ES2298732T3 - Proceso para la produccion de l-aminoacidos que utiliza cepas de la familia enterobacteriaceas, que sobre-expresan el gen galp, que codifica un simportador de protones de galactosa. - Google Patents

Proceso para la produccion de l-aminoacidos que utiliza cepas de la familia enterobacteriaceas, que sobre-expresan el gen galp, que codifica un simportador de protones de galactosa. Download PDF

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Abstract

Un proceso para la producción de L-aminoácidos seleccionados del grupo L-treonina, L-valina, L-homoserina y L-lisina, que comprende: a) fermentación de microorganismos del género Escherichia que producen ya los aminoácidos deseados y en los cuales se sobreexpresan el gen galP o secuencias de nucleótidos que codifican el producto génico simportador de protones de galactosa, donde sobreexpresión describe la actividad o concentración intracelular incrementada de dicho producto génico con relación a la actividad o concentración de dicho producto génico en el microorganismo de partida, por lo cual el sistema de transporte de fosfotransferasa (PTS) en dichos microorganismos no está desactivado en comparación con la célula PTS de tipo salvaje correspondiente, b) acumulación del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos, y c) aislamiento del L-aminoácido deseado, en donde algo o la totalidad (=0 a 100%) de la biomasa permanece en el producto.

Description

Proceso para la producción de L-aminoácidos que utiliza cepas de la familia enterobacteriáceas, que sobre-expresan el gen galP, que codifica un simportador de protones de galactosa.
Campo de la invención
Esta invención proporciona un proceso para la producción de L-valina, L-homoserina, L-lisina y L-treonina, que utiliza cepas de la familia Enterobacteriáceas en las cuales se sobreexpresa el gen galP.
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Antecedentes de la invención
Los L-aminoácidos, en particular L-treonina, se utilizan en medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y muy particularmente en nutrición animal.
Es sabido que pueden prepararse L-aminoácidos por la fermentación de cepas de Enterobacteriáceas, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Como resultado de la gran importancia de esto, se están realizando continuamente esfuerzos para mejorar el método de producción. Las mejoras de proceso pueden estar relacionadas con medidas de ingeniería de fermentación tales como p.ej. agitación y suministro de oxígeno, o con la composición de los medios nutrientes tal como p.ej. la concentración de azúcar durante la fermentación, o con el acabado de la forma del producto mediante p.ej. cromatografía de intercambio iónico, o las características intrínsecas de eficiencia del microorganismo propiamente dicho.
Los métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes se utilizan para mejorar las características de eficiencia de estos microorganismos. De este modo, se obtienen cepas que son resistentes a antimetabolitos tales como p.ej. el análogo de treonina ácido \alpha-amino-\beta-hidroxivalérico (AHV) o auxótrofos para metabolitos importantes en cuanto a la regulación y que producen L-aminoácidos tales como p.ej. L-treonina.
Desde hace algún tiempo, los métodos de ingeniería del DNA recombinante se han utilizado también para la mejora de cepas productoras de L-aminoácidos de la familia Enterobacteriáceas, por amplificación de los genes de biosíntesis de aminoácidos individuales y ensayo del efecto de esto sobre la producción. Un sumario de la información relativa a la biología celular y biología molecular de Escherichia coli y Salmonella puede encontrarse en Neidhardt (compilador): Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, 2ª edición, ASM Press, Washington, D.C., EE.UU. (1996).
Venter, Henrietta et al. (Biochemical Journal, vol. 363, nº 2, 15 de abril de 2002 (2002-04-15), páginas 243-252, XP002288523 ISSN: 0264-6021) describen la sobreexpresión del gen galP (proteína Symport D-galactosa-H^{+}) en E. coli. Walmsley Adrian R. et al. (Journal of Biological Chemistry, vol. 269, nº 25, 1994, páginas 17009-17019, XP 002288524 ISSN: 0021-9258) describen también la sobreexpresión del gen galP que codifica la proteína Symport D-galactosa-H^{+} en E. coli.
En el documento EP-A-1149911 se describe la preparación de L-treonina por fermentación, en donde se utilizan microorganismos de la familia Enterobacteriáceas, en particular en E. coli que expresan genes PTS o distintos de PTS de sacarosa para transporte de sacarosa. En particular, la permeasa de tipo lacY, sistema de transporte de protones, es uno de dichos genes. La materia que constituye el objeto de las reivindicaciones difiere en que en la presente memoria descriptiva el gen que se sobreexpresa en un microorganismo de la familia Enterobacteriáceas es el gen galP.
Martin Giles et al. (Journal of Biological Chemistry, vol. 269, nº 40, 1994, páginas 24870-24877, XP002288526 ISSN: 0021-9258) demostraron que la forskolina es un inhibidor notablemente específico del transporte energizado de D-galactosa por la proteína Symport de azúcar-H^{+} GalP de Escherichia coli. En el documento WO 2004/033471 (publicada posteriormente) se describe un método para restablecer un fenotipo Glu^{+} a una célula bacteriana PTS^{-}/Glu^{-} que era originalmente capaz de utilizar un sistema de transporte de fosfotransferasa (PTS) para el transporte de carbohidratos.
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Objeto de la invención
Los autores de la invención se han propuesto como objetivo de provisión de nuevas medidas para la producción mejorada por fermentación de L-aminoácidos, en particular L-treonina.
