JP2013511276A - 有機酸を生産する大腸菌株の代謝的進化 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2009年11月18日に出願された米国仮出願61/281,483の優先権を主張する。
この発明は、米国エネルギー省から承認された協定の下での米国政府支援で承認番号DE−EE0002878/001で行われた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
「Top value added chemicals from biomass」と題する2004年の米国エネルギー省の報告は、生体触媒を用いて再生可能な原料から生産することができる12の化学的成分を同定した。その12の糖ベースの成分は、1,4−二酸(コハク酸、フマル酸、およびリンゴ酸)、2,5−フランジカルボン酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、アスパラギン酸、グルカル酸、グルタミン酸、イタコン酸、レブリン酸、3−ヒドロキシブチロラクトン、グリセロール、ソルビトール、およびキシリトール/アラビニトールである。
遺伝学的に修飾され、そして、炭素の供給源としてグルコースを含有する最小増殖培地において発酵性のプロセスを通して商業的に意味のある量の有機酸を生産することに最適化された微生物が、最初に最適化された有機酸生産比率を維持しながら、炭素の供給源として複数の糖を同時に使用するためにさらに代謝的に進化することができることを我々は意外にも発見した。
本発明は、組換え微生物によって、炭素化合物の発酵から、商業的に意味のある量において有機酸を生産するためのプロセスを提供する。より具体的には、この本発明は、発酵性のプロセスを通した有機酸の生産に適した微生物を提供する。本発明の微生物は、有機酸の商業的に意味のある量の生産のための発酵性のプロセスにおいて複数の糖を使用する能力を保有する。
一般的注釈
株および接種材料調製:
KJ122(大腸菌(E.coli)C、ΔldhA、ΔadhE、ΔackA、ΔfocA−pflB、ΔmgsA、ΔpoxB、ΔtdcDE、ΔcitF、ΔaspC、ΔsfcA)が、本発明において使用された。KJ122は、Jantama et al(2008a; 2008b)、および特許協力条約の下で公開される国際特許出願である国際公開WO2008/115958およびWO2010/115067によって説明される遺伝学的修飾を通した大腸菌(E.coli)C(ATCC 8739)株に由来した。これらの全て文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
典型的にはエネルギーのために燃やすことによって使用される廃棄産物であるサトウキビバガスは、フロリダの製糖所からから得られる。この廃棄産物は、希酸前処理を用いるヘミセルロースおよびセルロース分画の調製のための開始材料として使用される。
C5利用
大腸菌(Escherichia Coli)株KJ122(大腸菌(E.coli)C、ΔldhA、ΔadhE、ΔackA、ΔfocA−pflB、ΔmgsA、ΔpoxB、ΔtdcDE、ΔcitF、ΔaspC、ΔsfcA)は、グルコース、キシロース、およびアラビノース上で好気的に増殖することができた。本発明の目的は、ヘキソースおよび他のペントース糖の両方を含有する培地において微好気的に大腸菌(E.coli)のKJ122株を増殖させること、および両方のタイプの糖を同時に使用することができる生物を選択することである。
KJ122の代謝的進化
本発明の別の実施態様において、KJ122株は、代謝的進化にさらされた。キシロース糖を補った液体AM1培地において微好気的に増殖するKJ122培養物は、2週間の期間、24時間ごとに、8%キシロースを含有する新鮮液体AM1培地に移動された。これら複数の移動の最後に、KJ122株は、8%キシロースを補ったAM1培地を有する新鮮発酵槽に移動された。発酵槽におけるKJ122の嫌気性増殖比率、ならびにコハク酸生産、およびキシロース利用の動力学が、観測された。発酵槽におけるコハク酸生産は、任意の遅延期なしに直ちに開始し、そして、より高い最終力価も産出し、そして、この株は、「代謝的に進化した株」と呼ばれる。我々の株コレクションにおいて、この代謝的に進化した株は、TG400として呼ばれてきた。
C5+C6共発酵
嫌気性増殖条件下におけるKJ122において、C5およびC6糖は、同時に代謝されない。C6糖は、一般的には最初に代謝され、そして、C5代謝に先立ち遅延が示される。したがって、同等量のC6およびC5糖の両方の存在下でのTG400の発酵特徴を測定することは必須であった。図4において示されるように、TG400は、同一の比率で、グルコースおよびキシロースを使用することができ、そして任意の遅延期なしにコハク酸を生産した。KJ122は、キシロースおよびグルコースの両方を使用することもできた。しかしながら、KJ122株において、キシロース利用は、グルコース濃度における実質的な減少の後でのみ開始した。さらに、表3に示されるように、KJ122によるキシロースおよびグルコース利用と比べた場合、TG400は、グルコースよりも、モル基準においてより多くのキシロースを使用した。
C5糖が豊富な解毒したバガス加水分解物の発酵
