MX2012005751A

MX2012005751A - Evolucion metabolica de cepas de escherichia coli que producen acidos organicos.

Info

Publication number: MX2012005751A
Application number: MX2012005751A
Authority: MX
Inventors: Tammy Grabar; Wei Gong; R Rogers Yocum
Original assignee: Myriant Corp
Priority date: 2009-11-18
Filing date: 2010-11-17
Publication date: 2012-06-19
Also published as: MY158175A; EP2501798B1; US8871489B2; CA2775971C; WO2011123154A3; JP5939986B2; AU2010349739A1; AU2010349739B2; CN102686718B; KR20160079897A; KR101695605B1; WO2011123154A2; US20120202259A1; CN102686718A; EP2501798A2; EP2501798A4; CA2775971A1; ES2644820T3; JP2013511276A; KR20120103645A

Abstract

Esta invención se relaciona con la evolución metabólica de un organismo microbiano previamente optimizado para producir un ácido orgánico, en cantidades comercialmente significativas, bajo condiciones de fermentación, utilizando un azúcar de hexosa como la única fuente de carbono en un medio mineral mínimo; como resultado de esta evolución metabólica, el organismo microbiano adquiere la capacidad de utilizar los azúcares de pentosa derivados de los materiales celulósicos para su crecimiento, mientras que retiene la cinética de crecimiento original, la velocidad de producción del ácido orgánico y la capacidad de utilizar los azúcares de hexosa como una fuente de carbono; esta invención también describe el cambio genético en el microorganismo, que confiere la capacidad de utilizar tanto los azúcares de hexosa como de pentosa de manera simultánea, en la producción de cantidades comercialmente significativas de los ácidos orgánicos.

Description

EVOLUCIÓN METABOLICA DE CEPAS DE ESCHERICHIA COL! QUE PRODUCEN ACIDOS ORGANICOS REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama la prioridad de la Solicitud Provisional de E.U.A. No. de Serie 61/281 ,483, presentada en Noviembre 18 del 2009.

APOYO GUBERNAMENTAL Esta invención se hizo con el apoyo del gobierno de los Estados Unidos bajo un contrato adjudicado del Departamento de Energía de los Estados Unidos, bajo el Número de Adjudicación DE-EE0002878/001. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Un reporte del Departamento de Energía de E.U.A. del 2004, titulado "Productos químicos con valor superior agregado a partir de la biomasa", ha identificado doce productos químicos de bloques de construcción que pueden producirse a partir de materiales de alimentación renovables. Los doce bloques de construcción basados en azúcar son 1 ,4-d ¡ácidos (succínico, fumárico y maleico), ácido 2,5-furan dicarboxílico, ácido 3- hidroxi propiónico, ácido aspártico, ácido glucárico, ácido glutámico, ácido itacónico, ácido levulínico, 3-hidroxibutirolactona, glicerol, sorbitol y xilitol/arabinitol.

Los productos químicos de bloques de construcción son moléculas con grupos funcionales múltiples, que poseen el potencial de transformarse en nuevas familias de moléculas útiles. Estos doce bloques de construcción pueden convertirse posteriormente a varios productos químicos o materiales biobasados de alto valor.

Muchos metabolitos naturales derivados de los procesos de fermentación biológica, tales como ácidos dicarboxílicos, aminoácidos y dioles, tienen grupos funcionales que son adecuados para la polimerización y la síntesis química de los polímeros. En los años recientes, la eficiencia de los microorganismos para producir compuestos químicos monoméricos, adecuados para uso industrial, se ha incrementado de manera significativa a través de las manipulaciones genéticas. Sin embargo, el costo de producir productos químicos industriales a través de un proceso de fermentación biológico, es todavía muy alto. Actualmente, los procesos de fermentación biológica para la producción de productos químicos industriales, utilizan carbohidratos purificados tales como glucosa y almidón de maíz como la fuente de carbono, y por lo tanto, agregan costo al proceso de fermentación para producir productos químicos industriales.

El costo del proceso de fermentación para producir productos químicos industriales puede reducirse dramáticamente utilizando una biomasa lignocelulósica como la fuente de carbono en el proceso de fermentación. La biomasa lignocelulósica puede obtenerse de varias fuentes, incluyendo residuos agrícolas, desechos de procesamiento de alimentos, madera y desechos de la industria del papel y la pulpa. La biomasa consiste de aproximadamente 40-50% de azúcares de hexosa (azúcares con seis átomos de carbono) y 10-30% de azúcares de pentosa (azúcares que tienen cinco átomos de carbono). Los azúcares de hexosa se conocen en la técnica como azúcares de C6. Los azúcares de pentosa son conocidos en la técnica como azúcares de C5. Cuando se hidrolizan, los materiales lignocelulósicos proporcionan una mezcla de azúcares que incluyen glucosa, xilosa, arabinosa, mañosa y galactosa. Sin embargo, varios procesos de fermentación para la producción de productos químicos industriales, se han desarrollado con glucosa pura como una fuente de carbono para su crecimiento y metabolismo. Por ejemplo, la cepa de E. coli descrita en la Patente de E.U.A. No. 7,223,567, utiliza un medio rico suplementado con glucosa como la fuente de carbono. La cepa de E. coli KJ122 útil para la producción de ácido succínico descrita por Jantama et al (2008a; 2008b) y en las Solicitudes de Patente del PCT publicadas Nos. WO/2008/021141A2 y WO20 0/1 15067A2, pueden crecer en un medio mínimo, pero requieren todavía de glucosa u otro azúcar como la fuente de carbono. Sería ideal si estos organismos con la capacidad de producir productos químicos industriales con una alta eficiencia, pudieran crecer en una mezcla de azúcares derivadas de la hidrólisis de la lignocelulosa. Los inventores han descubierto un método para permitir que los microorganismos ya optimizados para producir un producto químico industrial de especialidad, utilicen una mezcla de azúcares de C5 y C6 derivadas de la hidrólisis de un material de alimentación lignocelulósico.

La capacidad de los microorganismos para utilizar múltiples azúcares de manera simultánea, está limitada por la existencia de ciertos sistemas reguladores bioquímicos. Estos sistemas reguladores bioquímicos dentro de las células microbianas, tienen una base genética. Se han hecho esfuerzo por superar estos sistemas reguladores a través de manipulaciones genéticas.

En muchos casos, los microorganismos industriales se cultivan en un medio que contiene glucosa o sacarosa como la fuente de carbono. La presencia de glucosa en el medio de cultivo suprime el uso de otros azúcares en E. coli y otras especies de microorganismos industriales. El consumo de otros azúcares, tales como xilosa, un azúcar de pentosa, por estos microorganismos, se inicia únicamente después de que la glucosa en el medio de cultivo se ha consumido completamente. Este fenómeno relacionado con el uso del carbono en los microorganismos industriales se refiere como la represión del catabolito o el crecimiento diauxico. Un método para hacer que los microorganismos coutilicen los diferentes azúcares tales como los azúcares de C5 y C6 a través del alivio de la represión del catabolito durante la producción de productos químicos industriales a escala comercial, sería crítico para disminuir el costo de los productos químicos industriales producidos mediante fermentación.

Los microorganismos captan los azúcares a través de un conjunto de proteínas transportadoras localizadas en la membrana citoplásmica. Los transportadores del azúcar microbianos caen dentro de tres categorías principales. El grupo mayor de transportadores del azúcar en las bacterias se conoce como los transportadores del cásete que se une a ATP (ABC). Como su nombre lo implica, los transportadores ABC requieren una molécula de ATP por cada molécula de azúcar transportada en la célula bacteriana. XylFGH es un transportador ABC para el transporte de la xilosa, un azúcar de pentosa, en la célula. AraFGH es un transportador ABC para el transporte de la arabinosa, aún otra azúcar de pentosa.

El segundo tipo de transportadores del azúcar, bacterianos, se agrupan bajo la Superfamilia del Facilitador Principal (MFS). Dentro de los transportadores del azúcar MFS, se reconocen dos categorías diferentes de transportadores. MFS incluye los simportadores enlazados a H+, los simportadores-antiportadores enlazados a Na+ y los uniportadores. Los uniportadores son facilitadotes simples para el transporte del azúcar, y no requieren una molécula de ATP para cada molécula de azúcar transportada en la célula. La proteína transmembranal Glf en Zymononas mobilis es un ejemplo de un facilitador. Los simportadores H+ requieren un protón extracelular para cada molécula de azúcar transportada hacia la célula. La proteína GalP en E. coli es un simportador para el transporte de la galactosa, un azúcar de hexosa, en la célula. GalP es un simportador muy bien caracterizado con 12 espiras transmembranales. También se reporta que GalP tiene la capacidad de transportar la glucosa a través de la membrana celular. AraE es un simportador enlazado al protón para el transporte de la arabinosa a través de la membrana celular. De manera similar, la proteína XylE es un simportador enlazado al protón para el transporte de la xilosa.

El tercer transportador de azúcar principalmente responsable para la captación de los azúcares de hexosa, tales como glucosa, se conoce como el sistema de fosfoenolpiruvato: carbohidrato fosfotransferasa (PTS). Como una manera de diferenciar a los otros dos sistemas de transporte del azúcar del PTS, los otros dos sistemas de transporte del azúcar (transportadores ABC y miembros de los transportadores MFS), son referidos como transportadores de azúcar que no son de PTS. La transferencia del grupo fosforilo del fosfoenolpiruvato (PEP) catalizado por PTS, acciona el transporte y fosforilación de la glucosa y otros azúcares, y resulta en la formación de azúcares fosforiladas y de ácido pirúvico dentro de la célula. El ácido pirúvico generado por PTS es aparentemente no reciclado a PEP bajo condiciones de cultivo aeróbico, en donde la glucosa es la única fuente de carbono. En su lugar, el piruvato se oxida por medio del ciclo del ácido tricarboxílico a dióxido de carbono. Así, para el transporte de cada molécula única de glucosa, se consume una molécula de PEP. En términos de bioenergética celular, el transporte de los azúcares a través del PTS es un proceso que consume mucha energía. Por lo tanto, en las células que crecen de manera anaeróbica, en donde existe la necesidad de conservar el contenido de fosfoenolpiruvato dentro de las células para la producción de productos químicos industrialmente útiles, es deseable reemplazar el PTS con otros transportadores de azúcar que no son de PTS que no requieran una molécula de PEP por cada molécula de azúcar transportada hacia la célula.

El PTS está comprendido de dos componentes citoplásmicos nombrados E1 y HPr, y un componente unido a la membrana Ell. E. coli contiene al menos 15 diferentes complejos de Ell. Cada componente de Ell es específico para un tipo de azúcar a ser transportado, y contiene dos dominios de la membrana integral hidrofóbicos (C y D) y dos dominios hidrofílicos (A y B). Estos cuatro dominios juntos, son responsables del transporte y fosforilación de las moléculas de azúcar. La proteína transfiere el grupo fosfato de PEP a la proteína HPr. La proteína Ell transfiere el grupo fosfato de la proteína HPr fosforilada a la molécula de azúcar.

El se codifica por el gen ptsl. HPr se codifica por el gen ptsH. El complejo Ell específico de la glucosa de las bacterias entérica consiste de dos proteínas distintas, a saber, EIIAG|C codificada por el gen crr y la proteína asociada con la membrana EIICBG|C codificada por el gen ptsG. El transporte del azúcar mediado por PTS puede inhibirse por medio de la mutación de uno de estos genes que codifican las proteínas asociadas con el PTS. El reemplazo funcional del PTS por la captación independiente del fosfoenolpiruvato y las actividades de fosforilación (que no son PTS) alternas, resultaron en mejoras significativas en el rendimiento del producto de la glucosa y la productividad para varias clases de metabolitos.