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Sumario de la invención
La invención proporciona un proceso para la producción por fermentación de L-valina, L-valina, L-homoserina, L-lisina y L-treonina, utilizando microorganismos de la familia Enterobacteriáceas, en particular aquéllas que producen ya L-aminoácidos y en los cuales se sobreexpresa la secuencia de nucleótidos que codifica el gen galP.
Descripción detallada de la invención
El producto génico codificado por el gen galP es conocido en la técnica anterior, entre otras cosas, como "simportador de protones de galactosa" o "galactosa-permeasa".
En general, la proteína codificada por una secuencia de nucleótidos, a saber un gen o un alelo, o el ácido ribonucleico codificado se denomina producto génico.
Los alelos se entienden generalmente como formas alternativas de un gen dado. Las formas se caracterizan por diferencias en la secuencia de nucleótidos.
Siempre que se mencionan en lo sucesivo L-aminoácidos o aminoácidos, se entiende que estos términos significan uno o más aminoácidos, con inclusión de sus sales, seleccionados del grupo constituido por L-treonina, valina y homoserina, L-lisina, prefiriéndose particularmente L-treonina.
El término "sobreexpresión", en este contexto, describe el aumento en la actividad o concentración intracelular de una o más enzimas o proteínas, en un microorganismo, que son codificadas por el DNA correspondiente mediante, por ejemplo, aumento del número de copias del gen o genes por al menos una (1) copia o utilización de un promotor fuerte y opcionalmente combinación de estas medidas.
Como resultado de la sobreexpresión de medida, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se incrementa generalmente al menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, o 500%, como máximo hasta 1000% o 2000%, con respecto a la proteína de tipo salvaje o la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida. Se entiende que el microorganismo de partida o cepa originaria es el microorganismo sobre el cual se realizan las medidas de la invención.
La invención proporciona un proceso para la producción de L-aminoácidos por la fermentación de microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas, caracterizado porque
a)
los microorganismos que producen los L-aminoácidos arriba mencionados, en los cuales se sobreexpresa el gen galP o las secuencias de nucleótidos que codifican el mismo, se cultiva(n) en un medio en condiciones en las cuales dicho L-aminoácido se enriquece en el medio o en las células, y
b)
se aísla dicho L-aminoácido, en donde \geq0 a 100% de la biomasa se mantiene en el producto aislado.
Los microorganismos, en particular recombinantes, que son proporcionados también por la presente invención, pueden producir L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa, o a partir de glicerina y etanol. Los mismos son representativos de la familia Enterobacteriáceas seleccionados de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. Se prefieren los géneros Escherichia y Serratia. En el caso del género Escherichia, se menciona en particular la especie Escherichia coli, y en el caso del género Serratia, se menciona en particular la especie Serratia marcescens.
Los microorganismos recombinantes se producen generalmente por transformación, transducción, o conjugación utilizando un vector que contienen el gen deseado.
Cepas adecuadas del género Escherichia, en particular las que producen L-treonina, en particular de la especie Escherichia coli son, por ejemplo,
-
Escherichia coli H4581 (EP-A 0301572)
-
Escherichia coli KY10935 (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61(11): 1877-1882 (1997)
-
Escherichia coli VNIIgenetika MG442 (US-A-4.278.765)
-
Escherichia coli VNIIgenetika M1 (US-A-4.321.325)
-
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23 (US-A-5.631.157)
-
Escherichia coli BKIIM B-3996 (US-A-5.175.107)
-
Escherichia coli kat 13 (WO 98/04715)
-
Escherichia coli KCCM-10132 (WO 00/09660)
Cepas adecuadas del género Serratia, en particular las que producen L-treonina, en particular de la especie Serratia Marcescens son, por ejemplo
-
Serratia marcescens HNr21 (Applied and Environmental Microbiology 38(6): 1045-1051 (1979))
-
Serratia marcescens TLr156 (Gene 57(2-3): 151-158 (1987))
-
Serratia marcescens T-2000 (Applied Biochemistry and Biotechnology 37(3): 255-265 (1992))
Las cepas productoras de L-treonina de la familia Enterobacteriáceas poseen preferiblemente, entre otras cosas, una o más de las características genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo: resistencia al ácido \alpha-amino-\beta-hidroxivalérico, resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a \alpha-metilserina, resistencia al ácido diaminosuccínico, resistencia al ácido \alpha-aminobutírico, resistencia a borrelidina, resistencia al ácido ciclopentanocarboxílico, resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina tales como, por ejemplo, valinahidroxamato, resistencia a análogos de purina tales como, por ejemplo, 6-dimetil-aminopurina, requerimiento de L-metionina, opcionalmente requerimiento parcial y compensable de L-isoleucina, requerimiento de ácido meso-diaminopimélico, auxotrofia con respecto a dipéptidos que contienen treonina, resistencia a L-treonina, resistencia a treonina-rafinato, resistencia a L-homoserina, resistencia a L-lisina, resistencia a L-metionina, resistencia al ácido L-glutámico, resistencia a L-aspartato, resistencia a L-leucina, resistencia a L-fenilalanina, resistencia a L-serina, resistencia a L-cisteína, resistencia a L-valina, sensibilidad hacia fluoropiruvato, insuficiencia de treonina-deshidrogenasa, cisteína, resistencia a L-valina, sensibilidad hacia fluoropiruvato, insuficiencia de treonina-deshidrogenasa, opcionalmente capacidad de utilizar sacarosa, sobreexpresión del operón treonina, sobreexpresión de homoserina-deshidrogenasa-I-aspartato-quinasa I, preferiblemente la forma resistente a realimentación, sobreexpresión de homoserina-quinasa, sobreexpresión de treonina-sintasa, sobreexpresión de aspartato-quinasa, opcionalmente la forma resistente a realimentación, sobreexpresión de aspartato-semialdehido-deshidrogenasa, sobreexpresión de fosfoenolpiruvato-carboxilasa, opcionalmente la forma resistente a realimentación, sobreexpresión de fosfoenolpiruvato-sintasa, sobreexpresión de trans-hidrogenasa, sobreexpresión del producto del gen RhtB, sobreexpresión del producto del gen RhtC, sobreexpresión del producto del genYfiK, sobreexpresión de una piruvato-carboxilasa, y atenuación de la formación de ácido acético.
