treonina
por fermentación.
La invención proporciona una proceso para la
preparación de L-treonina por fermentación, que
utiliza microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que
producen ya en particular L-aminoácidos y en los
cuales al menos el gen cysB y opcionalmente una o más de las
secuencias de nucleótidos que codifica(n) los genes del
camino de biosíntesis de la cisteína (camino de cisteína
biosintética) seleccionados del grupo constituido por cysG, cysZ,
cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI,
cysH, cysE y sbp está(n) sobreexpresado(s).
El proceso de acuerdo con la invención para la
preparación de L-treonina comprende los pasos
siguientes:
- a)
- fermentación de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen L-treonina y en los cuales el gen cysB y opcionalmente uno o más de los genes del camino de biosíntesis de la cisteína seleccionados del grupo constituido por cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE y sbp, o secuencias de nucleótidos que codifican el producto génico de dicho gen está/están sobreexpresado(s),
- b)
- concentración de dicho L-aminoácido en el medio o en las células de los microorganismos, y
- c)
- aislamiento de dicho L-aminoácido, constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o porciones (> 0 a 100%) de la misma que quedan opcionalmente en el producto.
Se prefiere el uso de genes endógenos. Debe
entenderse que las expresiones "genes endógenos" o
"secuencias de nucleótidos endógenos" significan los genes o
secuencias de nucleótidos presentes en la población de una
especie.
En los casos en que se mencionan en lo sucesivo
L-aminoácidos o aminoácidos, esto significa
L-treonina con inclusión de sus sales.
En este contexto, el término "mejora"
describe el aumento en la actividad o concentración intracelular de
una o más enzimas o proteínas en un microorganismo que están
codificadas por el DNA correspondiente, por ejemplo por aumento del
número de copias del gen o genes, utilizando un promotor potente o
un gen o alelo que codifica una enzima o proteína correspondiente
con actividad alta, y opcionalmente la combinación de estas
medidas.
Por las medidas de mejora, particularmente
sobreexpresión, la actividad o concentración de la proteína
correspondiente se aumenta en general al menos en 10%, 25%, 50%,
75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, hasta un máximo de 1000% o
2000%, basada en la de la proteína de tipo salvaje o la actividad o
concentración de la proteína en el microorganismo de partida.
El proceso comprende la realización de los pasos
siguientes:
- a)
- fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en las cuales el gen cysB y opcionalmente uno o más de los genes del camino de biosíntesis de la cisteína seleccionados del grupo constituido por cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE y sbp está (están) sobreexpresado(s),
- b)
- concentración de la L-treonina en el medio o en las células de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas, y
- c)
- aislamiento de dicho L-aminoácido, constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o porciones (> 0 a 100%) de la misma que quedan opcionalmente en el producto.
Los microorganismos que proporciona la presente
invención pueden producir L-treonina a partir de
glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas,
opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa o a partir de glicerol
y etanol. Dichos organismos son representativos de la familia
Enterobacteriáceas seleccionados de los géneros Escherichia,
Erwinia, Providencia, y Serratia. Se prefieren los géneros
Escherichia y Serratia. Del género Escherichia, debe mencionarse en
particular la especie Escherichia coli, y del género Serratia
la especie Serratia marcescens.
Cepas adecuadas del género Escherichia que
producen L-treonina, en particular de la especie
Escherichia coli, son, por ejemplo
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika Ml
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM
B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli
KCCM-10132
Cepas adecuadas del género Serratia productoras
de L-treonina, en particular de la especie
Serratia marcescens, son, por ejemplo
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000
Las cepas de la familia Enterobacteriáceas que
producen L-treonina tienen, entre otras cosas, una o
más características genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo
constituido por: resistencia al ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico,
resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a
\alpha-metilserina, resistencia a ácido
diaminosuccínico, resistencia a ácido
\alpha-aminobutírico, resistencia a borrelidina,
resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina, tales
como, por ejemplo, hidroxamato de valina, resistencia a análogos de
purina, tales como, por ejemplo,
6-dimetilaminopurina, necesidad de
L-metionina, opcionalmente una necesidad parcial y
compensable de L-isoleucina, necesidad de ácido
meso-diaminopimélico, auxotrofia con respecto a
dipéptidos que contienen treonina, resistencia a
L-treonina, resistencia a
L-homoserina, resistencia a
L-lisina, resistencia a L-metionina,
resistencia a ácido L-glutámico, resistencia a
L-aspartato, resistencia a
L-leucina, resistencia a
L-fenilalanina, resistencia a
L-serina, resistencia a L-cisteína,
resistencia a L-valina, sensibilidad a
fluoropiruvato, deficiencia en
treonina-deshidrogenasa, opcionalmente capacidad
para utilización de sacarosa, intensificación del operón treonina,
intensificación del homoserina-deshidrogenasa
I-aspartato-quinasa I,
preferiblemente de la forma resistente a la realimentación,
intensificación de homoserina-quinasa,
intensificación de treonina-sintasa,
intensificación de aspartato-quinasa, opcionalmente
de la forma resistente a la realimentación, intensificación de
aspartato-semialdehido-deshidrogenasa,
intensificación de
fosfoenol-piruvato-carboxilasa,
opcionalmente de la forma resistente a la realimentación,
intensificación de
fosfoenol-piruvato-sintasa,
intensificación de trans-hidrogenasa,
intensificación del producto del gen RhtB, intensificación del
producto del gen RhtC, intensificación del producto del gen YfiK,
intensificación de una piruvato-carboxilasa, y
atenuación de la formación de ácido acético.
Se ha encontrado que microorganismos de la
familia Enterobacteriáceas producen L-treonina, de
manera mejorada después de sobreexpresión de al menos el gen cysB y
opcionalmente uno o más de los genes del camino de biosíntesis de la
cisteína seleccionados del grupo constituido por cysG, cysZ, cysK,
cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH,
cysE y sbp.
Las secuencias de nucleótidos de los genes de
Escherichia coli pertenecen a la técnica anterior (véanse las
referencias de texto siguientes) y pueden encontrarse también en la
secuencia del genoma de Escherichia coli publicada por
Blattner et al. (Science 277: 1453-1462
(1997)). Los genes y actividades del camino de biosíntesis de la
cisteína (camino de la cisteína biosintética) se describen también
en forma resumida en Kredich (en: Neidhardt (compilador),
Escherichia coli y Salmonella, American Society for
Microbiology, Washington, D.C., EE.UU.: 514-527
(1996)).
