BRPI1009992A2 - células bacterianas - Google Patents

Abstract

CÉLULAS BACTERIANAS. A presente invenção refere-se aos biocatalisadores para a produção eficiente de ácido succínico e/ou outros produtos de matérias-primas de alimentação biológicas renováveis. Os biocatalisadores têm uma eficiência muito alta pela produção acoplada ao crescimento de ácido succínico e/ou outros produtos de matérias-primas de alimentação de carboidrato como um resultado de ambas manipulações genéticas e evolução metabólica. Mais especificamente, certos biocatalisadores da presente invenção produzem ácido succínico a títulos altos e produzem em sais minerais, meios durante a fermentação em batelada, controlada por pH, simples sem a adição de qualquer material genético exógeno. As manipulações genéticas da presente invenção estão relacionadas às estratégias de conservação de energia acopladas com a eliminação de rotinas alternativas para oxidação de NADH diferente das rotinas para a produção de ácido sucínico. Os biocatalisadores contêm fosfoenol piruvato carboxicinase gliconeogênica reprimida por glicose (pck) desreprimida por modificações genéticas e um sistema de fosfotransferase geneticamente inativado. Em termos da eficiência de produção de ácido succínico, os biocatalisadores da presente invenção são funcionalmente equivalentes ao succinato produzindo bactérias rumen tais como Actinobacillus succinogens e Mannheimia succiniproducens com uma diferença que os biocatalisadores podem alcançar este nível alto de produção de ácido sucínico em um meio de sal mínimo com fonte de carboidrato ao invés da exigência de meios ricos para a produção de ácido sucínico por bactérias rumen.

Description

v .: Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CÉLULAS BACTERIANAS". . REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS . Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório U.S. No. Serial 61/166.093, depositado no dia 2 de abril de 2009. Este pedido tam- ” bém é uma continuação-em-parte do Pedido U.S. No. Serial 12/529.826, depositado em 3 de setembro de 2009, que é o pedido de estágio nacional U.S. PCT/US2008/057439, depositado em 19 de março de 2009, que reivin- dica o benefício do Pedido Provisório U.S. No. Serial 60/895.806, depositado em20de março de 2007, a descrição de cada dos quais está por este meio incorporada por referência em sua totalidade, incluindo todas as figuras, ta- belas e sequências de ácido nucleico ou aminoácido.

APOIO DO GOVERNO Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob uma conces- são premiada do Departamento de Energia sob o número de concessão USDOE-DE FG02-96ER20222 e Departamento de Energia junto com o De- partamento dos Estados Unidos de Agricultura sob o número de concessão USDA & DOE Biomass RDI DE FG36-04GO14019. O governo tem certos direitos na invenção. —ANTECEDENTE DA INVENÇÃO A presente invenção está no campo da produção de ácido suc- cínico de matérias-primas de alimentação biológicas renováveis usando bio- catalisadores microbianos. Esta invenção descreve as modificações genéti- cas aos biocatalisadores que são úteis no alcance da alta eficiência para produção de ácido succínico. Mais especificamente, esta invenção fornece biocatalisadores geneticamente modificados que são adequados para a pro- dução de ácido succínico de matérias-primas de alimentação renováveis em quantidades comercialmente significantes. Um relato do 2004 U.S. Department of Energy intitulado "Top va- lue added chemicais from biomass" identificou doze substâncias químicas de bloco de edifício que podem ser produzidas de matérias-primas de alimenta- ção renováveis. Os doze blocos de construção com base em açúcar são 1,4-

: diácidos (succínico, fumárico e maleico), ácido 2,5-furandicarboxílico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido aspártico, ácido glucárico, ácido glutâmico, ácido . itacônico, ácido levulínico, 3-hidroxibutirolactona, glicerol, sorbitol, e xili- : tol/arabinitol. A produção fermentativa destas substâncias químicas de bloco de construção de matérias-primas de alimentação renováveis ficará crescen- . temente competitiva quando os preços do petróleo aumentarem.

Estas substâncias químicas de bloco de construção são molécu- las com grupos funcionais múltiplos que possuem o potencial a ser transfor- mado em novas famílias de moléculas úteis. Estas doze substâncias quími- casde blocos de construção podem ser convertidas subsequentemente em vários materiais ou substâncias químicas bio-baseadas de alto valor. Por exemplo, succinato pode servir como um substrato para transformação em plásticos, solventes, e outras substâncias químicas atualmente feitas de pe- tróleo (Lee e outro, 2004; Lee e outro, 2005; McKinlay e outro, 2007; Wen- dische outro, 2006; Zeikus e outro, 1999). Muitas bactérias foram descritas com a capacidade natural de produzir succinato como um produto de fer- mentação principal (Tabela 1). Entretanto, processos complexos, meios de crescimento caros e tempos de incubação longos são exigidos frequente- mente para produzir ácido succínico destes micro-organismo produtores de ácido succínico de ocorrência natural.

Uma variedade de métodos genéticos foi usada previamente pa- ra criar cepas de Escherichia coli para produção de succinato com graus variados de sucesso (Tabela 1). Na maioria dos estudos, títulos obtidos fo- ram baixos e ingredientes médios complexos tal como extrato de levedura oulicormacerado de milho foram requeridos. Cepa de E. coli NZN111 pro- duziu o succinato a 108 mM com um rendimento molar de 0,98 mol de suc- cinato por mol de glicose metabolizada (Chatterjee e outro, 2001; Millard e outro, 1996; Stols e Donnelly, 1997). Esta cepa foi criada inativando-se dois genes (pfilB codificando piruvato-formiato liase e IdhA codificando lactato de- — sidrogenase), e super-expressando dois genes de E. coli, malato desidroge- nase (mdh) e fosfoeno!l piruvato carboxilase (ppc), de plasmídeos de múlti- plas cópias. Cepa de E. coli HL27659Kk foi criada mutando-se succinato desi-

: drogenase (sdhAB), fosfato acetiltransferase (pta), acetato cinase (ackA), piruvato oxidase (poxB), transportador de glicose (písG), e o repressor de . isocitrato liase (iclIR). Esta cepa produziu menos que 100 mM de succinato e : condições de fermentação limitada a oxigênio requerida (Cox e outro, 2006; Line outro, 2005a,2005b, 2005c; Yun e outro, 2005). Análise de metabolis- Ê mo in silico foi usada para projetar nocautes de gene para criar uma série de reação em E. coli que é análoga à série de reação de succinato nativo em Mannheimia succiniciproducens (Lee e outro, 2005 e 2006). Entretanto, a cepa resultante produziu muito pouco succinato. Andersson e outro, (2007) informou os níveis mais altos de produção de succinato por E. coli criado (339 mM) contendo apenas os genes nativos.

Outros investigadores procuraram métodos alternativos que ex- pressam genes heterológos expressos em E. coli. A piruvato carboxilase (pyc) de Rhizobium eteloti foi superexpressa a partir de um plasmídeo de múltiplas cópias para direcionar o fluxo de carbono ao succinato. (Gokamn e outro, 2000; Vemuri e outro, 2002a, 2002b). Cepa SBSS550MG foi construído inativando-se o repressor de isocitrato liase (iclR), adhE, IdhA, e ackA, e su- perexpressando-se o Bacillus subtilis citZ (citrato sintase) e R. etli pyc de um plasmídeo de múltiplas cópias (Sanchez e outro, 2005a). Com esta cepa, —succinato a 160 mM foram produzidos de glicose com um rendimento molar de 1,6.

Processos mais complexos também foram investigados para a produção de succinato (Tabela 1). Muitos destes processos incluem uma fase de crescimento aeróbica seguida por uma fase de produção anaeróbi- ca A fase anaeróbica é provida frequentemente com gás carbônico, hidro- gênio, ou ambos (Andersson e outro, 2007; Sanchez e outro, 2005a e 2005b; Sanchez e outro, 2006; Patente U.S. 5.869.301; Vemuri e outro, 2002a e 2002b). Em um recente estudo com um produtor de succinato nati- vo, A. succiniciproducens, eletrodiálise, pulverização com CO;, reciclagem de célula, e alimentaçãoem batelada foram combinados para a produção de ácido succínico de glicose em rendimento, título e produtividade altos (Mey- nial-Salles e outro, 2007).

: A maioria sem dúvida do conhecimento científico de E. coli é de- rivado de investigações em meio complexo tal como caldo de Luria em vez . do meio de sais minerais usando baixas concentrações de substratos de - açúcar (tipicamente 0,2% em p/v; 11 mM) em vez dos 5% (p/v) de glicose (278mM)e10% (p/v) de glicose (555 mM) usados nos estudos relatados * aqui. Quantidades grandes de açúcar são exigidas para produzir níveis co- mercialmente significantes de produto. Investigadores prévios descreveram a construção de muitos derivados de E. coli para a produção de succinato em meio complexo (Tabela 1). Com médio complexo, o projeto racional com base em séries de reações primárias teve razoavelmente êxito por demons- trações acadêmicas de engenharia metabólica. Entretanto, o uso de nutrien- tes complexos para produção de produtos de fermentação bacterianos au- menta o custo de materiais, o custo de purificação, e o custo associado com remoção residual. O uso de meio de sais minerais sem componentes de meios complexos deveria ser de custo muito mais eficaz.

E. coli C cresce bem em meio de sais minerais de NBS contendo glicose e produz uma mistura de lactato, acetato, etanol e succinato como produtos de fermentação (figura 1A; Tabela 4). Em comparação com outros estudos com E. coli (Tabela 1), os estudos relatados aqui focalizaram no desenvolvimento de cepas que podem converter nível alto de açúcares em succinato usando meio de sais minerais para minimizar os custos de materi- ais, purificação de succinato, e remoção residual.

Um aspecto da invenção fornece várias cepas de E. coli que produzm succinato em rendimentos e títulos altos em meios de sais minerais durante fermentações em batelada, de controle de pH, isoladas sem a ne- cessidade de genes heterólogos ou plasmídeos. Os inventores identificaram surpreendentemente vários genes úteis na manipulação genética de biocata- lisadores para alcançar eficiência alta para produção de ácida succínico.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO É um objetivo da presente invenção fornecer um método para obter um biocatalisador para ácido succínico industrial usando matérias- primas de alimentação biológicas. O método para obter os biocatalisadores à. para produção de ácido succínico de matérias-primas de alimentação bioló- gicas combina manipulações genéticas racionais e o processo de evolução * metabólica.

- Na geração de um biocatalisador para produção de ácido succí- nicode matérias-primas de alimentação biológicas, usando um projeto ra- f cional derivado de nosso conhecimento existente a cerca das séries de rea- ções metabólicas microbianas, um conjunto de genes dentro do cromos- soma bacteriano é inativado seguido pelo processo de evolução metabólica para selecionar uma cepa com fenótipo desejável.

Em um aspecto da presente invenção, a mutação dos genes no cromossoma bacteriano é realizada sem apresentar qualquer material gené- tico exógeno.

Em outro aspecto da presente invenção, a mutação dos genes endógenos é realizada introduzindo-se mutação pontual ou introduzindo-se um códon de interrupção na estrutura de leitura aberta do gene endógeno.

Em outro aspecto da presente invenção, a estrutura de leitura aberta inteira do gene endógeno é deletada do DNA cromossômico.

Em certas modalidades preferidas da invenção, a expressão de certos genes endógenos é aumentada significativamente. Em um aspecto da presente invenção, a transcrição do gene endógeno é aumentada por meio da introdução de certas mutações na região de promotor dos genes endóge- nos. Em outro aspecto da invenção, a transcrição do gene endógeno é real- çada por meio da substituição do controle repressivo do gene alvo.

Em certo aspecto da presente invenção, uma sequência de nu- cleotideo exógeno pode ser apresentada para inativar um gene alvo com a finalidade de selecionar uma cepa bacteriana com um gene mutado com fenótipo desejável. No aspecto mais preferido da presente invenção, a se- quência de nucleotídeo exógena introduzida no genoma microbiano é sub- sequentemente removida de forma contínua sem deixar para trás qualquer — sequência de nucleotídeo exógeno residual.

As manipulações genéticas racionalmente projetadas podem ser todas feitas em um único estágio ou em estágios múltiplos nos quais uma

: 6/129 é única alteração genética é realizada de uma vez. A cepa microbiana resul- tante de manipulações genéticas pode ser submetida à evolução metabólica . para melhorar o rendimento, título e produtividade volumétrica do ácido or- : gânico desejado. No aspecto mais preferido da presente invenção, as mani- —pulações genéticas racionais são feitas em estágios e o processo de evolu- : ção metabólica é realizado entre os estágios de manipulação genética.

Em uma modalidade da presente invenção, as mutações espon- tâneas que ocorrem durante a evolução metabólica são identificadas por sequenciamento das regiões apropriadas do DNA cromossômico. Em ainda —outramodalidade da presente invenção, as mutações que ocorrem durante a evolução metabólica são identificadas medindo-se as atividades de enzima suspeita.

Em uma modalidade da presente invenção, com base no projeto racional, um ou mais dos genes codificando para as proteinas conhecidas para funcionar nas séries de reações fermentativas são inativados por uma ou mais mutações.

Ainda outro aspecto da presente invenção, os genes que são homólogos funcionais dos genes que codificam para as proteínas que fun- cionam na série de reação fermentativa são inativados ao lado dos genes que codificam para as proteínas diretamente envolvidas na série de reação fermentativa.

Em uma modalidade da presente invenção, os genes que fun- cionam dentro do ciclo de TCA são geneticamente manipulados de forma que haja um fluxo aumentado de carbono para a produção de ácido succíni- co Em um aspecto da presente invenção, o fluxo de carbono por subdivisão redutiva do ciclo de TCA é realçado. Em outro aspecto da presente inven- ção, o fluxo de carbono por ramificação oxidativa do ciclo de TCA é geneti- camente manipulado. Em outro aspecto da presente invenção, o fluxo de carbono para ácido succínico é melhorado por manipulação genética da sé- riede reação de desvio de glioxalato intimamente associada com o ciclo de TCA.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, o fluxo de

: carbono de TCA para outras séries de reações metabólicas dentro da célula é bloqueado de forma que a mistura de carbono dentro da célula seja afuni- . lada para a produção de ácido succínico. - Em outra modalidade da presente invenção, o fluxo de carbono nociclodeTCA é realçado por manipulação genética que conduz a um den- tre mais enzimas de carboxilação dentro da célula. Em um aspecto da pre- sente invenção, a expressão de uma ou mais enzimas de carboxilação é obtida através da manipulação genética da região de promotor ou aliviando a repressão da expressão de gene.

Em outra modalidade da presente invenção, a mistura de fosfo- enol piruvato dentro da célula é conservada mutando-se aqueles genes en- volvidos na série de reação de captação de carbono que requer fosfoenol piruvato. Em um aspecto da presente invenção, o sistema de fosfotrans- ferase para captação de carbono é inativado para conservar o fosfoenol pi- —ruvato disponível para a operação do ciclo de TCA.

A presente invenção ilustra vários alvos que podem ser geneti- camente manipulados para alcançar uma produção de ácido succínico au- mentada. Todos estes vários alvos descritos na presente invenção podem ser geneticamente manipulados para alcançar uma produção de ácido suc- cínico melhorada. Na modalidade mais preferida, um número mínimo de al- vos é selecionado para manipulação genética para alcançar uma taxa dese- jável de produção de ácido succínico.

Na modalidade preferida da presente invenção, os biocatalisa- dores são selecionados quanto a sua capacidade de produzir ácido succíni- coem:fítulo, rendimento e produtividade volumétrica altos. No aspecto mais preferido da presente invenção, um biocatalisador capaz de produzir pelo menos 1,0 mol de ácido succínico para cada uma mol da fonte de carbono consumida é preferido.

Em outra modalidade mais preferida da presente invenção, o bi- —ocatalisador é selecionado durante a evolução metabólica quanto a sua ca- pacidade de produzir pelo menos 1,0 mol de ácido succínico para cada mol da fonte de carbono consumida em um meio de sal mineral e acoplando a

: produção de ácido succínico para o crescimento microbiano. Em ainda outra modalidade da presente invenção, os biocatali- . sadores capazes de produzir ácido succínico usando glicerol como uma ma- - téria-prima de alimentação são fornecidos.

Vantagem adicional desta invenção ficará facilmente evidente a partir da descrição detalhada resultante da invenção e dos exemplos forne- cidos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figuras 1A-1B. Fermentação de glicose para succinato. figura 1A mostra a série de reação padrão para fermentação de glicose por E. coli. Esta série de reação foi retirada de Unden e Kleefeld (2004). Setas em ne- grito representam séries de reações fermentativas centrais. As cruzes repre- sentam as deleções de gene realizadas neste estudo para criar KJ012 (IdhA, adhE, ackA). Genes e enzimas: /dhA, lactato desidrogenase; pflB, piruvato- formiato liase; focA, transportador de formiato; pta, fosfato acetiltransferase; ackA, acetato cinase; adhE, álcool desidrogenase; ppc, fosfoenolpiruvato carboxilase; pdh, complexo de piruvato desidrogenase; gltA, citrato sintase; mdh, malato desidrogenase; fumA, fumB, e fumC, isozimas de fumarase; frdABCD, fumarato redutase; fdh, formiato desidrogenase; icd, isocitrato de- sidrogenase; acs, acetil-CoA sintetase; mgsA, metilglioxal sintase; poxB, piruvato oxidase; a/dA, aldeido desidrogenase; e aldB, aldeído desidrogena- se. figura 1B mostra o acoplamento da produção de ATP e crescimento pa- ra produção de succinato em cepas criadas de E. coli para um série de rea- ção padrão para fermentação de glicose. Setas sólidas conectam as mistu- rasde NADH. Setas pontilhadas conectam as misturas de NAD+. Durante a glicólise sob condições anaeróbicas, o crescimento é obrigatoriamente aco- plado à produção de ATP e à oxidação de NADH. Figuras 2A-2D. Séries de reações de carboxilação potenciais para produção de succinato por E. coli. Genes codificando enzimas de car- —boxilação fundamentais são mostrados em tipo negrito. figura 2A mostra a reação catalisada pela enzima fosfoenolpiruvato (PEP) carboxilase (PPC). Nenhum ATP é produzida da carboxilação de fosfoenolpiruvato (PEP) pela enzima PPC. Isto é considerado como a rotina primária para a produção de succinato por E. coli durante a fermentação de glicose. figura 2B mostra a . enzima málica dependente de NADH. Energia é conservada durante a pro- : dução de ATP de PAD e PEP por piruvato cinase (pykA ou pykF). Enzima —málica(sfcA) catalisa uma carboxilação redutiva ligada por NADH para pro- í duzir malato. figura 2C mostra a enzima málica dependente de NADPH. E- nergia é conservada durante a produção de ATP de PAD e PEP por piruvato cinase (pykA ou pykF). Enzima málica (maeB) catalisa uma carboxilação redutiva, ligada por NADPH para produzir malato. figura 2D mostra a reação catalisada por PEP carboxicinase (PCK). Energia é conservada pela produ- ção de ATP durante a carboxilação de PEP para produzir ácido oxaloacético.

Figuras 3A-3C. O crescimento durante a evolução metabólica de KJ012 para produzir KJ017, KJO32, e KJO6O. Cepa KJO012 foi transferida sequencialmente em meio de NBS contendo 5% (p/v) (figura 3A) e 10% (p/v) (figura 3B) de glicose, respectivamente para produzir KJ017. Depois da de- leção de focA e pflB, a cepa resultante (KJ032) foi inicialmente subcultivado em meio suplementado com acetato (figura 3C). Os níveis de acetato foram diminuídos e subsequentemente eliminados durante as outras transferências para produzir KJO60. A linha quebrada representa a fermentação por KJO17 sem acetato, adicionado para comparação. Símbolo: e = densidade óptica em ODssonm- Figuras 4A-4F. Resumo dos produtos de fermentação durante a evolução metabólica das cepas para produção de succinato. As culturas fo- ram suplementadas com acetato de sódio como indicado. Setas pretas re- presentam a transição entre as condições de fermentação como indicado por texto. Nenhum formiato e apenas quantidades pequenas de lactato foram detectados durante a evolução metabólica de KJ032. Nenhum formiato e lactato foram detectados durante a evolução metabólica de KJO70 e KJO072. Evolução metabólica de KJ012 para KJ0O17 no meio contendo 5% em p/v de glicose (figura 4A) e o meio contendo 10% em p/v de glicose (figura 4B). E- volução metabólica de KJO32 para KJO6GO em meio contendo 5% em p/v de glicose (figura 4C) e 10% em p/v de glicose (figura 4D). Evolução metabólica

: de KJO70 para KJO71 no meio contendo 10% de glicose (figura 4E). Evolu- ção metabólica de KJO72 para KJO73 no meio contendo 10% de glicose (fi- - gura 4F). Símbolos para Fig 4A-4F: = succinato; 1, formiato; A, acetato; à, - malato; +, lactato; e V, piruvato Figura 5. Diagrama que resume as etapas na engenharia gené- ' tica e evolução metabólica de E. coli C como um biocatalisador para produ- ção de succinato. Este processo representa 261 transferências seriais que fornecem mais de 2000 gerações de seleção com base no crescimento. Os clones foram isolados da cultura final de cada regime e as designações de cepanomeadas, mostradas em parêntese na Tabela 4.

Figura 6. Série de reação para a fermentação de glicose-6- fosfato com séries de reações associadas mostrando os genes que foram deletados deliberadamente em construções criadas para a produção de suc- cinato. Setas sólidas representam séries de reações fermentativas centrais.

Setatracejada representa a série de reação microaerofílica para a oxidação de piruvato para acetato. Setas pontilhadas mostram séries de reações in- cluindo a desvio de glioxalato que normalmente funciona durante o metabo- lismo aeróbico. Cruzes em caixa representam as três deleções de gene ini- ciais ((dhA, adhE, ackA) que foram usadas para construir KJ012 e KJO17.

Cruzes comuns marcam os genes adicionais que foram deletados durante a construção de derivado de KJO017: KJO32 (IdhA, adhE, ackA, focA, pflB), e KJO70 (IdhA, adhE, ackA, focA, pflB, mgsA), e KJO72 (IdhA, adhE, ackA, fo- CA, pflB, mgsA, poxB). Genes e enzimas: /dhA, lactato desidrogenase; focA, transportador de formiato; pflB, piruvato-formiato liase; pta, fosfato acetil- transferase; ackA, acetato cinase; adh£E, álcool desidrogenase; ppc, fosfoe- nolpiruvato carboxilase; pdh, complexo de piruvato desidrogenase; gltA, ci- trato sintase; mdh, malato desidrogenase; fumA, fumB, e fumC, isozimas de fumarase; frdABCD, fumarato redutase; fdh, formiato desidrogenase; mgsA, metilglioxal sintase; g/oAB, glioxilase | e Il; poxB, piruvato oxidase; aceA, isocitrato liase; aceB, malato sintase; acnAB, aconitase; e acs, acetil-CoA sintetase.

Figuras 7A-7C. Produção de succinato e malato em meio de sal

À mineral com 10% de glicose (p/v) por derivados de E. coli C. figura 7A mos- tra a produção de succinato por KJO6O0 em meio de AM1. figura 7B mostra a - produção de succinato por KJO73 em meio de AM1. figura 7C mostra a pro- - dução de malato por KJO71 em médio de NBS. Fermentações foram inocu- ladasem um nível de 33 mg de DCW "!. Símbolos para Figura 7A-7C: o, f glicose; e, succinato; =, malato; A, massa celular.

Figura 8. Etapas envolvidas na construção do plasmídeo PLOI4162. Setas sólidas curtas associadas com pELO4 e pLOI4152 repre- sentam iniciadores usados para amplificação de DNA. Figura 9. Produção de succinato de glicose-6-fosfato em KJ073. O gene pck que codifica fosfoenolpiruvato carboxicinase, a enzima de car- boxilação primária envolvida na produção de succinato neste estudo, é mos- trada em tipo reverso. Setas sólidas indicam reações esperadas ser funcio- nais durante a fermentação anaeróbica de glicose. Cruzes sólidas indicam genes deletados. Cruzes em caixa representam as deleções fundamentais usadas para construir a cepa inicial para a produção de succinato, KJO17 (IdhA, adhE, ackA). A linha tracejada representa a oxidação de piruvato para acetato por PoxB, um processo que é tipicamente funcional apenas sob condições microaerofílicas. As linhas pontilhadas indicam reações que estão principalmente associadas com o metabolismo aeróbico. Genes e enzimas: IdhA, lactato desidrogenase; pflB, piruvato-formiato liase; focA, transportador de formiato; pta, fosfato acetiltransferase; ackA, acetato cinase; adhE, álcool desidrogenase; pck, fosfoenolpiruvato carboxicinase; pdh, complexo de piru- vato desidrogenase; gltA, citrato sintase; mdh, malato desidrogenase; fumA, fumB,efumC, isozimas de fumarase; frdABCD, fumarato redutase; fdh, for- miato desidrogenase; icd, isocitrato desidrogenase; acs, acetil-CoA sinteta- se; mgsA, metilglioxal sintase; poxB, piruvato oxidase; aldA, aldeido desi- drogenase; e aldB, aldeído desidrogenase. O gene fdcE (piruvato formiato- liase, homólogo para pflB) e gene tcdD (propionato cinase, homólogo para —ackA)são mostrados em parêntese e são expressos tipicamente durante a degradação de treonina.

Figura 10. Porção expandida do metabolismo ilustrando as sé-

: 12/129 : ries de reações de genes adicionais que foram deletados (cruzes sólidas). Succinato e acetato são produtos principais (em caixa) de fermentações de " KJ073. Genes e enzimas: citDEF, citrato liase; gltA, citrato sintase; aspC, aspartato aminotransferase; pck, fosfoenolpiruvato carboxicinase; sfcA, en- zimamálica ligada à NAD+; fumA & fumB, fumarase; frdABCD, fumarato re- ' dutase; pykA & pykF, piruvato cinase; tdcE, piruvato formiato-liase (homólo- go para pflB); pta, fosfato transacetilase; tcdD, acetato cinase (homólogo para ackA). Figura 11. Fermentação de glicose em cepas de E. coli criadas para produção de succinato.

As 5 estrelas sólidas indicam etapas metabóli- cas que foram bloqueadas construindo-se as deleções.

As 2 estrelas abertas indicam etapas metabólicas que foram bloqueadas por mutações adquiridas durante a evolução metabólica.

Setas pontilhadas indicam atividades não funcionais ou fracamento funcionais em mutantes produtores de succinato (KJO60 e KJO73). Setas em negrito na direção vertical indicam a série de reação primária para produção de succinato em KJO60 e KJO073. Esta série de reação é funcionalmente equivalente àquela de bactérias rumen produto- ras de succinato.

O dois genes galP e pck foram transcricionally ativados durante o desenvolvimento de cepa.

Uma deleção em pts! é adquirido duran- teaseleçãocom base no crescimento (estrela aberta), inativando-se o sis- tema de glicose fosfotransferase nativo para captação e fosforilação.

GalP foi subsequentemente encontrado para servir como o transportador primário para glicose com fosforilação dependente de ATP por glicocinase (glk). Figuras 12A-12C.

Comparação de abundância de transcrição das cepas produtoras de succinato criadas.

FIG 12A mostra a abundância relativa de transcrições para os genes pck, ppc, SfcA e maeB em cepas ATCC8739, KJ012, KJ017, KJO6O, KJO71 e KJO73 de E. coli.

FIG 12B mos- tra a abundância relativa das transcrições para os genes relatados para a utilização de glicose especialmente cyaA, crp, ptsG, galP e glk em cepas ATCC8739, KJO12, KJ0O17, KJOSO, KJO71 e KJO73 de E. coli.

FIG 12C mos- tra a abundância relativa das transcrições para os genes pfs/ e gene crr nas cepas ATCC8739, KJ012, KJ017, KJO6O, KJO71 e KJO73 de E. coli.

