JPH03504334A - 生物学的方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的方法 本発明は、糸状菌の形質転換における新規なマーカー系の使用に関する。本発明 はとくに、抗生物質生合成 ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換における選択マーカーとしての硝酸レダクタ ーゼ遺伝子の使用に関する。

糸状菌類における組換えＤＮＡ技術の発展および利用は、一部には、所望のベク ターＤＮＡで形質転換された糸状菌細胞を簡単に選択するのに効率的で工業的に 使用できる系を欠いていたために遅れていＩ；といえる。菌類の形質転換、すな わち菌類の細胞のＤＮＡ配列中への所望のＤＮＡの安定な導入は稀な現象であっ て、所望のＤＮＡを獲得したきわめてわずかな細胞を、多分、数百万もの非形質 転換細胞中から決定するための選択系が必要になる。所望のＤＮＡとともにベク ター中に存在し、形質転換細胞を認識、選択できるマーカー遺伝子を使用する様 々な系がこれまでに提案されてきた。

形質転換に成功した糸状菌細胞の選択には、これまで、たとえば形質転換体に唯 一の窒素源としての酢酸アミドの利用能を付与しくたとえば、Ｋｅｌｌｙ　＆　 Ｈｙｎｅｓ　：　ＥＭＢＯＪ、、　４　：　４７５．１９８５）、それによりこ のような形質転換体の同定方法を与えるアセトアミダーゼ（ａｍｄ　Ｓ）遺伝子 の使用が一明らかにされている。糸状菌の形質転換の特徴は、外因性ＤＮＡが宿 主ゲノム中に容易にまた安定に挿入されないので、形質転換効率が低いことであ る。このため、非形質転換体によるバックグラウンドのレベルが高く、ａｉｄ　 Ｓ選択マーカー系の場合には、これらの非形質転換体が、アセトアミダーゼ遺伝 子の発現を欠くにもかかわらず、唯一の窒素源としての酢酸アミドでも増殖する もののあることが見出された。このため、形質転換を受けた細胞が明瞭に識別さ れないことから、形質転換効率が低い場合にはとくに、ａｍｄ　Ｓマーカー選択 系の操作は難しい。

この問題は、マーカー法として抗生物質選択が開発されたことにより、ある程度 は解決された。たとえば、マーカーとしてホスホトランスフェラーゼ遺伝子を包 含するベクターによる形質転換は、形質転換体にアミノグリコシド抗生物質Ｇ４ １８およびハイグロマイシンＢに対する抵抗性を付与する（たとえば、Ｐｕｎｔ ら、Ｇｅｎｅ、　５６：　１１７゜１９８７参照）。形質転換された細胞はつい で、これらの抗生物質のいずれかを含有する培地上で増殖する能力によって認識 できる。この系は形質転換体の明瞭な選択方法を提供するが、得られた抗生物質 抵抗性菌株の大きな工業的規模での使用は、工業的利用を困難でかつ経費のがか るものとする高度の封じ込めが要求されるため、望ましくない。さらに、このよ うな株の使用に際しては、挿入された遺伝子が安定に維持されない復帰体の増殖 を防止するために、発酵培地中に抗生物質を存在させることにより選択圧を維持 するのが望ましいと考えられるが、このような発酵培地中での抗生物質の連続的 な使用はもちろん不利である。

糸状菌用の他のマーカー系としては、ａｒｇＢ遺伝子を用いるアルギニン要求性 （Ｂｕｘｔｏｎら：　　Ｇｅｎｅ、　　３７　：　２０７゜１９８５）、」Ｃ遺 伝子を用いるトリプトファンＣ要求性（Ｓａｎｃｈｅｚら：　Ｇｅｎｅ、　５１ 　：　９７．１９８７）またはＰｙｒ−４もしくはＰｙｒ　Ｃ遺伝子を用いるウ ラシル要求性（Ｃａｎｔｏｒａｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　５：　４ ９４．１９８７）の逆突然変異が報告されている。これらの技術はしかしながら 、適当な栄養要求変異体を得るための突然変異および選択を含む複雑な長い操作 が必要になる。また、このような操作は糸状菌の抗生物質産生株に抗生物質生産 性の喪失を招くことが多い。

したがって、マーカー遺伝子の発現を欠く適当な変異体の単離を容易にし、しか も選択操作は抗生物質抵抗性マーカーを使用しないで形質転換細胞の明瞭かつ容 易な同定を可能にする形質転換糸状菌の確認用マーカー系の開発が必要である。

さらに、このような系はマーカー遺伝子として同種遺伝子を（すなわち、形質転 換された種と同一種からの遺伝子）の使用によるものであることが理想である。

マーカー遺伝子が同種遺伝子である場合には、遺伝子コードが形質転換宿主に生 得のものであり、したがって宿主細胞によって容易に認識されるので、発現およ び形質転換を至適化しやすく、より効率的な遺伝子の発現がもたらされる。また 、環境リスクの可能性を低下させるためにも、宿主糸状菌への異種遺伝子の導入 は回避することが好ましい。

本発明者には、抗生物質産生糸状菌、Ｐｅｎ１ｃｉｌｌｉｕ■ｃｈｒｙｓｏｇｅ ｎｕｍおよびＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換細胞が 、硝酸レダクターゼを欠く細胞の形質転換において硝酸レダクターゼマーカー遺 伝子を用いることによって、うまく、効率的に選択されることを見出した。この ような系は、形質転換体の明瞭な選択を可能にし、抗生物質抵抗性の挿入による 欠点を回避し、また、所望により、マーカー遺伝子として同種遺伝子を使用する ことができる。

すなわち、本発明はその一態様として、硝酸レダクターゼを発現できるＰｅｎｉ ｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍまたはＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒ ｙｓｏｇｅｎｕａ＋の細胞を、最初は硝酸レダクターゼ遺伝子の発現を欠いてい た同種の細胞（ｎｉａ　Ｄ−細胞）から得る方法を提供する。この方法は、上記 ｎｉａ　Ｄ−細胞に選ばれた宿主細胞内での上記遺伝子の発現のための調節配列 と機能性に連結した硝酸レダクターゼをコードするマーカー遺伝子を包含するベ クターＤＮＡを導入し、ついで形質転換された細胞を、唯一の窒素源として硝酸 塩を含有する適当な培地上での発育能によって選択するものである。

本発明の方法に使用されるＰｅｎｉｃｊｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍお よびＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕ＋ｒ　（以前はＣｅｐｈａ　 １ｏｓｐｏｒ　ｉｕｍａｃｒｅｍｏｎｌｕｍと呼ばれていた）の株は、その抗生 物質産生株または硝酸レダクターゼ欠損変異株であることが好ましい。Ｐ、　ｃ ｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの株はペニシリン系抗生物質たとえばペニシリンＧおよび ペニシリンＶの工業的製造に広く用いられている。同様に、Ａ、　ｃｈｒｙｓｏ ｇｅｎｕｍの株はセファロスポリン系抗生物質たとえばセファロスポリンＣ１デ アセチルセフ７０スポリンＣおよびデアセトキシセフ７０スポリンＣの製造に使 用されている。