Se ha encontrado que microorganismos de la familia Enterobacteriáceas producen L-aminoácidos seleccionados en particular del grupo L-valina, L-homoserina, E-lisina y L-treonina de una manera mejorada después de sobreexpresión del gen galP.
Las secuencias de nucleótidos de los genes de Escherichia coli forman parte de la técnica anterior y pueden obtenerse de la secuencia del genoma de Escherichia coli publicada por Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997)).
El gen galP se describe, entre otras cosas, por los datos siguientes:
Nombre:
transportador de azúcar, simportador de protones lactosa
Función:
como proteína integral de membrana, simportador de 2-desoxi-D-galactosa y un protón en células
Referencia:
Macpherson et al.; The Journal of Biological Chemistry 258(7): 4390-4396 (1983), Venter et al.; The Biochemical Journal 363 (Pt2) 243-252 (2002)
Número de Acceso:
AE000377
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La galactosa-permeasa en Salmonella typhimurium se describe, entre otros lugares, en las referencias siguientes:
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Postma PW; Journal of Bacteriology 129(2): 630-639 (1977);
Nagelkerke y Postma; Journal of Bacteriology 133(2): 607-613 (1978).
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Las secuencias de ácido nucleico pueden obtenerse del banco de datos en el Centro Nacional de Información de Biotecnología (NCBI) en la National Library of Medicine (Bethesda, MD, EE.UU.), el banco de datos de secuencias de nucleótidos en el Laboratorio de Biología Molecular Europeo (EMBL, Heidelberg, Alemania y Cambridge, Reino Unido) o del banco de datos de DNA de Japón (DDBJ, Mishima, Japón).
En aras de una mayor claridad, la secuencia de nucleótidos del gen galP de Escherichia coli se da como SEQ ID NO: 3 y la secuencia de aminoácidos de la proteína simportadora de protones de galactosa codificada por gen este gen se da como SEQ ID NO: 4.
Los genes descritos en las referencias de bibliografía citadas pueden utilizarse de acuerdo con la invención. Adicionalmente, pueden utilizarse alelos de los genes en los casos en que se producen éstos por degeneración del código genético o por mutaciones de sentido funcionalmente neutras. Se prefiere el uso de genes endógenos.
"Genes endógenos" o "secuencias de nucleótidos endógenas" debe entenderse que son los genes o alelos o secuencias de nucleótidos presentes en la población de una especie.
Entre los alelos que contienen mutaciones de sentido funcionalmente neutras se incluyen aquéllas que conducen a al menos un cambio conservador de aminoácido en la proteína codificada por ellas.
En el caso de aminoácidos aromáticos, se hace referencia a cambios conservadores cuando fenilalanina, triptófano y tirosina se reemplazan entre sí. En el caso de aminoácidos hidrófobos, se hace referencia a cambios conservadores cuando se reemplazan entre sí leucina, isoleucina y valina. En el caso de aminoácidos polares, se hace referencia a cambios conservadores cuando se reemplazan glutamina y asparagina entre sí. En el caso de aminoácidos básicos, se hace referencia a cambios conservadores cuando se reemplazan entre sí arginina, lisina e histidina. En el caso de aminoácidos ácidos, se hace referencia a cambios conservadores cuando se reemplazan entre sí ácido aspártico y ácido glutámico. En el caso de amino-ácidos que contienen grupo(s) hidroxilo, se hace referencia a cambios conservadores cuando se reemplazan entre sí serina y treonina.
Del mismo modo, pueden utilizarse aquellas secuencias de nucleótidos que codifican variantes de las proteínas mencionadas que, adicionalmente, están alargadas o acortadas en el terminal N o C por al menos un (1) aminoácido. Esta extensión o reducción asciende a no más de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 ó 2 aminoácidos o agrupaciones de aminoácidos.
Con objeto de producir una sobreexpresión, puede incrementarse, por ejemplo, el número de copias de los genes correspondientes o pueden mutarse el promotor y la región reguladora o el sitio de fijación de ribosoma que está localizado aguas arriba del gen estructural. Las casetes de expresión que se incorporan aguas arriba del gen estructural actúan de igual modo. Como los promotores que pueden utilizarse se incluyen, entre otros, promotores de los operones lactosa y triptófano de Escherichia coli que se conocen bajo los nombres de promotores lac y trp. Un promotor híbrido que está contenido dentro de la región -10 del promotor lac y la región -35 del promotor trp es el promotor tac (DeBoer et al.; Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America 80: 21-25 (1983)). Otros promotores que pueden utilizarse son el promotor dirigido a la izquierda P_{L} de los bacteriófagos lambda y promotores de los fagos T7, que interaccionan con un represor, como lo hacen también los promotores lac, trp y tac ya mencionados, en donde los genes clonados en la transcripción pueden estar activados o desactivados específicamente. Por utilización de promotores inducibles, es también posible aumentar la expresión durante el curso de la producción de L-treonina por fermentación. La expresión se mejora también por medidas para prolongar la vida útil del m-RNA. Adicionalmente, la actividad enzimática se incrementa también por prevención de la degradación de la proteína enzimática. Los genes o constructos de genes pueden, o bien estar presentes en plásmidos con números de copias diferentes, o estar integrados y amplificados en el cromosoma. Alternativamente, además, la sobreexpresión de los genes relevantes puede conseguirse por modificación de la composición del medio y tratamiento del cultivo.