Figura 13. Metabolismo anaeróbico de E. coli usando a série de reação de fermentação ácida misturada. (Bock & Sawers, 1996). A série de . reação de ácido misturada nativa é mostrada com setas pretas. As reações adicionais para captação de glicose, carboxilação, e síntese de acetil-CoA são mostradas com setas pontilhadas. Setas em negrito pontilhadas indicam É novas etapas metabólicas que foram recrutadas para a produção de succi- nato em mutantes de E. coli Reações que foram bloqueadas por deleções de gene ou mutações pontuais são marcadas com um X. O pck * indica uma nova mutação que desreprimiu fosfoenolpiruvato carboxicinase, aumentando a atividade e permitindo esta enzima para servir como a rotina primária para a produção de oxaloacetato. Piruvato (em caixa) aparece em dois sítios nes- te diagrama porém existe como uma única mistura intracelular.

Figura 14. Séries de reações geralmente reconhecidas para o catabolismo de glicerol combinaram com a fermentação de ácido misturada (anaeróbia)em E. colitipo selvagem. Estas séries de reações são com base em uma combinação das revisões mais atuais em EcoSal, dados disponíveis em Ecocyc, e uma revisão da literatura primária. (Bachler e outro, 2005; Berman e Lin, 1971; Bock e Sawers, 1996; Erni e outro, 2006; Gutknecht e outro, 20071; Jin e outro, 1983; Keseler e outro, 2005; Lin, 1996; Tang e ou- tro, 1982). Setas em negrito indicam as séries de reações geralmente consi- deradas como dominantes para o catabolismo de glicerol e para fermenta- ção ácida misturada. Setas finas mostram uma série de reação considerada como oculta e não funcional em E. coli tipo selvagem (Jin e outro, 1983; Tang e outro, 1982) envolvendo diidroxiacetona como um intermediário. Pensa-se que esta série de reação funciona apenas em mutantes nos quais gipK é inativo. (Jin e outro, 1983; Tang e outro, 1982). Uma seta fina tam- bém é mostrada para glpD, a desidrogenase pensada funcionar durante o metabolismo aeróbico como uma substituição para glpABC (metabolismo anaeróbico). Abreviações: DHA, diidroxiacetona; DHAP, diidroxiacetona 3- fosfato; PEP, fosfoenolpiruvato; G3P, glicerol 3-fosfato; e GA3P, 3-fosfato de gliceraldeídeos. PEP é em caixa para indicar uma mistura comum. Figura 15. Nova série de reação de E. coli para a produção a-

íõ naeróbica de succinato de glicerol em meio de sais minerais. Setas em ne- grito indicam a rotina primária para o catabolismo anaeróbico de glicerol em . cepas tal como XZ721 contendo três mutações de núcleo para a produção - de succinato. Setas pontilhadas mostram séries de reações que foram blo- queados por mutações em pflB e ptsl. Nesta série de reação, a ativação mu- E: tacional de fosfoenolpiruvato carboxicinase (pck*) permite esta enzima servir como a etapa de carboxilação dominante para a produção de oxaloacetato. Ao contrário da enzima de carboxilação alternativa, fosfoenolpiruvato carbo- xilase (PPC), PCK conserva energia para produzir ATP adicional para bios- síntese.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS Como usado na presente invenção, o termo "título" significa uma concentração molar do composto particular no caldo de fermentação. Assim no processo de fermentação para a produção de ácido succínico de acordo coma presente invenção, um título de ácido succínico de 100 mM significa- ria que o caldo de fermentação na hora de medida continha 100 mMols de ácido succínico por litro do caldo de fermentação. Como usado na presente invenção, o termo "rendimento" refere- se aos mols do composto particular produzido por mol da matéria-prima de alimentação consumida durante o processo de fermentação. Assim no pro- cesso fermentativo para a produção de ácido succínico usando glicose como a matéria-prima de alimentação, o termo rendimento refere-se ao número de mols de ácido succínico produzido por mol de glicose consumida. Como usado na presente invenção, o termo "produtividade vo- lumétrica" refere-se à quantidade de composto particular em gramas produ- zida por volume unitário por tempo unitário. Assim um valor de produtividade volumétrica de 0,9 g L' h" para ácido succínico significaria que 0,9 grama de ácido succínico é acumulado em um litro de caldo de fermentação duran- te uma hora de crescimento. Os termos "título", "rendimento" e "produtividade volumétrica” como usados nesta invenção também incluem "título normalizado”, "rendi- mento normalizado" e "produtividade volumétrica normalizada". Na determi-

. nação do título normalizado, rendimento normalizado, e produtividade volu- métrica normalizada, o volume dos reagentes de neutralização adicionados ao vaso de fermentação para manter o pH do meio de crescimento também é levado em conta.

Os termos "geneticamente criado" ou "geneticamente modifica- À do" como usados aqui referem-se à prática de alterar a expressão de uma ou mais enzimas nos micro-organismos por manipulação do DNA genômico dos micro-organismos.

A presente invenção fornece um processo para a produção de ácido succínico em quantidades comercialmente significantes dos compos- tos de carbono por cepas bacterianas geneticamente modificadas (GMBS). Descritos nesta presente invenção são os micro-organismos adequados pa- ra a produção de ácido succínico por processo fermentativo.

Como usado na presente invenção, o termo "gene" inclui a estru- turade leitura aberta do gene bem como as sequências reguladoras a mon- tante e a jusante.

A região reguladora a montante também é referida como a região de promotor do gene.

A região reguladora a jusante também é referi- da como a região de sequência terminadora.

Quando usado na presente invenção, o termo mutação refere-se às modificações genéticas feitas ao gene incluindo a estrutura de leitura a- berta, a região reguladora a montante e a região reguladora a jusante.

As mutações de gene resultam em uma super-regulação ou uma sub-regulação ou inibição completa da transcrição da estrutura de leitura aberta do gene.

As mutações de gene são obtidas deletando-se a região de codificação intei- —rado gene ou uma porção da sequência de nucleotídeo de codificação ou introduzindo-se uma mutação da fase de leitura, uma mutação de sentido errado, e inserção, ou introduzindo-se um códon de interrupção ou combina- ções dos mesmos.

Como usado nesta invenção, o termo "exógeno" é pretendido significar que uma molécula ou uma atividade derivada do exterior de uma célula é introduzida no organismo microbiano hospedeiro.

No caso de uma molécula de ácido nucleico exógeno introduzida na célula microbiana, o áci-

: do nucleico introduzido pode existir como um plasmídeo independente ou pode ser integrado no DNA cromossômico hospedeiro.

O ácido nucleico e- xógeno codificando para uma proteína pode ser introduzido na célula micro- ” biana em uma forma expressível com seus próprios reguladores de sequên- ciatal como as sequências de promotor e terminador.

Alternativamente, a molécula de ácido nucleico exógeno pode ser integrada no DNA cromossô- mico hospedeiro e pode estar sob o controle da sequência reguladora hos- pedeira.

O termo "endógeno" refere-se às moléculas e atividade que es- tão presentes dentro da célula hospedeira.

Quando usado em referência a uma atividade biossintética, o termo "exógeno" refere-se a uma atividade que é introduzida no organismo de referência hospedeiro.

Por exemplo, a fonte pode ser um homólogo ou heterólogo que codifica ácido nucleico que expressa a atividade de referência após a introdução no organismo microbi- ano hospedeiro.

Se o ácido nucleico que codifica para uma proteina é obtido das mesmas espécies do organismo microbiano, ele é se referido como DNA homólogo.

Se o ácido nucleico derivado de uma espécie microbiana diferen- te, este é referido como DNA heterólogo.

Independente da natureza do DNA, se é homólogo ou heterólogo, quando introduzido em uma célula hospedei- ra oDNA bem como a atividade derivada deste DNA introduzido é referido como exógeno.

Portanto, a expressão exógena de um ácido nucleico de co- dificação da invenção pode utilizar qualquer um ou ambos ácidos nucleicos de codificação heterólogos e homólogos.

A presente invenção fornece GMBS mostrando títulos impres- sionantes, rendimento alto e produtividade volumétrica significantes para ácido succínico quando crescidos sob condições fermentativas em meio de sal mínimo contendo uma fonte de carbono como o substrato para o proces- so de fermentação.

Os micro-organismos da invenção objeto podem ser em- pregados em um processo de produção de etapa isolada usando vários açú- cares tais como hexoses, pentoses, dissacarídeos e outros compostos de carbono tal como glicerol.

Na presente invenção, combinações únicas e vantajosas das mutações de gene foram empregadas para direcionar o fluxo de carbono para produção de ácido succínico. Além disso, a produção de ácido succíni- . co é acoplada com o crescimento microbiano que, por sua vez, é acoplado ao nível de ATP celular e equilíbrio de redox.

O termo "equilíbrio de redox" refere-se à capacidade da céiula . manter a relação apropriada de NADH a NAD”*. Em outras palavras, as célu- las podem oxidar o NADH de forma que haja NAD* suficiente para oxidar os substratos de carboidrato durante o crescimento fermentativo anaeróbico. Durante o crescimento aeróbico, a mistura de NAD” é regenerada por fosfo- rilação oxidativa envolvendo NADH. Entretanto, sob condição de crescimen- to anaeróbica, a regeneração da mistura de NAD* é obtida apenas por meio da manipulação do fluxo de carbono por várias séries de reações metabóli- cas dentro da célula que poderia oxidar NADH.

Em uma modalidade da presente invenção, as modificações ge- mnéticas envolvem apenas a manipulação de genes dentro do genoma nativo dos micro-organismos. Nesta modalidade da presente invenção, nenhum material genético exógeno tal como plasmídeo que suportam genes com resistência a antibióticos ou qualquer outra sequência de nucleotídeo exóge- no que codificam para certas proteínas de enzima é introduzido nas cepas bacterianas usadas como biocatalisadores para a produção de ácido succí- nico.

Os micro-organismos recombinantes adequados para esta pre- sente invenção são derivados de várias famílias bacterianas, preferivelmente da família de Enterobacteriaceae. Os micro-organismos adequados são se- lecionados dos gêneros Escherichia, Erwinia, Providencia, e Serratia. O gê- nero Escherichia é preferido particularmente. Dentro do gênero Escherichia, a espécie E. coli é particularmente preferida. Qualquer uma cepa dentre E. coli tal como E. coli B, E., coli C, E. coli W, ou similares é útil para a presente invenção.

Cepas de E. coli capazes de produzir ácidos orgânicos em quan- tidades significantes são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, a Publi- cação de Pedido de Patente U.S. No. 2009/0148914 fornecem cepas de E.

: coli como um biocatalisador para a produção de acetato e/ou piruvato quimi- camente puro(s). A Publicação de Pedido de Patente U.S.

No. 2007/0037265 e . Patente U.S. 7.629.162 fornecem derivados da cepa K011 de E. coli constru- ida para a produção de ácido láctico.

Pedido de Patente Internacional publi- cadosobo Tratado de Cooperação Patente No.

WO 2008/115958 fornece o microrganismo construído para produzir succinato e malato em meio de sal mineral mínimo contendo glicose como uma fonte de carbono em fermenta-

ção em batelada controlada por pH.

Em algumas outras modalidades da invenção, bactérias que po- dem ser modificadas de acordo com a presente invenção incluem, porém não são limitadas a, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter asaii, Achromo- bacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agro- bacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Art- hrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffineus, Arthro- bacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxydans, Aureobacterium saper- dae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Bre- vibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globo- sum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacteri- um helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibac- terium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevi- bacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Enwinia amylo- vora, Enwinia carotovora, Enwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacte- rium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavo- bacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Fla- vobacterium meningosepticum, Micrococcus sp.

CCM825, Morganella morga- nii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococeus eucinatus, Proteus retige- ni, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azo- toformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomo- nas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rho-

: dococceus rhodochrous, Rhodococcus sp.

ATCC 15592, Rhodococcus sp.

ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschni- kovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochro- . mogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces oliva- É ceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces an- tibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces vi- ridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus subtilis, Bacillus licheni- formis, Bacillus amyloligyefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus pumilus, Ba- cillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, Xanthomonas citrie e assim sucessivamente.

Os micro-organismos adequados para a prática de presente in- venção podem ser cultivados aerobicamente (na presença de oxigênio) ou anaerobicamente (na ausência completa de oxigênio) ou microaerobiamente (com uma quantidade mínima de fornecimento de oxigênio). Na modalidade preferida da presente invenção, o micro-organismo selecionado para a pro- dução de ácido succínico é crescido em uma condição anaeróbica.

Alternati- vamente, os micro-organismos adequados para a presente invenção podem ser cultivados em um regime de crescimento de fase dual, em que o micro- organismo é inicialmente crescido em condição de crescimento aeróbica pa- ra alcançar um certo nível de crescimento de célula antes de transferir para a condição de crescimento anaeróbica para alcançar a produção de ácido succínico em quantidades comercialmente significantes.

Durante o cresci- mento de fase dual para a produção de ácido succínico pelos micro-orga- nismos da presente invenção, a produção e o acúmulo do ácido succínico ocorrem durante a fase de crescimento fermentativa anaeróbica.

A presente invenção combina a técnica de modificações genéti- cas específicas com o processo de evolução metabólica para obter cepas que mostram o rendimento, título e produtividade volumétrica altos para pro- dução de ácido succínico sob condição de crescimento anaeróbica no meio de sal mineral com um substrato de carboidrato.

. As cepas microbianas obtidas das manipulações genéticas teri- am o genótipo esperado para a produção de ácidos succínico. Entretanto, : sua taxa de crescimento no meio de sal mineral mínimo ou sua capacidade . de produzir ácido succínico no rendimento, título e produtividade volumétrica requeridos pode não nos permitir usar estes micro-organismos geneticamen- e te modificados como um biocatalisador para a produção comercial de ácido succínico por processo de fermentação em grande escala. Portanto, as ce- pas microbianas geneticamente modificadas obtidas das modificações gené- ticas são subsequentemente crescidas em meio de sal mineral com uma fonte de carboidrato para várias gerações para selecionar um clone com rendimento muito alto para produção de ácido succínico. Este processo para a seleção com base no crescimento de um clone com o fenótipo mais prefe- rido é referido como evolução metabólica. Durante a evolução metabólica, a cepa geneticamente modificada é transferida repetidamente em meio míni- mofresco durante um período de tempo para obter um clone em que as mu- tações espontâneas que ocorreram durante a evolução metabólica resulta em um clone que exibe o crescimento de célula rápido, consumo rápido de fontes de carbono diferentes, capacidade de usar açúcares múltiplos simul- taneamente, capacidade de tolerar as substâncias químicas tóxicas na fonte de carbono e produtividade e rendimento de produção altos do ácido orgâni- co desejado acoplado com a baixa produção de outros ácidos orgânicos.

Durante a evolução metabólica, atenção é prestada para sele- cionar o clone com os fenótipos desejáveis. Um clone resultante da evolução metabólica que mostra uma taxa de crescimento muito boa em meio mineral —suplementado com uma fonte de carbono porém que não melhorou no ren- dimento do ácido orgânico desejado não é um clone desejável.

Durante o processo de evolução metabólica usando certa pres- são seletiva para forçar o organismo a adquirir certo fenótipo desejável, duas possíveis alterações poderiam ocorrer. O organismo poderia se adaptar sim- plesmente à pressão seletiva e mostrar um fenótipo mudado. Alternativa- mente, o organismo poderia sofrer certas alterações genéticas sob pressão seletiva e exibir um fenótipo mudado permanentemente. Quando havia ape-

: nas uma adaptação e não havia nenhuma alteração genética, o organismo reverte novamente ao seu fenótipo original logo que a pressão de seleção é . aliviada.

Estes organismos são referidos como organismos "adaptados". Es- tes micro-organismos "adaptados" reverteriam novamente ao seu fenótipo original quando à pressão de seleção é removida.

Os micro-organismos "a- daptados" têm que sofrer outro ciclo fresco de evolução metabólica sob pressão de seleção para mostrar um fenótipo mudado.

Por outro lado, quan- do houver uma alteração genética acompanhante, o fenótipo mudado conti- nuará a existir até mesmo quando não houver nenhuma pressão de seleção.

A evolução metabólica acompanhada por uma certa alteração genética é desejável.

O micro-organismo que adquire uma alteração genética estável durante a evolução metabólica pode ser identificado facilmente por meio de cultivo do micro-organismo no meio de crescimento original sem qualquer pressão de seleção durante algum tempo antes de transferir para o meio fresco com a pressão de seleção.

Se estes organismos puderem mostrar bom crescimento e o fenótipo esperado sem qualquer período de atraso, o organismo é considerado ter adquirido um genótipo mudado durante a evo- lução metabólica.

A base da alteração genética ganha durante a evolução metabó- lica pode ser determinada por sequenciamento de regiões apropriadas den- tro do DNA cromossômico do organismo e comparando-se os dados de se- quência com aqueles da cepa de origem.

Os dados de sequência de DNA podem ser obtidos por meio do seguimento das técnicas bem conhecidas na arte.

Por exemplo, regiões apropriadas do DNA cromossômico da cepa me- tabolicamente evoluída podem ser obtidas por reação em cadeia da polime- rase e o produto obtido por reação em cadeia da polimerase pode ser se- quenciado usando iniciadores de sequenciamento apropriados.

Cepas de E. coli tipo selvagem obtidas de coleções de cultura tal como ATCC (Aamerican Type Culture Collection) podem ser criadas geneti- camente e subsequentemente metabolicamente evoluídas para obter uma cepa com uma capacidade realçada de produzir ácido succínico em quanti- dades comercialmente significantes.

õ 22/129 . As manipulações genéticas podem ser feitas em vários estágios diferentes acompanhados por evolução metabólica entre os estágios de ma- f nipulações genéticas.

As manipulações genômicas envolvem a alteração às das sequências de DNA endógeno ou completamente removendo as se- —quênciasde DNA específicos do DNA genômico.

As manipulações genéticas podem também envolver a inserção de uma sequência de DNA estranho dentro da sequência de DNA genômico do micro-organismo.

Certas modali- dades da presente invenção, as manipulações genéticas são realizadas por meio da remoção da sequência de DNA específico do DNA genômico dos micro-organismos sem introduzir qualquer DNA estranho.

Certas manipula- ções genéticas necessárias para inativar a expressão de um gene codifican- do para um produto de proteína particular requer uma inserção de um se- quência de DNA estranho no genoma do micro-organismo para selecionar um clone com a modificação genética desejada.

Por exemplo, genes marca- dores antibióticos exógenos podem ser usados para insercionalmente inati- var os genes endógenos e selecionar o clone com genótipo desejado.

Em uma modalidade da presente invenção, as sequências de DNA exógenas são finalmente removidas do DNA genômico do micro-organismo de forma que o micro-organismo ao término do processo de engenharia genética não tenha nenhum DNA exógeno em seu DNA genômico original.

Várias técni- cas de engenharia genética necessárias para realizar os objetivos da moda- lidade preferida da presente invenção foram descritas em detalhes em duas publicações científicas diferentes (Jantama e outro, 2008a; Jantama e outro, 2008b). Os Pedidos de Patente U.S.

Publicados com números US 2007/0037265 e US 2009/0148914 e o pedido de patente Internacional pu- blicado sob o Tratado de Cooperação de Patente com Número de Publica- ção Internacional WO 2008/115958 da mesma forma descrevem as técnicas de engenharia genética úteis na prática de várias modalidades desta presen- te invenção.

Estas publicações científicas bem como documentos de patente estão aqui incorporados por referência com a finalidade de fornecer os deta- lhes para técnicas de engenharia genética úteis para a presente invenção.

Para fazer o micro-organismo produzir ácido succínico em quan-

í 23/129 - tidades significantes, várias enzimas envolvidas em várias séries de reações metabólicas microbianas incluindo a série de reação glicolítico, ciclo de ácido f tricarboxílico (também conhecido como ciclo de Krebs ou ciclo de TCA) e ' desvio de glioxitato podem ser manipuladas usando uma variedade de técni- casde engenharia genética descritas na literatura científica e patente citada e podem ser incorporadas por referências no parágrafo acima. Os detalhes a cerca de várias séries de reações metabólicas microbianas podem ser en- contrados nos textos de bioquímica padrão tais como Principles of Bioche- mistry, por Lehninger and Bioquímica por Lubert Stryer. O cartaz das séries dereações Bioquímicas por G. Michael disponível de Sigma Chemical Com- pany em St. Louis, MO, USA também fornece detalhes a cerca de várias séries de reações bioquímicas em uma célula bacteriana. Durante o crescimento aeróbico, o metabolismo de carbono mi- crobiano envolve glicólise, ciclo de ácido tricarboxílico e fosforilação oxidati- va Os cofatores de enzima reduzidos tais como NADPH e NADH são rege- nerados pela operação de fosforilação oxidativa acompanhada por produção de ATP requerida para crescimento de célula. Sob condição de crescimento anaeróbica para a produção de ácido succínico na modalidade preferida da presente invenção, a regeneração de cofatores reduzidos NADPH e NADH é realizada direcionando-se o fluxo de carbono no ciclo de ácido tricarboxílico e eliminando-se todas as séries de reações fermentativas para regeneração de NADP* e NAD”*.

Dependendo do tipo de ácido orgânico preferido, as séries de reações metabólicas são especificamente criadas de forma que o micro- organismo produza um ácido orgânico particular de nossa escolha. Os mi- cro-organismo são capazes de sintetizar vários ácidos orgânicos incluindo ácido láctico, ácido acético, ácido málico, ácido pirúvico, ácido fórmico e áci- do succínico. Desse modo, no desenvolvendo de um biocatalisador para a produção de ácido succínico, as séries de reações para a produção de ácido acético, ácido láctico, ácido pirúvico, e ácido fórmico são bloqueadas e o fluxo de carbono para a produção de ácido succínico é facilitada para mani- pular um ou mais enzimas envolvidas no metabolismo de carbono dentro da

- célula. A lista das enzimas que são ativas na série de reação fermentativa microbiano que pode ser manipulada usando as técnicas de engenharia ge- : nética conhecidas inclui, porém não limitadas a, isocitrato sintetase (aceÃ), malato sintase (aceB), o opéron de desvio de glioxilato (aceBAK), acetato cinase-fosfotransacetilase (ackA-pta); aconitase hidratase 1 e 2 (acnA e : acnB); aceti-CoA sintetase (acs); citrato liase (citDEF); álcool desidrogenase (adhE); citrato sintase (citZ); fumarato redutase (frd); lactato desidrogenases (Idh); malato desidrogenase (mdh); repressor de opéron de aceBAK (iclR); fosfoenol piruvato carboxilase (pepC); piruvato formiato liase (pf); piruvato oxidase (poxB); piruvato carbóxi cinase (pck); e piruvato carboxilase (pyc) (Figuras 1,6 e9).

Glicólise de fontes de carbono resulta na produção de fosfoeno! piruvato (PEP). PEP também é metabolizado por série de reação ácida mis- turada. Como usado na presente invenção, o termo "série de reação ácida misturada" refere-se ao fluxo de carbono de PEP através de igualmente o ciclo de ácido tricarboxílico e várias séries de reações fermentativos que são operacionais sob condições anaeróbicas. Sob condições anaeróbicas, pelo menos quatro séries de reações fermentativas diferentes para o metabolis- mo de piruvato são reconhecíveis. O piruvato pode ser reduzido ao lactato usandooNADH e desse modo produzindo NAD+ para manter o equilíbrio de redox da célula necessária para o metabolismo contínuo de fonte de carbo- no. O acetil-CoA derivado de piruvato também pode ser reduzido para pro- duzir etanol acompanhado pela oxidação de NADH para produzir NAD*. Pi- ruvato também pode ser convertido em formiato ou acetato como mostrado naFigura1A Dentro do ciclo de TCA, duas subdivisões diferentes são reco- nhecidas. Em uma subdivisão do ciclo de TCA referido como a subdivisão oxidativa que abrange o fluxo de carbono de oxaloacetato ao ácido succínico por isocitrato, o NADP* é utilizado para oxidar o isocitrato com a formação resultante de NADPH. Na outra subdivisão do ciclo de TCA referido como a subdivisão redutiva do ciclo de TCA que abrange o fluxo de carbono de oxa- loacetato ao ácido succínico por malato e fumarato, o NADH é oxidado para

: produzir NAD* e desse modo ajudando a célula a manter o equilíbrio de re- dox. : Em uma modalidade da presente invenção, o fluxo de carbono de PEP por séries de reações fermentativas é prevenida por meia da inati- vação dos genes que codificam para as enzimas envolvidas na série de rea- ' ção fermentativa. As enzimas adequadas para bloquear o fluxo de carbono por série de reação fermentativa incluem /dhA, pflB, adhE, pta, ackA, e poxB. Espera-se que a eliminação de um ou mais destes genes reduza o fluxo de carbono de PEP através da série de reação fermentativa. A inativação de todos estes seis genes é esperada bloquear o fluxo de carbono por série de reação fermentativa totalmente. Em outro aspecto da presente invenção, o gene mgsA que codifica para o metilglioxal sintase (mgsA) responsável pela conversão de metilglioxal para ácido láctico inativado está ao lado da inati- vação de seis outros genes envolvidos na série de reação fermentativa.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, os homólogos funcionais dos genes envolvidos na série de reação fermentativa também são inativados além da inativação dos genes conhecidos por estar envolvi- dos em uma ou outra série de reação fermentativa. Uma propionato cinase com atividade de acetato cinase é codificada pelo gene tdcD que só é pro- duzido para a degradação de treonina. Entretanto, durante o crescimento anaeróbico com 10% (p/v) de glicose, a expressão de tdcD poderia substituir funcionalmente ackA. Além disso, o gene tdcE adjacente no mesmo opéron é similar a pflB e codifica a-cetobutirato formiato liase com atividade de piru- vato formiato-liase. Em um aspecto da presente invenção, os genes tdcDE são inativados para prevenir a entrada de carbono na série de reação fer- mentativa e garantir o fluxo de carbono no ciclo de TCA.

Em outra modalidade da presente invenção, além de bloquear o fluxo de carbono por séries de reações fermentativas, o fluxo de carbono dentro do ciclo de TCA é alterado de forma que haja fluxo de carbono dire- cionado para a produção de ácido succínico. Em um aspecto da presente invenção, a manipulação de fluxo de carbono dentro do ciclo de TCA é obti- da por meio da super-regulação da expressão de um ou mais genes. Em

.: ainda outro aspecto da presente invenção, um ou mais genes que funcionam dentro de ciclo de TCA pode ser inativado para facilitar um fluxo de carbono F aumentado ao ácido succínico.

: Em um aspecto preferido da presente invenção, o gene mdh que codifica para malato desidrogenase é super-regulado para melhorar a con- À versão de malato para fumarato e succinato. O fluxo do carbono de oxaloa- cetato para ácido succínico por malato e fumarato se referido como a subdi- visão redutiva do ciclo de TCA. O fluxo de carbono através desta subdivisão redutiva do ciclo de TCA de ácido oxaloacético para ácido succínico consu- miriadois mols de NADH para cada mol de ácido succínico produzido e as- sim ajudaria a manter o equilíbrio redox da célula sob condição anaeróbica. Em outras palavras, o super-regulação de mdh ajudaria na regeneração de NAD* requerido para manter o equilíbrio de redox da célula. A super- regulação da expressão de gene de mdh pode ser obtida por meio da substi- tuiçãodo promotor nativo para gene de mdh com alguma outra sequência de promotor forte ou alternativamente por meio da mutação da região de pro- motor do gene mdh de forma que haja um aumento da transcrição do gene mdh. Alternativamente, as cópias adicionais do gene mdh podem ser adicio- nadas à cepa. Em uma modalidade preferida da presente invenção, a super- regulação de expressão de gene mdh é obtida por meio de manipular gene- ticamente sua região de promotor.

Na operação regular do ciclo de TCA, ácido succínico é produzi- do através da operação oxidativa da subdivisão do ciclo de TCA. O fluxo de carbono de oxaloacetato para ácido succínico por citrato, cis-aconitato, isoci- trato, a-cetoglutarato, e sucinil-CoA é referido como a ramificação oxidativa do ciclo de TCA. O ácido succínico também pode ser produzido através da operação de desvio de glioxalato. Durante a operação de desvio de glioxala- to, pela ação de isocitrato liase, succinato e glioxilato são produzidos de iso- citrato. O succinato desse modo produzido da operação de ramificação oxi- —dativado ciclo de TCA ou da operação de desvio de glioxalato, pode ser a- gido por succinato desidrogenase (sdh) para produzir ácido fumárico e em seguida ácido málico. Portanto, em ainda outra modalidade da presente in-

í 27/129 . venção, a inativação do gene pode ser usada para prevenir a desidrogena- ção do succinato para aumentar a produção de ácido succínico intracelular. t Todavia em outro aspecto da presente invenção, o fluxo de carbono através do desvio de glioxilato pode ser manipulado para obter um aumentona produção de ácido succínico. A enzima isocitrato liase catalisa a ' clivagem de isocitrato em glioxilato e succinato. Isocitrato liase é codificado pelo opéron aceBAK. A atividade de isocitrato liase é suprimida pelos genes iclR. Em outras palavras, a expressão de gene iclR previne a operação de desvio de glioxilato. Em um aspecto da presente invenção, o gene iclR é ina- tivado juntamente com a inativação dos genes envolvidos no metabolismo fermentativo.