ペニシリン類およびセファロスポリン類、両者の生合成は、３種類のアミノ酸、 Ｌ−ａ−アミノアジピン酸、Ｌ−システィンおよびＬ−バリンの酵素ＡＣＶシン テターゼによる縮合に始まる。生成したトリペプチドは酵素イソペニシリンＮシ ンテターゼによって環化されイソペニシリンＮを産生ずる。Ｐ＝　ｃｈｒｙｓｏ ｇｅｎｕｍにおいては、イソペニシリンＮは多数の６−アミツベニシラン酸誘導 体、たとえばそのフェニル酢ｒ！ＩＷＩＩ導体、ペニシリンＧ、およびそのフェ ノキシ酢酸誘導体、ペニシリンＶに変換される。Ａ、　ｃｈｒｙｓｏ　ｅｎｕ＋ ｎにおいては、インペニシリンＮは、ペナム構造のチアゾリジン環をセフェム構 造のジヒドロチアジン環に変換してデアセトキシセファロスポリンＣを与える酵 素デアセトキシセファロスポリンＣシンテターゼ（エキスパンダーゼとも呼ばれ る）によって修飾を受ける。これは、酵゛素デアセチルセファ０スポリンＣシン テターゼ（ヒドロキシラーゼとしても知られている）によって、デアセチルセフ ァロスポリンＣに変換される（Ａ、　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍでは、エキスパン ダーゼとヒドロキシラーゼの酵素活性は同−蛋白分子上に存在する）。デアセチ ルセファロスポリンＣはついで酵素ＤＡＣアセチルトランスフェラーゼによって 、セファロスポリンＣにアセチル化される。

本発明の方法によって菌のゲノムに挿入されるベクター　ＤＮＡは、硝酸レダク ターゼをコードするマーカー遺伝子と同時に、形質転換後に改良された株を生じ る少なくとも１種の工業的に重要な遺伝子を包含することが好ましい。すなわち 、導入される遺伝子はたとえば、抗生物質発酵の生産性または費用効率を改善す る遺伝子、したがってたとえば、ペニシリン類もしくはセファロスポリン類の生 合成経路に関与する遺伝子、生物体の発育の産生相に関与する調節遺伝子、生物 体の新規な基質での生育を可能にする遺伝子、または産生ずる代謝物を変える遺 伝子である。挿入される遺伝子は、酵素ＡＣＶシンテターゼ、イソペニシリンＮ シンテターゼ、デアセトキシセファロスポリンＣシンテターゼまたはＤＡＣアセ チルトランスフェラーゼである。上述の理由により、これらの遺伝子は形質転換 される種と同一の種から単離されることが好ましい。

本発明の方法の別の操作においては、菌のゲノムへの挿入が所望される遺伝子と 硝酸レダクターゼマーカー遺伝子が別のベクター上に配置される。選択マーカー を含有するベクターによって形質転換された宿主株がまた所望の遺伝子により、 それらが別個のベクター上に配置されていたとしても、形質転換される可能性は かなり高いからである。

本発明の操作によって調製されＩ；形質転換株は、その現存する遺伝子のひとつ たとえば生合成経路遺伝子の新しい遺伝子または多重コピーのいずれかを有し、 したがって親株に比べてペニシリン類またはセファロスポリン類の産生に操作上 の利点を有する。このような利点の例としては、発育速度またはペニシリンもし くはセファロスボリン力価の改善、安定性の改善、様々な培地上での発育特性の 改善、および産生物の抽出の難易度の改善がある。

本発明の方法によって菌ゲノムｊご挿入される所望の遺伝子は、本技術分野でよ く知られている慣用技術により、または本明細書ｌ二硝酸レダクターゼ遺伝子に ついて記載される方法と類似の方法を用いて調製できる。

本発明の方法によって形質転換されるＰ、　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍおよびＡ、 　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの適当な宿主細胞は、硝酸レダクターゼ構造遺伝子（ ｎｉａ　Ｄ）の発現を欠く株である。したがって、それらは唯一の窒素源として 硝酸塩を利用できず、そのため硝酸塩が唯一の窒素源である最小培地上では発育 できない。このような欠損株はしたがって、本発明の方法によって形質転換され 、選択マーカーとして硝酸塩レダクターゼ遺伝子を有する株から容易に識別され る。

硝酸レダクターゼ欠損株は低頻度ではあるが偶然突然変異によって生じる。また 、突然変異は標準的な突然変異誘発技術によっても誘発できる。このような技術 には、ＤＮＡベルに作用する化学的変異誘発物質たとえば５−ブロモウラシルお よび２−アミノプリンがあり、これらはＤＮＡ複時にそれぞれチミジンおよびア デニンの代わりにＤＮＡ配列に取り込まれ、誤複写を生じる。ヌクレオチドの化 学修飾はＤＮＡの対合を変化させ、ｌ−とえば亜硝酸はアデニン、シトシンおよ びグアニンを脱アミン化し、ヒドロキシルアミンは特異的にシトシンを攻撃しく Ｎ−６−ヒドロキシシチジンを形成する）、これがグアニンでなくアデニンと対 合するようになる。アルキル化剤、たとえばイオウもしくは窒素マスタード、エ チレンオキサイド、エチレンメタンスルホン酸およびＮ−メチル−Ｎ′−二トロ ーＮ−ニトロングアニジン（ＮＴＧ）はグアニン残基に作用して塩基対欠失を起 こさせる。染色体異常は電離性放射線！二とえばａ、βおよσγ線もしくはＸ線 、または非電離性放射線たとえば紫外線によっても起こる。

他の様々な化学的変異誘発物質、たとえばジエボキシド類、エトキシカフェイン およびマレイキドラジンも使用できる。

硝酸レダクターゼ欠損変異株は、塩素酸塩（たとえば４００＋ＩＩＭ塩素酸ナト リウム）と硝酸レダクターゼ非抑圧窒素源（たとえばグルタミン酸）を含をする 培地上で容易に確認できる。硝酸レダクターゼ酵素を産生できる株は塩素酸塩を 有毒な亜塩素酸塩に還元して細胞を死滅させるからである。ついで様々な窒素源 上での単純な発育試験を使用して、硝酸レダクターゼ欠損変異株は、他の塩素塩 抵抗性変異株から容易に識別できる（たとえばＢｉｒｋｅｔｔ＆　Ｒｏｗｌａｎ ｄｓ、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１２３：２８１．１９８１ 参照）。塩素酸塩培地上での選択ののち、単離された変異株は、突然変異の復帰 または抗生物質力価の喪失について、たとえばフラスコ振盪分析によって試験す ることも一ゼ欠損株の、硝酸レダクターゼマーカー遺伝子による形質転換は、そ の株に硝酸塩を唯一の窒素源として利用する能力を回復させる。

