CN110527692B - 产l-鼠李糖的工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

产l-鼠李糖的工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了产L‑鼠李糖的工程菌及其构建方法与应用。本发明通过在大肠杆菌中过表达与L‑鼠李糖合成相关基因，增强L‑鼠李糖的合成通路，同时通过旁路途径的阻断，增加了前体L‑乳醛的积累量，开发了一套高效全细胞催化合成游离L‑鼠李糖的方法，首次实现在大肠杆菌中以葡萄糖为单一底物合成L‑鼠李糖。通过这种方式可以以廉价葡萄糖为原料，用大肠杆菌全细胞催化高效合成L‑鼠李糖，不仅合成的鼠李糖为游离态，避免了复杂的水解步骤，可直接用于分离纯化，而且得到的产物中也不含有其他单糖或蛋白质，减轻了后续分离纯化的负担。

Description

产L-鼠李糖的工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种以葡萄糖为单一底物产L-鼠李糖的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
L-鼠李糖是一种甲基戊糖，是L-甘露糖的衍生物，也称6-脱氧-L-甘露糖。在自然界中广泛存在于植物的多糖、糖苷、植物胶和细菌多糖中，其甜度为蔗糖的33％。鼠李糖在工业生产和科学研究中有广泛应用。例如，可以用于测定肠道的渗透性，作为有机物合成的中间体合成香料Furaneol，合成强心药物等。也可以直接用作食品添加剂添加于高档咖啡、饮料、肉类食品中。随着研究开发工作的不断深入，鼠李糖的应用范围将不断扩大。
目前国内外生产鼠李糖的方式主要如下：第一，从天然植物中提取。栎皮酮(橡树)、柚苷(柑橘皮)、维生素P(枥属树皮)等天然物质分子中含有鼠李糖基，可通过水解得到鼠李糖。这一类方法虽然工艺流程清晰，得率较高，但步骤复杂，萃取过程中有毒副产物多，且原材料有限，生产成本高。第二，利用微生物或藻类生产含鼠李糖基的多糖，再水解多糖获得鼠李糖。但是多糖粘性大，影响搅拌，发酵工艺难控制。多糖中鼠李糖含量偏低，水解液中含有多种单糖及杂蛋白，分离提取困难。第三，以微生物发酵生产鼠李糖脂，水解鼠李糖脂得到鼠李糖。绿脓假单胞杆菌、恶臭假单胞杆菌、克雷伯氏菌和乳酸杆菌都可以利用植物油作为碳源生产鼠李糖脂，经水解后获得鼠李糖。这种方法不能水解所有类型的鼠李糖脂，影响了鼠李糖产量。此外，这种方法对酶的要求很高，需要稳定性好、耐鼠李糖脂、适合发酵生产鼠李糖脂的条件、水解特异糖脂键等。综合上述，这三种方法都存在一定的问题，影响了鼠李糖的产率和产量。虽然鼠李糖具有极其重要的经济价值，但目前提取鼠李糖的工艺复杂，副产物多，成本高，产量低，仍没有找到合适的方式大规模工业化生产鼠李糖。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何大规模工业化生产L-鼠李糖。
为了解决上述技术问题，本发明提供了以葡萄糖为单一底物生产L-鼠李糖的方法。
第一方面，本发明要求保护一种产L-鼠李糖的基因工程菌的构建方法。
本发明提供的产L-鼠李糖的基因工程菌的构建方法包括如下步骤：提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶和/或果糖-1-磷酸酶和/或L-鼠李糖异构酶和/或甲基乙二醛合酶和/或甘油脱氢酶的含量和/或活性，和/或降低所述大肠杆菌中醛脱氢酶A和/或L-1,2-丙二醇氧化还原酶和/或NADPH依赖的醛还原酶和/或磷酸丙糖异构酶的含量和/或活性。
上述方法中，
所述鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的氨基酸序列的genebank号为NP_418338(提交日为08-AUG-2016)；
所述果糖-1-磷酸酶的氨基酸序列的genebank号为NP_417175(提交日为08-AUG-2016)；
所述L-鼠李糖异构酶的氨基酸序列的genebank号为YP_026276(提交日为08-AUG-2016)；
所述甲基乙二醛合酶的氨基酸序列的genebank号为NP_415483(提交日为08-AUG-2016)；
所述甘油脱氢酶的氨基酸序列的genebank号为NP_418380(提交日08-AUG-2016)；
所述醛脱氢酶A的氨基酸序列的genebank号为NP_415933(提交日为08-AUG-2016)；
所述L-1,2-丙二醇氧化还原酶的氨基酸序列的genebank号为NP_417279(提交日为08-AUG-2016)；
所述NADPH依赖的醛还原酶的氨基酸序列的genebank号为NP_417484(提交日为08-AUG-2016)；
所述磷酸丙糖异构酶的氨基酸序列的genebank号为NP_418354(提交日为08-AUG-2016)。
进一步的，所述提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶和/或果糖-1-磷酸酶和/或L-鼠李糖异构酶和/或甲基乙二醛合酶和甘油脱氢酶的含量和/或活性的方法是通过将鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的编码基因、果糖-1-磷酸酶的编码基因、L-鼠李糖异构酶的编码基因、甲基乙二醛合酶的编码基因和甘油脱氢酶的编码基因导入大肠杆菌来实现的；
所述降低所述大肠杆菌中醛脱氢酶A和/或L-1,2-丙二醇氧化还原酶和/或NADPH依赖的醛还原酶和/或磷酸丙糖异构酶的含量和/或活性是通过对所述大肠杆菌中醛脱氢酶A的编码基因、L-1,2-丙二醇氧化还原酶的编码基因、NADPH依赖的醛还原酶的编码基因和磷酸丙糖异构酶的编码基因进行敲除或抑制表达来实现的。
所述鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的编码基因为如下A1)或A2)；
A1)序列表的序列1所示的DNA分子；
A2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述果糖-1-磷酸酶的编码基因为如下B1)或B2)；
B1)序列表的序列2所示的DNA分子；
B2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述L-鼠李糖异构酶的编码基因为如下C1)或C2)；
C1)序列表的序列3所示的DNA分子；
C2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述甲基乙二醛合酶的编码基因为如下D1)或D2)；
D1)序列表的序列4所示的DNA分子；
D2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述甘油脱氢酶的编码基因为如下E1)或E2)；
E1)序列表的序列5所示的DNA分子；
E2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述醛脱氢酶A的编码基因为如下F1)或F2)；
F1)序列表的序列6所示的DNA分子；
F2)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
所述L-1,2-丙二醇氧化还原酶的编码基因为如下G1)或G2)；
G1)序列表的序列7所示的DNA分子；
G2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述NADPH依赖的醛还原酶的编码基因为如下H1)或H2)；
H1)序列表的序列8所示的DNA分子；
H2)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述磷酸丙糖异构酶的编码基因为如下I1)或I2)；
I1)序列表的序列9所示的DNA分子；
I2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子。
更进一步的，所述产L-鼠李糖的基因工程菌的构建方法具体为如下1)-7)中任一种：
1)提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1-磷酸酶、L-鼠李糖异构酶、甲基乙二醛合酶和甘油脱氢酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中醛脱氢酶A、L-1,2-丙二醇氧化还原酶、NADPH依赖的醛还原酶和磷酸丙糖异构酶的含量和/或活性；
2)提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1-磷酸酶、L-鼠李糖异构酶和甘油脱氢酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中醛脱氢酶A、L-1,2-丙二醇氧化还原酶、NADPH依赖的醛还原酶和磷酸丙糖异构酶的含量和/或活性；
3)提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1-磷酸酶和L-鼠李糖异构酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中醛脱氢酶A、L-1,2-丙二醇氧化还原酶、NADPH依赖的醛还原酶和磷酸丙糖异构酶的含量和/或活性；
4)提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1-磷酸酶和L-鼠李糖异构酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中醛脱氢酶A、L-1,2-丙二醇氧化还原酶和NADPH依赖的醛还原酶的含量和/或活性；
5)提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1-磷酸酶和L-鼠李糖异构酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中醛脱氢酶A和L-1,2-丙二醇氧化还原酶的含量和/或活性；
6)提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1-磷酸酶和L-鼠李糖异构酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中醛脱氢酶A的含量和/或活性；
7)提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1-磷酸酶和L-鼠李糖异构酶的含量和/或活性。
在本发明中，所述鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的编码基因、所述果糖-1-磷酸酶的编码基因、所述L-鼠李糖异构酶的编码基因、所述甲基乙二醛合酶的编码基因和所述甘油脱氢酶的编码基因均通过重组载体导入所述大肠杆菌中。