Todavia em outra modalidade da presente invenção, além de prevenir a operação das séries de reações fermentativas e aumentar o fluxo de carbono dentro do ciclo de TCA para a produção de ácido succínico por meio de manipulações genéticas, o fluxo de carbono externo do ciclo de TCA para outras séries de reações metabólicas pode também ser bloqueado por meio de métodos genéticos para aumentar a produção de ácido succíni- co. Por exemplo, o fluxo de carbono do ciclo de TCA para dentro do metabo- lismo de aminoácido pode ser bloqueado a fim de melhorar o fluxo de carbo- no para o ácido succíinico. O gene de aspartato aminotransferase (aspC) transfere o grupo amino do ácido glutâmico para o ácido oxaloacético na síntese de ácido aspártico e desse modo facilita o fluxo externo de carbono do ciclo de TCA. Em um aspecto da presente invenção, a inativação do gene aspC é seguida para bloquear o fluxo externo de carbono do ciclo de TCA a fim de melhorar o fluxo de carbono de oxaloacetato para a produção de áci- do succínico ou através da ramificação oxidativa ou redutiva do ciclo de TCA.

O outro fluxo externo do carbono do ciclo de TCA ocorre de ma- lato. A descarboxilação de malato pela enzima málica (sfcA) resulta na pro- — dução de piruvato. Em um aspecto da presente invenção, o gene codificando para o gene sfcA é inativado para diminuir o fluxo externo de carbono do ciclo de TCA. Todavia em outro aspecto da presente invenção, ambos os

. genes aspC e sfcA são inativados para impedir o fluxo externo de carbono do ciclo de TCA a fim de realçar o acúmulo de ácido succínico. Todavia em outro aspecto da presente invenção, o fluxo externo : de carbono do ciclo de TCA é impedido por inativação do gene de citrato liase (CitDEF) responsável pela clivagem de ácido cítrico em oxaloacetato e : acetato.

Além de descobrir que a inativação dos genes envolvidos nas séries de reações fermentativas e seus análogos funcionais, impedindo o fluxo de carbono para fora do ciclo de TCA e regulando o fluxo de carbono parao ácido succínico dentro do ciclo de TCA poderia melhorar a produção de ácido succínico na fermentação microbiana, a presente invenção surpre- endentemente também descobriu que o crescimento da produção de ácido succínico acoplado pode também ser melhorada por manipulações genéti- cas de enzimas de carboxilação dentro das células microbianas. Ao mesmo tempo que caracterizando as mudanças que ocorreram durante a evolução metabólica através da condução genética e análise de enzima, os inventores da presente invenção inesperadamente descobriram que as enzimas de car- boxilação dentro da célula pode ser ainda outro alvo para manipulação gené- tica para obter uma produção de ácido succínico melhorada.

Os intermediários glicolíticos piruvato de fosfoenol (PEP) e ácido pirúvico podem ser carboxilados para melhorar o fluxo de carbono dentro do ciclo de TCA. Sob condições normais, a entrada de carbono no ciclo de TCA é realizada pela ação de citrato sintase que combina o acetil-CoA derivado de piruvato com oxaloacetato, um intermediário no ciclo de TCA, para pro- —duzir ácido cítrico. Por métodos de melhorar a eficiência de uma ou mais enzimas de carboxilação presentes dentro da célula, é possível carboxilar piruvato de fosfoeno! e piruvato em oxaloacetato, um intermediário de ciclo de TCA (Figura 2). O oxaloacetato desse modo produzido a partir da reação de carboxilação pode ser também reduzido através da ramificação redutiva —dociclodeTCA para produzir ácido succeínico.

A presente invenção fornece um método para manipular as en- zimas de carboxilação presentes dentro da célula como um método para

S 29/129 : aumentar a produção de ácido succínico durante o crescimento fermentativo anaeróbico. É bem conhecido na técnica que, por métodos de introduzir pi- E: ruvato carboxilase (pyc) de uma fonte exógena é possível carboxilar piruvato em ácido oxaloacético. As cepas microbianas bem adaptadas para manipu- —lações genéticas tal como E. coli não têm o gene pyc. Os genes pyc deriva- dos de outras espécies bacterianas tais como Rhizopium elti e Lactobacillus lacti podem ser introduzidos nas cepas de E. coli geneticamente modificadas para melhorar a produção de ácido succínico.

Quatro diferentes enzimas de carboxilação endógenas são co- nhecidasem E. coli. Duas destas enzimas são responsáveis pela carboxila- ção de piruvato de fosfoenol e duas outras enzimas são responsáveis pela carboxilação de piruvato derivado de piruvato de fosfoeno! pela ação da en- zima piruvato cinase. A enzima piruvato de fosfoenol carboxilase (ppc) car- boxila piruvato de fosfoenol em oxaloacetato que pode entrar na ramificação —redutiva do ciclo de TCA para produzir succinato. A segunda enzima de car- boxilação piruvato de fosfoenol carboxicinase (pck) também carboxila piruva- to de fosfoenol para produzir oxaloacetato, porém normalmente catalisa a reação reversa visto que ela não é expressa na presença de glicose. As du- as outras enzimas de carboxilação a saber enzima maleica ligada a NADH (maeB)ea enzima maleica ligada a NADPH (maeA / sfcA) carboxilam o áci- do pirúvico em ácido málico. As enzimas maeB e sfcA carboxila o piruvato derivado de piruvato de fosfoenol pela ação de piruvato cinase. Qualquer uma das quatro enzimas de carboxilação presentes na célula pode ser geneticamente manipulada para aumentar sua atividade en- —zimáticaafim de melhorar o fluxo de carbono de intermediários de ciclo gli- colítico dentro do ciclo de TCA. Das quatro enzimas de carboxilação nativas presentes em E.coli, a reação catalisada por PPC é fortemente favorecida. À energia contida em PEP é perdida nesta reação com a liberação de fosfato inorgânico. As outras três enzimas de carboxilação, a saber pck, maeà e —sfcA(maeB), não são supostas funcionarem durante o crescimento fermen- tativo usando glicose como o substrato quando estas três enzimas de carbo- xilação são reprimidas por glicose. Estas três enzimas de carboxilação são

: 30/129 . supostas funcionarem na direção reversa durante gluconeogênese, quando as células estão oxidativamente metabolizando ácidos orgânicos. " Nesta invenção, os inventores surpreendentemente descobriram que a PEP carboxicinase (PCK) pode ser geneticamente manipulada para melhorar o fluxo de carbono dentro do ciclo de TCA.

O recrutamento de pck com a trilha primária para produção de ácido succínico em E. coli foi surpre- endente e está em contraste a nosso atual entendimento sobre o papel fun- cional de pck.

Estudos anteriores mostraram que a expressão aumentada de E. coli e Actinobacillus. succinogenes pck não tiveram nenhum efeito sobre a produção de succinato (Kim e outro, 2004; Millard e outro, 1996). Um estudo recente demonstrou que a expressão aumentada de E. coli pck é prejudicial para o crescimento em meio mínimo, diminuindo a taxa de crescimento, a taxa de metabolismo de glicose, e a produção de succinato. [Kwon e outro, 2008). A vantagem na melhora da atividade de pck situa-se no fato de que esta enzima ao mesmo tempo que carboxila piruvato de fosfoenol em oxalo- acetato, resulta na produção de uma molécula de ATP para cada molécula de oxaloacetato produzida.

Um aumento na produção de ATP aumentaria a taxa de crescimento das células.

A análise comparativa de piruvato de atividade de fosfoeno!l car- boxicinase em diversas cepas de E. coli construídas durante esta invenção revelou que o aumento na atividade de enzima PCK durante a evolução me- tabólica resulta de um aumento na atividade transcricional do gene pck.

Na- quelas cepas mostrando uma melhora na produção de succinato ligado ao crescimento celular, existe um aumento na abundância da transcrição de —pck.De fato, os resultados da presente invenção estabeleceram uma corre- lação positiva entre um aumento no nível de transcrição de pck transcript e um aumento na atividade de enzima PCK e produção de ácido succínico ligado ao crescimento.

O recrutamento do pck gluconeogênico nativo para produção de —succinato fermentativo pode ser obtido por qualquer mutação que positiva- mente afeta a transcrição do gene pck.

Um aumento no nível de atividade de PCK pode ser obtido por métodos de expressão do gene pck em um plasmí-

deo de mútiplas cópias com um promotor nativo ou qualquer outra sequência promotora que é conhecida aumentar a expressão de gene. Outro meio de aumentar a expressão do gene pck dentro do cell é integrar cópias adicio- : nais ao gene pck usando transposons. Em outra modalidade da presente invenção, o promotor nativo do gene pck pode ser substituído por alguns é outros elementos promotores conhecidos realçar o nível de atividade. Uma expressão aumentada de gene pck pode também ser obtida ou por mutação na região promotora do gene ou por manipulação genética dos elementos reguladores que são conhecidos interagirem com a região promotora do ge- ne pck O gene codificando para uma proteina reguladora do gene pck pode ser mutado ou deletado ou superexpresso de algum modo a fim de aumentar a expressão do gene pck. Os resultados da presente invenção indicaram que uma única mutação de ponto (transição de G para A na posição - 64 com relação ao códon de partida de ATG de gene pck) pode aumentar a transcrição do gene pck acompanhada por um correspondente aumento na na atividade da enzima piruvato de fosfoenol carboxicinase. Um aumento similar na expressão do gene pck pode também ser obtido geneticamente manipulando os genes codificando para as proteinas conhecidas regularem a expressão de gene pck. Por exemplo, a proteína Cra foi mostrada ativar a expressão de gene pck gene em E. coli (Saier e Ramseier, 196). Similar- mente o sistema csrA (compreendendo csrA, csrB, esrC, esrD, uvrY ou barA) foi também reportado regular o nível de pck e outros genes envolvidos em metabolismo de glicose alterando a estabilidade de MRNA (Babitzke e Ro- meo, 2007; Pernestig e outro, 2003; Suzuki K e outro, 2002).

Todavia outro método genético da presente invenção para au- mentar a produção de ácido succínico ligado ao crescimento durante o pro- cesso de fermentação anaeróbica diz respeito à conservação de energia gasta em captação de açúcar pelos biocatalisadores.

Os micro-organismos capturam os açúcares através de um gru- pode proteínas transportadoras localizadas na membrana citoplásmica (Jo- jima e outro, 2010). Os transportadores de açúcar microbianos incluem-se em três categorias maiores. O maior grupo de transportadores de açúcar nas

: 32/129 : bactérias é conhecido como transportadores de cassete de ligação de ATP (ABC). Como o nome indica, os transportadores de ABC requerem uma mo- Sa lécula de ATP para cada molécula de açúcar transportada para dentro da í célula bacteriana. XyIFGH é um transportador de ABC para o transporte de xilose, um açúcar de pentose, dentro da célula. AraFGH é um transportador ' de ABC para o transporte de arabinose, ainda outro açúcar de pentose.

O segundo tipo de transportadores de açúcar bacterianos é a- grupado sob a Superfamília de Facilitador Maior (MFS). Dentro dos transpor- tadores de açúcar de MFS, duas categorias diferentes de transportadores são reconhecidas. MFS inclui simportadores ligados a H*, antiportadores e uniportadores ligados a Na*. Os uniportadores são facilitadores simples para o transporte de açúcar e requerem uma molécula de ATP para cada molécu- la de açúcar transportada para dentro da célula. A proteína de transmem- brana GIf em E. coli é um exemplo de uniportador. Os simportadores de H* requerem um próton e uma molécula de ATP para cada molécula de açúcar transportada para dentro da célula. A proteína GalP em E. coli é um simpor- tador para o transporte de galactose, um açúcar de hexose, para dentro da célula. GalP é um simportador muito bem caracterizado com 12 alças de transmembrana. GalP é também reportado ter a capacidade de transportar glicose através da membrana celular. AraE é um simportador ligado a próton para o transporte de arabinose através da membrana celular. Similarmente a proteína XylE é um simportador ligado a próton para o transporte de xilose.

O terceiro transportador de açúcar primariamente responsável pela captação de açúcares de hexose, tal como glicose é conhecido como o fosfoenolpiruvato: sistema de carboidrato fosfotransferase (PTS). Transfe- rência do grupo de fosforila de fosfoenolpiruvato (PEP) catalisado por PTS direciona o transporte e fosforilação de glicose e resulta na formação de 6- fosfato de glicose e ácido pirúvico dentro da célula. Ácido pirúvico gerado por PTS é aparentemente não reciclado para PEP sob condições de cultura aeróbica, onde a glicose é a única fonte de carbono. De preferência, piruvato é oxidado por meio do ciclo de ácido tricarboxílico em dióxido de carbono. Desse modo, para o transporte de cada molécula individual de glicose, uma

: 33/129 : molécula de PEP é consumida. Em termos de bioenergéticos celulares, o transporte de açúcares através do PTS é um processo intensivo de energia. E Portanto, em células desenvolvidas anaerobicamente, onde existe uma ne- E cessidade de conservar o teor de fosfoenolpiruvato dentro das células para a produção de produtos químicos industrialmente úteis, é desejável substituir o PTS com algum outro transportador de açúcar que não requeiram uma mo- lécula de PEP para cada molécula de açúcar transportada para dentro da célula.

Além disso, estes genes diretamente envolvidos na glicólise, ci- clode ácido tricarboxílico e desvio de glioxilato de séries de reações meta- bólicas microbianas, manipulação genética dos genes envolvidos na capta- ção de compostos de carbono úteis como uma fonte de energia para a sin- tese de ácido succínico, podem também ser manipulados ou para realçar a captação de carbono ou para realçar a eficiência de utilização de energia em produção de ácido orgânico. Por exemplo, a eliminação da captação de gli- cose pelo sistema de fosfotransferase (PTS) pode ajudar na redução do consumo de energia na captação de glicose na célula microbiana. A energia conservada por manipulação do PTS pode ser acanalada para melhorar a eficiência de produção de ácido orgânico. Os genes de sistema de fosfo- transferase ptsH e ptsG podem ser manipulados para conservar a energia em captação de glicose e desse modo melhorar a eficiência de produção de ácido succínico por micro-organismo. Desse modo, explorando os dados disponíveis na área de séries de reações metabólicas microbianas, alguém pode deletar um grupo de genes a fim de bloquear a maior parte das séries de reações metabólicas e acanalar o fluxo de carbono para a produção de ácido succínico com grande eficiência.

PTS é compreendido de dois componentes citoplásmicos, a sa- ber E1 e HPr e um componente ligado à membrana Ell. E. coli contém pelo menos 15 diferentes complexos de Ell. Cada componente de Ell é específico para um tipo de açúcar a ser transportado e contém dois domínios de mem- brana integrais hidrofóbicos (C e D) e dois domínios hidrofílicos (A e B). Es- tes quatro domínios juntos são responsáveis pelo transporte e fosforilação

. 34/129 : das moléculas de açúcar.

A proteína El transfere o grupo fosfato de PEP para a proteina HPr.

A proteína Ell transfere o grupo fosfato da proteína HPr oa fosforilada para a molécula de açúcar.

SS A El é codificado pelo gene pts/. HPr é codificado pelo gene ptsH.

O complexo Ell específico de glicose de bactérias entéricas consiste em du- í as proteínas distintas, a saber, EIIAS* codificada pelo gene crr e a proteina associada à membrana EIICBº" codificada pelo gene ptsG.

O transporte de açúcar mediado pelo PTS pode ser inibido por métodos de deleção de um destes genes codificando para as proteínas associadas com o PTS.

Substi- tuição funcional de PTS por captação independente de fosfoenolpiruvato alternativa e atividades de fosforilação é um dos métodos genéticos para a obtenção de melhoras significantes na produção de produto de glicose e produtividade para diversas classes de metabólitos.

Com a inibição da captação de glicose mediada pelo PTS, ou- tros sistemas para a captação de glicose podem ser ativados para garantir a disponibilidade continuada de glicose dentro da célula para a produção dos produtos químicos industrialmente úteis.

Por exemplo, o gene glf codificando para a permease de glicose, um uniportador de glicose, foi mostrdo substituir a perda de captação de glicose mediada por PTS.

Similarmente a superex- pressão de genes galP e glk é relatada realçar a captação de glicose e fosfo- rilação na cepa pts' de E. coli.

GalP é um simportador para a captação de galactose, um açúcar de hexose.

GalP foi relatado transportar glicose na cepa pts.

A significância de captação de glicose mediada por GalP é evi- dência pelo fato de que a inativação do gene galP no mutante pts é consta- tada serletal (Yi e outro, 2003). GIk é necessário para obter a fosforilação da molécula de glicose antes que ela possa entrar na glicólise.

A expressão da proteína GalP na cepa pts pode ser obtida ou por expressão de um gene exógeno sob um promotor constitutivo ou por métodos de alívio da repres- são da expressão de galP através de mutações em genes codificando para o — repressor do gene galP tal como galS e galR.

Como descrito acima, a produção de ácido succínico usando ca- talisadores microbianos pode ser obtida por métodos de manipulação gené-

: tica acompanhados por evolução metabólica.

As mudanças genéticas que podem ocorrer durante a evolução metabólica podem ser identificadas por os meio de análise bioquímica e genética.

A presente invenção surpreendente- o mente descobriu que mutações que ocorrem nos genes para o sistema de fosfotransferase e enzimas de carboxilação presentes dentro da célula po- ' dem positivamente contribuir para o aumento para o aumento na produção de ácido succínico.

Estes alvos recentemente descobertos para manipula- ções genéticas podem ser combinados com os outros alvos nas séries de reações glicolítica, de ácido tricarboxílico e fermentativa de diversas maneirs diferentes para gerar biocatalisadores com alta eficiência para a produção de ácido succínico.

É também altamente desejável identificar um grupo de um número mínimo de genes alvo para a manipulação genética a fim de obter as melhores cepas produtoras de ácido succínico.

A invenção também fornece métodos genéticos para realçar a u- tilização de glicerol em produção de ácido succínico.

A captação de glicerol é mediada pela proteína codificada pelo gene glpF.

Logo que introduzido na célula, o glicerol é oxidado pela proteína codificada pelo gene gldA para pro- duzir acetona de di-hidróxi (DHA). A DHA é fosforilada em fosfato de aceto- na de di-hidróxi (DHAP) pelas proteínas codificadas pelo opéron dhaKLM.

À fosforilação de DHA em DHAP pelas proteínas codificadas pelo dhaKLM é dependente da disponibilidade do lago de piruvato de fosfoenol (PEP). Visto que a fosforilação de DHA requer PEP, ela depaupera o PEP disponível para PCK que direciona o fluxo de carbono de PEP para dentro do ciclo de TCA a fim de garantir o apropriado equilíbrio de redox requerido para obter alta produção de ácido succínico.

A presente invenção surpreendentemente des- cobriu que impedindo o fluxo de glicerol através das séries de reações de gldA e dhaKLM em uma célula bacteriana tendo uma atividade enzimática de PCK aumentada pode realçar a produção de ácido succínico usando gli- cerol como a fonte de carbono.

A presente invenção surpreendentemente também descobriu que outra melhora em produção de ácido succínico usan- do glicerol como a fonte de carbono pode ser obtida por métodos de impedir o fluxo de carbono através de séries de reações fermentativas em uma célu-

. 36/129 . la bacteriana com atividade de enzima PCK melhorada e deleções no gene gldA e opéron dhaKLM . a Os seguintes exemplos são fornecidos como meio de ilustração O da presente invenção. Estas invenções de modo algum limitam o escopo desta invenção. Uma pessoa experimentada no campo de microbiologia in- Ê dustrial seria capaz de praticar a presente invenção de diversas modalidades diferentes sem violar o espírito da presente invenção.

SEÇÃO EXPERIMENTAL Comentários gerais Cepas, meios e condições de crescimento Novos derivados de E. coli C (ATCC 8739) foram desenvolvidos para a produção de succinato usando uma única combinação de deleções de gene ligadas com a seleção com base no crescimento. As várias cepas de E. coli desenvolvidas na presente invenção foram depositadas com ARS Culture Collection com números de acessão como mostrado na Tabela 2.

O organismo microbiano da presente invenção pode ser cultiva- do em diversos diferentes meios de cultura bem conhecidos no campo de microbiologia. Por exemplo, as cepas mutantes e tipo selvagem de E. coli são cultivadas em meio Luria-Bertani (LB) contendo 1% (p/v) de triptona, 0,5% (p/v) de extrato de levedura, e 0,5% (p/v) de NaCl. Para a produção comercial do ácido orgânico usando processo fermentativo envolvendo mi- cro-organismo geneticamente modificado como biocatalisador, um meio de sal mineral mínimo suplementado com uma fonte de carbono é preferido. O uso de um meio de sal mineral mínimo como oposto a um meio rico seme- lhante ao meio LB reduz o custo para a produção de ácidos orgânicos em uma escala comercial.

Os meios minerais mínimos adequados para a presente inven- ção incluem o meio NBS (Causey e outro, 2007) e meio AMI (Martinez e ou- tro, 2007). O meio NBS contém 1 mM de betaína, 25,72 mM de KH2PO,, 28,71mMM de K2HPO,, 26,50 mM de (NHa)2HPO,s, 1 mM de MgSO,4.7H20, 0,1 mM de CaCl,.2H20, 0,15 mM de HC! de Tiamina, 5,92 uM de FeCI;6H20, 0,84 uM de COC!Iz.6H20, 0,59 uM de CuCl2. 2H20, 1,47 uM de ZnCb, 0,83

: 37/129 BR UM de Na2MoO, 2H20, e 0,81 uM de H3BO3. O meio AM1 contém 1 mM de betaína, 19,92 mM de (NH4)2HPO;,, 7,56 mM de NH,H2PO,, 1,5 mM de Mg- Ed SO4.7H20, 1,0 mM de Betaína-KCl, 8,88 uM de FeCI;6H20, 1,26 uM de o COChL.6H20, 0,88 uM de CuCl..2H,O0, 2,20 uM de ZnClz, 1,24 uM de NaMoOs2H2O, 1,21 uM de H3;BO;3 e 2,50 uM de MnNCIz4H20. Os elementos À de traço são preparados como um estoque de 1000X e continham os seguin- tes componentes: 1,6 g/L de FeCls, 0,2 g/L de CoCl2;-68H2O, 0,1 g/L de CuCl,, 0,2 g/L de ZnCl;-4H,0, 0,2 g/L de NaMoO;,, 0,05 g/L de H3BO;, e 0,33 g/L de MnCI3-4H20.

O meio mineral para produção microbiana de ácido orgânico é suplementado com uma fonte de carbono source. As fontes de carbono úteis na presente invenção incluem, porém não estão limitadas a açúcares de pentose semelhantes à xilose, açúcares de hexose semelhantes à glicose, fructose, e galactose e glicerol. A fonte de carbono pode também ser satis- feita fornecendo uma combinação de diferentes açúcares, tais como uma combinação de glicose e xilose. A fonte de carbono pode também ser deri- vada de uma hidrólise de amido e lignoceluloses. A hidrólise de carboidratos complexos tais como amido e lignoceluloses pode ser obtida ou usando pro- cessos de conversão termoquímica ou métodos enzimáticos bem conheci- dos na técnica. A fonte de carbono preferida para a produção industrial de ácido orgânico usando fermentação microbiana é hidrolisado lignocelulósico derivado da hidrólise de resíduos agrícolas ou de silvicultura. O hidrolisado lignocelulósico pode também ser fracionado para produzir uma fração enri- quecida por hexose e uma enriquecida por pentose e aquelas frações po- dem servir como a fonte de carbono para a produção comercial dos ácidos orgânicos, usando processo de fermentação microbiana. O hidrolisado ligno- celulósico pode também ser detoxificado para remover certos produtos qui- micos, tal como furfural, que são constatados serem tóxicos para diversos organismos microbianos acima de certas concentrações.

Cepas bacterianas, plasmídeos, e iniciadores usados neste es- tudo são listados nas tabelas 3, 7, 9, 14 e 15 e são explicados em detalhes nos locais apropriados na especificação abaixo. Durante a construção de

: cepa, culturas foram desenvolvidas aerobicamente a 30, 37, ou 39ºC em caldo Luria (10 g I* de triptona Difco, 5 g I' de extrato de levedura Difco e 5 fis g 1º de NaCl) contendo 2% (p/v) de glicose ou 5% (p/v) de arabinose.

Ne- e. nhum gene codificando resistência a antibiótico, plasmídeos, ou genes es- tranhos estão presentes nas cepas finais desenvolvidas para a produção de ' succinato.

Entretanto, durante os estágios anteriores de construção das dife- rentes cepas, vários marcadores de resistência a antibiótico foram usados.

Os antibióticos tais como ampicilina (50 mg 1), canamicina (50 mg 1), ou cloranfenicol (40 mg 1) foram adicionados quando necessário, para proces- sode seleção de antibiótico.

Fermentações Culturas de semente e fermentações foram desenvolvidas a 37ºC, 100 rpm em meio de sais minerais AM1 ou NBS contendo glicose, 100 mM de KHCO;z e 1 mM de betaína HCl.

Em alguns experimentos, licor de maceração de milho foi usado.

Ele é um subproduto da indústria de moagem úmida de milho.

Quando comparado ao extrato de levedura e peptona, ele é uma fonte barata de vitaminas e elementos de traço.

Para produção de succinato fermentativo, cepas foram desen- volvidas sem antibióticos a 37ºC em meio de sais minerais de NBS (Causey eoutro, 2004) suplementado com 10% (p/v) glicose e 100 mM de bicarbona- to de potássio a menos que de outro modo estabelecido.

Pré-inóculos para fermentação foram desenvolvidos transferindo-se colônias frescas para den- tro de um frasco de 250 ml (100 ml de meio de NBS, 2% de glicose). Após 16 horas (37ºC, 120 rpm), esta cultura foi diluída em um pequeno vaso de fermentação contendo 300 ml de meio de NBS (10% de glicose, 100 mM de bicarbonato de potássio) para fornecer um inóculo de 0,033 g de peso seco de célula (CDW) 1º.

Visto que o acúmulo de ácidos orgânicos no meio de crescimen- to tende a diminuir o pH do meio, é necessário adicionar agentes neutrali- zantes apropriados, como requerido para o meio de cultura.

O pH do vaso de cultura pode ser continuamente monitorado usando uma sonda de pH, e a base apropriada pode ser adicionada para manter o pH do meio de cres-

. 39/129 . cimento em torno do pH neutro.

As bases adequadas para manter o pH da cultura microbiana incluem, porém não estão limitadas a, NaOH, KOH, fr NH4SO,, Na2CO3z, NaHCO;3, e NH.CO;. As bases adequadas para este pro- o. pósito podem ser usadas sozinhas ou em combinação.

Em certos experimentos, fermentações foram automaticamente É mantidas em pH 7,0 adicionando-se base contendo CO, adicionado (carbo- nato de potássio a 24 M em hidróxido de potássio a 1,2 M). Subsequente- mente, pH foi mantido adicionando-se uma mistura de 1:1 de KCO; a 3M e KOH a 6N.

Os vasos de fermentação foram selados, exceto para uma agu- lhade16gauges que serve como uma abertura para a remoção da amostra.

Anaerobiose foi rapidamente obtida durante o crescimento com bicarbonato adicionado, servindo para garantir uma atmosfera de CO;. Métodos genéticos Métodos para deleções cromossômicas, integração, e remoção de genes de resistência a antibiótico foram anteriormente descritos (Datsen- ko e Wanner, 2000; Grabar e outro, 2006; Posfai e outro, 1997; Zhou e ou- tro, 2006). Na construção de cepas bacterianas usadas na presente inven- ção, genes cromossômicos foram deletados separadamente sem deixar segmentos de DNA estranho como anteriormente descrito. (Jantama e outro, 2008a, 2008b; Zhang e outro, 2007). A tecnologia de Red recombinase (Ge- ne Bridges GmbH, Dresden, Alemanha) foi usada para facilitar a integração cromossômica.