Con la disminución en la captación de glucosa mediada por PTS, otros sistemas para la captación de glucosa pueden activarse para asegurar la disponibilidad continua de glucosa dentro de la célula, para la producción de productos industrialmente útiles. Por ejemplo, el gen g/ que codifica para la glucosa permeasa, un uniportador de glucosa, ha mostrado sustituir la pérdida de la captación de la glucosa mediada por PTS. De manera similar, se reporta que la sobreexpresión de los genes galP y glk mejoran la captación de la glucosa y la fosforilación en la cepa pts' de E. coli. GalP es un simportador para la captación de la galactosa, un azúcar de hexosa. Se ha reportado que GalP transporta la glucosa en la cepa pts'. El significado de la captación de la glucosa mediada por GalP se evidencia por el hecho de que se encuentra que la inactivación del gen galP en el muíante pts' evita el crecimiento en la glucosa (Yi et al., 2003). En la ausencia de un PTS, Glk es necesaria para lograr la fosforilación de la molécula de glucosa antes de que pueda entrar en la glicólisis. La expresión de la proteína GalP en una cepa pts' puede lograrse expresando el gen galP bajo un promotor constitutivo o por medio de aliviar la represión de la expresión del gen galP a través de mutaciones en los genes que codifican el represor del gen galP, tal como galS y galR.

Además de reducir el costo de la energía incurrido en el transporte de los azúcares en las células, la introducción de una mutación en un gen que codifica una proteína asociada con PTS, se espera que alivie la represión del catabolito, que a su vez, permitiría el transporte y la utilización simultáneos de todos los azúcares presentes en el medio de cultivo, incluyendo los azúcares de pentosa y hexosa. Hernandez-Montalvo er al (2001 ), estudiaron el uso de una mezcla de azúcares que comprende glucosa, arabinosa y xilosa por una cepa de E. coli desprovista de PTS para el transporte de la glucosa. El mutante pts' fue capaz de captar azúcares mediante un mecanismo que no es de PTS tan rápidamente como su cepa original del tipo silvestre. En los cultivos que crecen en medio mínimo suplementado con mezclas de glucosa-xilosa o glucosa-arabinosa, la glucosa reprimió la utilización de la arabinosa o la xilosa en la cepa del tipo silvestre. Bajo las mismas condiciones de cultivo, el mutante pts' cometabolizó la glucosa y la arabinosa. Sin embargo, la glucosa ejercerá un efecto represor parcial en el consumo de la xilosa. En los cultivos que crecen con una mezcla triple de glucosa-arabinosa-xilosa, la cepa del tipo silvestre utilizó de manera secuencial a la glucosa, arabinosa y finalmente la xilosa. En contraste, la cepa pts' cometabolizó a la glucosa y la arabinosa, mientras que la xilosa se utilizó después del empobrecimiento de glucosa-arabinosa. Como resultado de un cometabolismo de la glucosa-arabinosa, la cepa pts' consumió la cantidad total de azúcares contenidas en el medio de cultivo, 16% más rápido que la cepa del tipo silvestre.

Una cepa mutante pts' con la capacidad de cometabolizar la glucosa y la xilosa, causaría además un incremento en la velocidad del consumo del azúcar en el medio, conduciendo a un incremento en la productividad. Así, existe la necesidad en la técnica por un microorganismo que pueda cometabolizar la glucosa y la xilosa, puesto que estos dos azúcares representan los azúcares predominantes que están presentes en el hidrolizado celulósico crudo. Además, se ha reportado que la eliminación de la función del gen ptsG podría disminuir la velocidad del crecimiento de los microorganismos diseñados metabólicamente para producir ácidos orgánicos (Sánchez et al., 2005). Por lo tanto, existe una necesidad adicional de lograr la capacidad de utilizar múltiples azúcares de manera simultánea sin comprometer la velocidad de crecimiento y la velocidad de producción de los productos químicos comercialmente importantes e intermediarios químicos.

El objetivo de la presente invención fue desarrollar metabólicamente, metabolismos capaces de producir altos niveles de productos químicos industriales, utilizando múltiples azúcares de manera simultánea, sin reducir la productividad. Los inventores han identificado de manera sorprendente un proceso para hacer microorganismos que consumen de manera simultánea múltiples azúcares a través de la evolución metabólica. Este proceso de la evolución metabólica permite que las células adquieran la capacidad de utilizar múltiples azúcares sin afectar ninguna de sus características originales, tales como el crecimiento rápido y la capacidad de producir productos químicos industriales específicos a cantidades comercialmente significativas.

Los inventores también han identificado una base genética novedosa para la capacidad de los microorganismos de utilizar la glucosa y la xilosa de manera simultánea. El secuenciamiento del genoma completo se utilizó para identificar la modificación genética que confiere a los microorganismos la capacidad de utilizar múltiples azúcares de manera simultánea en la producción del ácido orgánico.

Antes de la presente invención, habría sido dudoso si la capacidad de utilizar tanto los azúcares de hexosa como los azúcares de pentosa de manera simultánea, podría lograrse a través de una simple manipulación genética. La presente invención relacionada con la genética molecular ofrece el potencial de lograr la capacidad de metabolizar de manera eficiente todo el intervalo de azúcares derivadas de la biomasa. Por primera vez, la presente invención proporciona un procedimiento genético para lograr la captación simultánea de glucosa y xilosa que no está acoplada de manera obligatoria al gasto del fosfoenol piruvato.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha descubierto de manera inesperada, que los microorganismos modificados genéticamente y optimizados para producir cantidades comercialmente significativas de ácidos orgánicos a través de un proceso de fermentación, en un medio de cultivo mínimo que contiene glucosa como la fuente de carbono, puede además, desarrollarse metabólicamente para utilizar múltiples azúcares de manera simultánea, como una fuente de carbono, mientras que mantiene la velocidad de producción del ácido orgánico optimizada original.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para conferir a los microorganismos que producen ácido orgánico a través de un proceso de fermentación, la capacidad de utilizar múltiples tipos de moléculas de azúcar de manera simultánea, como una fuente de carbono, para su crecimiento y producción de ácido orgánico. Es otro objeto de la presente invención, proporcionar un proceso de fermentación que produzca altos rendimientos de ácidos orgánicos utilizando un hidrolizado celulósico crudo.

Una característica de la invención es el uso del proceso de evolución metabólica para permitir que los microorganismos modificados genéticamente y optimizados para producir ácidos orgánicos a partir de la glucosa, adquieran la capacidad de utilizar azúcares de hexosa y pentosa de manera simultánea.

En una modalidad de la presente invención, una bacteria de E. coli capaz de producir un ácido orgánico en un medio con glucosa como una fuente de carbono, se desarrolla metabólicamente para utilizar tipos adicionales de azúcar como una fuente de carbono, mientras que mantiene la misma velocidad de producción del ácido orgánico, y retiene la capacidad de utilizar la glucosa como una fuente de carbono.

En una modalidad preferida, la presente invención proporciona una bacteria de E. coli capaz de producir un ácido orgánico, en un medio de cultivo mínimo, utilizando de manera simultánea más de un tipo de azúcar.

En aún otra modalidad preferida, la presente invención proporciona una bacteria de E. coli capaz de producir un ácido orgánico en un medio de cultivo mínimo, utilizando un hidrolizado de planta incluyendo un hidrolizado lignocelulósico como la fuente de carbono.

En aún otra modalidad preferida de la presente invención, se proporciona una bacteria de E. coli que produce ácido succínico, utilizando de manera simultánea glucosa y xilosa.

En aún otra modalidad preferida de la presente invención, se proporciona una bacteria de E. coli que produce ácido succínico en un medio de cultivo mínimo, utilizando un hidrolizado de plantas, incluyendo un hidrolizado lignocelulósico.

La presente invención es especialmente útil para producir ácidos orgánicos altamente purificados, de una manera muy efectiva en costo, a través de un proceso de fermentación biológico, utilizando materiales lignocelulósicos.

En aún otra modalidad, la presente invención proporciona un método para hacer un microorganismo que utiliza múltiples azúcares de manera simultánea, por medio de la mutación de los genes que codifican para las proteínas del transportador que no es PTS, además de reducir la actividad de un gen que codifica una proteína asociada con un transportador del azúcar PTS.

En una modalidad más preferida, se proporciona un microorganismo que tiene un transportador del azúcar PTS con actividad reducida y una forma mutada del simportador de galactosa.

Las ventajas adicionales de esta invención se volverán fácilmente evidentes a partir de la siguiente descripción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Perfil de fermentación para la cepa KJ122 de E. coli en medio de sales minerales suplementado con xilosa al 8%. La fermentación se lleva a cabo para un periodo total de 168 horas. La utilización de la xilosa mostrada en círculos sólidos empezó alrededor de 96 horas, acompañado por un incremento en la densidad de las células bacterianas, medido en términos de un incremento en la densidad óptica a 550 nm mostrado en los círculos abiertos. El incremento en la concentración de succinato mostrado en cuadrados sólidos ocurrió alrededor de las 96 horas. También se muestran en la figura los cambios en la concentración del acetato, piruvato y malato en el medio durante el curso de 168 horas de fermentación.

Figura 2. Perfil de fermentación para la cepa KJ122 de E. coli adaptada para metabolizar la xilosa en un medio mineral suplementado con xilosa al 8%. La fermentación se lleva a cabo durante un periodo total de 168 horas. El uso de la xilosa mostrado en círculos sólidos empezó alrededor de 72 horas, acompañado por un incremento en la densidad de las células bacterianas, medido en términos de un incremento en la densidad óptica a 550 nm mostrado en círculos abiertos. El incremento en la concentración del succinato mostrado en cuadrados sólidos ocurrió alrededor de las 72 horas. También se muestran en la figura los cambios en la concentración del acetato, piruvato y malato en el medio durante el curso de 168 horas de fermentación.

Figura 3. Perfil de fermentación para la cepa TG400 de E. coli en medio mineral suplementado con xilosa al 8%. El perfil de fermentación se verificó durante un periodo de 120 horas. El uso de la xilosa mostrado en círculos sólidos empezó alrededor de 30 horas, acompañado por un incremento en la densidad de las células bacterianas, medido en términos de un incremento en la densidad óptica a 550 nm mostrado en círculos abiertos. El incremento en la concentración del succinato mostrado en cuadrados sólidos ocurrió alrededor de las 30 horas. También se muestran en la figura los cambios en la concentración del acetato, piruvato y malato en el medio durante el curso de 120 horas de fermentación.

Figura 4. Perfil de fermentación del azúcar mezclada por las cepas KJ122 y TG400 de E. coli. La fermentación se verificó durante un periodo total de 144 horas. El medio de fermentación contenía tanto glucosa como xilosa. El uso de la glucosa como se muestra por una disminución en la concentración de la glucosa se muestra por los cuadrados abiertos. El uso de la xilosa como se muestra por una disminución en la concentración de la xilosa se muestra por los círculos sólidos. El incremento en la concentración del succinato en el medio de fermentación se muestra por los cuadrados sólidos. El cambio en la densidad celular medida por la densidad óptica a 550 nm durante el curso de 144 horas de fermentación, se muestra por círculos abiertos. También se muestran en las figuras los cambios en la concentración del acetato, piruvato y malato durante el curso de 144 horas de fermentación.

