CN112143689B - 重组恶臭假单胞菌株的构建及其在转化苏氨酸合成丙酸中的应用 - Google Patents

重组恶臭假单胞菌株的构建及其在转化苏氨酸合成丙酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了重组恶臭假单胞菌株的构建及其在转化苏氨酸合成丙酸中的应用。本发明提供了提供的重组菌，为将恶臭假单胞菌KT2440的基因组按照如下改造，其他序列不变，得到重组菌：将所述恶臭假单胞菌KT2440基因组中的prpC基因缺失或者失活、ltaE基因缺失或者失活、bkd基因簇启动子替换为J23119启动子、lacI基因缺失或者失活、prpE基因缺失或者失活、rhtA基因缺失或者失活。本发明的实验证明了本发明得到的重组菌菌株PS11可以实现生产大量丙酸。

Description

重组恶臭假单胞菌株的构建及其在转化苏氨酸合成丙酸中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种重组恶臭假单胞菌株的构建及其在转化苏氨酸合成丙酸中的应用。
背景技术
丙酸及其衍生物在工业上的应用领域十分广泛，主要应用于食品防腐、饲料储藏、医药中间体合成、农业除草剂合成、有机合成中间体等方面。丙酸的生产方法有化学合成法和微生物发酵法。化学合成法生产丙酸普遍面临反应条件苛刻、不宜分离纯化、容易造成环境污染等问题。而生物转化法生产丙酸需要建立高转化率的合成路线，减少副产物的积累，才能降低生产成本，形成具有推广前景的生产模式。苏氨酸是一种必需氨基酸，主要通过微生物发酵的方法制备，工艺简单成本低廉，因此可以作为生产丙酸的原料。
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是一种革兰氏阴性菌，广泛生长于土壤，水环境及植物根部，能够分解环境中的一些有机物，从而能够起到净化环境的作用，并且具有生物催化、生物排污等有益于人类的功能，被称为最具有开发潜能的一大类环境益生菌。其中恶臭假单胞菌KT2440(P.putida KT2440)是一株在全世界范围内得到详尽研究和应用的菌株，是第一个被美国卫生部重组DNA委员会(Recombinant DNA Advisory Committee，RAC)认定为对环境安全的格兰氏阴性细菌(1982年),并许可KT2440作为基因工程的宿主菌。
发明内容
为了提供新的制备丙酸的重组菌，本发明提供如下技术方案：
本发明一个目的是提供一种重组菌。
本发明提供的重组菌，为将假单胞菌的基因组按照如下1)-6)所有的方式改造、1)-5)所有的方式改造、1)-4)所有的方式改造、1)-3)所有的方式改造、1)和2)所有方式改造或1)所示的方式改造，其他序列不变，得到重组菌：
1)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的甲基柠檬酸合成酶的活性；
2)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的苏氨酸醛缩酶的活性；
3)提高所述假单胞菌基因组中的支链酮酸脱氢酶复合物的活性；
4)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的乳糖操纵子阻遏蛋白(lacI)的活性；
5)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的丙酰辅酶A合成酶的活性；
6)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的苏氨酸/高丝氨酸外排蛋白(rhtA)的活性。
上述重组菌中，所述1)中，所述抑制或降低所述假单胞菌基因组中的甲基柠檬酸合成酶的活性为将所述假单胞菌基因组中的甲基柠檬酸合成酶prpC基因缺失或者失活；目的是减少了丙酸的降解；若lac启动子和大肠杆菌tdcBC基因插入缺失的prpC位点，则加强了苏氨酸到2酮丁酸的途径通路；
所述2)中，所述抑制或降低所述假单胞菌基因组中的苏氨酸醛缩酶的活性将所述假单胞菌基因组中的ltaE基因缺失或者失活；目的是阻断了苏氨酸到甘氨酸的途径通路；若lac启动子和大肠杆菌ilvA基因插入缺失的ltaE位点，则再次加强了苏氨酸到2-酮丁酸的途径通路；
所述3)中，所述提高所述假单胞菌基因组中的支链酮酸脱氢酶复合物的活性将所述假单胞菌基因组中的支链酮酸脱氢酶复合物bkd基因簇的启动子及调控基因bkdR替换为J23119启动子；目的是加强了2酮丁酸到丙酰辅酶A的途径通路；
所述4)中，所述抑制或降低所述假单胞菌基因组中的乳糖操纵子阻遏蛋白(lacI)的活性将所述假单胞菌基因组中的乳糖操纵子阻遏蛋白lacI基因缺失或者失活；目的是将lac启动子和流感嗜血杆菌HiYciA基因替换lacI基因，加强了丙酰辅酶A到丙酸的途径通路。
所述5)中，所述抑制或降低所述假单胞菌基因组中的丙酰辅酶A合成酶的活性为将所述假单胞菌基因组中的丙酰辅酶A合成酶prpE基因缺失或者失活；目的是减弱了丙酸到丙酰辅酶A的途径通路。
所述6)中，所述抑制或降低所述假单胞菌基因组中苏氨酸/高丝氨酸外排蛋白(rhtA)的活性为将所述假单胞菌基因组中的苏氨酸/高丝氨酸外排蛋白rhtA基因缺失或者失活；目的是减弱了苏氨酸往胞外转运的能力。
上述重组菌，也可以为将假单胞菌的基因组按照如下1)-6)所有的方式改造、1)-5)所有的方式改造、1)-4)所有的方式改造、1)-3)所有的方式改造、1)和2)所有方式改造或1)所示的方式改造，其他序列不变，得到重组菌：
1)将所述恶臭假单胞菌KT2440基因组中的prpC基因缺失或者失活；
2)将所述恶臭假单胞菌KT2440基因组中的ltaE基因缺失或者失活；
3)将所述恶臭假单胞菌KT2440基因组中的bkd基因簇的启动子及调控基因bkdR替换为J23119启动子；
4)将所述恶臭假单胞菌KT2440基因组中的lacI基因缺失或者失活；
5)将所述恶臭假单胞菌KT2440基因组中的prpE基因缺失或者失活；
6)将所述恶臭假单胞菌KT2440基因组中的rhtA基因缺失或者失活。
上述重组菌中，1)中，所述将假单胞菌基因组中的prpC基因缺失或者失活为敲除所述假单胞菌基因组中的prpC基因或将所述假单胞菌基因组中的prpC基因替换为含有tdcBC基因及其启动子的片段；
或，2)中，所述将假单胞菌基因组中的ltaE基因缺失或者失活为敲除所述假单胞菌基因组中的ltaE基因或将所述假单胞菌基因组中的ltaE基因替换为含有ilvA基因及其启动子的片段；
或，4)中，将所述假单胞菌基因组中的lacI基因缺失或者失活为敲除所述假单胞菌基因组中的lacI基因或将所述假单胞菌基因组中的lacI基因替换为含有HiYciA基因及其启动子的片段；
或，5)中，将所述假单胞菌基因组中的prpE基因缺失或者失活为敲除所述假单胞菌基因组中的prpE基因；
或，6)中，将所述假单胞菌基因组中的rhtA基因缺失或者失活为敲除所述假单胞菌基因组中的rhtA基因。
上述重组菌中，所述tdcBC基因的启动子为lac启动子；
或，所述ilvA基因的启动子为lac启动子；
或，所述HiYciA基因的启动子为lac启动子。
上述重组菌中，所述含有tdcBC基因及其启动子的片段为如下1)或2)或3)所示的DNA分子：
1)包括序列1的DNA分子；
2)为序列1的DNA分子；
3)将1)或2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与1)或2)具有相同功能的DNA分子；
或，所述J23119启动子为如下4)或5)或6)所示的DNA分子：
4)包括序列2的DNA分子；
5)为序列2的DNA分子；
