CN104894041B - 可提升甘油代谢的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种可提升甘油代谢的菌株，其属于大肠杆菌，且包含一λ噬菌体P_R启动子及一Trc启动子，其中λ噬菌体P_R启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpK基因、glpD基因、gldA基因及dhaKLM基因操纵组的表达，而Trc启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpF基因的表达。本发明更利用此菌株衍生成一种可抵抗粗甘油的菌株、与一种可生产D型乳酸的菌株。

Description

可提升甘油代谢的菌株及其应用

技术领域

本发明关于一种利用基因工程技术构建的菌株，且特别涉及一种可提升甘油代谢的菌株、以及此菌株的应用。

背景技术

当今全球环保意识当道，生质柴油便顺此潮流迅速发展，台湾更于2010年起全面推动B2生质柴油。生质柴油的制造还伴随副产物的产生，鉴于生质柴油的发展，副产物的数量亦急剧上升，于是产生大量待处理的废弃物。副产物中的甘油（为与后文提及的“纯净的甘油”区别，特称之为“粗甘油”）因与其它物质混合，如甲醇、动植物脂肪、或盐类，须经过精制来得到纯净的甘油，纯净的甘油始有经济价值，可用于化妆品、药品、或其它应用。目前，粗甘油的精制大多是仰赖与添加的化学物质反应，甚至可能须于高温下作用，以分离出纯净的甘油。生质柴油虽然诉求环保与低污染，但粗甘油的精制却需要如此不环保的过程，这与生质柴油的诉求背道而驰。

生物科技是二十一世纪发展的重点产业之一，其核心是在利用生物材料替代化学物质。大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）因生长快速、培养基配方简单、且发酵操作容易，为常见的生物材料之一。除此之外，大肠杆菌能代谢多种不同的碳源，如醣类或甘油，已广泛取代与其等效的化学物质。然而，就粗甘油而言，因其所含的物质会对菌株构成逆境环境，从而抑制菌株的生长与稳定性，甚至降低菌株的甘油代谢。

发明内容

本发明的第一构想关于一种可提升甘油代谢的菌株，其属于大肠杆菌，且包含一λ噬菌体P_R启动子、及一Trc启动子。λ噬菌体P_R启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的表达，而Trc启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpF基因 的表达。

本发明的第二构想关于一种可抵抗粗甘油的菌株，其属于大肠杆菌，且为利用一含以下步骤的方法制得的：培养上一构想的菌株于一第一培养液内；以及培养上一构想的菌株于一第二培养液内，第二培养液的粗甘油浓度高于第一培养液的粗甘油浓度。

本发明的第三构想关于一种可生产D型乳酸的菌株，其属于大肠杆菌，且为剔除前一构想的菌株染色体上的pta基因、adhE基因、frdA基因、mgsA基因、pflB基因、tdcDE基因操纵组、pflEF基因操纵组、及dld基因，并插入乳酸菌D-ldh基因至前一构想的菌株染色体而制得的。

附图说明

图1为大肠杆菌的甘油代谢的生化途径图，图中符号说明为：⊕，代表活化基因的表达；-○，代表抑制基因的表达。

图2为质粒pLoxKm-PR的图谱，图中缩写说明为：Ap，抗氨芐青霉素基因（ampicillin）；f1ori，噬菌体f1复制起始点；PR promoter，λ噬菌体P_R启动子；RE，Lox位；EM7promoter，细菌EM7启动子；Neo(Km)，抗新霉素基因（抗卡纳霉素基因）；LE，Lox位；ColE1ori，大肠杆菌ColE1复制起始点。

图3为质粒pTH19Cre-Cs的图谱，图中缩写说明为：Cm，抗氯霉素基因；pSC101ori，pSC101复制起始点；Cre，编码Cre蛋白的基因；BAD promoter，BAD启动子；Operator I1+I2，操纵子I1+I2；CAP site，CAP结合位；Operator1，操纵子O1；araC promoter，AraC启动子；Operator O2，操纵子O2；ara C，编码AraC蛋白的基因。

图4为质粒pLoxKm-Trc的图谱，图中缩写说明为：Ap，抗氨芐青霉素基因（ampicillin）；f1ori，噬菌体f1复制起始点；Trc promoter，Trc启动子；RE，Lox位；EM7promoter，细菌EM7启动子；Neo(Km)，抗新霉素基因（抗卡纳霉素基因）；LE，Lox位；ColE1ori，大肠杆菌ColE1复制起始点。

图5为使用分光光度计测量含菌株BLA-13的培养液在每次继代培养时菌体浓度的结果，以显示菌株在每次继代培养的生长情况。

图6为使用高效率液相层析测量含菌株BLA-13的培养液于每次继代培养 时甘油浓度的结果，以显示菌株于每次继代培养的甘油代谢情况。

图7为菌株BLA-13及菌株BLA-13-G于培养后的生长情况与粗甘油代谢情况，图中曲线说明为：实心方框的曲线，含菌株BLA-13的培养液的菌体浓度；空心方框的曲线，含菌株BLA-13-G的培养液的菌体浓度；实心圆框的曲线，含菌株BLA-13的培养液的粗甘油浓度；空心圆框的曲线，含菌株BLA-13-G的培养液的粗甘油浓度。

图8为菌株BLA-13-G9于发酵后的的生长情况、粗甘油代谢情况、及D型乳酸生产情况，图中曲线说明为：实心圆框的曲线，含菌株BLA-13-G9的发酵液的菌体浓度；实心三角框的曲线，含菌株BLA-13-G9的发酵液的粗甘油浓度；实心方框的曲线，含菌株BLA-13-G9的发酵液的D型乳酸浓度。

具体实施例

如图1，大肠杆菌的甘油代谢的生化途径主要分为：有氧代谢与无氧代谢。在有氧代谢途径中，菌株是将甘油先转化成甘油-3-磷酸（glycerol-3-phosphate，G3P），接着将甘油-3-磷酸转化为二羟丙酮磷酸（dihydroxyacetone phosphate，DHAP）；然而，在无氧代谢途径中，其是将甘油先转化为二羟基丙酮（dihydroxyacetone，DHA），然后将二羟基丙酮转化为二羟丙酮磷酸。而，有氧代谢途径与无氧代谢途径中的上述步骤的差异意味着涉及这些不同步骤的酵素的基因可能与氧气的调控有关。换言之，gldA基因、或dhaKLM基因操纵组的启动子可能为一缺氧（hypoxia）有关的调控组件，glpK基因、或glpD基因的启动子可能为一有氧（hyperoxia）有关的调控组件。