代謝的進化を通して得られたTG400株は、バガスの加水分解に由来するキシロースを使用するためのその能力について試験された。濃縮バガス加水分解物は、200rpmでのロータリーシェーカーにおいて、35℃で60分間、バガス加水分解物の各キログラムについて50グラムの木炭でそれを処理することによって解毒した。活性炭処理したC5 豊富バガスは、pH調節し、AM1無機塩、ベタイン、および微量元素を補い、そして、ろ過滅菌した。加水分解物は、最初に、8%(w/v)キシロース(C5)、および約0.8%グルコース(C6)、0.1%ガラクトース(C6)、0.1%マンノース(C6)、および0.002%アラビノース(C5)を含んだ。濃縮した解毒C5糖が豊富なバガス加水分解物は、さらに2.5%w/vコーンスティープリカーを補い、そして、0.5の初期OD550nmにTG400株に接種した。図5に示される結果が指し示すように、120時間以内で、培養培地における全ての糖が、消費され、そして、コハク酸塩が安定的に生産された。
大腸菌(Escherichia Coli)のKJ122、およびTG400株のゲノムのシーケンシング
親株KJ122および代謝的進化を通してKJ122に由来するTG400株の全体のゲノムが、ボストン、マサチューセッツ州、USAのタフツ(Tufts)大学コア施設(Core Facility)で、Illumina Genome analyzer IIを用いて配列決定された。Genome analyzer IIは、Illumina sequencing technologyによって提供される。KJ122およびTG400について得られるゲノムのデータは、KJ122からのTG400の代謝的進化を伴う遺伝学的変更を同定するために、他のそれぞれと比較された。TG400およびKJ122の比較分析は、TG400のgalP遺伝子における変異的変更を明らかにした。TG400におけるgalP遺伝子は、そのオープンリーディングフレームのヌクレオチド位置889で点変異を示した。この位置でのシトシンヌクレオチドは、グアノシン残基に変更していた。このヌクレオチド変更の結果として、アミノ残基グリシンは、アスパラギン酸塩に変更していた。galP遺伝子におけるこの変異は、galP*と呼ばれる。この変異は、ヌクレオチドレベルで、バクテリアのKJ122およびTG400株の間での唯一の相違であった。
TG400およびKJ122におけるgalP遺伝子配列のPCR および配列分析
キシロースおよびグルコースを同時に使用する能力を説明するTG400株におけるgalP遺伝子配列に変異があることを確立し、我々は、KJ122およびTG400からgalP遺伝子を得るために、PCR技術を使用した。TG400から得られたPCR産物、ならびにKJ122からのPCR産物が、配列決定された。配列データは、位置296におけるグリシン残基をアスパラギン酸塩残基に変更する(Gly296をAspへ)点変異を明らかにした。
galP遺伝子欠失の効果
グルコースおよびキシロースを同時に使用する能力を伴うTG400におけるgalP遺伝子変異があることを確立し、我々は、全体galP遺伝子の欠失が、変異したgalP遺伝子を有するTG400に見られるものと同一の表現型の効果を有するかどうか測定することを決定した。これらの実験において、我々は、親株として大腸菌(E.coli)のKJ122を使用した。
キシロース利用に対するgalPにおけるG297D点変異の効果
炭素の唯一の供給源としてキシロースを含有する発酵培地における増殖およびコハク酸塩生産に対する、G297D(GalPタンパク質における位置297におけるグリシン残基のアスパラギン酸塩残基との交換)をもたらす点変異の効果を検討するために、G297D変異が、KJ122株におけるgalP遺伝子配列に導入された。SI014(KJ122ΔgalP::galP*)は、プライマー17ASPgalP(配列番号9)および18SPgalP(配列番号10)を用いてG400から変異体galP*遺伝子をPCR増幅させて、そして、温度条件付きプラスミドであるpKD46からラムダレッドリコンビナーゼを発現するWG35(KJ122 ΔgalP::kan−sacB)内で組換えさせることによって作出された。プラスミドpKD46は、次に、昇温での増殖によって除去された(Datsenko and Waner,2000)。
全ての参考文献は、読み手の便宜のために掲載される。それぞれの参考文献は、参照によってその全体が組み込まれる。
Claims (21)
- galP遺伝子における変異を含むバクテリア細胞であって、前記バクテリア細胞は、C5およびC6糖を同時に利用する、細胞。
- 前記バクテリア細胞が、大腸菌(Escherichia Coli)、シトロバクター・フロインディイ(Citrobactor freundii)、グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans)、グルコノバクター・アサイイ(Gluconobacter asaii)、アクロモバクター・デルマーベ(Achromobacter delmarvae)、アクロモバクター・ビスコーサス(Achromobacter viscosus)、アクロモバクター・ラクティカム(Achromobacter lacticum)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacteriumtumefaciens)、アグロバクテリウム・ラジオバクター(Agrobacteriumradiobacter)、アルカリゲネス フェカリス(Alcaligenesfaecalis)、アルスロバクター・シトレウス(Arthrobacter citreus)、アルスロバクター・トゥメセンス(Arthrobacter tumescens)、アリスロバクター・パラフィニス(Arthrobacter paraffineus)、アルスロバクター・ヒドロカーボグルタミカス(Arthrobacter hydrocarboglutamicus)、アルスロバクター・オキシダンス(Arthrobacter oxydans)、オウレオバクテリウム(Aureobacterium)サペルダエ(saperdae)、アゾトバクター インディカス(Azotobacter