Gen
cysG:
- Descripción:
- Uroporfirinógeno III C metil-transferasa; precorrin-2-oxidasa; ferroquelatasa
- EC No.:
- 2.1.1.107; 1.-.-.-; 4.99.1.-
- Referencia:
- Peakman et al.; European Journal of Biochemistry 191(2): 315-323 (\underbar{1990})
- \quad
- Macdonald and Cole; Molecular and General Genetics 200(2): 328-334 (\underbar{1985}) Warren et al.; Biochemical Journal 265(3): 725-729 (\underbar{1990}) Spencer et al.; FEBS Letters 335(1): 57-60 (\underbar{1993})
- No. de Acceso:
- AE000412
\vskip1.000000\baselineskip
Gen
cysB:
- Descripción:
- Regulador positivo del regulón cys, activador de transcripción
- Referencia:
- Ostrowski et al.; Journal of Biological Chemistry 262(13): 5999-6005 (\underbar{1987}) Mascarenhas and Yudkin; Molecular and General Genetics 177 (3): 535-539 (\underbar{1980}) Lochowska et al.; Journal of Biological Chemistry 276 (3): 2098-2107 (\underbar{2001})
- No. de Acceso:
- AE000225
\vskip1.000000\baselineskip
Gen
cysZ:
- Descripción:
- Transportador de sulfato
- Referencia:
- Byrne et al.; Journal of Bacteriology 170(7): 3150-3157 (\underbar{1988})
- No. de Acceso:
- AE000329
\vskip1.000000\baselineskip
Gen
cysK:
- Descripción:
- Cisteína-sintasa A, O-acetilserina-(tiol)-liasa A
- EC No:
- 4.2.99.8
- Referencia:
- Byrne et al.; Journal of Bacteriology 170(7): 3150-3157 (\underbar{1988}) Boronat et al.; Journal of General Microbiology 130: 673-685 (\underbar{1984}) Levy and Danchin; Molecular Microbiology 2(6): 777-783 (\underbar{1988})
- No. de Acceso:
- AE000329
Nombre alternativo del gen:
cysZ
\vskip1.000000\baselineskip
Gen
cysM:
- Descripción:
- Cisteína-sintasa B, O-acetilserina-(tiol)-liasa B
- EC No.:
- 4.2.99.8
- Referencia:
- Sirko et al.; Journal of Bacteriology 172(6): 3351-3357 (\underbar{1990}) Sirko et al., Journal of General Microbiology 133: 2719-2725 (\underbar{1987})
- No. de Acceso:
- AE000329
\vskip1.000000\baselineskip
Gen
cysA:
- Descripción:
- Proteína de fijación de ATP del sistema de transporte de sulfato
- Referencia:
- Sirko et al.; Journal of Bacteriology 172(6): 3351-3357 (\underbar{1990}), Sirko et al.; Journal of General Microbiology 133: 2719-2725 (\underbar{1987})
- No. de Acceso:
- AE000329
\vskip1.000000\baselineskip
Gen
cysW:
- Descripción:
- Proteína de transporte de sulfato fijada a la membrana
- Referencia:
- Sirko et al.; Journal of Bacteriology 172(6): 3351-3357 (\underbar{1990})
- No. de Acceso:
- AE000329, AE000330
\vskip1.000000\baselineskip
Gen
cysU:
- Descripción:
- Proteína permeasa del sistema de transporte de sulfato
- Referencia:
- Sirko et al.; Journal of Bacteriology 172(6): 3351-3357 (\underbar{1990}) Hryniewicz et al.; Journal of Bacteriology 172 (6): 3358-3366 (\underbar{1990})
- No. de Acceso:
- AE000330
\vskip1.000000\baselineskip
Nombre alternativo del gen:
cysT
Gen
cysP:
- Descripción:
- Proteína periplásmica de fijación de tiosulfato
- Referencia:
- Hryniewicz et al.; Journal of Bacteriology 172(6): 3358-3366 (\underbar{1990}) Sirko et al.; Journal of Bacteriology 177(14): 4134-4136 (\underbar{1995})
- No. de Acceso:
- AE000330
\vskip1.000000\baselineskip
Gen
cysD:
- Descripción:
- Sub-unidad 2 de ATP-sulfurilasa (ATP: sulfato-adenilil-transferasa)
- EC No.:
- 2.7.7.4
- Referencia:
- Leyh et al.; Journal of Biological Chemistry 267(15): 10405-10410 (\underbar{1992}), Leyh et al.; Journal of Biological Chemistry 263(5): 2409-2416 (\underbar{1988})
- No. de Acceso:
- AE000358
\newpage
Gen
cysN:
- Descripción:
- Sub-unidad 1 de ATP-sulfurilasa (ATP: sulfato-adenilil-transferasa)
- EC No.:
- 2.7.7.4
- Referencia:
- Leyh et al.; Journal of Biological Chemistry 267(15): 10405-10410 (\underbar{1992}) Leyh et al.; Journal of Biological Chemistry 263(5): 2409-2416 (\underbar{1988}) Leyh and Suo; Journal of Biological Chemistry 267(1): 542-545 (\underbar{1992})
- No. de Acceso:
- AE000358
\vskip1.000000\baselineskip
Gen
cysC:
- Descripción:
- Adenilil-sulfato-quinasa (APS-quinasa)
- EC No.:
- 2.7.1.25
- Referencia:
- Leyh et al.; Journal of Biological Chemistry 267(15): 10405-10410 (\underbar{1992}), Leyh et al.; Journal of Biological Chemistry 263(5): 2409-2416 (\underbar{1988})
- No. de Acceso:
- AE000358
\vskip1.000000\baselineskip
Gen
cysJ:
- Descripción:
- Flavoproteína de NADPH-sulfito-reductasa
- EC No.:
- 1.8.1.2
- Referencia:
- Ostrowski et al.; Journal of Biological Chemistry 264(27): 15796-15808 (\underbar{1989}), Li et al.; Gene 53(2-3): 227-234 (\underbar{1987}), Gaudu and Fontecave; European Journal of Biochemistry 226(2): 459-463 (\underbar{1994}), Eschenbrenner et al.; Journal of Biological Chemistry 270(35): 20550-20555 (\underbar{1995})
- No. de Acceso:
- AE000360
Nombre alternativo del gen:
cysP
\vskip1.000000\baselineskip
Gen
cysI:
- Descripción:
- Hemoproteína de NADPH-sulfito-reductasa
- EC No.:
- 1.8.1.2
- Referencia:
- Ostrowski et al.; Journal of Biological Chemistry 264(26): 15726-15737 (\underbar{1989}) Li et al.; Gene 53(2-3): 227-234 (\underbar{1987}) Gaudu and Fontecave; European Journal of Biochemistry 226 (2): 459-463 (\underbar{1994})
- No. de Acceso:
- AE000360
Nombre alternativo del gen:
cysQ
\vskip1.000000\baselineskip
Gen
cysH:
- Descripción:
- Fosfoadenosina-fosfosulfato-reductasa (PAPS reductasa)
- EC No.:
- 1.8.99.4
- Referencia:
- Ostrowski et al.; Journal of Biological Chemistry 264(26): 15726-15737 (\underbar{1989}) Krone et al.; Molecular and General Genetics 225(2): 314-319 (\underbar{1991}), Li et al.; Gene 53(2-3) 227-234 (\underbar{1987}), Berendt et al.; European Journal of Biochemistry 233(1): 347-356 (\underbar{1995})
- No. de Acceso:
- AE000360
\vskip1.000000\baselineskip
Gen
cysE:
- Descripción:
- Serina-acetil-transferasa
- EC No.:
- 2.3.1.30
- Referencia:
- Denk and Böck; Journal of General Microbiology 133, 515-25 (\underbar{1987})
- No. de Acceso:
- AE000438
\vskip1.000000\baselineskip
Gen
sbp:
- Descripción:
- Proteína periplásmica de fijación de sulfato
- Referencia:
- Hellinga and Evans, European Journal of Biochemistry 149(2): 363-373 (\underbar{1985}), Sirko et al.; Journal of Bacteriology 177(14): 4134-4136 (\underbar{1995}), Jacobson et al.; Journal of Biological Chemistry 266(8): 5220-5225 (\underbar{1991})
- No. de Acceso:
- AE000466
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de ácido nucleico pueden
encontrarse en los bancos de datos del National Center for
Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine
(Bethesda, MD, EE.UU.), el banco de datos de secuencias de
nucleótidos de los Laboratorios Europeos de Biología Molecular
(EMBL, Heidelberg, Alemania o Cambridge, Reino Unido) o el banco de
datos de DNA de Japón (DDBJ, Mishima, Japón).
Los genes descritos en las referencias de texto
mencionadas pueden utilizarse de acuerdo con la invención.
Adicionalmente, pueden utilizarse alelos de los genes que son
resultado de la degeneración del código genético o debidos a
"mutaciones de sentido" de función neutra.
Para conseguir una intensificación, por ejemplo,
la expresión de los genes o las propiedades catalíticas de las
proteínas pueden incrementarse. Las dos medidas pueden combinarse
opcionalmente.
Para conseguir una sobreexpresión, puede
incrementarse el número de copias de los genes correspondientes, o
pueden mutarse el promotor y la región reguladora o el sitio de
fijación de ribosoma aguas arriba del gen estructural. Casetes de
expresión que se incorporan aguas arriba del gen estructural actúan
del mismo modio. Por medio de promotores inducibles, es posible
adicionalmente aumentar la expresión en el curso de la producción de
L-treonina por fermentación. La expresión se aumenta
análogamente por medidas para prolongar la vida del
m-RNA. Adicionalmente, la actividad enzimática se
intensifica también por prevención de la degradación de la proteína
enzimática. Los genes o constructos de genes pueden estar presentes
en plásmidos con un número variable de copias, o pueden integrarse y
amplificarse en el cromosoma. Alternativamente, una sobreexpresión
de los genes en cuestión puede conseguirse también por cambio de la
composición de los medios y el procedimiento de cultivo.