根据上述，本发明人推测若利用基因工程技术将一与氧气无关的启动子取代此二代谢途径中不同步骤的酵素的基因启动子，则菌株不再受有氧或无氧的影响，可同时活化甘油的有氧代谢途径与无氧代谢途径，双管齐下地提升甘油代谢。

于是，本发明的第一实施方式提出一种可提升甘油代谢的菌株。此菌株属于大肠杆菌，且含有一λ噬菌体P_R启动子、及一Trc启动子；其中，λ噬菌体P_R启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的表达，而Trc启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpF基因的表达。前述基因名称的全名，如下：dhaKLM，二羟基丙酮 激酶（dihydroxyacetone kinase）；gldA，甘油去氢酶（glycerol dehydrogenase）；glpD，甘油-3-磷酸去氢酶（glycerol-3-phosphatedehydrogenase）；glpF，传送甘油的辅助蛋白（glycerol uptake facilitator protein）；glpK，甘油激酶（glycerolkinase）。

在本实施方式中，λ噬菌体P_R启动子可镶嵌于glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的上游区域，Trc启动子可镶嵌于glpF基因的上游区域。

在本实施方式中，λ噬菌体P_R启动子可取代glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的上游区域的启动子，Trc启动子可取代glpF基因的上游区域的启动子。

再如图1，可调控glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组表达的λ噬菌体P_R启动子、与可调控glpF基因表达的Trc启动子均属一与氧气无关的启动子。也就是说，无论在有氧或无氧下，这些基因均为活化的，可大量地表现其产物酵素，从而使甘油代谢的有氧代谢途径及无氧代谢途径可同时进行。通过这种方式，本实施方式的菌株可大幅地提升甘油的代谢。此外，本实施方式的菌株的品系原则上不受到任何限制，而于本实施方式中，其品系为BL21。

本发明人更发现第一实施方式的菌株经设计过的演化导引法驯育后，驯育后的菌株不仅保有提升甘油代谢的能力，还对粗甘油产生抵抗性。

于是，本发明的第二实施方式提出一种可抵抗粗甘油的菌株。此菌株属于大肠杆菌，且为利用一含以下步骤的方法制得的：培养第一实施方式的菌株于一第一培养液内；以及培养第一实施方式的菌株于一第二培养液内，第二培养液的粗甘油浓度高于第一培养液的粗甘油浓度。而，本实施方式的菌株已于2014年3月2日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏单位地址：武汉市武昌区珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心（邮编：430072），保藏号CCTCCM2014055。

在本实施方式中，第一培养液的粗甘油浓度可为30g/L，第二培养液的粗甘油浓度可为70g/L。

在本实施方式中，第一阶段培养步骤的时间可为24小时，第二阶段培养步骤的时间可为70小时。

在本实施方式中，第一培养液及第二培养液，除了粗甘油外，均还可包含一 NBS培养基。而，NBS培养基的配方为：25.7mM的磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）、28.7mM的磷酸氢二钾（K₂HPO₄）、26.5mM的磷酸氢二铵（(NH₄)₂HPO₄）、1mM的硫酸镁（MgSO₄）、0.1mM的氯化钙（CaCl₂）、0.015mM的硫胺盐酸（thiaminehydrochloric acid）、1mM的甜菜碱（betaine）、5.9μM的氯化铁（FeCl3）、0.8μM的氯化钴（CoCl₂）、0.6μM的氯化铜（CuCl₂）、1.5μM的硫酸锌（ZnSO₄）、0.8μM的钼酸钠（Na₂MoO₄）、及0.8μM的硼酸（H₃BO₃）。

另外，S.Mazumdar等人已于Appl Environ Microbiol.2010;76(13):4327-36成功地发表一株新颖大肠杆菌菌株，且菌株染色体上的frdA基因、pta基因、与adhE基因已被剔除。发表的菌株能将40g/L的甘油发酵成32g/L的D型乳酸。据此，本发明人推测若能部分地仿效此文献剔除第二实施方式的菌株染色体上的部分基因，则此菌株可能会有较文献记载优异的甘油转化成D型乳酸的能力。

于是，本发明的第三实施方式提出一种可生产D型乳酸的菌株。此菌株属于大肠杆菌，且为剔除第二实施方式的菌株染色体上的pta基因、adhE基因、frdA基因、mgsA基因、pflB基因、tdcDE基因操纵组、pflEF基因操纵组、及dld基因、并插入乳酸菌D-ldh基因至第二实施方式的菌株染色体而制得的。前述基因名称的全名，如下：adhE，乙醛辅酶A/乙醇去氢酶（acetaldehyde-coA/alcohol dehydrogenase）；dld，D型乳酸去氢酶（D-lactatedehydrogenase）；frdA，富马酸还原酶（fumarate reductase）；D-ldh，D型乳酸去氢酶（D-lactate dehydrogenase）；mgsA，丙酮醛合成酶（methylglyoxal synthase）；pflB，甲基乙酰转移酶（formate acetyltransferase）；pflEF，丙酮酸甲酸裂解酶（pyruvate fomatelyase）；pta，磷酸乙酰转移酶（phosphate acetyltransferase）；tdcDE，丙酮酸甲酸裂解酶（pyruvate fomate lyase）。

于本实施方式中，乳酸菌为Lactobacillus helveticus。

又如图1，一方面，本实施方式的菌株的染色体缺少pta基因、adhE基因、frdA基因、mgsA基因、pflB基因、tdcDE基因操纵组、pflEF基因操纵组、及dld基因，因此这些基因为不活化的，且菌株缺乏其产物酵素。如此，本实施方式的菌株的甘油代谢途径可引导至D型乳酸的生产，而大量地制造D型乳酸。

另一方面，本实施方式的菌株的染色体还有外源性基因乳酸菌D-ldh基因，其产物酵素可促进丙酮酸转化成D型乳酸，同样地可大量地制造D型乳酸。

现以下述具体例，详细说明本发明的实施方式。

《实验方法与材料》

下文实施例采用的实验方法与材料可参考本发明所属技术领域人士熟悉的工具书：Sambrook J.,et al.,2001,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,3rd ed.，如限制酶剪切DNA片段（DNA cleavage by restriction enzyme）、T4DNA连接酶连接DNA片段（DNA ligation with T4DNA ligase）、及聚合酶连锁反应（polymerase chain reaction，PCR）等均可通过上述工具书及所属技术领域人士本身的专业素养来实施。