indicus)、ブレビバクテリウムアンモニアジェネス(Brevibacteriumammoniagenes)、ディバリカツム(divaricatum)、ブレビバクテリウムラクトファーメンツム(Brevibacteriumlactofermentum)、ブレビバクテリウムフラバム(Brevibacteriumflavum)、ブレビバクテリウムグロボサム(Brevibacteriumglobosum)、ブレビバクテリウムフスカム(Brevibacteriumfuscum)、ブレビバクテリウムケトグルタミクム(Brevibacteriumketoglutamicum)、ブレビバクテリウムヘルコルム(Brevibacteriumhelcolum)、バクテリウム・プシルム(Brevibacteriumpusillum)、ブレビバクテリウムテスタセウム(Brevibacteriumtestaceum)、ブレビバクテリウム・ロゼウム(Brevibacteriumroseum)、ブレビバクテリウム・イマリオフィリカム(Brevibacteriumimmariophilium)、ブレビバクテリウム・リネンス(Brevibacteriumlinens)、ブレビバクテリウム・プロトファルミエ(Brevibacteriumprotopharmiae)、コリネバクテリウム・アセトフィラム(Corynebacterium acetophilum)、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム(Corynebacterium acetoacidophilum)、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム(Corynebacterium acetoglutamicum)、エンテロバクター・アエロゲネス(Eenterobacter aerogenes)、エルウィニア・アミロボーラ(Erwinia amylovora)、エルウィニア・カロトボーラ(Erwinia carotovora)、エルウィニア・ヘルビコーラ(Erwinia herbicola)、エルウィニア・クリサンテミ(Erwinia chrysanthemi)、フラボバクテリウム・ペレグリナム(Flavobacteriumperegrinum)、フラボバクテリウム・フカタム(Flavobacteriumfucatum)、フラボバクテリウム・アウランティナム(Flavobacteriumaurantinum)、フラボバクテリウム・レナヌム(Flavobacteriumrhenanum)、フラボバクテリウム・セワネンセ(Flavobacteriumsewanense)、フラボバクテリウム・ブレベ(Flavobacteriumbreve)、フラボバクテリウム・メニンゴセブチクム(Flavobacteriummeningosepticum)、マイクロコッカス(Micrococcus)sp.CCM825、モーガネラ・モーガニイ(Morganella morganii)、ノカルジア・オパカ(ノカルジア・オパカ(Nocardia opaca))、ノカルジア・ルゴサ(nocardia rugosa)、プラノコッカス・ユーシナタス(Planococcus eucinatus)、プロテウス・レッゲリ(Proteus rettgeri)、プロピオニバクテリウム・セルマニ(Propionibacteriumshermanii)、シュードモナス・シンキサンサ(Pseudomonas synxantha)、シュードモナス・アゾトフォルマンス(Pseudomonas azotoformans)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・オバリス(Pseudomonas ovalis)、シュードモナス・スタッツェリ(Pseudomonas stutzeri)、シュードモナス・アシドボランス(Pseudomonas acidovolans)、シュードモナス・ムシドレンス(Pseudomonas mucidolens)、シュードモナス・テストステロニ(Pseudomonas testosteroni)、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)、ロドコッカス・ロドクロラス(Rhodococcus rhodochrous)、ロドコッカス(Rhodococcus)sp.ATCC 15592、ロドコッカス(Rhodococcus)sp.ATCC 19070、スポロサルシナ・ウレア(Sporosarcina ureae)、スタフィローコッカス・オーリーアス(Staphylococcus aureus)、ビブリオ・メッシュニコビ(Vibrio metschnikovii)、ビブリオ・チロゲネス(Vibrio tyrogenes)、アクチノマヅラ・マヅレ(Actinomadura madurae)、アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス(Actinomyces violaceochromogenes)、キタサトスポリア・パルロサ(Kitasatosporia parulosa)、ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)、ストレプトマイセス・フラベラス(Streptomyces flavelus)、ストレプトマイセス・グリセオラス(Streptomyces griseolus)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、ストレプトマイセス・オリバセウス(Streptomyces olivaceus)、ストレプトマイセス・タナシエンシス(Streptomyces