Instrucciones en este contexto pueden ser
encontradas por los expertos, entre otros lugares en Chang y Cohen
(Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), en
Hartley and Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), en
Amann and Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), en de
Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America 80: 21-25 (1983)),
en LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11:
187-193 (1993)), en el documento PCT/US97/13359, en
Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), en
Quandt and Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), en
Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622
(1989)), en Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58:
191-195 (1998)) y en libros de texto conocidos de
genética y biología molecular.
Pueden utilizarse vectores de plásmido que son
capaces de replicación en Enterobacteriáceas, tales como v.g.
vectores de clonación derivados de pACYC184 (Bartolomé et
al.; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann
et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) o derivados
de pSC101 (Vocke and Bastia, Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 80 (21): 6557-6561 (1983)). Una cepa
transformada con un vector de plásmido, donde el vector de plásmido
lleva al menos el gen cysB y opcionalmente uno o más de los genes
seleccionados del grupo constituido
por cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE y sbp o secuencias de nucleótidos que codifican éstos, puede(n) emplearse en un proceso de acuerdo con la invención.
por cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE y sbp o secuencias de nucleótidos que codifican éstos, puede(n) emplearse en un proceso de acuerdo con la invención.
Es también posible transferir mutaciones que
afectan a la expresión del gen particular en diversas cepas por
intercambio de secuencias (Hamilton et al. (Journal of
Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), conjugación o
trans-
ducción.
ducción.
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la
producción de L-treonina, con cepas de la familia
Enterobacteriáceas, intensificar una o más enzimas del camino
conocido de biosíntesis de la treonina o enzimas del metabolismo
anaplerótico o enzimas para la producción de
nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato
reducido o enzimas de la glicólisis o enzimas PTS, además de la
sobreexpresión del gen cysB y opcionalmente uno o más de los genes
del camino de biosíntesis de la cisteína seleccionado(s) del
grupo constituido por cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU,
cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE y sbp.
Así, por ejemplo, pueden sobreexpresarse al
mismo tiempo uno o más de los genes seleccionados del grupo
constituido por
- \bullet
- el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa (documento US-A-4.278.765),
- \bullet
- el gen pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato-carboxilasa (documento WO 99/18228),
- \bullet
- el gen pps que codifica fosfoenol-piruvato-sintasa (Molecular and General Genetics 231: 332-336 (1992)),
- \bullet
- el gen ppc que codifica fosfoenol-piruvato-carboxilasa (Gene 31: 279-283 (1984)),
- \bullet
- los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
- \bullet
- el gen rhtB que imparte resistencia a la homoserina (documento EP-A-0 994 190),
- \bullet
- el gen mqo que codifica malato:quinona-oxidorreductasa (documento WO 02/06459),
- \bullet
- el gen rhtC que imparte resistencia a la treonina (documento EP-A-1 013 765),
- \bullet
- el gen thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica la exportación de treonina (WO 01/92545),
- \bullet
- el gen gdhA que codifica glutamato-deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983))
- \bullet
- el gen hns que codifica la proteína de fijación de DNA HLP-II (Molecular and General Genetics 212: 199-202 (1988)),
- \bullet
- el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa (Journal of Bacteriology 176: 5847-5851 (1994)),
- \bullet
- el gen fba que codifica fructosa-bifosfato-aldolasa (Biochemical Journal 257: 529-534 (1989)),
- \bullet
- el gen ptsH del operón ptsHIcrr que codifica la proteína fosfohistidina-hexosa-fosfotransferasa del sistema de fosfotransferasa PTS (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
- \bullet
- el gen ptsI del operón ptsHIcrr que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa PTS (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
- \bullet
- el gen crr del operón ptsHIcrr que codifica el componente IIa específico de glucosa del sistema de fosfotransferasa PTS (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
- \bullet
- el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa (Journal of Biological Chemistry 261: 16398-16403 (1986)),
- \bullet
- el gen lrp que codifica el regulador del regulón leucina (Journal of Biological Chemistry 266: 10768-10774 (1991)),
- \bullet
- el gen mopB que codifica la chaperona de 10 Kd (Journal of Biological Chemistry 261: 12414-12419 (1986)) y es conocido también por el nombre groES,
- \bullet
- el gen ahpC del operón ahpCF que codifica la subunidad pequeña de la alquil-hidroperóxido-reductasa (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 7617-7621 (1995)),
- \bullet
- el gen ahpF del operón ahpCF que codifica la subunidad grande de la alquil-hidroperóxido-reductasa (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 7617-7621 (1995)).
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la
producción de L-treonina, además de la
sobreexpresión del gen cysB y opcionalmente de uno o más de los
genes seleccionados del grupo constituido por cysG, cysZ, cysK,
cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH,
cysE y sbp, que se eliminen uno o más de los genes seleccionados del
grupo constituido por
- \bullet
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa (Ravnikar and Somerville (Journal of Bacteriology 169: 4716-4721 (1987)),
- \bullet
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa (E.C.1.1.1.37) (Vogel et al. (Archives in Microbiology 149: 36-42 (1987)),
- \bullet
- el producto del gen del marco de lectura abierto (orf) yjfA (Número de Acceso AAC77180 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.)),
- \bullet
- el producto del gen del marco de lectura abierto (orf) ytfP (Número de Acceso AAC77179 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.)),
- \bullet
- el gen pckA que codifica la enzima fosfoenol-piruvato-carboxiquinasa (Medina et al. Journal of Bacteriology 172: 7151-7156 (1990)),
- \bullet
- el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa (Grabau and Cronan (Nucleic Acids Research 14(13): 5449-5460 (1986)),
- \bullet
- el gen aceA que codifica la enzima isocitrato-liasa (Matsuoko and McFadden (Journal of Bacteriology 170, 4528-4536 (1988)),
- \bullet
- el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa (Hosono et al. (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59: 256-251 (1995)), y es conocido también bajo el nombre del gen mlc,
- \bullet
- el gen fruR que codifica el represor de fructosa (Jahreis et al. (Molecular and General Genetics 226: 332-336 (1991)) y es conocido también por el nombre del gen cra, y
- \bullet
- el gen rpoS que codifica el factor sigma^{38} (documento WO 01/05939) y es conocido también bajo el nombre del gen katF.
El término "atenuación" en este contexto,
describe la reducción o eliminación de la actividad o concentración
intracelular de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo
que están codificadas por el DNA correspondiente, por ejemplo
utilizando un promotor débil o un gen o alelo que codifica una
enzima o proteína correspondiente con una actividad baja o desactiva
la enzima o proteína o gen correspondiente, y combinación opcional
de estas medidas.
Por medidas de atenuación, la actividad o
concentración de la proteína correspondiente se reduce en general
hasta 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5% de la actividad o
concentración de la proteína de tipo salvaje o de la actividad o
concentración de la proteína en el microorganismo de partida.
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la
producción de L-treonina, además de la
sobreexpresión del gen cysB y de uno o más de los genes del camino
de biosíntesis de la cisteína seleccionados del grupo constituido
por cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN,
cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE y sbp, eliminar reacciones secundarias
indeseables (Nakayama: "Breeding of Amino-Acid
Producing Microorganisms", en: Overproduction of Microbial
Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (compiladores), Academic Press,
Londres, Reino Unido, 1982).
Los microorganismos producidos de acuerdo con la
invención pueden cultivarse en el proceso de lotes (cultivo de
lotes), el proceso de lote alimentado (proceso de alimentación) o el
proceso de lote alimentado repetido (proceso de alimentación
repetitiva). Un sumario de métodos de cultivo conocidos se describe
en el libro de texto publicado por Chmiel (Bioprozesstechnik 1.
Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1.
Introduction to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag,
Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto publicado por Storhas
(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and
Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden,
1994)).
El medio de cultivo a utilizar tiene que
satisfacer los requerimientos de las cepas particulares de una
manera adecuada. Descripciones de medios de cultivo para diversos
microorganismos se contienen en la guía "Manual of Methods for
General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology
(Washington D.C., EE.UU., 1981).
Como fuente de carbono pueden utilizarse
azúcares y carbohidratos, tales como v.g. glucosa, sacarosa,
lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y opcionalmente
celulosa, aceites y grasas, tales como v.g. aceite de soja, aceite
de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco, ácidos grasos,
tales como v.g. ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico,
alcoholes, tales como v.g. glicerol y etanol, y ácidos orgánicos,
tales como v.g. ácido acético. Estas sustancias pueden utilizarse
individualmente o como una mezcla.