Una persona experta en la técnica puede encontrar instrucciones para esto, entre otros lugares, en Chang and Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), en Hartley and Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), en Amann and Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), en de Broer et al. (Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America 80: 21-25 (1983)), en LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11: 187-193 (1993)), en WO98/04715, en Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), en Quandt and Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), en Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), en Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)) y en libros de texto muy conocidos sobre genética y biología molecular.
Pueden utilizarse vectores de plásmido que se pueden replicar en Enterobacteriáceas, tales como p.ej. vectores de clonación derivados de pACYC184 (Bartolomé et al.; gen 102: 75-78 (1991), pTrc99A (Amann et al.; gen 69: 301-315 (1988)) o derivados de pSC101 (Vocke and Bastia; Proceedings of The National Academy of Sciences EE.UU. 80(21): 6557-6561 (1983)). En un proceso de acuerdo con la invención, puede utilizarse una cepa transformada con un vector plasmídico, en la cual el vector plasmídico contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el gen galP.
Debe entenderse que la expresión transformación es la aceptación de un ácido nucleico aislado por un hospedador (microorganismo).
Es también posible convertir mutaciones que afectan a la expresión del gen particular por cambio de secuencia (Hamilton et al.; Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), conjugación o transducción en cepas diferentes.
Explicaciones más detalladas de los conceptos utilizados en genética y biología molecular pueden encontrarse en libros de texto muy conocidos de genética y biología molecular, tales como por ejemplo el libro de texto de Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4ª edición, Springer Verlag, Nueva York (EE.UU.), 2000) o el libro de texto de Berg, Tymoczko y Stryer (Biochemistry, 5ª edición, Freeman and Company, Nueva York (EE.UU.) 2002) o el manual de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Serie de 3 Volúmenes), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EE.UU.), 2001).
Adicionalmente, para la producción de L-aminoácidos seleccionados del grupo L-valina, L-homoserina, L-lisina y L-treonina puede ser ventajoso utilizar cepas de la familia Enterobacteriáceas, además de sobreexpresar el gen galP, para sobreexpresar una o más enzimas en el camino bien conocido de la biosíntesis de la treonina o enzimas del metabolismo anoplerótico o enzimas para la producción de nicotinamina-adenina-dinucleótido-fosfato reducido o enzimas de glicólisis o enzimas PTS o enzimas del metabolismo del azufre. Generalmente se prefiere el uso de genes endógenos.
Así, por ejemplo, pueden sobreexpresarse simultáneamente uno o más genes seleccionados del grupo
\bullet
el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa (US-A-4.278.765),
\bullet
el gen pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato-carboxilasa (WO 99/18228),
\bullet
el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato-sintasa (Molecular and General Genetics 231(2): 332-336 (1992)),
\bullet
el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato-carboxilasa (Gene 31: 279-283 (1984)),
\bullet
los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
\bullet
el gen rhtB que imparte resistencia a la homoserina (EP-A-0 994 190),
\bullet
el gen mqo que codifica malato:quinona-oxidorreductasa (WO 02/06459),
\bullet
el gen rhtC que imparte resistencia a la treonina (EP-A-1 013 765),
\bullet
el gen thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína exportadora de treonina (WO 01/ 92545),
\bullet
el gen gdhA que codifica glutamato-deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); gen 23: 199-209 (1983)),
\bullet
el gen glk que codifica glucoquinasa (Journal of Bacteriology 179: 1298-1306 (1997),
\bullet
el gen hns que codifica la proteína de fijación de DNA HLP-II (WO 03/004671),
\bullet
el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa (WO 03/004598),
\bullet
el gen fba que codifica fructosa-bisfosfato-aldolasa WO 03/004664),
\bullet
el gen ptsH del operón ptsHIcrr que codifica la proteína fosfohistidina hexosa-fosfotransferasa en el sistema de fosfotransferasa PTS (WO 03/004674),
\bullet
el gen ptsI del operón ptsHIcrr que codifica la enzima I en el sistema de fosfotransferasa PTS (WO 03/004674),
\bullet
el gen crr del operón ptsHIcrr que codifica el componente específico de glucosa IIA en el sistema de fosfotransferasa PTS (WO 03/004674),
\bullet
el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa (WO 03/004670),
\bullet
el gen lrp que codifica el regulador en el regulón leucina (WO 03/004665),
\bullet
el gen csrA que codifica el regulador global Csr (Journal of Bacteriology 175: 4744-4755 (1993),
\bullet
el gen fadR que codifica el regulador en el regulón fad (Nucleic Acids Research 16: 7995-8009 (1988)),
\bullet
el gen ic1R que codifica el regulador en el metabolismo intermedio central (Journal of Bacteriology 172: 2642-2649 (1990)),
\bullet
el gen mopB que codifica la chaperona de 10 KDa (WO 03/004669), que se conoce también con el nombre groES,
\bullet
