TWI481711B - 可提升甘油代謝的菌株及其應用 - Google Patents

Description

可提升甘油代謝的菌株及其應用

本發明關於一種利用基因工程技術建構的菌株，且特別攸關一種可提升甘油代謝的菌株、以及此菌株的應用。

當今全球環保意識當道，生質柴油便順此潮流迅速發展，我國更於民國九十九年起全面推動B2生質柴油。生質柴油的製造尚伴隨副產物的產生，鑒於生質柴油的發展，副產物的數量亦急遽上升，於是產生大量待處理的廢棄物。副產物中的甘油(為與後文提及的「純淨的甘油」區別，特稱之為「粗甘油」)因與其他物質混合，如甲醇、動植物脂肪、或鹽類，須經過精製來得到純淨的甘油，純淨的甘油始有經濟價值，可用於化妝品、藥品、或其他應用。目前，粗甘油的精製大多係仰賴與添加的化學物質反應，甚至可能須於高溫下作用，以分離出純淨的甘油。生質柴油雖然訴求環保與低汙染，但粗甘油的精製卻需要如此不環保的過程，這與生質柴油的訴求背道而馳。

生物科技是二十一世紀發展的重點產業之一，其核心是在利用生物材料替代化學物質。大腸桿菌(Escherichia coli ，E.coli )因生長快速、培養基配方簡單、且發酵操作容易，為常見的生物材料之一。除此之外， 大腸桿菌能代謝多種不同的碳源，如醣類或甘油，已廣泛取代與其等效的化學物質。然而，就粗甘油而言，因其所含的物質會對菌株構成逆境環境，從而抑制菌株的生長與穩定性，甚至降低菌株的甘油代謝。

本發明之第一構想關於一種可提升甘油代謝的菌株，其屬於大腸桿菌，且包含一λ噬菌體P_R 啟動子、及一Trc啟動子。λ噬菌體P_R 啟動子為鑲嵌於菌株的染色體上，以調控染色體上之glpK 基因、glpD 基因、gldA 基因、及dhaKLM 基因操縱組的表現，而Trc啟動子為鑲嵌於菌株的染色體上，以調控染色體上之glpF 基因的表現。

本發明之第二構想關於一種可抵抗粗甘油的菌株，其屬於大腸桿菌，且為利用一含以下步驟之方法製得的：培養上一構想的菌株於一第一培養液內；以及培養上一構想的菌株於一第二培養液內，第二培養液的粗甘油濃度高於第一培養液的粗甘油濃度。

本發明之第三構想關於一種可生產D型乳酸的菌株，其屬於大腸桿菌，且為剔除前一構想之菌株染色體上的pta 基因、adhE 基因、frdA 基因、mgsA 基因、pflB 基因、tdcDE 基因操縱組、pflEF 基因操縱組、及dld 基因，並插入乳酸菌D-ldh 基因至前一構想之菌株染色體而製得的。

第1圖為大腸桿菌之甘油代謝的生化途徑圖，圖中符號說明為：⊕，代表活化基因的表現；，代表抑制基因的表現。

第2圖為質體pLoxKm-PR的圖譜，圖中縮寫說明為：Ap，抗氨芐青黴素基因 (ampicillin)；f1 ori，噬菌體f1複製起始點；PR promoter，λ噬菌體P_R 啟動子；RE，Lox位；EM7 promoter，細菌EM7啟動子；Neo(Km)，抗新黴素基因(抗卡納黴素基因)；LE，Lox位；ColE1 ori，大腸桿菌ColE1複製起始點。

第3圖為質體pTH19Cre-Cs的圖譜，圖中縮寫說明為：Cm，抗氯黴素基因；pSC101ori，pSC101複製起始點；Cre，編碼Cre蛋白的基因；BAD promoter，BAD啟動子；Operator I1+I2，操縱子I1+I2；CAP site，CAP結合位；Operator1，操縱子O1；araC promoter，AraC啟動子；Operator O2，操縱子O2；ara C，編碼AraC蛋白的基因。

第4圖為質體pLoxKm-Trc的圖譜，圖中縮寫說明為：Ap，抗氨芐青黴素基因(ampicillin)；f1 ori，噬菌體f1複製起始點；Trc promoter，Trc啟動子；RE，Lox位；EM7 promoter，細菌EM7啟動子；Neo(Km)，抗新黴素基因(抗卡納黴素基因)；LE，Lox位；ColE1 ori，大腸桿菌ColE1複製起始點。

第5圖為使用分光光度計測量含菌株BLA-13之培養液於每次繼代培養時菌體濃度的結果，以顯示菌株於每次繼代培養的生長情況。

第6圖為使用高效率液相層析測量含菌株BLA-13之培養液於每次繼代培養時甘油濃度的結果，以顯示菌株於每次繼代培養的甘油代謝情況。

第7圖為菌株BLA-13及菌株BLA-13-G於培養後的生長情況與粗甘油代謝情況，圖中曲線說明為：實心方框的曲線，含菌株BLA-13之培養液的菌體濃度；空心方框的曲線，含菌株BLA-13-G之培養液的菌體濃度；實心圓框的曲線，含菌株BLA-13之培養液的粗甘油濃度；空心圓框的曲線，含菌株BLA-13-G之培養液的粗甘油濃度。

第8圖為菌株BLA-13-G9於發酵後的的生長情況、粗甘油代謝情況、及D型乳酸生產情況，圖中曲線說明為：實心圓框的曲線，含菌株BLA-13-G9之發酵液的菌體濃度；實心三角框的曲線，含菌株BLA-13-G9之發酵液的粗甘油濃度；實心方框的曲線，含菌株BLA-13-G9之發酵液的D型乳酸濃度。

如第1圖，大腸桿菌之甘油代謝的生化途徑主要分為：有氧代謝與無氧代謝。於有氧代謝途徑中，菌株係將甘油先轉化成甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate，G3P)，接著將甘油-3-磷酸轉化為二羥丙酮磷酸(dihydroxyacetone phosphate，DHAP)；然而，於無氧代謝途徑中，其係將甘油先轉化為二羥基丙酮(dihydroxyacetone，DHA)，然後將二羥基丙酮轉化為二羥丙酮磷酸。而，有氧代謝途徑與無氧代謝途徑中之上述步驟的差異意謂著涉及這些不同步驟之酵素的基因可能與氧氣的調控有關。換言之，gldA 基因、或dhaKLM 基因操縱組的啟動子可能為一缺氧(hypoxia)有關的調控元件，glpK 基因、或glpD 基因的啟動子可能為一有氧(hyperoxia)有關的調控元件。

根據上述，本發明人推測若利用基因工程技術將一與氧氣無關的啟動子取代此二代謝途徑中不同步驟之酵素的基因啟動子，則菌株不再受有氧或無氧的影響，可同時活化甘油的有氧代謝途徑與無氧代謝途徑，雙管齊下地提升甘油代謝。

於是，本發明之第一實施方式提出一種可提升甘油代謝的菌株。此菌株屬於大腸桿菌，且含有一λ噬菌體P_R 啟動子、及一Trc啟動子；其中，λ噬菌體P_R 啟動子為鑲嵌於菌株的染色體上，以調控染色體上之glpK 基因、glpD 基因、gldA 基因、及dhaKLM 基因操縱組的表現，而Trc啟動子為鑲嵌於菌株的染色體上，以調控染色體上之glpF 基因的表現。前述基因名稱的全名，如下：dhaKLM ，二羥基丙酮激酶(dihydroxyacetone kinase)；gldA ，甘油去氫酶(glycerol dehydrogenase)；glpD ，甘油-3-磷酸去氫酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)；glpF ，傳送甘油的輔助蛋白(glycerol uptake facilitator protein)；glpK ，甘油激酶(glycerol kinase)。

於本實施方式中，λ噬菌體P_R 啟動子可鑲嵌於glpK 基因、glpD 基因、gldA 基因、及dhaKLM 基因操縱組的上游區域，Trc啟動子可鑲嵌於glpF 基因的上游區域。

於本實施方式中，λ噬菌體P_R 啟動子可取代glpK 基因、glpD 基因、gldA 基因、及dhaKLM 基因操縱組之上游區域的啟動子，Trc啟動子可取代glpF 基因之上游區域的啟動子。