6)将4)或5)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与1)或2)具有相同功能的DNA分子；
或，所述含有ilvA基因及其启动子的片段为如下7)或8)或9)所示的DNA分子：
7)包括序列3的DNA分子；
8)为序列3的DNA分子；
9)将7)或8)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与1)或2)具有相同功能的DNA分子；
或，所述含有HiYciA基因及其启动子的片段为如下10)或11)或12)所示的DNA分子：
10)包括序列4的DNA分子；
11)为序列4的DNA分子；
12)将10)或11)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与1)或2)具有相同功能的DNA分子。
上述重组菌中，所述敲除或所述替换采用同源重组的方式进行；
或，所述敲除或所述替换采用λ-red同源重组系统或sacB基因介导筛选的同源重组，在本发明的实施例中，采用的是sacB基因介导筛选的同源重组。
上述重组菌中，所述假单胞菌为恶臭假单胞菌。在本发明的实施例中，采用的恶臭假单胞菌为恶臭假单胞菌KT2440。
在本发明的实施例中，按照如下1)-6)所有的方式改造得到重组菌PS11；
按照1)-5)所有的方式改造得到重组菌PS10；
按照1)-4)所有的方式改造得到重组菌PS09；
按照1)-3)所有的方式改造得到重组菌PS05或PS06；
按照1)和2)所有方式改造得到重组菌PS03或PS02；
按照1)所示的方式改造得到重组菌PS01。
本发明另一个目的是提供一种制备上述重组菌的方法。
本发明提供的方法，为将假单胞菌按照上述重组菌中的1)-6)任一中所述方式进行改造，得到重组菌。
上述方法中，所述假单胞菌为恶臭假单胞菌。
上述重组菌在利用苏氨酸生产或制备丙酸中的应用也是本发明保护的范围。
本发明还有一个目的是提供一种制备丙酸的方法。
本发明提供的制备丙酸的方法，包括如下步骤：用上述重组菌催化苏氨酸，得到丙酸。
本发明在之前构建的重组菌PS03基础上，将基因组中的bkd基因簇启动子替换为J23119启动子，构建菌株PS05；然后在恶臭假单胞菌PS05基因组上导入来自大肠杆菌高效的苏氨酸脱氨酶ilvA基因，构建菌株PS06；再继续导入表达流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)硫酯酶基因HiYciA，构建菌株PS09；然后从PS09菌株出发，利用同源重组方法敲除了丙酰辅酶A合成酶基因prpE，减弱了丙酸到丙酰辅酶A的途径通路，得到工程菌株PS10；在PS10的基础上，进一步敲除了该菌株苏氨酸外排基因rhtA基因，降低重组菌株的苏氨酸外排能力，构建菌株PS11。这些重组菌均可产生丙酸。
附图说明
图1为丙酸标准品HPLC结果。
图2为样品的HPLC结果。
图3为PS01、PS02、PS03、PS05、PS06、PS07、PS08、PS09、PS10产生的丙酸定量检测结果。
图4为PS11产生的丙酸定量检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、重组恶臭假单胞菌工程菌株PS11的构建
下述实施例中所用引物序列列表如表1和表2：
表1为构建重组菌PS03所用引物
Figure BDA0002111360360000051
Figure BDA0002111360360000061
Figure BDA0002111360360000071
表2为构建重组菌PS11所用引物序列表
Figure BDA0002111360360000072
Figure BDA0002111360360000081
Figure BDA0002111360360000091
Figure BDA0002111360360000101
下述实施例中所用引物序列列表如表1：
实施例1、重组恶臭假单胞菌工程菌株PS03的构建
本实施例制备了可以用于制备生产丙酸的一株基础菌株PS03，该菌株的制备方法如下，所用引物见表1。
一、重组菌PS01的制备
(1)甲基柠檬酸合成酶基因prpC的敲除。
从恶臭假单胞菌KT2440(ATCC 47054)出发，利用同源重组方法敲除了甲基柠檬酸合成酶基因prpC(Gene ID:1045332,updated on 6-Sep-2017)，减少了丙酸的降解，得到工程菌株PS01，具体步骤如下：
(1-a)构建敲除质粒pK18-prpC。
以pK18质粒(ATCC 87097)为模板，设计引物(引物为pK18-F/pK18-R)进行PCR扩增，得到6000bp左右的质粒DNA线性片段；
选择prpC基因ORF上下游各500bp，设计引物(引物分别为18-prpCup-F/prpCup-down-R和prpCup-down-F/prpCdown-18-R)，以恶臭假单胞菌KT2440的基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，得到500bp上游敲除同源臂DNA片段和500bp下游敲除同源臂DNA片段；
用Gibson方法(Gibson DG,Young L,Chuang RY,et al.Enzymatic assembly ofDNA molecules up to several hundred kilobases.Nat Meth,2009,6(5):343–345.)将上述500bp上游敲除同源臂DNA片段、上述500bp下游敲除同源臂DNA片段和上述6000bp左右的质粒DNA线性片段连接到一起，得到敲除质粒pK18-prpC。
(1-b)利用结合转导技术将质粒pK18-prpC转入出发菌株KT2440中。
以大肠杆菌S17-1(ATCC 47055)作为结合转导的质粒供体，制备S17-1的电转感受态；
将上述得到的敲除质粒pK18-prpC转化到S17-1感受态细胞中，得到含有敲除质粒的S17-1的菌株；
将含有敲除质粒的S17-1的菌株和出发菌株KT2440分别接种LB液体培养基，37℃过夜活化，得到S17-1菌液和KT2440菌液。分别取1mL菌液，离心后弃上清用500μL的LB液体重悬。在无抗的LB固体培养基上，点10μL的KT2440菌液，晾干。点15μL的S17-1菌液覆盖于KT2440之上，晾干。37℃培养16h。
(1-c)两次同源重组。
用涂布棒刮取混合菌落于含有终浓度25mg/L庆大霉素和25mg/L氯苯酚的LB固体培养基上涂匀。每4个菌落涂布一个固体培养基平板，置于37℃培养24h，这时长出的菌落为完成第一次同源重组带有庆大霉素抗性的菌株。挑单菌落于含有终浓度25mg/L氯苯酚和20％蔗糖的LB固体培养基上划线，置于37℃培养24h，这时长出的菌落为完成第二次同源重组的敲除菌株。挑单菌落分别于含有终浓度25mg/L氯苯酚的LB固体培养基和含有终浓度25mg/L庆大霉素的LB固体培养基上，37℃培养12h。挑选在前者上长，后者上不长的单菌落进行PCR验证。
PCR验证用prpC-YF/prpC-YR引物扩增鉴定，未敲除prpC的菌株扩增得到约2400bp的片段，敲除株扩增得到约1270bp的片段，挑选敲除结果为阳性的菌株命名为PS01。
测序分析结果表明PS01的基因组上没有prpC基因，PS01是将恶臭假单胞菌KT2440基因组上的prpC基因敲除，其他序列不变，得到重组恶臭假单胞菌KT2440的突变体。
二、重组菌PS02的制备
(2)苏氨酸醛缩酶ltaE的敲除。
从PS01菌株出发，利用同源重组方法敲除了苏氨酸醛缩酶基因ltaE(Gene ID:1044018,updated on 24-Sep-2016)，阻断了苏氨酸到甘氨酸的途径通路，得到工程菌株PS02，具体步骤如下：
(2-a)构建敲除质粒pK18-ltaE。