具体的，所述1)中，所述鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的编码基因、所述果糖-1-磷酸酶的编码基因和所述L-鼠李糖异构酶的编码基因通过重组载体甲导入所述大肠杆菌中；
所述重组载体甲为将所述鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的编码基因、所述果糖-1-磷酸酶的编码基因和所述L-鼠李糖异构酶的编码基因插入pRB1k载体多克隆位点得到的载体；
所述甲基乙二醛合酶的编码基因和所述甘油脱氢酶的编码基因通过重组载体乙导入所述大肠杆菌中；
所述重组载体乙为将所述甲基乙二醛合酶的编码基因和所述甘油脱氢酶的编码基因插入pBAD载体多克隆位点得到的载体；
所述2)中，所述鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的编码基因、所述果糖-1-磷酸酶的编码基因和所述L-鼠李糖异构酶的编码基因通过所述重组载体甲导入所述大肠杆菌中；
所述甘油脱氢酶的编码基因通过重组载体丙导入所述大肠杆菌中；
所述重组载体丙为将所述甘油脱氢酶的编码基因插入pBAD载体多克隆位点得到的载体；
所述3)-7)中，所述鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的编码基因、所述果糖-1-磷酸酶的编码基因和所述L-鼠李糖异构酶的编码基因通过所述重组载体甲导入所述大肠杆菌中。
在本发明中，利用P1噬菌体转导技术进行基因敲除。
具体的，所述1)-3)中，对所述大肠杆菌中醛脱氢酶A的编码基因、L-1,2-丙二醇氧化还原酶的编码基因、NADPH依赖的醛还原酶的编码基因和磷酸丙糖异构酶的编码基因进行敲除的方法为对所述大肠杆菌进行如下m1)至m4)改造：
m1)将所述大肠杆菌基因组中的醛脱氢酶A的编码基因敲除；
m2)将m1)得到的突变型大肠杆菌基因组中的L-1,2-丙二醇氧化还原酶的编码基因敲除；
m3)将m2)得到的突变型大肠杆菌基因组中的NADPH依赖的醛还原酶的编码基因敲除；
m4)将m3)得到的突变型大肠杆菌基因组中的磷酸丙糖异构酶的编码基因敲除；
所述4)中，对所述大肠杆菌中醛脱氢酶A的编码基因、L-1,2-丙二醇氧化还原酶的编码基因和NADPH依赖的醛还原酶的编码基因进行敲除的方法为对所述大肠杆菌进行上述m1)至m3)改造；
所述5)中，对所述大肠杆菌中醛脱氢酶A的编码基因和L-1,2-丙二醇氧化还原酶的编码基因进行敲除的方法为对所述大肠杆菌进行上述m1)和m2)改造；
所述6)中，对所述大肠杆菌中醛脱氢酶A的编码基因进行敲除的方法为对所述大肠杆菌进行上述m1)改造。
上述方法中，所述大肠杆菌可为大肠杆菌K12；具体为大肠杆菌K12菌株BW25113。
第二方面，本发明要求保护由前文所述的方法构建得到的产L-鼠李糖的基因工程菌。
上述重组载体甲或重组载体乙或重组载体丙也属于本发明的保护范围。
第三方面，本发明要求保护由前文所述的方法构建得到的产L-鼠李糖的基因工程菌或重组载体甲或重组载体乙或重组载体丙在制备L-鼠李糖或与其有相似合成途径的稀有糖中的应用。
上述应用中，制备L-鼠李糖或与其有相似合成途径的稀有糖是以葡萄糖为单一底物或以磷酸二羟基丙酮和L-乳醛为底物。
第四方面，本发明要求保护一种制备L-鼠李糖的方法。
本发明所提供的制备L-鼠李糖的方法为如下(1)或(2)：
(1)包括如下步骤：将按照前文6)或7)所述的方法构建得到的基因工程菌进行培养，得到重组菌；用所述重组菌催化葡萄糖反应，生成L-鼠李糖；
(2)包括如下步骤：将按照前文1)-5)所述的方法构建得到的基因工程菌进行培养，得到重组菌；用所述重组菌催化磷酸二羟基丙酮和L-乳醛反应，生成L-鼠李糖。
进一步的，所述培养为阿拉伯糖诱导培养；所述阿拉伯糖诱导培养是在含有阿拉伯糖且其终浓度为0.2g/100mL的培养基中进行的，所述诱导培养的温度为37℃，所述诱导培养的时间为16h。
进一步的，所述(1)中，催化反应的条件为37℃培养20h；所述(2)中，催化反应的条件为37℃培养4h。
更进一步的，所述阿拉伯糖为L-阿拉伯糖。
本发明通过在大肠杆菌中过表达从葡萄糖合成游离L-鼠李糖途径相关酶基因，同时阻断旁路途径，开发了一套以葡萄糖为单一底物全细胞催化合成游离L-鼠李糖的方法，首次实现在大肠杆菌中以葡萄糖为单一底物合成L-鼠李糖。通过这种方式可以以廉价葡萄糖为原料，用大肠杆菌全细胞催化高效合成L-鼠李糖，不仅合成的鼠李糖为游离态，避免了复杂的水解步骤，可直接用于分离纯化，而且得到的产物中也不含有其他单糖或蛋白质，减轻了后续分离纯化的负担，也为与L-鼠李糖类似稀有糖的生产提供了一条新的思路。
附图说明
图1为pRB1k的物理图谱。
图2为大肠杆菌突变体AODT的PCR验证结果。M：marker；1，3，5，7：K12；2，4，6，8：AODT。
图3为L-鼠李糖标准品的HPLC图谱。
图4为工程菌AODT0357的全细胞催化转化产物的HPLC图谱。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中大肠杆菌K12记载于文献“Baba T,Ara T,Hasegawa M,Takai Y,Okumura Y,Baba M,Datsenko KA,Tomita M,Wanner BL,Mori H:Construction ofEscherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keiocollection.Mol Syst Biol 2006,2:2006.0008.”中，是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短，容易培养且培养基原料低廉。大肠杆菌K12的全基因组序列的GenBankAccession为U00096.3(GI：545778205，update date是AUG01，2014，version是3)。公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的野生型P1噬菌体菌种记载于文献“Thomason LC,Costantino N,Court DL:E.coli genome manipulation by P1transduction.Curr Protoc Mol Biol2007,Chapter 1:Unit 1.17.”中，公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的供体菌：大肠杆菌K12菌株BW25113、BW25113△aldA::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW1412)、BW25113△fucO::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW2770)、BW25113△yqhD::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW2978)和BW25113△tpiA::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW3890)均记载于文献“Baba T,Ara T,Hasegawa M,Takai Y,Okumura Y,Baba M,DatsenkoKA,Tomita M,Wanner BL,Mori H:Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Mol Syst Biol 2006,2:2006.0008.”中，公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中pRB1k载体的核苷酸序列如序列表中序列10所示，包括如下片段：(1)araC-araBAD-MCS片段(含阿拉伯糖诱导启动子、多克隆位点)；(2)MCS-TrrnB片段(含多克隆位点、终止子TrrnB)；(3)RSF1030复制起始位点片段；(4)卡那霉素抗性基因Kan片段。pRB1k载体图谱如图1所示。
下述实施例中pBAD载体购自Invitrogen公司，货号为V43001，包括如下片段：(1)araC-araBAD-MCS片段(含阿拉伯糖诱导启动子、多克隆位点)；(2)MCS-TrrnB片段(含多克隆位点、终止子TrrnB)；(3)pBR322复制起始位点片段；(4)氨苄青霉素抗性基因Amp片段。
实施例1、构建协同表达鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1-磷酸酶和L-鼠李糖异构酶的重组质粒
1、以大肠杆菌K12基因组为模板，采用引物对P1和P2进行PCR扩增，PCR扩增得到果糖-1-磷酸酶的编码基因(yqaB)。PCR条件如下：98℃，2min；98℃，20sec，55℃，20sec，72℃，30sec(30个循环)；72℃，5min。通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小约为570bp，与目的片段大小相符，将yqaB基因片段回收。
2、以大肠杆菌K12基因组为模板，采用引物对P3和P4进行PCR扩增，PCR扩增得到L-鼠李糖异构酶的编码基因(rhaA)。PCR条件如下：98℃，2min；98℃，20sec，55℃，20sec，72℃，45sec(30个循环)；72℃，5min。通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小约为1300bp，与目的片段大小相符，将rhaA基因片段回收。
3、以大肠杆菌K12基因组为模板，采用引物对P5和P6进行PCR扩增，PCR扩增得到鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的编码基因(rhaD)。PCR条件如下：98℃，2min；98℃，20sec，55℃，20sec，72℃，30sec(30个循环)；72℃，5min。通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小约为800bp，与目的片段大小相符，将rhaD基因片段回收。
4、将pRB1k载体用NcoI和PstI双酶切后，回收大小约为3500bp的载体大片段。
5、将步骤1-3回收的yqaB、rhaA和rhaD基因片段与载体大片段用Gibson方法(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,3rd,Smith HO:Enzymaticassembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.Nat Methods 2009,6:343-345.)进行连接，连接产物转化Trans1-T1感受态细胞(北京全式金生物，产品目录号为CD501)，涂布含卡那霉素的LB固体平板。37℃过夜，挑取单克隆提取质粒，采用引物对P7和P8进行PCR验证，正确的克隆送测序。将测序正确的重组质粒命名为重组质粒pRh03。