Plasmídeos e iniciadores usados durante a construção são listados nas tabelas 3, 7, 9, 14, e 15. Os plasmídeos e iniciadores usados na construção das cepas KJO12, KJ017, KJO32, KJOSO, KJO70, KJO71, KJO72, KJO073, e SZ204 são sumariados na tabela 3. Os iniciadores de sentido con- têm sequências que correspondem à terminal N de cada gene alvo (tipo ne- grito) seguido por 20 pares de base (sublinhado) correspondendo ao cassete FRT-Kkan-FRT.

Iniciadores antissentido contêm sequências que correspon- dem à região de terminal C de cada gene alvejado (tipo negrito) seguido por 20 pares de base (sublinhado) que corresponde ao cassete.

Fragmentos de DNA amplificados foram eletroporados em cepas de E. coli que alojam a õ 40/129 : Red recombinase (pKD46). Em recombinantes resultantes o cassete FRT- Kkan-FRT substituiu a região deletada do gene alvo por recombinação homó- io loga (evento de cruzamento duplo). O gene de resistência (FRT-kan-FRT) foi oo subsequentemente excisado do cromossoma com FLP recombinase usando oplasmídeo pFT-A, deixando uma região de cicatriz contendo um sítio FRT.

As deleções e integrações cromossômicas foram verificadas testando-se quanto aos marcadores antibióticos, análise de PCR, e análise de produtos de fermentação.

A transdução de fago P1 generalizado (Miller, 1992) foi u- sado para transferir a mutação de AfocA-pfiB::FRT-kan-FRT da cepa SZ204 emcepaKJO017 para produzir KJ0O32. Deleção de marcadores de FRT nas regiões adhE, IdhA, e focA-pfiB A estratégia usada para fazer deleções sequenciais de gene e remover os marcadores de FRT dos locos de adhE, IdhA e focA-pfiB foi des- crita anteriormente (Datsenko e Wanner, 2000; Grabar e outro, 2006; Janta- mae outro, 2008b; Zhang e outro, 2007). O plasmídeo pl OIl4151 foi usado como uma fonte de um cassete cat-sacB e Red recombinase (pKD46) foi usada para facilitar eventos de recombinação homóloca, de duplo cruzamen- to.

Resistência ao cloranfenicol foi usada para selecionar quanto à integra- ção.

O crescimento com sacarose foi usado para selecionar quanto à perda de sacB.

Com este método, deleções sucessivas foram construídas para produzir derivados de KJO79 que eliminaram todos os sítios de FRT.

Os ini- ciadores e plasmídeos usados na remoção de marcadores de FRT dos locos de adhE, IdhA e focA-pflB são listados na tabela 3. Para remover o sítio FRT na região AadhE, iniciadores híbridos —(WMadhEA/C) para a região alvo AadhE::FRT foram designados para conter aproximadamente 50 pares de base de homologia para as regiões 5' e 3' de sítio AadhE::FRT e 20 pares de base que correspondem ao gene cat-sacB de pLO!4151. Estes iniciadores foram usados para amplificação por PCR do cassete cat-sacB usando pLOI4151 como um padrão.

O produto de PCR foi usado para substituir o sítio de FRT em região AadhE com um cassete de cat-sacB por um evento de recombinação homólogo, de cruzamento duplo, com seleção quanto à resistência ao cloranfenicol, para produzir TG200.

: 41/129 : O gene adhE e sequência circundante foram amplificados de E. coli C usando iniciadores adhEascendentes/descendentes. O produto de mi, PCR contendo ychE'-adhE-ychG' (3,44 kb) foi clonado em pCR2.1-TOPO, e produzindo pLOl4413. Um segundo grupo de iniciadores (IO-adhEup/down) foiusado para amplificar o produto de dentro para fora com pLOI4413 como um padrão e Pfu polimerase para produzir um produto de extremidade em- botada em que um segmento interno de 2,6 kb de sequência de adhE foi deletado. Este produto de PCR de dentro para for a foi tratado com cinase e auto-ligado, resultando em pLOI4419. O produto de PCR amplificado de pLOI44189 (iniciadores adhEascendentes/descendentes) foi usado para subs- tituir o cassete de cat-sacB em TG200 com a sequência cromossômica de- sejada por outro evento de recombinação homóloga, duplo, com seleção de sacarose para perda de sacB. A cepa resultante foi designada TG201 (KJO079 com a FRT removida da região de AadhE). Os sítios de FRT nas regiões AIdhA e A(focA-pfiB) foram remo- vidos de um modo análogo àquele usado para deletar o sítio adhE::FRT. Grupos de iniciador adicional ((dhAA/C e IO-IldhAascend./descendente) usa- dos para remover o sítio de FRT em A/dhA são incluídos na Tabela 7 junta- mente com os plasmídeos correspondentes (pLOI4430 e pLOI4432). A cepa TG202 foi produzida substituindo esta região em TG201 com o produto de PCR de pl OI4151 (iniciadores WM/dhAA/C). O cassete cat-sacB em TG202 foi substituído com o produto de PCR de pLOI4432 (iniciadores /IdhAA/C) com seleção de sacarose para perda de sacB para produzir TG203. Os grupos iniciadores (ascend.focA/MidpflA e I10-ycaOascend./ IO-midpflAdescend.) e plasmídeos correspondentes (pLOI4415 e pLO14421) usados para remover o sítio de FRT em A(focA-pflB) são incluídos na tabela

7. A cepa TG204 foi produzida substituindo esta região em TG203 com o produto PCR de pLOI4151 (iniciadores WMpfIBA/C). O cassete cat-sacB em TG204 foi substituído com o produto PCR de pl OI4421 (iniciadores ascen- — dentesfocA/MidpflA) com seleção de sacarose para perda de sacB para pro- duzir KJ091. KJO91 é um derivado de KJ073 em que todos os sítios de FRT foram removidos das regiões AadhE, AIdhA e AfocA-pflB do cromossoma.

: Remoção do sítio de FRT em região ackA e construção de deleções de gene citF, sfcA, e pta-ackA.

Ns Para eliminar o sítio de FRT na região ackA de KJO73, plasmí- F deos contendo sequências da mutação desejada foram construídos como segue. DNA genômico de E. coli C foi usado como o padrão para a amplifi- õ cação de PCR de ackA com os iniciadores JMackAF 1/R1 que liga aproxima- damente 200 pares de base a montante e a jusante do gene ackA. O produ- to linear foi clonado em pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carisbad, CA) para pro- duzir pLOI4158. O plasmídeo pl Ol4158 foi então usado como um padrão paraPCT de dentro para for a com iniciadores JMackAup1/descencentes1 e Pfu polimerase para produzir um produto de extremidade embotada que não tem um segmento interno de 808 pares de base de ackA. O cassete cat- sacB flanqueado por Pacl (O fragmento Smal/Sfol de pLOI4162) foi então ligado no produto de PCR embotado para produzir pLOI4159. O plasmídeo pLOI4159 serviu como um padrão para amplificação de PCR (iniciadores JMackAF1/R1). Este produto de PCR foi usado para substituir o sítio de FRT na região ackA de KJO73 por recombinação homóloga de cruzamento duplo, com seleção quanto à resistência ao cloranfenicol. O clone resultante foi de- signado KJO76.

O plasmídeo pLOI4159 foi também digerido com Pacl para re- mover o cassete cat-sacB e autoligado para produzir pLO14160, retendo a sequência de interrupção translacional de 18 pares de base. O plasmídeo PLOI4160 serviu como um padrão de PCR (iniciadores JMackAF1/R1). Este fragmento amplificado foi usado para substituir o cassete cat-sacB em KJO76 por recombinação homóloga de cruzamento duplo comseleção quanto àa perda de sacB. Após a remoção de pKD486 por crescimento em temperatura elevada, a cepa resultante foi designada KJO079. Nesta cepa, a região dele- tada foi substituída pela sequência de interrupção translacional de 18 pares de base.

A estratégia usada acima para remover o sítio de FRT da região ackA foi empregada para fazer deleções sequenciais de citF, sfcA e pta- ackA e para substituir as regiões deletadas com a sequência de interrupção

S 43/129 * translacional de 18 pares de base. Os grupos iniciadores adicionais (citFas- cend./descendente e citF2/3) usado para construir a deleção de citF são in- Ar cluídos na tabela 7 juntamente com os plasmídeos correspondentes oo (PLOI4629, pLOI4630, e pLOI4631). A cepa resultante foi designada KJ104.

o O gene sfcA foi deletado de cepas KJ104 e KJ110, resultando : em cepas designadas KJ119 e KJ122, respectivamente. Grupos de iniciador adicionais (sfeAascend./desc. e sfcA1/2) usados para construir as deleções SfcA são incluídos na tabela 7 juntamente com os correspondentes plasmí- deos (pLO/4283, pl Ol4284, e pLOt4285).

O opéron ackA-pta (incluindo a sequência de interrupção trans- lacional sintética) foi deletado de KJ122 para produzir a cepa KJ134. Grupos de iniciador adicionais (ackAup/ptadescend, e ackA2/pta2) usados para construir esta deleção são incluídos na tabela 7 juntamente com os corres- pondentes plasmídeos (pLOI4710, pLOI4711, e pLOI4712). A cepa KJ134 não contém quaisquer sítios de FRT ou genes estranhos.

Construção de plLOI4162 contendo um cassete cat-sacB para deleções de gene sem marcador Para facilitar a deleção sequencial de DNA cromossômico, plasmídeo pLOI4162 (figura 8) foi construído com um cassete cat-sacB re- —movívele a opção para incluir um segmento de 18 pares de base de DNA sintético com códons de interrupção em todas as estruturas de leitura. Este plasmídeo é composto de sequências sintéticas e partes de plasmídeos PLO/I2228 (Martinez-Morales e outro, 1999), pLOI2511 (Underwood e outro, 2002), e pELO4 (Lee e outro, 2001; Thomason e outro, 2005). Usando pELO04 como um padrão, PCR de dentro para for a foi realizado com os iniciadores JMpELO4F1/R1 para eliminar sítios Smal e BamHIl indesejados entre os ge- nes cat e sacB. O produto amplificado foi digerido com Bg/ll (dentro de am- bos os iniciadores) e autoligado para produzir pLOI4152. O plasmídeo PLOI4131 foi construído por ligação do fragmento FRT-cat-FRT (Klenow- treated Banl, Clal) de pLOI2228 em sítios compatíveis de pLOI2511 (Clal, Nhel tratado por Klenow). O plasmídeo pLOI4131 foi subsequentemente di- gerido com EcoRI e auto-ligado para remover o fragmento FRT-cat-FRT pa-

ra produzir pl OI4145, retendo os sítios individuais Kasl e Xmal.

Um seg- mento poliligador (S(PBXPS) foi preparado por temperamento de oligonucle- Pi otídeos complementares (SfPBXPSsense e SIPBXPScomp). Após digestão é com Kasl e Xmal, este segmento foi ligado em sítios correspondentes de pLOIl4145 para produzir plLOI4153. O cassete cat-sacB modificado em É PLOI4152 foi amplificado por PCR usando o grupo iniciador JMcatsac- Bup3/descend.3. Após digestão com BamHlI e Xhol, este cassete foi ligado nos sítios correspondentes de pl Ol4153 para produzir pl 014146. Para criar uma região de 18 pares de base (SGCCTAATTAATTAATCCC3') (SEQ ID NO: 1) com códons de interrupção em todas as seis estruturas de leitura, PLOI4146 foi digerido com Pacl e autoligado para produzir pLOI4154 (não mostrado), removendo o cassete cat-sacB.

Duas bases adicionais (T e A) foram inseridas entre os sítios Sfol e Pacl de pl OIl4154 usando iniciadores mutagênicos (JM4161sense/comp) e amplificação de plasmídeo linear para produzir pLOI4161. Finalmente, o fragmento digerido por Pacl de pLOI4146 contendo o cassete cat-sacB foi ligado no sítio digerido por Pacl de PLOI4161 para produzir pLOI4162 (GenBank acessão EU531506). Deleção de genes mgsA e poxB Um método modificado foi desenvolvido para deletar genes cro- —mossômicos de E. coli usando processo de recombinação homóloga de du- as etapas (Thomason e outro, 2005). Com este método, nenhum gene anti- biótico ou sequências de cicatrização permanece sobre o cromossoma após a deleção do gene.

Na primeira recombinação, parte do gene alvo foi substi- tuída por um cassete de DNA contendo um gene de resistência ao cloranfe- —nicol(caf)e um gene de levansucrase (sacB). Na segunda recombinação, o cassete cat-sacB foi substituído com sequências nativas omitindo a região de deleção.

Células contendo o gene sacB acumulam levan durante a incu- bação com sacarose e são mortas.

Recombinantes sobreviventes são alta- mente enriquecidos para perda do cassete cat-sacB.

Um cassete foi construído para facilitar as deleções de gene.

À região cat-sacB foi amplificada de pEL 04 (Lee e outro, 2001; Thomason e outro, 2005) por PCR usando o grupo iniciador JMcatsacB (Tabela 3), dige-

. rido com Nhel, e ligado no correspondente sítio de pLOI3421 para produzir PLOI4151. O cassete cat-sacB foi amplificado por PCR usando pLOI4151 f (padrão) e o grupo iniciador cat-ascendente2/sacB-descendente2 (sítio E- oo coRV incluído em cada iniciador), digerido com EcoRV, e usado em ligações subsequentes.

É O gene mgsA e regiões de 500 pares de base vizinhas (yccT- mgsA-helD', 1435 pares de base) foram amplificados usando o grupo inicia- dor mgsA-ascendente/descendente e clonados no vetor pCR2.1-TOPO (Invi- trogen) para produzir o plasmídeo pLO1!4228. Uma preparação diluída 1000 vezes deste DNA de plasmídeo serviu como um padrão para amplificação de dentro para fora usando o grupo iniciador mgsA-1/2 (ambos os iniciadores dentro do gene mgsA e faceando externamente). O fragmento de 4958 pa- res de base resultante contendo o réplicon foi ligado ao cassete cat-sacB digerido por EcoRV amplificado de pLOI4151 para produzir pLO14229. Este fragmento de 4958 pares de base foi também usado para construir um se- gundo plasmídeo, pLO14230 (fosforilação e auto-ligação). Em pLOI4230, a região central de mgsA é ausente (ycceT-mgsA"-mgsA" — hel).

Após digestão de pLOI4229 e pLOI4230 com Xmnl (dentro do vetor), cada um serviu como um padrão para amplificação usando o grupo iniciador mgsA-ascendente/descendente para produzir os fragmentos de DNA lineares para a etapa | de integração (ycceT-mgsA"- cat-sacB- mgsA"- helD') e etapa 1l (yceT-mgsA-mgsA'"- helD'), respectivamente. Após a ele- troporação do fragmento de etapa | em KJO6O contendo pKD46 (Red recom- binase) e 2 horas de incubação a 30ºC para permitir a expressão e segrega- ção, recombinantes foram selecionados de resistência ao cloranfenicol (40 mg 1º) e ampicilina (20 mg 1) sobre placas (30ºC, 18 h). Três clones foram escolhidos, desenvolvidos em caldo Luria com ampicilina e 5% p/v de arabi- nose, e preparados para eletroporação. Após eletroporação com o fragmen- to de etapa !l, as células foram incubadas a 37ºC durante 4 horas e transfe- ridas para dentro de um frasco de 250 ml contendo 100 m! de LB modificado (100 mM de tampão de MOPS adicionado e NaCl omitido) contendo 10% de sacarose. Após incubação durante a noite (37ºC), clones foram selecionados

. sobre placas LB modificadas (nenhum NaCl; 100 mM de MOPS adicionado) contendo 6% de sacarose (39ºC, 16 horas). Os clones resultantes foram tes- E tados quanto à perda de resistência à ampicilina e cloranfenicol. A constru- o ção foi também confirmada por análise de PCR. Um clone sem o gene mgsA foiselecionado e designado KJO70.

E O gene poxB foi deletado de KJO71 de uma maneira análoga àquela usada para deletar o gene mgsA. Grupos iniciadores adicionais (poxB-ascendente/descendente e poxB-1/2) usados para construir a deleção de poxB são incluídos na tabela 3, juntamente com os correspondentes plasmídeos (pLOl4274, plLOI4275, e pl Ol4276). A cepa resultante foi desig- nada KJO072. Construção de deleções de gene em tdcDE, e aspC O gene tdcDE e regiões de 1000 pares de base vizinhas (tdeG”- tdcFED-tdcC', 5325 pares de base) foram amplificados usando iniciadores tdcDEascendente/descendente e clonados no vetor pCR2.1-TOPO para produzir o plasmídeo pLOI4515. Uma preparação diluída 1000 vezes deste DNA de plasmídeo serviu como um padrão para amplificação de dentro para fora usando os iniciadores tdcDEF7/R7 (ambos os iniciadores dentro do ge- ne tdcDE e faceando externamente). O fragmento de 6861 pares de base resultante contendo o réplicon, foi ligado ao cassete cat-sacB digerido por Smal/Sfol de pLOI4162 (iniciadores JmcatsacBascend.3/descend.3) para produzir pLOIl4516. Este fragmento de 6861 pares de base foi também usa- do para construir um segundo plasmídeo, pLOIl4517 (tratado por cinase, au- toligação) contendo uma deleção de tcdD e fdcE. Os fragmentos de PCR —amplificados de pLOI4516 e plLOI4517 (iniciadores tdcDEascend./descend.) foram usados para substituir a região tdcDE em KJO91. Os clones resultan- tes foram testados quanto à perda de resistência à ampicilina e cloranfenicol. O gene aspC foi deletado de KJ104 de uma maneira análoga àquela usada para deletar o gene tdcDE. Os grupos iniciadores adicionais (aspCascend./descend.e aspC1/2) usados para construir a deleção de aspC são incluídos na tabela 7, juntamente com os correspondentes plasmídeos (PLOI4280, pLOI4281, e pLO1l4282). A cepa resultante foi designada KJ110.

: Nem KJO098, nem KJ110 contém qualquer sequência intermediária dentro das respectivas regiões deletadas (tdcDE e aspC). Dos Construção de deleções de gene em gldA e dhaKLM E As cepas E. coli XZ464, XZ465, e XZ466 foram derivadas da ce- paef. coli XZ632 usando os métodos genéticos descritos acima.

A caracte- rística relevante das cepas E. coli XZ464, XZ465, XZ466 e XZ632 é forneci- da na Tabela 15. Análise de RT-PCR em tempo real RT-PCR em tempo real foi usado para medir nível de RNA men- —sageiro como previamente descrito (Jarboe e outro, 2008). Células foram cultivadas em meio de NBS com 5% ou 10% de glicose e colhidas durante crescimento intermediário por agitação em um banho de gelo seco/etanol, seguido por centrifugação e armazenamento a -80ºC em RNALater (Qiagen, Valencia CA) até a purificação.

Purificação de RNA foi realizada com colu- nas RNeasy Mini (Qiagen), seguido por digestão com DNasel (Invitrogen). Transcrição reversa com Superscript 1l (Invitrogen, Carlsbad CA) usado 50 ng de RNA total como modelo.

PCR em tempo real foi realizada dentro um Bio-Rad iCycler com misturador SYBR Green RT-PCR (Bio-Rad, Hercules CA). RNA foi conferido para contaminação de DNA genômica conduzindo-se umRT-PCR na ausência de transcrição reversa.

Abundância de transcrição foi estimada usando o DNA genômico como um padrão e níveis de expres- são foram normalizados pelo gene de birA, um repressor transcricional (Jar- boe e outro, 2008). Iniciadores de RT-PCR usados para pck e birA são lista- dos na Tabela 3. — Sequenciamento de região de pck Para saber se houve qualquer mutação no gene pck de KJ073, a região de codificação e região de promotor (cerca de 800 bp à frente da re- gião de codificação) de gene pck igualmente em KJ012 e KJO073 foram am- pliados por PfuUltra High Didelity DNA Polymerase (Stratagene; Wilmington, DE) Conjunto de pck-F/R foi usado para amplificar a região de codificação através do terminador transcricional (Tabela 9). Conjunto de iniciador pck-2/3 foi usado para amplificar a região de promotor.

Sequenciamento DNA foi

.: fornecido pela University of Florida Interdisciplinary Center for Biotechnology Research (com Applied Biosystems autosequencers).

Ea Evolução metabólica à Células das fermentações controladas por pH foram serialmente transferidas em 24 horas para encorajar evolução metabólica através de se- : leção com base em crescimento. O inóculo, aproximadamente 1/100 do vo- lume dos novos meios, foi adicionado diretamente aos meios frescos, pré- aquecidos para uma ODs5o de partida de 0,05. Clones com características de fermentação melhoradas foram isolados. A estratégia de evolução metabóli- cafoiaplicada para melhorar o rendimento da produção de succinato. Análises Crescimento celular: Massa celular foi estimada a partir da den- sidade óptica em 550 nm (OD 1,0 = 333 mg de peso seco de célula Iº) com um espectrofotômetro Bausch & Lomb Spectronic 70.

A produção do ácido orgânico pelo micro-organismo genetica- mente criado pode ser confirmada e quantificada usando-se técnicas apro- priadas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, técnicas de HPLC podem ser usadas para medir a quantidade do ácido orgânico produzido pelo clone selecionado. A tecnologia de HPLC é da mesma forma útil determinando-se a pureza do ácido orgânico produzido pelos clones selecionados. Ácidos orgânicos e açúcares foram determinados usando-se cromatografia líquida de alto desempenho (Grabar e outro, 2006; Zhang e outro, 2007).

Ácido succínico e outros ácidos orgânicos presentes no caldo de fermentação foram analisados em aparato de HPLC Agilent 1200 com colu- na BioRad Aminex HPX-87H. Cátion H* BioRad Microguard foi usado como uma coluna de guarda. Os padrões para análise de HPLC foram preparados em 0,008N de ácido sulfúrico. A temperatura de coluna de HPLC foi mantida a 50ºC. Ácido sulfúrico em concentração de 0,008N foi usado como uma fase móvel na taxa de fluxo de 0,6 mi/min. Quantificação de vários compo- —nentes foi feita medindo-se sua absorção em 210 nm.

Ensaio de enzima Células foram colhidas por centrifugação (8.000 x g durante 5

.- 49/129 . minutos a 4ºC) durante crescimento de meio-log, lavadas com 100 mM de tampão de Tris-HCI! frio (pH 7,0), e ressuspensas no mesmo tampão (1 ml). à. Depois de rompimento celular usando um Fast Prep-24 (MP Biomedicals, . Solon, OH), preparações foram clarificadas por centrifugação (13.000 x g durante15 minutos). Proteína foi medida pelo método de BCA (Pierce, Rock- ' ford, IL) usando albumina de soro bovina como um padrão.

Atividade de PEP carboxilase foi medida como descrito por Ca- novas e Kornberg (1969). A mistura reacional continha 100 mM de tampão de Tris-HCI (pH 8,0), 10 mM de MgCI2, 1 mM de DTT, 25 mM de NaHCO;, 0,2mM de NADH, 20 U de malato de desidrogenase, e extrato bruto. A mis- tura de ensaio foi incubada durante 15 minutos a 37ºC para ativar a enzima, depois da qual a reação foi iniciada por adição de 10 mM de PEP.

Atividade de PEP carboxicinase foi medida como descrito por Van der Werf e outro, (1997). A mistura reacional continha 100 mM de tam- pãodeMES (pH6,6), 10 MM de MgCl2, 75 MM de NaHCO;3, 5 mM de MnCl, 50 mM de PAD, 1 mM de DTT, 0,2 mM de NADH, 20 U de malato desidro- genase, e extrato bruto. A reação foi iniciada por adição de 10 mM de PEP.

Atividade de enzima málica (direção de carboxilação) foi medida como descrito por Stols e Donnelly (1997). A mistura reacional continha 100 mM de tampão de Tris-HCI (pH 7,5), 25 mM de NaHCO;3, 1 MM de MnClk,, 1 mM de DTT, 0,2 mM de NADH, e extrato bruto. A reação foi iniciada por adi- ção de 25 mM de piruvato. Este método de ensaio foi inadequado para me- dida de atividade de SÍcA em E. coli tipo selvagem devido à presença de lactato desidrogenase.

A atividade de B-galactosidase foi medida como descrito por Mil- ler (1992). Em todos os ensaios, uma unidade de atividade representa a quantidade de enzima requerida para oxidar ou reduzir 1 nmol de substrato por minuto.

Exemplo 1 Construção de cepa de KJ073 para produção de succinato Na construção de uma cepa adequada para produção de ácido succínico em meio mínimo contendo 5% de glicose, igualmente uma abor-

: 50/129

BR dagem de projeto racional e evolução metabólica foram seguidos.

Por inspe- ção da figura 1 ilustrando as séries de fermentação padrões geralmente a- To ceitos para E. coli, um projeto racional para a engenharia metabólica de ce- f pas produzindo succinato foi planejado em que as inativações insercionais foram feitas em genes codificando as etapas terminais para todos os produ- tos alternativos: lactato (/dhA), etanol (adhE) e acetato (ackA). Resultados desta engenharia metabólica para projeto racional foram completamente i- nesperadas.

A cepa KJ012 (AIdhA::FRT AadhE::FRT AackA::FRT) resultante da inativação insercional de genes /dhA, adhE e ack cresceram muito po- bremente sob condições anaeróbiccas em meio de sal mineral contendo 5% de glicose (278 mM) e produziu acetato em vez de succinato como o produto de fermentação primário.

Contador para expectativas de projeto racional, succinato permaneceu como um produto menor.

Rendimentos molares de succinato com base em glicose metabolizada foram inalterados como um resultado destas mutações.

O rendimento de succinato foi constatado ser 0,2 mol de succinato por mol de glicose igualmente para as cepas de origem e KJ012 durante a fermentação em meio de sais minerais de NBS contendo 5% de glicose.

Nós confirmamos que meio de sais minerais de NBS contêm todos os nutrientes minerais necessários para o crescimento de KJO012 incu- bando-se sob condições aeróbiccas (frasco agitado aeróbicco; 5% de glico- se). Em frascos agitados aeróbiccos, produções de célula para KJ012 foram 5 vezes mais altas do que durante o crescimento anaeróbicco e 75% do que de E. coli C (origem) durante o crescimento anaeróbicco.

Estes resultados da mesma forma confirmaram que todas as séries de reações biossintéticas centrais permanecem funcionais em KJ012. Quando nutrientes complexos estavam presentes (caldo de Luri- a), a produção de succinato fermentativa por KJ012 aumentou 20 vezes quando comparada a KJ012 em meio de sais mínimos e a produção molar para succinato aumentou em 3,5 vezes.

Claramente, projeto racional com base em séries de reações primárias é melhor adequado para demonstra- ções acadêmicas ou para processos de projeto pretendidos para uso com nutrientes complexos.

A base para o crescimento pobre, produção de succinato pobre, e o aumento na produção de acetato por KJ012 durante metabolismo anae- fo. róbicco em meio de sais minerais é desconhecida. Estas são consequências : inesperadas que resultaram em engenharia metabólica usando projeto ra- cionalcom base em quadros de série de reação padrões. Em médio mínimo, : desígnios racionais para engenharia metabólica não são previsíveis. A cepa resultante, KJ012, foi inferior a de origem em crescimento e não melhor do que a de origem para produção de succinato. KJO12(4/ldhA:FRT AadhE:FRT AackA::FRT) cresceu pobremente em comparação à E. coli C, exibiu taxas inferiores de produção de succinato, e não fornece produções molares melhores (Tabela 4).