Figura 5. Perfil de fermentación del hidrolizado de C5 de bagazo concentrado desintoxicado suplementado con licor de maceración de maíz al 2.5% (peso/volumen) por la cepa TG400 de E. coli. La fermentación se llevó a cabo durante un periodo de 168 horas. El uso de la xilosa medido por una disminución en la concentración de xilosa se muestra en los círculos sólidos. El incremento en la concentración de succinato en el medio de fermentación se muestra por cuadrados sólidos. También se muestran en la figura los cambios en la concentración del piruvato, acetato, malato y lactato en el medio durante el curso de 168 horas de fermentación.

Figura 6. Perfil de fermentación de la cepa WG37 de E. coli en un medio que contiene tanto glucosa como xilosa. La fermentación se llevó a cabo durante un periodo de 120 horas. El uso de la glucosa medido por una disminución de la glucosa en el medio, se muestra en cuadrados abiertos. El uso de la xilosa medido por una disminución en la concentración de xilosa en el medio, se muestra en los círculos sólidos. El cambio en la densidad de las células bacterianas medido por la densidad óptica a 550 nm durante el cuerdo de 120 horas de fermentación, se muestra por los círculos abiertos. El incremento en la concentración del succinato se muestra en cuadrados sólidos. También se muestran en la figura los cambios en la concentración del ácido acético, ácido piruvico y ácido málico durante el curso de 120 horas de fermentación.

Figura 7. Comparación lado a lado de la producción de ácido succínico por las cepas TG400, WG37 y KJ122 de bacterias en el medio de cultivo que contiene xilosa al 4% y glucosa al 7%. La fermentación se llevó a cabo durante un periodo de 120 horas. El incremento en la concentración de ácido succínico en el medio de fermentación con las cepas TG400 (círculos sólidos), KJ122 (triángulo sólido) y WG37 (triángulo invertido) de E. coli se verificó durante un periodo de 120 horas.

Figura 8. Comparación lado a lado de la producción de ácido succínico por las cepas TG400, WG37 y KJ122 de bacterias en el medio de cultivo que contiene únicamente xilosa al 10%. La fermentación se llevó a cabo durante un periodo de 120 horas. El incremento en la concentración de ácido succínico en el medio de fermentación con las cepas TG400 (círculos sólidos), KJ122 (triángulo invertido) y WG37 (triángulo) de E. coli se verificó durante un periodo de 120 horas.

Figura 9. Comparación lado a lado de la producción de ácido succínico por las cepas TG400, WG37 y KJ122 de bacterias en el medio de cultivo que contiene únicamente glucosa al 10%. La fermentación se llevó a cabo durante un periodo de 120 horas. El incremento en la concentración de ácido succínico en el medio de fermentación con las cepas TG400 (círculos sólidos), KJ122 (triángulo) y WG37 (triángulo invertido) de E. coli se verificó durante un periodo de 120 horas.

Figura 10. Perfil de crecimiento de las cepas KJ122 y SI014 de E. coli en un medio de cultivo que contiene xilosa como la única fuente de carbono. El crecimiento bacteriano se verificó en términos de la densidad óptica a 600 nm durante un periodo total de 97 horas. La cepa KJ122 (círculos sólidos), mostró sólo un crecimiento muy lento. Por otra parte, la cepa SI014 (cuadrados sólidos), mostró un crecimiento rápido en el transcurso de 27 horas, seguido por una disminución lenta en la densidad celular.

Figura 1 1. Perfil para el uso de la xilosa y producción de succinato por las cepas KJ122 y SI014 de E. coli en un medio que contiene xilosa como la única fuente de carbono. El uso de la xilosa se midió en términos de la disminución en la concentración de la xilosa en el medio durante un periodo de 97 horas, el uso de la xilosa con la cepa SI014 (cuadrados sólidos), fue mucho más rápido cuando se compara con el uso de la xilosa por la cepa KJ122 (círculos sólidos). De manera similar, la producción de ácido succínico con la cepa SI014 (cuadrados abiertos), fue mucho más rápida cuando se comparó con la producción de ácido succínico por la cepa KJ122 (círculos abiertos).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención proporciona un proceso para la producción de ácidos orgánicos, en cantidades comercialmente significativas, de la fermentación de compuestos de carbono, por microorganismos recombinantes. De manera más específica, esta presente invención proporciona los microorganismos adecuados para la producción de ácido orgánico a través de un proceso de fermentación. Los microorganismos de la presente invención poseen la capacidad de utilizar múltiples azúcares en el proceso de fermentación, para la producción de cantidades comercialmente significativas del ácido orgánico.

Se describen en esta presente invención, microorganismos adecuados para la producción de ácido succínico, a través de un proceso de fermentación. Aunque la presente invención proporciona un proceso para la producción de ácido succínico en cantidades comercialmente significativas a partir de compuestos de carbono por cepas bacterianas modificadas genéticamente, las enseñanzas de la presente invención son igualmente aplicables a la producción industrial de varios otros compuestos químicos.

Para el propósito de la descripción de la presente invención, se utilizarán las siguientes definiciones.

Varios compuestos químicos industrialmente útiles pueden fabricarse utilizando la presente invención. Los ejemplos de tales compuestos químicos incluyen, de manera no exclusiva, etanol, butanoles, lactato, succinato, fumarato, malato, treonina, metionina y lisina. Puesto que los ácidos orgánicos pueden existir tanto como ácidos libres y como sales (por ejemplo, de manera no exclusiva, sales de sodio, potasio, magnesio, calcio, amonio cloruro, sulfato, carbonato, bicarbonato, etc.), los nombres químicos tales como ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido aspártico, treonina, metionina y lisina deberán pretender incluir tanto el ácido libre como cualquier sal de los mismos. De igual manera, cualquier sal, tal como succinato, fumarato, malato, aspartato, etc., deberá significar incluir el ácido libre también.

La presente invención combina la técnica de las modificaciones genéticas específicas con el proceso de la evolución metabólica para obtener cepas que muestran un alto rendimiento, título y productividad volumétrica para la producción del ácido succínico bajo condiciones de crecimiento anaeróbicas, en el medio de sales minerales con un sustrato de carbohidratos.

Como se utiliza en la presente invención, el término "título", significa la concentración molar de un compuesto particular en el caldo de fermentación. Así, en el proceso de fermentación para la producción del ácido succínico de acuerdo con la presente invención, un título de ácido succínico de 100 mM significaría que el caldo de fermentación al momento de la medición contenía 100 mMoles de ácido succínico por litro de caldo de fermentación.

Como se utiliza en la presente invención, el término "rendimiento", se refiere a las moles del compuesto particular producidas por mol del material de alimentación consumido durante el proceso de fermentación. Así, en el proceso de fermentación para la producción de ácido succínico utilizando glucosa como el material de alimentación, el término rendimiento se refiere al número de moles de ácido succínico producidas por moles de glucosa consumida.

Como se utiliza en la presente invención, el término "productividad volumétrica", se refiere a la cantidad de un compuesto particular en gramos producidos por volumen unitario por tiempo unitario. Así, un valor de la productividad volumétrica de 0.9 g L'1h'1 para el ácido succínico, significaría que 0.9 gramos de ácido succínico se acumulan en un litro de caldo de fermentación durante una hora de cultivo.

Como se utiliza en la presente invención, el término "gen", incluye el marco de lectura abierto del gen, así como las secuencias reguladoras corriente arriba y corriente abajo. La región reguladora corriente arriba también se refiere como la región promotora del gen. La región reguladora corriente abajo también se refiere como la región de la secuencia terminadora.

La frase "funcionalmente similar" significa ampliamente, cualquier secuencia de ADN del tipo silvestre o mutada, gen, enzima, proteína, de cualquier organismo, que tiene una función biológica que es equivalente o similar a cualquier secuencia de ADN del tipo silvestre o mutada, gen, enzima, proteína que se encuentre en el mismo o en un organismo diferente mediante los métodos descritos en la presente. La similitud funcional no requiere homología de la secuencia. El alelo es uno de dos o más formas de la secuencia de ADN de un gen particular. Cada gen tiene diferentes alelos. Un gen sin alguna mutación se refiere como un alelo del tipo silvestre cuando se compara con un gen correspondiente que tiene una mutación.

Un homólogo es un gen relacionado con un segundo gen por descendencia de una secuencia de ADN de un ancestro común. El término homólogo, puede aplicarse a la relación entre los genes separados por el evento de especiación o a la relación entre los genes separados por el evento de duplicación genética. Los ortólogos son genes en diferentes especies que evolucionaron de un gen ancestral común mediante especiación.

Normalmente, los ortólogos retienen la misma función en el curso de la evolución. La identificación de los ortólogos es crítica para la predicción confiable de la función génica en los genomas secuenciados recientemente. La especiación es el origen de una nueva especie, capaz de sobrevivir de una nueva forma a partir de la especie de la cual surgió. Como parte de este proceso, también ha adquirido alguna barrera al intercambio genético con la especie original. Los parálogos son genes relacionados mediante la duplicación dentro de un genoma. Los ortólogos retienen la misma función en el curso de la evolución, mientras que los parálogos evolucionan a una nueva función, incluso si estos están relacionados con el original.

Un gen o una proteína con "actividad alterada", se define ampliamente como un gen o proteína que produce una diferencia mensurable en una propiedad mensurable, cuando se compara con el gen o proteína del tipo silvestre. La actividad alterada podría manifestarse a sí misma de una manera general, incrementando o disminuyendo la velocidad de crecimiento o la eficiencia de la producción de succinato de la cepa que contiene el gen o proteína alterada. Otras propiedades mensurables incluyen, de manera no exclusiva, la actividad enzimática, especificidad del sustrato de una enzima, parámetros cinéticos de una enzima tales como afinidad por un sustrato o velocidad, estabilidad de una enzima, propiedades reguladoras de una enzima, nivel de expresión del gen, regulación de la expresión del gen bajo varias condiciones, etc.

Como se utiliza en la presente invención, el término mutación, se refiere a modificaciones genéticas hechas al gen, incluyendo el marco de lectura abierto, la región reguladora corriente arriba y la región reguladora corriente abajo. Las mutaciones del gen resultan en una sobrerregulación o una desregulación o una inhibición completa de la transcripción del marco de lectura abierto del gen. Las mutaciones génicas se logran ya sea suprimiendo toda la región codificante del gen o una porción de la secuencia nucleotídica codificante, o introduciendo una mutación del cambio del marco, una mutación con un mal sentido y una inserción, o introduciendo un codón de paro o combinaciones de lo mismo. Las mutaciones pueden ocurrir en los genes estructurales que codifican las proteínas directamente implicadas en las funciones biológicas, tales como las reacciones enzimáticas o el transporte de las moléculas orgánicas a través de la membrana celular. De manera alterna, las mutaciones pueden ocurrir en los genes reguladores que codifican las proteínas que controlan la expresión de los genes que codifican las proteínas implicadas directamente en las funciones biológicas. Las proteínas que controlan la expresión de los otros genes son referidas como proteínas reguladoras, y los genes que codifican estas proteínas reguladoras son referidos como genes reguladores.