重组质粒pRh03为将pRB1k载体的NcoI和PstI位点间的片段替换为序列表中序列2所示的果糖-1-磷酸酶基因、序列3所示的L-鼠李糖异构酶基因和序列1所示的鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因后得到的载体。其中，序列2所示的果糖-1-磷酸酶基因(Gene ID：945776，updated on 4-Feb-2018)编码的果糖-1-磷酸酶的氨基酸序列的genebank号为NP_417175(提交日为08-AUG-2016)；序列3所示的L-鼠李糖异构酶基因(Gene ID：948400，updated on3-Apr-2018)编码的L-鼠李糖异构酶的氨基酸序列的genebank号为YP_026276(提交日为08-AUG-2016)；序列1所示的鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因(Gene ID：948401，updated on3-Apr-2018)编码的鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的氨基酸序列的genebank号为NP_418338(提交日为08-AUG-2016)。在重组质粒pRh03中，启动基因转录的启动子为序列10第994-1266位所示的pBAD启动子。
上述引物序列如下：
P1：5’-gctaacaggaggaattaaccatgtacgagcgttatgcagg-3’；
P2：5’-attatatctccttctcgagtcacagcaagcgaacatcca-3’；
P3：5’-gactcgagaaggagatataatgaccactcaactggaaca-3’；
P4：5’-attatatctccttgaattcttacccgcggcgactcaaaat-3’；
P5：5’-aagaattcaaggagatataatgcaaaacattactcagtc-3’；
P6：5’-ggctgccgcgcggcaccagctgcagttacagcgccagcgcactg-3’；
P7：5’-cggcgtcacactttgctatg-3’；
P8：5’-cgtttcacttctgagttcggc-3’。
实施例2、构建协同表达甲基乙二醛合酶和甘油脱氢酶的重组质粒
1、构建重组质粒pFU54
(1)以大肠杆菌K12基因组为模板，采用引物对P9和P10进行PCR扩增，PCR扩增得到甘油脱氢酶的编码基因(gldA)。PCR条件如下：98℃，2min；98℃，20sec，55℃，20sec，72℃，45sec(30个循环)；72℃，5min。通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小约为1100bp，与目的片段大小相符，将gldA基因片段回收。
(2)将pBAD载体用XhoI和EcoRI双酶切后，回收大小约为4000bp的载体大片段。
(4)将步骤(1)回收的gldA基因片段与载体大片段用Gibson方法(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,3rd,Smith HO:Enzymatic assembly ofDNA molecules up to several hundred kilobases.Nat Methods 2009,6:343-345.)进行连接，连接产物转化Trans1-T1感受态细胞(北京全式金生物，产品目录号为CD501)，涂布含氨苄青霉素的LB固体平板。37℃过夜，挑取单克隆提取质粒，采用引物对P7和P8进行PCR验证，正确的克隆送测序。将测序正确的重组质粒命名为重组质粒pFU54。
重组质粒pFU54为将pBAD载体的XhoI和EcoRI位点间的片段替换为序列表中序列5所示的甘油脱氢酶基因后得到的载体。其中，序列5所示的甘油脱氢酶基因(Gene ID：948440，updated on 8-Apr-2018)编码的甘油脱氢酶的氨基酸序列的genebank号为NP_418380(提交日为08-AUG-2016)。在重组质粒pFU54中，启动基因转录的启动子为pBAD启动子。
2、构建重组质粒pFU57
(1)以大肠杆菌K12基因组为模板，采用引物对P11和P12进行PCR扩增，PCR扩增得到甘油脱氢酶的编码基因(gldA)。PCR条件如下：98℃，2min；98℃，20sec，55℃，20sec，72℃，45sec(30个循环)；72℃，5min。通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小约为1100bp，与目的片段大小相符，将gldA基因片段回收。
(2)以大肠杆菌K12基因组为模板，采用引物对P13和P14进行PCR扩增，PCR扩增得到甲基乙二醛合酶的编码基因(mgsA)。PCR条件如下：98℃，2min；98℃，20sec，55℃，20sec，72℃，30sec(30个循环)；72℃，5min。通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小约为500bp，与目的片段大小相符，将mgsA基因片段回收。
(3)将pBAD载体用XhoI和EcoRI双酶切后，回收大小约为4000bp的载体大片段。
(4)将步骤(1)和(2)回收的gldA和mgsA基因片段与载体大片段用Gibson方法(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,3rd,Smith HO:Enzymaticassembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.Nat Methods 2009,6:343-345.)进行连接，连接产物转化Trans1-T1感受态细胞(北京全式金生物，产品目录号为CD501)，涂布含氨苄青霉素的LB固体平板。37℃过夜，挑取单克隆提取质粒，采用引物对P7和P8进行PCR验证，正确的克隆送测序。将测序正确的重组质粒命名为重组质粒pFU57。
重组质粒pFU57为将pBAD载体的XhoI和EcoRI位点间的片段替换为序列表中序列5所示的甘油脱氢酶基因和序列4所示的甲基乙二醛合酶基因后得到的载体。其中，序列5所示的甘油脱氢酶基因(Gene ID：948440，updated on 8-Apr-2018)编码的甘油脱氢酶的氨基酸序列的genebank号为NP_418380(提交日08-AUG-2016)；序列4所示的甲基乙二醛合酶基因(Gene ID：945574，updated on 8-Apr-2018)编码的甲基乙二醛合酶的氨基酸序列的genebank号为NP_415483(提交日为08-AUG-2016)。在重组质粒pFU57中，启动基因转录的启动子为pBAD启动子。
上述引物序列如下：
P9：5’-tgacgataaggatccgagctcgagaggagcaattatggaccgcattattcaat-3’；
P10：5’-gccaaaacagccaagcttcgaattcttattcccactcttgcagga-3’；
P11：5’-tgacgataaggatccgagctcgagaggagcaattatggaccgcattattcaat-3’；
P12：5’-aatgtaccctcctgaattcttattcccactcttgcagga-3’；
P13：5’-gaattcaggagggtacattatggaactgacgactcgcac-3’；
P14：5’-gccaaaacagccaagcttcgaattcttacttcagacggtccgcga-3’。
实施例3、构建产L-鼠李糖的宿主菌AODT
对野生型大肠杆菌K12进行染色体编辑，敲除野生型大肠杆菌K12的醛脱氢酶A基因(aldA)、L-1,2-丙二醇氧化还原酶基因(fucO)、NADPH依赖的醛还原酶基因(yqhD)和磷酸丙糖异构酶基因(tpiA)，得到大肠杆菌突变体AODT。本实施例采用P1噬菌体介导的转染法构建大肠杆菌突变体AODT，具体步骤如下：
(1)获得供体菌的P1：将供体菌BW25113△aldA::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW1412)，BW25113△fucO::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW2770)，BW25113△yqhD::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW2978)和BW25113△tpiA::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW3890)分别接种于含10mM MgCl2、5mM CaCl2和0.1g/100ml葡萄糖的LB培养基中，培养1h，分别加入野生型P1噬菌体，培养1-3h。加几滴氯仿再摇几分钟，离心取上清即得噬菌体P1virΔaldA、P1virΔfucO、P1virΔyqhD和P1virΔtpiA。
(2)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌敲除菌A：将大肠杆菌K12(受体菌)过夜培养，取1.5mL菌体6000rpm离心2分钟后，用0.75mL的P1盐溶液(溶剂为水，溶质为10mMCaCl2和5mM MgSO4)重悬受体菌细胞，将100μl噬菌体P1virΔaldA与100μl大肠杆菌K12细胞悬浮液混合，室温孵育30分钟，添加200μl浓度为1M的柠檬酸钠和1mL LB培养基，37℃继续培养1h，离心收集菌体，用100μl LB培养基重悬后，涂布在含卡那霉素的LB平板(卡那霉素浓度为50μg/mL)上，筛选阳性克隆(能在含卡那霉素的平板上生长的克隆)即BWΔaldA::Kan。
(3)消除卡那霉素抗性：利用FIp重组酶的质粒pCP20(CIontech)化学转化BWΔaldA::Kan，将BWΔaldA::Kan的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除。消除BWΔaldA::Kan的卡那霉素抗性，得到大肠杆菌突变体BWΔaldA(简称A)。
(4)以A为受体菌，BW25113△fucO::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW2770)为供体菌，重复以上步骤，利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌敲除菌BWΔaldAΔfucO(简称AO)。
(5)以AO为受体菌，BW25113△yqhD::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW2978)为供体菌，重复以上步骤，利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌敲除菌BWΔaldAΔfucO△yqhD(简称AOD)。