形質転換マーカーとして用いられる硝酸レダクターゼ遺伝子は、糸状菌の株のゲ ノムＤＮＡライブラリーから単離することができる。この株は、宿主として考慮 される株と同一種まｌ；は近縁種の株であることが好ましい。すなわち、Ｐ、　 　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍおよびＡ、　　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのほかに、Ａ ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ、　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇ ｅｒおよびＡｓ　ｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅのようなアスペルギルス種の 株を使用できる。ゲノムライブラリーは、総染色体ＤＮＡを制限酵素たとえばＳ ａｕ　３Ａｌを用いて部分消化することによって構築される（たとえば、Ｇａｒ ｂｅｒ　＆　’Ｉｏｄｅｒ、　　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　１３５：４１６．　１９８３参照）　、　１５〜２５ｋ ｂｐの範囲内の消化フラグメントを、たとえばスクロース勾配上サイズ分画によ って回収するのが便利である。消化７ラグメントはλＥＭＢＬ３またはλＥＭＢ Ｌ４のようなファージベクターに連結することができる。これらをついでファー ジ粒子１：　ｉｎ　ｖｉＬｒｏパッケージングを行ったのち、たとえば大腸菌の ような原核生物宿主内で増殖させて７アージライブラリーを作製する。このライ ブラリーは、他の糸状菌たとえばアスペルギルスの種から単離されたｎｉａ　Ｄ の全遺伝子またはフラグメントを用いてバクテリアローン上７７−ジ粒子のブレ ーティング後にスクリーニングされる。

また、ライブラリーは、本技術分野で公知の発現系または本明細書に記載する方 法と類似の系を用いて硝酸レダクターゼの発現についてスクリーニングしてもよ い。

この方法で選択されるＤＮＡ配列はそれ自体、硝酸レダクターゼ酵素をコードす る他のＤＮＡ配列を選択するプローブとして使用できる。それらのマーカー遺伝 子としての有効性は、Ｐ、　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｙｍまたはＡ、　ｃｈｒｙｓｏ ｇｅｎｙｍいずれかの硝酸レダクターゼ欠損株の形質転換に、それらを適当な組 換えＤＮＡ分子中で使用することによって明らかにされる。硝酸レダクターゼ酵 素をコードする単離ＤＮＡ配列は、形質転換される種と同一の種に由来すること が好ましい。

本発明の方法においては、硝酸レダクターゼ欠損宿主は、発現ベクター中に連結 された硝酸レダクターゼマーカー遺伝子および所望の遺伝子によって形質転換さ れる。

発現ベクターはその宿主株で高い形質転換頻度を示すことが好ましく、ゲノムへ 挿入される所望の遺伝子および硝酸レダクターゼマーカー遺伝子のコード要素が 宿主にトランスホームされたならば効果的に発現するように構築されなければな らない。

発現ベクターは、その後の遺伝子操作を容易にするため、原核生物宿主、好まし くは大腸菌内で複製可能でなければならない。大腸菌の増殖後、０」Ｄを含有す るベクターは、ハイブリダイゼーション選択を用い、他の近菌のゲノムへ導入さ れる所望の遺伝子がマーカー遺伝子と同じ発現ベクターに導入されるされる場合 には、所望の遺伝子は両遺伝子が発現されるようにベクター中に連結されなけれ ばならない。すなわち、その連結が硝酸レダクターゼ遺伝子またはその原核生物 宿主の複製および選択に必要な遺伝子の機能的活性を破壊しないようにしなけれ ばならない。これは、ベクターが所望の遺伝子が挿入される唯一の制限部位をも つことを保証することによって達成される。

硝酸レダクターゼ欠損宿主の形質転換に適当な発現ベクターは、染色体、非染色 体および合成りＮＡ配列の部分から構成され、たとえば既知の細菌プラスミドの 誘導体、たとえばＣｏｔ　　Ｅｌのような「天然」プラスミドまたはｐＢＲ３２ ２もしくはＰＭ８９のような「人工」プラスミド、あるいは酵母プラスミドたと えば２μである。他の適当なベクターとしては、７アージＤＮＡたとえばＭ１３ の誘導体もしくはバクテリオファージラムダ、または酵母ベクターたとえばＹｌ ｐ、　ＹＥｐもしくはＹＲｐの誘導体を挙げることができる。

このような発現ベクターはまた、硝酸レダクターゼマーカー遺伝子および所望の 遺伝子に有効に連結した少なくとも１個の発現調節配列によっても特徴づけられ る。

有用な発現調節配列の例には、酵母の解糖プロモーター（たとえば３−ホスホグ リセリン酸キナーゼ、ＰＧＫに対するプロモーター）、酵母の酸性ホスファター ゼ（Ｐｈｏ　５）もしくはアルコールデヒドロゲナーゼ−２（ＩＬＱｃＡ）のプ ロモーター、またはグルコアミラーゼプロモーターが包含される。調節配列はマ ーカー遺伝子または所望の遺伝子と分離していることが好ましく、これによって 異種調節配列を用いて発現ベクターを構築する必要が回避される。

発現ベクターはまた所望により、好ましくは形質転換される種と同一種からのミ トコンドリアまたは染色体ＤＮＡのフラグメントに由来する自己複製配列（ａｒ Ｓ）によって特徴づけることもできる。

本発明の方法による硝酸レダクターゼ欠損宿主、宿主細胞の形質転換のためには 、細胞をまずプロトプラストに変換するか、または、たとえばＤｎａｗａｌｅら 、ＣｕｒｒｅｎｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、　８　：　７７（１９８４）に記載されて いるように金属塩たとえば酢酸リチウムで処理する。本技術分野でよく知られて いる他の形質転換法には、プロトプラストのエレクトロポレーションまたはりボ ゾーム内包ＤＮＡ処理、マイクロインジェクション、およびＤＮＡを菌細胞内に 導入する他の物理的手段がある。

好ましい方法はプロトプラストを使用する。その形成の前に、宿主株は常法によ り、たとえば振盪フラスコ中で適当な集団サイズまで培養する。培養培地の性質 はプロトプラスト収率に影響するが、一般的にはＰ、　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕ＋ ｏまたは＾、ＣｈｒｙＳＯｇｅｎｕｍの生育に慣用されるものでよく、もちろん 硝酸塩に代わる別の窒素源たとえばグルタミン酸を添加する。ついで菌糸体を濾 過または遠心分離によって回収し、洗浄して培養培地を除去する。回収された菌 糸体は所望によりチオール類を還元状態に維持するための試薬（たとえばジチオ スレイトール、０．００５Ｍ〜０．１Ｍ、　ｐＨ５〜ｐＨ８，５）で処理しても よく、これはプロトプラストの生成を補助し、したがって収率を改曽てきる。

次に、菌糸体を、培地のｐＨおよび浸透圧を維持するための適当な緩衝液の存在 下に、１種または２種以上の酵素プレバレージョンで処理する。適当な酵素プレ バレーシコンは市販品があって、たとえばＮｏｖｏｚｙａ＋　２３４またはＮｏ ｖｏｚｙｍ　２４９である（Ｎｏｖｏ、　　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ、　Ａ／Ｓ　ＤＫ 　２８８０Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、　Ｄｅｎｍａｒｋ）　ａ　これらのプレバレー ジョンは数種の酵素たとえばセルロース、プロテアーゼ、シチナーゼおよびペク チナーゼを含有する不確定の混合物である。