以pK18质粒(ATCC 87097)为模板，设计引物(引物为pK18-F/pK18-R)进行PCR扩增，得到6000bp左右的质粒DNA线性片段；
选择ltaE基因ORF上下游各500bp，设计引物(引物分别为18-ltaEup-F/ltaEup-down-R和ltaEup-down-F/ltaEdown-18-R)，以恶臭假单胞菌KT2440的基因组DNA为模板，分别用上述引物进行PCR扩增，得到500bp上游敲除同源臂DNA片段和500bp下游敲除同源臂DNA片段；
用Gibson方法将500bp上游敲除同源臂DNA片段、500bp下游敲除同源臂DNA片段和6000bp左右的质粒DNA线性片段连接到一起，得到敲除质粒pK18-ltaE。
(2-b)利用结合转导技术将质粒pK18-ltaE转入出发菌株PS01中。
以大肠杆菌S17-1(ATCC 47055)作为结合转导的质粒供体，制备S17-1的电转感受态；
将质粒pK18-ltaE转化到S17-1电转感受态中，得到含有敲除质粒的S17-1的菌株；
将含有敲除质粒的S17-1的菌株和出发菌株PS01分别接种LB液体培养基，37℃过夜活化，得到S17-1菌液和PS01菌液。分别取1mL菌液，离心后弃上清用500μL的LB液体重悬。在无抗的LB固体培养基上，点10μL的PS01菌液，晾干。点15μL的S17-1菌液覆盖于PS01之上，晾干。37℃培养16h。
(2-c)两次同源重组
用涂布棒刮取混合菌落于含有终浓度25mg/L庆大霉素和25mg/L氯苯酚的LB固体培养基上涂匀。每4个菌落涂布一个固体培养基平板，置于37℃培养24h，这时长出的菌落为完成第一次同源重组带有庆大霉素抗性的菌株。挑单菌落于含有终浓度25mg/L氯苯酚和20％蔗糖的LB固体培养基上划线，置于37℃培养24h，这时长出的菌落为完成第二次同源重组的敲除菌株。挑单菌落分别于含有终浓度25mg/L氯苯酚的LB固体培养基和含有终浓度25mg/L庆大霉素的LB固体培养基上，37℃培养12h。挑选在前者上长，后者上不长的单菌落进行PCR验证。
用ltaE-YF/ltaE-YR引物扩增鉴定，未敲除ltaE的菌株扩增得到约2250bp的片段，敲除株扩增得到约1200bp的片段，挑选敲除结果为阳性的菌株命名为PS02。
测序分析结果表明PS02是将PS01菌株的ltaE基因敲除得到的菌株；
即重组菌PS02为将恶臭假单胞菌KT2440基因组上的prpC基因和ltaE基因敲除，其他序列不变，得到重组菌。
三、重组菌PS03的制备
(3)表达大肠杆菌(Escherichia coli)苏氨酸脱氨酶基因tdcB和苏氨酸转运酶基因tdcC的质粒的构建。
从大肠杆菌(ATCC 700926)中提取基因组DNA，用引物tdcB(SacI)F/tdcC(BamHI)R扩增tdcB和tdcC基因，得到2500bp左右的DNA片段tdcBC。用SacI和BamHI分别酶切片段tdcBC和载体pUCP18(BioVector，Cloning vector pUCP18)，回收片段tdcBC的酶切产物和pUCP18载体大片段。用T4连接酶将片段tdcBC的酶切产物和pUCP18载体大片段进行连接反应，并转化大肠杆菌DH5α(transgen biotech，CD201-01)，用引物pucp18-YF/pucp18-YR鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，将获得的阳性重组质粒命名为pUCP18-tdcBC。
(4)lac启动子和tdcBC基因的插入整合。
从PS02菌株出发，利用同源重组方法将lac启动子和大肠杆菌tdcBC基因插入整合到PS02基因组prpC位点，加强了苏氨酸到2酮丁酸的途径通路，得到工程菌株PS03，具体步骤如下：
(4-a)构建整合质粒pK18-tdcBC::prpC。
以pK18-prpC质粒为模板，设计引物(引物为tdcBC-down-F/up-tdcBC-R)进行PCR扩增，得到7000bp左右的质粒DNA线性片段；
扩增lac启动子和tdcBC基因：设计引物(引物为up-tdcBC-F/tdcBC-down-R)，以pUCP18-tdcBC质粒为模板，用上述引物进行PCR扩增，得到2500bp左右大小的DNA片段(tdcBC基因和驱动其基因表达的lac启动子，序列1)；
用Gibson方法将上述二者DNA片段连接到一起，得到整合质粒pK18-tdcBC::prpC。
(4-b)利用结合转导技术将质粒pK18-tdcBC::prpC转入出发菌株PS02中。
以大肠杆菌S17-1作为结合转导的质粒供体，制备S17-1的电转感受态；
将质粒pK18-tdcBC::prpC转化到S17-1中，得到含有敲除质粒的S17-1的菌株；
将含有敲除质粒的S17-1的菌株和出发菌株PS02分别接种LB液体培养基，37℃过夜活化，得到S17-1菌液和PS02菌液。分别取1mL菌液，离心后弃上清用500μL的LB液体重悬。在无抗的LB固体培养基上，点10μL的PS02菌液，晾干。点15μL的S17-1菌液覆盖于PS02之上，晾干。37℃培养16h。
(4-c)两次同源重组。
用涂布棒刮取混合菌落于含有终浓度25mg/L庆大霉素和25mg/L氯苯酚的LB固体培养基上涂匀。每4个菌落涂布一个固体培养基平板，置于37℃培养24h，这时长出的菌落为完成第一次同源重组带有庆大霉素抗性的菌株。挑单菌落于含有终浓度25mg/L氯苯酚和20％蔗糖的LB固体培养基上划线，置于37℃培养24h，这时长出的菌落为完成第二次同源重组的敲除菌株。挑单菌落分别于含有终浓度25mg/L氯苯酚的LB固体培养基和含有终浓度25mg/L庆大霉素的LB固体培养基上，37℃培养12h。挑选在前者上长，后者上不长的单菌落进行PCR验证。
用prpC-YF/prpC-YR引物扩增鉴定，未整合插入的菌株扩增得到约1200bp的片段，整合插入的菌株扩增得到约3700bp的片段，挑选结果为阳性的菌株命名为PS03。
测序分析结果表明PS03是将PS02菌株在缺失prpC的位点处插入lac启动子和tdcBC基因得到的菌株；即重组菌PS03为将恶臭假单胞菌KT2440基因组上的prpC基因替换为tdcBC基因和驱动其基因表达的lac启动子，且敲除基因组上的ltaE基因，其他序列不变，得到重组菌。
实施例2、重组菌PS05的制备
一、重组菌PS05的制备
(1)通过启动子替换增强bkd基因的表达
从实施例1制备的PS03菌株出发，利用同源重组方法将J23119启动子替换该菌株中支链酮酸脱氢酶复合物bkd基因簇(bkd基因簇包含了bkdAA，bkdAB，bkdB以及lpdV四个亚基，这一步是用J23119启动子替换了基因簇自身的启动子以及前面的调控基因bkdR)自身启动子以及bkd基因簇的调控基因bkdR，加强了2酮丁酸到丙酰辅酶A的途径通路，得到工程菌株PS05，具体步骤如下：
(1-a)构建启动子替换质粒pK18-119::bkdR。
以pK18质粒为模板，设计引物(引物为pK18-F/pK18-R)进行PCR扩增，得到6000bp左右的质粒DNA线性片段；
选择bkdR基因上游500bp做上游同源臂，bkdAA基因ORF前500bp做下游同源臂，设计引物(引物分别为18-bkdup-F/bkdup-119-R和119-bkddown-F/bkddown-18-R)，同时J23119启动子序列(序列2)设计在PCR引物上，以恶臭假单胞菌KT2440的基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，得到500bp上游同源臂DNA片段和500bp下游同源臂DNA片段；
用Gibson方法将500bp上游同源臂DNA片段、500bp下游同源臂DNA片段和6000bp左右的质粒DNA线性片段连接到一起，得到启动子替换质粒pK18-119::bkdR。