再如第1圖，可調控glpK 基因、glpD 基因、gldA 基因、及dhaKLM 基因操縱組表現的λ噬菌體P_R 啟動子、與可調控glpF 基因表現的Trc啟動子均屬一與氧氣無關的啟動子。也就是說，無論於有氧或無氧下，這些基因均為活化的，可大量地表現其產物酵素，從而使甘油代謝的有氧代謝途徑及無氧代謝途徑可同時進行。透過這種方式，本實施方式的菌株可大幅地提升甘油的代謝。此外，本實施方式之菌株的品系原則上不受到任何限制，而於本實施方式中，其品系為BL21。

本發明人更發現第一實施方式之菌株經設計過的演化導引法馴育後，馴育後的菌株不僅保有提升甘油代謝的能力外，還對粗甘油產生抵抗性。

於是，本發明之第二實施方式提出一種可抵抗粗甘油的菌株。此菌株屬於大腸桿菌，且為利用一含以下步驟之方法製得的：培養第一實施方式的菌株於一第一培養液內；以及培養第一實施方式的菌株於一第二培養液內，第二培養液的粗甘油濃度高於第一培養液的粗甘油濃度。而，本實施方式的菌株寄存於食品工業發展研究所(FIRDI)，寄存編號為BCRC 910601。

於本實施方式中，第一培養液的粗甘油濃度可為30g/L，第二培養液的粗甘油濃度可為70g/L。

於本實施方式中，第一階段培養步驟的時間可為24小時，第二階段培養步驟的時間可為70小時。

於本實施方式中，第一培養液及第二培養液，除了粗甘油外，均還可包含一NBS培養基。而，NBS培養基的配方為：25.7mM的磷酸二氫鈉(NaH₂ PO₄ )、28.7mM的磷酸氫二鉀(K₂ HPO₄ )、26.5mM的磷酸氫二銨((NH₄ )₂ HPO₄ )、1mM的硫酸鎂(MgSO₄ )、0.1mM的氯化鈣(CaCl₂ )、0.015mM的硫胺鹽酸(thiamine hydrochloric acid)、1mM的甜菜鹼(betaine)、5.9μM的氯化鐵(FeCl₃ )、0.8μM的氯化鈷(CoCl₂ )、0.6μM的氯化銅(CuCl₂ )、1.5μM的硫酸鋅(ZnSO₄ )、0.8μM的鉬酸鈉(Na₂ MoO₄ )、及0.8μM的硼酸(H₃ BO₃ )。

另外，S.Mazumdar等人已於Appl Environ Microbiol.2010；76(13)：4327-36成功地發表一株新穎大腸桿菌菌株，且菌株染色體上的frdA 基因、pta 基因、與adhE 基因已被剔除。發表的菌株能將40g/L的甘油發酵成32g/L的D型乳酸。據此，本發明人推測若能部分地仿效此文獻剔除第二實 施方式之菌株染色體上的部分基因，則此菌株可能會有較文獻記載優異之甘油轉化成D型乳酸的能力。

於是，本發明之第三實施方式提出一種可生產D型乳酸的菌株。此菌株屬於大腸桿菌，且為剔除第二實施方式之菌株染色體上的pta 基因、adhE 基因、frdA 基因、mgsA 基因、pflB 基因、tdcDE 基因操縱組、pflEF 基因操縱組、及dld 基因、並插入乳酸菌D-ldh 基因至第二實施方式之菌株染色體而製得的。前述基因名稱的全名，如下：adhE ，乙醛輔酶A/乙醇去氫酶(acetaldehyde-coA/alcohol dehydrogenase)；dld ，D型乳酸去氫酶(D-lactate dehydrogenase)；frdA ，富馬酸還原酶(fumarate reductase)；D-ldh ，D型乳酸去氫酶(D-lactate dehydrogenase)；mgsA ，丙酮醛合成酶(methylglyoxal synthase)；pflB ，甲基乙醯轉移酶(formate acetyltransferase)；pflEF ，丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate fomate lyase)；pta ，磷酸乙醯轉移酶(phosphate acetyltransferase)；tdcDE ，丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate fomate lyase)。

於本實施方式中，乳酸菌為Lactobacillus helveticus 。

又如第1圖，一方面，本實施方式之菌株的染色體缺少pta 基因、adhE 基因、frdA 基因、mgsA 基因、pflB 基因、tdcDE 基因操縱組、pflEF 基因操縱組、及dld 基因，因此這些基因為不活化的，且菌株缺乏其產物酵素。如此，本實施方式之菌株的甘油代謝途徑可引導至D型乳酸的生產，而大量地製造D型乳酸。

另一方面，本實施方式之菌株的染色體還有外源性基因乳酸菌D-ldh 基因，其產物酵素可促進丙酮酸轉化成D型乳酸，同樣地可大量地製造D型乳酸。

茲以下述具體例，詳細說明本發明之實施方式。

《實驗方法與材料》

下文實施例採用的實驗方法與材料可參考本發明所屬技術領域人士熟悉的工具書：Sambrook J.,et al.,2001,Molecular Cloning：a Laboratory Manual,3rd ed.，如限制酶剪切DNA片段(DNA cleavage by restriction enzyme)、T4 DNA黏接酶連接DNA片段(DNA ligation with T4 DNA ligase)、及聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)等均可透過上述工具書及所屬技術領域人士本身的專業素養來實施。

細菌培養液的菌體濃度是使用分光光度計(Thermo Co.)測得的，而測量使用的光波長為550nm，測量結果紀錄為OD₅₅₀ 。細菌及噬菌體的染色體、質體、及DNA片段的純化是各利用Blood & Tissue Genomic Mini Kit(Viogene Co.)、Plasmid Extraction Mini Kit(Favorgen Co.)、及Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit(Geneaid Co.)等商業套組完成的。限制酶購自New England Biolabs、及Thermo Co.。T4 DNA黏接酶、與Pfu DNA聚合酶購自Promega Co.。聚合酶連鎖反應使用的引子為委託明欣生物科技公司、及源資生物科技公司合成的。轉形使用的細胞為大腸桿菌DH5α(Statagene Co.)、與BL21(Promega Co.)，而菌株培養於液態培養基。經轉形後，菌株則培養於含抗生素的液態培養基，抗生素的劑量如：100μg/mL的氨芐青黴素(ampicillin)、50μg/mL的卡納黴素(kanamycin)、、15μg/mL的健他黴素(gentamycin)、或50μg/mL的氯黴素(chloramphenicol)。

針對下述實施例使用的「化學轉形法」、「電穿孔法(electroporation)」、「原位聚合酶連鎖反應」、及「高效率液相層析(high pressure liquid chromatography，HPLC)」於下做詳細介紹：

I、化學轉形法

從固態培養基中挑選單一菌落至液態培養基，並於適當溫度下，以150rpm震盪培養12至16小時。將菌液接種到新鮮液態培養基，其菌體起始濃度為OD₅₅₀ =0.08，並在適當溫度下，以150rpm震盪培養。直到菌體濃度OD₅₅₀ =0.3至0.5，取出4mL的菌液至無菌試管中，冰浴10分鐘，然後以4000rpm離心2分鐘並移除上清液。將剩下的菌體與2mL的0.1M氯化鎂均勻混合後，冰浴5分鐘，再以4000rpm離心2分鐘並移除上清液。將離心剩餘的菌體與1.5mL的0.05M氯化鈣均勻混合後，冰浴20分鐘，再以4000rpm離心2分鐘並移除上清液。加入300μL的0.05M氯化鈣與離心殘存的菌體均勻混合後，則製得勝任細胞(competent cell)。

接著，取2ng/mL的質體與100μL的勝任細胞加入至無菌試管中並混合均勻。冰浴30分鐘後，將無菌試管移至42℃恆溫水浴槽中2分鐘，再冰浴5分鐘。加入1mL的新鮮液態培養基(4℃)至勝任細胞菌液後，置於適當溫度中培養2小時，再以4000rpm離心10分鐘並移除上清液。將殘存的液態培養基與離心下來的勝任細胞菌體混合均勻後，吸取適量的勝任細胞菌液，均勻塗在含抗生素的固態培養基，並將其置於適當溫度的恆溫培養箱中，隔夜培養至長出菌落。