细菌培养液的菌体浓度是使用分光光度计（Thermo Co.）测得的，而测量使用的光波长为550nm，测量结果纪录为OD550。细菌及噬菌体的染色体、质粒、及DNA片段的纯化是各利用Blood&Tissue Genomic Mini Kit（Viogene Co.）、Plasmid Extraction Mini Kit（Favorgen Co.）、及Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit（Geneaid Co.）等商业套组完成的。限制酶购自New England Biolabs、及Thermo Co.。T4DNA连接酶、与Pfu DNA聚合酶购自Promega Co.。聚合酶连锁反应使用的引物为委托明欣生物科技公司、及源资生物科技公司合成的。转化使用的细胞为大肠杆菌DH5α（Statagene Co.）、与BL21（Promega Co.），而菌株培养于液态培养基。经转化后，菌株则培养于含抗生素的液态培养基，抗生素的剂量如：100μg/mL的氨芐青霉素（ampicillin）、50μg/mL的卡纳霉素（kanamycin）、15μg/mL的正大霉素（gentamycin）、或50μg/mL的氯霉素（chloramphenicol）。

针对下述实施例使用的“化学转化法”、“电穿孔法（electroporation）”、“原位聚合酶连锁反应”、及“高效率液相层析（high pressure liquid chromatography，HPLC）”于下做详细介绍：

I、化学转化法

从固态培养基中挑选单一菌落至液态培养基，并于适当温度下，以150rpm震荡培养12至16小时。将菌液接种到新鲜液态培养基，其菌体起始浓度为OD550＝0.08，并在适当温度下，以150rpm震荡培养。直到菌体浓度OD550＝0.3至0.5，取出4mL的菌液至无菌试管中，冰浴10分钟，然后以4000rpm离心2分钟并移除上清液。将剩下的菌体与2mL的0.1M氯化镁均匀混合后，冰浴5分钟，再以 4000rpm离心2分钟并移除上清液。将离心剩余的菌体与1.5mL的0.05M氯化钙均匀混合后，冰浴20分钟，再以4000rpm离心2分钟并移除上清液。加入300μL的0.05M氯化钙与离心残存的菌体均匀混合后，则制得感受态细胞（competentcell）。

接着，取2ng/mL的质粒与100μL的感受态细胞加入至无菌试管中并混合均匀。冰浴30分钟后，将无菌试管移至42℃恒温水浴槽中2分钟，再冰浴5分钟。加入1mL的新鲜液态培养基（4℃）至感受态细胞菌液后，置于适当温度中培养2小时，再以4000rpm离心10分钟并移除上清液。将残存的液态培养基与离心下来的感受态细胞菌体混合均匀后，吸取适量的感受态细胞菌液，均匀涂在含抗生素的固态培养基，并将其置于适当温度的恒温培养箱中，隔夜培养至长出菌落。

II、电穿孔法

从固态培养基中挑选单一菌落至含适当量的抗生素的液态培养基，并于适当温度下，以150rpm震荡培养12至16小时。将菌液接种到新鲜液态培养基，其菌体起始浓度为OD₅₅₀＝0.08，并在适当温度下，以150rpm震荡培养。直到菌体浓度OD₅₅₀＝0.3至0.5，取出20mL的菌液至无菌试管中，冰浴10分钟，然后以4000rpm离心2分钟并移除上清液。将剩下的菌体与5mL的10%甘油均匀混合后，于4℃下以4000rpm离心10分钟并移除上清液。将离心剩余的菌体与5mL的10%甘油均匀混合后，于4℃下以4000rpm离心10分钟并移除上清液。加入240μL的10%甘油与离心残存的菌体均匀混合后，则制得感受态细胞。

接着，取500ng/mL的线性DNA与40μL的感受态细胞加入至电穿管中并混合均匀。冰浴1分钟后，以250奥姆、2500伏特的条件电击感受态细胞，接着迅速加入2mL的SOC培养基（98mL的SOB培养基、1mL的2M硫酸镁、及1mL的2M葡萄糖，其中SOB培养基的配方为：20g/L的胰蛋白（tryptone）、5g/L的酵母萃取物（yeast extract）、0.584g/L的氯化钠、0.186g/L的氯化钾、及980mL的水）。于适当温度下培养SOC培养基2小时后，以4000rpm离心10分钟并移除上清液。将残存的SOC培养基与离心下来的感受态细胞菌体混合均匀后，吸取适量的感受态细胞菌液，均匀涂布在含抗生素的固态培养基，并将其置于适当温度的恒温培养箱中，隔夜培养至长出菌落。

III、原位聚合酶连锁反应

将50mμL的反应物（1x聚合酶连锁反应缓冲液、0.2μM的dNTP、1μM的正向引物、1μM的反向引物、1.25U的聚合酶、及去离子水）加入至微量试管内。从固态LB培养基挑选单一菌落，并与反应物混合。将微量试管置于热循环器内，对菌落进行聚合酶连锁反应。

IV、高效率液相层析

取500μL的菌株发酵培养液后，离心并取上清液来进行高效率液相层析。利用此层析测量发酵培养液的甘油浓度时，分析管柱尺寸为7.8mmx300mm（ICSep ICE-COREGEL87H3Column），移动相为0.0085N的硫酸，流速为0.6mL/min，温度为80℃，分析体积为20μL。利用此层析测量发酵培养液的有机酸浓度时，分析管柱尺寸为6.5mmx300mm（ICSepICE-ORH-801Column），移动相为0.0085N的硫酸，流速为0.4mL/min，温度为55℃，紫外线波长为210nm，分析体积为20μL。

《实施例1》

I、λ噬菌体P_R启动子取代glpK基因的启动子

依美国国家生物科技信息中心（National Center for BiotechnologyInformation，NCBI）基因体数据库设计以下引物：

正向引物：5’-attgggtaccacttcactttggt-3’（SEQ ID NO：1）；

反向引物：5’-ggtggcggccgctcgacttcgagcagactcatc-3’（SEQ ID NO：2）。

正向引物设计有限制酶KpnI剪切的位置（如底线标记处），反向引物设计有限制酶NotI剪切的位置（如底线标记处）。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含glpK基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段（约1.0kb）。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶KpnI及NotI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS(+)（Stratagene Co.）后，使用限制酶KpnI及NotI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一含glpK基因的部分区域及其部分上游区域的质粒pBlue-glpK。

依质粒pBlue-glpK设计以下引物：

正向引物：5’-agggggatccgtttaattgtcccgtagtca-3’（SEQ ID NO：3）；

反向引物：5’-gatccatatgactgaaaaaaaatatatcgt-3’（SEQ ID NO：4）。

正向引物设计有限制酶BamHI剪切的位置（如底线标记处），反向引物设计有限制酶NdeI剪切的位置（如底线标记处）。以质粒pBlue-glpK为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含glpK基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段（约3.8kb）。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶BamHI及NdeI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pLoxKm-PR（其图谱如图2）后，使用限制酶BamHI及NdeI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一质粒pBlue-glpK’-lox，其依序含有glpK基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及glpK基因的部分区域。