(1-b)利用结合转导技术将质粒pK18-119::bkdR转入出发菌株PS03中。
以大肠杆菌S17-1作为结合转导的质粒供体，制备S17-1的电转感受态；
将质粒pK18-119::bkdR转化到S17-1中，得到含有敲除质粒的S17-1的菌株；
将含有敲除质粒的S17-1的菌株和出发菌株PS03分别接种LB液体培养基，37℃过夜活化，得到S17-1菌液和PS03菌液。分别取1mL菌液，离心后弃上清用500μL的LB液体重悬。在无抗的LB固体培养基上，点10μL的PS03菌液，晾干。点15μL的S17-1菌液覆盖于PS03之上，晾干。37℃培养16h。
(1-c)两次同源重组。
用涂布棒刮取混合菌落于含有终浓度25mg/L庆大霉素和25mg/L氯苯酚的LB固体培养基上涂匀。每4个菌落涂布一个固体培养基平板，置于37℃培养24h，这时长出的菌落为完成第一次同源重组带有庆大霉素抗性的菌株。挑单菌落于含有终浓度25mg/L氯苯酚和20％蔗糖的LB固体培养基上划线，置于37℃培养24h，这时长出的菌落为完成第二次同源重组的敲除菌株。挑单菌落分别于含有终浓度25mg/L氯苯酚的LB固体培养基和含有终浓度25mg/L庆大霉素的LB固体培养基上，37℃培养12h。挑选在前者上长，后者上不长的单菌落进行PCR验证。
用bkd-YF/bkd-YR引物扩增鉴定，未替换启动子的菌株扩增得到约2000bp的片段，替换启动子的菌株扩增得到约1300bp的片段，挑选结果为阳性的菌株命名为PS05。
测序分析结果表明PS05是将PS03菌株的bkd基因簇启动子及bkdR基因(序列5)替换为J23119启动子(序列2)得到的菌株。
重组菌PS05为将恶臭假单胞菌KT2440基因组上的prpC基因替换为tdcBC基因和驱动其基因表达的lac启动子(序列1)，且敲除基因组上的ltaE基因，且将基因组中的bkd基因簇启动子及bkdR基因(序列5)替换为J23119启动子(序列2)，其他序列不变，得到重组菌。
二、重组菌PS06的制备
(2)表达大肠杆菌(Escherichia coli)苏氨酸脱氨酶基因ilvA质粒的构建。
从大肠杆菌(ATCC 700926)中提取基因组DNA，用引物ilvA(SacI)F/ilvA(XmaI)R扩增ilvA基因，得到1500bp左右的DNA片段ilvA。用SacI和XmaI分别酶切片段ilvA和载体pUCP18(BioVector，Cloning vector pUCP18)，回收片段ilvA的酶切产物和pUCP18载体大片段。用T4连接酶将片段ilvA的酶切产物和pUCP18载体大片段进行连接反应，并转化大肠杆菌DH5α(transgen biotech，CD201-01)，用引物pucp18-YF/pucp18-YR鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，将获得的阳性重组质粒命名为pUCP18-ilvA。
(3)lac启动子和ilvA基因的插入整合。
从PS05菌株出发，利用同源重组方法将lac启动子和大肠杆菌ilvA基因插入整合到PS05基因组ltaE位点，再次加强了苏氨酸到2-酮丁酸的途径通路，得到工程菌株PS06，具体步骤如下：
(3-a)构建整合质粒pK18-ilvA::ltaE。
以pK18-ltaE质粒为模板，设计引物(引物为ilvA-down-F/up-ilvA-R)进行PCR扩增，得到7000bp左右的质粒DNA线性片段；
扩增lac启动子和ilvA基因：设计引物(引物为up-ilvA-F/ilvA-down-R)，以pUCP18-ilvA质粒为模板，用上述引物进行PCR扩增，得到1500bp左右大小的DNA片段(ilvA基因和驱动其基因表达的lac启动子，序列3)；
用Gibson方法将上述二者DNA片段连接到一起，得到整合质粒pK18-ilvA::ltaE。
(3-b)利用结合转导技术将质粒pK18-ilvA::ltaE转入出发菌株PS05中。
以大肠杆菌S17-1作为结合转导的质粒供体，制备S17-1的电转感受态；
将质粒pK18-ilvA::ltaE转化到S17-1中，得到含有敲除质粒的S17-1的菌株；
将含有敲除质粒的S17-1的菌株和出发菌株PS05分别接种LB液体培养基，37℃过夜活化，得到S17-1菌液和PS05菌液。分别取1mL菌液，离心后弃上清用500μL的LB液体重悬。在无抗的LB固体培养基上，点10μL的PS05菌液，晾干。点15μL的S17-1菌液覆盖于PS05之上，晾干。37℃培养16h。
(3-c)两次同源重组。
用涂布棒刮取混合菌落于含有终浓度25mg/L庆大霉素和25mg/L氯苯酚的LB固体培养基上涂匀。每4个菌落涂布一个固体培养基平板，置于37℃培养24h，这时长出的菌落为完成第一次同源重组带有庆大霉素抗性的菌株。挑单菌落于含有终浓度25mg/L氯苯酚和20％蔗糖的LB固体培养基上划线，置于37℃培养24h，这时长出的菌落为完成第二次同源重组的敲除菌株。挑单菌落分别于含有终浓度25mg/L氯苯酚的LB固体培养基和含有终浓度25mg/L庆大霉素的LB固体培养基上，37℃培养12h。挑选在前者上长，后者上不长的单菌落进行PCR验证。
用ltaE-YF/ltaE-YR引物扩增鉴定，未整合插入的菌株扩增得到约1200bp的片段，整合插入的菌株扩增得到约2700bp的片段，挑选结果为阳性的菌株命名为PS06。
测序分析结果表明PS06是将PS05菌株在缺失ltaE的位点处插入lac启动子和ilvA基因得到的菌株；即重组菌PS06为将恶臭假单胞菌KT2440基因组上的prpC基因替换为tdcBC基因和驱动其基因表达的lac启动子(序列1)，将ltaE基因替换为ilvA基因和驱动其基因表达的lac启动子(序列3)，且将基因组中的bkd基因簇启动子及bkdR基因替换为J23119启动子(序列2)，其他序列不变，得到重组菌。
三、重组菌PS09的制备
(4)表达流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)硫酯酶基因HiYciA质粒的构建。
根据流感嗜血杆菌(ATCC 51907)硫酯酶基因HiYciA序列(Gene ID:949716,updated on 7-May-2019)，人工合成HiYciA基因，得到500bp左右的DNA片段HiYciA。用SacI和XmaI分别酶切片段HiYciA和载体pUCP18(BioVector，Cloning vector pUCP18)，回收片段HiYciA的酶切产物和pUCP18载体大片段。用T4连接酶将片段HiYciA的酶切产物和pUCP18载体大片段进行连接反应，并转化大肠杆菌DH5α(transgen biotech，CD201-01)，用引物pucp18-YF/pucp18-YR鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，将获得的阳性重组质粒命名为pUCP18-HiYciA。
(5)lac启动子和HiYciA基因的插入整合。
从PS06菌株出发，利用同源重组方法将lac启动子和流感嗜血杆菌HiYciA基因插入整合到PS06基因组lacI位点(替换lacI基因，Gene ID:1046272,updated on6-Sep-2017)，加强了丙酰辅酶A到丙酸的途径通路，得到工程菌株PS09，具体步骤如下：
(5-a)构建整合质粒pK18-HiYciA::lacI。
以pK18质粒为模板，用引物pK18-F/pK18-R进行PCR扩增，得到6000bp左右的质粒DNA线性片段；