el gen ahpC del operón ahpCF que codifica la subunidad pequeña de alquil-hidroperóxido-reductasa (WO 03/004663),
\bullet
el gen ahpF del operón ahpCF que codifica la subunidad grande de alquil-hidroperóxido-reductasa (WO 03/004663),
\bullet
el gen cysK que codifica la cisteína-sintasa A (WO 03/006666),
\bullet
el gen cysB que codifica el regulador en el regulón cys (WO 03/006666),
\bullet
el gen cysJ del operón cysJIH que codifica la flavoproteína en NADPH sulfito-reductasa (WO 03/006666),
\bullet
el gen cysI del operón cysJIH que codifica la hemoproteína en NADPH sulfito-reductasa (WO 03/006666),
\bullet
el gen cysH del operón cysJIH que codifica adenilil-sulfato-reductasa (WO 03/006666),
\bullet
el gen phoB del operón phoBR que codifica el regulador positivo PhoB en el pho regulón (WO 03/008606),
\bullet
el gen phoR del operón phoBR que codifica la proteína sensora en el regulón pho (WO 03/008606),
\bullet
el gen phoE que codifica la proteína E en la membrana celular exterior (WO 03/008608),
\bullet
el gen pykF que codifica la piruvato-quinasa I estimulada por fructosa (WO 03/008609),
\bullet
el gen pfkB que codifica 6-fosfofructoquinasa II (WO 03/008610),
\bullet
el gen malE que codifica la proteína de fijación periplasmática en el transporte de maltosa (WO 03/008605),
\bullet
el gen sodA que codifica superoxidodismutasa (WO 03/008613),
\bullet
el gen rseA del operón rseABC que codifica una proteína de membrana con actividad anti-sigmaE (WO 03/008612),
\bullet
el gen rseC del operón rseABC que codifica un regulador global en el factor sigmaE (WO 03/008612),
\bullet
el gen sucA del operón sucABCD que codifica la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato-deshidro-genasa (WO 03/008614),
\bullet
el gen sucB del operón sucABCD que codifica la subunidad dihidrolipoiltranssuccinasa E2 de 2-ceto-glutarato-deshidrogenasa (WO 03/008614),
\bullet
el gen sucC del operón sucABCD que codifica la subunidad \beta de succinil-CoA sintetasa (WO 03/008615),
\bullet
el gen sucD del operón sucABCD que codifica la subunidad \alpha en succinil-CoA sintetasa (WO 03/008615),
\bullet
el gen adk que codifica adenilato-quinasa (Nucleic Acids Research 13(19): 7139-7151 (1985)),
\bullet
el gen hdeA que codifica una proteína periplasmática con una función semejante a chaperonina (Journal of Bacteriology 175(23): 7747-7748 (1993)),
\bullet
el gen hdeB que codifica una proteína periplasmática con una función semejante a chaperonina (Journal of Bacteriology 175(23): 7747-7748 (1993)),
\bullet
el gen icd que codifica isocitrato-deshidrogenasa (Journal of Biological Chemistry 262(22): 10422-10425 (1987)),
\bullet
el gen mglB que codifica la proteína de transporte periplasmática fijadora de galactosa (Molecular and General Genetics 229 (3): 453-459 (1991)),
\bullet
el gen lpd que codifica la dihidrolipoamida-deshidrogenasa (European Journal of Biochemistry 135(3): 519-527 (1983)),
\bullet
el gen aceE que codifica el componente E1 del complejo piruvato-deshidrogenasa (European Journal of Biochemistry 133(1): 155-162 (1983)),
\bullet
el gen aceF que codifica el componente E2 del complejo piruvato-deshidrogenasa (European Journal of Biochemistry 133(3): 481-489 (1983)),
\bullet
el gen pepB que codifica la aminopeptidasa B (Journal of Fermentation and Bioengineering 82: 392-397 (1996)),
\bullet
el gen aldH que codifica la aldehído-deshidrogenasa (E.C. 1.2.1.3) (Gene 99(1): 15-23 (1991)),
\bullet
el gen bfr que codifica la homoproteína de almacenamiento de hierro \bullet (bacterioferritina) (Journal of Bacteriology 171(7): 3940-3947 (1989)),
\bullet
el gen udp que codifica la uridina-fosforilasa (Nucleic Acids Research 17(16): 6741 (1989)) y
\bullet
el gen rseB que codifica el regulador de la actividad del factor sigmaE (Molecular Microbiology 24(2): 355-371 (1997)).
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la producción de los L-aminoácidos arriba mencionados, además de la sobreexpresión del gen galP, atenuar, en particular interrumpir o reducir la expresión de uno o más de los genes seleccionados del grupo
\bullet
el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa (Journal of Bacteriology 169: 4716-4721 (1987)),
\bullet
el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149: 36-42 (1987)),
\bullet
el producto del gen del marco de lectura abierto (ORF) yjfA (Número de Acceso AAC77180 en el National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA, WO 02/29080),
\bullet
el producto del gen del marco de lectura abierto (ORF) ytfP \bullet (Número de Acceso AAC77179 en el National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA, WO 02/29080),
\bullet
el gen pckA que codifica la enzima fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (WO 02/29080),
\bullet
el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa (WO 02/36797),
\bullet
el gen aceA que codifica la enzima isocitrato-liasa (WO 02/081722),
\bullet
el gen dgsA que codifica el regulador DgsA en el sistema de fosfotransferasa (WO 02/081721), que se conoce también con el nombre de gen mlc,
\bullet
el gen fruR que codifica el represor fructosa (WO 02/081698), que se conoce también con el nombre de gen cra,
\bullet
el gen rpoS que codifica el Factor sigma^{38} (WO 01/05939), que se conoce también con el nombre de gen katF,
\bullet
el gen aspA que codifica aspartato-amonio-liasa (WO 03/008603) y
\bullet
el gen aceB que codifica malato-sintasa A (WO 03/008603).