菌糸体は酵素プレバレージョンと、満足できる収率のプロトプラストが得られる までインキュベートする。インキュベーション培地のｐＨおよび温度は使用した 酵素についての指示に従って選択され、たとえばＮｏｖｏｚｙｍ　２３４の場合 、ｐＨ約５．８、約２６℃で約３時間である。通常の酵素濃度は０．０５〜２０ ｔａｇ／　Ｑの範囲で、Ｎｏｖｏｚｙｍの場合５ｍｇ／＋＊ｆｆである。

適当な緩衝液は、たとえば２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐａｓ、ｓである。インキュ ベーション培地の浸透圧は、プロトゲラストの安定性を保証できる、たとえば０ ．５Ｍ　−１，０Ｍ当量の範囲である。浸透圧は無機塩たとえば塩化カリウムも しくは硫酸マグネシウムを用い、または糖もしくは糖アルコールで調整される。

プロトプラストは菌糸屑から、焼結ガラスフィルターもしくはコドンウールを通 して濾過して、および／または遠心分離たとえば３．０００〜４　、０００ｒｐ ■、１０〜２０分により分離される。プロトプラストはペレットとして回収され 、浸透圧安定溶液（たとえば０．７Ｍ塩化カリウム）中で洗浄したのち、浸透圧 安定溶液中に１０’〜１０８プラスト７ｍｍの濃度で再懸濁する。

単離プロトプラストの形質転換は、上述のベクターを、１０’個のプロトゲラス トあたりベクターＤＮＡ約ｌθ〜２０μ９の割合で用いて行われる。形質転換の 確率を最大にするため、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を加える。ＰＥＧは １．０００〜ｓ、ｏｏｏの範囲たとえば約４，０００の分子量のものが好ましい 。ＰＥＧは、水性緩衝液中好ましくは濃度２０〜６０％たとえば約５０％の溶液 として使用される。ｐｕは５〜ＩＯの範囲が適当であり、好ましくは５．８〜７ ．５である。この過程は濃度範囲０．００２Ｍ　−１，０Ｍのカルシウムイオン によって好ましく支持され、Ｉ；とえば０．０５Ｍの塩化カルシウムが使用され る。形質転換は０〜２５°Ｃの温度範囲、好ましくは室温で、１時間まで行うの が有利である。

インキュベーションは、さらにＰＥＧを添加して反復してもよい。形質転換頻度 は最初のインキュベーションを中で加温しても形質転換頻度は改善される。プロ トプラストは緩和な遠心分離（たとえば２　、０００ｒｐｍ、５〜ＩＯ分）で収 穫し、少量の適当な浸透圧安定緩衝液（たとえば１．０Ｍソルビトール数１１Ｑ ）中に再懸濁する。

形質転換体の選択は、形質転換操作を受けた菌細胞を形質転換選択培地上でブレ ーティングすることによって容易に達成される。この場合の培地は唯一の窒素源 を硝酸塩、たとえば硝酸ナトリウムのような硝酸金属塩とした最小培地でなけれ ばならない。必要に応じて、ｔ；とえばプロトプラスト形質転換が起こった場合 には、培地は、形質転換コロニーが、非硝酸塩利用自然増殖から旺盛番こ生育す るためには１０〜３０℃で５〜２０日のインキュベーションを要する。

本発明の方法によるＰ、　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍまたはＡ、、　ｃｈｒｙｓｏ −ｇｅｎｕｍの硝酸レダクターゼ欠損宿主株の形質転換の好ましい方法は以下の 工程からなる。

（ｉ）　　意図された宿主と同一種または近縁種の菌の細胞から単離される全Ｄ ＮＡの１種または２種以上の制限酵素たとえば酵素熟且３Ａｌによる消化（ｉ） 選ばれｌ；原核生物、好ましくは大腸菌の感染およびその生物での複製が可能な ことが既知のバクテリオファージベクターの（ｉ）で得られｔ；制限７ラグメン トとの融合体の調製 （ｉｊ）　　（ｉｉ）で調製された組換えバクテリオファージベクターのｉｎ　 ｖｉｔｒｏパッケージング、選ばれた原核生物細胞の感染および細菌ローン上プ ラークとしてクローン７アージ粒子の回収 （ｉｖ）　　（ｉｉ）で得られた組換えクローンファージ粒子の、硝酸レダクタ ーゼ遺伝子についての、様々な種からの他の既知硝酸レダクターゼ遺伝子とのホ モロジーによる、または機能活性による選択 （Ｖ）　　組換えファージの適当な制限フラグメントの、選ばれた厚核生物好ま しくは大腸菌で形質転換および複製可能なことが既知のベクターへのサブクロー ニングによる硝酸レゼクターゼ遺伝子の回収（ｖＩ）所望の工業的に重要な１種 または２種以上の遺伝子、とくにセファロスポリンまＩ；はペニシリン生合成に 関与する生合成または調節遺伝子の（ｖ）で得られたベクターとのＤＮＡフラグ メントの好ましくは融合による挿入（これは両遺伝子が発現されるように、すな わち融合が硝酸レゼクターゼ遺伝子の機能活性または原核生物宿主内での複製お よび選択に必要な機能を破壊しないように行われる） （ｖｉｉ）　　付加的な、ただし必須ではない工程として、他の構成りＮＡフラ グメント、たとえば酵母または他の糸状菌で自己複製能を有するＤＮＡフラグメ ントを（ｖ）および（ｖｉ）に記載したベクターに融合させることもできる。

（ｖｉｉ）　　上記工程（ｉｖ　−ｖ社）で製造された原核生物トランスホーマ ント中に得られ、工業的に重要な遺伝子および（ｉｉ）と（ｉｖ　）の手段で確 認された硝酸レゼクターゼ遺伝子を含有するベクターを用いる、Ｌｃｈｒｙｓｏ ｇｅｎｕｍまたはＡ、　　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの硝酸レダクターゼ欠損宿主 株の形質転換。この形質転換は、高い浸透圧強度の培地中細胞壁成分の酵素消化 による菌ル処理によるプロトプラストへのベクターの導入によって行われるのが 好ましい。

（ｉｘ）　　新たに導入されＩ；硝酸レダクターゼ遺伝子を選択マーカーとして 発現する菌トランスホーマントの、唯一の窒素源として硝酸塩を含有する培地上 での選択。好ましい形質転換系（ｖｉ）では、この培地はプロトプラスト再生を 可能にする高い浸透圧強度を有す工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、制限フラグ メントの（Ｖ）に記載したベクターへの直接融合および（ｉｖ　）におけるｎｉ ａ　Ｄについてのスクリーニングに置換できることは明らかである。また、工業 的に重要な１種または２種以上の遺伝子は別個のベクター残基または制限フラグ メントに配置し、工程（ｖｉｉ　）は別個のベクターＤＮＡ残基の共形質転換、 ｎｉａ　　Ｄ遺伝子の存在の選択および工業的に重要な遺伝子の取り込みのハイ ブリダイゼーションまたは機能活性によるスクリーニングとして実施できること も理解されよ本発明の方法によって製造された形質転換細胞はついで、醗酵によ るペニシリン類まＩ；はセファロスポリン類の生産に使用できる。したがって、 本発明は他の態様として、上述の本発明の方法によって製造されたＰ、　ｃｈｒ ｙｓｏｇｅｎｕｍまたはＡ、　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換株を培養し、 培養培地から所望のペニシリンまｌ；はセファロスポリンを単離することからな るペニシリンまたはセファロスポリンの製造方法を提供する。