依质粒pBlue-glpK’-lox设计以下引物：

正向引物：5’-cgtcacgttttaaatgctcg-3’（SEQ ID NO：5）；

反向引物：5’-ccattgacgggttttgccatg-3’（SEQ ID NO：6）。

以质粒pBlue-glpK’-lox为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段（约1.76kb），其依序含有glpK基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及glpK基因的部分区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述“化学转化法”将协助质粒pKD46（Proc Natl Acad SciU S A.2000;97(16):6640-5）送至大肠杆菌BL21内，得到一转化菌株BLA-8/pKD46。依上述“电穿孔法”，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-8/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入1mM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ-Red蛋白质，以协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提高至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含卡纳霉素的固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，而其染色体依序含有glpK基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及glpK基因的部分区域。

利用上述“化学转化法”转化质粒pTH19Cre-As（其图谱如图3）至挑选的菌落内。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入0.3mM阿拉伯糖诱发质粒 pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，以协助菌株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提高至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体含有λ噬菌体PR启动子但未含抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-9。

II、λ噬菌体PR启动子取代glpD基因的启动子

依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：

正向引物：5’-attgggtacccagaagtagcacgagtacgag-3’（SEQ ID NO：7）；

反向引物：5’-gtggcggccgctgccgtgataacacatcaccatc-3’（SEQ ID NO：8）。

正向引物设计有限制酶KpnI剪切的位置（如底线标记处），反向引物设计有限制酶NotI剪切的位置（如底线标记处）。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含glpD基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段（约0.9kb）。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶KpnI及NotI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质质粒pBluescript IIKS(+)后，使用限制酶KpnI及NotI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一含glpD基因的部分区域及其部分上游区域的质粒pBlue-glpD。

依质粒pBlue-glpD设计以下引物：

正向引物：5’-tgggggatccgctgccctcattcactttc-3’（SEQ ID NO：9）；

反向引物：5’-gatccatatggaaaccaaagatctgattg-3’（SEQ ID NO：10）。

正向引物设计有限制酶BamHI剪切的位置（如底线标记处），反向引物设计有限制酶NdeI剪切的位置（如底线标记处）。以质粒pBlue-glpD为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含glpD基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段（约3.8kb）。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶BamHI及NdeI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pLoxKm-PR后，使用限制酶BamHI及NdeI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一质粒pBlue-glpD’-lox，此依序含有glpD基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及glpD基因的部分区域。

依质粒pBlue-glpD’-lox设计以下引物：

正向引物：5’-tcagtagcacttcacgttcag-3’（SEQ ID NO：11）；

反向引物：5’-atcgcgaatatcgaccagcac-3’（SEQ ID NO：12）。

以质粒pBlue-glpD’-lox为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段（约1.62kb），其依序含有glpD基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及glpD基因的部分区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述“化学转化法”转化协助质粒pKD46至菌株BLA-9内，得到一转化菌株BLA-9/pKD46。依上述“电穿孔法”，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-9/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入1mM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ-Red蛋白质，以协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含卡纳霉素的固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体依序含有glpD基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及glpD基因的部分区域。

利用上述“化学转化法”转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入0.3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，以协助菌株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。使用上述「原位聚合酶连锁反应」挑选出一菌落，其染色体含有λ噬菌体PR启动子但未含抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-10。

III、Trc启动子取代glpF基因的启动子

依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：

正向引物：5’-gagcctcgagtgatgagtctgctcgaagtc-3’（SEQ ID NO：13）；

反向引物：5’-gagctctagagcttccagtttctcaaacacttc-3’（SEQ ID NO：14）。

正向引物设计有限制酶XhoI剪切的位置（如底线标记处），反向引物设计有 限制酶XbaI剪切的位置（如底线标记处）。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含glpF基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段（约0.8kb）。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶XhoI及XbaI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS(+)后，使用限制酶XhoI及XbaI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一含glpF基因的部分区域及其部分上游区域的质粒pBlue-glpF。

依质粒pBlue-glpF设计以下引物：

正向引物：5’-tgggggatcctgaagagttaatgtttgttg-3’（SEQ ID NO：15）；

反向引物：5’-gatccatatgagtcaaacatcaaccttga-3’（SEQ ID NO：16）。

正向引物设计有限制酶BamHI剪切的位置（如底线标记处），反向引物设计有限制酶NdeI剪切的位置（如底线标记处）。以质粒pBlue-glpF为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含glpF基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段（约3.7kb）。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶BamHI及NdeI剪切纯化的DNA片段。另外，利用PlasmidExtraction Mini Kit纯化质粒pLoxKm-Trc（其图谱如图4）后，使用限制酶BamHI及NdeI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一质粒pBlue-glpF’-lox，此依序含有glpF基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、Trc启动子、及glpF基因的部分区域。

依质粒pBlue-glpF’-lox设计以下引物：

正向引物：5’-ctttgcgcttgtcgaaacag-3’（SEQ ID NO：17）；

反向引物：5’-tcctgaattgcaaggcgttg-3’（SEQ ID NO：18）。

以质粒pBlue-glpF’-lox为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段（约1.8kb），其依序含有glpF基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、Trc启动子、及glpF基因的部分区域，再利用Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述“化学转化法”转化协助质粒pKD46至菌株BLA-10内，得到一转化菌株BLA-10/pKD46。依上述「电 穿孔法」，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-10/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入1mM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含卡纳霉素的固态LB培养基。使用上述的“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体依序含有glpF基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、Trc启动子、及glpF基因的部分区域。

利用上述“化学转化法”转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入0.3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体含有Trc启动子但未含抗抗生素基因的菌落，并培育成菌株，命名为BLA-11。

IV、λ噬菌体PR启动子取代gldA基因的启动子

依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：

正向引物：5’-ccggaggtaccatgaaatgtgccagtgc-3’（SEQ ID NO：19）；

反向引物：5’-gtactgagctcgtacggttcaggagctg-3’（SEQ ID NO：20）。

正向引物设计有限制酶XhoI剪切的位置（如底线标记处），反向引物设计有限制酶SacI剪切的位置（如底线标记处）。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含gldA基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段（约1.8kb）。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶XhoI及SacI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS(+)后，使用限制酶XhoI及SacI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一含gldA基因的部分区域及其部分上游区域的质粒pBlue-gldA。

依质粒pBlue-gldA设计以下引物：

正向引物：5’-accggatccttgctcctttagagatgagtagtgc-3’（SEQ ID NO：21）；

反向引物：5’-gagcacatatggaccgcattattcaatcac-3’（SEQ ID NO：22）。

正向引物设计有限制酶BamHI剪切的位置（如底线标记处），反向引物设计有限制酶NdeI剪切的位置（如底线标记处）。以质粒pBlue-gldA为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含gldA基因的部分区域及其部分上游区域的DNA片段（约3.4kb）。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶BamHI及NdeI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pLoxKm-PR后，使用限制酶BamHI及NdeI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一质粒pBlue-gldA’-lox，此依序含有gldA基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及gldA基因的部分区域。