Como fuente de nitrógeno pueden utilizarse
compuestos nitrogenados orgánicos, tales como peptonas, extracto de
levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maceración
de maíz, harina de soja y urea, o compuestos inorgánicos, tales como
sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato
de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden
utilizarse individualmente o como una mezcla.
Como fuente de fósforo pueden utilizarse ácido
fosfórico, dihidrogeno-fosfato de potasio o
hidrogeno-fosfato dipotásico las sales
correspondientes que contienen sodio. El medio de cultivo debe
comprender adicionalmente sales de metales, tales como v.g. sulfato
de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el
crecimiento. Finalmente, sustancias esenciales para el crecimiento,
tales como aminoácidos y vitaminas, pueden emplearse además de las
sustancias mencionadas anteriormente. Pueden añadirse además al
medio de cultivo precursores adecuados. Las sustancias de partida
mencionadas pueden añadirse al cultivo en la forma de un solo lote,
o pueden introducirse durante el cultivo de una manera
adecuada.
Para controlar el pH del cultivo se pueden
emplear compuestos básicos, tales como hidróxido de sodio, hidróxido
de potasio, amoniaco o amoniaco acuoso, o compuestos ácidos, tales
como ácido fosfórico o ácido sulfúrico, de una manera adecuada. Para
controlar el desarrollo de espuma se pueden emplear antiespumantes,
tales como v.g. poliglicol-ésteres de ácidos grasos. Sustancias
adecuadas que tienen una acción selectiva, v.g. antibióticos, pueden
añadirse al medio para mantener la estabilidad de los plásmidos.
Para mantener condiciones aerobias, se introducen en el cultivo
oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno, tales como v.g.
aire. La temperatura del cultivo es usualmente 25ºC a 45ºC, y
preferiblemente 30ºC a 40ºC. El cultivo se continúa hasta que se ha
formado un máximo de L-aminoácidos o
L-treonina. Este objetivo se alcanza usualmente en
el transcurso de 10 horas a 160 horas.
El análisis de L-aminoácidos
puede llevarse a cabo por cromatografía de intercambio aniónico con
derivación subsiguiente de ninhidrina, como ha sido descrito por
Spackman et al. (Analytical Chemistry 30:
1190-1206 (1958)), o puede realizarse por HPLC en
fase inversa como ha sido descrito por Limbroth et al.
(Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).
El proceso de acuerdo con la invención se
utiliza para la preparación de L-treonina por
fermentación.
Los medios mínimo (M9) y completo (LB) para
Escherichia coli utilizados han sido descritos por J.H.
Miller (A short course in bacterial genetics (1992), Cold Spring
Harbor Laboratory Press). El aislamiento de DNA plasmídico a partir
de Escherichia coli y todas las técnicas de restricción,
ligación, Klenow y tratamiento con fosfatasa alcalina se llevan a
cabo por el método de Sambrook et al. (Molecular cloning - A
Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). A no
ser que se describe de otro modo, la transformación de
Escherichia coli se lleva a cabo por el método de Chung et
al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America (1989) 86: 2172-2175).
La temperatura de incubación para la preparación
de cepas y transformantes es 37ºC.
El gen cysB de E. coli K12 se amplifica
utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y
oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de
nucleótidos del gen cysB en E. coli K12 MG1655 (Número de
Acceso AE000225, Blattner et al. (Science 277:
1453-1462 (1997)), se sintetizan iniciadores PCR
(MWG Biotech, Ebersberg, Alemania):
| cysB1: | 5'-GCGTCTAAGTGGATGGTTTAAC-3' | (SEQ ID No. 1) | |
| cysB2: | 5'-GGTGCCGAAAATAACGCAAG-3' | (SEQ ID No. 2) |
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones del
fabricante con "Qiagen Genomic-tips 100/G"
(QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA de aprox. 1000 pb de
tamaño puede amplificarse con los iniciadores específicos en
condiciones estándar de PCR (Innis et al. (1990) PCR
Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con
Pfu-DNA-polimerasa (Promega
Corporation, Madison, EE.UU.). El producto PCR se liga de acuerdo
con las instrucciones del fabricante con el vector
pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO
PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Países Bajos) y se
transforma en la cepa de E. coli TOP10.
La selección de las células portadoras de
plásmido tiene lugar sobre agar LB, al que se añaden 50 \mug/ml de
kanamicina. Después de aislamiento del DNA plasmídico, el vector
pCR-Blunt
II-TOPO-cysB se escinde con las
enzimas de restricción HindIII y XbaI y, después de separación en
gel de agarosa al 0,8%, se aísla el fragmento cysB con ayuda del Kit
de Extracción de Gel QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania). El vector
pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) se escinde con las
enzimas HindIII y XbaI y se lleva a cabo la ligación con el
fragmento cysB aislado. La cepa de E. coli
XL1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, EE.UU.) se
transforma con el lote de ligación y se seleccionan células
portadoras del plásmido en agar LB, al que se añaden 50 \mug/ml de
ampicilina. La clonación con éxito puede demostrarse después de
aislamiento del DNA plasmídico por escisión de control con las
enzimas ScaI y SmaI. El plásmido se denomina pTrc99AcysB (Figura
1).
La cepa de E. coli productora de
L-treonina, MG442 se describe en la memoria
descriptiva de la patente
US-A-4.278.765 y ha sido depositada
como CMIM B-1628 en la Colección Nacional de Rusia
para Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia).
La cepa MG442 se transforma con el plásmido de
expresión pTrc99AcysB descrito en el Ejemplo Ia y con el vector
pTrc99A y las células portadoras del plásmido se seleccionan sobre
agar LB con 50 \mug/ml de ampicilina. De esta manera se forman las
cepas MG442/pTrc99AcysB y MG442/pTrc99A. Las colonias individuales
seleccionadas se multiplican luego adicionalmente en medio mínimo
con la composición siguiente: 3,5 g/l Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O,
1,5 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l NH_{4}Cl, 0,1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 2 g/l glucosa, 20 g/l agar, 50 mg/l
ampicilina. La formación de L-treonina se comprueba
en cultivos de lotes de 10 ml contenidos en matraces cónicos de 100
ml. Para esto, se inoculan 10 ml de medio de precultivo de la
composición siguiente: 2 g/l extracto de levadura, 10 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina, y el lote se incuba durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en
una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza).
Porciones de 250 \mul de este precultivo se
trans-inoculan en 10 ml de medio de producción (25
g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}*7H_{2}O, 0,018 g/l
MnSO_{4}*1H_{2}O, 30 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina) y el lote se incuba durante 48 horas a 37ºC. Para la
inducción completa de la expresión del gen cysB, se añaden 100 mg/l
de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido
(IPTG) en lotes paralelos. La formación de
L-treonina por la cepa MG442 de partida se investiga
de la misma manera, pero no tiene lugar adición alguna de
ampicilina al medio. Después de la incubación, se determina la
densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo con un fotómetro
LP2W del Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) a una longitud de onda de
medida de 660 nm.
La concentración de L-treonina
formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en
condiciones estériles con un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y reacción
post-columna con detección por ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 1.
| Cepa | Aditivos | DO (660 nm) | L-treonina g/l |
| MG442 | - | 5,6 | 1,4 |
| MG442/pTrc99A | - | 3,8 | 1,3 |
| MG442/pTrc99AcysB | - | 4,4 | 1,7 |
| MG442/pTrc99AcysB | IPTG | 5,4 | 2,0 |
El gen cysK de E. coli K12 se amplifica
utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y
oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de
nucleótidos del gen cysK en E. coli K12 MG1655 (Número de
Acceso AE000329, Blattner et al. (Science 277:
1453-1462 (1997)), se sintetizan iniciadores PCR
(MWG Biotech, Ebersberg, Alemania):
| cysK1: | 5'-GAGTTAAGGACAGGCCATGAG-3' | (SEQ ID No. 3) | |
| cysK2: | 5'-GCTGGCATTACTGTTGCAATTC-3' | (SEQ ID No. 4) |
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones del
fabricante con "Qiagen Genomic-tips 100/G"
(QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA de aprox. 1000 pb de
tamaño puede amplificarse con los iniciadores específicos en
condiciones estándar de PCR (Innis et al. (1990) PCR
Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con
Pfu-DNA-polimerasa (Promega
Corporation, Madison, EE.UU.). El producto PCR se liga de acuerdo
con las instrucciones del fabricante con el vector
pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO
PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Países Bajos) y se
transforma en la cepa de E. coli TOP10.