II、電穿孔法

從固態培養基中挑選單一菌落至含適當量之抗生素的液態培養基，並於適當溫度下，以150rpm震盪培養12至16小時。將菌液接種到新鮮液態培養基，其菌體起始濃度為OD₅₅₀ =0.08，並在適當溫度下，以150rpm 震盪培養。直到菌體濃度OD₅₅₀ =0.3至0.5，取出20mL的菌液至無菌試管中，冰浴10分鐘，然後以4000rpm離心2分鐘並移除上清液。將剩下的菌體與5mL的10%甘油均勻混合後，於4℃下以4000rpm離心10分鐘並移除上清液。將離心剩餘的菌體與5mL的10%甘油均勻混合後，於4℃下以4000rpm離心10分鐘並移除上清液。加入240μL的10%甘油與離心殘存的菌體均勻混合後，則製得勝任細胞。

接著，取500ng/mL的線性DNA與40μL的勝任細胞加入至電穿管中並混合均勻。冰浴1分鐘後，以250歐姆、2500伏特的條件電擊勝任細胞，接著迅速加入2mL的SOC培養基(98mL的SOB培養基、1mL的2M硫酸鎂、及1mL的2M葡萄糖，其中SOB培養基的配方為：20g/L的胰蛋白(tryptone)、5g/L的酵母萃取物(yeast extract)、0.584g/L的氯化鈉、0.186g/L的氯化鉀、及980mL的水)。於適當溫度下培養SOC培養基2小時後，以4000rpm離心10分鐘並移除上清液。將殘存的SOC培養基與離心下來的勝任細胞菌體混合均勻後，吸取適量的勝任細胞菌液，均勻塗佈在含抗生素的固態培養基，並將其置於適當溫度的恆溫培養箱中，隔夜培養至長出菌落。

III、原位聚合酶連鎖反應

將50mμL的反應物(1x聚合酶連鎖反應緩衝液、0.2μM的dNTP、1μM的順向引子、1μM的反向引子、1.25U的聚合酶、及去離子水)加入至微量試管內。從固態LB培養基挑選單一菌落，並與反應物混合。將微量試管置於熱循環器內，對菌落進行聚合酶連鎖反應。

IV、高效率液相層析

取500μL的菌株發酵培養液後，離心並取上清液來進行高效率液 相層析。利用此層析測量發酵培養液的甘油濃度時，分析管柱尺寸為7.8mmx300mm(ICSep ICE-COREGEL 87H3 Column)，移動相為0.0085N的硫酸，流速為0.6mL/min，溫度為80℃，分析體積為20μL。利用此層析測量發酵培養液的有機酸濃度時，分析管柱尺寸為6.5mmx300mm(ICSep ICE-ORH-801 Column)，移動相為0.0085N的硫酸，流速為0.4mL/min，溫度為55℃，紫外線波長為210nm，分析體積為20μL。

《實施例1》

I、λ噬菌體P_R 啟動子取代glpK 基因的啟動子

依美國國家生物科技資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)基因體資料庫設計以下引子：順向引子：5’-attgggtacc acttcactttggt-3’(SEQ ID NO：1)；反向引子：5’-ggtggcggccgc tcgacttcgagcagactcatc-3’(SEQ ID NO：2)。

順向引子設計有限制酶Kpn I剪切的位置(如底線標記處)，反向引子設計有限制酶Not I剪切的位置(如底線標記處)。以大腸桿菌BL21的染色體為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含glpK 基因之部分區域及其部分上游區域的DNA片段(約1.0kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Kpn I及Not I剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體pBluescript II KS(+)(Stratagene Co.)後，使用限制酶Kpn I及Not I剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一含glpK 基因之部分區域及 其部分上游區域的質體pBlue-glpK。

依質體pBlue-glpK設計以下引子：順向引子：5’-agggggatcc gtttaattgtcccgtagtca-3’(SEQ ID NO：3)；反向引子：5’-gatccatatg actgaaaaaaaatatatcgt-3’(SEQ ID NO：4)。

順向引子設計有限制酶Bam HI剪切的位置(如底線標記處)，反向引子設計有限制酶Nde I剪切的位置(如底線標記處)。以質體pBlue-glpK為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含glpK 基因之部分區域及其部分上游區域的DNA片段(約3.8kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Bam HI及Nde I剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體pLoxKm-PR(其圖譜如第2圖)後，使用限制酶Bam HI及Nde I剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一質體pBlue-glpK’-lox，其依序含有glpK 基因的部分上游區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌體P_R 啟動子、及glpK 基因的部分區域。

依質體pBlue-glpK’-lox設計以下引子：順向引子：5’-cgtcacgttttaaatgctcg-3’(SEQ ID NO：5)；反向引子：5’-ccattgacgggttttgccatg-3’(SEQ ID NO：6)。

以質體pBlue-glpK’-lox為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一線性DNA片段(約1.76kb)，其依序含有glpK 基因的部分上游區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌體P_R 啟動子、及glpK 基因的部分區域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的線性DNA片 段。利用上述「化學轉形法」將協助質體pKD46(Proc Natl Acad Sci U S A.2000；97(16)：6640-5)送至大腸桿菌BL21內，得到一轉形菌株BLA-8/pKD46。依上述「電穿孔法」，將純化的線性DNA片段送至轉形菌株BLA-8/pKD46。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入1mM阿拉伯糖誘發質體pKD46表現λ-Red蛋白質，以協助線性DNA片段與菌株的染色體同源重組。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提高至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於含卡納黴素的固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，而其染色體依序含有glpK 基因之部分上游區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌體P_R 啟動子、及glpK 基因之部分區域。

利用上述「化學轉形法」轉形質體pTH19Cre-As(其圖譜如第3圖)至挑選的菌落內。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入0.3mM阿拉伯糖誘發質體pTH19Cre-As表現Cre蛋白質，以協助菌株之染色體的二LoxP位重組而移除抗抗生素基因。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提高至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體含有λ噬菌體P_R 啟動子但未含抗抗生素基因，並培育成菌株，命名為BLA-9。

II、λ噬菌體P_R 啟動子取代glpD 基因的啟動子

依美國國家生物科技資訊中心基因體資料庫設計以下引子：順向引子：5’-attgggtacc cagaagtagcacgagtacgag-3’(SEQ ID NO：7)；反向引子：5’-gtggcggccgc tgccgtgataacacatcaccatc-3’(SEQ ID NO：8)。

順向引子設計有限制酶Kpn I剪切的位置(如底線標記處)，反向引子設計有限制酶Not I剪切的位置(如底線標記處)。以大腸桿菌BL21的染色體為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含glpD 基因之部分區域及其部分上游區域的DNA片段(約0.9kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Kpn I及Not I剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體pBluescript II KS(+)後，使用限制酶Kpn I及Not I剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一含glpD 基因之部分區域及其部分上游區域的質體pBlue-glpD。

依質體pBlue-glpD設計以下引子：順向引子：5’-tgggggatcc gctgccctcattcactttc-3’(SEQ ID NO：9)；反向引子：5’-gatccatatg gaaaccaaagatctgattg-3’(SEQ ID NO：10)。

順向引子設計有限制酶Bam HI剪切的位置(如底線標記處)，反向引子設計有限制酶Nde I剪切的位置(如底線標記處)。以質體pBlue-glpD為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含glpD 基因之部分區域及其部分上游區域的DNA片段(約3.8kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Bam HI及Nde I剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體pLoxKm-PR後，使用限制酶Bam HI及Nde I剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿 菌DH5α內，而得到一質體pBlue-glpD’-lox，此依序含有glpD 基因的部分上游區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌體P_R 啟動子、及glpD 基因的部分區域。

依質體pBlue-glpD’-lox設計以下引子：順向引子：5’-tcagtagcacttcacgttcag-3’(SEQ ID NO：11)；反向引子：5’-atcgcgaatatcgaccagcac-3’(SEQ ID NO：12)。

以質體pBlue-glpD’-lox為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一線性DNA片段(約1.62kb)，其依序含有glpD 基因的部分上游區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌體P_R 啟動子、及glpD 基因的部分區域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的線性DNA片段。利用上述「化學轉形法」轉形協助質體pKD46至菌株BLA-9內，得到一轉形菌株BLA-9/pKD46。依上述「電穿孔法」，將純化的線性DNA片段送至轉形菌株BLA-9/pKD46。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入1mM阿拉伯糖誘發質體pKD46表現λ-Red蛋白質，以協助線性DNA片段與菌株的染色體同源重組。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於含卡納黴素的固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體依序含有glpD 基因之部分上游區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌體P_R 啟動子、及glpD 基因之部分區域。