Apesar destes resultados, a transferência serial desta cepa foi experimentada como um método para cosselecionar o crescimento melhora- do e produção de succinato com base na seguinte razão. A série de reação primária para a fermentação de glicose em succinato (figura 1A e figura 2A) é geralmente pensada usar fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) para a etapa de carboxilação (Unden e Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Keseler e outro, 2005; Millard e outro, 1996; Gottschalk, 1985; Karp e outro, 2007). Esta en- zima de carboxilação não conserva o fosfato de alta energia em fosfoenolpi- ruvato e reduz o ATP líquido disponível para o crescimento. Séries de rea- ções alternativas para produção de succinato podem ser previstas usando o repertório de genes de E. coli conhecidos os quais poderiam aumentar as produções de ATP e poderiam desse modo aumentar o crescimento (figura 1A; figuras 2B, 2C e 2D). Entretanto, nenhuma destas rotinas alternativas — mostrou funcionar para a produção de succinato durante a fermentação com cepas nativas de E. coli. Enzimas fundamentais nestas rotinas alternativas são reprimidas por glicose e são normalmente ativas durante gliconeogêne- se. Tipicamente, níveis destas enzimas gliconeogênicas variam inversamen- te com a disponibilidade de glicose e outros metabólitos (Goldie e Sanwal, 1980a; Wright e Sanwal, 1969; Sanwal e Smando, 1969a) e funcionam na direção inversa, descarboxilação (Keseler e outro, 2005; Oh e outro, 2002; Kao e outro, 2005; Stols e Donnelly, 1997; Samuelov e outro, 1991; Sanwal,

: 1970a; Delbaere e outro, 2004; Goldie e Sanwal, 1980b; Sanwal e Smando, 1969b; Sanwal 1970b).

* A enzima fundamental para um destes, enzima málica ligada a . NADH (sfcA) (figura 2B), demonstrou ser capaz de aumentar a produção de succinatoem E. coli porém superexpressão requerida de um plasmídeo para fazer desse modo (Stols e Donnelly, 1997). Entretanto, nenhuma destas sé- ries de reações alternativas seria esperada ser funcional em cepas nativas de E. coli ou KJ012 durante o crescimento anaeróbicco com níveis altos de glicose. Transferências seriais de KJ012 com seleção para crescimento me- lhorado ofereceram uma oportunidade de selecionar a ativação mutacional de rotinas alternativas para produção de succinato (figura 1B) que mantinha o equilíbrio de redox e aumentar as produções de ATP. Evolução metabólica de KJ012 foi realizada sequencialmente subcultivando-se sob vários regimes usando fermentadores pequenos, con- trolados por pH para melhorar o crescimento. KJO012 foi serialmente transfe- rido em meio de glicose de NBS sob condições fermentativas tão rapidamen- te quanto permitido o crescimento (figura 3A; figura 4A; figura 5). Crescimen- to permaneceu lento com 4-5 dias de incubação requerida entre as primeiras 9 transferências, em seguida aumentou dramaticamente permitindo fazer transferências em intervalos de 24 horas. Este evento foi acompanhado por um aumento em acetato (figura 4A) com pequena melhoria na produção de succinato. Depois de 27 transferências (60 dias), KOH foi substituído com uma mistura de 1:1 de 3M de KCO; e 6N de KOH para fornecer dióxido de carbono adicional (100 mM inicialmente adicionados a todo o meio de sais minerais de NBS). Transferências contínuas levaram à melhorias na produ- ção de succinato. Um total de 40 transferências foi feito em 5% de glicose (227 mM), seguido por mais 40 transferências em 10% de glicose (555 mM). Durante as transferências em 10% de glicose, produções de succinato per- maneceram aproximadamente 0,7 mol por mol de glicose metabolizada com lactato, acetato, e formiato como coprodutos (Tabela 4). Este rendimento foi 3 vezes mais alto do que as cepas de E. coli C e KJO012. Um clone foi isolado e designado KJ017. Seleção para melhorias no crescimento de KJ012 para

: produzir KJ017 co-selecionada para melhorias na produção de succinato

(taxa, título, e produção molar). pos Succinato produzido por E. coli usando a série de reação geral- . mente considerada como a série de ração de fermentação nativa com base em fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) desgasta a energia de fosfoenolpiru- : vato produzindo-se fosfato inorgânico.

Um ATP é perdido por succinato pro- duzido por esta série de reação (figura 1; figura 6). A conservação desta e- nergia como ATP usando sistemas de enzima alternativos representa uma oportunidade de aumentar o crescimento celular e cosselecionar a produção de succinato aumentada.

Com base em genes conhecidos em E. coli, três outras rotinas de enzima para produção de succinato foram previstas que conservariam ATP e poderiam desse modo aumentar crescimento (figura 1; figura 6). Entretanto, todas as etapas de carboxilação nestas rotinas alterna- tivas são acreditadas funcionar na direção inversa (descarboxilação) princi- palmente para gliconeogênese durante o crescimento em substratos tais como ácidos orgânicos (Keseler e outro, 2005; Oh e outro, 2002; Kao e ou- tro, 2005; Stols e Donneily, 1997; Samuelov e outro, 1991; Sanwal, 1970a; Delbaere e outro, 2004; Goldie e Sanwal, 1980b; Sanwal e Smando, 1969b; Sanwal, 1970b). Para testar a hipótese que a seleção com base no cresci- mento para desenvolver KJ017 realmente ativou uma ou mais destas rotinas alternativas, as atividades das quatro enzimas de carboxilação foram compa- radas em cepa ATCC 8739, KJ012 tipo selvagem (deletada em séries de reações de fermentação primárias), e a cepa KJ017 metabolicamente evolu- ida (Tabela 5). Atividades de PEP carboxilase foram similarmente baixas em tudo, 20a30U (mg de proteina). Atividade de enzima málica ligada a NA- DH (SfcA; direção de carboxilação) foi da mesma forma baixa e a atividade de enzima málica ligada a NADPH (MaeB; direção de carboxilação) foi inde- tectável.

Em comparação, a atividade de PEP carboxicinase foi aumentada em 4 vezes em KJ017 quando comparada a KJO012, consistente com uma hipótese que a seleção para crescimento melhorado cosselecionaria a pro- dução aumentada de succinato através de produções de ATP crescentes, uma consequência do aumento da expressão de uma rotina de conservação

: de energia para produção de succinato. Outras seleções com base em crescimento e deleções de gene adicionais foram usadas para construir muitas cepas adicionais com outras melhorias em crescimento e produção de succinato (figura 3 e figura 4).

Durante crescimento com 10% de (p/v) glicose, coprodutos inde- sejados (acetato, formiato, e lactato) foram abundantes em fermentações com KJO017 (AIIhA::FRT A4adhE::FRT AackA::FRT) apesar das deleções de genes codificando as atividades de lactato desidrogenase primárias (IdhA) e acetato cinase (ackA) (Tabela 4). Produção de lactato e acetato poderia da mesma forma resultar em produções de ATP mais altas, uma base para se- leção com base em crescimento (figura 1A).

O gene codificando piruvato formatoliase (pflB) foi deletado a partir de KJ017 para eliminar a perda do redutor como formiato e um ace- til-CoA em excesso, uma fonte potencial de acetato. O transportador de formiato a montante (focA) neste opéron foi da mesma forma deletado. Co- mo esperado, esta cepa deletada (KJ032) não cresceu sem acetato confir- mando que esta é a rotina primária para produção de acetil-CoA em KJO017 (figura 3C). Deleção de pflB é bem conhecida por causar auxotrofia de ace- tato sob condições anaeróbiccas (Sawers e Bock, 1988). Crescimento e pro- dução de succinato por KJ032 foram restabelecidos pela adição de 20 mM de acetato (figura 3C, figura 4C, e figura 5). Produção de formiato e acetato foi substancialmente reduzida como resultado de deleção de pflB (focA). Embora esta cepa tenha requerido acetato para crescimento, acetato adicio- nal foi da mesma forma produzido durante a fermentação. O mesmo fenô- meno foi previamente relatado para cepas deletadas por pflB durante a construção de biocatalisadores K-12 de E. coli para produção de piruvato (Causey e outro, 2004). Níveis de lactato foram da mesma forma reduzidos em KJO032 (Tabela 4; figura 4C). Transferências subsequentes foram acom- panhadas por melhorias no crescimento e produção de succinato. Acetato — adicionado foi reduzido, tamanho de inóculos foi reduzido, e concentração de glicose foi dobrada (10% p/v) durante transferências subsequentes (figura 4D). Depois das outras transferências, acetato foi omitido e uma cepa foi

- 55/129 . desenvolvida a qual não foi mais auxotrófica para acetato, presumivelmente devido à expressão aumentada de outro gene.

Entretanto, as produções de Sr succinato declinaram na eliminação de acetato adicionado enquanto níveis : de malato e acetato aumentaram.

Um clone foi isolado da última transferên- cia e designado, KJOSO (AIdhA::FRT AadhE:FRT AackA:FRT AfocA- pfIB::FRT). Esta cepa produziu 1 mol de succinato por mo! de glicose meta- bolizada em meios de sais minerais de NBS com 10% de glicose.

A quantidade pequena de lactato presente nos caldos de fer- mentação de várias cepas é presumida originar-se da série de reação de metilglioxal sintase (figura 6; Grabar e outro, 2006). Embora isto represente uma perda pequena de produção, a produção de lactato por esta série de reação é indicativa de acúmulo de metilglioxal, um inibidor de crescimento e glicólise (Egyud e Szent-Gyorgyi, 1966; Grabar e outro, 2006; Hopper Coo- per, 1971). Produção de metilglioxal e lactato foi eliminada deletando-se o gene de mgsA (metilglioxal sintase) em KJO6O para produzir KJO70 (AIdhA::FRT A4adhE::FRT AackA::FRT AfocA-pfiB::FRT AmgsA). Cepa KJO70 foi inicialmente subcultivada em 5% de (p/v) glicose (figura 4E, e figura 5). Deleção de mgsA é presumida ter fluxo glicolítico aumentado como compro- vado pelo acúmulo de piruvato no meio (Tabela 4). Este aumento em fluxo —glicolítico pode da mesma forma ser responsável pelo outro declínio na rela- ção de succinato/malato devido à produção aumentada de oxaloacetato, um inibidor alostérico de fumarato reductase (lverson e outro, 2002; Sanwal, 19700). A transferência 21, glicose foi dobrada em 10% (p/v) e transfe- —rências continuaram.

Este nível mais alto de glicose e transferências subse- quentes resultaram em uma nova cepa que foi isolada da subcultura final e KJO71 designado (AIIhA::FRT AadhE:FRT AackA::FRT AfocA-pfilB::FRT (mgsA). Esta cepa pode ser útil para produção de malato.

Embora a conversão de glicose para acetato seja redox neutro, adivisãode carbono para acetato diminui a produção de succinato e malato.

Piruvato oxidase (poxB) representa uma fonte potencial de acetato e CO, durante a incubação sob condições microaerofílicas (Causey e outro, 2004).

: 56/129 : Embora não deveria funcionar para oxidar piruvato sob condição anaeróbic- ca, poxB foi alvejado para deleção de gene (figura 6). Como esperado, a EO deleção de poxB para produzir KJO72 (AIIhA::FRT AadhE::FRT AackA::FRT É AfocA-pfiB::FRT AmgsA 4poxB) não reduz a produção de acetato indicando que séries de reações alternativas são envolvidas na produção de acetato. Entretanto, a eliminação de poxB resultou em mudanças inesperadas em produtos de fermentação, incluindo um aumento em succinato (Tabela 4; figura 4F). O mecanismo para esta melhoria na produção de succinato é desconhecido, porém, pode estar relacionado a outras atividades de piruvato oxidasetalcomo produção de acetoina, descarboxilação, e carboligação (Ajl e Werkman, 1948; Chang e Cronan, 2000).

Cepa KJO072 foi submetida a 40 outros ciclos de evolução meta- bólica em meio de AM1, um meio de sal inferior, com 10% de (p/v) glicose (Tabela 4;:figura 4F, e figura 5). Melhorias em crescimento, produção celular e produção de succinato foram observadas durante estas transferências. Níveis de malato, piruvato e acetato da mesma forma aumentaram. Um clo- ne foi isolado da transferência final e KJO73 alvo (AIIhA::FRT AadhE::FRT AackA::FRT 4ApflB::FRT AmgsA 4poxB).

A cepa KJ073 reteve a rotina de fosfoenolpiruvato carboxicinase para carboxilação (Tabela 5). Atividade in vitro desta cepa foi 45 vezes mais alta do que aquela de KJ012 e 10 vezes mais alta do que KJ017 fornecendo outra evidência para o acoplamento de conservação de energia para produ- ção de succinato e crescimento e também estabelecer a base usada para seleção.

Aumentos grandes na atividade de PEP carboxicinase foram bem correlacionados com melhorias na produção celular e produção de suc- cinato (Tabela 5). A partir de KJ012 a KJ017 (evolução metabólica), ativida- de de PEP carboxicinase aumentou 4,3 vezes, a produção celular aumentou 5,7 vezes, e produção de succinato aumentou 8,8 vezes. A partir de KJ017 a —KJO6O (deleção de pflB seguido por evolução metabólica), atividade de PEP carboxicinase aumentou 12 vezes, produção celular aumentou 1,3 vezes, e produção de succinato aumentou 2,6 vezes. A partir de KJO6O0 a KJO71 (de-

. leção de mgsA seguido por evolução metabólica), atividade de PEP carboxi- cinase diminuiu em 92%, produção celular diminuiu em 45%, e produção de o succinato diminuiu em 63%. A partir de KJO71 a KJO73 (deleção de poxB . seguido por evolução metabólica), atividade de PEP carboxicinase, produ- ção celular, e produção de succinato foram restabelecidas em níveis equiva- Ú lentes a KJO60.

O pck e regiões circundantes foram clonados a partir de KJ012 e KJ073, e sequenciadas. Nenhuma mudança foi encontrada na região de co- dificação. Modificações pós-translacionais ausentes, as propriedades catalí- ticasda enzima deveriam estar inalteradas. Uma única mutação foi detecta- da na região de promotor de pck, G a A em sítio de -64 bp relativo ao sítio de início de tradução. Esta mutação estava atrás do sítio de começo de trans- crição que é sítio de -139 bp relativo ao sítio de início translacional. Investigadores prévios notaram que os parâmetros cinéticos de carboxilase de fosfoenolpiruvato (ppc) e fosfoenolpiruvato carboxicinase (pck) podem ter efeitos importantes em carboxilação e produção de succina- to (Millard e outro, 1996; a Kim e outro, 2004). O Km para bicarbonato para E. coli fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) é 0,15 mM (Morikawa e outro, 1980), 9 vezes mais baixa (13 mM) do que E. coli fosfoenolpiruvato carboxi- cinase (pck) (Krebs e Bridger, 1980). Embora superexpressão de pck de E. coli usando plasmídeo de multicópia aumentou atividade de fosfoenolpiruva- to carboxicinase em 50 vezes, foi relatado não ter efeito na produção de succinato (Millard e outro, 1996). Produção de succinato não foi da mesma forma aumentada quando fosfoenolpiruvato carboxicinase de Anaerobiospi- rillum succiniciproducens foi superexpresso em E. coli K12 (a Kim e outro, 2004). Esta enzima da mesma forma tem um Km alto (30 mM) para bicarbo- nato (Laivenieks e outro, 1997). Entretanto, quando A. succiniciproducens pck foi superexpresso em um mutante de ppc de E. coli K12, produção de succinato foi aumentada 6,5 vezes (Kim e outro, 2004). Em KJ017 e deriva- dos subsequentes, fosfoenolpiruvato carboxicinase é claramente a atividade de carboxilação dominante ainda na presença de fosfoenolpiruvato carboxi- lase nativo funcional.

: Resultados de medidas de enzima de E. coli C foram bastante surpreendentes.

A enzima geralmente considerada como a atividade de car- : boxilação dominante para produção de succinato por E. coli nativo (fosfoe- - nolpiruvato carboxilase; ppc) durante crescimento (Unden e Kleefeld, 2004; — Fraenkel, 1996; Keseler e outro, 2005; Millard e outro, 1996; Gottschalk, é 1985; Karp e outro, 2007) não foi a enzima mais ativa in vitro para E. coli C.

Desse modo as séries de reações metabólicas geralmente aceitas para E. coli (Unden e Kleefeld, 2004; Fraenkel, 1996; Sanchez e outro, 2006; Cox e outro, 2006; Vemuri e outro, 2002a; Wang e outro, 2006; Sanchez e outro, 2005ab; Gokarn e outro, 2000; Karp e outro, 2007) em que projeto racional de engenharia metabólica e estimativas de fluxo metabólico estão tipicamen- te com base pode não precisamente refletir metabolismo em todas as cepas.

Sob condições de saturação de substrato in vitro, atividade de fosfoenolpiru- vato carboxicinase foi a mais ativa.

Em E. coli K12, atividades igualmente para fosfoenolpiruvato carboxilase e fosfoenolpiruvato carboxicinase foram relatadas ser iguais in vitro (140 nm min” mg” de proteina de célula; Van der Werf e outro, 1997) com o último servindo como a rotina primária para succinato.

Estudos prévios mostraram que a superexpressão de um gene ppcnativoem E. coliresultou na produção de succinato específica mais alta (Millard e outro, 2000), taxa de crescimento específico mais alta, e produção de acetato específica mais baixa devido a mais carboxilação de PEP resta- belecer intermediários ciclo de TCA (Farmaer e Liao, 1997). Entretanto, visto que PEP é requerido para o sistema de transporte de glicose, superexpres- sãode ppc da mesma forma diminui a taxa de captação de glicose em 15- 40% sem significativamente aumentar produção de succinato (por glicose) quando comparado a um controle isogênico (Chao e Liao, 1993; Gokarn e outro, 2000). Este fracasso do fosfoenolpiruvato carboxilase nativo de au- mentar produções de succinato desviou a maioria atenção de pesquisa para um novo projeto metabólico, em expressão do PYC (piruvato carboxilase) de Lactobacillus lactis ou Rhizobium etli como a etapa de carboxilação (Vemuri e outro, 2002ab; Gokarn e outro, 2000; Lin e outro, 2005a, 2005b, 2005c) em

. vez de procurar outro trabalho com o repertório nativo de genes de E. coli. Bactérias de rumen tal como Actinobacillus succinogenes produ- a zem succinato como um produto primário durante fermentação de glicose - usando a energia conservando fosfoenolpiruvato carboxicinase para carboxi- lação (Kim e outro, 2004; McKinlay e outro, 2005; McKinlay e Vieille, 2008). Atividades relatadas para este organismo são 5 vezes àquelas de KJ017 e metade daquela obtida por seleção com base no crescimento continuado (evolução metabólica) de KJ073. Desse modo, usando-se uma combinação de engenharia metabólica (IdhA adhE ackA) e evolução metabólica (seleção com base em crescimento para eficiência aumentada de produção de ATP), os estudos relatados aqui demonstram o desenvolvimento de cepas produto- ras de succinato de E. coli que se assemelham a um organismo de rumen tal como A. succinogenes usando apenas o repertório nativo de genes de E. coli. Apesar de relatórios anteriores que super expressão da E. coli fosfoe- — nolpiruvato carboxicinase (pck) não é útil para produção de succinato na au- sência de uma mutação em fosfoenolpiruvato sintase (Chao e Liao, 1993; Kim e outro, 2004; Gokarn e outro, 2000; Millard e outro, 1996), KJ017 e de- rivados foram metabolicamente evoluídos para usar fosfoenolpiruvato carbo- xicinase como a rotina primária para produção de succinato e malato.

A figura 7 mostra fermentações de batelada com KJO60 e KJ073, os dois melhores biocatalisadores para produção de succinato. Em- bora o crescimento tenha sido completado dentro das 48 horas iniciais da incubação, produção de succinato continuou durante 96 horas. Um terço de produção de succinato ocorreu na ausência de crescimento celular. Estas cepas produziram títulos de succinato de 668-733 mM, com uma produção molar de 1,2-1,6 com base em glicose metabolizada. Com meio de AM1, produções foram tipicamente mais altas do que com meio de sais minerais de NBS. Acetato, malato, e piruvato acumularam como coprodutos indesejá- veis e detrairam da produção potencial de succinato (Tabela 4). A produção máxima teórico de succinato de glicose e CO, (excesso) é 1,71 mol por mol de glicose com base na seguinte equação: CsH12O06 + 6 CO; — 12 CaHsO, + 6 HO. Entretanto, não há série

- : 60/129 . de reação de succinato direta em E. coli que alcance este rendimento (figura 6). Ria Embora este estudo focalizasse principalmente na conversão de ' glicose para succinato. É bem conhecido que a E. colitem a capacidade na- tivade metabolizar toda a hexose e açúcares de pentose que são compo- À nentes de paredes de célula de planta (Asghari e outro, 1996; Underwood e outro, 2004). Algumas cepas de E. coli podem da mesma forma metabolizar sacarose (Moniruzzaman e outro, 1997). Cepa KJ073 foi testada para utili zação de 2% de açúcares de hexoses e pentoses em tubos de soro. Em to- dos os casos, estes açúcares foram convertidos principalmente para succi- nato. Cepa KJ073 da mesma forma metabolizou glicerol para succinato. Du- rante incubação com 2% de glicerol, 143 mM de glicerol foi metabolizado para produzir 127 mM de succinato com uma produção molar de 0,89, ou 89% da produção teórico máxima para ácido succínico usando glicerol como afontede carbono para crescimento bacteriano.

O metabolismo fermentativo de E. coli foi mostrado para ser no- tavelmente adaptável. Derivados foram criados e evoluíram para evitar nu- merosas deleções de genes envolvidos com séries de reações de fermenta- ção nativas e aumenta fluxos através de enzimas restantes para manter e- quilíbrio redox, aumenta a eficiência de produção de ATP, e aumenta cres- cimento. Entretanto muito mais desafiador, as células podem fazer tais mu- danças adaptáveis em meios de sais minerais enquanto equilibrando divisão de carbono para fornecer todas as necessidades biossintéticas. Depois de eliminar as rotinas primárias para oxidação de NADH (lactato desidrogenase, —álcooldesidrogenase) e produção de acetato (acetato cinase), crescimento e produção de ATP permanecem ligadas a oxidação de NADH e a produção de malato ou succinato para equilíbrio redox (figura 1B). Seleções com base em crescimento anaeróbicas garantem equilíbrio redox e selecionam para eficiência aumentada e taxas aumentadas de produção de ATP, a base para crescimento aumentado. Esta seleção para equilíbrio de redox e produção de ATP não pode facilmente distinguir entre malato e succinato como produ- tos finais, visto que os precursores de ambos servem como aceptores de

.: elétron.

Deleção de pflB, a fonte primária de acetil-CoA durante cresci- oo mento anaeróbicco, resultou em uma exigência auxotrópica para acetato o (Sawers e Bock, 1988). Esta exigência foi eliminada por evolução metabóli- ca, presumivelmente devido a produção aumentada de acetil-CoA por ou- Ú tras rotinas tal como piruvato desidrogenase (de Graef e outro, 1999). A fon- te metabólica do acetato ou acetil-CoA que substituíram esta necessidade auxotrófica é desconhecida. A troca para produção de succinato mais alta depois que uma deleção de poxB foi da mesma forma surpreendente. Pouca mudança no nível de acetato foi observada indicando que esta enzima foi uma fonte menor de acetato ou que foi funcionalmente substituído por outras rotinas para produção de acetato. Depois da deleção de poxB, succinato foi novamente produzido como o ácido dicarboxílico dominante. Esta troca em produtos metabólicos acompanhando deleção de poxB foi inesperada.

Com as melhores cepas para produção de succinato, KJO60 e KJO073, malato e acetato permaneceram como coprodutos abundantes (Ta- bela 4; figuras 4D e 4F). Eliminação destes representa uma outra oportuni- dade para aumentar a produção.

Toda a E. coli previamente criada desenvolvida para produção de succinato usaram meios complexas e plasmídeos com antibióticos para manutenção. A maioria obteve apenas baixos títulos de succinato em fer- mentações de batelada simples, requerendo processos mais complexos pa- ra obter títulos altos (Tabela 1). Outros investigadores da mesma forma usa- ram genes heterólogos e processos complicados que incluem a pulverização com gás(CO,, H2, Os ou ar) e etapas de processo aeróbicco e anaeróbicco duais. Uma variedade de abordagens genéticas foi relatada que aumenta a produção de succinato de glicose por E. coli recombinante em meio comple- xo. Esta complexidade de processo e nutrientes seria esperada aumentar o custo de construção, materiais, purificação, e disposição de resíduo. Meios complexos contendo vitaminas, aminoácidos, e outros precursores macro- moleculares podem mascarar problemas reguladores potenciais em metabo- lismo e biossíntese que foram criados por engenharia metabólica. Em nossa é: construção inicial, crescimento e metabolismo de açúcar foram muito pobres em meio de sais minerais, porém, foram muito fortes em meio complexo ir (caldo de Luria). Em comparação, cepas KJO60 e KJO073 produziram títulos . altos de succinato (600-700 mM) em fermentações de batelada simples (10% de açúcar) usando meio de sais minerais sem qualquer nutriente com- ' plexo ou genes estrangeiros.

Exemplo 2

Construção de cepa KJ134 para produção de succinato Como descrito no Exemplo 1 acima, os genes de fermentação anaeróbiccos centrais em E., coli C tipo selvagem foram sequencialmente apagados pela estratégia de Datsenko & Wanner (2000) com produtos de PCR e marcadores antibióticos removíveis (usando-se sítios de reconheci- mento de FRT e FLP recombinase). Estas construções em combinação com evolução metabólica (seleção com base em crescimento para eficiência au- mentada de produção de ATP) foram usadas para selecionar uma cepa mu- tante que recrutou a conservação de energia, fosfoenolpiruvato carboxicina- se (pck) para aumentar crescimento e produção de succinato (figura 9). À cepa resultante, KJ073, produziu 1,2 mol de succinato por mol de glicose metabolizada (Jantama e outro, 2008a) e usa uma série de reação de succi- nato bastante análoga às bactérias rumen, Actinobacillus succinogenes (van der Werf e outro, 1997) e Mannheimia succiniciproducens (Song e outro, 2007). Entretanto, métodos usados para construir estas deleções de gene deixaram uma única cicatriz genética longa de nucleotídeo 82 a 85 ou sítio de FRT na região de cada gene deletado (ackA, IdhA, adhE, ackA, focA- pflB). Estes sítios de FRT serviram como sítios de reconhecimento para FLP recombinase (Storici e outro, 1999) durante remoção dos genes antibióticos.

Todas estas sequências estranhas foram sequencialmente removidas de KJ073 e substituídas com DNA nativo com apenas a deleção de gene dese- jado usando métodos que foram previamente descritos (Grabar e outro, 2006; Zhang e outro. 2007; Jantama e outro, 2008b). A cepa resultante, KJO091, contém deleções específicas em ackA, IdhA, adhE, focA-pflB, ackA, mMgsA, e poxB e falta todos os sítios de FRT presentes na cepa KJ073. À

: cepa KJO91 é destituída de todo DNA estrangeiro e sintético exceto para uma sequência de parada translacional 18-bp dentro de ackA. Produção de A succinato por cepa KJO91 foi equivalente aquela de cepa KJO073 (Tabela 8). e. Esta cepa foi usada como a origem para outras melhorias na produção de succinato.

Na primeira etapa para outra melhoria de cepa KJO91, atenção foi prestada para reduzir a produção de acetato. Durante a fermentação a- naeróbicca de glicose por E. coli, piruvato formiato-liase (pflB) serve como a fonte primária de acetil-CoA, o precursor de acetil-P, e acetato cinase (ac- kA) serve como a rotina primária para produção de acetato de acetil-P (Karp e outro, 2007; Kessler & Knappe, 1996). A abundância de acetato como um produto de fermentação em cepas KJO73 e KJO91 foi surpreendente visto que estas cepas contêm deleções igualmente em ackA e pfiB (figura 9). Este acetato residual ao término de fermentação representa uma oportunidade potencial para outro metabolismo redirecionado para produção de succinato melhorado.