"Mutación" deberá incluir también cualquier cambio en la secuencia de ADN con relación a aquella del organismo del tipo silvestre relevante. Por ejemplo, una mutación encontrada en la cepa KJ122 es cualquier cambio en la secuencia del ADN que puede encontrarse cuando la secuencia del ADN de la región mutada se compara con aquella de la cepa de tipo silvestre original, E. coli C, también conocida como ATCC 8739. Una mutación puede ser una inserción de ADN adicional de cualquier número de pares de bases o una supresión de ADN de cualquier número de pares de bases. Un tipo particular de una mutación de inserción es una duplicación génica. Un gen puede duplicarse mediante un evento de mutación espontánea, en el cual la segunda copia del gen puede ubicarse adyacente a la copia original, o un gen puede duplicarse mediante ingeniería genética, en la cual la segunda copia del gen puede localizarse en un sitio en el genoma que está distante de la copia original. Una mutación puede ser un cambio de un tipo de base a otro tipo de base, por ejemplo, un cambio de una adenina a una base de guanina. En la carga de la genética, una mutación puede ser un sentido erróneo (que cambia el aminoácido codificado por un codón), sin sentido (que cambia un codón en un codón de paro), un desplazamiento del marco (que es una inserción o supresión de un número de bases que no es un múltiplo de tres y que cambia el marco de lectura y altera la secuencia de aminoácidos que es codificada corriente abajo de la mutación, e introduce con frecuencia un codón de paro corriente abajo de la mutación), o una inversión (que resulta de una secuencia de ADN que cambia de polaridad, pero no se suprime).

Una "mutación nula" es una mutación que confiere un fenotipo que es sustancialmente idéntico a aquél de una supresión de un marco de lectura abierto completo del gen relevante, o que elimina toda la actividad mensurable del gen relevante.

Un "mutante" es un microorganismo cuyo genoma contiene una o más mutaciones.

Como se utiliza en esta invención, el término "exógeno" pretende significar que una molécula o una actividad derivada del exterior de una célula, se introduce en el organismo microbiano hospedero. En el caso de una molécula de ácido nucleico exógena introducida en la célula microbiana, el ácido nucleico introducido puede existir como un plásmido independiente o puede integrarse en el ADN cromosomal del hospedero. El ácido nucleico exógeno que codifica una proteína puede introducirse en la célula microbiana en una forma expresable, con sus propias secuencias reguladoras, tales como las secuencias promotoras y terminadoras. De manera alterna, la molécula del ácido nucleico exógeno puede integrarse en el ADN cromosomal del hospedero, y puede estar bajo el control de las secuencias reguladoras hospederas.

El término "endógeno" se refiere a las moléculas y actividad que están presentes dentro de la célula hospedera. Cuando se utiliza con referencia a una actividad biosintética, el término "exógeno" se refiere a una actividad que se introduce en el organismo de referencia hospedero. La fuente puede ser, por ejemplo, un homólogo o heterólogo que codifica un ácido nucleico que expresa la actividad referida, después de la introducción en el organismo microbiano hospedero. Si el ácido nucleico que codifica una proteína se obtiene de la misma especie del organismo microbiano, se refiere como un ADN homólogo. Si el ácido nucleico se deriva de una especie microbiana diferente, se refiere como un ADN heterologo. Sin importar la naturaleza del ADN, si es homólogo o heterologo, cuando se introduce en una célula hospedera, el ADN, así como la actividad derivada del ADN introducido, se refiere como exógeno. Por lo tanto, la expresión exógena de un ácido nucleico codificante de la invención, puede utilizar a cualquiera o ambos de un ácido nucleico codificante heterologo y homólogo.

Una célula que "utiliza azúcares de C5 y C6 de manera simultánea", significa una célula que consume a una velocidad mensurable, y sin ningún retardo sustancial al inicio de una inoculación de la célula en un medio, tanto un azúcar de C5, tal como xilosa, arabinosa, ribosa, etc., como un azúcar de C6, tal como glucosa, fructosa, galactosa, etc., cuando la célula se cultiva en un medio que contiene una concentración sustancial de un azúcar de C5 y C6. El medio que contiene tanto el azúcar de C5 como de C6 puede hacerse de azúcares purificados, o puede derivarse de un hidrolizado de biomasa.

Varios microorganismos, incluyendo Escherichia coli, Citrobactor freundii, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter asan, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffíneus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxydans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicoia, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquifaciens, Bacillus coagulans, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumonía o Xanthomonas citri, son adecuados para la presente invención. Los microorganismos recombinantes más adecuados para esta presente invención, se derivan de manera preferida de la familia de Enterobacteríaceae. Los microorganismos preferidos se seleccionan de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia, Klebsiella, Citrobacter y Serratia. El género Escherichia es el más preferido. Dentro del género Escherichia, la especie Escherichia coli es particularmente preferida.

Las cepas de E. coli capaces de producir ácidos orgánicos en cantidades significativas son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2009/0148914, proporciona cepas de E. coli como un biocatalizador para la producción de acetato y/o piruvato químicamente puro. La Patente de E.U.A. No. 7,629,162, proporciona derivados de la cepa K0 1 de E. coli construidos para la producción de ácido láctico. Las Solicitudes de Patente Internacionales publicadas bajo el Tratado de Cooperación de Patentes Nos. WO 2008/115958 y WO 2010/1 15067, proporcionan microorganismos diseñados para producir succinato y malato en un medio mínimo de sales minerales que contienen glucosa como una fuente de carbono en una fermentación en lotes con el pH controlado.

Las cepas de E. coli del tipo silvestre obtenidas de las colecciones de cultivo tales como la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo), pueden diseñarse genéticamente, y evolucionar metabólicamente posteriormente, para obtener una cepa con una capacidad mejorada para producir uno o más ácidos orgánicos en cantidades comercialmente significativas.

El término "diseñado genéticamente" o "ingeniería genética" como se utiliza en la presente, se refiere a la práctica de alterar la expresión de una o más enzimas en los microorganismos a través de la manipulación del ADN genómico o un plásmido del microorganismo. Las manipulaciones genómicas involucran alterar, agregar o eliminar secuencias de ADN específicas del ADN genómico. Las manipulaciones genéticas también involucran la inserción de una secuencia de ADN extraño en la secuencia del ADN genómico del microorganismo. En las modalidades más preferidas de la presente invención, las manipulaciones genéticas se logran por medio de la eliminación de las secuencias de ADN específicas del ADN genómico de los microorganismos, sin introducir ningún ADN extraño. Ciertas manipulaciones genéticas necesarias para inactivar la expresión de un gen que codifica un producto de una proteína particular, requiere una inserción de una secuencia de ADN extraño en el genoma del microorganismo. En la modalidad más preferida de la presente invención, las secuencias del ADN exógeno introducidas se eliminan finalmente del ADN genómico del microorganismo, de manera que el microorganismo al final del proceso de la ingeniería genética no tendría un ADN exógeno en su ADN genómico original. Varias técnicas necesarias para lograr los objetivos de la modalidad preferida de la presente invención, se han descrito con detalle en Jantama et al (Biotechnology and Bioengineering 99:1140-1153 y Biotechnology and Bioengineering 101 :881-893). La Patente de E.U.A. publicada No. 7,629,162 y la Solicitud de Patente de E.U.A. 2009/0148914 y las solicitudes de patente Internacional publicadas bajo el Tratado de Cooperación de Patentes con los Números de Publicación Internacional WO 2008/1 15958 y WO 2010/115067, también describen las técnicas de ingeniería genética útiles para practicar varias modalidades de la presente invención. Estas publicaciones científicas, así como los documentos de patente, se incorporan en la presente como referencia, con el propósito de proporcionar los detalles para las técnicas de ingeniería genética útiles para la presente invención.

Los microorganismos adecuados para la práctica de la presente invención, pueden cultivarse de manera aeróbica (en la presencia de oxígeno) o anaeróbica (en la ausencia completa de oxígeno) o microaeróbicamente (con una baja proporción de suministro de oxígeno). De manera alterna, los microorganismos adecuados para la presente invención, pueden cultivarse en un régimen de crecimiento de fase doble, en donde el microorganismo se cultiva inicialmente en una condición de cultivo aeróbico para alcanzar un cierto nivel de crecimiento celular antes de transferirlo con una condición de crecimiento anaeróbico, para lograr la producción de los ácidos orgánicos deseados en cantidades comercialmente significativas. Con el fin de hacer los microorganismos para producir un ácido orgánico particular, varias enzimas involucradas en varias trayectorias metabólicas microbianas, incluyendo la trayectoria glucolítica, el ciclo del ácido tricarboxílico (también llamado el ciclo de Krebs o el ciclo de TCA) y la atrofia del glioxilato puede manipularse en una variedad de técnicas de ingeniería genética descritas en la literatura científica y de patentes citada e incorporada como referencia en el párrafo anterior. Todas de esas referencias se incorporan en esta solicitud de patente como referencia. Los detalles sobre varias trayectorias metabólicas microbianas pueden encontrarse en los libros de texto de bioquímica estándar, tales como Principios de Bioquímica, por Lehninger y Bioquímica por Lubert Stryer.

Dependiendo del tipo de ácido orgánico preferido, las trayectorias metabólicas son diseñadas genéticamente, de manera que un microorganismo produzca un ácido orgánico particular de nuestra elección. Los microorganismos son capaces de sintetizar varios ácidos orgánicos, incluyendo ácido láctico, ácido acético y ácido succínico. La lista de las enzimas que son activas en la trayectoria de fermentación microbiana, que pueden manipularse utilizando las técnicas de ingeniería genética conocidas incluyen, de manera no exclusiva, la isocitrato sintetasa (aceA), malato sintasa (aceB), el operón de la atrofia de glioxilato (aceBAK), la acetato cinasa-fosfotransacetilasa (ackA-pta); aconitasa hidratasa 1 y 2 (acnA y acnB); acetil-CoA sintetasa (acs); alcohol deshidrogenase (adhE); citrato sintasa (citZ); fumarato reductasa (frd); lactato deshidrogenasas (Idh); malato deshidrogenasas (mdh); represor del operón de aceBAK (icIR); fosfoenol piruvato carboxilasa (pepC); piruvato formiato liasa (pfí); piruvato oxidasa ( oxS); y piruvato carboxilasa (pyc). Además de estos genes involucrados directamente en la glucólisis, el ciclo del ácido tricarboxílico y la atrofia del glioxilato de las trayectorias metabólicas microbianas, la manipulación genética de los genes involucrados en la captación de los compuestos de carbono útiles como una fuente de energía para la síntesis del ácido orgánico, también pueden manipularse para mejorar la captación del carbono o para mejorar la eficiencia de la utilización de energía en la producción del ácido orgánico. Por ejemplo, una disminución en la captación de la glucosa por un sistema de fosfotransferasa (PTS), ayudaría a reducir el gasto de energía en la captación de la glucosa en la célula microbiana. La energía conservada mediante la manipulación del PTS puede canalizarse para mejorar la eficiencia de la producción del ácido orgánico. Los genes del sistema de fosfotransferasa ptsH y ptsG, pueden manipularse para conservar la energía en la captación de la glucosa y, por lo tanto, mejorar la eficiencia de la producción del ácido orgánico por el microorganismo. Así, al buscar en los datos disponibles en el área de las trayectorias metabólicas microbianas, uno puede suprimir un conjunto de genes, para bloquear la mayoría de las trayectorias metabólicas y canalizar el flujo de carbono a la producción de un ácido orgánico particular.

Además de las trayectorias metabólicas centrales y los mecanismos de captación del azúcar, las enzimas carboxilantes dentro de las células bacterianas también pueden manipularse para mejorar la producción de la fermentación del ácido orgánico. El papel de las enzimas carboxilantes en la producción de fermentación está ahora bien establecido. Al menos cuatro diferentes tipos de enzimas carboxilantes se conocen por ser funcionales dentro de las células bacterianas. La fosfoenol piruvato carboxilasa (PEPcasa o PPC), carboxila el fosfoenol piruvato conduciendo a la formación de ácido oxaloacético. Las enzimas málicas carboxilan el ácido pirúvico, conduciendo a la formación de ácido málico y requiere cofactores reducidos, tales como NADH o NADPH. La tercera enzima carboxilante conocida como piruvato carboxilasa (PYC), carboxila el ácido pirúvico para producir ácido oxaloacético. La cuarta enzima carboxilante conocida como fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PCK), carboxila el fosfoenol piruvato a oxaloacetato con la producción de una molécula de ATP por cada molécula de oxaloacetato producida de la carboxilación de la molécula de fosfoenol piruvato. Cualquiera de estas enzimas carboxilantes puede también manipularse de manera apropiada en las cepas bacterianas, con la capacidad de utilizar azúcares de hexosa y pentosa de manera simultánea, para mejorar la producción de fermentación de los productos químicos industrialmente útiles.