利用上述「化學轉形法」轉形質體pTH19Cre-As至挑選的菌落內。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入0.3mM阿拉伯糖誘發質體pTH19Cre-As表現Cre蛋白質，以協助菌株之染色體的二LoxP位重組而移除 抗抗生素基因。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體含有λ噬菌體P_R 啟動子但未含抗抗生素基因，並培育成菌株，命名為BLA-10。

III、Trc啟動子取代glpF 基因的啟動子

依美國國家生物科技資訊中心基因體資料庫設計以下引子：順向引子：5’-gagcctcgag tgatgagtctgctcgaagtc-3’(SEQ ID NO：13)；反向引子：5’-gagctctaga gcttccagtttctcaaacacttc-3’(SEQ ID NO：14)。

順向引子設計有限制酶Xho I剪切的位置(如底線標記處)，反向引子設計有限制酶Xba I剪切的位置(如底線標記處)。以大腸桿菌BL21的染色體為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含glpF 基因之部分區域及其部分上游區域的DNA片段(約0.8kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Xho I及Xba I剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體pBluescript II KS(+)後，使用限制酶Xho I及Xba I剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一含glpF 基因之部分區域及其部分上游區域的質體pBlue-glpF。

依質體pBlue-glpF設計以下引子：順向引子：5’-tgggggatcc tgaagagttaatgtttgttg-3’(SEQ ID NO： 15)；反向引子：5’-gatccatatg agtcaaacatcaaccttga-3’(SEQ ID NO：16)。

順向引子設計有限制酶Bam HI剪切的位置(如底線標記處)，反向引子設計有限制酶Nde I剪切的位置(如底線標記處)。以質體pBlue-glpF為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含glpF 基因之部分區域及其部分上游區域的DNA片段(約3.7kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Bam HI及Nde I剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體pLoxKm-Trc(其圖譜如第4圖)後，使用限制酶Bam HI及Nde I剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一質體pBlue-glpF’-lox，此依序含有glpF 基因的部分上游區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、Trc啟動子、及glpF 基因的部分區域。

依質體pBlue-glpF’-lox設計以下引子：順向引子：5’-ctttgcgcttgtcgaaacag-3’(SEQ ID NO：17)；反向引子：5’-tcctgaattgcaaggcgttg-3’(SEQ ID NO：18)。

以質體pBlue-glpF’-lox為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一線性DNA片段(約1.8kb)，其依序含有glpF 基因的部分上游區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、Trc啟動子、及glpF 基因的部分區域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的線性DNA片段。利用上述「化學轉形法」轉形協助質體pKD46至菌株BLA-10內，得到一轉形菌株BLA-10/pKD46。依上述「電穿孔法」，將純化的線性DNA片段送至轉形 菌株BLA-10/pKD46。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入1mM阿拉伯糖誘發質體pKD46表現λ-Red蛋白質，協助線性DNA片段與菌株的染色體同源重組。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於含卡納黴素的固態LB培養基。使用上述的「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體依序含有glpF 基因之部分上游區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、Trc啟動子、及glpF 基因之部分區域。

利用上述「化學轉形法」轉形質體pTH19Cre-As至挑選的菌落內。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入0.3mM阿拉伯糖誘發質體pTH19Cre-As表現Cre蛋白質，協助菌株之染色體的二LoxP位重組而移除抗抗生素基因。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體含有Trc啟動子但未含抗抗生素基因的菌落，並培育成菌株，命名為BLA-11。

IV、λ噬菌體P_R 啟動子取代gldA 基因的啟動子

依美國國家生物科技資訊中心基因體資料庫設計以下引子：順向引子：5’-ccggaggtacc atgaaatgtgccagtgc-3’(SEQ ID NO：19)；反向引子：5’-gtactgagctc gtacggttcaggagctg-3’(SEQ ID NO：20)。

順向引子設計有限制酶Xho I剪切的位置(如底線標記處)，反向引子設計有限制酶Sac I剪切的位置(如底線標記處)。以大腸桿菌BL21的染色體為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含gldA 基因之部 分區域及其部分上游區域的DNA片段(約1.8kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Xho I及Sac I剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體pBluescript II KS(+)後，使用限制酶Xho I及Sac I剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一含gldA 基因之部分區域及其部分上游區域的質體pBlue-gldA。

依質體pBlue-gldA設計以下引子：順向引子：5’-accggatcc ttgctcctttagagatgagtagtgc-3’(SEQ ID NO：21)；反向引子：5’-gagcacatatg gaccgcattattcaatcac-3’(SEQ ID NO：22)。

順向引子設計有限制酶Bam HI剪切的位置(如底線標記處)，反向引子設計有限制酶Nde I剪切的位置(如底線標記處)。以質體pBlue-gldA為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含gldA 基因之部分區域及其部分上游區域的DNA片段(約3.4kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Bam HI及Nde I剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體pLoxKm-PR後，使用限制酶Bam HI及Nde I剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一質體pBlue-gldA’-lox，此依序含有gldA 基因的部分上游區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌體P_R 啟動子、及gldA 基因 的部分區域。

依質體pBlue-gldA’-lox設計以下引子：順向引子：5’-ccatgaaatgtgccagtgc-3’(SEQ ID NO：23)；以質體pBlue-gldA’-lox為模板，並利用此引子與SEQ ID NO：20的引子對其進行PCR，增幅出一線性DNA片段(約1.7kb)，其依序含有gldA 基因的部分上游區域、LoxP位、抗抗生素基因、λ噬菌體P_R 啟動子、LoxP位、及gldA 基因的部分區域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的線性DNA片段。利用上述「化學轉形法」轉形協助質體pKD46至菌株BLA-11內，得到一轉形菌株BLA-11/pKD46。依上述「電穿孔法」，將純化的線性DNA片段送至轉形菌株BLA-11/pKD46。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入1mM阿拉伯糖誘發質體pKD46表現λ-Red蛋白質，協助線性DNA片段與菌株的染色體同源重組。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於含卡納黴素的固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體依序含有gldA 基因之部分上游區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌體P_R 啟動子、及gldA 基因之部分區域。

利用上述「化學轉形法」轉形質體pTH19Cre-As至挑選的菌落內。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入0.3mM阿拉伯糖誘發質體pTH19Cre-As表現Cre蛋白質，協助菌株之染色體的二LoxP位重組而移除抗抗生素基因。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體含有λ噬菌體P_R 啟動子但 未含抗抗生素基因，並培育成菌株，命名為BLA-12。

V、λ噬菌體P_R 啟動子取代dhaKLM 基因操縱組的啟動子

依質體pLoxKm-PR設計以下引子：順向引子：5’-catcattgatcaattttttcatatggatcaacctcctta-3’(SEQ ID NO：24)；反向引子：5’-gtcgttgaacatcatccatgcccattaatgtcgacgatcc-3’(SEQ ID NO：25)。

以質體pLoxKm-PR為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一DNA片段(約1.17kb)，其依序含有LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌體P_R 啟動子。

依美國國家生物科技資訊中心基因體資料庫設計以下引子：順向引子：5’-ttgttcgtccagtacgtcttgcacatcattgatcaattttttcat-3’(SEQ ID NO：26)；反向引子：5’-ttcatcggcagtcagtggtcgccgtgtcgttgaacatcatccatg-3’(SEQ ID NO：27)。

以前述的DNA片段為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出另一DNA片段(約1.2kb)，其依序含有dhaKLM 基因操縱組之部分上游區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌體P_R 啟動子、及dhaKLM 基因操縱組之部分區域。

以前述另一DNA片段設計以下引子：順向引子：5’-gctttcgccagtcctgccagttgttcgtccagtacgtctt-3’(SEQ ID NO：28)； 反向引子：5’-ccttgcctgatgcacaatggattcatcggcagtcagtggt-3’(SEQ ID NO：29)。