Uma enzima relacionada com acetato cinase (e proprionato ci- nase) atividade é codificada por tdcD porém é tipicamente produzida apenas para a degradação de treonina (Hesslinger e outro, 1998; Reed e outro, 2003). É possível que mutações ocorram durante seleção aumentaram ex- pressão de tdcD como ilustrado na figura 10. Durante crescimento anaeró- bicco com 10% de (p/v) glicose, expressão de tdcD poderia funcionalmente substituir ackA, aumentando a produção de acetato a partir de acetil-P. O gene de tdcE adjacente no mesmo opéron é similar a pfiB e codifica uma atividade de piruvato (e a-cetobutirato) formateliase que é coexpressada du- rante degradação de treonina (Hesslinger e outro, 1998). É possível que ex- pressão aumentada deste gene durante crescimento anaeróbicco com 10% de (p/v) glicose poderia aumentar a produção de acetil-CoA, o precursor imediato de acetil-P, e redutor de resíduo como formiato (figura 10). TdcD e tdcE (adjacente) foram simultaneamente deletado de KJO91 para produzir KJO98. Deleção destes dois genes reduziu produção de acetato pela metade e aumentou produção de succinato em 10% em KJO98 em comparação a

: KJO91, estabelecendo a importância desta série de reação inesperada des- viando-se fluxo de carbono longe do succinato. O nível de piruvato produzido a por KJ098 da mesma forma declinou em 40%, um intermediário que seria e a predito para aumentar em eliminação de duas rotinas alternativas para me- tabolismo de piruvato, atividade de piruvato formato-liase (tdcD) e atividade de acetato cinase (tdcE). A diminuição significante na produção de piruvato é um resultado inesperado de deleções de gene tdcD / tdcE. Os mecanismos responsáveis para a redução em piruvato, e o aumento em succinato que resultou em deleções simultâneas de tdcD e tdcE é desconhecido.

Embora KJO098 represente uma melhoria significante em KJO91, outra redução em níveis de acetato e outros aumentos em produções de succinato podem ser possíveis. Sob condições anaeróbiccas, oxaloacetato é dividido no produto reduzido (malato) e intermediário oxidado (citrato) (figura 9). Citrato pode ser convertido outra vez a oxaloacetato e acetato por citrato liase (CitDEF) para reciclar a mistura de OAA (figura 10) para outras funções metabólicas (Nilekani e outro, 1983). Expressão de quantidades significantes de citrato liase está associada com crescimento em citrato (Lutgens e Gotts- chalk, 1980; Kulla e Gottschalk, 1977). Citrato liase é um complexo de muiti- enzima feito de três cadeias de polipeptídeo diferentes. O a ou subunidade grande é um citrato-ACP transferase que catalisa a primeira etapa. O Bº ou subunidade média é um citril-ACP liase que catalisa a segunda etapa. O y ou subunidade pequena age como uma proteína de acila-veículo e da mesma forma transporta os componentes de grupo protéticos. Todas as três subuni- dades são requeridas para a reação ocorrer (Quentmeier e outro, 1987). À —deleção de genes codificando uma ou mais destas subunidades eliminaria atividade de citrato liase e pode também reduzir o nível de acetato durante produção de succinato. O gene citF foi deletado de KJO98 para produzir KJ104. Esta deleção, entretanto, não teve efeito na produção de acetato ou outra produção de succinato (Tabela 8). Visto que a deleção de citF não causou qualquer redução em acetato, este intermediário é presumido surgir de outras séries de reações. Por razões desconhecidas, deleção de citF ad- versamente afetou o crescimento de KJ104 (produção celular reduzida em

: 22%) e aumentou o nível de piruvato ao término de fermentação em quase 50% em comparação a KJO98. Entretanto, a produção de succinato, título, A produtividade média, e níveis de acetato com KJ104 foram comparáveis à- . queles com KJO98 (Tabela 8).

Aspartato aminotransferase (aspC) é uma enzima multifuncional que catalisa a síntese de aspartato, fenilalanina e outros compostos por transaminação. Na reação, L-aspartato é sintetizado de oxaloacetato, um intermediário de carboxilação de PEP, por uma reação de transaminação com L-glutamato. Além de ser um componente de proteína, aspartato parti- cipaem várias outras séries de reações biossintéticas. Cerca de 27 porcento do nitrogênio celular foram estimados fluir através de aspartato (Reitzer, 2004). Biossíntese de aspartato e parte de produção de succinato uma mis- tura intracelular comum de oxaloacetato. Deleção de aspC poderia levar a produção de succinato aumentada porém pode da mesma forma criar um requerimento auxotrófico que previne crescimento anaeróbicco em meios de sais mínimo tal como AM1.

Este gene de aspartato aminotransferase (aspC) foi deletado de KJ104 para produzir KJ110. Inesperadamente, a deleção de aspC não teve efeito na produção de succinato ou produção celular em KJ110 quando comparado a KJ104 (Tabela 8). Desse modo, aspartase não parece desviar níveis significantes de oxaloacetato longe da produção de succinato em nos- sa cepa. Enzimas alternativas parecem estar disponíveis que substitui as necessidades biossintéticas antigamente catalisadas por aspartato amino- transferase.

Quantidades significantes de piruvato estão presentes no térmi- no de fermentação com KJ104 e outras cepas de E. coli criadas para produ- ção de succinato (Tabela 8). Este piruvato representa um produto indesejado e uma outra oportunidade para aumentar rendimento de succinato. Este ní- vel alto de piruvato em caldo de fermentação poderia resultar na descarboxi- lação de malato para piruvato por enzima málica (sfcA) como ilustrado na figura 10. Acredita-se que esta enzima funcione principalmente durante gli- coneogênese (Unden e Kleefeld, 2004; Stois e Donneliy, 1997; Oh e outro,

: 2002) em vez de durante o catabolismo anaeróbicco de glicose. Embora carboxilação redutiva de piruvato para formar malato seja termodinamica- "oo mente favorecida, os parâmetros cinéticos desta enzima favorecem a desi- ' drogenação e descarboxilação sob condições fisiológicas (Stols e Donnelly, 1997) Superexpressão desta enzima para carboxilato piruvato foi previa- : mente usada como uma base para construir cepas para produção de succi- nato de E. coli (Stols e Donnelly 1997). Se enzima málica (sfcA) é carboxilação em KJ104 (e cepas rela- cionadas) e contribuindo para produção de succinato, deleção deste gene seria esperada reduzir a produção de succinato e aumentar os níveis de ou- tros produtos tal como piruvato. Alternativamente, se enzima málica (scfA) é a descarboxilação em KJ104 e desvio de malato para piruvato, a deleção do gene que codifica esta enzima seria esperado aumentar as produções de succinato e diminuir os níveis de piruvato. Inesperadamente, a deleção do gene sfcA de KJ104 para produzir KJ119 não teve efeito mensurável na pro- dução de succinato, crescimento, níveis de piruvato, etc (Tabela 8) em com- paração a KJ104. Estes resultados demonstraram claramente que a enzima múálica (sfcA) é sem importância para a produção de succinato em KJ104 e cepas relacionadas. Este resultado é contraste brusco às cepas produtoras de succinato desenvolvidas por Stols e Donnelly (1997) em que aumentou produção de enzima málica foi usada como a rotina primária para produção de succinato.

Embora nenhum benefício significante tenha sido observado de uma deleção de sfcA ou uma deleção de aspC em KJ104, estudos foram realizados para testar o efeito da deleção de ambos os genes em combina- ção. Isto foi feito deletando-se o gene sfcA em KJ110 para produzir KJ122 e não esperou-se ver benefício. Entretanto, a deleção combinada de ambas SÍcA e aspC (cepa KJ122) resultou em um aumento inesperado na produção de succinato e título com uma redução pequena em acetato (Tabela 8), em comparação à cepa de origem KJ110 e cepas relacionadas (KJ104 e KJ119). A deleção combinada (aspC e sfcA) em KJ122 resultou em aumen- tos de 18% na produção de succinato, aumento de 24% em título de succi-

: nato, e aumento de 24% em produtividade média quando comparado a KJ104. Embora o mecanismo seja desconhecido, é possível que mutações "os isoladas sejam ineficazes porque elas foram compensados em parte por flu- - xo aumentado através da atividade de enzima restante, enzima málica ou aspartato aminotransferase (figura 10), deprimindo qualquer benefício po- : tencial. O aumento na produção de succinato e título são presumidos para resultar em um aumento na disponibilidade de oxaloacetato permitindo uma fração maior proceder para succinato. Níveis de malato da mesma forma permaneceram extremamente baixos.

Cepa KJ122 (Tabela 8) produziu 1,5 mol de succinato por mol de glicose, 88% da produção teórica máxima (1,71 mol por glicose de mol). Pa- ra produzir este nível alto de succinato e completamente reduz produção de malato, redutor adicional foi requerido. Embora a fonte deste redutor adicio- nal é desconhecida, estes resultados são consistentes com um aumento no fluxo de piruvato por piruvato desidrogenase. Acredita-se que esta enzima funcione principalmente durante metabolismo aeróbicco (Guest e outro., 1989) porém foi da mesma forma relatado para funcionar a baixos níveis durante fermentação (de Graef e outro, 1999).

KJ122 produziu produções de succinato excelentes (1,5 mol de mol glicose) mais quantidades menores de acetato e piruvato. O rendimen- to teórico máximo para succinato é 1,71 mol de mol” glicose e estes inter- mediários de 3-carbono representam uma oportunidade para também au- mentar produção. Piruvato é presumido acumular-se a partir de glicólise co- mo um transbordamento metabólico e pode ser relatado ao acúmulo de ace- tato. Acetil-CoA é um regulador alostérico de muitas enzimas. A fonte de acetato e atividade de acetato cinase é desconhecida visto que genes codifi- cando as duas atividades primárias para acetato cinase (fdcD e ackA) foi deletada (figura 9 e figura 10). Assumindo que o acetato é produzido a partir de acetil-P, o produto de fosfotransacetilase, uma outra deleção foi constru- ídaemkKJ122 para inativar o gene pta. A cepa resultante, KJ134, produziu nível teórico próximo de succinato (Tabela 8). Nesta cepa, níveis de piruvato e acetato foram substancialmente reduzidos. Produtividade volumétrica foi

A da mesma forma reduzida em 17%. Produções de succinato com cepa KJ134 são iguais ou melhores do que todas as outras cepas embora a com- "o plexidade de processos de fermentação, meios, ou condições de crescimen- . to.

Exemplo3

* Recrutamento de PEP carboxicinase gliconeogênica (pck) para produção de succinato E. colitem o potencial metabólico para quatro séries de reações de carboxilação nativos que poderiam ser usados para produzir succinato (figuras 2A-2D). A carboxilação de fosfoenolpiruvato (PEP) para oxaloaceta- to (OAA) por fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) é reconhecida como a série de reação primária para a produção fermentativa de succinato em E. coli (figura 2A). (Fraenkel DG, 1996; Unden & Kleefeld, 2004; Karp e outro, 2007). Esta reação é essencialmente irreversível devido à perda de energia associada com a liberação de fosfato inorgânico.

As três outras reações de carboxilação são normalmente reprimidas por concentração alta de glicose no meio e da mesma forma relacionado à função na direção inversa para gliconeogênese. (Samuelov e outro, 1991; Oh e outro, 2002; Stols & Donnel- ly, 1997). A segunda e terceira séries de reações de carboxilação (figuras. 2Be2C) usam enzimas de ácido málico ligadas a NADH e ligadas a NAPDH (SfcA e maeB), respectivamente, para catalisar a carboxilação reversível de piruvato para malato.

Ambas as séries de reações permitem energia ser conservada como ATP durante a formação de piruvato a partir de PEP.

À quarta série de reação usa PEP carboxicinase (pck) para a carboxilação re- versível de PEP para OAA com a conservação de energia como ATP (figura 2D). Embora PEP carboxicinase (PCK) tipicamente funcione apenas durante gliconeogênese em E. coli, um PEP carboxicinase análogo está presente em níveis muito altos em bactérias de rumen produtoras de succinato onde ser- ve como a atividade de carboxilação de PEP primária. (Van der Werf e outro,

19900)

Cepa E. coli KJ073 foi metabolicamente criada igualmente por deleção de gene alvejado e evolução para taxa de crescimento alta e produ-

: 69/129 - ção de succinato. (Jantama e outro, 2008a). Genes codificando uma cada das quatro enzimas de carboxilação (ppc, sfcA, maeB e pck) foram individu- E almente deletados para identificar a série de reação primária para produção õ de succinato na cepa criada KJ073 (Tabela 10). Deleção do gene ppc codifi- candoa etapa de carboxilação primária em E. coli nativa (XZ320) não altere : produção de succinato. Deleção dos genes codificando enzimas málicas (sf- cA e maeB) para produzir XZ341 e XZ396, respectivamente, da mesma for- ma não tiveram efeito na produção de succinato consistente com sua função primária em gliconeogênese. Deleção de pck codificando PEP carboxicinase (X7332), entretanto, dramaticamente reduziu o crescimento celular, metabo- lismo de açúcar, produção de succinato, e rendimento de succinato. Com- plementação da mutação de deleção em cepa XZ332 com o gene pck total de cepa KJ073 (plasmídeo pLOI4677) substancialmente melhorou produção de succinato para aproximar-se aquela de KJ073 (Tabela 10).

Juntamente, estes resultados demonstram que o PEP carboxici- nase gliconeogênico foi recrutado durante evolução metabólica para servir como a reação de carboxilação primária para produção de succinato fermen- tativa em KJO73. Ao contrário da PEP carboxilase (figura 2A), PEP carboxi- cinase conserva energia fornecendo um ATP adicional (figura 2D). Visto que crescimento fermentativo e produção de ATP estão intimamente ligados, o aumento na produção de ATP com PEP carboxicinase (figura 2D) forneceria uma vantagem competitiva durante a seleção com base no crescimento nas etapas de evolução metabólica, levando à cepa KJ073.

O aumento na atividade de PEP carboxicinase correlacionou-se comum aumento em abundância de pck MRNA (Tabela 11; figura 12A). Ní- veis de transcrição para ppc, sícA e maeB foram essencialmente inalterados enquanto abundância de transcrição de pck aumentou em KJO073 quando comparada ao tipo selvagem, em acordo excelente com a atividade de PEP carboxicinase realçada (Tabela 11).

Sequenciamento do gene pck não revelou diferença na codifica- ção ou regiões de terminador do gene pck de KJ073. Entretanto, uma única mutação pontual (transição de G para A na posição —64 relativo ao códon de

. início de ATG) foi encontrada na região de promotor a montante de gene pck em KJO073(Tabela 11). Todas as seis cepas foram sequenciadas para identi- nto ficar a origem desta mutação durante melhoria da cepa. Embora atividade de : PEP carboxicinase foi 4 vezes mais alta em KJ017 do que em KJ012, a mu- taçãoG para A estava ausente. Esta mutação pontual na região de promotor de gene pck em cepa KJ073 é referida como mutação de pck”* (atividade de PEP carboxicinase alta). Esta mutação de pck* estava presente apenas em cepas KJO60 e KJO73 mostrando atividade de PEP carboxicinase alta e au- sente em KJO071. Perda desta mutação em KJO071 foi acompanhada por uma diminuição de 10 vezes em atividade de PEP carboxicinase para um nível equivalente aquele de KJO017.

Introdução da mutação pontual de pck * (G para A) em KJ017, e KJO71 aumentou atividade de PEP carboxicinase em 9 vezes (Tabela 11). Restabelecendo o gene pck tipo selvagem (A para G) em cepas KJO60 e KJO73 produz as cepas XZ622 e XZ624 respectivamente. Igualmente XZ622 e XZ624 mostraram uma atividade de PEP carboxicinase diminuída em qua- se 8 vezes (Tabela 12). Juntamente, estes resultados demonstram que o aumento em atividade de PCK que ocorreu durante a evolução metabólica de KJ017 para produzir KJO6O é devido a uma única alteração de nucleotí- deoempck(G paraA em -64 em relação ao início de ATG). Ausência desta mutação em KJ017 sugere que o aumento de 4 vezes inicial na atividade de PEP carboxicinase observada nesta cepa é devido a outras mudanças ainda a ser definidas. Aparentemente, o recrutamento do PCK gliconeogênico nati- vo para produção de succinato fermentativa resultou em mutações múltiplas que afetam a transcrição do gene pck.

O aumento de 4 vezes na atividade de PEP carboxicinase que ocorreu durante o desenvolvimento de KJ017 a partir de KJ012 não resultou em uma mutação em pck e pode envolver uma mutação em um regulador transcricional. A proteína Cra foi mostrada para ativar a expressão de pck eme. coli (Saier & Ramseier, 1996). Entretanto, nenhuma mutação foi en- contrada no gene cra ou na região montante. A deleção de cra em KJO017 (XZ626) e KJO6O (XZ627) não afeta a atividade de PEP carboxicinase (Ta-

é bela 12). O sistema de csrA também foi relatado para regular o nível de GEES pck e outros genes envolvidos no metabolismo de glicose alterando-se a - estabilidade de mRNA. (Pernestig e outro, 2003). Entretanto, nenhuma mu- tação foi encontrada nas sequências de genes envolvidas neste sistema re- * gulador (csrA, csrB, csrC, csrD, uvrY ou barÃ).

A atividade de PEP carboxicinase de E. coli é submetida à re- pressão de catabólito de glicose. (Goldie 1984). Dois sítios de ligação de Crp foram identificados no promotor (Ramseier e outro, 1995), bastante distante damutação pontual em KJO6O e KJO73. Os genes associados com a repres- são de catabólito (cyaA, crp) e captação de glicose pelo sistema de fosfo- transferase (ptsH, ptsl, crr, ptsG) foram sequenciados (região a montante através do terminador). Apenas uma mutação foi encontrada, uma mutação de fase de leitura na região carbóxi terminal de pts! (deleção de base isolada na posição 1.673) em cepas KJO60, KJO71, e KJO73. Considerando que esta deleção estava ausente em KJ017, esta não pode ser responsável pelo au- mento de 4 vezes inicial na atividade de PEP carboxicinase nesta cepa (Ta- bela 12). A deleção de pts/ em KJ017 (XZ613) e em KJO60 (XZ615) não afet a atividade de PEP carboxicinase.

As alterações potenciais na repressão de catabólito de pck tam- bém foram investigadas cultivando-se ATCC 8739, KJ012, KJ017, e KJO6O de E. coli aerobicamente em meio de LB com e sem 5% de glicose (Tabela 13). A atividade de PEP carboxicinase foi relatada ser máxima durante a fa- se exponencial recente de crescimento (Goldie, 1984) e isto foi confirmado em nossas cepas. Em ATCC 8739 e a cepa de partida para evolução meta- bólica (KJ012), as atividades de PEP carboxicinase foram fortemente repri- midas (>70%) pela presença de glicose. A repressão mediada por glicose foi invertida pela adição de AMP cíclico. Em comparação, a atividade de PEP carboxicinase foi 4 vezes mais alta em KJ017 (que em KJ012) e não foi afe- tada pela adição de glicose que indica uma perda de repressão de catabóli- to. A atividade de PEP carboxicinase foi até mais alta em KJO60 (5 vezes do que de KJO017) durante o crescimento na ausência de glicose, e também

. 72/129 . aumentou quando a glicose foi incluída. Em KJO60 (e KJO73), a repressão de catabólito de glicose de pck foi substituída com a ativação de glicose (Ta- O bela 13). A abundância da transcrição de cyaA, crp, ptsG, pts! e crr foi com- o parada entre estas cepas (Figs. 12B e 12C). As transcrições para cyaA, crp, e ptsG foram geralmente mais altas em KJO017, KJO6O0, KJO71, e KJO73 do ' que em KJ012 e ATCC 8739. Níveis elevados destas proteínas poderiam mascarar a repressão de catabólito aumentando o nível de AMP cíclico.

A perda da repressão de catabólito nestes mutantes não foi limi- tada à expressão de pck. A atividade de B-galactosidase foi reduzida pela metade em ATCC 8739 e KJ0O12 durante o crescimento com glicose (Tabela 13). Esta atividade normalmente é reprimida por glicose, porém, foi relativa- mente inafetada em KJO017 e KJO6O, consistente com a perda geral do regu- lamento de glicose mediado por Crp.

A deleção do gene crp em KJ012 e KJO017 reduziu o nível da ati- vidade de PEP carboxicinase nas cepas resultantes (XZ642 e X7Z643, res- pectivamente) para aquelas de ATCC 8739, de origem reprimida por glicose (Tabela 13). Nestas cepas deletadas por crp, a atividade de PEP carboxici- nase não foi afetada pela adição de glicose ou AMP cíclico. Desse modo, Crp pode ser potencialmente um elemento regulador essencial para o au- mento de 4 vezesem expressão de pck observada em KJ017 e seus deriva- dos. Estas cepas mediadas por Crp ou aumento de 4 vezes na expressão de poek junto com o aumento de 10 vezes na expressão associada com mutação de pck a montante podem responder pelas alterações nos níveis de ativida- de de PEP carboxicinase observados durante o desenvolvimento de KJO60 e

25. KJO73.

Outros genes associados com o regulamento de cAMP-CRP também foram sequenciados (Tabela 13) tal como o ygiF de adenilato cicla- se predito, um coativador transcricional para Crp sxy, o cpdA de cAMP fos- fodiesterase e o regulador global de metabolismo de carboidrato mlc. (Kese- lere outro, 2005; Cameron & Redfield, 2006; Imamura e outro, 1996; Plum- bridge, 2002). Entretanto, nenhum destes genes associados com regulamen- tos de cCAMP=CRP foram constatados ter qualquer mutação nas regiões de

: terminador ou de codificação, a montante. O gene pts! codifica a PEP-proteína fosfotransferase, um com- To ponente geral (açúcar não específico) do sistema de fosfotransferase de a- E çúcar dependente de fosfoenolpiruvato. Este sistema de transporte ativo de carboidrato principal catalisa a fosforilação de substratos de açúcar de en- é trada concomitantemente com sua translocação através da membrana celu- lar. PEP-proteína fosfotransferase transfere o grupo fosforila de fosfoenolpi- ruvato (PEP) para a proteína de veículo de fosforila (HPr). (Veja, por exem- plo, UniProtKB, Número de Acesso PO8839).

Uma mutação de fase de leitura em pts/ (deleção de par de base isolada da posição 1673 bp) foi constatada ter ocorrido durante a evolução metabólica de KJO6O de KJ017. Para investigar a significação desta muta- ção, o terminal carbóxi 175 bp de pts! foi deletado em KJ017 e KJO6O para produzir XZ613 e XZ615, respectivamente. A deleção de pts! em KJO6O (XZ615) não teve nenhum efeito sobre o crescimento e atividades de PEP carboxicinase como esperado. A deleção do terminal carbóxi de pts/ em KJO017 para produzir XZ613 resultou em uma incapacidade de crescer em glicose contendo sais minerais de NBS, consistente com a perda do sistema de captação primário para glicose (sistema de fosfotransferase dependente dePEP). Depois de vários dias de incubação, as culturas de XZ613 começa- ram a crescer, as quais são presumidas ser derivadas as quais ativaram o(s) sistema(s) de transporte de glicose alternativo. (Karp e outro, 2007).

A mutação de pts/ encontrada em KJO60, KJO71, e KJO073 seria esperada inativar o sistema de fosfotransferase dependente de PEP para glicose. Os sistemas de captação de glicose alternativos tal como GalP fo- ram mostrados para restabelecer a captação de glicose em mutantes de pts. (Wang e outro, 2006; Yi e outro, 2003). A expressão de galP foi aumentada por 5 vezes a 20 vezes nestas cepas melhoradas (figura 12B) quando com- parada a KJ012 e ATCC 8739, com um aumento menor na glicocinase (glk).

A substituição do gene pts! mutante em KJO6O com um gene tipo selvagem funcional (XZ616) foi prejudicial, reduzindo dramaticamente o crescimento em meio de NBS-glicose. Este efeito prejudicial pode ser o resultado da de-

: pleção de PEP, um substrato requerido para transporte de glicose tipo sel- vagem.

Um sistema de fosfotransferase dependente de PEP funcional com- OS petiria com PEP carboxicinase, diminuindo a mistura de PEP disponível para o o equilíbrio de redox, a produção de ATP, e produção de succinato.

Assim, a perda do sistema de fosfotransferase dependente de PEP para glicose pode ser vista como um evento benéfico durante o desenvolvimento da cepa con- tanto que sistemas de transporte alternativo tal como GaiP (e glicocinase)

estejam disponíveis.

Fluxos de carbono no nodo de PEP servem para limitar a quan- tidade de succinato produzida para equilíbrio de redox durante a fermenta- ção anaeróbica de glicose (figura 13). Além disso, estes fluxos têm que for- necer energia suficiente (ATP) para o crescimento, manutenção, e precurso- res para biossíntese.

Bactérias rumen que produzem succinato como o pro- duto dominante usam uma PEP carboxicinase de conservação de energia para produção de OAA (figura 2D). (Van der Werf e outro, 1997; Kim e outro, 2004). Cepas nativas de E. coli produzem succinato como um produto se- cundário e usam PEP carboxilase (ppc) (figura 2A). Ao contrário da PEP carboxicinase, PEP carboxilase é essencialmente irreversível devido à perda de energia associada com a liberação de fosfato inorgânico.

Estudos prévios mostraram que a superexpressão do gene ppc nativo em E. coli resultaram na produção de succinato específica mais alta (Millard e outro, 1996) e a taxa de crescimento específica mais alta devido à carboxilação aumentada de PEP para oxaloacetato. (Farmer & Liao, 1997). Entretanto, desde que PEP seja requerido para o sistema de transporte de glicose nativo, a super- expressão ppc também diminuiu a taxa de captação de glicose sem rendi- mento de succinato significativamente crescente. (Chao & Liao, 1993; Go- karn e outro, 2000). Este fracasso da PEP carboxilase nativa para aumentar os rendimentos de succinato desviou a maioria da atenção de pesquisa para um novo projeto metabólico, a superexpressão de piruvato carboxilase de Lactobacillus lactis ou Rhizobium etli como a etapa de carboxilação (San- chez e outro, 2005b; Gokarn e outro, 2000) e a superexpressão de PEP car- boxicinase de Actinobacillus succinogenes (Kim e outro, 2004) para o de-

senvolvimento de biocatalisadores industriais, em vez de procurar outro tra- balho com o repertório nativo de genes de E. coli.

Ao Cepas de E. coli nativas têm três séries de reações de carboxi- r lação alternativas (figuras 2B -2D) que tipicamente só funciona na direção inversa para gliconeogênese. (Samuelov e outro, 19971; Kao e outro, 2005; : Oh e outro, 2002; Stols & Donnelly, 1997). Todos os três permitiriam a con- servação de energia de PEP como ATP. Com succinato como a rotina ex- clusiva para oxidação de NADH, a seleção com base no crescimento (evolu- ção metabólica) resultou em cepas KJ017, KJO60, KJO71, e KJO73 com me- lhorias em crescimento (rendimento de célula) e produção de succinato. Nestas cepas, a PEP carboxicinase (pck) gliconeogênica foi recrutada para servir como a atividade de carboxilação primária por ativação transcricional. O recrutamento de PEP carboxicinase como a série de reação primária para a produção de succinato em E. coli foi surpreendente. Muitos estudos mos- traram que a expressão aumentada de pck de E. coli não teve efeito sobre a produção de succinato. (Gokarn, e outro, 2001; Vemuri e outro, 2002; Millard e outro, 1996; Gokarn e outro, 2000; Hong & Lee, 2001). Um recente estudo demonstrou que a expressão aumentada de pck de E. coli foi prejudicial para o crescimento em meio mínimo, diminuindo a taxa de crescimento, a taxa de metabolismo de glicose, e o rendimento de succinato. (Kwon e outro, 2008). A expressão aumentada de pck em E. coli resultou no fluxo de carbono aumentado no intermediário de 4-carbono OAA para produção de succinato (equilíbrio de redox), produção de succinato aumentada, e aumen- tou a produção líquida de ATP para o crescimento e manutenção. Pelo me- —nostrês eventos contribuíram para a transcrição aumentada de pck: 1) perda de repressão de glicose mediada por Crp; 2) ganho da ativação de glicose; e 3) uma única alteração básica na região a montante de pck. Cada um destes eventos forneceu uma base para seleção através da evolução metabólica aumentando-se o nível de PEP carboxicinase, aumentando o fluxo de car- bono em succinato, e aumentando a conservação de energia metabólica como ATP. A ação combinada destes eventos genéticos resultou em níveis altos de PEP carboxicinase (>7000 U (mg de proteína)') em KJO6O e KJO73,

S equivalente às bactérias rumen que evoluíram para produzir o succinato co- mo o produto de fermentação primário. (VanderWerf e outro, 1997). FA Alterações de conservação de energia adicionais foram encon- E tradas nas cepas KJO6O, KJO71, e KJO73 que podem ajudar potencialmente —norecrutamento de PEP carboxicinase como a rotina primária para a produ- ção de succinato fermentativa. O sistema de fosfotransferase dependente de PEP é o sistema de captação de glicose primário em cepas nativas de E. coli. Durante o transporte, a metade de PEP produzida de glicose é usada para a captação e fosforilação, limitando opções metabólicas para equilíbrio deredoxe produção de ATP. As cepas melhoradas continham uma mutação de fase de leitura em pts! que inativou este sistema de captação. A expres- são de galP codificando um symporter de próton que pode transportar glico- se foi aumentada por até 20 vezes. A expressão aumentada de GalP e a glicocinase nativa pode funcionalmente substituir o sistema de fosfotransfe- —rasede glicose usando ATP no lugar de PEP para fosforilação. (Wang e ou- tro, 2006; Yi e outro, 2003; Flores e outro, 2007). Esta troca respeita um mo- do eficiente de energia para aumentar o tamanho da mistura de PEP dispo- nível para carboxilação e equilíbrio de redox usando o succinato (figura 11). Todas as cepas melhoradas direcionaram mais que metade do carbono de glicoseem produtos de 4-carbono (malato mais succinato) e requereram mais que metade de PEP para equilíbrio de redox. Piruvato pode ser conver- tido para PEP por ATP com a formação de PPi e AMP, porém, a energia é perdida por este processo. Assim, a mutação de pts/ e expressão de galP aumentaram a eficiência de energia de metabolização de glicose para succi- nato, fornecendo uma vantagem de crescimento durante a evolução metabó- lica.