La fosfoenolpiruvato carboxicinasa (pck) puede manipularse genéticamente para mejorar el flujo del carbono hacia el ciclo del ácido tricarboxílico. La ventaja de mejorar la actividad de la pck ya sea en el hecho de que esta enzima, mientras que carboxila al fosfoenol piruvato a oxaloacetato, resulta en la producción de una molécula de ATP por cada molécula de oxaloacetato producida. Un incremento en el rendimiento del ATP, incrementaría la velocidad de crecimiento de las células.

El reclutamiento de la pck nativa para la producción del succinato por fermentación, puede lograrse mediante cualquier mutación que afecte de manera positiva la transcripción del gen pck. Un incremento en el nivel de actividad de la PCK puede lograrse por medio de expresar el gen pck en un plásmido con múltiples copias con un promotor nativo o cualquier otra secuencia promotora que se sepa que incrementa la expresión del gen. Otra manera de incrementar la expresión del gen pck dentro de la célula, es integrar copias adicionales del gen pck utilizando transposones. En otra modalidad de la presente invención, el promotor nativo del gen pck puede reemplazarse por algunos otros elementos promotores conocidos por mejorar el nivel de la actividad. Una expresión incrementada del gen pck también puede lograrse ya sea mediante mutación en la región promotora del gen o mediante manipulación genética de los elementos reguladores que se sabe que interactúan con la región promotora del gen pck. El gen que codifica una proteína reguladora del gen pck puede mutarse o suprimirse o sobreexpresarse de alguna manera, con el fin de incrementar la expresión del gen pck. Una mutación puntual única (transición de G a A en la posición - 64 con relación al codón de inicio ATG del gen pck), podría incrementar la transcripción del gen pck acompañado por un incremento correspondiente en la actividad de la enzima fosfoenol piruvato carboxicinasa. Un incremento similar en la expresión del gen pck también puede lograrse manipulando genéticamente los genes que codifican las proteínas que se sabe que regulan la expresión del gen pck.

La producción del ácido orgánico por el microorganismo diseñado genéticamente puede confirmarse y cuantificarse utilizando técnicas apropiadas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden utilizarse técnicas de HPLC para medir la cantidad del ácido orgánico producido por la clona seleccionada. La tecnología de HPLC también es útil para determinar la pureza del ácido orgánico producido por las clonas seleccionadas.

El organismo microbiano de la presente invención puede cultivarse en varios medios de cultivo diferentes, bien conocidos en el campo de la microbiología. Por ejemplo, las cepas del tipo silvestre y mutantes de E. coli se cultivan en medio de Luria-Bertani (LB) que contiene triptona al 1 % (peso/volumen), extracto de levadura al 0.5% (peso/volumen), y NaCI al 0.5% (peso/volumen). Para la producción comercial del ácido orgánico utilizando el proceso de fermentación que involucra el microorganismo modificado genéticamente como biocatalizador, se prefiere un medio mínimo de sales minerales suplementado con una fuente de carbono. El uso de un medio mínimo de sales minerales en oposición a un medio rico como el medio LB, reduce el costo de la producción de los ácidos orgánicos a escala comercial. El medio mínimo mineral adecuado para la presente invención, incluye medio NBS (Causey et al., 2007) y medio AM1 (Martínez ef al., 2007). El medio NBS contiene betaína 1 mM, KH2P04 25.72 mM, K2HP04 28.71 mM, (NH4)2HP04 26.50 mM, MgS04.7H20 1 mM, CaCI2.2H20 0.1 mM, Tiamina HCI 0.15 mM, FeCI3.6H20 5.92 µ?, CoCI2.6H2O 0.84 µ?, CuCI2.2H20 0.59 µ?, ZnCI2 1.47 µ?, Na2Mo04.2H20 0.83 µ? y H3B03 0.81 µ?. El medio AM1 contiene betaína 1 mM, (NH4)2HP04 19.92 mM, NH4H2P04 7.56 mM, MgS04.7H20 1.5 mM, Betaína-KCI 1.0 mM, FeCI3.6H20 8.88 µ?, CoCI2.6H20 1.26 µ?, CuCI2.2H20 0.88 µ?, ZnCI2 2.20 µ?, Na2Mo042H20 1.24 µ?, H3B03 1.21 µ? y MnCI2.4H20 2.50 µ?.

Puesto que la acumulación de los ácidos orgánicos en el medio de cultivo tiende a disminuir el pH del medio, es necesario agregar agentes neutralizantes apropiados conforme se requiera al medio de cultivo. El pH del recipiente de cultivo puede verificarse de manera continua utilizando una sonda para pH, y puede agregarse una base apropiada para mantener el pH del medio de cultivo alrededor de un pH neutro. Las bases adecuadas para mantener el pH del cultivo microbiano incluyen, NaOH, KOH, NH4HC03, Na2C03, NaHC03, K2C03 y (NH )2C03. Las bases adecuadas para este propósito pueden utilizarse solas o en combinación.

El medio mineral para el crecimiento microbiano se suplementa con una fuente de carbono. Las fuentes de carbono útiles en la presente invención incluyen, de manera no exclusiva, azúcares de pentosa como xilosa, y azúcares de hexosa como glucosa, fructosa y galactosa. La fuente de carbono también puede satisfacerse proporcionando una combinación de diferentes azúcares, tales como una combinación de glucosa y xilosa. La fuente de carbono también puede derivarse de la hidrólisis de almidón o lignocelulosa. La hidrólisis de los carbohidratos complejos, tales como almidón y lignocelulosas, puede lograrse utilizando procesos de conversión termoquímicos o métodos enzimáticos bien conocidos en la técnica. La fuente de carbono preferida para la producción industrial del ácido orgánico utilizando la fermentación microbiana, es el hidrolizado lignocelulósico derivado de la hidrólisis de desechos agrícolas o forestales. El hidrolizado lignocelulósico puede fraccionarse además, para proporcionar una fracción enriquecida con hexosa y una enriquecida con pentosa, y esas fracciones pueden servir como la fuente de carbono para la producción comercial de los ácidos orgánicos, utilizando el proceso de fermentación microbiana. El hidrolizado lignocelulósico puede además, desintoxicarse para eliminar ciertos productos químicos, tales como furfural, que son tóxicos para varios organismos microbianos por encima de ciertas concentraciones.

Las cepas microbianas obtenidas de la ingeniería genética tienen el genotipo esperado para la producción de ácidos orgánicos. Sin embargo, su velocidad de crecimiento en el medio mínimo de sales minerales o su capacidad para producir un ácido orgánico específico a la proporción requerida o su capacidad para tolerar ciertos productos químicos en la fuente de carbono derivada del hidrolizado lignocelulósico, pueden no ser adecuadas para utilizar estos microorganismos modificados genéticamente como un biocatalizador para la producción comercial del ácido orgánico a través de un proceso de fermentación a gran escala. Las cepas microbianas modificadas genéticamente obtenidas de las supresiones del gen se seleccionaron posteriormente para la clona más representativa vía la adaptación o evolución metabólica. Durante la evolución metabólica, el cultivo seleccionado se transfirió de manera repetida a medio mínimo fresco durante un periodo de tiempo, para lograr una clona en la cual una o más mutaciones espontáneas que ocurrieron durante la selección, resulten en un fenotipo que exhiba un rápido crecimiento celular, un rápido consumo de diferentes fuentes de carbono, capacidad de utilizar múltiples azúcares de manera simultánea, capacidad de tolerar productos químicos tóxicos en la fuente de carbono y un alto rendimiento de producción y productividad del ácido orgánico deseado, pero baja producción de otros ácidos orgánicos. Durante la evolución metabólica, se presta atención a seleccionar la clona con los fenotipos deseables. Un organismo microbiano diseñado genéticamente para producir un ácido orgánico particular, puede no tener una velocidad de crecimiento comercialmente atractiva, y en consecuencia, puede no mostrar el rendimiento esperado de ese ácido orgánico particular. La evolución metabólica puede seguirse para desarrollar una cepa que muestre un crecimiento significativo, acompañado por una velocidad incrementada para la producción de ese ácido orgánico particular. Una clona que resulte de la evolución metabólica que muestre una muy buena velocidad de crecimiento en el medio mineral suplementado con una fuente de carbono, pero que no tiene mejora en el rendimiento del ácido orgánico deseado, no es una clona deseable.

La cepa KJ122 de E. coli se utilizó en la modalidad preferida de la presente invención. KJ122 se derivó de la cepa C de E. coli del tipo silvestre, a través de múltiples etapas que involucran una combinación de ingeniería genética y evolución metabólica. Utilizando técnicas de ingeniería genética,, doce diferentes genes, incluyendo el de la lactato hidrogenasa (IdhA), alcohol deshidrogenasa {adhE), transformador del formiato (focA), acetato cinasa (ackA), piruvato-formiato liasa (prVS), metilglioxal sintasa (msgA), piruvato oxidasa (poxB), propionato cinasa con actividad de acetato cinasa (tdcD), a-cetobutirato formiato liasa (tdcE), citrato liasa (citF), aspartato aminotransferasa (aspC) y enzima mélica (sfcA), se suprimieron del ADN cromosomal de la cepa C de E. coli original ATCC 8739. Las manipulaciones genéticas hechas a la cepa C de E. coli ATCC 8739, condujeron a la cepa KJ 122 que se ha descrito con detalle por Jantama et al (2008a 2008b).

Durante el proceso de la evolución metabólica utilizando la presión selectiva para obligar al organismo a adquirir un fenotipo deseable, podrían ocurrir dos cambios posibles. El organismo podría simplemente adaptarse a sí mismo a la presión selectiva y mostrar un fenotipo cambiado. De manera alterna, el organismo puede someterse a ciertos cambios genéticos bajo presión selectiva y exhibir un fenotipo cambiado de manera permanente. Cuando solo hubo una adaptación y no hay cambio genético, el organismo regresa nuevamente a su fenotipo original una vez que la presión de selección se alivia. Estos organismos son referidos como organismos "adaptados". Los microorganismos "adaptados" tienen que someterse a otra ronda fresca de evolución metabólica bajo presión de selección, para mostrar un fenotipo cambiado. Por otra parte, cuando hay un cambio genético acompañante, el fenotipo cambiado continuará existiendo incluso cuando no haya presión de selección. La evolución metabólica acompañada por un cierto cambio genético es deseable. El microorganismo que adquiere un cambio genético estable durante una evolución metabólica, puede identificarse fácilmente por medio del cultivo del microorganismo en el medio de cultivo original sin ninguna presión de selección durante algún tiempo, antes de transferirlo al medio fresco con la presión de selección. Si estos organismos son capaces de mostrar un buen crecimiento y el fenotipo esperado sin ningún periodo de retardo, se considera que el organismo ha adquirido un fenotipo cambiado durante la evolución metabólica.

La base del cambio genético ganado durante la evolución metabólica, puede determinarse secuenciando el ADN cromosomal del organismo, y comparando los datos de la secuencia con aquéllos de la cepa original. Los datos de la secuencia genómica pueden obtenerse por medio de seguir las técnicas bien conocidas en el campo. Así, la cepa original KJ122 obtenida de la cepa de E. coli ATCC 8739, puede someterse a evolución metabólica para obtener una cepa con un nuevo fenotipo deseable. El genoma de la nueva cepa desarrollada metabólicamente con la cepa original KJ122, puede secuenciarse y las mutaciones en la cepa desarrollada metabólicamente que constituyen el fenotipo cambiado pueden identificarse.