本発明はさらに他の態様として、硝酸レダクターゼをコードするマーカー遺伝子 を包含するベクターＤＮＡを提供する。この場合、マーカー遺伝子はその遺伝子 の発現に対する調節配列と作動性に連結され、硝酸レダクターゼをコードする遺 伝子および調節遺伝子はいずれも、形質転換が意図される宿主、Ｐ、　　ｃｈｒ ｙｓｏｇｅｎｕｍまたはＡ、　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍと同一種の細胞に由来す るものであることが好ましい。とくに好ましいベクターＤＮＡは、硝酸レダクタ ーゼをコードするマーカー遺伝子に加えて、上述のように、Ｐ、　ｃｈｒｙｓｏ ｇｅｎｕｍまたはＡ、　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換によって、改良株を 与える少なくとも１種の遺伝子を含有する。

本発明は他の態様として、硝酸レダクターゼをコードするマーカー遺伝子がその 遺伝子の形質転換宿主細胞内での発現の調節配列と作動性に連結されて包含され るベクターＤＮＡを含むＰ、　　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍまにはＡ、　　ｃｈｒ ｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換細胞を提供する。

以下の実施例は本発明はを例示するものであって、本発明を限定するものではな い。実施例中には以下の略号が使用される：　ＥＤＴＡ−スチレンジアミン四酢 酸、ＥＧＴＡ−エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ、Ｎ ’−四酢酸、　５ＤＳ−ドデシル硫酸ナトリウム；　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ−１−リ ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩；ＤＴＴ−ＤＬ−ジチオスレイトー ル、　ＡＴＰ−アデノシリン三リン酸、　５ＳＣ−食塩クエン酸ナトリウム；　 ＰＥＧ−ポリエチレングリコール、　５ＳＰＥ−食塩リン酸ナトリウム／ＥＤＴ Ａ　；　ｋｂ−ＤＮＡのキロ塩基対。

実施例　ｌ プラスミドｐＮ　ＩＩ　ＡはａｒｇＢ遺伝子ベースのクローニングベクターｐｌ ＬＪ　１６（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら、ＥＭＢＯＪ、　４：　１３０７〜１３１１ ゜１９８５）中にそのｎｉｉ　Ａ４　（硝酸レダクターゼ遺伝子）、シ」。

伝子（硝酸レダクターゼ遺伝子）中に及んだ多数の遺伝的に同定された欠失につ いてざらに相補実験を行い、の制限酵素地図と相対させて第１図に例示する。こ の地図は単なる例示であって限られた数の制限部位が示されていて、特定の制限 酵素についてはすべての位置が地図化されていない場合もある。

ｐＮＩ［ＡのＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、再すゲーションによりプラスミドｐ ＳＴＡｔを構築した。この処理はＥｃｏＲ１部位の一方の側まですべてのＤＮＡ を欠失させる手段を提供しく第１図に例示）、シたがってすべての虹１１および １上１遺伝子コ一ド配列が除去された。ｐｓＴＡＩ　ＤＮＡ内からの２．４ｋｂ かって、さらに単離されたクローンを完全なｎｉａ　Ｄ遺伝子の存在についてス クリーニングする手段を与える。プラスミドｐＳＴＡ　１は、特許手続の目的で の微生物の寄託の国際的認識に関するブダペスト協定に基づいて、Ｎａｔ　１ｏ −ｎａｌ　Ｃａ１ｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩｎｄｕｓＬｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａ ｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ。

１３５　Ａｂｂｅｙ　Ｒｏａｄ、　Ａｂｅｒｄｅｅｎ、　ＡＢ９８ＤＧｌ：　１ ９８９年１月２３日、受入番号ＮＣｌ３４０１０２として寄託された。

ｐｓＴＡＩ　　ＤＮＡの一部１０μｇを１ＸＸｂａ±緩衝液条件（１０１Ｔｒｉ ｓ−ＨＣＱ、ｐＨ７，５，７，５ｍＭ　ＭｇＣＱ、、１００＋＋＋Ｍ　ＮａＣＱ 、　７　ｍｍ２−メルカグトエタノール）に置き、１００単位のＸｂａＩ酵素（ Ａｏ＋ｅｒｓｈａｍ、　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｌｃ、　Ｗｈｉｔｅ　 Ｌｉｏｎ　Ｒｏａｄ。

Ａｍｅｒｓｈａｍ、　Ｂｕｃｋｓ、　ＨＦ２９ＬＬ）で消化した。制限生成物を １％低融点アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋ｍ１ｃａｌ　Ｃｏ、、Ｆａｎ ｃｙＲｄ、　Ｐｏｏｌｅ、　Ｄａｒｓｅｔ、　ＢＨ１７７ＮＨ）上、標準条件の 電気泳動によって分割した。２．４ｋｂ　ＸｂａＩ　７ラグメントを含むＤＮＡ バンドを切り出し、４０℃で再融解し、ＤＮＡをフェノール抽出およびエタノー ル沈澱で回収した。この物質はｎｉａ　Ｄ特異的プローブとして完全な機能性岨 １１遺伝子を単離するために使用した。

硝酸塩を旺盛に利用する＾、ｎ　ｉｄｕ　Ｉａｎｓ株をアスペルギルス完全培地 、ＡＣＭ　（Ｃ１ｕｔｔｅｒｂｕｃｋ、　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｒ　Ｇｅｎｅｔ ｉｃｓ（Ｋｉｎｇ編）、４４７〜５１０頁、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　１９ ７４）中２８℃で生育させた。適当な株は、様々な培養菌体コレクション、たと えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　 （ＡＴＣＣ）１２３０１　　Ｐａｒｋｌａｗｎ　　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌ ｌｅ、ＭＤ　　２０８５２．ＵＳＡ：Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ　　Ｍｙｃｏｌ ｏｇｉｃａｌ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　　Ｆｅｒｒｙ　　Ｌａｎｅ。

Ｋｅｙ、５ｕｒｒｅｙ、ＴＷＡ　　３ＡＦ　；　Ｆｕｎｇａｌ　　Ｇｅｎｅｔｉ ｃｓ　　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｒｅ。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　　５ｔａｔｅ　　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｈｕａ＋ｂｏ ｌｄｔ、Ａｒｃａｔａ、ＣＡ９５５２１、　ＵＳＡから広く入手できる。