选择lacI基因ORF上下游各500bp，设计引物(引物分别为18-lacIup-F/lacIup-HiYciA-R和HiYciA-lacIdown-F/lacIdown-18-R)，以恶臭假单胞菌KT2440的基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，得到500bp上游敲除同源臂DNA片段和500bp下游敲除同源臂DNA片段；
扩增lac启动子和HiYciA基因：设计引物(引物为lacIup-HiYciA-F/HiYciA-lacIdown-R)，以pUCP18-HiYciA质粒为模板，用上述引物进行PCR扩增，得到600bp左右大小的DNA片段(HiYciA基因和驱动其基因表达的lac启动子，序列4)；
用Gibson方法将上述二者DNA片段连接到一起，得到整合质粒pK18-HiYciA::lacI。
(5-b)利用结合转导技术将质粒pK18-HiYciA::lacI转入出发菌株PS06中。
以大肠杆菌S17-1作为结合转导的质粒供体，制备S17-1的电转感受态；
将质粒pK18-HiYciA::lacI转化到S17-1中，得到含有敲除质粒的S17-1的菌株；
将含有敲除质粒的S17-1的菌株和出发菌株PS06分别接种LB液体培养基，37℃过夜活化，得到S17-1菌液和PS06菌液。分别取1mL菌液，离心后弃上清用500μL的LB液体重悬。在无抗的LB固体培养基上，点10μL的PS06菌液，晾干。点15μL的S17-1菌液覆盖于PS06之上，晾干。37℃培养16h。
(5-c)两次同源重组。
用涂布棒刮取混合菌落于含有终浓度25mg/L庆大霉素和25mg/L氯苯酚的LB固体培养基上涂匀。每4个菌落涂布一个固体培养基平板，置于37℃培养24h，这时长出的菌落为完成第一次同源重组带有庆大霉素抗性的菌株。挑单菌落于含有终浓度25mg/L氯苯酚和20％蔗糖的LB固体培养基上划线，置于37℃培养24h，这时长出的菌落为完成第二次同源重组的敲除菌株。挑单菌落分别于含有终浓度25mg/L氯苯酚的LB固体培养基和含有终浓度25mg/L庆大霉素的LB固体培养基上，37℃培养12h。挑选在前者上长，后者上不长的单菌落进行PCR验证。
用lacI-YF/lacI-YR引物扩增鉴定，未整合插入的菌株扩增得到约2200bp的片段，整合插入的菌株扩增得到约1800bp的片段，挑选结果为阳性的菌株命名为PS09。
测序分析结果表明PS09是将PS06菌株在lacI的位点处插入lac启动子和HiYciA基因得到的菌株；即重组菌PS06为将恶臭假单胞菌KT2440基因组上的prpC基因替换为tdcBC基因和驱动其基因表达的lac启动子(序列1)，将ltaE基因替换为ilvA基因和驱动其基因表达的lac启动子(序列3)，将基因组中的将bkd基因簇启动子及bkdR基因替换为J23119启动子(序列2)，且将lacI基因替换为HiYciA基因和驱动其基因表达的lac启动子(序列4)，其他序列不变，得到重组菌。
四、重组菌PS10的制备
(6)丙酰辅酶A合成酶prpE的敲除。
从PS09菌株出发，利用同源重组方法敲除了丙酰辅酶A合成酶基因prpE(Gene ID:1045356,updated on 6-Sep-2017)，减弱了丙酸到丙酰辅酶A的途径通路，得到工程菌株PS10，具体步骤如下：
(6-a)构建敲除质粒pK18-prpE。
以pK18质粒(ATCC 87097)为模板，用引物pK18-F/pK18-R进行PCR扩增，得到6000bp左右的质粒DNA线性片段；
选择prpE基因ORF上下游各500bp，设计引物(引物分别为18-prpEup-F/prpEup-down-R和prpEup-down-F/prpEdown-18-R)，以恶臭假单胞菌KT2440的基因组DNA为模板，分别用上述引物进行PCR扩增，得到500bp上游敲除同源臂DNA片段和500bp下游敲除同源臂DNA片段；
用Gibson方法将500bp上游敲除同源臂DNA片段、500bp下游敲除同源臂DNA片段和6000bp左右的质粒DNA线性片段连接到一起，得到敲除质粒pK18-prpE。
(6-b)利用结合转导技术将质粒pK18-prpE转入出发菌株PS09中。
以大肠杆菌S17-1作为结合转导的质粒供体，制备S17-1的电转感受态；
将质粒pK18-prpE转化到S17-1电转感受态中，得到含有敲除质粒的S17-1的菌株；
将含有敲除质粒的S17-1的菌株和出发菌株PS09分别接种LB液体培养基，37℃过夜活化，得到S17-1菌液和PS09菌液。分别取1mL菌液，离心后弃上清用500μL的LB液体重悬。在无抗的LB固体培养基上，点10μL的PS09菌液，晾干。点15μL的S17-1菌液覆盖于PS09之上，晾干。37℃培养16h。
(6-c)两次同源重组
用涂布棒刮取混合菌落于含有终浓度25mg/L庆大霉素和25mg/L氯苯酚的LB固体培养基上涂匀。每4个菌落涂布一个固体培养基平板，置于37℃培养24h，这时长出的菌落为完成第一次同源重组带有庆大霉素抗性的菌株。挑单菌落于含有终浓度25mg/L氯苯酚和20％蔗糖的LB固体培养基上划线，置于37℃培养24h，这时长出的菌落为完成第二次同源重组的敲除菌株。挑单菌落分别于含有终浓度25mg/L氯苯酚的LB固体培养基和含有终浓度25mg/L庆大霉素的LB固体培养基上，37℃培养12h。挑选在前者上长，后者上不长的单菌落进行PCR验证。
用prpE-YF/prpE-YR引物扩增鉴定，未敲除prpE的菌株扩增得到约3100bp的片段，敲除株扩增得到约1200bp的片段，挑选敲除结果为阳性的菌株命名为PS10。
测序分析结果表明PS10是将PS09菌株的prpE基因敲除得到的菌株；即重组菌PS10为将恶臭假单胞菌KT2440基因组上的prpC基因替换为tdcBC基因和驱动其基因表达的lac启动子，将ltaE基因替换为ilvA基因和驱动其基因表达的lac启动子，将基因组中的将bkd基因簇启动子及bkdR基因替换为J23119启动子，将lacI基因替换为HiYciA基因和驱动其基因表达的lac启动子，且将prpE基因敲除，其他序列不变，得到重组菌。
五、重组菌PS11的制备
(7)苏氨酸外排泵基因rhtA基因的敲除。
从PS10菌株出发，利用同源重组方法敲除了苏氨酸外排泵基因rhtA(Gene ID:1045115,updated on 6-Sep-2017)，减弱了苏氨酸往胞外转运的能力，得到工程菌株PS11，具体步骤如下：
(7-a)构建敲除质粒pK18-rhtA。
以pK18质粒(ATCC 87097)为模板，用引物pK18-F/pK18-R进行PCR扩增，得到6000bp左右的质粒DNA线性片段；
选择rhtA基因ORF上下游各500bp，设计引物(引物分别为18-rhtAup-F/rhtAup-down-R和rhtAup-down-F/rhtAdown-18-R)，以恶臭假单胞菌KT2440的基因组DNA为模板，分别用上述引物进行PCR扩增，得到500bp上游敲除同源臂DNA片段和500bp下游敲除同源臂DNA片段；
用Gibson方法将500bp上游敲除同源臂DNA片段、500bp下游敲除同源臂DNA片段和6000bp左右的质粒DNA线性片段连接到一起，得到敲除质粒pK18-rhtA。
(6-b)利用结合转导技术将质粒pK18-rhtA转入出发菌株PS10中。
以大肠杆菌S17-1作为结合转导的质粒供体，制备S17-1的电转感受态；
将质粒pK18-rhtA转化到S17-1电转感受态中，得到含有敲除质粒的S17-1的菌株；
将含有敲除质粒的S17-1的菌株和出发菌株PS10分别接种LB液体培养基，37℃过夜活化，得到S17-1菌液和PS10菌液。分别取1mL菌液，离心后弃上清用500μL的LB液体重悬。在无抗的LB固体培养基上，点10μL的PS10菌液，晾干。点15μL的S17-1菌液覆盖于PS10之上，晾干。37℃培养16h。