La selección de las células portadoras de
plásmido tiene lugar sobre agar LB, al que se añaden 50 \mug/ml de
kanamicina. Después de aislamiento del DNA plasmídico, el vector
pCR-Blunt
II-TOPO-cysK se escinde con las
enzimas de restricción SpeI y XbaI y, después de separación en gel
de agarosa al 0,8%, se aísla el fragmento cysK con ayuda del Kit de
Extracción de Gel QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania). El vector
pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) se escinde con la
enzima XbaI y se lleva a cabo la ligación con el fragmento cysK
aislado. La cepa de E. coli XL1-Blue MRF'
(Stratagene, La Jolla, EE.UU.) se transforma con el lote de ligación
y se seleccionan células portadoras del plásmido en agar LB, al que
se añaden 50 \mug/ml de ampicilina. La clonación con éxito puede
demostrarse después de aislamiento del DNA plasmídico por escisión
de control con las enzimas HindIII y PvuII. El plásmido se denomina
pTrc99AcysK (Figura 2).
La cepa de E. coli MG442 productora de
L-treonina se describe en la memoria descriptiva de
la patente US-A-4.278.765 y ha sido
depositada como CMIM B-1628 en la Colección Nacional
de Rusia para Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia).
La cepa MG442 se transforma con el plásmido de
expresión pTrc99AcysK descrito en el Ejemplo 2a y con el vector
pTrc99A y las células portadoras del plásmido se seleccionan sobre
agar LB con 50 \mug/ml de ampicilina. De esta manera se forman las
cepas MG442/pTrc99AcysK y MG442/pTrc99A. Las colonias individuales
seleccionadas se multiplican luego adicionalmente en medio mínimo
con la composición siguiente: 3,5 g/l Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O,
1,5 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l NH_{4}Cl, 0,1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 2 g/l glucosa, 20 g/l agar, 50 mg/l
ampicilina. La formación de L-treonina se comprueba
en cultivos de lotes de 10 ml contenidos en matraces cónicos de 100
ml. Para esto, se inoculan 10 ml de medio de precultivo de la
composición siguiente: 2 g/l extracto de levadura, 10 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina, y el lote se incuba durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en
una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza).
Porciones de 250 \mul de este precultivo se
trans-inoculan en 10 ml de medio de producción (25
g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}*7H_{2}O, 0,018 g/l
MnSO_{4}*1H_{2}O, 30 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina) y el lote se incuba durante 48 horas a 37ºC. La
formación de L-treonina por la cepa MG442 de partida
se investiga de la misma manera, pero no tiene lugar adición alguna
de ampicilina al medio. Después de la incubación, se determina la
densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo con un fotómetro
LP2W del Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) a una longitud de onda de
medida de 660 nm.
La concentración de L-treonina
formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en
condiciones estériles con un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y reacción
post-columna con detección por ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
| Cepa | DO (660 nm) | L-treonina g/l |
| MG442 | 5,6 | 1,4 |
| MG442/pTrc99A | 3,8 | 1,3 |
| MG442/pTrc99AcysK | 5,6 | 2,1 |
\vskip1.000000\baselineskip
El gen cysM de E. coli K12 se amplifica
utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y
oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de
nucleótidos del gen cysM en E. coli K12 MG1655 (Número de
Acceso AE000329, Blattner et al. (Science 277:
1453-1462 (1997)), se sintetizan iniciadores PCR
(MWG Biotech, Ebersberg, Alemania). Las secuencias de los
iniciadores se modifican de tal modo que se forman sitios de
reconocimiento por enzimas de restricción. Se selecciona la
secuencia de reconocimiento por XbaI para el iniciador cysM1 y la
secuencia de reconocimiento por HindIII para el iniciador cysM2, que
están marcadas por subrayado en la secuencia de nucleótidos que se
muestra a continuación:
\newpage
| cysM1: | 5'-CGCATCAGTCTAGACCACGTTAGGATAG-3' | (SEQ ID No. 5) | |
| cysM2: | 5'-CATCAGTCTCCGAAGCTTTTAATCC-3' | (SEQ ID No. 6) |
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones del
fabricante con "Qiagen Genomic-tips 100/G"
(QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA de aprox. 950 pb de
tamaño puede amplificarse con los iniciadores específicos en
condiciones estándar de PCR (Innis et al. (1990) PCR
Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con
Pfu-DNA-polimerasa (Promega
Corporation, Madison, EE.UU.). El producto PCR se liga de acuerdo
con las instrucciones del fabricante con el vector
pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO
PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Países Bajos) y se
transforma en la cepa de E. coli TOP10.
La selección de las células portadoras de
plásmido tiene lugar sobre agar LB, al que se añaden 50 \mug/ml de
kanamicina. Después de aislamiento del DNA plasmídico, el vector
pCR-Blunt
II-TOPO-cysM se escinde con las
enzimas de restricción HindIII y XbaI y, después de separación en
gel de agarosa al 0,8%, se aísla el fragmento cysM con ayuda del Kit
de Extracción de Gel QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania). El vector
pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) se escinde con las
enzimas HindIII y XbaI y se lleva a cabo la ligación con el
fragmento cysM aislado. La cepa de E. coli
XL1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, EE.UU.) se
transforma con el lote de ligación y se seleccionan células
portadoras del plásmido en agar LB, al que se añaden 50 \mug/ml de
ampicilina. La clonación con éxito puede demostrarse después de
aislamiento del DNA plasmídico por escisión de control con las
enzimas EcoRV, Eco91I, PauI y SspI. El plásmido se denomina
pTrc99AcysM (Figura 3).
La cepa de E. coli MG442 productora de
L-treonina se describe en la memoria descriptiva de
la patente US-A-4.278.765 y ha sido
depositada como CMIM B-1628 en la Colección Nacional
de Rusia para Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia).
La cepa MG442 se transforma con el plásmido de
expresión pTrc99AcysM descrito en el Ejemplo 3a y con el vector
pTrc99A y las células portadoras del plásmido se seleccionan sobre
agar LB con 50 \mug/ml de ampicilina. De esta manera se forman las
cepas MG442/pTrc99AcysM y MG442/pTrc99A. Las colonias individuales
seleccionadas se multiplican luego adicionalmente en medio mínimo
con la composición siguiente: 3,5 g/l Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O,
1,5 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l NH_{4}Cl, 0,1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 2 g/l glucosa, 20 g/l agar, 50 mg/l
ampicilina. La formación de L-treonina se comprueba
en cultivos de lotes de 10 ml contenidos en matraces cónicos de 100
ml. Para esto, se inoculan 10 ml de medio de precultivo de la
composición siguiente: 2 g/l extracto de levadura, 10 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina, y el lote se incuba durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en
una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza).
Porciones de 250 \mul de este precultivo se
trans-inoculan en 10 ml de medio de producción (25
g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}*7H_{2}O, 0,018 g/l
MnSO_{4}*1H_{2}O, 30 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina) y el lote se incuba durante 48 horas a 37ºC. La
formación de L-treonina por la cepa MG442 de partida
se investiga de la misma manera, pero no tiene lugar adición alguna
de ampicilina al medio. Después de la incubación, se determina la
densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo con un fotómetro
LP2W del Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) a una longitud de onda de
medida de 660 nm.