tanashiensis)、ストレプトマイセス・バージニエ(Streptomyces virginiae)、ストレプトマイセス・アンチバイオチクス(Streptomyces antibioticus)、ストレプトマイセス・カカオイ(Streptomyces cacaoi)、ストレプトマイセス・ラベンジュレ(Streptomyces lavendulae)、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridochromogenes)、アエロモナス・サルモニシダ(Aeromonas salmonicida)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・シルクランス (Bacillus circulans)、バチルス・チアミノリティカス(Bacillus thiaminolyticus)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliqyefaciens)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、エシェリキア・フロインディ(Escherichia freundii)、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacteriumammoniaphilum)、セラシア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、サルモネラ・ショットムレリ(Salmonella schottmulleri)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumonia)およびキサントモナス・シトリ(Xanthomonas citri)からなる群から選択される、請求項1のバクテリア細胞。
- galP遺伝子における変異が点変異である、請求項1のバクテリア細胞。
- 前記バクテリア細胞が、大腸菌(Escherichia Coli)であり、galP遺伝子における前記変異が位置889におけるヌクレオチドシトシンのヌクレオチドチミンへの交換を含む、請求項1のバクテリア細胞。
- 前記バクテリア細胞が大腸菌(Escherichia Coli)であり、galP遺伝子における前記変異が位置297におけるグリシン残基のアスパラギン酸塩残基への交換を含む、請求項1のバクテリア細胞。
- galP遺伝子における前記変異が欠失である、請求項1のバクテリア細胞。
- PEP−依存性ホスホトランスフェラーゼ系の活性を減少させる少なくとも1つの変異をさらに含む、請求項1のバクテリア細胞。
- PEP−依存性ホスホトランスフェラーゼ系の活性を減少させる少なくとも1つの変異、および少なくとも1つの非−PTS糖輸送体の活性を増大させる少なくとも1つの変異をさらに含む、請求項1のバクテリア細胞。
- 前記非−PTS糖輸送体がATP結合カセット輸送体のメンバーである、請求項8のバクテリア細胞。
- 前記非−PTS糖輸送体が主要ファシリテータースーパーファミリーのメンバーである、請求項8のバクテリア細胞。
- 発酵経路にかかわる1または複数の遺伝子の発現を不活性化する少なくとも1つの変異をさらに含む、請求項1のバクテリア細胞。
- トリカルボン酸サイクルと関連する1または複数の遺伝子を不活性化する少なくとも1つの変異をさらに含む、請求項1のバクテリア細胞。
- ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子、NADH 依存性リンゴ酸酵素をコードする遺伝子、およびNADPH依存性リンゴ酸酵素をコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の少なくとも1つにおける変異をさらに含む、請求項1のバクテリア細胞。
- 外因性ピルビン酸カルボキシラーゼをさらに含む、請求項のバクテリア株。
- 前記ピルビン酸カルボキシラーゼが、ラクトバチルス・ラクチス(Lactobacillus lactis)、またはソルガム・ブルガレ(Sorghum vulgare)、またはリゾビウム・エトリ(Rhizopium etli)からのものである、請求項14のバクテリア株。
- 増大したホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性をさらに含む、請求項1のバクテリア細胞。
- 増大したレベルのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性がpck 遺伝子における変異に起因する、請求項16のバクテリア細胞。
- 前記変異が前記pck遺伝子のプロモーター領域中にある、請求項17のバクテリア細胞。
- 有機酸の微生物の生産のためのプロセスであって、
a. galP遺伝子における変異を有するバクテリア細胞を提供すること、ここで前記バクテリア細胞は、ペントースおよびヘキソース糖を同時に利用する;
b. ペントースおよびヘキソース糖の両方を同時に含有する培地において、工程(a)のバクテリア細胞を培養すること;ならびに
c. 培養培地から有機酸を随意的に回収すること、
を含むプロセス。 - 変異した非−PTS糖輸送体を含むバクテリア細胞であって、前記変異した糖輸送体は、前記遺伝子の野生型対立遺伝子を含む前記バクテリア細胞と比較して、第一の糖における増殖の比率を減少させる、および第二の糖における増殖の比率を増大させる、バクテリア細胞。
- 前記第一の糖がヘキソース糖であり、第二の糖がペントース糖である、請求項20におけるような微生物。
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