(6)以AOD为受体菌，BW25113△tpiA::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW3890)为供体菌，重复以上步骤，利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌敲除菌BWΔaldAΔfucO△yqhD△tpiA(简称AODT)。
(7)以AODT的基因组DNA为模板，分别用引物对aldA-up100-F和aldA-down100-R，fucO-up100-F和fucO-down100-R，yqhD-up100-F和yqhD-down100-R，tpiA-up100-F和tpiA-down100-R进行PCR扩增，分别扩增得到大小约300bp、400bp、400bp和300bp的片段。以大肠杆菌K12的基因组DNA为模板，分别用引物对aldA-up100-F和aldA-down100-R，fucO-up100-F和fucO-down100-R，yqhD-up100-F和yqhD-down100-R，tpiA-up100-F和tpiA-down100-R进行PCR扩增，分别扩增得到大小约1600bp、1500bp、1500bp和1000bp的片段(图3)。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的aldA、fucO、yqhD和tpiA基因的上游和下游区域。引物序列如下：aldA-up100-F：5’-cgaatatggcttcgtcacac-3’，aldA-down100-R：5’-agcccttcacagaattgtcc-3’，fucO-up100-F：5’-cagtgctgagcgatgaagag-3’，fucO-down100-R：5’-ccgatttgcatatcgacggc-3’，yqhD-up100-F：5’-gcatttctccagcactctgg-3’，yqhD-down100-R：5’-ggcatgacattgccatcctg-3’，tpiA-up100-F：5’-aaagcaaagcctttgtgccg-3’，tpiA-down100-R：5’-tctactgacgcttaaccgtg-3’。
结果表明：大肠杆菌突变体AODT是将大肠杆菌K12的序列6所示的醛脱氢酶A基因(aldA)、序列7所示的L-1,2-丙二醇氧化还原酶基因(fucO)、序列8所示的NADPH依赖的醛还原酶基因(yqhD)和序列9所示的磷酸丙糖异构酶基因(tpiA)敲除后的突变体(简称AODT)。AODT的基因型为BW25113△aldA△fucO△yqhD△tpiA。
其中，序列6所示的醛脱氢酶A基因(aldA)(Gene ID：945672，updated on 8-Apr-2018)编码的醛脱氢酶A的氨基酸序列的genebank号为NP_415933(提交日为08-AUG-2016)；序列7所示的L-1,2-丙二醇氧化还原酶基因(fucO)(Gene ID：947273，updated on 4-Feb-2018)编码的L-1,2-丙二醇氧化还原酶的氨基酸序列的genebank号为NP_417279(提交日为08-AUG-2016)；序列8所示的NADPH依赖的醛还原酶基因(yqhD)(Gene ID：947493，updatedon 4-Feb-2018)编码的NADPH依赖的醛还原酶的氨基酸序列的genebank号为NP_417484(提交日为08-AUG-2016)；序列9所示的磷酸丙糖异构酶基因(tpiA)(Gene ID：948409，updatedon 3-Apr-2018)编码的磷酸丙糖异构酶的氨基酸序列的genebank号为NP_418354(提交日为08-AUG-2016)。
实施例4、构建产L-鼠李糖的基因工程菌
1、L-鼠李糖合成途径的构建
本发明所用出发菌株为大肠杆菌K12菌株BW25113，其基因型为lacIqrrnBT14ΔlacZWJ16hsdR514ΔaraBADAH33ΔrhaBADLD78，不存在鼠李糖合成途径，不能够合成鼠李糖。
将实施例1制备的pRh03质粒利用氯化钙法转化大肠杆菌K12菌株BW25113，在其中构建了一条L-鼠李糖的合成途径，在卡那霉素(卡那霉素的浓度为50μg/ml)抗性的LB平板上筛选阳性克隆子(能在平板上生长的克隆)，并将其命名为BW03。以直接底物磷酸二羟基丙酮和L-乳醛全细胞催化能够合成约150mg/L的L-鼠李糖。
2、旁路途径的阻断
将实施例1制备的pRh03质粒利用氯化钙法分别转化实施例3构建的大肠杆菌宿主A、AO、AOD和AODT，在卡那霉素(卡那霉素的浓度为50μg/ml)抗性的LB平板上筛选阳性克隆子(能在平板上生长的克隆)，并将其分别命名为A03、AO03、AOD03和AODT03。以直接底物磷酸二羟基丙酮和L-乳醛全细胞催化合成L-鼠李糖，结果显示，各个敲除靶点均能够一定程度提高L-鼠李糖的产量，AODT03产物水平最高，达463.8mg/L。
3、构建以葡萄糖为单一底物合成L-鼠李糖的基因工程菌
直接底物磷酸二羟基丙酮和L-乳醛均不稳定且价格昂贵，当以葡萄糖替代步骤2中的磷酸二羟基丙酮，用葡萄糖和L-乳醛为底物时，基因工程菌AODT03可以合成约800mg/L的L-鼠李糖。但是以葡萄糖为单一底物时，基因工程菌AODT03只有微量(小于100mg/L)的L-鼠李糖合成。
将实施例2制备的pFU54质粒和实施例1制备的pRh03质粒用氯化钙法共转化大肠杆菌宿主AODT，在卡那霉素(卡那霉素的浓度为50μg/ml)和氨苄青霉素(氨苄青霉素的浓度为100μg/ml)双抗性的LB平板上筛选阳性克隆子(能在该双抗性平板上生长的克隆)，并将其命名为AODT0354。
将实施例2制备的pFU57质粒和实施例1制备的pRh03质粒用氯化钙法共转化大肠杆菌宿主AODT，在卡那霉素(卡那霉素的浓度为50μg/ml)和氨苄青霉素(氨苄青霉素的浓度为100μg/ml)双抗性的LB平板上筛选阳性克隆子(能在该双抗性平板上生长的克隆)，并将其命名为AODT0357。
基因工程菌AODT0354以葡萄糖为单一底物进行全细胞催化可以合成约400mg/L的L-鼠李糖，基因工程菌AODT0357以葡萄糖为单一底物进行全细胞催化可以合成约600mg/L的L-鼠李糖。
各基因工程菌的信息如表1所示。
表1、各基因工程菌的信息
重组质粒 宿主菌 重组菌
pRh03质粒 大肠杆菌K12菌株BW25113 BW03
pRh03质粒 大肠杆菌突变体A A03
pRh03质粒 大肠杆菌突变体AO AO03
pRh03质粒 大肠杆菌突变体AOD AOD03
pRh03质粒 大肠杆菌突变体AODT AODT03
pRh03质粒、pFU54质粒 大肠杆菌突变体AODT AODT0354
pRh03质粒、pFU57质粒 大肠杆菌突变体AODT AODT0357
实施例5、利用产L-鼠李糖的基因工程菌以葡萄糖为单一底物合成L-鼠李糖
一、工程菌的自诱导培养
以BW03、A03、AO03、AOD03、AODT03、AODT0354和AODT0357这7株菌中的任一菌株单独为工程菌，均同时进行如下实验：将产L-鼠李糖的基因工程菌划线到含有质量百分比浓度为1.5g/100ml的琼脂、50μg/mL的卡那霉素(AODT0354和AODT0357还需要添加100μg/mL的氨苄青霉素)的LB平板上，37℃培养12h。挑取平板上所长的单克隆，接种到含有50μg/mL的卡那霉素(AODT0354和AODT0357还需要添加100μg/mL的氨苄青霉素)的液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，转速为220rpm；将过夜培养物以体积百分比为1％的接种量接种至含50μg/mL的卡那霉素的自诱导培养基ZYM-5052(AODT0354和AODT0357还需要添加100μg/mL的氨苄青霉素)中，37℃振荡培养，转速220rpm，培养时间为16h。
自诱导培养基ZYM-5052配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E(以下均为质量百分比浓度，即％表示g/100ml)；
A.ZY：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；
B.50×M：1.25M Na2HPO4，1.25M KH2PO4，2.5M NH4Cl和0.25M Na2SO4；
C.50×5052：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％L-阿拉伯糖；
D.500×MgSO4：1M MgSO4
E.1000×微量元素：50mM FeCl3，20mM CaCl2，10mM MnCl2，10mM ZnSO4，CoCl2、NiCl2、Na2MoO4、Na2SeO3和H3BO3各2mM。
二、全细胞催化以葡萄糖为单一底物产L-鼠李糖
将步骤一工程菌诱导后的细胞，根据菌液的生长情况，取一定量菌体，于4℃，4000rpm离心10min后，用1mL生理盐水(0.85％氯化钠水溶液)洗涤一次，弃上清后，再次重悬于1mL转化底物液(BW03、A03、AO03、AOD03和AODT03均使用底物转化液1；AODT0354和AODT0357均使用底物转化液2)中，使其最终OD600nm值为30。将重悬后的菌液置于1.5mL的eppendorf管中，于37℃，150rpm的摇床中振荡培养，BW03、A03、AO03、AOD03和AODT03培养4h，AODT0354和AODT0357培养20h，将转化反应液于12000rpm离心5min，取上清，得到转化液。
转化底物液1：1×M9salts(12.8g/L Na2HPO4·7H2O，3g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，1g/L NH4Cl)，5mM磷酸二羟基丙酮，6mM L-乳醛，用0.22μm滤膜(MilLipore公司)过滤除菌。
转化底物液2：1×M9salts(12.8g/L Na2HPO4·7H2O，3g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，1g/L NH4Cl)，10g/L葡萄糖，用0.22μm滤膜(MilLipore公司)过滤除菌。
将转化液用蒸馏水稀释2倍，先用0.22μm滤膜过滤后，再用HPLC检测L-鼠李糖产量。HPLC采用Agilent 1200高效液相色谱仪(配四元泵、RID检测器和工作站)。色谱条件：Bio-Rad Aminex HPX-87H Column，300×7.8mm，9μm；流动相：5mM H2SO4，流速：0.5mL min-1，柱温：40摄氏度；进样量：10μL，示差折光检测器检测。以L-鼠李糖标准品(Sigma公司)保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析。实验设置三次重复，结果取平均值。