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión "atenuación", en este contexto, describe la reducción en o la interrupción de la actividad o concentración intracelular de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo, siendo codificadas éstas por el DNA correspondiente, utilizando, por ejemplo, un promotor débil gen o un gen o alelo que codifica una enzima o proteína correspondiente con una menor actividad o desactivando la enzima o proteína gen o el gen correspondiente, y opcionalmente por combinación de estas medidas.
Debido a la medida de atenuación, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se reduce por regla general hasta 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5% de la actividad o concentración de la proteína de tipo salvaje en el microorganismo de partida.
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácidos, en particular L-treonina, además de sobreexpresar el gen galP, interrumpir reacciones secundarias no deseadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", en: Overproduction The Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (compiladores), Academy Press, Londres, Reino Unido, 1982).
Los microorganismos producidos de acuerdo con la invención pueden cultivarse en un proceso de lotes, en un proceso de lotes alimentado o en un proceso de lotes alimentado repetido. Un sumario de métodos de cultivo conocidos se da en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto por Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a utilizar debe satisfacer las demandas de la cepa particular de una manera apropiada. Descripciones de medios de cultivo para diferentes microorganismos se dan en el manual: "Manual of Methods for General Bacteriology" por la American Society for Bacteriology (Washington, D.C., EE.UU., 1981).
Fuentes adecuadas de carbono que pueden utilizarse son azúcares y carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y opcionalmente celulosa, aceites y grasas tales como v.g. aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete, y grasa de coco, ácidos grasos tales como v.g. ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como v.g. glicerina y etanol y ácidos orgánicos tales como v.g. ácido acético. Estas sustancias pueden utilizarse por separado o en forma de mezclas.
Fuentes de nitrógeno que pueden utilizarse son compuestos orgánicos nitrogenados tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de maceración de maíz, harina de soja y urea o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse por separado o en forma de mezclas.
Fuentes de fósforo que pueden utilizarse son ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato dipotásico o las sales correspondientes que contienen sodio. El medio de cultivo debe contener también sales de metales tales como v.g. sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, pueden utilizarse también sustancias esenciales para el crecimiento tales como aminoácidos y vitaminas además de las sustancias arriba mencionadas. Precursores adecuados pueden añadirse también al medio de cultivo. Los materiales de alimentación arriba mencionados pueden añadirse al cultivo en la forma de una mezcla simple o pueden alimentarse durante el cultivo de manera apropiada.
La fermentación se realiza generalmente a un pH de 5,5 a 9,0, en particular 6,0 a 8,0. Compuestos básicos tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco y agua amoniacal o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico se utilizan de manera apropiada para controlar el pH. Pueden utilizarse agentes antiespumantes tales v.g. poliglicolésteres de ácidos grasos para controlar la formación de espuma. Sustancias que actúan de una manera selectiva, tales como v.g. antibióticos, pueden añadirse al medio para mantener la estabilidad de los plásmidos. Con objeto de mantener condiciones aerobias, se introducen en el cultivo oxígeno o gases que contienen oxígeno, tales como v.g. aire. La temperatura del cultivo es normalmente 25ºC a 45ºC y preferiblemente 30ºC a 40ºC. El cultivo se continúa hasta que se ha producido un máximo de L-aminoácidos o L-treonina. Este objetivo se alcanza normalmente en el transcurso de 10 horas a 160 horas. El análisis de L-aminoácidos puede realizarse por cromatografía de intercambio de aniones seguida por derivación con ninhidrina, como se describe en Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)), o puede realizarse por HPLC en fase inversa, como se describe en Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).
El proceso de acuerdo con la invención se utiliza para la producción por fermentación de L-aminoácidos tales como, por ejemplo, L-treonina, L-isoleucina, L-valina, L-metionina, L-homoserina y L-lisina, en particular L-treonina.
La presente invención se explica con mayor detalle a continuación, utilizando ejemplos prácticos.
El medio mínimo (M9) y el medio completo (LB) para Escherichia coli han sido descritos por J.H. Miller (A short course in bacterial genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press). El aislamiento de DNA plasmídico a partir de Escherichia coli y todas las técnicas relativas a restricción, ligación, y tratamientos con Klenow y fosfatasa alcalina se realizan como ha sido descrito por Sambrook et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). La transformación de Escherichia coli se realiza, a no ser que se indique otra cosa, como ha sido descrito por Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 2172-2175 (1989)).
La temperatura de incubación durante la producción de cepas y transformantes es 37ºC.
Ejemplo 1 Construcción del plásmido de expresión pTrc99AgalP
El gen galP de E. coli K12 se amplifica utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la secuencia de nucleótidos del gen galP en E. coli K12 MG1655 (Número de Acceso AE000377, Blattner et al. (Science 277: 1453-1474 (1997)), se sintetizan iniciadores PCR. (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania). Las secuencias del iniciador se modifican a fin de que se produzcan sitios de reconocimiento para enzimas de restricción. Se selecciona la secuencia de reconocimiento para XbaI para el iniciador galP1 y se selecciona el sitio de reconocimiento para HindIII para el iniciador galP2, indicándose éstos por subrayado en las secuencias de nucleótidos que se muestran a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655 utilizado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando "Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA de tamaño aproximado 1450 pb puede amplificarse con los iniciadores específicos en condiciones PCR estándar (Innis et al., (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) utilizando Vent DNA-polimerasa (New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Alemania) (SEQ ID No. 3).