(6-c)两次同源重组
用涂布棒刮取混合菌落于含有终浓度25mg/L庆大霉素和25mg/L氯苯酚的LB固体培养基上涂匀。每4个菌落涂布一个固体培养基平板，置于37℃培养24h，这时长出的菌落为完成第一次同源重组带有庆大霉素抗性的菌株。挑单菌落于含有终浓度25mg/L氯苯酚和20％蔗糖的LB固体培养基上划线，置于37℃培养24h，这时长出的菌落为完成第二次同源重组的敲除菌株。挑单菌落分别于含有终浓度25mg/L氯苯酚的LB固体培养基和含有终浓度25mg/L庆大霉素的LB固体培养基上，37℃培养12h。挑选在前者上长，后者上不长的单菌落进行PCR验证。
用rhtA-YF/rhtA-YR引物扩增鉴定，未敲除rhtA的菌株扩增得到约2100bp的片段，敲除株扩增得到约1200bp的片段，挑选敲除结果为阳性的菌株命名为PS11。
测序分析结果表明PS11是将PS10菌株的rhtA基因敲除得到的菌株；即重组菌PS11为将恶臭假单胞菌KT2440基因组上的prpC基因替换为tdcBC基因和驱动其基因表达的lac启动子，将ltaE基因替换为ilvA基因和驱动其基因表达的lac启动子，将基因组中的将bkd基因簇启动子及bkdR基因替换为J23119启动子，将lacI基因替换为HiYciA基因和驱动其基因表达的lac启动子，将prpE基因敲除，且将rhtA基因敲除，其他序列不变，得到重组菌。
实施例3、利用重组菌菌株全细胞催化生产丙酸
一、PS01、PS02、PS03、PS05、PS06、PS07、PS08、PS09、PS10重组菌全细胞催化生产丙酸
1、菌体的培养
将菌株KT2440、实施例1和实施例2制备的PS01、PS02、PS03、PS05、PS06、PS07、PS08、PS09、PS10菌株分别接种于LB液体培养基中，37℃过夜活化。活化后的菌株按体积百分含量1％接种量分别接种于含50mL的LB液体培养基摇瓶中，37℃培养16h至稳定期，5000g离心5min收集菌体，得到各个菌体。
2、丙酸的全细胞催化生产
将步骤1收集得到的菌体分别用50mM的PBS缓冲液重悬于试管中，得到菌悬液，OD600值均为30。
分别向菌悬液中加入400mM的L-苏氨酸，37℃摇床培养36h后，10000g离心1min取上清液用0.22μm滤器过滤，得到过滤液，即为待测样品。
以丙酸为标准品采用标准曲线法(外标法)利用HPLC定量分析待测样品中丙酸的含量。HPLC方法：Aminex HPX-87H色谱柱(300×7.8mm)；二极管阵列检测器(Diode arraydetector，DAD)；流动相：18mM硫酸；检测波长：210nm；进样量：10μL；流速：0.6mL/min；柱温：35℃。
丙酸标准品HPLC结果如图1所示，丙酸的保留时间在13.38min左右；样品的HPLC结果如图2所示，其中11.801min出的峰为2酮丁酸，18.316min出的峰为丙酸。
定量检测结果如图3所示，经过36h转化，利用KT2440制备的丙酸产量为0mM；利用PS01制备的丙酸产量为23.3mM；利用PS02制备的丙酸产量为63.3mM；利用PS03制备的丙酸产量为135.9mM；利用PS05制备的丙酸产量为193.4mM；利用PS06制备的丙酸产量为342.6mM；利用PS09制备的丙酸产量为385.7mM；利用PS10制备的丙酸产量为396.9mM。
上述结果表明，成功构建能够生产丙酸的重组菌。
二、PS11重组菌全细胞催化生产丙酸
1、菌体的培养
将实施例2制备的重组菌PS11接种于LB液体培养基中，37℃过夜活化。活化后的菌株按体积百分含量1％接种量接种于含50mL的LB液体培养基摇瓶中，37℃培养16h至稳定期，5000g离心5min收集菌体，得到菌体。
2、丙酸的全细胞催化生产
将步骤1收集得到的菌体用10mM的PBS缓冲液重悬于试管中，得到菌悬液，OD600值均为10。
分别向菌悬液中加入40mM的L-苏氨酸，37℃摇床培养不同时间后，10000g离心1min取上清液用0.22μm滤器过滤，得到过滤液，即为待测样品。
以丙酸为标准品采用标准曲线法(外标法)利用HPLC定量分析待测样品中丙酸的含量。HPLC方法：Aminex HPX-87H色谱柱(300×7.8mm)；二极管阵列检测器(Diode arraydetector，DAD)；流动相：18mM硫酸；检测波长：210nm；进样量：10μL；流速：0.6mL/min；柱温：35℃。
丙酸标准品HPLC结果和样品的HPLC结果仍为图1和图2。图2中，11.801min出的峰为2酮丁酸，18.316min出的峰为丙酸。
菌株PS11在不同时间丙酸生成量如图4所示，经过36h转化，400mM的L-苏氨酸基本全部转化为丙酸盐，该丙酸盐可以为丙酸钙、丙酸铵或丙酸钠。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院微生物研究所
<120>重组恶臭假单胞菌株的构建及其在转化苏氨酸合成丙酸中的应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2458
<212> DNA
<213> Artificial sequenc
<400> 1
taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc 60
ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgaattcga gctcgatgca 120
tattacatac gatctgccgg ttgctattga tgacattatt gaagcgaaac aacgactggc 180
tgggcgaatt tataaaacag gcatgcctcg ctccaactat tttagtgaac gttgcaaagg 240
tgaaatattc ctgaagtttg aaaatatgca gcgtacgggt tcatttaaaa ttcgtggcgc 300
atttaataaa ttaagttcac tgaccgatgc ggaaaaacgc aaaggcgtgg tggcctgttc 360
tgcgggcaac catgcgcaag gggtttccct ctcctgcgcg atgctgggta tcgacggtaa 420
agtggtgatg ccaaaaggtg cgccaaaatc caaagtagcg gcaacgtgcg actactccgc 480
agaagtcgtt ctgcatggtg ataacttcaa cgacactatc gctaaagtga gcgaaattgt 540
cgaaatggaa ggccgtattt ttatcccacc ttacgatgat ccgaaagtga ttgctggcca 600
gggaacgatt ggtctggaaa ttatggaaga tctctatgat gtcgataacg tgattgtgcc 660
aattggtggt ggcggtttaa ttgctggtat tgcggtggca attaaatcta ttaacccgac 720
cattcgtgtt attggcgtac agtctgaaaa cgttcacggc atggcggctt ctttccactc 780
cggagaaata accacgcacc gaactaccgg caccctggcg gatggttgtg atgtctcccg 840
cccgggtaat ttaacttacg aaatcgttcg tgaattagtc gatgacatcg tgctggtcag 900
cgaagacgaa atcagaaaca gtatgattgc cttaattcag cgcaataaag tcgtcaccga 960