−夜生育させたのち濾過して菌糸体を収穫し、液体窒素中で凍結し、−夜凍結乾 燥した。この物質はＲａａｄｅｒ　＆Ｂｒｏｄａの方法（Ｌｅｔｔ、　Ａｐｐｌ ｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　ｌ　：　１７〜２Ｌ１９８５）の改良法を用い て高分子量ＤＮＡを単離するために使用した。凍結乾燥した菌糸体（２，５９） を０．１容の砂とともに粉砕し、２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｇ、　ｐＨ８，５ 中２５＋ｓＭ　ＥＤＴＡ、　０．５％ＳＤＳおよび２５０ｍＭ　ＮａＣＱからな る抽出緩衝液５ｍｄで水和した。フェノール（抽出緩衝液で平衡化）　３．５ｍ １２を加え、混合し、ついで１．５ｓｌのクロロホルム／イソアミルアルコール （２４：ｌ）を加え、次にこの溶液を渦動させた。分解物を室温、１２０００９ で１時間遠心分離し、ついで核酸を水相から０．６容のプロパン−２−オールで 沈澱させた。放置して得られた歌いペレットを７０％エタノール１藁ａ中で洗浄 し、ＴＥ緩衝液（１０＋ａＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆ、　ｐＨ８，０、ｌ　ｍＭ　 ＥＤＴＡ）１＋ｗａ中ですすいだ。７．５Ｍ酢酸アンモニウムを２．５になるよ うに加えてＲＮＡを沈澱させ、４℃で１５分間インキュベートした。上述のよう に短時間遠心分離したのち、ＤＮＡを水相から２容のエタノールで沈澱させた。

ペレットを７０％エタノール中で洗浄し、乾燥し、ｌ　ｍｊ２ＴＥ緩衝液中です すいだ。収量は約１　ｒｒｒｙであった。

上述のようにして得られたＤＮＡを酵素５ａｕ３Ａ　Ｉ　（Ａｍｅｒｓ−ｈａｍ 　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｌｃ）で部分制限した。２００μｓの部分を ５００ｕｆｆ容量中Ｉ　Ｘ　５ａｕ３Ａ　Ｉ緩衝液条件（ｌｏｍＭ　Ｔｒｊｓ− ＨＣＬｐＨ７，５，７ｍＭ　ＭｇＣＱ２．２０ｍＭ　ＮａＣＱ）に調整し、つい で１．５単位の酵素により３７℃で１時間消化した。ＥＤＴＡをｌｏｍＭまで加 えて反応を終結させ、ついで反応生成物を、予め形成させた３８ｍＱスクロース 勾配（ＩＭ　ＮａＣＱ、　　５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ ｐＨ８，０中ｔｏ〜４０％スクロース）を通してサイズ分画し、５Ｗ２８０−タ ー（Ｂｅｃｋ＋ｎａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＵＫ）Ｌｔｄ。

Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　Ｒｄ、　Ｈｉｇｈ　Ｗｙｃｏｍｅ、　Ｂｕｃｋｓ、　ＨＰ１ ２４ＪＬ）を用い、９００ｈ、２１℃で２０時間遠心分離した。勾配を０　、５ ｍｆｆ部分に分画し、サイズ範囲１５ｋｂ〜２５ｋｂ　（アガロースゲル電気泳 動によって測定）のＤＮＡをプールし、酢酸ナトリウム０．３Ｍに調整し、２容 の水冷エタノールを加えてエタノール中に沈澱させ、氷上で３０分間インキュベ ートした。遠心分離で回収されたＤＮＡベレットをＴＥ緩衝液２５μα中ですず いラムダクローニングベクターλＥＭＢＬ３（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆら、Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１７０：　８２７〜８４２．１９８３）はＢａｍ旧消化腕部 としてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｉｎｃ　（１１０９９Ｎｏｒｔｈ　Ｔｏｒｒｅｙ 　Ｐｉｎｅｓ　Ｒｄ、Ｌａ　Ｊｏ−１１ａ、　ＣＡ９２０３７．　ＵＳＡ）から 入手した。Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　ＤＮＡの５ａｕ３Ａ　Ｉフラグメント（ｌ μｇ）およびλＥＭＢＬ３腕部（２μｇ）を２０μＱのリゲーション緩衝液（２ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（４％ｐＨ７，６，１０ｍＭ　ＭｇＧ（１，，１０ｍＭ　 ＤＴＴ、　０．６ｍＭ　ＡＴＰ）中に混合し、５単位特表千３−５０４３３４　 （５３） のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともに１４°Ｃで１８時間イン キュベートした。

リゲーション生戊物を市販のＧｉｇａｐａｃｋ　Ｗｉｔ　（Ｓｔｒａｔａｇ−ｅ ｎｅ　Ｉｎｃ）を用いて７ア一ジ粒子中にｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングを行 った。パッケージングされたファージを大腸菌０３５８株中で増殖させ、１．５ Ｘ　１０’ブラ゛−り形成単位（ｐｆｕ）の組換え７アージライブラリーを作製 した。

約３　Ｘ　ＩＱ’ｐｆｕのし１鰭ｕ　Ｊａｎｓ組換え７フージライブラリーを帆 ５ｍαのｌｏｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，中、ＩＸ　１０’個の大腸菌０３５８Ｍ胞と混合 した。３７℃で１５分間インキュベートしたのち、混合物を２５ｉ＋ｆｆの熔Ｉ Ｉ＆（４２℃）軟質アガール（ＬＢ＋　ｌｏｍＭ　Ｍｇ５Ｏａ＋０．６％アガー ル）に加え、ＬＢ培地＋１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ＊含有２０Ｘ２０ｃｒａベトリブレ ートを覆うのに使用した（ＬＢ（Ｌｕｒ　１ａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地は１％バ タトートリプトン、０．５％酵母エキス、０，５％ＮａＣＱｆ　ｐＨ７，ｏで含 有する。大腸菌操作の標準技術はＭａｎｉａｔｉｓら（Ｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８ ２）によって記載されている〕。−夜インキユベートしたのち、プレートに二重 に押しつけた濾紙をＨｙｂｏｎｄ−Ｎ膜を用いて標準技術によって採取した。濾 紙をそれぞれブレインキュベーション緩衝液（６ＸＳＳＣ，５Ｘデンハルト溶液 、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および変性サケ精子ＤＮＡ）２５ Ｉ＋＋Ｑ中、６５℃で６時間インキュベートした。　ＳＳＣは０．１５ＭＮａＣ Ｑ、　０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム；デンハルト溶液はポリビニルピロリド ン、ウシ血清アルブミン、フィコール（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 ）各０．０２％である。

工程ｌで製造された、ｐｓＴＡｌの２．４ｋｂ　Ｘｂａｌ　７ラグメント（ｎｉ ａ　　Ｄ特異的ＤＮＡフラグメント）を、市販のキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を 用い、ニックトランスレージ３ン法によって３２ｐで標識した。放射性標識７ラ グメントは５ｅｐｈａｄｅｘＧ−５０ニツクカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫ Ｂ、　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