Rotinas alternativas de eliminação para oxidação de NADH dife- rente de succinato juntamente com a evolução metabólica com a seleção para melhorias no crescimento resultaram em cepas produtoras de succinato deeE. coliquesão os equivalentes funcionais de bactérias rumen produtoras de succinato tal como Actinobacillus succinogenes e Mannheimia succinici- producens. (VanderWerf e outro, 1997; a Kim e outro, 2007; Martin, 1994;

é MckKinlay e outro, 2008). OAA é produizido usando uma PEP-carboxicinase de conservação de energia. PEP é conservado para eliminar a necessidade Fio para regeneração dispendiosa de energia (equivalentes de 2-ATP) usando- . se glicose permeases (e glicocinase) em vez do sistema de fosfotransferase dependente de PEP para captação de glicose. Nota-se que entre as bacté- É rias rumen que produzem outros produtos de fermentação, o sistema de fos- fotransferase é extensamente usado para captação de glicose. (Martin, 1994). As cepas de E. coli mais promissoras para a produção de succinato, KJO60 e KJO73, produziu aproximadamente 700 mM de succinato com um rendimento de 1,2 mol de succinato por mol de glicose (Jantama e outro, 2008a), comparável às melhores bactérias rumen produtoras de succinato naturais, Actinobacillus succinogenes. (Guettler e outro, Pat. U.S. No.

5.505.004). Estratégias conservadoras de energia que melhoraram a produ- ção de succinato de glicose em E. coli também poderiam ser aplicadas a outros problemas importantes na construção da cepa. Glicerol está se tor- nando uma matéria-prima de alimentação barata devido ao aumento global na produção de biodiesel. Estando mais reduzido que a glicose, cada glicerol pode ser convertido em succinato e manter o equilíbrio de redox. Entretanto, nenhum ATP líquido seria produzido durante o metabolismo de glicerol para succinato usando a atividade de carboxilação de de desperdício de energia nativa, PEP carboxilase. Este problema deveria ser resolvido usando a PEP carboxicinase de conservação de energia e permitindo a formação líquida de 1 ATP por succinato. Além disso, o produto de carboxilação, OAA, é um in- termediário importante no metabolismo de célula que serve como um pre- cursor para muitos outros produtos de fermentação importantes tal como ácido málico, ácido fumárico, ácido aspártico, lisina, treonina, metionina, en- tre outros. Alguém de experiência na técnica apreciará que as estratégias de conservação de energia ilustradas aqui podem ser usadas para desenvolver e melhorar os biocatalisadores para a produção de muitas substâncias quíi- micas industrialmente importantes. Exemplo 4

.: Reconstrução de E. coli para a produção de succinato em meio de sais mi- nerais Dos As cepas usadas neste estudo são listadas na Tabela 16. Plas- mídeos e iniciadores usados durante a construção de várias cepas desen- —volvidas durante o curso desta invenção são listadas na Tabela 15.

É Exame da série de reação de ácido misturada em E. coli indica três rotinas primárias para oxidação de NADH que conduz ao succinato, lac- tato, e etanol (figura 14). A deleção dos genes que eliminaram estas rotinas de competição para oxidação de NADH foi insuficiente para direcionar o flu- xode carbono para o succinato (Tabela 16). Com a exceção de um aumento pequeno depois da deleção de adhE, deleções individuais destes genes di- minuíram o rendimento e produção de succinato durante a fermentação em meio de sais minerais de NBS com pouco efeito sobre o rendimento da célu- la em comparação à cepa de origem (ATCC 8739). A deleção de ambas sé- ries de reações de oxidação de NADH alternativas ((dhA com adhE ou IdhA com pflB) substancialmente reduziu o crescimento, rendimento de succinato, e produção de succinato em meio de sais minerais de NBS.

Os resultados bastante diferentes foram observados em caldo de Luria (Tabela 16). Um aumento modesto no rendimento de succinato foi encontrado em todas as cepas que continham uma deleção em /dhA (sozi- nha ou em combinação). Novamente, o crescimento foi reduzido em mutan- tes duplos e mutantes triplos. Nenhuma destas deleções foi suficiente para redirecionar as quantidades significativas de carbono de glicose para succi- nato em qualquer meio de sais minerais ou meio complexo. As cepas dele- tadas construídas para a produção de succinato com base na análise obser- vacional da série de reação de ácido misturado nativo em E. coli foram me- nos produtivas do que as esperadas em meio complexo, e malsucedidas em meio de sais minerais de NBS.

As investigações prévias (Jantama e outro, 2008a; Jantama e outro, 2008b) descobriram uma mutação de promotor (G para A em —-64 em relação ao começo de ATG; denotado pck *) que aumentou a atividade de fosfoenolpiruvato carboxicinase (PCK) e aumentou a produção de succinato

: 79/129 de glicose na presença de muitas mutações adicionais.

Isto foi surpreenden- te porque pck é tipicamente reprimida por glicose (Goldie, 1984) e foi mos- E trada para funcionar principalmente na gliconeogênese durante o metabo- E lismo aeróbico de ácidos orgânicos. (Kao e outro, 2005; Keseler e outro, 2005; Oh e outro, 2002; Unden & Kleefeld, 2004; Wu e outro, 2007). Para examinar isto também, o gene pck (sítio de ligação ribossômico, região de codificação e de terminador) foi amplificado e clonado em pCR2.1-TOPO para produzir pLOIl4677 com expressão de pck sob controle do promotor /ac.

Este plasmídeo foi transformado em ATCC 8739. Da mesma forma, o gene pck nativo em ATCC 8739 foi substituído com o gene pck* mutante para construir XZ632. A fermentação de glicose foi examinada em ambas as ce- pas que usam meio de sais minerais de NBS.

A introdução de pck * resultou em um aumento modesto no ren- dimento e produção de succinato quando comparado às cepas isogênicas contendo o gene pck nativo (Tabela 16). A atividade de PCK foi encontrada realçada em mais de 8 vezes tanto na cepa de XZ632 quanto na cepa de origem tendo um plasmídeo contendo o gene pck* sob o promotor induzido por IPTG quando comparada à cepa de origem.

Na integração cromossômi- ca, a cópia isolada pck* foi quase tão eficaz para a produção de PCK quanto parao plasmídeo de múltiplas cópias contendo o gene pck* sob o promotor induzido por IPTG.

Uma melhoria modesta no rendimento e produção de succinato foi observada para ambas as cepas com atividade de PCK eleva- da quando comparada à cepa ATCC 8739 de origem (Tabela 17). Entretan- to, a atividade de PCK aumentada só foi insuficiente para redirecionar o car- —bonode glicose para succinato.

A mutação de pck* foi testada em combinação com outras muta- ções que eliminaram as séries de reações para oxidação de NADH (Tabela 18). A ação combinada das mutações para eliminar as rotinas de competição rotinas para oxidação de NADH e atividade de PCK aumentada também foi insuficiente para substancialmente redirecionar o carbono de glicose para succinato.

O sistema de fosfotransferase dependente de fosfoenolpiruvato

. é o mecanismo primário para captação de glicose em E. coli e uma parte integrante do sistema de repressão de catabólito de glicose. (Keseler e ou- iai tro, 2005; Postma e outro, 1996). Como descrito no Exemplo 3 acima, uma SS mutação de fase de leitura dentro da extremidade de carboxila de pts/ (dele- çãode par de base isolada na posição de 1673 bp) foi descoberta nas cepas ' produtoras de succinato KJO6O, KJO71 e KJO73 como resultado da evolução metabólica. Seria esperado que esta mutação rompa a função do sistema de fosfotransferase. (Postma e outro, 1996). Neste mutante, a captação de gli- cose foi substituída funcionalmente por gal/P (galactose permease) e glk (gli- cocinase) (Hernandez-Montalvo e outro, 2003; Keseler e outro, 2005). Para investigar o efeito do rompimento de pts/ sobre a produção de succinato, o terminal carbóxi 175 bp de ptsi foi deletado em ATCC 8739 de E. coli tipo selvagem para obter a cepa XZ650. Surpreendentemente, a produção e ren- dimento de succinato foram diminuídos por esta mutação em comparação a deorigem (Tabela 18).

Dois métodos foram usados para investigar o efeito da combina- ção da truncação de pts/ com níveis altos de PCK usando a mutação de pck* ou a de pck nativa superexpressa do promotor /ac (plasmídeo pLOI4677). Em combinação com a truncação de pts/, ambos métodos resultaram em um aumento dramático na produção de succinato (Tabela 18). Cepa XZ647 (pck*, Aptsl!) produziu 216 mmol de succinato em meio de sais minerais de NBS com 5% de glicose com um rendimento de 0,89 mol de succinato por mol de glicose, 4,7 vezes mais alto que ATCC 8739 de E. coli tipo selvagem (Tabela 18). Com XZ647 e XZ650 (pLOl4677), formiato, etanol e quantida- des pequenas de lactato permaneceram como subprodutos secundários. Estas duas alterações, inativação do sistema de fosfotransferase dependen- te de fosfoenolpiruvato e níveis elevados de atividade de PCK, representam as mudanças de núcleo exigidas para efetivamente redirecionar o metabo- lismo de glicose para succinato em meio de sais minerais de NBS sem modi- ficar quaisquer genes diretamente relacionados com o equilíbrio de redox fermentativo.

Experiências adicionais confirmaram que uma ampla variedade

: de mutações no sistema de fosfotransferase aumenta o succinato em uma base de pck *. O rompimento do sistema de fosfotransferase dependente de E PEP para glicose a qualquer etapa aumenta o fluxo de carbono em succina- o to, aumentando tanto o título quanto o rendimento. O sistema de fosfotransferase dependente de PEP transporta o fosfato de PEP para Ptsl, em seguida PtsH, em seguida PtsG, e em seguida para glicose para formar 6-fosfato de glicose. Tabela 19 mostra que em uma cepa contendo a mutação de pck* que aumenta o nível de fosfoenolpiruvato carboxicinase, uma segunda mutação em qualquer um dos genes Pts envol- vida neste sistema de revezamento de fosfato (pts/, ptsH ou ptsG) resulta em uma troca dramática similar no fluxo de carbono em succinato como o produto de fermentação dominante. Neste respeito, a deleção do gene pts/ inteiro ou uma truncação do terminal carbóxi do gene pts/ foi superior às de- leções de ptsH e ptsG. A truncação do terminal carbóxi de ptsl produziu o rendimento mais alto e título de succinato, ligeiramente melhor que a dele- ção completa de ptsl. Outras mutações tais como inserções, deleções, e fa- se de leitura que conduzem a produtos de gene inativos seriam esperadas ter efeitos similares.

Embora a cepa XZ647 (pck* Apts/) tenha produzido succinato como o produto de fermentação dominante, níveis significantes de co- produtos indesejados (lactato, etanol, formiato, e acetato) também foram produzidos (Tabela 18). A deleção de adhE (XZ723) ou pflB (XZ721) elimi- nou a produção de etanol. A produção de acetato e formiato foi substancial- mente reduzida ou só eliminou por deleção de pflB. A cepa resultante, (XZ721) produziu níveis altos de succinato com um rendimento molar de mais de 1,2 mol de succinato por mol de glicose.

Succinato tipicamente representa um produto secundário de fermentação de glicose em E. coli. A maioria do carbono de glicose é con- vertida em etanol e lactato com quantidades menores de formiato e acetato que usam séries de reações de oxidação de NADH alternativas (figura 14). Derivados de E. coli foram construídos para melhorar a produção de succi- nato para mais que uma década com sucesso variável. (Donnelly e outro,

: Pat. U.S. No. 5.770.435; Gokarn e outro, 2000; Gokarn e outro, Pat. U.S. No.

6.455.284; Millard e outro, 1996; San e outro, Pat. U.S. No. 7.223.567; San- o chez e outro, 2005b; Sanchez e outro, 2005a; Stols & Donnelly, 1997; Vemu- O ri e outro, 2002a; Wu e outro, 2007). A estratégia usada para construir estas cepas focalizou-se tipicamente na eliminação das séries de reações compe- tindo para oxidação de NADH. (Donnelly e outro, Pat. U.S. No. 5.770.435; Gokarn e outro, Pat. U.S. No. 6.455.284; San e outro, Pat. US. No.

7.223.567; Sanchez e outro, 2005b; Sanchez e outro, 2005a; Vemuri e outro, 2002a; Wu e outro, 2007). Os genes alvos para a deleção foram seleciona- dos principalmente com base na inspeção da série de reação (figura 14). Entretanto, sucessos com esta estratégia foram limitados ao meio complexo e processos de duas etapas (fase de crescimento aeróbica seguida por fase de produção anaeróbica). (Donnelly e outro, Pat. U.S. No. 5.770.435; Gokarn e outro, Pat. U.S. No. 6.455.284; Millard e outro, 1996; San e outro, Pat. U.S. No 7.223.567; Sanchez e outro, 2005b; Sanchez e outro, 2005a; Vemuri e outro, 2002a; Wu e outro, 2007).

Em meio complexo tal como caldo de Luria, a maioria das ne- cessidades biossintéticas para o crescimento é fornecida para intermediários e moléculas de blocos de construção nos nutrientes (extrato de levedura e triptona). Neste meio, a deleção dos genes com base na observação da pró- pria série de reação de fermentação melhorou geralmente a produção de succinato (figura 14; tabela 16). A deleção de (IdhA) e todas as combinações de genes alvos incluindo /dhA resultou na produção de succinato aumentada e rendimento de succinato aumentado por glicose durante a fermentação em —caldode Luria (Tabela 16).

Com um meio de sais minerais tal como caldo de AM1 ou NBS, entretanto, a deleção dos mesmos genes alvos na série de reação de fer- mentação ácida misturada não foi útil. Deleções da maioria foram prejudici- ais para a produção de succinato e rendimento de succinato. Com a exceção deum aumento pequeno depois da deleção de adhE, deleções de gene iso- ladas e combinações de deleções de gene na série de reação de fermenta- ção ácida misturada reduziu os rendimentos e produção de succinato em meio de sais minerais de NBS (Tabela 17). KJ012 (ATCC 8739 AIdhA AadhE AackA), o equivalente genético de uma cepa patenteada para produção de fa succinato de duas etapas (fase de crescimento aeróbica seguida por fase de : produção anaeróbica) em meio complexo (San e outro, Pat. U.S. No.

7.223.567) produziu menos succinato que o de origem tipo selvagem em : meio de sais minerais de NBS. Com base nestes resultados, nós concluímos que a seleção racional de genes alvos para a deleção com base em obser- vações das séries de reações é um prenunciador incerto de sucesso para melhorias na produção de succinato ao usar meio de sais minerais. Em meio de saisminerais, o carbono deve ser dividido precisamente entre a geração de energia, fermentação, e a biossíntese de moléculas de bloco de constru- ção necessárias para o crescimento de célula.

Como os resultados mostrados acima indicam, esta invenção fornece uma nova estratégia para construir cepas para produção de succina- toem meio de sais minerais. Nenhuma mutação foi requerida em genes que codificam a série de reação de fermentação de ácido misturada de E. coli (figura 14) para redirecionar substancialmente o carbono de glicose para succinato. Nesta invenção, a combinação de duas alterações de núcleo em séries de reações periféricas resultadas em um aumento de cinco vezes no rendimento de succinato. As duas alterações de núcleo que são requeridas para a produção de succinato são: 1) expressão aumentada da energia que conserva (gliconeogênica) fosfoenolpiruvato carboxicinase para substituir a fosfoenolpiruvato carboxilase fermentativa nativa (desperdício de energia) e 2) substituição do sistema de fosfotransferase dependente de fosfoenolpiruvato de glicose com uma permease alternativa tal como fosforilação dependente de ATP (glk) e galP. Juntamente, estas alterações aumentaram a produção de ATP líquida para o crescimento, aumentaram a mistura de fosfoenolpiruvato disponível para carboxilação, e aumentaram a produção de succinato. Mutações adicionais em genes na série de reação de fermenta- ção ácida misturada tal como a deleção de pfiB e outros representam opor- tunidades para aumentos adicionais modestos no rendimento e produção de succinato. Nota-se que acetil-CoA é um metabólito essencial para biossínte-

: se que é produzida principalmente por pflB durante o crescimento fermenta- tivo. Esta função é presumida ser substituída em mutantes de pflB por ex- io pressão nativa do complexo piruvato desidrogenase (aceEF, lpd), uma en- SE zima que tipicamente serve como a rotina dominante para a produção de —acetilCoA durante o metabolismo oxidativo. (Kim e outro, 2007). A série de Ú reação de succinato resultante em cepas de E. coli idealmente criada para a produção de succinato em meio de sais minerais (figura 14) é funcionalmen- te similar à série de reação nativa que evoluiu em bactérias rumen produto- ras de succinato. (Kim e outro, 2004; Lee e outro, 2002; Lee e outro, 2006; Samuelove outro, 1991; VanderWerf e outro, 1997). Exemplo 5 Produção de Succinato de Glicero! Apesar da diferença em propriedades de redox e mecanismo de transporte para glicerol e glicose, temos descoberto que as mesmas muta- ções que permitem a conversão de glicose em succinato em meio de sal mineral para redirecionar o metabolismo de glicerol também podem ser usa- das efetivamente na produção de succinato a 80% da eficiência máxima pa- ra a conversão de glicerol para succinato (0,8 mol de succinato produzido por mol de glicero! consumido).

Durante o curso destes estudos, temos descoberto que gldA e a série de reação de fosfotransferase dependente de PEP previamente consi- deradas secretas compreendem uma rotina funcional importante para o ca- tabolismo de glicerol (figura 15). Em ambos as séries de reações, glicerol entra nas células por difusão facilitada. Dentro da célula, parte do glicerol é imediatamente fosforilado seguido por oxidação para DHAP, a série de rea- ção que é amplamente considerada como a série de reação padrão para o metabolismo de glicerol em E. co/li. Temos descoberto que pelo menos 1/3 do glicerol é primeiro reduzido por gldA para DHA e subsequentemente fos- forilado pelo sistema de fosfotransferase dependente de PEP (ptsH, pts!) agindo dentro do citoplasma para produzir DHAP. DHAP serve como o ponto de entrada comum para o metabolismo central para sistemas de captação e ativação.

. Tabela 20 demonstra claramente a eficácia da combinação das mutações de núcleo identificadas para a produção de succinato com glicose EA para a produção de succinato de glicerol em meio de sais minerais (NBS) E sem a adição de nutrientes complexos. Embora a deleção de apenas pflB tenha reduzido a produção de succinato abaixo daquela de origem tipo sel-. ' vagem, a combinação da deleção de pflB com a mutação de promotor em pok (pck*; ativação transcricional) dobrou o rendimento de succinato de 0,25 mol/mo! de glicerol para 0,5 mol/mol de glicerol. A adição subsequente de uma mutação em pís/ também aumentou o rendimento de succinato para 0,8 mol de —succinato/ mol de glicerol, 80% do rendimento teórico máximo. Resultados si- milares também foram encontrados para a deleção de outros genes fundamen- tais (gldA, ptsH, pts!, dhaKL, dhaM) que rompem o uso do sistema phosphore- lay para fosforilação (Tabela 20). Estes resultados foram inesperados. A série de reação resultante para conversão de glicerol é mostrada na figura 15.

A figura 15 mostra uma combinação da série de reação geral- mente aceita para catabolismo de glicerol (Lin, 1996) e a série de reação de fermentação ácida misturada (Bock e Sawers, 1996) em E. coli tipo selva- gem. Nesta série de reação, toda ATP produzida seria consumida por fosfo- rilação de glicerol se succinato é produzido como um produto exclusivo. Ne- nhum ATP estaria disponível para crescimento. Com base na figura 15, a deleção de pflB seria esperada aumentar a produção de succinato aumen- tando a disponibilidade de redutor e intermediários. Em comparação com esta expectativa, uma diminuição na produção de succinato foi observada com a deleção de gene pfiB (Tabela 20). Com base nesta série de reação, a ativação mutacional do gene pck que normalmente só funciona durante a gliconeogênese pode se antecipar para aumentar o fluxo de fosfoenolpiruva- to em succinato competindo com piruvato cinases com base somente na observação anterior neste pedido de patente que este aumento na expres- são de PCK foi benéfico para a fermentação de açúcar em succinato, de ou- tramaneira isto seria inesperado. A utilização de fosfoenolpiruvato carboxi- cinase (pck) em vez de fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) tem a vantagem adicionada de conservar energia de fosfoenolpiruvato como um ATP adicio-

. nal que pode ser usado para biossíntese.

Embora uma mutação em pts! seja benéfica para a diversão de io carbono de glicose para succinato, isto não pode ter sido predito para ser de A qualquer benefício desde que o único sistema de captação de glicerol reco- — nhecido como funcional em E. coli tipo selvagem (glpF) não envolva o siste- ma de fosfoenolpiruvato fosfotransferases. (Keseler e outro, 2005; Lin,

1996.). O único envolvimento conhecido do sistema de fosfotransferase em metabolismo de glicerol está dentro de uma série de reação secundária pen- sada ser inativa em E. coli tipo selvagem. (Jin e outro, 1983:; Lin, 1996; Tang e outro, 1982). Esta série de reação secundária reduz primeiro o glicerol! in- tracelular para diidroxiacetona (DHA) com GIdA em seguida usa PtsH (ptsH) e El (pts/) como veículos de fosfato para acoplar fosfoenolpiruvato à fosfori- lação de DHA intracelular para produzir diidroxiacetona-fosfato (DHAP). Pensa-se que esta série de reação só funciona em cepas mutantes nas quais glpK é inativo. (Gutknecht e outro, 2001; Keseler e outro, 2005). Ao contrário de todas as expectativas com base nas séries de reações geral- mente aceitas para metabolismo de glicerol, uma mutação de pts! aumentou significativamente a produção de succinato de glicerol. Estes resultados indi- cam que a glicerol! desidrogenase (gldA) e sistema de fosfo-revezamento de PTS (fosfoenolpiruvato, PtsH, Pts/) são de importância inesperada para o catabolismo de glicerol para fosfato de diidroxiacetona (DHAP) durante a fermentação anaeróbica de glicerol em médio de sais minerais de NBS. Com base no aumento grande no rendimento de succinato, esta série de reação de diidroxiacetona (DHA) pode ser estimada a responder por pelo menos um terço do fluxo de glicerol em glicólise. A deleção em pts! inativou este série de reação e aumentou a disponibilidade de fosfoenolpiruvato para produção de succinato. Juntamente, estas três mutações de núcleo (pck *, pts!, pflB) efetivamente e inesperadamente redirecionaram o fluxo de carbono de glice- rol para succinato em 80% do rendimento teórico máximo durante a fermen- tação anaeróbica em meio de sais minerais (figura 15). Além disso, o uso desta série de reação resulta em um aumento importante na produção de ATP, facilitando o crescimento.