La concentración de L-treonina
formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en
condiciones estériles con un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y reacción
post-columna con detección por ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 3
\vskip1.000000\baselineskip
| Cepa | DO (660 nm) | L-treonina g/l |
| MG442 | 5,6 | 1,4 |
| MG442/pTrc99A | 3,8 | 1,3 |
| MG442/pTrc99AcysM | 1,6 | 2,0 |
Los genes cysP, cysU, cysW y cysA de E.
coli K12 se amplifican utilizando la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la
secuencia de nucleótidos de los genes cysP, cysU, cysW y cysA en
E. coli K12 MG1655 (Números de Acceso AE000329 y AE000330,
Blattner et al. (Science 277: 1453-1462
(1997)), se sintetizan iniciadores PCR (MWG Biotech, Ebersberg,
Alemania). Las secuencias de los iniciadores se modifican de tal
modo que se formen sitios de reconocimiento por enzimas de
restricción. Se selecciona la secuencia de reconocimiento por XbaI
para el iniciador cysPUWA1 y la secuencia de reconocimiento por
HindIII para el iniciador cysPUWA2, que están marcadas por subrayado
en la secuencia de nucleótidos que se muestra a
continua-
ción:
ción:
| cysPUWA1: | 5'-GTCTCTAGATAAATAAGGGTGCGCAATGGC-3' | (SEQ ID No. 7) | |
| cysPUWA2: | 5'-CCGGGCGTTTAAGCTTCACTCAACC-3' | (SEQ ID No. 8) |
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones del
fabricante con "Qiagen Genomic-tips 100/G"
(QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA de aprox. 3900 pb de
tamaño puede amplificarse con los iniciadores específicos en
condiciones estándar de PCR (Innis et al. (1990) PCR
Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con
Pfu-DNA-polimerasa (Promega
Corporation, Madison, EE.UU.). El producto PCR se escinde con las
enzimas de restricción XbaI y HindIII y se liga con el vector
pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) que se ha digerido con
las enzimas XbaI y HindIII. La cepa de E. coli
XL1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, EE.UU.) se
transforma con el lote de ligación y se seleccionan células
portadoras del plásmido en agar LB, al que se añaden 50 \mug/ml de
ampicilina. La clonación con éxito puede demostrarse después de
aislamiento del DNA plasmídico por escisión de control con las
enzimas BamHI, EcoRV, MluI, NdeI y SspI. El plásmido se denomina
pTrc99AcysPUWA (Figura 4).
La cepa de E. coli MG442 productora de
L-treonina se describe en la memoria descriptiva de
patente US-A-4.278.765 y se ha
depositado como CMIM B-1628 en la Colección Nacional
de Rusia para Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia).
La cepa MG442 se transforma con el plásmido de
expresión pTrc99AcysPUWA descrito en el Ejemplo 4a y con el vector
pTrc99A y las células portadoras de plásmido se seleccionan en agar
LB con 50 \mug/ml de ampicilina. De este modo se forman las cepas
MG442/pTrc99AcysPUWA y MG442/pTrc99A. Las colonias individuales
seleccionadas se multiplican luego adicionalmente en medio mínimo
con la composición siguiente: 3,5 g/l Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O,
1,5 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l NH_{4}Cl, 0,1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 2 g/l glucosa, 20 g/l agar, 50 mg/l
ampicilina. La formación de L-treonina se comprueba
en cultivos de lotes de 10 ml contenidos en matraces cónicos de 100
ml. Para esto, se inoculan 10 ml de medio de precultivo de la
composición siguiente: 2 g/l extracto de levadura, 10 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina, y el lote se incuba durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en
una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza).
Porciones de 250 \mul de este precultivo se
trans-inoculan en 10 ml de medio de producción (25
g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}*7H_{2}O, 0,018 g/l
MnSO_{4}*1H_{2}O, 30 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina) y el lote se incuba durante 48 horas a 37ºC. Para la
inducción completa de la expresión de los genes cysPUWA, se añaden
100 mg/l de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido
(IPTG) en lotes paralelos. La formación de
L-treonina por la cepa MG442 de partida se investiga
de la misma manera, pero no tiene lugar adición alguna de ampicilina
al medio. Después de la incubación, se determina la densidad óptica
(DO) de la suspensión de cultivo con un fotómetro LP2W del Dr. Lange
(Düsseldorf, Alemania) a una longitud de onda de medida de
660
nm.
nm.
La concentración de L-treonina
formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en
condiciones estériles con un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y reacción
post-columna con detección por ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 4.
| Cepa | Aditivos | DO (660 nm) | L-treonina g/l |
| MG442 | - | 5,6 | 1,4 |
| MG442/pTrc99A | - | 3,8 | 1,3 |
| MG442/pTrc99AcysPUWA | - | 5,5 | 1,7 |
| MG442/pTrc99AcysPUWA | IPTG | 6,5 | 2,1 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los genes cysD, cysN y cysC de E. coli
K12 se amplifican utilizando la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) y oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de
nucleótidos de los genes cysD, cysN y cysC en E. coli K12
MG1655 (Número de Acceso AE000358, Blattner et al. (Science
277: 1453-1462 (1997)), se sintetizan iniciadores
PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania). Las secuencias de los
iniciadores se modifican de tal modo que se forman sitios de
reconocimiento por enzimas de restricción. Se selecciona la
secuencia de reconocimiento por XbaI para el iniciador cysDNC1 y la
secuencia de reconocimiento por HindIII para el iniciador cysDNC2,
que están marcadas por subrayado en la secuencia de nucleótidos que
se muestra a continuación:
| cysDNC1: | 5'-GCAAGAAAATAGCGGTCTAGATAAGGAACG-3' | (SEQ ID No. 9) | |
| cysDNC2: | 5'-CATGGAAAGCTTGTGGGTGTCTCAGG-3' | (SEQ ID No. 10) |
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones del
fabricante con "Qiagen Genomic-tips 100/G"
(QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA de aprox. 3000 pb de
tamaño puede amplificarse con los iniciadores específicos en
condiciones estándar de PCR (Innis et al. (1990) PCR
Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con
Pfu-DNA-polimerasa (Promega
Corporation, Madison, EE.UU.). El producto PCR se escinde con las
enzimas de restricción XbaI y HindIII y se liga con el vector
pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), que se ha digerido con
las enzimas XbaI y HindIII. La cepa de E. coli
XL1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, EE.UU.) se
transforma con el lote de ligación y se seleccionan células
portadoras del plásmido en agar LB, al que se añaden 50 \mug/ml de
ampicilina. La clonación con éxito puede demostrarse después de
aislamiento del DNA plasmídico por escisión de control con las
enzimas EcoRV, HincII, NruI, PvuI y ScaI. El plásmido se denomina
pTrc99AcysDNC (Figura 5).
La cepa de E. coli MG442 productora de
L-treonina se describe en la memoria descriptiva de
la Patente US-A-4.278.765 y ha sido
depositada como CMIM B-1628 en la Colección Nacional
de Rusia para Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia).
La cepa MG442 se transforma con el plásmido de
expresión pTrc99AcysDNC descrito en el Ejemplo 5a y con el vector
pTrc99A y las células portadoras de plásmido se seleccionan en agar
LB con 50 \mug/ml de ampicilina. De este modo se forman las cepas
MG442/pTrc99AcysDNC y MG442/pTrc99A. Las colonias individuales
seleccionadas se multiplican luego adicionalmente en medio mínimo
con la composición siguiente: 3,5 g/l Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O,
1,5 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l NH_{4}Cl, 0,1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 2 g/l glucosa, 20 g/l agar, 50 mg/l
ampicilina. La formación de L-treonina se comprueba
en cultivos de lotes de 10 ml contenidos en matraces cónicos de 100
ml. Para esto, se inoculan 10 ml de medio de precultivo de la
composición siguiente: 2 g/l extracto de levadura, 10 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina, y el lote se incuba durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en
una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza).
Porciones de 250 \mul de este precultivo se
trans-inoculan en 10 ml de medio de producción (25
g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}*7H_{2}O, 0,018 g/l
MnSO_{4}*1H_{2}O, 30 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina) y el lote se incuba durante 48 horas a 37ºC. La
formación de L-treonina por la cepa MG442 de partida
se investiga de la misma manera, pero no tiene lugar adición alguna
de ampicilina al medio. Después de la incubación, se determina la
densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo con un fotómetro
LP2W del Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) a una longitud de onda de
medida de 660 nm.