aggcgcaggc gctctggcat gtgctgcatt attaagcggt aaattagacc aatatattca 1020
aaacagaaaa accgtcagta ttatttccgg cggcaatatc gatctttctc gcgtctctca 1080
aatcaccggt ttcgttgacg cttaattaat tcgttgagga taggatatga gtacttcaga 1140
tagcattgta tccagccaga caaaacaatc gtcctggcgt aaatcagata ccacatggac 1200
gttaggcttg tttggtacgg caatcggcgc cggggtgctg ttcttcccta tccgcgcagg 1260
ttttggcgga ctgatcccga ttcttctgat gttggtattg gcatacccca tcgcgtttta 1320
ttgccaccgg gcgctggcgc gtctgtgtct ttctggctct aacccttccg gcaacattac 1380
ggaaacggtg gaagagcatt ttggtaaaac tggcggcgtg gttatcacgt tcctgtactt 1440
cttcgcgatt tgcccactgc tgtggattta tggcgttact attaccaata cctttatgac 1500
gttctgggaa aaccagctcg gctttgcacc gctgaatcgc ggctttgtgg cgctgttcct 1560
gttgctgctg atggctttcg tcatctggtt tggtaaggat ctgatggtta aagtgatgag 1620
ctacctggta tggccgttta tcgccagcct ggtgctgatt tctttgtcgc tgatccctta 1680
ctggaactct gcagttatcg accaggttga cctcggttcg ctgtcgttaa ccggtcatga 1740
cggtatcctg atcactgtct ggctggggat ttccatcatg gttttctcct ttaacttctc 1800
gccaatcgtc tcttccttcg tggtttctaa gcgtgaagag tatgagaaag acttcggtcg 1860
cgacttcacc gaacgtaaat gttcccaaat catttctcgt gccagcatgc tgatggttgc 1920
agtggtgatg ttctttgcct ttagctgcct gtttactctg tctccggcca acatggcgga 1980
agccaaagcg cagaatattc cagtgctttc ttatctggct aaccactttg cgtccatgac 2040
cggtaccaaa acaacgttcg cgattacact ggaatatgcg gcttccatca tcgcactcgt 2100
ggctatcttc aaatctttct tcggtcacta tctgggaacg ctggaaggtc tgaatggcct 2160
ggtcctgaag tttggttata aaggcgacaa aactaaagtg tcgctgggta aactgaacac 2220
tatcagcatg atcttcatca tgggctccac ctgggttgtt gcctacgcca acccgaacat 2280
ccttgacctg attgaagcca tgggcgcacc gattatcgca tccctgctgt gcctgttgcc 2340
gatgtatgcc atccgtaaag cgccgtctct ggcgaaatac cgtggtcgtc tggataacgt 2400
gtttgttacc gtgattggtc tgctgaccat cctgaacatc gtatacaaac tgttttaa 2458
<210> 2
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial sequenc
<400> 2
ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagccgcgc gcgtaacagg aggaattaac 60
c 61
<210> 3
<211> 1687
<212> DNA
<213> Artificial sequenc
<400> 3
gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg 60
gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac 120
catgattacg aattcgagct cgatggctga ctcgcaaccc ctgtccggtg ctccggaagg 180
tgccgaatat ttaagagcag tgctgcgcgc gccggtttac gaggcggcgc aggttacgcc 240
gctacaaaaa atggaaaaac tgtcgtcgcg tcttgataac gtcattctgg tgaagcgcga 300
agatcgccag ccagtgcaca gctttaagct gcgcggcgca tacgccatga tggcgggcct 360
gacggaagaa cagaaagcgc acggcgtgat cactgcttct gcgggtaacc acgcgcaggg 420
cgtcgcgttt tcttctgcgc ggttaggcgt gaaggccctg atcgttatgc caaccgccac 480
cgccgacatc aaagtcgacg cggtgcgcgg cttcggcggc gaagtgctgc tccacggcgc 540
gaactttgat gaagcgaaag ccaaagcgat cgaactgtca cagcagcagg ggttcacctg 600
ggtgccgccg ttcgaccatc cgatggtgat tgccgggcaa ggcacgctgg cgctggaact 660
gctccagcag gacgcccatc tcgaccgcgt atttgtgcca gtcggcggcg gcggtctggc 720
tgctggcgtg gcggtgctga tcaaacaact gatgccgcaa atcaaagtga tcgccgtaga 780
agcggaagac tccgcctgcc tgaaagcagc gctggatgcg ggtcatccgg ttgatctgcc 840
gcgcgtaggg ctatttgctg aaggcgtagc ggtaaaacgc atcggtgacg aaaccttccg 900
tttatgccag gagtatctcg acgacatcat caccgtcgat agcgatgcga tctgtgcggc 960
gatgaaggat ttattcgaag atgtgcgcgc ggtggcggaa ccctctggcg cgctggcgct 1020
ggcgggaatg aaaaaatata tcgccctgca caacattcgc ggcgaacggc tggcgcatat 1080
tctttccggt gccaacgtga acttccacgg cctgcgctac gtctcagaac gctgcgaact 1140