依质粒pBlue-gldA’-lox设计以下引物：

正向引物：5’-ccatgaaatgtgccagtgc-3’（SEQ ID NO：23）；

以质粒pBlue-gldA’-lox为模板，并利用此引物与SEQ ID NO：20的引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段（约1.7kb），其依序含有gldA基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、λ噬菌体PR启动子、LoxP位、及gldA基因的部分区域，再利用Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述“化学转化法”转化协助质粒pKD46至菌株BLA-11内，得到一转化菌株BLA-11/pKD46。依上述「电穿孔法」，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-11/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入1mM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含卡纳霉素的固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体依序含有gldA基因的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及gldA基因的部分区域。

利用上述“化学转化法”转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入0.3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。 残存的菌体涂抹于固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体含有λ噬菌体PR启动子但未含抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-12。

V、λ噬菌体PR启动子取代dhaKLM基因操纵组的启动子

依质粒pLoxKm-PR设计以下引物：

正向引物：5’-catcattgatcaattttttcatatggatcaacctcctta-3’（SEQ ID NO：24）；

反向引物：5’-gtcgttgaacatcatccatgcccattaatgtcgacgatcc-3’（SEQ IDNO：25）。

以质粒pLoxKm-PR为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一DNA片段（约1.17kb），其依序含有LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子。

依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：

正向引物：5’-ttgttcgtccagtacgtcttgcacatcattgatcaattttttcat-3’（SEQ IDNO：26）；

反向引物：5’-ttcatcggcagtcagtggtcgccgtgtcgttgaacatcatccatg-3’（SEQ IDNO：27）。

以前述的DNA片段为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出另一DNA片段（约1.2kb），其依序含有dhaKLM基因操纵组的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及dhaKLM基因操纵组的部分区域。

以前述另一DNA片段设计以下引物：

正向引物：5’-gctttcgccagtcctgccagttgttcgtccagtacgtctt-3’（SEQ ID NO：28）；

反向引物：5’-ccttgcctgatgcacaatggattcatcggcagtcagtggt-3’（SEQ ID NO：29）。

以前述另一DNA片段为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段（约1.25kb），其依序含有dhaKLM基因操纵组的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、PR启动子、及dhaKLM基因操纵组的部分区域， 再利用Gel/PCR DNA FragmentExtraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述“化学转化法”转化协助质粒pKD46至前述菌株BLA-12内，得到一转化菌株BLA-12/pKD46。依上述“电穿孔法”，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-12/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入1mM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含卡纳霉素的固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体依序含有dhaKLM基因操纵组的部分上游区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、及dhaKLM基因操纵组的部分区域。

利用上述“化学转化法”转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入0.3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体含有λ噬菌体PR启动子但未含抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-13。

《实施例2》

本实施例主要是分析菌株BLA-13对纯净的甘油的代谢效果。首先，从固态培养基中挑选菌株BLA-13的单一菌株后，培养于5mL的液态LB培养基，并于37℃下，以200rpm震荡培养至隔夜。将菌液接种至含NBS培养基与35g/L的纯甘油的培养液中，其菌体起始浓度为OD550＝2.0。接种的菌液于37℃下以150rpm震荡培养，并于培养48小时后，重新接种至另一含NBS培养基与35g/L的纯甘油的培养液中，其菌体起始浓度为OD550＝2.0。而自第一次接种到第二次接种称为“一次继代培养”，并于第一次接种起每隔24小时取培养液进行分析。

如图5所示，为使用分光光度计测量菌液的菌体浓度的结果。从此图可看出：随着继代培养的次数增加，菌体的浓度亦逐渐增加，而且当继代培养12次后，菌体的浓度可达OD550=9.07。

如图6所示，为利用上文“高效率液相层析”测量菌液的甘油浓度的结果。 从此图可得到：随着继代培养的次数增加，菌株的甘油代谢速率亦逐渐增加，且当继代培养6次后，菌株可于48小时内完全代谢培养液中35g/L的纯甘油。

《实施例3》

从固态培养基中挑选菌株BLA-13的单一菌落后，培养于5mL的液态LB培养基中，并于37℃下，以200rpm震荡培养隔夜。将菌液接种至含NBS培养基与30g/L的粗甘油的培养液中，其菌体初始浓度达到OD550＝0.2，并于37℃下，以200rpm震荡培养24小时。重复以上培养步骤，直到细胞密度增加后，再菌液转至含NBS培养基与70g/L的粗甘油的培养液中，其菌体初始浓度达到OD550＝0.2，并于37℃下，以200rpm震荡培养60小时。最后自培养液中筛选出一菌株，命名为BLA-13-G。

接着，将菌株BLA-13和BLA-13-G培养至含NBS培养基与110g/L的粗甘油的培养液中。如图7所示，为利用上文“高效率液相层析”测量含菌株BLA-13与BLA-13-G的菌液的粗甘油浓度的结果。由此可知，菌株BLA-13-G可随培养的时间生长并消耗粗甘油；反之，菌株BLA-13的生长迟缓，且粗甘油的消耗十分缓慢。上述结果证实菌株BLA-13-G具有较为优异的粗甘油耐受性。

《实施例4》

I、剔除pta基因

依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：

正向引物：5’-tgtccaagcttattatgctgatccctacc-3’（SEQ ID NO：30）；

反向引物：5’-gttcgactagtttagaaatgcgcgcgtc-3’（SEQ ID NO：31）。

正向引物设计有限制酶HindIII剪切的位置（如底线标记处），反向引物设计有限制酶SpeI剪切的位置（如底线标记处）。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含pta基因的DNA片段（约0.94kb）。利用Gel/PCR DNA FragmentExtraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶HindIII及SpeI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pMCS-5（Mo Bi Tec.）后，使用限制酶HindIII及SpeI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法‘将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一含pta基因的质粒pMCS-pta。

依质粒pMCS-pta设计以下引物：

正向引物：5’-acgatgaattccatcagcacatctttctg-3’（SEQ ID NO：32）；

反向引物：5’-accgtgtcgacggtacctgatcgcgactcgtgc-3’（SEQ ID NO：33）。

正向引物设计有限制酶EcoRI剪切的位置（如底线标记处），反向引物设计有限制酶SalI剪切的位置（如底线标记处）。以质粒pMCS-pta为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含pta基因的5’端区域及其3’端区域的DNA片段（约3.5kb）。利用Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及SalI剪切纯化的DNA片段。