Ｍｉｄｓｕｍｍｅｒ　Ｂａｕｌｅｖａｒａ、　Ｍｉｌｔｏｎ　Ｋｅｙｎｅｓ、　 Ｂｕｃｋ　Ｍｇ９３ＨＰ）から溶出して導入されなかった標識を除いて回収し、 新鮮なハイブリダイゼーション緩衝液（ブレＩ・イブリダイゼーション緩衝液と 同様に調製）　２５ｍ＜２に加えた。ノ＼イブリダイゼーションは６５℃で一夜 行った。ついで濾紙を標準条件を用いて洗浄して過剰のプローブを除去し、最後 に帆ｌＸ５ｓｃ、　０．１％ＳＤＳにより６５℃で洗浄し、乾燥したが紙を一２ ０℃で４時間Ｘ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｏ＋　Ｂ−ｍａｘ。

Ａｍｅｒｓｈａｍ）に露出した。

陽性プラークの候補を採取し、もつと低いブレーティング密度で（９ｃｍ径のプ レートあたり約１００プラーク）再精査した。この方法で単離された１（ｉの陽 性クローン（λＡＮ８ａ）を以後の使用に保有した。このクローンは第１図に例 示したようなＡ、ｎ１ｄｕｌａｎｓの全ｎｉａ　Ｄ遺伝子をコードし、本発明の 形質転換プロトコールの外米性ＤＮＡのソースとする。

工程４：機能性Ａｓｐｅｒｇ４目ｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｎｉａ　Ｄ遺伝子クローン の単離 硝酸塩利用のＡ、ｎｉｇｅｒ株を工程２に記載したのとほぼ同じ完全培地中で生 育させた。適当な株はＡＴＣＣ，ＣＭＩ、ＦＧＳＣまたは他の培養体コレクショ ンから広く入手できる。

工程２に記載した方法により、菌糸体を収穫し、ＤＮＡを単離した。

ｎｉａ　Ｄ特異的プローブとしてｐｓＴＡｌの２．４ｋｂ　Ｘｂａ　Ｉフラグメ ントを用いたＡ、ｎｉｇｅｒゲノムＤＮＡのサザンブロツテイングにより、Ｅｃ ｏＲＩで消化しｔ；場合、Ａ、ｎｉｇｅｒ硝酸レダクターゼ（ｎｉａ　Ｄ）遺伝 子は約２．８８よび２　、　ＯｋｂのＤＮＡフラグメント上に存在することが明 らかにされた。ハイブリダイゼーションおよび３２Ｐ標識プローブの製造の実験 条件は工程３の記載とほぼ同じであった。バックグランド、非ハイブリダイゼー ション放射能は、最終塩濃度２Ｘｓｓｃ、　５６℃まで洗浄しで除去した。

＾、ｎｉｇｅｒゲノムＤＮＡ（５０ｐｇ）をｌ　Ｘ　５ａｕ３Ａ　Ｉ緩衝条件に 置き、２００μＱ容量中の２単位の５ａｕ３Ａ　Ｉにより３７℃で３０分間消化 した。６〜１２ｋｂの範囲の７ラグメントを１％アガロースゲルからニトロセル ロースを介して単離した（Ｚｈｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　３：　１０１４ 〜１０１６．１９８５）。

広く利用できるプラスミドベクターｐＵＣ８（Ｖｉｅｉｒａ　＆Ｍｅｓｓｉｎｇ 、　Ｇｅｎｅ　１９；　２５９＝２６８．１９８２）をｌＸＢａｍＨＩ緩衝液条 件（ＩＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（４，ｐＨ８，０，７０１Ｍ　ＭｇＣＱ、、１００ ｍＭ　ＮａＣＱ。

２ｍＭ　２−メルカプトエタノール）に調整し、１０μＱ容量中１０単位のＢａ ｍＨＩにより３７℃で２時間消化した。酢酸アンモニウムを２Ｍまでおよび２容 の冷エタノールを添加してＤＮＡを沈澱させた。遠心分離で回収されたＤＮＡペ レットを２０ｕＱの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（２ｐＨ８，０、Ｏ，１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡに取り、０．５単位のアルカリホスファターゼＣＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　 ＭａｎｎｈａｉｍＧｍｂＨ，、Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　３１０１２０　Ｄ−６８００、 Ｍａｎｎｈｅｉｍ　３１　ＦＲＧ）とともに３７℃で１時間インキュベートした 。ＥＧＴＡを１０ｍＭまで加え、６５℃に４５分間加熱して、ホスファターゼを 不活化した。酢酸ナトリウムを０．３Ｍまでおよび２容の冷エタノールを加えて ＤＮＡを沈澱させた。

Ａ、ｎｉｇｅｒ　Ｓａｕ　３ＡＩフラグメント約２５０ｎｇを含むサンプルおよ び脱リン酸化ＢａｍＨＩ切断ｐＵＣ３ベクター１１００ｎを混合し、工程２の記 載とほぼ同様にしてリゲーションさせた。

リゲーション生成物を使用して、広く入手できる大腸菌ＤＨ５株を形質転換して 、硝酸レダクターゼ構造遺伝子をもつことが期待されるフラグメントに富んだ約 ２ＸｌＯ’個のＡ、ｎｉｇｅｒ　　ＤＮＡライブラリーを作製した。このライブ ラリーを各１５００〜３０００個のクローンを含む９個のプールに分けた。プー ルされた単離体を１００μｇ／ｌａＱのアンピシリンを補充したＬＢ培地中Ｉこ 生育させ、ＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉｓ　＆Ｄｏｌｙのアルカリ性ＳＤＳ法の改良 法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出）でＤＮＡを単離した。単離されたＤＮＡを、工 程ｌの記載と同様にして、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、電気泳動によ って分別し、プロッティングし　３２ｐ標識ｎｉａ　Ｄ特異的なｐＳＴＡ　Ｉの ２．４ｋｂ　Ｘｂａ　ｒフラグメントをプローブとして精査し、単離しｔ；。プ ールのひとつがこのプローブに高いホモロジーを示すフラグメントを含んでいた 。このプールを用い、再びプローブとしてｐｓＴＡＩ　　ＤＮＡ７ラグメントを 使用してＭａｎｉａｔｉｓら（前出）の記載に従い、標準コロニーハイブリダイ ゼーション１こよってｎ　ｉ　ａ　　Ｄ　特ｊ％　的クローンを単離しｔ；。こ の方法で２個のクローンが単離された。

このひとつを以後能の試験に使用し、ｐｓＴＡｌｏと命名した。

ｐｓＴＡｌｏの制限地図（第２図）は、ｐｓＴＡｌｏ中に存在するしｎｉｇｅｒ 　ＤＮＡ７ラグメントに対するｎ１ａＤ遺伝子の概略の配置を例示する。この地 図は単に例示したものであって、限られた数の制＠部位のみが示され、特定の制 限酵素の部位はすべてが地図化されていない場合がある。