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É Tabela 5. Comparação de atividades de enzima de carboxilação em cepas diferentes * 2 EEE E . KJ012 | KJOI7 | KJoO7T3 12”? succinogenes º LA Rss aaa boxilase boxicinase EE ST = === lica (NADH, carboxilação) Enzima má- <t <1 <1 <1 Desconhecido | Desconhecido lica (carboxi- PH) o * dados foram de van der Werf e outro, 1997 * Incapaz de medir em E. coli C tipo selvagem devido à presença de lactato desidrogenase E ANS + Belana us mb! AMISSSISINS 5 mM DDD aa DIO a a a DC DE a asas DD A a o a e e O o IO Ca

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. Tabela 7. Cepas de Escherichia coli, ptasmíideos e iniciadores usados aqui Cepas de Escherichia coli — Características Relevantes | Fontes | e. Cepa B E KJo73 AIdhA::FRT AadhE::FRT A(focA-pflB)::FRT AackA::FRT AmgsA | Jantamae ado ai EST aaa aa eras | PISTA a ea aaa tura Thomason, 2005 Morales e outro, 1999 outro, 2002 pLOI4131 bla; ligação de pLOI2228 (cassete FRT-cat-FRT digerido por | Descrito aqui Bank, tratados por Klenow, digerido por C/al) e pLOI2511 (dige- rido por Nhel, tratado por Klenow, digerido por Clal) pLOI4146 bla cat; ligação de PCR de cassete cat-sacB amplificada (usan- | Descrito aqui do iniciadores JMcatsacBup3/down3) de pLOI4152, plOI4153 digerido por BamHl/Xhol e digerido por BamHI/Xhol outro, 2008 PLOI4152 | cassete cat-sacB; cassette amplificado por PCR de pELO4 (u- | Descrito aqui sando iniciadores JMpELO4F1/R1), digestão de Ball e autoliga- ão pLOI4153 bla ; ligação de pLOI4145 (digerido por Kasl/Xmal) e poliligador | Descrito aqui la SÍPBXPS digerido por Kasl/Xmal (anelamento de oligonucleoti- deos complementares SfPBXPSsentido/SfPBXPScomp é: pLOI4146 digerido por Pacl, autoligação Descrito aqui bla cat; cassete cat-sacB E Descrito aqui bla cat; ligação de cassete cat-sacB (digerido por Pacl) de | Descrito aqui PLOI4146 e pLOI4161 digerido por Pacl bla kan; vetor de clonagem TOPO TA nem

TOPO F1/R1) clonado no vetor pCR2.1-TOPO

Continuação PLOI4159 | cassete cat-sacB digerido por Smal/Sfol de pt OI4162 clonado | Descrito aqui no produto inside-out amplificado por PCR de pLOI4158 (usan- : do JMackAup1/down1 So RAE * digestão de Pacl de pLOI4159, em seguida autoligado Descrito aqui - res tdcDE-up/down) clonado no vetor pCR2.1-TOPO pLOI4516 cassete caf-sacB digerido por Smal/Sfol de pLOIl4162 clonado | Descrito aqui - no produto inside-out amplificado por PCR de pLOI4515 (usan- do iniciadores tdcDE-F7/R7 PLOI517 | produto inside-out amplificado por fragmento de PCR de | Descrito aqui pLOI415 (usando iniciadores tdcDE-F7/R7), tratado por cinase, em seguida autoligado up2/down2) clonado no vetor pCR2.1-TOPO PLOIM630 | cassete cat-sacB digerido por Smal/Sfol de pLOI4162 clonado | Descrito aqui no produto inside-out amplificado por PCR de plLOI4629 (usan- do iniciadores citF-2/3 up/down) clonado no vetor pCR2.1-TOPO pLOI4281 cassete cat-sacB digerido por Smal/Sfol de pLOI4162 clonado | Descrito aqui no produto inside-out amplificado por PCR de pLOI4280 (usan- do iniciadores aspC-1/2 pLOI4282 | produto inside-out amplificado por fragmento de PCR de | Descrito aqui pLOI4280 (usando iniciadores aspC-1/2), tratado por cinase, em seguida autoligado upidown) clonado no vetor pCR2.1-TOPO pLOI4284 | cassete cat-sacB digerido por Smal/Sfol de pLOI4162 clonado | Descrito aqui no produto inside-out amplificado por PCR de pLOI4283 (usan- do iniciadores sfcA-1/2 up/pta-down) clonado no vetor pCR2.1-TOPO pLOI4711 cassete cat-sacB digerido por Smal/Sfol de pLOI4162 clonado | Descrito aqui no produto inside-out amplificado por PCR de pLOI4710 (usan- do iniciadores ackA-2/pta-2. PpLOI413 | bla kan; ychE-adhE-ychG' (PCR) de E.coli C (usando iniciado- res up/down-adh&) clonado no vetor pCR2.1-TOPO PLOI4419 | produto inside-out amplificado por fragmento de PCR de | Descrito aqui pLOI4413 (IO-adhE-up/down usando iniciadores), tratado por cinase, em seguida autoligado dores up-focA/Mid-pflA) clonado no vetor pCR2.1-TOPO pLOI421 | produto inside-out amplificado por fragmento de PCR de | Descrito aqui PLOI4415 (usando iniciadores 10-ycaO-up/IO-midpfiB-down), tratado por cinase, em seguida autoligado JdhA-A/C) clonado no vetor pCR2.1-TOPO PLOI4432 | produto inside-out amplificado por fragmento de PCR de | Descrito aqui PLOI4424 (usando iniciadores IO0-/dhA-up/down), tratado por cinase, em seguida autoligado

Continuação Fr [| Confúntos de IMERIHOr o a en o sta JM4161 S'ACCGCATCAGGCGCCTAATTAATTAATCCCGG3' (SEQ ID | Descrito aqui sentido/ NO: 30) os comp 5'CCGGGATTAATTAATTAGGCGCCTGATGCGGT3' (SEQ ID NO: 31 . JMpELO4F | SCAGCAGATCTAAGTAAATCGCGCGGGTTTG3' (SEQ ID NO: | Descrito aqui . URI 32) CAGCAGATCTAGCGGCTATITTAACGACCCT3' (SEQ ID NO: - Se FUR1 5S'GCACGATAGTCGTAGTCTGAS' (SEQ ID NO: 35. upi/downt | SGCCGCAATGGTTCGTGAACT3' (SEQ ID NO: 37 JmcatsacB | 5CTCACCTCGAGTGTGACGGAAGATCACTTCG3' (SEQ |D | Descrito aqui up3/down3 | NO: 38) 5'GTGCAGGATCCATCAAAGGGAAAACTGTCCATAT3' (SEQ ID NO: 39 SIPBXPS —| SATGTAGGCGCCATTAATTAATGGATCCACTATCTCGAGAT | Descrito aqui sentido! — | TANTTAATCCCGGGACTAT3' (SEQ ID NO: 40) comp S'ATAGTCCCGGGATTAATTAATCTCGAGATAGTGGATCCAT TAATTAATGGCGCCTACAT3' (SEQ ID NO: 41 WMadhE —| SATGGCTGTTACTAATGTCGCTGAACTTAACGCACTCGTAG | Descrito aqui AC AGCGTCGGCACGTAAGAGGTTCCAA3 (SEQ ID NO: 42) 5 TTAAGCGGATTTTTTCGCTTTTTTCTCAGCTITTAGCCGGAG CAGCACACTGCTTCCGGTAGTCAA3' (SEQ ID NO: 43 WMIdhA — | SATGAAMACTCGCCGTTTATAGCACAAAACAGTACGACAAGA | Descrito aqui AC AGTACGGCACGTAAGAGGTTCCAAS' (SEQ ID NO: 44) S'TTAMACCAGTTCGTTCGGGCAGGTTTCGCCTTTTTCCAGA TTGCTACACTGCTTCCGGTAGICAAS (SEQ ID NO: 45) WMpfB 5 TTACTCCGTATITGCATAAAAMACCATGCGAGTTACGGGCC | Descrito aqui Ac TATAACGGCACGTAAGAGGTTCCAAS' (SEQ ID NO: 46) 5'TTACATAGATTGAGTGAAGGTACGAGTAATAACGTCCTGC TGCTGTTCTACACTGCTICCGGTAGTCAAS' (SEQ ID NO: 47: down 5STGATGAGCTACCTGGTATGG3' (SEQ ID NO: 49; FTIRT S'GACGACGTGCTGGATTACGA3' (SEQ ID NO: 51 down2 S'GCCCGAGAGGATGACTATGT3' (SEQ ID NO: 53; SCCCGTTCTIGTCGTTGAGAT3' (SEQ ID NO: 55 upídown — | SACGCTCTACGAGTGCGTTAA3 (SEQ ID NO: 57 MidpflB — | SAACCGTTGGTGTCCAGACÇAG3' (SEQ ID NO: 59. 10-yca0-up/ | SGGCCTACATTGCGTAGGCTAT3' (SEQ ID NO: 60) Descrito aqui IOTmdphê- | SGCAGCAGGACGTTATTACTC3' (SEQ ID NO: 61) S'TTAMACCAGTTCGTTGCCC3' (SEQ ID NO: 63) — IO-dhA- — | SCGTTCGATCCGTATCCAAGT3' (SEQ ID NO: 64) Descrito aqui upidown — | SAGGCTGGAACTCGGACTACT3' (SEQ ID NO: 65, 5TCCATCGCTTACACCAAATC3' (SEQ ID NO: 66) Descrito aqui down 5'TGGGGGATGACGTGATATTT3' (SEQ ID NO: 67) BS'AGATAACATGGCTCCGCTGT3' (SEQ ID NO: 68) Descrito aqui S'AGGAGCGGCGGTAATGTTC3' (SEQ ID NO: 69;

Continuação down SACGATCGCCTGGTTITAATG3' (SEQ ID NO: 71

SIcA-N2 S'TACCGCCGTACCTCCATCTA3' (SEQ ID NO: 72) - . S'CGTAAGGGATATAAAGCGAACG3' (SEQ ID NO: 73 ackA-up! — | SCGGGACAACGTTCAAAACAT3' (SEQ ID NO: 74) Descrito aqui fr pta-down —) SATTGCCCATCTTCTTGTTGG3' (SEQ ID NO: 75)

B'AACTACCGCAGTTCAGAACCA3 (SEQ ID NO: 76)

pta-2 S'TCTGAACACCGGTAACACCA3' (SEQ ID NO: 77

E e gl o = E Ns e = o po = + mm Ns FS S SN g x E E Ss E Z F Sl um ho E Em O Ho E 8 |á - & 88 Se 8 (8 5 (8 8 |$ |E |S & ae <= s E ss o E o o o e Ss o E ENE pe REEF RERERR E ss R S Fe a RP z a s a 2 aj É ” - s A o Ie sen a sa 3 LE a x À = F 2 2 B Eº 8 BE ns R Rs 8 já a o e Be LL kh jo sz E Ev ES GEEK e os x ps o QN =: mm o ê E E E é SR EE = o o o o o o ix Da Da So - o Age ee dee e use E RB RB RE RE EeEeRrRr | Desa > <& WS = & E s s s va S so So So o Ss =) So So So So

E Ss a E kh E E E E E E kh = 8 js |jê ja | à | | jà | |ê E So So o Ss So - Ss p= Ss Ss S  S R S SF FS ú S S o me E Be No e ES o mr m o e o bi o > o o |U 8 5 5 E e j bb jo e Oh o Sfeê — o BR = -= N nm assis BP RB BB iE db RR E js E S 2/8 FS S * F EH F SY F FS Segs ES a ô = o o o Ô = = ntóss Pe ER ne RE ho 6 14 5 ole gs e = — - - - —- - -. — E cd Ele 25s - - - - - - — - SES |S 5 5 Ss Ss ; ; ; 5; vã FR F F FR FR 8 $ s FR So ja o jo o : ; - B|SO ss aa a - - o as a a —)É"o | = < = = = = = = = = = = o BE RE E BB SE ES 5 ol o |< < < < < < < < < < Esso E E E E E E E E E ckose e se e sé es Pb SS ES | vc =OS o s o 8 sas PT as Cesar os as hs os LES o [82 |82 [88 8% [88 |3% [8% |8$ | 88 |8E BS x x x x x x = x + x Sã agssSssSEassSESSSS SST SSS SAT SASSADS E XX o 2X o 2 ao =X o Co oZCoZY o 2 %Yo42Xo, So ELE os SE. E SEE. tEao ES EO so EOCSIED.SEOSIEOS EDS EDS EOSIEDE ESSES EDS É z8TZiTZ3 TZ 8 TZ 8 TZ 8TZ TZ 8TZ TZ 58 lSfcS Ass fcs css isa ins fns o toe tóoacoleçoecioeioesolacosTóálea o Es |ESolESolESO|ESOlESOIE SO E SO E SO |E SO E So 52 [SSsSOs ESSE OSSOS EO sEO SEO E OO Sis SSSFSSRFRS BOBOS SO ESSES OO -ô |82SBZoESoESoavoaro aro vo aroEro co Ss Sa BE E BE E E E E RE Rk Se Bones pob ob o bsb E no e Fjo DA << x EA ba EA x z q à e | : o - E : : 8 - o 3 e 3 : : e 48 á o o : $ o : 2 É | a : " [ á 3 o tds 3 É 3 $ o É a 8 | la 3 ss ê 8 Ss E : o & - 8 2 E 3 Ss - E) a S ã ss | Ss Dk Ee 8 BR EE õ nl gal ; 2 sã Ss so ã 8 T Ê 3 3 Tk : Ss : : e & õ q s O dE e os à as se io , .sõ8 S8 de 2823 É Ss sis 85 23 Se Se BEtg 2 FEAS 085 E. 25 É Bo faFIcE 588 sê ve eser 2 ÉS gs géÉsEr ESSO? E PE8$S8&s Se. SS incÕE E Es Sd

ES SS SSESSES oo gs ToES SE23 B328s22 2 ã%> ogeSSaZ z e t2S o CBsSES o = E 8 o E |Sss5s 2 SS sEços SE ER Sos 2/88 ss g$ssãs: a 22 SE 28858 o Eos" SERES

IRES 3 BROEGRS à SS SHSSE 8, - BESEZES e |s£ E 5S5S 82 lsStScos 3 |8$ [9SÊs E 21 25oie0 80 SS 0353285 ds ZSB8 553885 Sa Esso E 2. > SE Sa 8 Es SSERE elElS ATEEIIIAAA) : w/0/5 SootcaS gs S/s Sos ava dsT Ses 9328 RadãR Sos SS L2ERESBSS

SEOROSUS e so ESOGBE = 25S8s + Siga 8 25. Seg Ss SSEBSSE Fiô z 2EERRDES pIAirO E e...

Tabela 9. Fontes e características de cepas de E. coli e plasmídeos usados neste esudo nO Características relevantes Fonte ou referência . Cepas — Tipo selvagem — outro 2008 outro 2008 outro 2008 outro 2008 outro 2008 XZ626 KJO017, Acra — XZ627 KJO6O, Acra XZ642 pLOI4677 bla kan; pck (incluindo sítio de ligação ribossô- | Este estudo mico, codificação e fragmento de terminador) de

EEE O

TOPO mudança de mutação de pts! Co de E.coli clonado no vetor pCR2.1-TOPO pLOI4162) clonado no pts/ de pLO!4734 nvaança de mutação da oe LO RC O RBS O O OO ATCC873 de E.coli clonado no vetor pCR2.1-

TOPO PLOI4737 cassete cat-sacB ( fragment de Smal-Sfol de | Este estudo

ETA Pro-1/Pro-2)

Continuação ' Iniciadores mudança de mutação de pck Fr A : pek-Pro-up CACGGTAGCAACAACATTGC (SEQ ID NO: 78) Este estudo pek-Pro- e down AGAAAGCGTCGACAACGAAC (SEQ ID NO:79) pek-Pro-1 ATGCGCGTTAACAATGGTTT (SEQ ID NO: 80) pek-Pro-2 ATGGATAACGTTGAACTTTC (SEQ ID NO: 81 mudança de mutação de pts! Lo ptsl-D-up CGCATTATGTTCCCGATGAT (SEQ ID NO: 82) Este estudo ptsl-D-down GCCTTTCAGTTCAACGGTGT (SEQ ID NO: 83) ptsl-D-1 CGGCCCAATTTACTGCTTAG (SEQ ID NO: 84) ptsl-D-2 ATCCCCAGCAACAGAAGTGT (SEQ ID NO: 85) | Eoquenciamento de pele o AO TA peck-F TTGGCTAAGGAGCAGTGAAATGCGCGTTA (SEQ ID | Este estudo NO: 86) pek-R CACGACAAAAGAAGGGTAAATAAAC (SEQ ID NO: 87) pek-2 TTGTTAACGCGCATTTCACT (SEQ ID NO: 88) pck-3 GCGATAGCGGCTACTGTCAT (SEQ ID NO: 89; pck* representa a forma mutada de pck contendo, uma transição de G para A em -64 (ATG). Todas as cepas são de derivados de ATCC8739 de E. coli.

Tabela 10. Pek é critico para fermentação de glicose para succinato por derivados de KJ073 Cepa* Modificação Glicose Succinat | Rendimento 1 | Acetato | Piruvato genética consumida | o (molimol) (mM) | (mM) mM) [xz320 —[Ko7aampe — [278 — [346 125 ---—joo | ras or aca Os aa 1 os | O) Xz396 Ki07s. âmas& as sm lz ue [9 SO [za ion aee or o Ras TO RE US prot | soperiessão 1) (pPLOIA677) | superexpressão | —“*Todasasfermentações foram realizadas em meio de NBS com 5% de glicose e 100 mM de bicarbo- nato de potássio. *t Rendimento foi calculado como mol de succinato produzido por mo! de glicose metabolizada.

O - x & o 2º E ns SSSESEDO |; ato so ZZ2)|0 20/22 9 o - is = : a õ < = : “ E a o <> ke s Sela aiho S < Tlolaillaei 2 = o E 2 o

E mo E Pee ee e =/o | Svlviv vv 22 sn o - o o o = o E = E SS aleloja 7 S SS SER = a, 5 o 2 < Bo = BE s 88; o 8 TS c aeb /oenigo [8 BS e oa oaNaT= | sas T E SS "o q s É ã a = Sà |sgssSSETSS | : BS ui SN SS Ê > = o N z o 5 O

S SK Do C 8|jo s ss E83 DS CEC EZ | o lo . 2 o8o esse) TF ST t=w SS oo ss, sos s3< = Ss 18 8 Fa Ss €f Ss H GF Ss S a 2 - 223 > Es |olaininhejelaio é 8 RES Noll az Z Ss EEE nn à oco o o 2/0 q o TX o 8 SE b Vo, 8 E sã Kd Rx ss ã 3 2 ã 8 SE 8 3 slo'88 ZE Sô 8 Ba os ui 8 =22n 6% = e uilo Sw S o E Ss 8 e|$ 812 E 83 o ole o o 0/8 E 8 ES vs Ds Ser N= E SS ENO so ojsissis|s/[sE 0/0 EO S |O E lS[SS/S/S|]i8 Sia 5 2 O FIO < CEM XX X<O., 22 4 k Tabela 12. Efeitos de mutações em pck, pts/, e cra sobre a atividade de PEP carboxicinase. a Capa Genáfi PEP-carboxicinase p ENO RO U / mg de proteína) KJO17 700 7 XZ618 KJO17, pck* 6.419 XZ613 KJO17, Cptsl 614 . XZ626 KJO017, Lera 508 KJoso + pek”, pislV, - cra* 8.363 x2622 KJO6O, - pck* 1.103 XZ615 KJO60, pts! 10.309 XZ627 KJO60, Gera 7181 KJo71T — | ptsiv-pok, ora” XZ620 KJO71, pck* 6.193 Kio7st — | pole, pisiv, - ora! xze24T — | KJ073,- pol” Essa t O pck em KJ017 e KJO71 foi mutado (G para A) para pck* em XZ618 e XZ620, respectivamente. tA mutação de pck * em KJO6O e KJO073 foi restabelecida para tipo selvagem (A para G, - pck*) em XZ622 e XZ624. $ A abreviação pts/V refere-se a uma mutação de fase de leitura, uma deleção de base isolada na região de terminal carbóxi.

Tabela 13. Efeito de glicose e cAMP sobre atividades * de PEP carboxicinase (pck) e B- galactosidase (lacZ) Cepa atividade! de PEP carboxicinase Gi Gi cAMP Gi Gl KJo60 2177 Los ae | BA | 20 | NC X2642 iu das par o = XZ643 124 UE toa aEEa * Culturas foram aerobicamente crescidas em frascos agitados com caldo de Luria. 1 A atividade é a média das duas repetições e é expressada co- moU (mg de proteína). i Relação é a atividade sem glicose para a atividade com 5% de glicose.

: Plasmídeos == — pCR2.1-TOPO bla kan; vetor de clonagem TOPO TA — fiada pLOI4162 bla cat; plasmídeo para fornecer cassete cat-sacB delação de SB o O E ME aaa aaa raso) à bla kan; sícA (PCR) de ATCC 8739 clonado no vetor pCR2.1-

TOPO cassete cat-sacB (fragmento de Smal-Sfol de pLOI4162) clonado . no sfcA de pLOl4284 Faeteção de pre E RREO COCO

TOPO no ppc de pl Ol4264 [per deleção O o a eee Seen aa aeee

TOPO no ppc de pLOl4641 maeB delação E

TOPO no maeB de pLOI4728 Sa Aee eamnI SA, mutação de pts! PCR2.1-TOPO nado no pts/ de pLOI4734 SER EEE A o A O E Ee ana mutação de pck vetor de PCR2.1-TOPO peck-P de pLO14736 (peck-Pro-1/Pro-2 | deleçãode sfcA So sfcA-up CTATGCTTGATCGGCAACCT (SEQ ID NO: 90) sfcA-down ACGATCGCCTGGTTTTAATG (SEQ ID NO: 91) sfcA-1 TACCGCCGTACCTCCATCTA (SEQ ID NO: 92) SfcA-2 CGTAAGGGATATAAAGCGAACG (SEQ ID NO: 93 | eeleção de DRE CO A a LO SEIS RES ppe-up TCAAACGATGCCCAACTGTA (SEQ ID NO: 94) ppc-down TTTAATCCGCTTCGGAAAGA (SEQ ID NO: 95) ppc-1 GTCACTATTGCCGGGATTGC (SEQ ID NO: 96) ppc-2 CAATGCGGAATATTGTTCGT (SEQ ID NO: 97 do pek-up TCCGGGCAGTAGTATTTTGC (SEQ ID NO: 98) pek-down ATGGCTGGATCAAAGTCAGC (SEQ ID NO: 99) pek-1 CCTGGCGAAACTGTTTATCG (SEQ ID NO: 100

: enem maeB-up GCATCCTGGGGATGATAATG (SEQ ID NO: 102) maeB-down TITCTICGCCAGTTCCTCAC (SEQ ID NO: 103) AH maeB-1 AACCCAACCGCTGTAATTTTIT (SEQ ID NO: 104) maeB-2 CTGGAACTGGAAATTCATGG (SEQ ID NO: 105; " tação de pck pek-Pro-up CACGGTAGCAACAACATTGC (SEQ ID NO: 106) : pek-Pro-down AGAAAGCGTCGACAACGAAC (SEQ ID NO: 107) pek-Pro-1 ATGCGCGTTAACAATGGTTT (SEQ ID NO: 108) pck-Pro-2 ATGGATAACGTTGAACTTTC (SEQ ID NO: 109 tação de pts! ptsl-D-up CGCATTATGTTCCCGATGAT (SEQ ID NO: 110) ptsl-D-down GCCTITCAGTTCAACGGTGT (SEQ ID NO: 111) ptsl-D-1 CGGCCCAATTTACTGCTTAG (SEQ ID NO: 112) pts!-D-2 ATCCCCAGCAACAGAAGTGT (SEQ ID NO: 113 pek-F TTGGCTAAGGAGCAGTGAAATGCGCGTTA (SEQ ID NO: 114) pek-R CACGACAAAAGAAGGGTAAATAAAC (SEQ ID NO: 115) pek-2 TTGTTAACGCGCATTTCACT (SEQ ID NO: 116) pek-3 GCGATAGCGGCTACTGTCAT (SEQ ID NO: 117 cra-down CTTCCCCGGTTAACAGTCCT (SEQ ID NO: 119 ptsHl-up1 TCATCGGGTGAGCGTTATTT (SEQ ID NO: 120) ptsHl-down1 TGACCGTCCAGCGTAATAGC (SEQ ID NO: 121) ptsHl-up2 CATCCTGGGCCTGAAGATTA (SEQ ID NO: 122) ptsHl-down2 AGCAATACCATCACCAACGA (SEQ ID NO: 123 crr-down CTCATCAGTGGCTTGCTGAA (SEQ ID NO: 125 ptsG-down AAGGAAACGCCGTTAATCCT (SEQ ID NO: 127 TCGCCATCAACTTGTCTTTG (SEQ ID NO: 128) cyaA-down AAAGGCGATGAGTGGATTTG (SEQ ID NO: 129) TGAGTTGCCGTCCATTAAAA (SEQ ID NO: 130) crp-S-down AATCGTAATTCGCCAAGCAT (SEQ ID NO: 131 cpdA-S-down AGGACAATGGATTCCAGCAG (SEQ ID NO: 133) giF-S-down GCTGTCCTGCACAAAATCAC (SEQ ID NO: 135 SXy-S-Up TITACTTGCTGCGGATGAGA (SEQ ID NO: 136) sxy-S-down | TATCTCAGCCCTCGGTGCTC (SEQ ID NO: 137: esrÃ-up CAGCGTTAGCCAGTGTGAAA (SEQ ID NO: 138) esrA-down ACGCCTCTTACGAGTGCTTC (SEQ ID NO: 139) csrB-S-up CTGTAGGAGATCGCCAGGAA (SEQ ID NO: 140) esrB-S-down TCTAACAAATCGTGCATTCG (SEQ ID NO: 141) esrC-S-up GCCATACGCTTTGTGAGACA (SEQ ID NO: 142) esrC-S-down AGTCACGCCCAATGGAATAG (SEQ ID NO: 143) csrD-S-up1 ATGTGCATGATGGATTGGAA (SEQ ID NO: 144) esrD-S-down1 CGGTATCCTGACCACTACGC (SEQ ID NO: 145) esrD-S-up2 GTGATTTTGCTGCGCTGTTA (SEQ ID NO: 146) esrD-S-down2 ACAAGGCGCAAAAATCATCT (SEQ ID NO: 147 uvrY-s-down1 TATCATCGCGTAGCAAAACG (SEQ ID NO: 149 barA-s-up1 TTTTGCTTCGCTGCTGTAAA (SEQ ID NO: 150) barA-s-down1 TCAGGCACGTCGCTTTTAAT (SEQ ID NO: 151) barA-s-up2 CGCGATCACCTGAATACGAT (SEQ ID NO: 152

. barA-s-up3 TGGCCTATGTCGAACCAAAC (SEQ ID NO: 154 mlc-s-up1 CTGGCAAATAACCCGAATGT (SEQ ID NO: 155) mlc-s-down1 CCAGGGCATCTTTATTACGC (SEQ ID NO: 156) a mic-s-up2 TGAAACTGAAGCCTGGCACT (SEQ ID NO: 157 * Os iniciadores para sequenciamento foram usados para ampli- ar o fragmento a montante, de codificação e terminador de todos os genes. e Tabela 15. Fontes e características de cepas de E. coli, plasmídeos e iniciadores usados neste estudo EEaGEAAS DP 1 Características relevantes Fonte ou referência 2008a Ez [ap o Este estudo | Aa XZ466 pck*, AptsH —— Este estudo pck", AptsI-W — Este estudo pck”, AptsG AIdhA, AadhE, pel” | Plasmídeos pLOI4 162 bla, cat sacB cassete Jantama e outro, E EC 2008b deleção de /dhA CR2.1-TOPO pLOI4653 Este estudo CR2.1-TOPO S digestão de Pacl de pLOl4668, e autoligada CR2.1-TOPO

Este estudo - mudança do promoter de pck bla kan, pck-P from E.coli clonado no vetor pCR2.1-

TOPO 7 Este estudo pts! deleção bla kan; pts! de E.coli clonado no vetor pCR2.1- | Este estudo

TOPO digestão de Pacl of pLOI4735, e autoligado Esteestuado = ptsG

TOPO pLOI4162) clonado no ptsG de pLOI4683 Er o sara tramas FE esco gldA

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: REFERÊNCIAS Todas as referências são listadas aqui para a conveniência do os leitor. Cada referência está incorporada por referência em sua totalidade.

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Claims (1)

1. : REIVINDICAÇÕES

   1. Célula bacteriana, caracterizada pelo fato de que compreende o uma ou mais modificações genéticas que rompem o funcionamento do sis- í tema de fosfotransferase dependente de PEP, ou uma ou mais modificações genéticas que super-regulam a expressão de um ou mais genes que codifi- cam transportadores de açúcar e níveis aumentados de transcrições de ge- ne de fosfoenol piruvato carboxicinase (pck), as referidas transcrições codifi- cando a fosfoenol piruvato carboxicinase ativa (PCK) e em que a referida célula exibe atividade de PCK aumentada.

   2. Célula bacteriana, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que a referida bactéria é Escherichia coli, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacteri- um radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tu- mescens, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Art- hrobacter oxydans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevi- bacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Bre- vibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Bre- vibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusil- Jum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium im- mariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Coryne- bacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium cal- lunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutami- cum, Enterobacter aerogenes, Enwinia amylovora, Enwinia carotovora, Envi- nia herbicola, Enwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacte- rium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavo- bacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepti- cum, Micrococcus sp. CCM825, Morganella morganii, Nocardia opaca, No- cardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudo- monas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudo- monas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni,

   : Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodoc- hrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Spo- ros rosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyroge- . nes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatos- poria parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomy- ces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomy- ces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Ae- romonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiami- nolyticus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquifaciens, Bacillus coagulans, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, ou Xanthomonas citri.

   3. Célula bacteriana, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que níveis aumentados das referidas transcrições de pck resultam da substituição de sequências reguladoras nativas com sequências reguladoras alteradas do gene de pck que aumenta a transcrição de pck, em que as ditas sequências reguladoras estão na região de promotor do referido gene de pck.

   4. Célula bacteriana, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que os referidos níveis aumentados das referidas transcri- ções de pck resultam de uma ou mais mutações na região de promotor do gene de pck, preferivelmente as referidas uma ou mais mutações são muta- ções pontuais compreendendo a substituição de nucleotídeo A com nucleo- tíideoG na posição 68 a montante do códon de iniciação de gene de pck; ou substituição da sequência de promotor nativo com uma sequência de promo- tor exógeno, preferivelmente o referido promotor exógeno é um promotor constitutivo ou um promotor induzível, mais preferivelmente o referido pro- motor induzível é um promotor /ac.

   5. Célula bacteriana, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que o referido transportador de açúcar é um membro de transportadores de cassete de ligação de ATP.

   S 6. Célula bacteriana, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que o referido transportador de açúcar é um membro da fr principal superfamília de facilitador. - 7. Célula bacteriana, caracterizada pelo fato de que compreende uma mutação em gene gldA ou uma mutação em opéron de dhaKLM e ní- veis aumentados de transcrições de gene de fosfoenol piruvato carboxicina- se (pck), as referidas transcrições codificando a fosfoenol piruvato carboxici- nase ativa (PCK) e em que a referida célula exibe atividade de PCK aumen- tada.

   8. Célula bacteriana, de acordo com a reivindicação 7, caracteri- zada pelo fato de que compreende ainda uma mutação em um ou mais ge- nes codificando para uma proteina em sistema de fosfotransferase.

   9. Célula bacteriana, de acordo com a reivindicação 7, caracteri- zada pelo fato de que compreende ainda uma mutação em um ou mais ge- nes codificando para proteínas envolvidas na série de reação fermentativa.

   10. Célula bacteriana, de acordo com a reivindicação 7, caracte- rizada pelo fato de que compreende ainda uma mutação em um ou mais ge- nes codificando para proteínas associadas com a operação do ciclo de TCA.