依质粒pLoxGm-PR设计以下引物：

正向引物：5’-aagccatatggaattcattaccgttcgtataatgtatgc-3’（SEQ ID NO：34）；

反向引物：5’-tcgacgtcgacataccgttcgtatagcatacat-3’（SEQ ID NO：35）；

正向引物设计有限制酶EcoRI剪切的位置（如底线标记处），反向引物设计有限制酶SalI剪切的位置（如底线标记处）。以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一DNA片段（约0.73kb），其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及SalI剪切纯化的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一质粒pMCS-ptaGm，此依序含有pta基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pta基因的3’端区域。

以质粒pMCS-ptaGm为模板，并利用SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：31的引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段（约1.3kb），其依序含有pta基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pta基因的3’端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述“化学转化法”转化协助质粒pKD46至菌株BLA-13-G内，得到一转化菌株BLA-13-G/pKD46。依上述“电穿孔法”，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入1mM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述“原位 聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体依序含有pta基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pta基因的3’端区域。

利用上述「化学转化法」转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入0.3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体缺乏pta基因但未含抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G1。

II、剔除adhE基因

依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：

正向引物：5’-gttctgtctgaagacgacac-3’（SEQ ID NO：36）；

反向引物：5’-ccggtgagctcagacccaagtggtcg-3’（SEQ ID NO：37）。

反向引物设计有限制酶SacI剪切的位置（如底线标记处）。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含adhE基因的DNA片段（约2.08kb）。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶KpnI及SacI剪切纯化的DNA片段。另外，利用PlasmidExtraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS(+)后，使用限制酶KpnI及SacI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一含adhE基因的质粒pBlue-adhE。

依质粒pBlue-adhE设计以下引物：

正向引物：5’-cgcagtaactcacgccatgg-3’（SEQ ID NO：38）；

反向引物：5’-tcagcgaattcatcgataacaactggag-3’（SEQ ID NO：39）。

反向引物设计有限制酶EcoRI剪切的位置（如底线标记处）。以质粒pBlue-adhE为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含adhE基因的5’端区域及其3’端区域的DNA片段（约3.7kb）。利用Gel/PCR DNA FragmentExtraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及HindIII剪切纯化的DNA片段。以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用SEQ ID NO：34及SEQ ID NO： 35的引物对其进行PCR，扩增出一DNA片段（约0.73kb），其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及HindIII剪切纯化的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一质粒pBlue-adhE-Gm，此依序含有adhE基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及adhE基因的3’端区域。

依质粒pBlue-adhE-Gm设计以下引物：

正向引物：5’-accatcactatcgctgaacc-3’（SEQ ID NO：40）。

以质粒pBlue-adhE-Gm为模板，并利用此引物与SEQ ID NO：39的引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段（约1.52kb），其依序含有adhE基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及adhE基因的3’端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述“化学转化法”转化协助质粒pKD46至菌株BLA-13-G1内，得到一转化菌株BLA-13-G1/pKD46。依上述“电穿孔法”，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G1/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入1mM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体依序含有adhE基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及adhE基因的3’端区域。

利用上述“化学转化法”转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入0.3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体缺乏adhE基因但未含抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G2。

III、剔除frdA基因

依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：

正向引物：5’-gaaagtcgacgaatcccgcccagg-3’（SEQ ID NO：41）；

反向引物：5’-caagaaagcttgttgataagaaagg-3’（SEQ ID NO：42）。

以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含frdA基因的DNA片段（约3.52kb）。利用Gel/PCR DNA Fragment ExtractionKit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶PstI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS(+)后，使用限制酶PstI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一含frdA基因的质粒pBlue-frdA。

依质粒pBlue-frdA设计以下引物：

正向引物：5’-cacaccatatgttagaattcattaccgttcg-3’（SEQ ID NO：43）；

反向引物：5’-gatccaggccttaatgtcgacgatcctatacc-3’（SEQ ID NO：44）。

正向引物设计有限制酶NdeI剪切的位置（如底线标记处）。以质粒pBlue-frdA为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含frdA基因的5’端区域及其3’端区域的DNA片段（约1.1kb）。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶NdeI及StuI剪切纯化的DNA片段。以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用此SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35的引物对其进行PCR，扩增出一DNA片段（约1.1kb），其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶NdeI剪切纯化的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一质粒pBlue-frdA-Gm，此依序含有frdA基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及frdA基因的3’端区域。

依质粒质粒pBlue-frdA-Gm设计以下引物：

正向引物：5’-ccatatctagactgcagaagggggctccg-3’（SEQ ID NO：45）；

反向引物：5’-tgaagggtacctgcagctctgccagcttg-3’（SEQ ID NO：46）。

以质粒pBlue-frdA-Gm为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段（约1.9kb），其依序含有frdA基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及frdA基因的3’端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述「化学转化法」转化协助质粒pKD46至菌株BLA-13-G2内，得到一转化菌株BLA-13-G2/pKD46。依上述“电穿孔法”，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G2/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入1mM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体依序含有frdA基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及frdA基因的3’端区域。

利用上述“化学转化法”转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入0.3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体缺乏frdA基因但未含抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G3。

IV、剔除mgsA基因

依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：

正向引物：5’-taatgagctcttacttcagacggtccgcgag-3’（SEQ ID NO：47）；

反向引物：5’-taatggtaccctgacgactcgcactttacc-3’（SEQ ID NO：48）。

正向引物设计有限制酶SacI剪切的位置（如底线标记处），反向引物设计有限制酶KpnI剪切的位置（如底线标记处）。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含mgsA基因的DNA片段（约0.47kb）。利用Gel/PCR DNA FragmentExtraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶SacI及KpnI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS(+)后，使用限制酶SacI及KpnI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一含mgsA基因的质粒pBlue-mgsA。

依质粒pBlue-mgsA设计以下引物：

正向引物：5’-tgattgtcgacaagctttgggatccactaaatgc-3’（SEQ ID NO：49）；

反向引物：5’-taactgaattctgagatcaatgcgccaac-3’（SEQ ID NO：50）。

正向引物设计有限制酶SalI剪切的位置（如底线标记处），反向引物设计有限制酶EcoRI剪切的位置（如底线标记处）。以质粒pBlue-mgsA为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含mgsA基因的5’端区域及其3’端区域的DNA片段（约3.3kb）。利用Gel/PCRDNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及SalI剪切纯化的DNA片段。

以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35的引物对其进行PCR，扩增出一DNA片段（约0.73kb），其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及SalI剪切纯化的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一质粒pBlue-mgsAGm，此依序含有mgsA基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及mgsA基因的3’端区域。