Como se define en esta invención, el término mutación incluye cualquier cambio en la secuencia nucleotídica dentro del gen. Un cambio nucleotídico dentro de un gen puede ser un cambio de un solo nucleótido dentro de un codón triple conduce al reemplazo de un residuo de aminoácido con otro residuo de aminoácido. De manera alterna, un cambio de un nucleótido dentro de un marco de lectura abierta de un gen, puede involucrar una supresión de una porción del marco de lectura abierto o todo el marco de lectura abierto. Un cambio nucleotídico dentro de un marco de lectura abierto puede también incluir la introducción de paro, y como resultado, el marco de lectura abierto codifica a una proteína trunca en lugar de una proteína de longitud completa. Como se utiliza en la presente invención, el término mutación también incluye cambios en las secuencias nucleotídicas corriente arriba o corriente abajo del marco de lectura abierto. Las regiones corriente arriba y corriente abajo de un marco de lectura abierto, contienen varias secuencias nucleotídicas reguladoras, y están involucradas en la expresión de la proteína codificada por el marco de lectura abierto. Una mutación que ocurre en estas regiones reguladoras, puede alterar la expresión del gen que conduce a una sobrerregulación o desregulación de la función del gen. Otra posibilidad es una inserción o supresión nucleotídica que resulte en una mutación de desplazamiento de los marcos.

Basándose en el conocimiento ganado de la presente invención, las modificaciones genéticas que conducen al uso simultáneo de los azúcares de pentosa y hexosa, puede llevarse a cabo por cualquier cepa bacteriana ya diseñada genéticamente, para la producción de uno o más productos químicos industriales, utilizando glucosa como la fuente de carbono. De manera alterna, la modificación genética requerida para el uso simultáneo del azúcar de hexosa y pentosa, puede llevarse a cabo en cualesquier cepas bacterianas del tipo silvestre y la cepa bacteriana del tipo silvestre así modificada para el uso simultáneo del azúcar de hexosa y pentosa, puede someterse a modificaciones genéticas adicionales para desarrollar un microorganismo adecuado para la producción de productos químicos industriales en una escala comercial.

Sección experimental Notas generales Cepa y preparaciones del inoculo: Se utilizó a KJ122 (E. coli C, AldhA, AadhE, AackA, AfocA-pflB, AmgsA, ?????, átdcDE, AcitF, aspC, AsfcA) en la presente invención. KJ122 se derivó de la cepa de E. coli C (ATCC 8739), a través de modificaciones genéticas, como se describió por Jantama et al (2008a; 2008b) y en las Solicitudes de Patente Internacionales publicadas bajo el Tratado de Cooperación de Patentes con los Números de Publicación Internacional WO 2008/1 5958 y WO 2010/1 5067. Todos estos documentos se incorporan en la presente como referencia.

La cepa de E. coli KJ122 es capaz de fermentar a la glucosa al 10% en medio mineral AM1 para producir 88 g/L de succinato, normalizado para la adición de la base, en 72 horas. El medio AM1 contiene (NH4)2HP04 2.63 g/L, NH H2P04 0.87 g/L, MgS04 1.5 mM, betaína 1.0 mM y elementos en trazas 1.5 ml/L. Los elementos en trazas se preparan como una solución madre 1000X y contienen los siguientes componentes: FeCb 1.6 g/L, CoCI2*6H20 0.2 g/L, CuCI2 0.1 g/L, ZnCI2»4H2O 0.2 g/L, NaMo04 0.2 g/L, H3BO3 0.05 g/L y MnCI2»4H20 0.33 g/L. El pH del caldo de fermentación se mantuvo a 7.0 con: 1 :4 (KOH 6 N:K2C03 3 M) (KOH 1.2 N, K2C03 2.4 ).

En algunos experimentos, se agregó licor macerado de maíz. Este es un subproducto de la industria de molienda en húmedo del maíz. Cuando se compara con el extracto de levadura y la peptona, es una fuente barata de vitaminas y elementos en trazas.

Fermentaciones: Las fermentaciones empezaron cultivando en línea en una placa de NBS-xilosa al 2% fresca, una solución madre de glicerol de la cepa de E. coli diseñada genéticamente para producir ácido succínico y almacenada en el congelador a -80°C. Después de 16 horas (37°C), las células de la placa se rasparon y se inocularon directamente en el recipiente de fermentación. Los recipientes de fermentación tienen un volumen de trabajo de 350 mi. Esta primera fermentación se refiere como el cultivo de "siembra", y no se utilizó para acumular datos. El medio en todas las fermentaciones fue medio AM1 tradicional suplementado con KHCO3 0.03M, betaína 1 mM y xilosa al 8% (a menos que se indique de otra manera), y neutralizado con una base que consiste de KOH 1.2 N y K2C03 2.4 M. Los recipientes de fermentación se mantuvieron a un pH de 7.0, 37°C con agitación de 150 rpm. Después de 24 horas, el cultivo de siembra se utilizó para inocular un nuevo cultivo (ya sea experimentos en lotes o "transferencias") a una OD550 inicial de 0.05. Con las excepciones de las transferencias diarias, todos los experimentos se realizaron por triplicado. El experimento de cofermentación de C5/C6 incluyó xilosa al 4%, glucosa al 7%, arabinosa al 0.5%, galactosa al 0.4% y mañosa al 0.3% (azúcares puros), y se inoculó con un cultivo que crece en xilosa como la única fuente de carbono y furfural al 0.08%. La cofermentación de C5/C6 también se realizó con la mezcla de xilosa al 8% y glucosa al 1%. Estos experimentos se realizaron por triplicado sin la adición de inhibidores, con acetato al 1% o con furfural al 0.1%.

Cultivo de células: La masa celular se estimó midiendo la densidad óptica a 550 nm (OD550) utilizando un espectrofotómetro Thermo Electronic Spectronic 20.

Análisis del ácido orgánico y el azúcar: La concentración de varios ácidos orgánicos y azúcares se midió mediante HPLC. El ácido succínico y otros ácidos orgánicos presentes en el caldo de fermentación se analizaron en un aparato de HPLC Agilent 1200 con una columna BioRad Aminex HPX-87H. Se utilizó el Catión H+ Microguard de BioRad como un protector de la columna. Los estándares para el análisis con HPLC se prepararon en ácido sulfúrico 0.008 N. La temperatura de la columna de la HPLC se mantuvo a 50°C. Se utilizó ácido sulfúrico a una concentración de 0.008 N como una fase móvil a la velocidad de flujo de 0.6 ml/minuto. La cuantificación de varios componentes se hizo midiendo su absorción a 210 nm.

Evolución metabólica: Las células de las fermentaciones con pH controlado se transfirieron serialmente a 24 horas para alertar la evolución metabólica a través de la selección basada en el cultivo. El inoculo, aproximadamente 1/100 del volumen del medio nuevo, se agregó directamente al medio fresco precalentado, a una OD550 inicial de 0.05. Las clonas con características de fermentación mejoradas se aislaron. La estrategia de evolución metabólica se aplicó para mejorar la fermentación de la xilosa.

Preparación del bagazo: El bagazo se caña de azúcar se obtuvo de molinos de azúcar el Florida, que es un producto de desecho que se utiliza típicamente para quemarse para obtener energía. Este producto de desecho se utiliza como la materia prima para la preparación de las fracciones de semicelulosa y celulosa utilizando un pretratamiento con ácido diluido.

El bagazo de caña de azúcar se secó a un contenido de humedad de aproximadamente 10% y se molió utilizando un molino de cuchillas. El material se trató en reactores de vapor (Zipperclave & Parr), con ácido sulfúrico diluido a temperaturas moderadas. Las condiciones de pretratamiento típicas para el pretratamiento con ácido diluido son una concentración de ácido de 0.1-3%, temperatura 100-200°C, y tiempo de residencia de 1-30 minutos en el reactor. Las condiciones óptimas del reactor para lograr un rendimiento de xilosa máximo con la degradación mínima del azúcar son una concentración de ácido de aproximadamente 0.5%, 160°C, y tiempo de residencia de 10 minutos en el reactor.

PCR y secuenciamiento del ADN: Un conjunto de dos cebadores específicos galP BY38 y BY39 (Cuadro 1 ), se utilizó para obtener el gen galP de las cepas TG400, KJ122 y WG37 de E. coli. La PCR se llevó a cabo utilizando el protocolo estándar utilizando un kit de mezcla maestra HF 2phusion de New England Biolabs. Los productos de la PCR se corrieron en un gel de agarosa al 0.8% para determinar el tamaño de los productos de la PCR de cada una de estas diferentes cepas de £ coli. Los productos de la PCR también se secuenciaron utilizando el método de Sanger por la instalación central de secuenciamiento del ADN Tufts en Boston, MA, EUA. Los datos de la secuencia se analizaron utilizando el programa Vector NTI.

Construcción de la cepa WG37 de E. coli: La cepa WG37 de £ coli se derivó de la cepa KJ122 suprimiendo toda la región codificante del gen galP. El gen galP se suprimió en dos pasos, que involucran la recombinación homologa. En la primera etapa, la secuencia del gen galP se reemplazó por un cásete que contiene un marcador de antibiótico y una secuencia del gen sacB. Los recombinantes se seleccionaron en una placa LB con antibiótico. En la segunda etapa, el cásete del antibiótico se eliminó del ADN cromosomal, y los recombinantes se seleccionaron en un medio que contiene sacarosa. Las colonias que crecen en las placas que contienen sacarosa, están altamente enriquecidas para la pérdida del cásete sacB.

En la construcción de la cepa WG37 de £ coli, un cásete kan se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores 51a y 51 b (Cuadro 1 ) y el plásmido pGW 62 digerido con Xmnl como una plantilla. El fragmento del ADN del cásete kan-sacB se introdujo en la cepa KJ122 de E. coli. En el primer paso, los transformantes se seleccionaron en una placa LB con kanamicina y se confirmaron mediante PCR utilizando los cebadores 49a, 49b (Cuadro 1). Esta cepa se designó como WG35. El gen galP y las regiones de 300 pb vecinas, se amplificaron utilizando los cebadores 49a, 49b (Cuadro 1 ) y se clonaron en un vector fácil pGEMT para producir el plásmido pGW180. La preparación diluida de este ADN del plásmido, sirvió como una plantilla para la amplificación de adentro hacia fuera utilizando los cebadores 50a, 50b (Cuadro 1 ). El fragmento resultante se autoligó para construir el plásmido pGW181. En pGW181 (Cuadro 1), el gen galP se suprimió. El fragmento de ADN que contiene la supresión de galP se amplificó mediante PCR con los cebadores 49a, 49b y el plásmido pGW181 como plantilla. El producto de la PCR se introdujo en WG35 y los transformantes se seleccionaron en placas LB con sacarosa al 10%. Las clonas resultantes se probaron para la pérdida de la resistencia a la kanamicina. La cepa con la supresión de galP final se designó como WG37 y la supresión del gen específico se confirmó mediante PCR utilizando los cebadores 49a y 49b (Cuadro 1 ).