L-鼠李糖标准品的HPLC图谱如图3所示，从图中可见，L-鼠李糖标准品的保留时间为11.7min。转化物产物的HPLC图谱如图4所示，从图中可见，保留时间为11.7min处为L-鼠李糖，10.4min处为葡萄糖。经计算可知，BW03转化4h后，可产生153.1mg/L的L-鼠李糖；A03转化4h后，可产生215.6mg/L的L-鼠李糖；AO03转化4h后，可产生261.4mg/L的L-鼠李糖；AOD03转化4h后，可产生339.2mg/L的L-鼠李糖；AODT03转化4h后，可产生463.8mg/L的L-鼠李糖；AODT0354转化20h后，可产生403.7mg/L的L-鼠李糖；AODT0357转化20h后，可产生605.9mg/L的L-鼠李糖。
序列表
<110>中国科学院微生物研究所
<120>产L-鼠李糖的工程菌及其构建方法与应用
<160>10
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>825
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
atgcaaaaca ttactcagtc ctggtttgtc cagggaatga tcaaagccac caccgacgcc 60
tggctgaaag gctgggatga gcgcaacggc ggcaacctga cgctacgcct ggatgacgcc 120
gatatcgcac catatcacga caatttccac caacaaccgc gctatatccc gctcagccag 180
cccatgcctt tactggcaaa tacaccgttt attgtcaccg gctcgggcaa attcttccgt 240
aacgtccagc ttgatcctgc ggctaactta ggcatcgtaa aagtcgacag cgacggcgcg 300
ggctaccaca ttctttgggg gttaaccaac gaagccgtcc ccacttccga acttccggct 360
cacttccttt cccactgcga gcgcattaaa gccaccaacg gcaaagatcg ggtgatcatg 420
cactgccacg ccaccaacct gatcgccctc acctatgtac ttgaaaacga caccgcggtc 480
ttcactcgcc aactgtggga aggcagcacc gagtgtctgg tggtattccc ggatggcgtt 540
ggcattttgc cgtggatggt gcccggcacg gacgaaatcg gccaggcgac cgcacaagag 600
atgcaaaaac attcgctggt gttgtggccc ttccacggcg tcttcggcag cggaccgacg 660
ctggatgaaa ccttcggttt aatcgacacc gcagaaaaat cagcacaagt attagtgaag 720
gtttattcga tgggcggcat gaaacagacc atcagccgtg aagagttgat agcgctcggc 780
aagcgtttcg gcgttacgcc actcgccagt gcgctggcgc tgtaa 825
<210>2
<211>567
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
atgtacgagc gttatgcagg tttaattttt gatatggatg gcacaatcct ggatacggag 60
cctacgcacc gtaaagcgtg gcgcgaagta ttagggcact acggtcttca gtacgatatt 120
caggcgatga ttgcgcttaa tggatcgccc acctggcgta ttgctcaggc aattattgag 180
ctgaatcagg ccgatctcga cccgcatgcg ttagcgcgtg aaaaaacaga agcagtaaga 240
agtatgctgc tggatagcgt cgaaccgctt cctcttgttg atgtggtgaa aagttggcat 300
ggtcgtcgcc caatggctgt aggaacgggg agtgaaagcg ccatcgctga ggcattgctg 360
gcgcacctgg gattacgcca ttattttgac gccgtcgtcg ctgccgatca cgtcaaacac 420
cataaacccg cgccagacac atttttgttg tgcgcgcagc gtatgggcgt gcaaccgacg 480
cagtgtgtgg tctttgaaga tgccgatttc ggtattcagg cggcccgtgc agcaggcatg 540
gacgccgtgg atgttcgctt gctgtga 567
<210>3
<211>1260
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
atgaccactc aactggaaca ggcctgggag ctagcgaaac agcgtttcgc ggcggtgggg 60
attgatgtcg aggaggcgct gcgccaactt gatcgtttac ccgtttcaat gcactgctgg 120
cagggcgatg atgtttccgg ttttgaaaac ccggaaggtt cgctgaccgg ggggattcag 180
gccacaggca attatccggg caaagcgcgt aatgccagtg agctacgtgc cgatctggaa 240
caggctatgc ggctgattcc ggggccgaaa cggcttaatt tacatgccat ctatctggaa 300
tcagatacgc cagtctcgcg cgaccagatc aaaccagagc acttcaaaaa ctgggttgaa 360
tgggcgaaag ccaatcagct cggtctggat tttaacccct cctgcttttc gcatccgcta 420
agcgccgatg gctttacgct ttcccatgcc gacgacagca ttcgccagtt ctggattgat 480
cactgcaaag ccagccgtcg cgtttcggcc tattttggcg agcaactcgg cacaccatcg 540
gtgatgaaca tctggatccc ggatggtatg aaagatatca ccgttgaccg tctcgccccg 600
cgtcagcgtc tgctggcagc actggatgag gtgatcagcg agaagctaaa ccctgcgcac 660
catatcgacg ccgttgagag caaattgttt ggcattggcg cagagagcta cacggttggc 720
tccaatgagt tttacatggg gtatgccacc agccgccaga ctgcgctgtg cctggacgcc 780
gggcacttcc acccgactga agtgatttcc gacaagattt ccgccgccat gctgtatgtg 840
ccgcagttgc tgctgcacgt cagccgtccg gttcgctggg acagcgatca cgtagtgctg 900
ctggatgatg aaacccaggc aattgccagt gagattgtgc gtcacgatct gtttgaccgg 960
gtgcatatcg gccttgactt cttcgatgcc tctatcaacc gcattgccgc gtgggtcatt 1020
ggtacacgca atatgaaaaa agccctgctg cgtgcgttgc tggaacctac cgctgagctg 1080
cgcaagctgg aagcggcggg cgattacact gcgcgtctgg cactgctgga agagcagaaa 1140
tcgttgccgt ggcaggcggt ctgggaaatg tattgccaac gtcacgatac gccagcaggt 1200
agcgaatggc tggagagcgt gcgggcttat gagaaagaaa ttttgagtcg ccgcgggtaa 1260
<210>4
<211>459
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
atggaactga cgactcgcac tttacctgcg cggaaacata ttgcgctggt ggcacacgat 60
cactgcaaac aaatgctgat gagctgggtg gaacggcatc aaccgttact ggaacaacac 120
gtactgtatg caacaggcac taccggtaac ttaatttccc gcgcgaccgg catgaacgtc 180
aacgcgatgt tgagtggccc aatggggggt gaccagcagg ttggcgcatt gatctcagaa 240
gggaaaattg atgtattgat tttcttctgg gatccactaa atgccgtgcc gcacgatcct 300
gacgtgaaag ccttgctgcg tctggcgacg gtatggaaca ttccggtcgc caccaacgtg 360
gcaacggcag acttcataat ccagtcgccg catttcaacg acgcggtcga tattctgatc 420
cccgattatc agcgttatct cgcggaccgt ctgaagtaa 459
<210>5
<211>1104
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>5
atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt 60
ctgggcgaat acctgaagcc gctggcagaa cgctggttag tggtgggtga caaatttgtt 120
ttaggttttg ctcaatccac tgtcgagaaa agctttaaag atgctggact ggtagtagaa 180
attgcgccgt ttggcggtga atgttcgcaa aatgagatcg accgtctgcg tggcatcgcg 240
gagactgcgc agtgtggcgc aattctcggt atcggtggcg gaaaaaccct cgatactgcc 300
aaagcactgg cacatttcat gggtgttccg gtagcgatcg caccgactat cgcctctacc 360