El fragmento galP amplificado se escinde con las enzimas XbaI y HindIII y se liga con el vector pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) que ha sido digerido con las enzimas XbaI y HindIII. La cepa de E. coli TOP 10 One Shot® (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Países Bajos) se transforma con la mezcla de ligación y las células que contienen plásmido se seleccionan en agar LB que se ha tratado con 50 \mug/ml de ampicilina. La clonación con éxito puede detectarse después del aislamiento del DNA plasmídico por escisión de prueba con las enzimas XbaI, HindIII y EcoRV. El plásmido se denomina pTrc99AgalP (Figura 1).
Ejemplo 2 Producción de L-treonina con la cepa MG442/pTrc99AgalP
La cepa de E. coli MG442 productora de L-treonina se describe en la memoria descriptiva de patente US-A-4.278.765 y está depositada en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, Moscú, Rusia) como CMIM B-1628.
La cepa MG442 se transforma con el plásmido de expresión pTrc99AgalP descrito en el Ejemplo 1 y con el vector pTrc99A, y las células que contienen plásmido se seleccionan en agar LB con 50 \mug/ml de ampicilina. La transformación con éxito puede confirmarse después del aislamiento del DNA plasmídico por escisiones de prueba con las enzimas HincII, BamHI y KpnI. De este modo se producen las cepas MG442/pTrc99AgalP y MG442/pTrc99A. Las colonias individuales seleccionadas se multiplican luego nuevamente en medio mínimo con la composición siguiente: 3,5 g/l Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O, 1,5 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l NH_{4}Cl, 0,1 g/l MgSO_{4}*7H_{2}O, 2 g/l glucosa, 20 g/l agar, 50 mg/l ampicilina. La producción de L-treonina se comprueba en cultivos de lotes de 10 ml que se ponen en matraces Erlenmeyer de 100 ml. Se añaden a éstos 10 ml de medio de precultivo con la composición siguiente: 2 g/l extracto de levadura, 10 g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l ampicilina, se inocula y se incuba durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en un incubador ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza). Se inoculan luego 250 \mul de cada uno de estos precultivos en 10 ml de medio de producción (25 g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}*7H_{2}O, 0,018 g/l MnSO_{4}*1H_{2}O, 30 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l ampicilina) y se incuba durante 48 horas a 37ºC. La producción de L-treonina por la cepa de partida MG442 se comprueba del mismo modo; sin embargo, en este caso no se añade cantidad alguna de ampicilina al medio. Después de la incubación, se determina la densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo a una longitud de onda de medida de 660 nm utilizando un fotómetro LP2W de Dr. Lange Co. (Düsseldorf, Alemania).
Finalmente, se determina la concentración de L-treonina producida en el líquido sobrenadante de cultivo estéril filtrado utilizando un analizador de aminoácidos de Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por medio de cromatografía de intercambio iónico y reacción post-columna con detección por ninhidrina.
La Tabla 1 da los resultados de la prueba.
TABLA 1
3
Breve descripción de la figura
Figura 1: Mapa del plásmido pTrc99AgalP que contienen el gen galP.
Los datos relativos a longitudes deben considerarse como datos aproximados. Las abreviaturas y nombres utilizados se definen como sigue:
\bullet
gen Amp: Gen de resistencia a ampicilina
\bullet
lacI: Gen para la proteína represora en los promotores trc
\bullet
Ptrc: Región del promotor trc, inducible por IPTG
\bullet
galP: Región codificante de los genes galP
\bullet
5S: Región de rRNA 5S
\bullet
rrnBT: Región terminadora de rRNA
\vskip1.000000\baselineskip
Las abreviaturas para las enzimas de restricción se definen como sigue:
\bullet
BamHI: Endonucleasa de restricción de Bacillus amyloliquefaciens H
\bullet
EcoRV: Endonucleasa de restricción de Escherichia coli B946
\bullet
HincII: Endonucleasa de restricción de Haemophilus influence R_{c}
\bullet
HindIII: Endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae'
\bullet
KpnI: Endonucleasa de restricción de Klebsiella pneumoniae
\bullet
XbaI: Endonucleasa de restricción de Xanthomonas badrii (ATTC 11672)
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para la producción de L-aminoácidos que utiliza cepas de la familia Enterobacteriáceas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 020481 ST
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version. 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> galP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacaatctag ataaaccata ttggagggca tc 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> galP2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaggaagc ttggggagat taatc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1446
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Fragmento de DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1446)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Producto de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(1427)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región codificante de galP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 464
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
6
7

Claims (71)

1. Un proceso para la producción de L-aminoácidos seleccionados del grupo L-treonina, L-valina, L-homoserina y L-lisina, que comprende:
a)
fermentación de microorganismos del género Escherichia que producen ya los aminoácidos deseados y en los cuales se sobreexpresan el gen galP o secuencias de nucleótidos que codifican el producto génico simportador de protones de galactosa, donde sobreexpresión describe la actividad o concentración intracelular incrementada de dicho producto génico con relación a la actividad o concentración de dicho producto génico en el microorganismo de partida, por lo cual el sistema de transporte de fosfotransferasa (PTS) en dichos microorganismos no está desactivado en comparación con la célula PTS de tipo salvaje correspondiente,