La concentración de L-treonina
formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en
condiciones estériles con un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y reacción
post-columna con detección por ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 5.
| Cepa | DO (660 nm) | L-treonina g/l |
| MG442 | 5,6 | 1,4 |
| MG442/pTrc99A | 3,8 | 1,3 |
| MG442/pTrc99AcysDNC | 5,1 | 2,5 |
Los genes cysJ y cysI de E. coli K12 se
amplifican utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y
oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de
nucleótidos de los genes cysJ y cysI en E. coli K12 MG1655
(Número de Acceso AE000360, Blattner et al. (Science 277:
1453-1462 (1997)), se sintetizan iniciadores PCR
(MWG Biotech, Ebersberg, Alemania):
| cysjI1: | 5'-CTGGAACATAACGACGCATGAC-3' | (SEQ ID No. 11) | |
| cysjI2: | 5'-GACCGGGCTGATGGTTAATCC-3' | (SEQ ID No. 12) |
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones del
fabricante con "Qiagen Genomic-tips 100/G"
(QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA de aprox. 3550 pb de
tamaño puede amplificarse con los iniciadores específicos en
condiciones estándar de PCR (Innis et al. (1990) PCR
Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con
Pfu-DNA-polimerasa (Promega
Corporation, Madison, EE.UU.). El producto PCR se liga de acuerdo
con las instrucciones del fabricante con el vector
pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO
PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Países Bajos) y se
transforma en la cepa de E. coli TOP10.
La selección de las células portadoras de
plásmido tiene lugar sobre agar LB, al que se añaden 50 \mug/ml de
kanamicina. Después de aislamiento del DNA plasmídico, el vector
pCR-Blunt
II-TOPO-cysJI se escinde con las
enzimas de restricción HindIII y XbaI y, después de separación en
gel de agarosa al 0,8%, se aísla el fragmento cysJI con ayuda del
Kit de Extracción de Gel QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania). El
vector pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) se escinde con
las enzimas HindIII y XbaI y se lleva a cabo la ligación con el
fragmento cysJI aislado. La cepa de E. coli
XL1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, EE.UU.) se
transforma con el lote de ligación y se seleccionan células
portadoras del plásmido en agar LB, al que se añaden 50 \mug/ml de
ampicilina. La clonación con éxito puede demostrarse después de
aislamiento del DNA plasmídico por escisión de control con las
enzimas AccI, ClaI y SphI. El plásmido se denomina pTrc99AcysJI
(Figura 6).
La cepa de E. coli MG442 productora de
L-treonina se describe en la memoria descriptiva de
la patente US-A-4.278.765 y ha sido
depositada como CMIM B-1628 en la Colección Nacional
de Rusia para Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia).
La cepa MG442 se transforma con el plásmido de
expresión pTrc99AcysJI descrito en el Ejemplo 6a y con el vector
pTrc99A y las células portadoras del plásmido se seleccionan sobre
agar LB con 50 \mug/ml de ampicilina. De esta manera se forman las
cepas MG442/pTrc99AcysJI y MG442/pTrc99A. Las colonias individuales
seleccionadas se multiplican luego adicionalmente en medio mínimo
con la composición siguiente: 3,5 g/l Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O,
1,5 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l NH_{4}Cl, 0,1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 2 g/l glucosa, 20 g/l agar, 50 mg/l
ampicilina. La formación de L-treonina se comprueba
en cultivos de lotes de 10 ml contenidos en matraces cónicos de 100
ml. Para esto, se inoculan 10 ml de medio de precultivo de la
composición siguiente: 2 g/l extracto de levadura, 10 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina, y el lote se incuba durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en
una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza).
Porciones de 250 \mul de este precultivo se
trans-inoculan en 10 ml de medio de producción (25
g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}*7H_{2}O, 0,018 g/l
MnSO_{4}*1H_{2}O, 30 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina) y el lote se incuba durante 48 horas a 37ºC. La
formación de L-treonina por la cepa MG442 de partida
se investiga de la misma manera, pero no tiene lugar adición alguna
de ampicilina al medio. Después de la incubación, se determina la
densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo con un fotómetro
LP2W del Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) a una longitud de onda de
medida de 660 nm.
La concentración de L-treonina
formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en
condiciones estériles con un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y reacción
post-columna con detección por ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 6.
| Cepa | DO (660 nm) | L-treonina g/l |
| MG442 | 5,6 | 1,4 |
| MG442/pTrc99A | 3,8 | 1,3 |
| MG442/pTrc99AcysJI | 6,3 | 2,5 |
El gen cysH de E. coli K12 se amplifica
utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y
oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de
nucleótidos del gen cis en E. coli K12 MG1655 (Número de
Acceso AE000360, Blattner et al. (Science 277:
1453-1462 (1997)), se sintetizan iniciadores PCR
(MWG Biotech, Ebersberg, Alemania):
| cysH1: | 5'-GGCAAACAGTGAGGAATCTATG-3' | (SEQ ID No. 13) | |
| cysH2: | 5'-GTCCGGCAATATTTACCCTTC-3' | (SEQ ID No. 14) |
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones del
fabricante con "Qiagen Genomic-tips 100/G"
(QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA de aprox. 800 pb de
tamaño puede amplificarse con los iniciadores específicos en
condiciones estándar de PCR (Innis et al. (1990) PCR
Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con
Pfu-DNA-polimerasa (Promega
Corporation, Madison, EE.UU.). El producto PCR se liga de acuerdo
con las instrucciones del fabricante con el vector
pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO
PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Países Bajos) y se
transforma en la cepa de E. coli TOP10.
La selección de células portadoras del plásmido
tiene lugar en agar LB, al que se añaden 50 \mug/ml de kanamicina.
Después de aislamiento del DNA plasmídico, el vector
pCR-Blunt
II-TOPO-cysH se escinde con las
enzimas de restricción HindIII y XbaI y, después de separación en
gel de agarosa al 0,8%, el fragmento cysH se aísla con ayuda del Kit
de Extracción en Gel QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania). El vector
pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) se escinde con las
enzimas HindIII y XbaI y la ligación se lleva a cabo con el
fragmento cysH aislado. La cepa de E. coli
XL1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, EE.UU.) se
transforma con el lote de ligación y las células portadoras del
plásmido se seleccionan en agar LB, al que se añaden 50 \mug/ml de
ampicilina. La clonación con éxito puede demostrarse después de
aislamiento del DNA plasmídico por escisión de control con las
enzimas HincII y MluI. El plásmido se denomina pTrc99AcysH (Figura
7).
La cepa de E. coli MG442 productora de
L-treonina se describe en la memoria descriptiva de
la patente US-A-4.278.765 y ha sido
depositada como CMIM B-1628 en la Colección Nacional
de Rusia para Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia).
La cepa MG442 se transforma con el plásmido de
expresión pTrc99AcysH descrito en el Ejemplo 7a y con el vector
pTrc99A y las células portadoras del plásmido se seleccionan sobre
agar LB con 50 \mug/ml de ampicilina. De esta manera se forman las
cepas MG442/pTrc99AcysH y MG442/pTrc99A. Las colonias individuales
seleccionadas se multiplican luego adicionalmente en medio mínimo
con la composición siguiente: 3,5 g/l Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O,
1,5 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l NH_{4}Cl, 0,1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 2 g/l glucosa, 20 g/l agar, 50 mg/l
ampicilina. La formación de L-treonina se comprueba
en cultivos de lotes de 10 ml contenidos en matraces cónicos de 100
ml. Para esto, se inoculan 10 ml de medio de precultivo de la
composición siguiente: 2 g/l extracto de levadura, 10 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina, y el lote se incuba durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en
una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza).
Porciones de 250 \mul de este precultivo se
trans-inoculan en 10 ml de medio de producción (25
g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}*7H_{2}O, 0,018 g/l
MnSO_{4}*1H_{2}O, 30 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina) y el lote se incuba durante 48 horas a 37ºC. La
formación de L-treonina por la cepa MG442 de partida
se investiga de la misma manera, pero no tiene lugar adición alguna
de ampicilina al medio. Después de la incubación, se determina la
densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo con un fotómetro
LP2W del Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) a una longitud de onda de
medida de 660 nm.
La concentración de L-treonina
formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en
condiciones estériles con un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y reacción
post-columna con detección por ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 7.
| Cepa | DO (660 nm) | L-treonina g/l |
| MG442 | 5,6 | 1,4 |
| MG442/pTrc99A | 3,8 | 1,3 |
| MG442/pTrc99AcysH | 4,1 | 2,7 |
Figura 1: Mapa del plásmido pTrc99AcysB que
contiene el gen cysB.