gggcgaacag cgtgaagcgt tgttggcggt gaccattccg gaagaaaaag gcagcttcct 1200
caaattctgc caactgcttg gcgggcgttc ggtcaccgag ttcaactacc gttttgccga 1260
tgccaaaaac gcctgcatct ttgtcggtgt gcgcctgagc cgcggcctcg aagagcgcaa 1320
agaaattttg cagatgctca acgacggcgg ctacagcgtg gttgatctct ccgacgacga 1380
aatggcgaag ctacacgtgc gctatatggt cggcggacgt ccatcgcatc cgttgcagga 1440
acgcctctac agcttcgaat tcccggaatc accgggcgcg ctgctgcgct tcctcaacac 1500
gctgggtacg tactggaaca tttctttgtt ccactatcgc agccatggca ccgactacgg 1560
gcgcgtactg gcggcgttcg aacttggcga ccatgaaccg gatttcgaaa cccggctgaa 1620
tgagctgggc tacgattgcc acgacgaaac caataacccg gcgttcaggt tctttttggc 1680
gggttag 1687
<210> 4
<211> 607
<212> DNA
<213> Artificial sequenc
<400> 4
gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg 60
gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac 120
catgattacg aattcgagct cgatgtctgc caattttact gataaaaatg gtcgccaatc 180
aaaaggagtt cttttactac gaactttggc gatgccttct gacaccaatg ctaacggaga 240
tatttttggt ggctggatta tgtctcaaat ggatatgggc ggcgcgattt tagcgaaaga 300
aatcgcacac ggacgcgtgg ttactgtcgc cgttgaaagt atgaatttta tcaaaccaat 360
ctctgtgggc gatgtggttt gttgctacgg tcaatgtctc aaagttgggc gttcttccat 420
taaaattaaa gtagaagtat gggtaaaaaa agtggcgagt gagccaattg gcgaacgtta 480
ttgtgtcacc gatgcggtat ttacttttgt tgcagttgat aataatggtc gctctcgcac 540
gattccccgt gaaaataacc aagagttaga aaaagcatta gccttaattt cagaacaacc 600
cttgtaa 607
<210> 5
<211> 584
<212> DNA
<213> Artificial sequenc
<400> 5
aagcgcgtca ggtaatcgag aaaccgctcc agcgcctgga tgctcggcag cagcacccgc 60
agcaggtaat ccggatcgcc ggtcatcagg tagcactcca tcacctcagg ccgctcggcg 120
atctcttctt caaagcgatg caacgactgc tccacctgtt tttccaggct gacatggata 180
aacacattca catccagccc cagcacctca ggcgacagca aggtcacctg ctggcgaatc 240
acccccagct cttccatggc ccgcacccga ttgaaacaag gcgtgggcga caggttcacc 300
gagcgtgcca gctcggcatt ggtgatgcgg gcgttctctt gcaggctgtt gagaatgccg 360
atatcagtac gatcgagttt gcgcataaga caaaatcacc ggttttttgt gtttatgcgg 420
aatgtttatc tgccctgctc agcaaaggca atcaacttga gagaaaaatt ctcctgccgt 480
gccactaaga tgtaggtgac gctgacttac cagtcacaag ccggtactca gcggcggccg 540
cttcagagct cacaaaaaca aatacccgag cgagcgtaaa aagc 584

Claims (6)

1.重组菌，为如下任一种：
制备方式为将恶臭假单胞菌KT2440基因组上的prpC基因替换为tdcBC基因和驱动其基因表达的lac启动子，且敲除基因组上的ltaE基因，且将基因组中的bkd基因簇启动子及bkdR基因替换为J23119启动子，其他序列不变，得到的重组菌；
或，制备方式为将恶臭假单胞菌KT2440基因组上的prpC基因替换为tdcBC基因和驱动其基因表达的lac启动子，将ltaE基因替换为ilvA基因和驱动其基因表达的lac启动子，且将基因组中的bkd基因簇启动子及bkdR基因替换为J23119启动子，其他序列不变，得到的重组菌；
或，制备方式为将恶臭假单胞菌KT2440基因组上的prpC基因替换为tdcBC基因和驱动其基因表达的lac启动子，将ltaE基因替换为ilvA基因和驱动其基因表达的lac启动子，将基因组中的将bkd基因簇启动子及bkdR基因替换为J23119启动子，且将lacI基因替换为HiYciA基因和驱动其基因表达的lac启动子，其他序列不变，得到的重组菌；
或，制备方式为将恶臭假单胞菌KT2440基因组上的prpC基因替换为tdcBC基因和驱动其基因表达的lac启动子，将ltaE基因替换为ilvA基因和驱动其基因表达的lac启动子，将基因组中的将bkd基因簇启动子及bkdR基因替换为J23119启动子，将lacI基因替换为HiYciA基因和驱动其基因表达的lac启动子，且将prpE基因敲除，其他序列不变，得到的重组菌；
或，制备方式为将恶臭假单胞菌KT2440基因组上的prpC基因替换为tdcBC基因和驱动其基因表达的lac启动子，将ltaE基因替换为ilvA基因和驱动其基因表达的lac启动子，将基因组中的将bkd基因簇启动子及bkdR基因替换为J23119启动子，将lacI基因替换为HiYciA基因和驱动其基因表达的lac启动子，将prpE基因敲除，且将rhtA基因敲除，其他序列不变，得到的重组菌。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：
所述敲除或所述替换采用同源重组的方式进行。
3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于：
所述敲除或所述替换采用λ-red同源重组系统或sacB基因介导筛选的同源重组。
4.一种制备权利要求1所述重组菌的方法，其特征在于：将恶臭假单胞菌按照权利要求1中的制备方式进行改造，得到重组菌。
5.权利要求1所述重组菌在利用苏氨酸生产或制备丙酸中的应用。
6.一种制备丙酸的方法，包括如下步骤：权利要求1所述重组菌催化苏氨酸，得到丙酸。
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