b)
acumulación del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos, y
c)
aislamiento del L-aminoácido deseado, en donde algo o la totalidad (\geq0 a 100%) de la biomasa permanece en el producto.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la sobreexpresión del o de los polinucleótidos que codifica(n) el producto del gen galP se consigue por aumento del número de copias de dicho gen.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual se fermentan microorganismos en los cuales se sobreexpresan además simultáneamente uno o más genes seleccionados del grupo indicado a continuación:
3.1
el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa,
3.2
el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa,
3.3
el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato-sintasa,
3.4
el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato-carboxilasa,
3.5
los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa,
3.6
el gen rhtB que imparte a la homoserina resistencia,
3.7
el gen mqo que codifica malato:quinona-oxidorreductasa,
3.8
el gen rhtC que imparte resistencia a la treonina,
3.9
el gen thrE que codifica la proteína de exportación de treonina,
3.10
el gen gdhA que codifica glutamato-deshidrogenasa,
3.11
el gen glk que codifica glucoquinasa,
3.12
el gen hns que codifica la proteína de fijación de DNA HLP-II,
3.13
el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa,
3.14
el gen fba que codifica fructosa-bisfosfato-aldolasa,
3.15
el gen ptsH que codifica la proteína fosfohistidina hexosa-fosfotransferasa,
3.16
el gen ptsI que codifica la enzima I en el sistema de fosfotransferasa,
3.17
el gen crr que codifica el componente IIA específico de glucosa,
3.18
el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa,
3.19
el gen lrp que codifica el regulador en el regulón leucina,
3.20
el gen csrA que codifica el regulador global Csr,
3.21
el gen fadR que codifica el regulador en el regulón fad,
\hskip0,4cm3.22 \hskip0,22cm el gen iclR que codifica el regulador en el metabolismo intermedio central,
3.23
el gen mopB que codifica la chaperona de 10 KDa,
3.24
el gen ahpC que codifica la subunidad pequeña de alquil-hidroperóxido-reductasa,
3.25
el gen ahpF que codifica la subunidad grande de alquil-hidroperóxido-reductasa,
3.26
el gen cysK que codifica la cisteína-sintasa A,
3.27
el gen cysB que codifica el regulador en el regulón cys,
3.28
el gen cysJ que codifica la flavoproteína en la NADPH sulfito-reductasa,
3.29
el gen cysI que codifica hemoproteína en la NADPH sulfito-reductasa,
3.30
el gen cysH que codifica adenililsulfato-reductasa
3.31
el gen phoB que codifica el regulador positivo PhoB en el regulón pho,
3.32
el gen phoR que codifica la proteína sensora en el regulón pho,
3.33
el gen phoE que codifica la proteína E en la membrana celular exterior,
3.34
el gen pykF que codifica la piruvato-quinasa I estimulada por fructosa,
3.35
el gen pfkB que codifica 6-fosfofructoquinasa II,
3.36
el gen malE que codifica la proteína de fijación periplasmática en el transporte de maltosa,
3.37
el gen sodA que codifica superoxidodismutasa,
3.38
el gen rseA que codifica una proteína de membrana con actividad anti-sigmaE,
3.39
el gen rseC que codifica un regulador global en el factor sigmaE,
3.40
el gen sucA que codifica la subunidad descarboxilasa de la 2-cetoglutarato deshidrogenasa,
3.41
el gen sucB que codifica la subunidad dihidrolipoiltranssuccinasa E2 de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa,
3.42
el gen sucC que codifica la subunidad \beta de succinil-CoA-sintetasa,
3.43
el gen sucD gen que codifica la subunidad \alpha en succinil-CoA-sintetasa,
3.44
el gen adk que codifica adenilato-quinasa,
3.45
el gen hdeA que codifica una proteína periplasmática con una función semejante a chaperonina,
3.46
el gen hdeB que codifica una proteína con una función semejante a chaperonina,
3.47
el gen icd que codifica isocitrato-deshidrogenasa,
3.48
el gen mglB que codifica una proteína de transporte periplasmática fijadora de galactosa,
3.49
el gen lpd que codifica dihidrolipoamida-deshidrogenasa,
3.50
el gen aceE que codifica el componente E1 del complejo piruvato-dehidrogenasa,
3.51
el gen aceF que codifica el componente E2 del complejo piruvato-dehidrogenasa,
3.52
el gen pepB que codifica aminopeptidasa B,
3.53
el gen aldH que codifica la aldehído-deshidrogenasa,
3.54
el gen bfr que codifica la homoproteína de almacenamiento de hierro,
3.55
el gen udp que codifica la uridina-fosforilasa y
3.56
el gen rseB que codifica el regulador de actividad del factor sigmaE.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se fermentan microorganismos, en los cuales, adicionalmente, se atenúan uno o más de los genes seleccionados del grupo indicado a continuación, en particular se desactivan o cuya expresión se reduce:
4.1
el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa,
4.2
el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa,
4.3
el producto del gen del marco de lectura abierto (ORF) yjfA,
4.4
el producto del gen del marco de lectura abierto (ORF) ytfP,
4.5
el gen pckA que codifica la enzima fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa;
4.6
el gen poxB que codifica la piruvato-oxidasa,
4.7
el gen aceA que codifica la isocitrato-liasa,
4.8
el gen dgsA que codifica el regulador en el sistema de la fosfotransferasa,
4.9
el gen fruR que codifica el represor fructosa,
4.10
el gen rpoS que codifica el Factor sigma^{38},
4.11
el gen aspA que codifica la aspartato-amonio-liasa y
4.12
el gen aceB que codifica el gen de malato-sintasa A.
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