EJEMPLO 1 Uso de C5 La cepa de Escheríchia coli KJ122 (E. coli C, AldhA, AadhE, AackA, AfocA-pflB, AmgsA, ?????, AtdcDE, AcitF, AaspC, AsfcA), fue capaz de crecer de manera aeróbica en glucosa, xilosa y arabinosa. El objetivo de la presente invención fue cultivar la cepa KJ122 de E. coli de manera microaeróbica, en un medio que contiene tanto hexosa como otros azúcares de pentosa, y seleccionar un organismo que es capaz de utilizar ambos tipos de azúcares de manera simultánea.

La selección inicial para el uso de C5 se realizó mediante el cultivo aeróbico en placas de medio mineral NBS suplementadas con 2% de xilosa. Las placas se incubaron a 37°C durante la noche. Las colonias que aparecen en la placa de xilosa cultivaron en línea en placas frescas durante tres veces consecutivas. Al final de la tercera transferencia en el medio mineral NBS sólido con xilosa al 2%, las células de la placa se rasparon y se inocularon directamente a un matraz de fermentación que contiene medio mineral AM1 suplementado con KHC03 0.03 M, betaína 1 mM y xilosa al 8%. El medio de fermentación se neutralizó con una base que consiste de KOH 1 .2 N y K2C03 2.4 M, para mantener el pH de 7.0 a 37°C. El cultivo se agitó con una barra de agitación magnética que opera a la velocidad de 150 rpm. El cultivo del líquido se cultivó durante un periodo inicial de 24 horas y se utilizó como un cultivo de siembra para empezar un nuevo cultivo con una OD550 inicial de 0.05.

Este cultivo en el medio mineral AM1 con xilosa, exhibió una fase de retardo de 72 horas inicial, durante el cual no se notó crecimiento de KJ122. Al final de este periodo de retardo inicial, la cepa KJ122 empezó a mostrar crecimiento. Junto con el crecimiento de las células bacterianas medido por un incremento en la OD a 550 nm, hubo una disminución en la concentración de la xilosa en el medio, acompañado por un incremento proporcional en la concentración del ácido succínico en el medio de cultivo.

Al final del periodo de crecimiento de 216 horas en medio que contiene xilosa, se preparó una solución madre de glicerol de este cultivo, y se almacenó a -80°C. El cultivo fresco al final del periodo de crecimiento de 216 horas o la solución madre de glicerol del cultivo preparado al final del periodo de crecimiento de 216 horas, se utilizó para inocular un recipiente de fermentación fresco con medio mineral AM1 suplementado con xilosa al 8%. Sin importar la fuente del inoculo, si fue de un cultivo fresco o de una solución madre de glicerol, el cultivo en el segundo recipiente de fermentación creció sin ningún periodo de retardo. La producción de ácido succínico también acompañó al crecimiento bacteriano sin ningún periodo de retardo. Así, tres rondas de cultivo en un medio mineral sólido con xilosa al 2%, seguido por un solo ciclo de cultivo durante un periodo de 216 horas, resultó en la "cepa adaptada" de KJ122, que es capaz de crecer de manera microaeróbica en un medio que contiene xilosa.

EJEMPLO 2 Evolución metabólica de KJ122 En otra modalidad de la presente invención, la cepa KJ122 se sometió a evolución metabólica. El cultivo de KJ122 que crece microaeróbicamente en un medio AM1 líquido, suplementado con el azúcar de xilosa, se transfirió a un medio AM1 líquido fresco que contiene xilosa al 8% cada 24 horas, durante un periodo de 2 semanas. Al final de estas transferencias múltiples, la cepa KJ122 se transfirió a un fermentador fresco con medio AM1 suplementado con xilosa al 8%. La velocidad de crecimiento anaeróbico de KJ122 en el fermentador, así como la producción del ácido succínico y la cinética del uso de la xilosa se verificaron. La producción de ácido succínico en el fermentador empezó inmediatamente sin ningún periodo de retardo, y también produjo títulos finales más altos, y esta cepa es referida como una "cepa desarrollada metabólicamente". En nuestra colección de cepas, esta cepa desarrollada metabólicamente se ha designado como TG400.

Con el fin de determinar si la "cepa adaptada" de KJ122 y la cepa "desarrollada metabólicamente" TG400 tienen alguna base genética para su fenotipo cambiado, se llevaron a cabo los siguientes experimentos. La cepa KJ122 no modificada, la "cepa adaptada de KJ122" y la cepa "desarrollada metabólicamente" TG400, se cultivaron en línea en una placa con medio mineral fresco que contiene glucosa al 2%. Las colonias resultantes se cultivaron en línea en una placa fresca con glucosa al 2%. Este cultivo en línea se hizo en una base diaria durante 11 días consecutivos. Al final del undécimo día, el cultivo se cultivó en línea en una placa de agar que contiene xilosa. Las colonias que crecen en la placa de xilosa cultivaron en línea nuevamente en una placa que contiene xilosa fresca. Esto fue seguido por la transferencia de las colonias que crecen en la segunda placa que contiene xilosa a un cultivo líquido. La velocidad de crecimiento, la cinética de producción del ácido succínico y la velocidad de disminución en la concentración de xilosa en el medio de cultivo se verificaron.

Como indican los resultados mostrados en las Figuras , 2 y 3, el uso de la xilosa como se verifica por la desaparición de la xilosa en el medio de cultivo, mostró un periodo de retardo de 96 horas, tanto en la cepa KJ122 original, como en la cepa "adaptada" de KJ122. En el caso de la cepa desarrollada metabólicamente TG400, la mayoría de la xilosa en el medio se consumió en el transcurso de las primeras 96 horas. Además, para la TG400, la producción de ácido succínico no mostró ningún periodo de retardo. De manera similar, el crecimiento celular para TG400 no mostró un periodo de retardo, mientras que la "cepa adaptada" de KJ122 y la cepa original de KJ122 mostraron una fase de retardo inicial de aproximadamente 72 horas (Figuras 1 y 2). Estas observaciones establecen claramente que la cepa TG400 desarrollada metabólicamente ha adquirido un fenotipo estable para el uso de la xilosa durante la evolución metabólica, y esta capacidad no se pierde incluso cuando esta cepa se cultiva durante varias generaciones en ausencia de xilosa. Por otra parte, la cepa KJ122 adaptada para crecer en el medio que contiene xilosa únicamente, pierde su capacidad para utilizar xilosa, cuando se cultiva durante varias generaciones en el medio que contiene glucosa en ausencia de xilosa. Esta "cepa adaptada" de KJ122 cultivada en la ausencia de xilosa, necesitó 96 horas adicionales para adaptarse a sí misma contra el uso de xilosa como una fuente de carbono. Así, la "cepa adaptada" de KJ122 no adquirió ninguna modificación genética durante su adaptación en el medio que contiene xilosa durante 96 horas.

TG400, aunque adquiere una capacidad para utilizar la xilosa como una fuente de carbono, todavía retuvo su capacidad para utilizar la glucosa como la fuente de carbono (Cuadro 2).

EJEMPLO 3 Cofermentación de C5 + C6 En KJ122 bajo condiciones de crecimiento anaeróbico, los azúcares de C5 y C6 no se metabolizan de manera simultánea. Los azúcares de C6 se metabolizan primero generalmente, y se exhibe un retardo antes del metabolismo de C5. Por lo tanto, fue esencial determinar las características de la fermentación de TG400 en la presencia de cantidades iguales de azúcares de C6 y C5. Como se muestra en la Figura 4, TG400 fue capaz de utilizar glucosa y xilosa a la misma proporción, y produjo ácido succínico sin ningún periodo de retardo. KJ122 también fue capaz de utilizar tanto la xilosa como la glucosa. Sin embargo, en la cepa KJ122, el uso de la xilosa empezó únicamente después de una disminución sustancial en la concentración de la glucosa. Además, como se muestra en el Cuadro 3, TG400 utilizó más xilosa en una base molar que la glucosa cuando se compara con el uso de la xilosa y la glucosa por KJ122.

EJEMPLO 4 Fermentación del hidrolizado de bagazo desintoxicado enriquecido en azúcares de C5 La cepa TG400 obtenida a través de la evolución metabólica se probó a través de su capacidad para utilizar la xilosa derivada de la hidrólisis de un bagazo. El hidrolizado del bagazo concentrado se desintoxicó por medio de un tratamiento con 50 gramos de carbón por cada kilogramo de hidrolizado de bagazo a 35°C durante 60 minutos en un agitador giratorio a 200 rpm. El bagazo enriquecido con C5 tratado con carbón activado se ajustó al pH, se suplemento con sales minerales AM1 , betaína y elementos en trazas y a continuación se esterilizó por filtración. El hidrolizado comprendió principalmente xilosa (C5) al 8% (peso/volumen) y aproximadamente glucosa (C6) al 0.8%, galactosa (C6) al 0.1%, mañosa (C6) al 0.1% y arabinosa (C5) al 0.002%. El hidrolizado de bagazo enriquecido con azúcares de C5 desintoxicado concentrado, se suplemento además con 2.5% en peso/volumen de licor de maceracion de maíz y se inoculó con la cepa TG400 a una OD550 nm inicial de 0.5. Como lo indican los resultados mostrados en la Figura 5, en el transcurso de 120 horas, todos los azúcares en el medio de cultivo se consumieron, y hubo una producción estable de succinato.

EJEMPLO 5 Secuenciamiento genómico de las cepas KJ122 y TG400 de Escherichia coli Todo el genoma de la cepa original KJ122 y la cepa TG400 derivada de KJ122 a través de una evolución metabólica, se secuenció utilizando un Analizador II del Genoma lllumina, en la Instalación Central del Universidad de Tufos, en Boston, EUA. El Analizador II del Genoma se proporcionó por lllumina Sequencing Technology. Los datos genómicos obtenidos para KJ122 y TG400 se compararon unos con otros para identificar los cambios genéticos que acompañan a la evolución metabólica de TG400 de KJ122. Un análisis comparativo de TG400 y KJ122, reveló un cambio mutacional en el gen galP de TG400. El gen galP en TG400 mostró una mutación puntual en la mutación del nucleótido 889 de su marco de lectura abierto. El nucleótido citosina en esta posición, se cambió a un residuo de guanosina. Como resultado de este cambio del nucleótido, el residuo de aminoácido glicina se cambió a aspartato. Esta mutación en el gen galP es referida como galP*. Esta mutación fue la única diferencia entre las cepas KJ122 y TG400 de las bacterias a nivel nucleotídico.

EJEMPLO 6 PCR y análisis de la secuencia de las secuencias del gen qa/P en TG400 v KJ122 Habiendo establecido que hay una mutación en la secuencia del gen galP en la cepa TG400 que se toma en cuenta para su capacidad de utilizar la xilosa y la glucosa de manera simultánea, utilizamos técnicas de PCR para obtener el gen galP de KJ122 y TG400. Los productos de la PCR obtenidos de TG400, así como el producto de la PCR de KJ122, se secuenciaron. Los datos de la secuencia revelaron una mutación puntual que cambia un residuo de glicina en la posición 296 a un residuo de aspartato (Gly296 a Asp).

EJEMPLO 7 Efecto de la supresión del gen qa/P Habiendo establecido que hay una mutación en el gen galP en TG400, que acompaña la capacidad de utilizar a la glucosa y a la xilosa de manera simultánea, decidimos determinar si la supresión del todo el gen galP tendría todo el mismo efecto fenotípico observado en TG400 con un gen galP mutado. En estos experimentos, utilizando a KJ122 de E. coli como la cepa original.