以前述另一DNA片段為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一線性DNA片段(約1.25kb)，其依序含有dhaKLM 基因操縱組的部分上游區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、P_R 啟動子、及dhaKLM 基因操縱組的部分區域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的線性DNA片段。利用上述「化學轉形法」轉形協助質體pKD46至前述菌株BLA-12內，得到一轉形菌株BLA-12/pKD46。依上述「電穿孔法」，將純化的線性DNA片段送至轉形菌株BLA-12/pKD46。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入1mM阿拉伯糖誘發質體pKD46表現λ-Red蛋白質，協助線性DNA片段與菌株的染色體同源重組。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於含卡納黴素的固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體依序含有dhaKLM 基因操縱組之部分上游區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、λ噬菌體P_R 啟動子、及dhaKLM 基因操縱組之部分區域。

利用上述「化學轉形法」轉形質體pTH19Cre-As至挑選的菌落內。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入0.3mM阿拉伯糖誘發質體pTH19Cre-As表現Cre蛋白質，協助菌株之染色體的二LoxP位重組而移除抗抗生素基因。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體含有λ噬菌體P_R 啟動子但 未含抗抗生素基因，並培育成菌株，命名為BLA-13。

《實施例2》

本實施例主要是分析菌株BLA-13對純淨之甘油的代謝效果。首先，從固態培養基中挑選菌株BLA-13的單一菌株後，培養於5mL的液態LB培養基，並於37℃下，以200rpm震盪培養至隔夜。將菌液接種至含NBS培養基與35g/L之純甘油的培養液中，其菌體起始濃度為OD₅₅₀ =2.0。接種的菌液於37℃下以150rpm震盪培養，並於培養48小時後，重新接種至另一含NBS培養基與35g/L之純甘油的培養液中，其菌體起始濃度為OD₅₅₀ =2.0。而自第一次接種到第二次接種稱為「一次繼代培養」，並於第一次接種起每隔24小時取培養液進行分析。

如第5圖所示，為使用分光光度計測量菌液之菌體濃度的結果。從此圖可看出：隨著繼代培養的次數增加，菌體的濃度亦逐漸增加，而且當繼代培養12次後，菌體的濃度可達OD₅₅₀ =9.07。

如第6圖所示，為利用上文「高效率液相層析」測量菌液之甘油濃度的結果。從此圖可得到：隨著繼代培養的次數增加，菌株的甘油代謝速率亦逐漸增加，且當繼代培養6次後，菌株可於48小時內完全代謝培養液中35g/L的純甘油。

《實施例3》

從固態培養基中挑選菌株BLA-13的單一菌落後，培養於5mL的液態LB培養基中，並於37℃下，以200rpm震盪培養隔夜。將菌液接種至含NBS培養基與30g/L之粗甘油的培養液中，其菌體初始濃度達到OD₅₅₀ =0.2，並於37℃下，以200rpm震盪培養24小時。重複以上培養步驟，直到 細胞密度增加後，再菌液轉至含NBS培養基與70g/L之粗甘油的培養液中，其菌體初始濃度達到OD₅₅₀ =0.2，並於37℃下，以200rpm震盪培養60小時。最後自培養液中篩選出一菌株，命名為BLA-13-G。

接著，將菌株BLA-13和BLA-13-G培養至含NBS培養基與110g/L之粗甘油的培養液中。如第7圖所示，為利用上文「高效率液相層析」測量含菌株BLA-13與BLA-13-G之菌液之粗甘油濃度的結果。由此可知，菌株BLA-13-G可隨培養的時間生長並消耗粗甘油；反之，菌株BLA-13的生長遲緩，且粗甘油的消耗十分緩慢。上述結果證實菌株BLA-13-G具有較為優異的粗甘油耐受性。

《實施例4》

I、剔除pta 基因

依美國國家生物科技資訊中心基因體資料庫設計以下引子：順向引子：5’-tgtccaagctt attatgctgatccctacc-3’(SEQ ID NO：30)；反向引子：5’-gttcgactagt ttagaaatgcgcgcgtc-3’(SEQ ID NO：31)。

順向引子設計有限制酶Hin dIII剪切的位置(如底線標記處)，反向引子設計有限制酶Spe I剪切的位置(如底線標記處)。以大腸桿菌BL21的染色體為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含pta 基因的DNA片段(約0.94kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Hin dIII及SpeI剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體pMCS-5(Mo Bi Tec.)後，使 用限制酶Hin dIII及Spe I剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一含pta 基因的質體pMCS-pta。

依質體pMCS-pta設計以下引子：順向引子：5’-acgatgaattc catcagcacatctttctg-3’(SEQ ID NO：32)；反向引子：5’-accgtgtcgac ggtacctgatcgcgactcgtgc-3’(SEQ ID NO：33)。

順向引子設計有限制酶Eco RI剪切的位置(如底線標記處)，反向引子設計有限制酶Sal I剪切的位置(如底線標記處)。以質體pMCS-pta為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含pta 基因之5’端區域及其3’端區域的DNA片段(約3.5kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Eco RI及Sal I剪切純化的DNA片段。

依質體pLoxGm-PR設計以下引子：順向引子：5’-aagccatatggaatt cattaccgttcgtataatgtatgc-3’(SEQ ID NO：34)；反向引子：5’-tcgacgtcgac ataccgttcgtatagcatacat-3’(SEQ ID NO：35)；順向引子設計有限制酶Eco RI剪切的位置(如底線標記處)，反向引子設計有限制酶Sal I剪切的位置(如底線標記處)。以質體pLoxGm-PR為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一DNA片段(約 0.73kb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Eco RI及Sal I剪切純化的DNA片段。接著，利用T4 DNA黏接酶接合二純化的DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一質體pMCS-ptaGm，此依序含有pta 基因之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pta 基因之3’端區域。

以質體pMCS-ptaGm為模板，並利用SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：31的引子對其進行PCR，增幅出一線性DNA片段(約1.3kb)，其依序含有pta 基因之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pta 基因之3’端區域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的線性DNA片段。利用上述「化學轉形法」轉形協助質體pKD46至菌株BLA-13-G內，得到一轉形菌株BLA-13-G/pKD46。依上述「電穿孔法」，將純化的線性DNA片段送至轉形菌株BLA-13-G/pKD46。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入1mM阿拉伯糖誘發質體pKD46表現λ-Red蛋白質，協助線性DNA片段與菌株的染色體同源重組。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於含健他黴素的固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體依序含有pta 基因之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pta 基因之3’端區域。

利用上述「化學轉形法」轉形質體pTH19Cre-As至挑選的菌落內。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入0.3mM阿拉伯糖誘發質體pTH19Cre-As表現Cre蛋白質，協助菌株之染色體的二LoxP位重組而移除抗 抗生素基因。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體缺乏pta 基因但未含抗抗生素基因，並培育成菌株，命名為BLA-13-G1。

II、剔除adhE 基因

依美國國家生物科技資訊中心基因體資料庫設計以下引子：順向引子：5’-gttctgtctgaagacgacac-3’(SEQ ID NO：36)；反向引子：5’-ccggtgagctc agacccaagtggtcg-3’(SEQ ID NO：37)。

反向引子設計有限制酶Sac I剪切的位置(如底線標記處)。以大腸桿菌BL21的染色體為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含adhE 基因的DNA片段(約2.08kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Kpn I及Sac I剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體pBluescript II KS(+)後，使用限制酶Kpn I及Sac I剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一含adhE 基因的質體pBlue-adhE。

依質體pBlue-adhE設計以下引子：順向引子：5’-cgcagtaactcacgccatgg-3’(SEQ ID NO：38)；反向引子：5’-tcagcgaattc atcgataacaactggag-3’(SEQ ID NO：39)。

反向引子設計有限制酶Eco RI剪切的位置(如底線標記 處)。以質體pBlue-adhE為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含adhE 基因之5’端區域及其3’端區域的DNA片段(約3.7kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Eco RI及Hin dIII剪切純化的DNA片段。以質體pLoxGm-PR為模板，並利用SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35的引子對其進行PCR，增幅出一DNA片段(約0.73kb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Eco RI及Hin dIII剪切純化的DNA片段。接著，利用T4 DNA黏接酶接合二純化的DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一質體pBlue-adhE-Gm，此依序含有adhE 基因之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及adhE 基因之3’端區域。