以质粒pBlue-mgsAGm为模板，并利用SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：48的引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段（约1.19kb），其依序含有mgsA基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及mgsA基因的3’端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment ExtractionKit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述“化学转化法”转化协助质粒pKD46至菌株BLA-13-G3内，得到一转化菌株BLA-13-G3/pKD46。依上述「电穿孔法」，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G3/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入1mM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体依序含有mgsA基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及mgsA基因的3’端区域。

利用上述“化学转化法”转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入0.3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30℃下培 养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体缺乏mgsA基因但未含抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G4。

V、剔除pflB基因

依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：

正向引物：5’-gaacgatctagaaggtgtaggagataccatc-3’（SEQ ID NO：51）；

反向引物：5’-gagggtctcgagtccttcctggctgg-3’（SEQ ID NO：52）。

以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含pflB基因的DNA片段（约1.9kb）。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRV剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS(+)后，使用限制酶EcoRV剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一含pflB基因的质粒pBlue-pflB。

依质粒pBlue-pflB设计以下引物：

正向引物：5’-catcaggtagtcgataccgtacagc-3’（SEQ ID NO：53）；

反向引物：5’-tgctgaaggcctgtctgcaatcaaatatgc-3’（SEQ ID NO：54）。

以质粒pBlue-pflB为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含pflB基因的5’端区域及其3’端区域的DNA片段（约1.1kb），再利用Gel/PCR DNAFragment ExtractionKit纯化扩增的DNA片段。

以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44的引物对其进行PCR，扩增出一DNA片段（约1.1kb），其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一质粒pBlue-pflBGm，此依序含有pflB基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pflB基因的3’端区域。

以质粒pBlue-pflBGm为模板，并利用SEQ ID NO：51及SEQ ID NO：52的 引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段（约1.95kb），其依序含有pflB基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pflB基因的3’端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment ExtractionKit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述“化学转化法”转化协助质粒pKD46至菌株BLA-13-G4内，得到一转化菌株BLA-13-G4/pKD46。依上述“电穿孔法”，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G4/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入1mM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体依序含有pflB基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pflB基因的3’端区域。

利用上述「化学转化法」转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入0.3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体缺乏pflB基因但未含抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G5。

VI、剔除tdcDE基因操纵组

依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：

正向引物：5’-tgcaatctagaggtgacgatcgacacct-3’（SEQ ID NO：55）；

反向引物：5’-aacggctcgagtgttgatacctcaatggg-3’（SEQ ID NO：56）。

正向引物设计有限制酶XbaI剪切的位置（如底线标记处），反向引物设计有限制酶XhoI剪切的位置（如底线标记处）。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含tdcDE基因操纵组的DNA片段（约1.81kb）。利用Gel/PCR DNA FragmentExtraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶XbaI及XhoI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pBluescript II KS(+)后，使用限制酶XbaI及XhoI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法” 将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一含tdcDE基因操纵组的质粒pBlue-tdcDE。

使用限制酶EcoRI及EcoRV剪切质粒pBlue-tdcDE。另外，以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35的引物对其进行PCR，扩增出一DNA片段（约0.73kb），其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI剪切纯化的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一质粒pBlue-tdcDEGm，此依序含有tdcDE基因操纵组的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及tdcDE基因操纵组的3’端区域。

以质粒pBlue-tdcDEGm为模板，并利用SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：56的引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段（约1.74kb），其依序含有tdcDE基因操纵组的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及tdcDE基因操纵组的3’端区域，再利用Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述“化学转化法”转化协助质粒pKD46至菌株BLA-13-G5内，得到一转化菌株BLA-13-G5/pKD46。依上述“电穿孔法”，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G5/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入1mM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体依序含有tdcDE基因操纵组的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及tdcDE基因操纵组的3’端区域。

利用上述「化学转化法」转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入0.3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体缺乏tdcDE基因操纵组但未含抗抗生素基因，并培育成菌株，命 名为BLA-13-G6。

VII、剔除pflEF基因操纵组

依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：

正向引物：5’-ctcatcctttagctcaggaaag-3’（SEQ ID NO：57）；

反向引物：5’-gcaactatgattttcaatattcagc-3’（SEQ ID NO：58）。

以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含pflEF基因操纵组的DNA片段（约3.67kb）。利用Gel/PCR DNA FragmentExtraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRV剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid ExtractionMini Kit纯化质粒pBluescript II KS(+)后，使用限制酶EcoRV剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一含pflEF基因操纵组的质粒pBlue-pflEF。

依质粒pMCS-patGm设计以下引物：

正向引物：5’-gatgcatatgattaccgttcgtataatgtatgc-3’（SEQ ID NO：59）；

反向引物：5’-tcgacacgcgtataccgttcgtatagcatacat-3’（SEQ ID NO：60）。

以质粒pMCS-patGm为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含LoxP位、抗抗生素基因、及loxP位的DNA片段（约0.76kb）。利用Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶NdeI剪切纯化的DNA片段。另外，使用限制酶NdeI及HpaI剪切质粒pBlue-pflEF。接着，利用T4DNA连接酶接合二纯化的DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一质粒pBlue-pflEFGm，此依序含有pflEF基因操纵组的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pflEF基因操纵组的3’端区域。

以质粒pBlue-pflEFGm为模板，并利用SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：58的引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段（约1.33kb），其依序含有pflEF基因操纵组的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pflEF基因操纵组的3’端区域，再利用Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述“化学转化法”转化协助质粒pKD46至菌株BLA-13-G6内，得到一转化菌株BLA-13-G6/pKD46。依上述“电穿孔法”，将纯化的线性DNA 片段送至转化菌株BLA-13-G6/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入1mM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体依序含有pflEF基因操纵组的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pflEF基因操纵组的3’端区域。

利用上述「化学转化法」转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入0.3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体缺乏pflEF基因操纵组但未含抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G7。

VIII、剔除dld基因

依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：

正向引物：5’-tgataaagcttgctcgtctggtgggttc-3’（SEQ ID NO：61）；

反向引物：5’-gtgtcggcttcaatatcacg-3’（SEQ ID NO：62）。

正向引物设计有限制酶HindIII剪切的位置（如底线标记处）。以大肠杆菌BL21的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含dld基因的DNA片段（约0.68kb）。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶HindIII剪切纯化的DNA片段。另外，利用PlasmidExtraction Mini Kit纯化质粒pMCS5后，使用限制酶HindIII及EcoRV剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一含dld基因的5’端区域及其3’端区域的质粒pMCS5-dld。