gatgcaccgt gcagcgcatt gtctgttatc tacaccgatg agggtgagtt tgaccgctat 420
ctgctgttgc caaataaccc gaatatggtc attgtcgaca ccaaaatcgt cgctggcgca 480
cctgcacgtc tgttagcggc gggtatcggc gatgcgctgg caacctggtt tgaagcgcgt 540
gcctgctctc gtagcggcgc gaccaccatg gcgggcggca agtgcaccca ggctgcgctg 600
gcactggctg aactgtgcta caacaccctg ctggaagaag gcgaaaaagc gatgcttgct 660
gccgaacagc atgtagtgac tccggcgctg gagcgcgtga ttgaagcgaa cacctatttg 720
agcggtgttg gttttgaaag tggtggtctg gctgcggcgc acgcagtgca taacggcctg 780
accgctatcc cggacgcgca tcactattat cacggtgaaa aagtggcatt cggtacgctg 840
acgcagctgg ttctggaaaa tgcgccggtg gaggaaatcg aaaccgtagc tgcccttagc 900
catgcggtag gtttgccaat aactctcgct caactggata ttaaagaaga tgtcccggcg 960
aaaatgcgaa ttgtggcaga agcggcatgt gcagaaggtg aaaccattca caacatgcct 1020
ggcggcgcga cgccagatca ggtttacgcc gctctgctgg tagccgacca gtacggtcag 1080
cgtttcctgc aagagtggga ataa 1104
<210>6
<211>1440
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>6
atgtcagtac ccgttcaaca tcctatgtat atcgatggac agtttgttac ctggcgtgga 60
gacgcatgga ttgatgtggt aaaccctgct acagaggctg tcatttcccg catacccgat 120
ggtcaggccg aggatgcccg taaggcaatc gatgcagcag aacgtgcaca accagaatgg 180
gaagcgttgc ctgctattga acgcgccagt tggttgcgca aaatctccgc cgggatccgc 240
gaacgcgcca gtgaaatcag tgcgctgatt gttgaagaag ggggcaagat ccagcagctg 300
gctgaagtcg aagtggcttt tactgccgac tatatcgatt acatggcgga gtgggcacgg 360
cgttacgagg gcgagattat tcaaagcgat cgtccaggag aaaatattct tttgtttaaa 420
cgtgcgcttg gtgtgactac cggcattctg ccgtggaact tcccgttctt cctcattgcc 480
cgcaaaatgg ctcccgctct tttgaccggt aataccatcg tcattaaacc tagtgaattt 540
acgccaaaca atgcgattgc attcgccaaa atcgtcgatg aaataggcct tccgcgcggc 600
gtgtttaacc ttgtactggg gcgtggtgaa accgttgggc aagaactggc gggtaaccca 660
aaggtcgcaa tggtcagtat gacaggcagc gtctctgcag gtgagaagat catggcgact 720
gcggcgaaaa acatcaccaa agtgtgtctg gaattggggg gtaaagcacc agctatcgta 780
atggacgatg ccgatcttga actggcagtc aaagccatcg ttgattcacg cgtcattaat 840
agtgggcaag tgtgtaactg tgcagaacgt gtttatgtac agaaaggcat ttatgatcag 900
ttcgtcaatc ggctgggtga agcgatgcag gcggttcaat ttggtaaccc cgctgaacgc 960
aacgacattg cgatggggcc gttgattaac gccgcggcgc tggaaagggt cgagcaaaaa 1020
gtggcgcgcg cagtagaaga aggggcgaga gtggcgttcg gtggcaaagc ggtagagggg 1080
aaaggatatt attatccgcc gacattgctg ctggatgttc gccaggaaat gtcgattatg 1140
catgaggaaa cctttggccc ggtgctgcca gttgtcgcat ttgacacgct ggaagatgct 1200
atctcaatgg ctaatgacag tgattacggc ctgacctcat caatctatac ccaaaatctg 1260
aacgtcgcga tgaaagccat taaagggctg aagtttggtg aaacttacat caaccgtgaa 1320
aacttcgaag ctatgcaagg cttccacgcc ggatggcgta aatccggtat tggcggcgca 1380
gatggtaaac atggcttgca tgaatatctg cagacccagg tggtttattt acagtcttaa 1440
<210>7
<211>1149
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>7
atggctaaca gaatgattct gaacgaaacg gcatggtttg gtcggggtgc tgttggggct 60
ttaaccgatg aggtgaaacg ccgtggttat cagaaggcgc tgatcgtcac cgataaaacg 120
ctggtgcaat gcggcgtggt ggcgaaagtg accgataaga tggatgctgc agggctggca 180
tgggcgattt acgacggcgt agtgcccaac ccaacaatta ctgtcgtcaa agaagggctc 240
ggtgtattcc agaatagcgg cgcggattac ctgatcgcta ttggtggtgg ttctccacag 300
gatacttgta aagcgattgg cattatcagc aacaacccgg agtttgccga tgtgcgtagc 360
ctggaagggc tttccccgac caataaaccc agtgtaccga ttctggcaat tcctaccaca 420
gcaggtactg cggcagaagt gaccattaac tacgtgatca ctgacgaaga gaaacggcgc 480
aagtttgttt gcgttgatcc gcatgatatc ccgcaggtgg cgtttattga cgctgacatg 540
atggatggta tgcctccagc gctgaaagct gcgacgggtg tcgatgcgct cactcatgct 600
attgaggggt atattacccg tggcgcgtgg gcgctaaccg atgcactgca cattaaagcg 660
attgaaatca ttgctggggc gctgcgagga tcggttgctg gtgataagga tgccggagaa 720
gaaatggcgc tcgggcagta tgttgcgggt atgggcttct cgaatgttgg gttagggttg 780
gtgcatggta tggcgcatcc actgggcgcg ttttataaca ctccacacgg tgttgcgaac 840
gccatcctgt taccgcatgt catgcgttat aacgctgact ttaccggtga gaagtaccgc 900
gatatcgcgc gcgttatggg cgtgaaagtg gaaggtatga gcctggaaga ggcgcgtaat 960
gccgctgttg aagcggtgtt tgctctcaac cgtgatgtcg gtattccgcc acatttgcgt 1020
gatgttggtg tacgcaagga agacattccg gcactggcgc aggcggcact ggatgatgtt 1080
tgtaccggtg gcaacccgcg tgaagcaacg cttgaggata ttgtagagct ttaccatacc 1140
gcctggtaa 1149
<210>8
<211>1440
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>8
atgtcagtac ccgttcaaca tcctatgtat atcgatggac agtttgttac ctggcgtgga 60
gacgcatgga ttgatgtggt aaaccctgct acagaggctg tcatttcccg catacccgat 120
ggtcaggccg aggatgcccg taaggcaatc gatgcagcag aacgtgcaca accagaatgg 180
gaagcgttgc ctgctattga acgcgccagt tggttgcgca aaatctccgc cgggatccgc 240
gaacgcgcca gtgaaatcag tgcgctgatt gttgaagaag ggggcaagat ccagcagctg 300
gctgaagtcg aagtggcttt tactgccgac tatatcgatt acatggcgga gtgggcacgg 360
cgttacgagg gcgagattat tcaaagcgat cgtccaggag aaaatattct tttgtttaaa 420
cgtgcgcttg gtgtgactac cggcattctg ccgtggaact tcccgttctt cctcattgcc 480
cgcaaaatgg ctcccgctct tttgaccggt aataccatcg tcattaaacc tagtgaattt 540