依質體pBlue-adhE-Gm設計以下引子：順向引子：5’-accatcactatcgctgaacc-3’(SEQ ID NO：40)。

以質體pBlue-adhE-Gm為模板，並利用此引子與SEQ ID NO：39的引子對其進行PCR，增幅出一線性DNA片段(約1.52kb)，其依序含有adhE 基因之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及adhE 基因之3’端區域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的線性DNA片段。利用上述「化學轉形法」轉形協助質體pKD46至菌株BLA-13-G1內，得到一轉形菌株BLA-13-G1/pKD46。依上述「電穿孔法」，將純化的線性DNA片段送至轉形菌株BLA-13-G1/pKD46。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入1mM阿拉伯糖誘發質體pKD46表現λ-Red蛋白質，協助線性DNA片段與菌株的染色體同源重組。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫 度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於含健他黴素的固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體依序含有adhE 基因之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及adhE 基因之3’端區域。

利用上述「化學轉形法」轉形質體pTH19Cre-As至挑選的菌落內。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入0.3mM阿拉伯糖誘發質體pTH19Cre-As表現Cre蛋白質，協助菌株之染色體的二LoxP位重組而移除抗抗生素基因。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體缺乏adhE 基因但未含抗抗生素基因，並培育成菌株，命名為BLA-13-G2。

III、剔除frdA 基因

依美國國家生物科技資訊中心基因體資料庫設計以下引子：順向引子：5’-gaaagtcgacgaatcccgcccagg-3’(SEQ ID NO：41)；反向引子：5’-caagaaagcttgttgataagaaagg-3’(SEQ ID NO：42)。

以大腸桿菌BL21的染色體為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含frdA 基因的DNA片段(約3.52kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Pst I剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體pBluescript II KS(+)後，使用限制酶Pst I剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合 剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一含frdA 基因的質體pBlue-frdA。

依質體pBlue-frdA設計以下引子：順向引子：5’-cacaccatatg ttagaattcattaccgttcg-3’(SEQ ID NO：43)；反向引子：5’-gatccaggccttaatgtcgacgatcctatacc-3’(SEQ ID NO：44)。

順向引子設計有限制酶Nde I剪切的位置(如底線標記處)。以質體pBlue-frdA為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含frdA 基因之5’端區域及其3’端區域的DNA片段(約1.1kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Nde I及Stu I剪切純化的DNA片段。以質體pLoxGm-PR為模板，並利用此SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35的引子對其進行PCR，增幅出一DNA片段(約1.1kb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Nde I剪切純化的DNA片段。接著，利用T4 DNA黏接酶接合二純化的DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一質體pBlue-frdA-Gm，此依序含有frdA 基因之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及frdA 基因之3’端區域。

依質體質體pBlue-frdA-Gm設計以下引子：順向引子：5’-ccatatctagactgcagaagggggctccg-3’(SEQ ID NO：45)； 反向引子：5’-tgaagggtacctgcagctctgccagcttg-3’(SEQ ID NO：46)。

以質體pBlue-frdA-Gm為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一線性DNA片段(約1.9kb)，其依序含有frdA 基因之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及frdA 基因之3’端區域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的線性DNA片段。利用上述「化學轉形法」轉形協助質體pKD46至菌株BLA-13-G2內，得到一轉形菌株BLA-13-G2/pKD46。依上述「電穿孔法」，將純化的線性DNA片段送至轉形菌株BLA-13-G2/pKD46。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入1mM阿拉伯糖誘發質體pKD46表現λ-Red蛋白質，協助線性DNA片段與菌株的染色體同源重組。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於含健他黴素的固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體依序含有frdA 基因之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及frdA 基因之3’端區域。

利用上述「化學轉形法」轉形質體pTH19Cre-As至挑選的菌落內。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入0.3mM阿拉伯糖誘發質體pTH19Cre-As表現Cre蛋白質，協助菌株之染色體的二LoxP位重組而移除抗抗生素基因。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體缺乏frdA 基因但未含抗抗生素基因，並培育成菌株，命名為BLA-13-G3。

IV、剔除mgsA 基因

依美國國家生物科技資訊中心基因體資料庫設計以下引子：順向引子：5’-taatgagctc ttacttcagacggtccgcgag-3’(SEQ ID NO：47)；反向引子：5’-taatggtacc ctgacgactcgcactttacc-3’(SEQ ID NO：48)。

順向引子設計有限制酶Sac I剪切的位置(如底線標記處)，反向引子設計有限制酶Kpn I剪切的位置(如底線標記處)。以大腸桿菌BL21的染色體為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含mgsA 基因的DNA片段(約0.47kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Sac I及Kpn I剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體pBluescript II KS(+)後，使用限制酶Sac I及Kpn I剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一含mgsA 基因的質體pBlue-mgsA。

依質體pBlue-mgsA設計以下引子：順向引子：5’-tgattgtcgac aagctttgggatccactaaatgc-3’(SEQ ID NO：49)；反向引子：5’-taactgaattc tgagatcaatgcgccaac-3’(SEQ ID NO：50)。

順向引子設計有限制酶Sal I剪切的位置(如底線標記處)，反向引子設計有限制酶Eco RI剪切的位置(如底線標記處)。以質體pBlue-mgsA為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含mgsA 基因 之5’端區域及其3’端區域的DNA片段(約3.3kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Eco RI及Sal I剪切純化的DNA片段。

以質體pLoxGm-PR為模板，並利用SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35的引子對其進行PCR，增幅出一DNA片段(約0.73kb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Eco RI及Sal I剪切純化的DNA片段。接著，利用T4 DNA黏接酶接合二純化的DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一質體pBlue-mgsAGm，此依序含有mgsA 基因之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及mgsA 基因之3’端區域。

以質體pBlue-mgsAGm為模板，並利用SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：48的引子對其進行PCR，增幅出一線性DNA片段(約1.19kb)，其依序含有mgsA 基因之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及mgsA 基因之3’端區域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的線性DNA片段。利用上述「化學轉形法」轉形協助質體pKD46至菌株BLA-13-G3內，得到一轉形菌株BLA-13-G3/pKD46。依上述「電穿孔法」，將純化的線性DNA片段送至轉形菌株BLA-13-G3/pKD46。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入1mM阿拉伯糖誘發質體pKD46表現λ-Red蛋白質，協助線性DNA片段與菌株的染色體同源重組。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於含健他黴素的固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選 出一菌落，其染色體依序含有mgsA 基因之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及mgsA 基因之3’端區域。

利用上述「化學轉形法」轉形質體pTH19Cre-As至挑選的菌落內。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入0.3mM阿拉伯糖誘發質體pTH19Cre-As表現Cre蛋白質，協助菌株之染色體的二LoxP位重組而移除抗抗生素基因。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體缺乏mgsA 基因但未含抗抗生素基因，並培育成菌株，命名為BLA-13-G4。

V、剔除pflB 基因

依美國國家生物科技資訊中心基因體資料庫設計以下引子：順向引子：5’-gaacgatctagaaggtgtaggagataccatc-3’(SEQ ID NO：51)；反向引子：5’-gagggtctcgagtccttcctggctgg-3’(SEQ ID NO：52)。

以大腸桿菌BL21的染色體為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含pflB 基因的DNA片段(約1.9kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Eco RV剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體pBluescript II KS(+)後，使用限制酶Eco RV剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一含pflB 基因的質體pBlue-pflB。

依質體pBlue-pflB設計以下引子： 順向引子：5’-catcaggtagtcgataccgtacagc-3’(SEQ ID NO：53)；反向引子：5’-tgctgaaggcctgtctgcaatcaaatatgc-3’(SEQ ID NO：54)。

以質體pBlue-pflB為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含pflB 基因之5’端區域及其3’端區域的DNA片段(約1.1kb)，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段。

以質體pLoxGm-PR為模板，並利用SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44的引子對其進行PCR，增幅出一DNA片段(約1.1kb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段。接著，利用T4 DNA黏接酶接合二純化的DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一質體pBlue-pflBGm，此依序含有pflB 基因之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pflB 基因之3’端區域。

以質體pBlue-pflBGm為模板，並利用SEQ ID NO：51及SEQ ID NO：52的引子對其進行PCR，增幅出一線性DNA片段(約1.95kb)，其依序含有pflB 基因之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pflB 基因之3’端區域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的線性DNA片段。利用上述「化學轉形法」轉形協助質體pKD46至菌株BLA-13-G4內，得到一轉形菌株BLA-13-G4/pKD46。依上述「電穿孔法」，將純化的線性DNA片段送至轉形菌株BLA-13-G4/pKD46。培養轉形菌株於SOC培養 基內，並加入1mM阿拉伯糖誘發質體pKD46表現λ-Red蛋白質，協助線性DNA片段與菌株的染色體同源重組。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於含健他黴素的固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體依序含有pflB 基因之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pflB 基因之3’端區域。