Suprimimos la secuencia del gen galP de la cepa KJ122 de E. coli para producir una nueva cepa llamada WG37. Medimos la cinética del crecimiento, el patrón de uso del azúcar y la producción de ácido succínico en las cepas KJ122, TG400 y WG37 cultivadas de manera anaeróbica en un medio mínimo que contiene tanto glucosa como xilosa como la fuente de carbono. WG37 fue capaz de utilizar tanto a la glucosa como a la xilosa de manera simultánea, durante el curso de 96 horas (Figura 6). Su cinética de crecimiento, así como los patrones de uso del azúcar fueron similares a aquellos de TG400, que tiene una forma mutada del gen galP. En KJ122, la glucosa se consumió completamente en el transcurso de 72 horas, mientras que el uso de la xilosa mostró un retardo inicial de 24 horas. Tanto en TG400 como en WG37, la glucosa no se terminó incluso después de 96 horas de cultivo y una cantidad significativa de glucosa permaneció en el medio a las 96 horas de cultivo. Además, tanto en TG400 como en WG37, el uso de la xilosa pudo detectarse tan inicialmente como a las 12 horas.

Las Figuras 7, 8 y 9 muestran la comparación lado a lado de la cinética de la producción del ácido succínico en todas las tres cepas utilizadas en la presente invención. Cuando se cultivan en el medio que contiene xilosa al 4% y glucosa al 7%, todas las cepas mostraron una cinética similar para la producción de ácido succínico, sin importar si tenían una secuencia del gen galP intacta o no. En el medio que contiene los azúcares mezclados, TG400 mostró una velocidad ligeramente más alta para la producción de ácido succínico (Figura 7).

En el medio que contiene xilosa como la única fuente de carbono, las cepas TG400 y WG37, mostraron velocidades mucho más rápidas para la producción de ácido succínico cuando se comparan con la velocidad de producción del ácido succínico por la cepa KJ122 (Figura 8).

En el medio que contiene glucosa como la única fuente de carbono, las dos cepas bacterianas TG400 y WG37 con las supresiones en la presencia del gen galP, mostraron velocidades más lentas para la producción de ácido succínico, cuando se comparan con la velocidad de producción del ácido succínico por KJ122. (Figura 9).

EJEMPLO 8 Efecto de la mutación puntual G297D en galP en el uso de la xílosa Con el fin de examinar el efecto de la mutación puntual que resulta en G297D (reemplazo de un residuo de glicina en la posición 297 con un residuo de aspartato en la proteína GalP) en el crecimiento y producción de succinato en el medio de fermentación que contiene xilosa como la única fuente de carbono, la mutación G297D se introdujo en la secuencia del gen galP en la cepa KJ122. SI014 (KJ122 AgalP::galP*), se creó mediante PCR amplificando el gen mutante galP* de TG400, utilizando los cebadores 17ASPgalP (SEQ ID No. 9) y 18SPgalP (SEQ ID NO. 10), y recombinándolos entonces dentro de WG35 (KJ122 AgalP::kan-sacB), que expresaba a la recombinasa roja lambda de un plásmido condicional de la temperatura, pKD46. Los plásmidos pKD46 se eliminaron mediante el cultivo a una temperatura elevada (Datsenko y Waner, 2000).

KJ122 se obtuvo de una placa de lactosa MacConkey. SI014 (KJ122galP*), se tomó de una placa de glucosa al 2% LB. Los raspados de las placas se utilizaron para inocular 25 mi de glucosa al 2% LB. Los cultivos se hicieron crecer durante 8 horas a 37°C, 150 rpm. La OD6oo final para estos cultivos fue 0.71 para KJ122 y 0.58 para SI014. 5 mi de cada cultivo de glucosa LB se utilizaron para inocular un fermentador de siembra de 300 mi que contiene medio de glucosa al 10% AM1. Estas fermentaciones se mantuvieron a pH 7.0, 37°C durante 24 horas. La OD6oo final para estos cultivos fue 3.82 para KJ122 y 2.89 para SI014. Estos cultivos se utilizaron para inocular fermentadores por triplicado que contienen el medio de xilosa al 10% AM1. La OD60o final objetivo es 0.1 , de manera que para KJ122, se utilizaron 7.85 mi y para SI014, se utilizaron 10.38 mi para inocular una fermentación de 300 mi. Las fermentaciones se mantuvieron a pH 7.0 y 37°C durante 97 horas. Las muestras se tomaron diariamente para el análisis de la OD6oo y el metabolito. Todos los datos del metabolito y del cultivo se graficaron y analizaron (ANOVA de 2 vías) utilizando GraphPad Prism.

El perfil de cultivo para la cepa SI014 de E. coli que contiene una mutación puntual en el gen galP que resulta en un cambio en 1 aminoácido en la posición 297, se muestra en la Figura 10. Está muy claro por los valores de OÜ6oo que, en un medio que contiene xilosa como la única fuente de carbono, la cepa SI014 crece más rápidamente y más densamente que KJ122. La única diferencia conocida entre estas dos cepas, es la mutación puntual en el gen galP. La Figura 11 muestra el consumo incrementado de xilosa y el incremento concomitante en la producción de ácido succínico para la cepa SI014 en comparación con KJ122.

La invención de las solicitantes se ha descrito con detalle anteriormente, con referencia particular a la modalidad preferida. Un practicante con experiencia familiarizado con la descripción detallada anterior, puede hacer cualesquier modificaciones sin apartarse del espíritu de las reivindicaciones que siguen.

CUADRO 1 Secuencia nucleotídica de los cebadores utilizados en la presente invención CUADRO 2 Fermentación de la glucosa por las cepas KJ122 y TG 400 de E. coli Todos los valores proporcionados aquí están normalizados para la adición de la base.

CUADRO 3 Cofermentación de los azúcares de CS y C6 por las cepas KJ122 y TG400 de E. coli. TG400 y KJ122 estuvieron en un medio que contiene glucosa antes del experimento. TG400*** creció de manera activa en la xilosa antes del experimento. Los resultados son el promedio de dos fermentaciones *Todos los valores proporcionados aquí están normalizados para la adición de la base.

CUADRO 4 Rendimientos de las fermentaciones por lotes (xilosa al 8%) - KJ122 vs.

TG400 a Las fermentaciones en lotes se realizaron por triplicado en medio de sales minerales AM1 suplementado con KHCO2 0.03 M, betaína 1 mM y xilosa al 8%, a menos que se indique de otra manera; el pH se controló a 7.0 mediante la adición automática de KOH 1.2 N y K2CO3 2.4 M: Los títulos están normalizados para la adición de la base. b Los rendimientos se basan en el azúcar metabolizada, suponiendo un rendimiento teórico máximo de 1.12 g de ácido succínico por g de xilosa. c Primera fermentación de la xilosa (por duplicado) d Concentración del azúcar inicial: xilosa al 4%, glucosa al 7%, galactosa al 0.4%, mañosa al 0.3%, arabinosa al 0.5% e Hidrolizado de C5 desintoxicado concentrado del bagazo (véase la leyenda de la Figura 5). La concentración inicial del azúcar fue: 56.6 g/L de xilosa, 4.5 g/L de glucosa, 0.0009 g/L de galactosa, 2.7 g/L de arabinosa. Todos los azúcares se consumieron. El ácido acético inicial del proceso de pretratamiento 4.04 g/L), se sustrajo del acetato final para determinar el ácido acético producido durante la fermentación.

Referencias Todas las referencias se listan por conveniencia del lector. Cada referencia se incorpora como referencia en su totalidad.

Patente de E.U.A. No. 5,168,056 Patente de E.U.A. No. 5,169,768 Patente de E.U.A. No. 5,602,030 Patente de E.U.A. No. 6,962,794 Patente de E.U.A. No. 7,223,567 Patente de E.U.A. No. 7,371 ,558 Patente de E.U.A. No. 7,524,660 Patente de E.U.A. No. 7,629,162 Publicación de la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2004/0214294 Publicación de la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2007/0037265 Publicación de la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2008/0176302 Publicación de la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2009/0148914 Publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 2008/115958 Publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 2010/115067 Bertilsson, M., Olofsson, K., Liden, G. (2009) "Prefermentation improves xylose utilization in simultaneous saccharification and co-fermentation of pretreated spruce." Biotechnol Biofuels 2: 8 (Biomed Central. Published April 8, 2009) Biville, F., Turlin, E., Gasser, F. (1991) "Mutants of Escherichia coli producing pyrroloquinoline quinine." J Gen Microbio 137: 1775-1782.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una célula bacteriana que comprende una mutación en el gen galP, en donde la célula bacteriana utiliza los azúcares de C5 y C6 de manera simultánea.

2.- La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la célula bacteriana se selecciona de un grupo que consiste de Escherichia coli, Citrobactor freundii, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxydans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter ¡ndicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium fíavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacteríum peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacteríum rhenanum, Flavobacteríum sewanense, Flavobacteríum breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgerí, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporía parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces gríseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacilius pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquifaciens, Bacillus coagulans, Escheríchia freundii, Microbacteríum ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimuríum, Salmonella schottmullerí, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumonía y Xanthomonas citrí.

3. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la mutación en el gen ga/P es una mutación puntual.

4. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la célula bacteriana es de Escherichia coli y la mutación en el gen ga/P comprende el reemplazo de un nucleótido de citosina en la posición 889 con un nucleótido de timina.

5. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la célula bacteriana es Escherichia coli y la mutación en el gen ga/P comprende el reemplazo de un residuo de glicina en la posición 297 con un residuo de aspartato.

6. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la mutación en el gen ga/P es una supresión.

7. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente al menos una mutación que disminuye la actividad del sistema de fosfotransferasa dependiente de PEP.

8. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente al menos una mutación que disminuye la actividad del sistema de fosfotransferasa dependiente de PEP y al menos una mutación que incrementa la actividad de al menos un transportador del azúcar que no es PTS.

9. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el transportador del azúcar que no es PTS es un miembro de los transportadores del cásete que se unen al ATP.

10. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el transportador de azúcar que no es PTS es un miembro de una superfamilia del facilitador principal.

11. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente al menos una mutación que inactiva la expresión de uno o más genes involucrados en una trayectoria de fermentación.

12.- La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente al menos una mutación que inactiva uno o más genes asociados con el ciclo del ácido tricarboxílico.

13.- La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente una mutación en el menos uno de los genes seleccionados de un grupo que consiste del gen que codifica para la fosfoenolpiruvato carboxilasa, un gen que codifica para la enzima málica dependiente de NADH, y un gen que codifica para la enzima málica dependiente de NADPH.

14.- La cepa bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente una piruvato carboxilasa exógena.

15.- La cepa bacteriana de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque la piruvato carboxilasa es de Lactobacillus lactis o de Sorghum vulgare o de Rhizopium etli.

16. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente una actividad incrementada de la fosfoenol piruvato carboxicinasa.

17. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque los niveles de actividad de la fosfoenol piruvato carboxicinasa resultan de una mutación en el gen pck.

18. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque la mutación está en la región promotora del gen pck.

19. - Un proceso para la producción microbiana de un ácido orgánico, que comprende: a. proporcionar una célula bacteriana que tiene una mutación en el gen galP, en donde la célula bacteriana utiliza los azúcares de pentosa y hexosa de manera simultánea; b. cultivar la célula bacteriana del paso (a) en un medio que contiene los azúcares de pentosa y hexosa de manera simultánea; y c. recuperar opcionalmente el ácido orgánico del medio de cultivo.

20. - Una célula bacteriana que comprende un transportador del azúcar que no es de PTS mutado, en donde el transportador del azúcar mutado disminuye la velocidad de crecimiento del primer azúcar, e incrementa la velocidad de crecimiento del segundo azúcar con relación a la célula bacteriana que comprende el alelo del tipo silvestre del gen.

21.- El microorganismo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el primer azúcar es un azúcar de hexosa y el segundo azúcar es un azúcar de pentosa.