acgccaaaca atgcgattgc attcgccaaa atcgtcgatg aaataggcct tccgcgcggc 600
gtgtttaacc ttgtactggg gcgtggtgaa accgttgggc aagaactggc gggtaaccca 660
aaggtcgcaa tggtcagtat gacaggcagc gtctctgcag gtgagaagat catggcgact 720
gcggcgaaaa acatcaccaa agtgtgtctg gaattggggg gtaaagcacc agctatcgta 780
atggacgatg ccgatcttga actggcagtc aaagccatcg ttgattcacg cgtcattaat 840
agtgggcaag tgtgtaactg tgcagaacgt gtttatgtac agaaaggcat ttatgatcag 900
ttcgtcaatc ggctgggtga agcgatgcag gcggttcaat ttggtaaccc cgctgaacgc 960
aacgacattg cgatggggcc gttgattaac gccgcggcgc tggaaagggt cgagcaaaaa 1020
gtggcgcgcg cagtagaaga aggggcgaga gtggcgttcg gtggcaaagc ggtagagggg 1080
aaaggatatt attatccgcc gacattgctg ctggatgttc gccaggaaat gtcgattatg 1140
catgaggaaa cctttggccc ggtgctgcca gttgtcgcat ttgacacgct ggaagatgct 1200
atctcaatgg ctaatgacag tgattacggc ctgacctcat caatctatac ccaaaatctg 1260
aacgtcgcga tgaaagccat taaagggctg aagtttggtg aaacttacat caaccgtgaa 1320
aacttcgaag ctatgcaagg cttccacgcc ggatggcgta aatccggtat tggcggcgca 1380
gatggtaaac atggcttgca tgaatatctg cagacccagg tggtttattt acagtcttaa 1440
<210>9
<211>768
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>9
atgcgacatc ctttagtgat gggtaactgg aaactgaacg gcagccgcca catggttcac 60
gagctggttt ctaacctgcg taaagagctg gcaggtgttg ctggctgtgc ggttgcaatc 120
gcaccaccgg aaatgtatat cgatatggcg aagcgcgaag ctgaaggcag ccacatcatg 180
ctgggtgcgc aaaacgtgga cctgaacctg tccggcgcat tcaccggtga aacctctgct 240
gctatgctga aagacatcgg cgcacagtac atcatcatcg gtcactctga acgtcgtact 300
taccacaaag aatctgacga actgatcgcg aaaaaattcg cggtgctgaa agagcagggc 360
ctgactccgg ttctgtgcat cggtgaaacc gaagctgaaa atgaagcggg caaaactgaa 420
gaagtttgcg cacgtcagat cgacgcggta ctgaaaactc agggtgctgc ggcattcgaa 480
ggtgcggtta tcgcttacga acctgtatgg gcaatcggta ctggcaaatc tgcaactccg 540
gctcaggcac aggctgttca caaattcatc cgtgaccaca tcgctaaagt tgacgctaac 600
atcgctgaac aagtgatcat tcagtacggc ggctctgtaa acgcgtctaa cgctgcagaa 660
ctgtttgctc agccggatat cgacggcgcg ctggttggtg gtgcttctct gaaagctgac 720
gccttcgcag taatcgttaa agctgcagaa gcggctaaac aggcttaa 768
<210>10
<211>3528
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>10
aatgtgcctg tcaaatggac gaagcaggga ttctgcaaac cctatgctac tccgtcaagc 60
cgtcaattgt ctgattcgtt accaattatg acaacttgac ggctacatca ttcacttttt 120
cttcacaacc ggcacggaac tcgctcgggc tggccccggt gcatttttta aatacccgcg 180
agaaatagag ttgatcgtca aaaccaacat tgcgaccgac ggtggcgata ggcatccggg 240
tggtgctcaa aagcagcttc gcctggctga tacgttggtc ctcgcgccag cttaagacgc 300
taatccctaa ctgctggcgg aaaagatgtg acagacgcga cggcgacaag caaacatgct 360
gtgcgacgct ggcgatatca aaattgctgt ctgccaggtg atcgctgatg tactgacaag 420
cctcgcgtac ccgattatcc atcggtggat ggagcgactc gttaatcgct tccatgcgcc 480
gcagtaacaa ttgctcaagc agatttatcg ccagcagctc cgaatagcgc ccttcccctt 540
gcccggcgtt aatgatttgc ccaaacaggt cgctgaaatg cggctggtgc gcttcatccg 600
ggcgaaagaa ccccgtattg gcaaatattg acggccagtt aagccattca tgccagtagg 660
cgcgcggacg aaagtaaacc cactggtgat accattcgcg agcctccgga tgacgaccgt 720
agtgatgaat ctctcctggc gggaacagca aaatatcacc cggtcggcaa acaaattctc 780
gtccctgatt tttcaccacc ccctgaccgc gaatggtgag attgagaata taacctttca 840
ttcccagcgg tcggtcgata aaaaaatcga gataaccgtt ggcctcaatc ggcgttaaac 900
ccgccaccag atgggcatta aacgagtatc ccggcagcag gggatcattt tgcgcttcag 960
ccatactttt catactcccg ccattcagag aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac 1020
attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct tctcgctaac caaaccggta accccgctta 1080
ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg 1140
tctataatca cggcagaaaa gtccacattg attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg 1200
ccatagcatt tttatccata agattagcgg atcctacctg acgcttttta tcgcaactct 1260
ctactgtttc tccatacccg ttttttgggc taacaggagg aattaaccat gggtacctct 1320
catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagcctcga gggtagatct 1380
ggtactagtg gtgaattcgg tgagctcggt ctgcagctgg tgccgcgcgg cagccaccac 1440
caccaccacc actaatacag attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt 1500
tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac 1560
gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat 1620
caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gtcgaccatg cagcgctctt 1680
ccgcttcctc gctcactgac tcgctacgct cggtcgttcg actgcggcga gcggtgtcag 1740
ctcactcaaa agcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataaagcc ggaaagaaca 1800
tgtgagcaaa aagcaaagca ccggaagaag ccaacgccgc aggcgttttt ccataggctc 1860
cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagcc agaggtggcg aaacccgaca 1920
ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 1980
accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 2040
catagctcac gctgttggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 2100
gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 2160
tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccattggtaa ctgatttaga 2220