利用上述「化學轉形法」轉形質體pTH19Cre-As至挑選的菌落內。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入0.3mM阿拉伯糖誘發質體pTH19Cre-As表現Cre蛋白質，協助菌株之染色體的二LoxP位重組而移除抗抗生素基因。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體缺乏pflB 基因但未含抗抗生素基因，並培育成菌株，命名為BLA-13-G5。

VI、剔除tdcDE 基因操縱組

依美國國家生物科技資訊中心基因體資料庫設計以下引子：順向引子：5’-tgcaatctaga ggtgacgatcgacacct-3’(SEQ ID NO：55)；反向引子：5’-aacggctcgag tgttgatacctcaatggg-3’(SEQ ID NO：56)。

順向引子設計有限制酶Xba I剪切的位置(如底線標記處)，反向引子設計有限制酶Xho I剪切的位置(如底線標記處)。以大腸桿菌BL21的染色體為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含tdcDE 基因操 縱組的DNA片段(約1.81kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Xba I及Xho I剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體pBluescript II KS(+)後，使用限制酶Xba I及Xho I剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一含tdcDE 基因操縱組的質體pBlue-tdcDE。

使用限制酶Eco RI及Eco RV剪切質體pBlue-tdcDE。另外，以質體pLoxGm-PR為模板，並利用SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35的引子對其進行PCR，增幅出一DNA片段(約0.73kb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Eco RI剪切純化的DNA片段。接著，利用T4 DNA黏接酶接合二純化的DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一質體pBlue-tdcDEGm，此依序含有tdcDE 基因操縱組之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及tdcDE 基因操縱組之3’端區域。

以質體pBlue-tdcDEGm為模板，並利用SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：56的引子對其進行PCR，增幅出一線性DNA片段(約1.74kb)，其依序含有tdcDE 基因操縱組之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及tdcDE 基因操縱組之3’端區域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的線性DNA片段。利用上述「化學轉形法」轉形協助質體pKD46至菌株BLA-13-G5內，得到一轉形菌株BLA-13-G5/pKD46。依上述「電穿孔法」，將純化的線性DNA片段送至轉形菌株 BLA-13-G5/pKD46。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入1mM阿拉伯糖誘發質體pKD46表現λ-Red蛋白質，協助線性DNA片段與菌株的染色體同源重組。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於含健他黴素的固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體依序含有tdcDE 基因操縱組之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及tdcDE 基因操縱組之3’端區域。

利用上述「化學轉形法」轉形質體pTH19Cre-As至挑選的菌落內。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入0.3mM阿拉伯糖誘發質體pTH19Cre-As表現Cre蛋白質，協助菌株之染色體的二LoxP位重組而移除抗抗生素基因。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體缺乏tdcDE 基因操縱組但未含抗抗生素基因，並培育成菌株，命名為BLA-13-G6。

VII、剔除pflEF 基因操縱組

依美國國家生物科技資訊中心基因體資料庫設計以下引子：順向引子：5’-ctcatcctttagctcaggaaag-3’(SEQ ID NO：57)；反向引子：5’-gcaactatgattttcaatattcagc-3’(SEQ ID NO：58)。

以大腸桿菌BL21的染色體為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含pflEF 基因操縱組的DNA片段(約3.67kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Eco RV剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體 pBluescript II KS(+)後，使用限制酶Eco RV剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一含pflEF 基因操縱組的質體pBlue-pflEF。

依質體pMCS-patGm設計以下引子：順向引子：5’-gatgcatatg attaccgttcgtataatgtatgc-3’(SEQ ID NO：59)；反向引子：5’-tcgacacgcgtataccgttcgtatagcatacat-3’(SEQ ID NO：60)。

以質體pMCS-patGm為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含LoxP位、抗抗生素基因、及loxP位的DNA片段(約0.76kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Nde I剪切純化的DNA片段。另外，使用限制酶Nde I及Hpa I剪切質體pBlue-pflEF。接著，利用T4 DNA黏接酶接合二純化的DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一質體pBlue-pflEFGm，此依序含有pflEF 基因操縱組之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pflEF 基因操縱組之3’端區域。

以質體pBlue-pflEFGm為模板，並利用SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：58的引子對其進行PCR，增幅出一線性DNA片段(約1.33kb)，其依序含有pflEF 基因操縱組之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pflEF 基因操縱組之3’端區域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的線性DNA片段。利用上述「化學轉形法」轉形協助質體pKD46 至菌株BLA-13-G6內，得到一轉形菌株BLA-13-G6/pKD46。依上述「電穿孔法」，將純化的線性DNA片段送至轉形菌株BLA-13-G6/pKD46。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入1mM阿拉伯糖誘發質體pKD46表現λ-Red蛋白質，協助線性DNA片段與菌株的染色體同源重組。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於含健他黴素的固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體依序含有pflEF 基因操縱組之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及pflEF 基因操縱組之3’端區域。

利用上述「化學轉形法」轉形質體pTH19Cre-As至挑選的菌落內。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入0.3mM阿拉伯糖誘發質體pTH19Cre-As表現Cre蛋白質，協助菌株之染色體的二LoxP位重組而移除抗抗生素基因。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體缺乏pflEF 基因操縱組但未含抗抗生素基因，並培育成菌株，命名為BLA-13-G7。

VIII、剔除dld 基因

依美國國家生物科技資訊中心基因體資料庫設計以下引子：順向引子：5’-tgataaagctt gctcgtctggtgggttc-3’(SEQ ID NO：61)；反向引子：5’-gtgtcggcttcaatatcacg-3’(SEQ ID NO：62)。

順向引子設計有限制酶Hin dIII剪切的位置(如底線標記處)。以大腸桿菌BL21的染色體為模板，並利用此二引子對其進行PCR， 增幅出一含dld 基因的DNA片段(約0.68kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Hin dIII剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體pMCS5後，使用限制酶Hin dIII及Eco RV剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一含dld 基因之5’端區域及其3’端區域的質體pMCS5-dld。

依質體pMCS5-dld設計以下引子：順向引子：5’-tcgagaattc ggtcaggcctgtattgg-3’(SEQ ID NO：63)；反向引子：5’-gtggcgtcgac ggtaccgaaatgtcgttattcg-3’(SEQ ID NO：64)。

順向引子設計有限制酶Eco RI剪切的位置(如底線標記處)，反向引子設計有限制酶Sal I剪切的位置(如底線標記處)。以質體pMCS5-dld為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含dld 基因之5’端區域及其3’端區域的DNA片段(約3.3kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Eco RI及Sal I剪切純化的DNA片段。另外，以質體pLoxGm-PR為模板，並利用此SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35的引子對其進行PCR，增幅出一DNA片段(約0.73kb)，其依序有LoxP位、抗抗生素基因、及LoxP位。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Eco RI及Sal I剪切純化的DNA片段。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一質體 pMCS-dldGm，此依序含有dld 基因的5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及dld 基因的3’端區域。

以質體pMCS-dldGm為模板，並利用SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：62的引子對其進行PCR，增幅出一線性DNA片段(約3.3kb)，其依序含有dld 基因的5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及dld 基因的3’端區域，再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的線性DNA片段。利用上述「化學轉形法」轉形協助質體pKD46至菌株BLA-13-G7內，得到一轉形菌株BLA-13-G7/pKD46。依上述「電穿孔法」，將純化的線性DNA片段送至轉形菌株BLA-13-G7/pKD46。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入1mM阿拉伯糖誘發質體pKD46表現λ-Red蛋白質，協助線性DNA片段與菌株的染色體同源重組。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於含健他黴素的固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體依序含有dld 基因的5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、及dld 基因的3’端區域。

利用上述「化學轉形法」轉形質體pTH19Cre-As至挑選的菌落內。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入0.3mM阿拉伯糖誘發質體pTH19Cre-As表現Cre蛋白質，協助菌株之染色體的二LoxP位重組而移除抗抗生素基因。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體缺乏dld 基因但未含抗抗生素基因，並培育成菌株，命名為BLA-13-G8。