依质粒pMCS5-dld设计以下引物：

正向引物：5’-tcgagaattcggtcaggcctgtattgg-3’（SEQ ID NO：63）；

反向引物：5’-gtggcgtcgacggtaccgaaatgtcgttattcg-3’（SEQ ID NO：64）。

正向引物设计有限制酶EcoRI剪切的位置（如底线标记处），反向引物设计有限制酶SalI剪切的位置（如底线标记处）。以质粒pMCS5-dld为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含dld基因的5’端区域及其3’端区域的DNA片段（约3.3kb）。利用Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及SalI剪切纯化的DNA片段。另外，以质粒pLoxGm-PR为模板，并利用此SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35的引物对其进行PCR，扩增出一DNA片段（约0.73kb），其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶EcoRI及SalI剪切纯化的DNA片段。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一质粒pMCS-dldGm，此依序含有dld基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及dld基因的3’端区域。

以质粒pMCS-dldGm为模板，并利用SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：62的引物对其进行PCR，扩增出一线性DNA片段（约3.3kb），其依序含有dld基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及dld基因的3’端区域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述“化学转化法”转化协助质粒pKD46至菌株BLA-13-G7内，得到一转化菌株BLA-13-G7/pKD46。依上述“电穿孔法”，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G7/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入1mM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含健他霉素的固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体依序含有dld基因的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及dld基因的3’端区域。

利用上述「化学转化法」转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入0.3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一 菌落，其染色体缺乏dld基因但未含抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G8。

IX、插入乳酸菌Lactobacillus helveticus的D-ldh基因

依美国国家生物科技信息中心基因体数据库设计以下引物：

正向引物：5’-ctggacatatgacaaaggtttttgcttacg-3’（SEQ ID NO：65）；

反向引物：5’-ttggggcccaggcctttaaaacttgttcttgttcaaag-3’（SEQ ID NO：66）。

正向引物设计有限制酶NdeI剪切的位置（如底线标记处），反向引物设计有限制酶StuI剪切的位置（如底线标记处）。以乳酸菌Lactobacillus helveticus CCRC12936（食品工业发展研究所）的染色体为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含D-ldh基因的DNA片段（约1.0kb）。利用Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit纯化扩增的DNA片段后，使用限制酶NdeI及StuI剪切纯化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit纯化质粒pLoxKm-PR后，使用限制酶NdeI及StuI剪切纯化的质粒。接着，利用T4DNA连接酶接合剪切的质粒与DNA片段后，依上文“化学转化法”将接合产物送至大肠杆菌DH5α内，而得到一质粒pLoxKm-D-ldh，其依序含有LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位及D-ldh基因。

依质粒pLoxKm-D-ldh设计以下引物：

正向引物：5’-atcacttcccgttccagagcgtcaaggctgatatcgttaaaacttgttcttgttcaaagc-3’（SEQ ID NO：67）；

反向引物：5’-ggaaacgatggcggcaaactgcacagatgcccagcgtcggatcctataccgttcgtatag-3’（SEQ ID NO：68）。

以质粒pLoxKm-D-ldh为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位及D-ldh基因的DNA片段（约2.2kb）。

依DNA片段设计以下引物：

正向引物：5’-gcgtgacgccgccgccggacgtgcgaaagaaaatgtcatctttcatcacttcccgttccag-3’（SEQ ID NO：69）；

反向引物：5’-aagcctcgcagaaacacattttgcgttacgccgaactggcggaacgatggcggcaaact-3’（SEQ ID NO：70）。

以DNA片段为模板，并利用此二引物对其进行PCR，扩增出一含pflCD基因操纵组的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、D-ldh基因、及pflCD基因操纵组的3’端区域的DNA片段（约2.28kb）。再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit纯化扩增的线性DNA片段。利用上述「化学转化法」转化协助质粒pKD46至菌株BLA-13-G8内，得到一转化菌株BLA-13-G8/pKD46。依上述“电穿孔法”，将纯化的线性DNA片段送至转化菌株BLA-13-G8/pKD46。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入1mM阿拉伯糖诱发质粒pKD46表达λ-Red蛋白质，协助线性DNA片段与菌株的染色体同源重组。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于含卡纳霉素的固态LB培养基。使用上述「原位聚合酶连锁反应」挑选出一菌落，其染色体依序含有pflCD基因操纵组的5’端区域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、D-ldh基因、及pflCD基因操纵组的3’端区域。

利用上述「化学转化法」转化质粒pTH19Cre-As至挑选的菌落内。培养转化菌株于SOC培养基内，并加入0.3mM阿拉伯糖诱发质粒pTH19Cre-As表达Cre蛋白质，协助菌株的染色体的二LoxP位重组而移除抗抗生素基因。于30℃下培养菌株2小时后，将培养温度提升至42℃持续培养2小时，再离心并移除上清液。残存的菌体涂抹于固态LB培养基。使用上述“原位聚合酶连锁反应”挑选出一菌落，其染色体镶嵌D-ldh基因但未含抗抗生素基因，并培育成菌株，命名为BLA-13-G9。

《实施例5》

本实施例主要为检测菌株BLA-13-G9的D型乳酸发酵能力。首先，从固态培养基中分别选取菌株BLA-13-G9的单一菌落，培养于5mL的液态LB培养基，并于37℃下，以200rpm震荡培养至隔夜。将菌液接种至50mL的NBS培养基（含5%的粗甘油），并于37℃下，以200rpm震荡培养10小时。再将菌液接种至500mL的NBS培养基（含5％的粗甘油），并于37℃下，以200rpm震荡培养10小时。又将菌液接种至含1L的NBS培养基（含5.5%（约67.58g/L）的粗甘油）的发酵槽，其菌体起始浓度OD550＝1.33，并于30℃、溶氧度50%、利用10N氢氧化钠控制的pH7.0下，进行发酵。于发酵8小时后，将溶氧度控制于3%，并随发酵时间，取样分析。

如图8所示，为利用分光光度计测量发酵液的菌体浓度结果、以及利用上文“高效率液相层析”测量菌液的甘油与D型乳酸浓度的结果。且根据此图，菌株BLA-13-G9于发酵60小时后，可消耗60.83g/L的粗甘油，并产生54.79g/的D型乳酸，而可推估其D型乳酸的重量转化率约为90%。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，但不能以此限定本发明实施的范围；因此，凡依本发明申请专利范围及发明说明书内容所作的简单的等效改变与修饰，皆仍属本发明专利涵盖的范围内。

Claims (1)

1.一种可生产D型乳酸的菌株，其属于大肠杆菌，且为剔除2014年3月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号CCTCC NO：M2014055的可抵抗粗甘油的菌株(Escherichia coli)染色体上的pta基因、adhE基因、frdA基因、mgsA基因、pflB基因、tdcDE基因操纵组、pflEF基因操纵组、及dld基因、并插入乳酸菌D-ldh基因至该可抵抗粗甘油的菌株染色体而制得的。