Figura 2: Mapa del plásmido pTrc99cysK que
contiene el gen cysK.
Figura 3: Mapa del plásmido pTrc99cysM que
contiene el gen cysM.
Figura 4: Mapa del plásmido pTrc99AcysPUWA que
contiene los genes cysP, cysU, cysW y cysA.
Figura 5: Mapa del plásmido pTrc99AcysDNC que
contiene los genes cysD, cysN y cysC.
Figura 6: Mapa del plásmido pTrc99AcysJI que
contiene los genes cysJ y cysI.
Figura 7: Mapa del plásmido pTrc99AcysH que
contiene el gen cysH.
Los datos de longitud deben entenderse como
datos aproximados. Las abreviaturas y designaciones utilizadas
tienen el significado siguiente:
- \bullet Amp:
- Gen de resistencia a ampicilina
- \bullet lacI:
- Gen para la proteína represora del promotor trc
- \bullet Ptrc:
- Región promotora trc, inducible por IPTG
- \bullet cysB:
- Región codificante del gen cysB
- \bullet cysK:
- Región codificante del gen cysK
- \bullet cysM:
- Región codificante del gen cysM
- \bullet cysP:
- Región codificante del gen cysP
- \bullet cysU:
- Región codificante del gen cysU
- \bullet cysW:
- Región codificante del gen cysW
- \bullet cysA:
- Región codificante del gen cysA
- \bullet cysD:
- Región codificante del gen cysD
- \bullet cysN;
- Región codificante del gen cysN
- \bullet cysC:
- Región codificante del gen cysC
- \bullet cysJ:
- Región codificante del gen cysJ
- \bullet cysI:
- Región codificante del gen cysI
- \bullet cysH:
- Región codificante del gen cysH
- \bullet 5S:
- Región de rRNA 5S
- \bullet rrnBT:
- Región terminadora de rRNA
\vskip1.000000\baselineskip
Las abreviaturas para las enzimas de restricción
tienen el significado siguiente:
- \bullet AccI:
- Endonucleasa de restricción de Acinetobacter calcoaceticus
- \bullet BamHI:
- Endonucleasa de restricción de Bacillus amyloliquefaciens H
- \bullet BstEII:
- Endonucleasa de restricción de Bacillus stearothermophilus ATCC 12980
- \bullet ClaI:
- Endonucleasa de restricción de Caryophannon latum
- \bullet EcoRI:
- Endonucleasa de restricción de Escherichia coli RY13
- \bullet EcoRV:
- Endonucleasa de restricción de Escherichia coli B946
- \bullet HincII:
- Endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae Rc
- \bullet HindIII:
- Endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae
- \bullet MluI:
- Endonucleasa de restricción de Micrococcus luteus IFO 12992
- \bullet NdeI:
- Endonucleasa de restricción de Neisseria dentrificans
- \bullet NruI:
- Endonucleasa de restricción de Norcadia ruba (ATCC 15906)
- \bullet PauI:
- Endonucleasa de restricción de Paracoccus alcaliphilus
- \bullet PvuI:
- Endonucleasa de restricción de Proteus vulgaris (ATCC 13315)
- \bullet PvuII:
- Endonucleasa de restricción de Proteus vulgaris (ATCC 13315)
- \bullet ScaI:
- Endonucleasa de restricción de Streptomyces caespitosus
- \bullet SmaI:
- Endonucleasa de restricción de Serratia marcescens
- \bullet SpeI:
- Endonucleasa de restricción de Sphaerotilus species ATCC 13923
- \bullet SphI:
- Endonucleasa de restricción de Streptomyces phaeochromogenes
- \bullet SspI:
- Endonucleasa de restricción de Sphaerotilus species ATCC 13925
- \bullet XbaI:
- Endonucleasa de restricción de Xanthomonas campestris
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para la preparación de
L-aminoácidos que utiliza cepas de la familia
Enterobacteriáceas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 010275 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cysB1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtctaagt ggatggttta ac
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cysB2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgccgaaa ataacgcaag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cysK1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagttaagga caggccatga g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cysK2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctggcatta ctgttgcaat tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cysM1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcatcagtc tagaccacgt taggatag
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cysM2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcagtctc cgaagctttt aatcc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cysPUWA1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctctagat aaataagggt gcgcaatggc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cysPUWA2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgggcgttt aagcttcact caacc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cysDNC1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaagaaaat agcggtctag ataaggaacg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cysDNC2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatggaaagc ttgtggtgtc tcagg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cysJI1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggaacata acgacgcatg ac
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cysJI2
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cysJI2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccgggctg atggttaatc c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cysH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcaaacagt gaggaatcta tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cysH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtccggcaat atttaccctt c
\hfill21
Claims (7)
1. Un proceso para la preparación de
L-treonina, que comprende la realización de los
pasos siguientes:
- a)
- fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen L-treonina y en los cuales al menos el gen cysB del camino de biosíntesis de la cisteína, o secuencias de nucleótidos que codifican el producto génico de dicho gen está (están) sobreexpresado(s),
- b)
- concentración de L-treonina en el medio o en las células de los microorganismos, y
- c)
- aislamiento de dicho L-aminoácido, constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o porciones (> 0 a 100%) de la misma que quedan opcionalmente en el producto.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, en el cual el o los polinucleótidos que codifica(n) uno o
más de los productos génicos de los genes de biosíntesis de la
cisteína seleccionados del grupo constituido por cysG, cysZ, cysK,
cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH,
cysE y sbp se sobreexpresa(n).
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, en el cual, para la preparación de L-treonina, se
fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriáceas, en el
cual se sobreexpresan adicionalmente al mismo tiempo uno o más de
los genes seleccionados del grupo constituido por:
- a)
- el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa,
- b)
- el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa,
- c)
- el gen pps que codifica fosfoenol-piruvato-sintasa,
- d)
- el gen ppc que codifica fosfoenol-piruvato-carboxilasa,
- e)
- los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa,
- f)
- el gen rhtB que imparte resistencia a homoserina,
- g)
- el gen mqo que codifica malato:quinona-oxido-rreductasa,
- h)
- el gen rhtC que imparte resistencia a la treonina,
- i)
- el gen thrE que codifica la proteína de exportación de treonina,
- j)
- el gen gdhA que codifica glutamato-deshidrogenasa,
- k)
- el gen hns que codifica la proteína HLP-II de fijación de DNA,
- l)
- el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa,
- m)
- el gen fba que codifica fructosa-difosfato-aldolasa,
- n)
- el gen ptsH que codifica la proteína fosfohistidina hexosa-fosfotransferasa,
- o)
- el gen ptsI que codifica la enzima I del sistema de la fosfotransferasa,
- p)
- el gen crr que codifica el componente IIA específico de glucosa,
- q)
- el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa,
- r)
- el gen lrp que codifica el regulador del regulón de leucina,
- s)
- el gen mopB que codifica la chaperona de 10 Kd,
- t)
- el gen ahpC que codifica la subunidad pequeña de alquil-hidroperóxido-reductasa,
- u)
- el gen ahpF que codifica la subunidad grande de alquil-hidroperóxido-reductasa.
4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, en el cual, para la preparación de L-treonina, se
fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriáceas,
en el cual se elimina(n) adicionalmente al mismo tiempo uno o
más de los genes seleccionados del grupo constituido por:
- a)
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa,
- b)
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa,
- c)
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) yjfA,
- d)
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) yjfP,
- e)
- el gen pckA que codifica fosfoenol-piruvato-carboxiquinasa,
- f)
- el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa,
- g)
- el gen aceA que codifica isocitrato-liasa,
- h)
- el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa,
- i)
- el gen fruR que codifica el represor de fructosa,
- j)
- el gen rpoS que codifica el factor sigma^{38}.
5. Microorganismos productores de
L-treonina de la familia Enterobacteriáceas, en los
cuales se sobreexpresan al menos el operón thrABC, genes que
codifican aspartato-quinasa,
homoserina-deshidrogenasa,
homoserina-quinasa y
treonina-sintasa, y el gen cysB.
6. Microorganismos de acuerdo con la
reivindicación 5, en los cuales los microorganismos se originan en
el género Escherichia.
7. Microorganismos de acuerdo con la
reivindicación 5, en los cuales los microorganismos se originan en
la especie E. coli.
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