IX、插入乳酸菌Lactobacillus helveticus 的D-ldh 基因

依美國國家生物科技資訊中心基因體資料庫設計以下引子：順向引子：5’-ctggacatatg acaaaggtttttgcttacg-3’(SEQ ID NO：65)；反向引子：5’-ttggggcccaggcct ttaaaacttgttcttgttcaaag-3’(SEQ ID NO：66)。

順向引子設計有限制酶Nde I剪切的位置(如底線標記處)，反向引子設計有限制酶Stu I剪切的位置(如底線標記處)。以乳酸菌Lactobacillus helveticus CCRC 12936(食品工業發展研究所)的染色體為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含D-ldh 基因的DNA片段(約1.0kb)。利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的DNA片段後，使用限制酶Nde I及Stu I剪切純化的DNA片段。另外，利用Plasmid Extraction Mini Kit純化質體pLoxKm-PR後，使用限制酶Nde I及Stu I剪切純化的質體。接著，利用T4 DNA黏接酶接合剪切的質體與DNA片段後，依上文「化學轉形法」將接合產物送至大腸桿菌DH5α內，而得到一質體pLoxKm-D-ldh，其依序含有LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位及D-ldh 基因。

依質體pLoxKm-D-ldh設計以下引子：順向引子：5’-atcacttcccgttccagagcgtcaaggctgatatcgttaaaacttgttcttgttcaaagc-3’(SEQ ID NO：67)；反向引子：5’-ggaaacgatggcggcaaactgcacagatgcccagcgtcggatcctataccgttcgtatag-3’(SEQ ID NO：68)。

以質體pLoxKm-D-ldh為模板，並利用此二引子對其進行 PCR，增幅出一含LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位及D-ldh 基因的DNA片段(約2.2kb)。

依DNA片段設計以下引子：順向引子：5’-gcgtgacgccgccgccggacgtgcgaaagaaaatgtcatctttcatcacttcccgttccag-3’(SEQ ID NO：69)；反向引子：5’-aagcctcgcagaaacacattttgcgttacgccgaactggcggaacgatggcggcaaact-3’(SEQ ID NO：70)。

以DNA片段為模板，並利用此二引子對其進行PCR，增幅出一含pflCD 基因操縱組之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、D-ldh 基因、及pflCD 基因操縱組之3’端區域的DNA片段(約2.28kb)。再利用Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit純化增幅的線性DNA片段。利用上述「化學轉形法」轉形協助質體pKD46至菌株BLA-13-G8內，得到一轉形菌株BLA-13-G8/pKD46。依上述「電穿孔法」，將純化的線性DNA片段送至轉形菌株BLA-13-G8/pKD46。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入1mM阿拉伯糖誘發質體pKD46表現λ-Red蛋白質，協助線性DNA片段與菌株的染色體同源重組。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於含卡納黴素的固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體依序含有pflCD 基因操縱組之5’端區域、LoxP位、抗抗生素基因、LoxP位、D-ldh 基因、及pflCD 基因操縱組之3’端區域。

利用上述「化學轉形法」轉形質體pTH19Cre-As至挑選的菌落內。培養轉形菌株於SOC培養基內，並加入0.3mM阿拉伯糖誘發質體 pTH19Cre-As表現Cre蛋白質，協助菌株之染色體的二LoxP位重組而移除抗抗生素基因。於30℃下培養菌株2小時後，將培養溫度提升至42℃持續培養2小時，再離心並移除上清液。殘存的菌體塗抹於固態LB培養基。使用上述「原位聚合酶連鎖反應」挑選出一菌落，其染色體鑲嵌D-ldh 基因但未含抗抗生素基因，並培育成菌株，命名為BLA-13-G9。

《實施例5》

本實施例主要為檢測菌株BLA-13-G9的D型乳酸發酵能力。首先，從固態培養基中分別選取菌株BLA-13-G9的單一菌落，培養於5mL的液態LB培養基，並於37℃下，以200rpm震盪培養至隔夜。將菌液接種至50mL的NBS培養基(含5%的粗甘油)，並於37℃下，以200rpm震盪培養10小時。再將菌液接種至500mL的NBS培養基(含5%的粗甘油)，並於37℃下，以200rpm震盪培養10小時。又將菌液接種至含1L之NBS培養基(含5.5%(約67.58g/L)的粗甘油)的發酵槽，其菌體起始濃度OD₅₅₀ =1.33，並於30℃、溶氧度50%、利用10N氫氧化鈉控制的pH7.0下，進行發酵。於發酵8小時後，將溶氧度控制於3%，並隨發酵時間，取樣分析。

如第8圖所示，為利用分光光度計測量發酵液之菌體濃度結果、以及利用上文「高效率液相層析」測量菌液之甘油與D型乳酸濃度的結果。且根據此圖，菌株BLA-13-G9於發酵60小時後，可消耗60.83g/L的粗甘油，並產生54.79g/的D型乳酸，而可推估其D型乳酸的重量轉化率約為90%。

惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例，但不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效改變與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

食品工業發展研究所，11月28日，BCRC 910601

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

無

<110> 逢甲大學

<120> 可提升甘油代謝的菌株及其應用

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Claims (7)

1. 一種可抵抗粗甘油的菌株，係寄存於食品工業發展研究所(FIRDI)，寄存編號為BCRC 910601，該可抵抗粗甘油的菌株屬於大腸桿菌，且利用一含以下步驟之方法製得的：培養一可提升甘油代謝的菌株於一第一培養液內；以及培養該可提升甘油代謝的菌株於一第二培養液內，該第二培養液的粗甘油濃度高於該第一培養液的粗甘油濃度；其中，該可提升甘油代謝的菌株，屬於大腸桿菌，且包含：一λ噬菌體P_R 啟動子，係鑲嵌於該可提升甘油代謝之菌株的染色體上，以調控該染色體上之glpK 基因、glpD 基因、gldA 基因、及dhaKLM 基因操縱組的表現；以及一Trc啟動子，係鑲嵌於該可提升甘油代謝之菌株的染色體上，以調控該染色體上之glpF 基因的表現。
2. 如請求項第1項所述之可抵抗粗甘油的菌株，其中該第一培養液的粗甘油濃度係為30g/L，而該第二培養液的粗甘油濃度係為70g/L。
3. 如請求項第2項所述之可抵抗粗甘油的菌株，其中該第一階段培養步驟的時間係為24小時，且該第二階段培養步驟的時間係為70小時。
4. 如請求項第2項所述之可抵抗粗甘油的菌株，其中該第一培養液及該第二培養液均包含一NBS培養基。
5. 如請求項第4項所述之可抵抗粗甘油的菌株，其中該NBS培養基的配方為：體積莫耳濃度為25.7mM的磷酸二氫鈉(NaH₂ PO₄ )、體積莫耳濃度為28.7mM的磷酸氫二鉀(K₂ HPO₄ )、體積莫耳濃度為26.5mM的磷酸氫 二銨((NH₄ )₂ HPO₄ )、體積莫耳濃度為1mM的硫酸鎂(MgSO₄ )、體積莫耳濃度為0.1mM的氯化鈣(CaCl₂ )、體積莫耳濃度為0.015mM的硫胺鹽酸(thiamine hydrochloric acid)、體積莫耳濃度為1mM的甜菜鹼(betaine)、體積莫耳濃度為5.9μM的氯化鐵(FeCl₃ )、體積莫耳濃度為0.8μM的氯化鈷(CoCl₂ )、體積莫耳濃度為0.6μM的氯化銅(CuCl₂ )、體積莫耳濃度為1.5μM的硫酸鋅(ZnSO₄ )、體積莫耳濃度為0.8μM的鉬酸鈉(Na₂ MoO₄ )、及體積莫耳濃度為0.8μM的硼酸(H₃ BO₃ )。
6. 一種可生產D型乳酸的菌株，係屬於大腸桿菌，且為剔除一如請求項第1項所述之可抵抗粗甘油的菌株染色體上的pta 基因、adhE 基因、frdA 基因、mgsA 基因、pflB 基因、tdcDE 基因操縱組、pflEF 基因操縱組、及dld 基因、並插入乳酸菌D-ldh 基因至該如請求項第1項所述之可抵抗粗甘油的菌株染色體而製得的。
7. 如請求項第6項所述之可生產D型乳酸的菌株，其中該乳酸菌為Lactobacillus helveticus 。