ggactttgtc ttgaagttat gcacctgtta aggctaaact gaaagaacag attttggtga 2280
gtgcggtcct ccaacccact taccttggtt caaagagttg gtagctcagc gaaccttgag 2340
aaaaccaccg ttggtagcgg tggtttttct ttatttatga gatgatgaat caatcggtct 2400
atcaagtcaa cgaacagcta ttccgttact ctagatttca gtgcaattta tctcttcgcg 2460
gccgccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat 2520
aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagccat attcaacggg 2580
aaacgtcttg ctctaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata 2640
aatgggctcg cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg tatgggaagc 2700
ccgatgcgcc agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag 2760
atgagatggt cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt 2820
ttatccgtac tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccccggg aaaacagcat 2880
tccaggtatt agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt 2940
tcctgcgccg gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gaccgcgtat 3000
ttcgtctcgc tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg 3060
atgacgagcg taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat aaacttttgc 3120
cattctcacc ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg 3180
acgaggggaa attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc 3240
aggatcttgc catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc 3300
tttttcaaaa atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc 3360
tcgatgagtt tttctaagaa ttaattcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 3420
aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacttgc ggagacccgg 3480
tcgtcagctt gtcgtcggtt cagggcaggg tcgttaaata gcgcatgc 3528

Claims (9)

1.一种产L-鼠李糖的基因工程菌的构建方法，所述方法为如下1）-7）中任一种：
1）提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1-磷酸酶、L-鼠李糖异构酶、甲基乙二醛合酶和甘油脱氢酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中醛脱氢酶A、L-1,2-丙二醇氧化还原酶、NADPH依赖的醛还原酶和磷酸丙糖异构酶的含量和/或活性；
2）提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1-磷酸酶、L-鼠李糖异构酶和甘油脱氢酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中醛脱氢酶A、L-1,2-丙二醇氧化还原酶、NADPH依赖的醛还原酶和磷酸丙糖异构酶的含量和/或活性；
3）提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1-磷酸酶和L-鼠李糖异构酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中醛脱氢酶A、L-1,2-丙二醇氧化还原酶、NADPH依赖的醛还原酶和磷酸丙糖异构酶的含量和/或活性；
4）提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1-磷酸酶和L-鼠李糖异构酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中醛脱氢酶A、L-1,2-丙二醇氧化还原酶和NADPH依赖的醛还原酶的含量和/或活性；
5）提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1-磷酸酶和L-鼠李糖异构酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中醛脱氢酶A和L-1,2-丙二醇氧化还原酶的含量和/或活性；
6）提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1-磷酸酶和L-鼠李糖异构酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中醛脱氢酶A的含量和/或活性；
7）提高大肠杆菌中鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1-磷酸酶和L-鼠李糖异构酶的含量和/或活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述1）中，所述鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的编码基因、所述果糖-1-磷酸酶的编码基因和所述L-鼠李糖异构酶的编码基因通过重组载体甲导入所述大肠杆菌中；
所述重组载体甲为将所述鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的编码基因、所述果糖-1-磷酸酶的编码基因和所述L-鼠李糖异构酶的编码基因插入pRB1k载体多克隆位点得到的载体；
所述甲基乙二醛合酶的编码基因和所述甘油脱氢酶的编码基因通过重组载体乙导入所述大肠杆菌中；
所述重组载体乙为将所述甲基乙二醛合酶的编码基因和所述甘油脱氢酶的编码基因插入pBAD载体多克隆位点得到的载体；
所述2）中，所述鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的编码基因、所述果糖-1-磷酸酶的编码基因和所述L-鼠李糖异构酶的编码基因通过所述重组载体甲导入所述大肠杆菌中；
所述甘油脱氢酶的编码基因通过重组载体丙导入所述大肠杆菌中；
所述重组载体丙为将所述甘油脱氢酶的编码基因插入pBAD载体多克隆位点得到的载体；
所述3）-7）中，所述鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的编码基因、所述果糖-1-磷酸酶的编码基因和所述L-鼠李糖异构酶的编码基因通过所述重组载体甲导入所述大肠杆菌中；
或，所述1）-3）中，对所述大肠杆菌中醛脱氢酶A的编码基因、L-1,2-丙二醇氧化还原酶的编码基因、NADPH依赖的醛还原酶的编码基因和磷酸丙糖异构酶的编码基因进行敲除的方法为对所述大肠杆菌进行如下m1）至m4）改造：
m1）将所述大肠杆菌基因组中的醛脱氢酶A的编码基因敲除；
m2）将m1）得到的突变型大肠杆菌基因组中的L-1,2-丙二醇氧化还原酶的编码基因敲除；
m3）将m2）得到的突变型大肠杆菌基因组中的NADPH依赖的醛还原酶的编码基因敲除；
m4）将m3）得到的突变型大肠杆菌基因组中的磷酸丙糖异构酶的编码基因敲除；
所述4）中，对所述大肠杆菌中醛脱氢酶A的编码基因、L-1,2-丙二醇氧化还原酶的编码基因和NADPH依赖的醛还原酶的编码基因进行敲除的方法为对所述大肠杆菌进行上述m1）至m3）改造；
所述5）中，对所述大肠杆菌中醛脱氢酶A的编码基因和L-1,2-丙二醇氧化还原酶的编码基因进行敲除的方法为对所述大肠杆菌进行上述m1）和m2）改造；
所述6）中，对所述大肠杆菌中醛脱氢酶A的编码基因进行敲除的方法为对所述大肠杆菌进行上述m1）改造。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的编码基因为序列表的序列1所示的DNA分子；
所述果糖-1-磷酸酶的编码基因为序列表的序列2所示的DNA分子；
所述L-鼠李糖异构酶的编码基因为序列表的序列3所示的DNA分子；
所述甲基乙二醛合酶的编码基因为序列表的序列4所示的DNA分子；
所述甘油脱氢酶的编码基因为序列表的序列5所示的DNA分子；
所述醛脱氢酶A的编码基因为序列表的序列6所示的DNA分子；
所述L-1,2-丙二醇氧化还原酶的编码基因为序列表的序列7所示的DNA分子；
所述NADPH依赖的醛还原酶的编码基因为序列8所示的DNA分子；
所述磷酸丙糖异构酶的编码基因为序列表的序列9所示的DNA分子。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌K12。
5.由权利要求1-4任一所述的方法构建得到的基因工程菌。
6.权利要求2中所述的重组载体甲。
7.权利要求5所述的基因工程菌或权利要求6所述的重组载体甲在制备L-鼠李糖中的应用。
8.一种制备L-鼠李糖的方法，为如下（1）或（2）：
（1）包括如下步骤：将按照权利要求1中1）或2）所述的方法构建得到的基因工程菌进行培养，得到重组菌；用所述重组菌催化葡萄糖反应，生成L-鼠李糖；
（2）包括如下步骤：将按照权利要求1中3）-7）所述的方法构建得到的基因工程菌进行培养，得到重组菌；用所述重组菌催化磷酸二羟基丙酮和L-乳醛反应，生成L-鼠李糖。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述（1）中，所述反应的条件为37℃培养20h；
所述（2）中，所述反应的条件为37℃培养4h。
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