程２の記載と同様にしてλＥＭＢ　３ベクター中に作製した。

最初のファージライブラリーは約Ｉ　Ｘ　１０’ｐｆｕを含有した。

約４　ＸＩＯ’ｐｆｕを、広く入手できる大腸菌株ＮＭ２５９中で増殖させ、工 程３の記載と同様にして、ｎｉａ　Ｄ遺伝子配列の存在をハイブリダイゼーショ ンによってスクリーニングした。Ａ、ｎ１ｄｕｌａｎｓ　ｎｉａ　Ｄ遺伝子の部 分を含有するｐＳＴＡｌの２．４ｋｂ　Ｘｂａｌフラグメントを工程ｌの記載と 同様にして単離し、ハイブリダイゼーショングローブとして使用した。この方法 で２種のクローンがｎｉａ　Ｄ遺伝子配列を含むものとして確認された。λ５Ｔ Ａ６２と命名されたこのひとつを以後のサブクローニング実験に使用した。

λ５ＴＡ６２から単離されたＤＮＡ約５μ９をｌｘシリ」−緩衝液条件（１０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２．　ｐＨ８，０，１５０ｍＭ　ＮａＣＱ、　１０ｍＭ　 ＭｇＣＱｘ、１ｍＭ２−メルカグトエタノール）に調整し、５０μＱの反応容量 中５０単位の５ａｌＩにより３７°Ｃで２時間消化した。消化されたフラグメン トを０．８％アガロースゲル上で分割し、８−２ｋｂフラグメントを工程４の記 載と同様にして単離した。このフラグメントは、Ａ、ｎ１ｄｕｌａｎｓ　ｎｉａ 　Ｄ遺伝子プローブとのホモロジーによりＡ、ｏｒｙｚａｅ　ｎｉａ　Ｄ遺伝子 をもつことがわかった。

広く入手できるプラスミドベクターｐＵｃ１ｇ　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏ ｎら、Ｇｅｎｅ、　３３＝　１０３〜ｌ１９．１１８５）１μ９を同様にしてｌ Ｏ単位の５ａｌＩで消化した。単離された８、２ｋｂ　Ａ、０ｒｙＺ−ａｅＳａ ｌ１７ラグメント約１１００ｎ量と５ａｌＩ消化ｐＵＣ１８を、工程２の記載と 同様に、１単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いてリゲーシミンさせた。リゲーシ ジン生成物を用いて、広く入手できる大腸菌ＤＨ５株を形質転換した。アンピシ リン抵抗性コロニーを、Ｍａｎｉａｔｉｓら（前出）によって記載されたＢｉｒ ｎ　＆　Ｄｏｌｙの改良アルカリＳＤＳ法により、所望のインサートＤＮＡを含 むプラスミドの存在についてスクリーニングした。λ５ＴＡ６２からの８．２ｋ ｂ　Ｓａｌ　Ｉ　７ラグメントをもつプラスミド単離体が同定され、ｐＳＴＡ　 １４と命名された。ｐｓＴＡＩ４中に存在するＡ、ｏｒｙｚａｅ　ＤＮＡの制限 地図を第３図に示す。この地図は単に例示したものであって、限られた数の制限 部位のみが示され、特定の制限酵素の部位はすべてが地図化されていない場合が ある。

工程６　二Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　ｎｉａ　Ｄ−変 異体の充したアスペルギルス完全培地（ＣＩｕＬｔｅｒｂｕｃｋ、前出）上で生 育させ、１６５％アガールで固化した。０．０１％Ｔｖｅｅｎ８０中に懸濁して 分生子を収穫した。約１０１個の分生子を、Ｂｉｒｋｅｔｔ　＆　Ｒｏｗｌａｎ ｄｓ　（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　１２３　：　２８１〜２８５゜１９ ８１）の記載に従い、６ｍＭＬ−アルギニンおよび９４ｍＭＮａＣＱＯ，を補充 したアスペルギルス最小培地、ＡＭＭ（Ｃ１ｕｔｔ−ｅｒｂｕｃＬ前出）をベー スとした亜塩素酸選択培地に分散させブレーティングを行った。硝酸塩を唯一の 窒素源として利用できない変異体のこの亜塩素酸選択の根拠についてはよく知ら れていて、Ｃｏｖｅの総説があるＣＢｉｏｌ、Ｒｅｖ。

５４　：　２９１〜３２７．１９７９）。

旺盛に生育したコロニーを採取し、自然発生亜塩素酸抵抗変異体の例として精製 した。単離体について、分生体を２０ｍＭ硝酸ナトリウム含有ＡＭＭ上でブレー ティングし、生育を評価して硝酸塩利用への復帰を試験した。硝酸塩グロフィシ エント単離体／添加分生子の復帰率が１０１未満のものについて、各種窒素源上 での生育をさらに試験した（Ｂｉｒｋｅｔｔ　＆　Ｒｏｗｌａｎｄｓ、前出）。

亜硝酸塩（１，５ｍＭ）またはアデニン（０，６ｍＭアデニン塩酸塩）上では生 育したが、硝酸塩では生育できなかったものを硝酸レダクターゼ遺伝子変異体と みなし、ｎｉａ　Ｄ−と命名した（　Ａ、１ｉｄｕｌａｎｓの基準と同様）。

これらの単離体の硝酸レダクターゼ活性を、Ｃｏｖｅの生化学的方法（Ｂｉｏｃ ｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　１１３：　５１〜５６．１９６６）を用 いてさらに試験した。これらの検定では２０ｍＭ　ＮａＮ０゜補充ＡＭＭ培地中 、２６℃、２９Ｏｒｐｍにおいて２６時間、菌糸体を生育させた。ｎｉａ　Ｄ型 の単離体は最低の硝酸レダクターゼ活性を示したが、一方Ｑ１７６は正常レベル の酵素を含有していた。

Ｓｌ　９００と命名した株は、このような自然発生ｎｉａ　Ｄ’″変異体の例で あり、ブダペスト協定の条件によりＣｏｍｍｏｎ−ｗｅａｌｔｈ　Ｍｙｃｏｌｏ ｇｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｃｏ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに、１９８ ９年１月２３日、受入番号ＣＭＩＣＣ３３０１７７として寄託し５１９００変異 株の分生予約１０”個を１００ｔＱのＡＣＭ中振盪しながら（２２０ｒｐｍ）２ ６℃で４２時間生育させた。菌糸体をＷｈａｔ−＋ｎａｎ　Ｎｏ、　ｌ濾紙上に 濾過して回収し、Ｎｏｖｏｚｙｍ　２３４（Ｎｏｖ。

１ｎｄｕｓｔｒｉ、　Ａ／Ｓ　ＤＫ２８８０　Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、　Ｄｅｎｍ ａｒｋ）をｌＱｉ＊ｇ／　ｗｒＱ含有する９、７Ｍ　ＫＣ（１，１０ｍＭリン酸 緩衝液ｐＨ８，５に再懸濁した。この緩衝液は細胞湿重量１ｇあたりＬＯ＊Ｑ割 合で加えた。細胞懸濁液を穏やかに振盪しながら２６℃で２時間インキュベート し、ついでプロトプラストを焼結ガラスフィルター（孔度２）を通して濾過して 大量の菌糸屑から分離した。プロトプラストはペンチトップ遠沈管中、４０００ ｒｐｍで１０分間遠心分離して回収した。プロトプラストのベレットを０．７Ｍ 　ＫＣＱ、　５０ｍＭ　ＣａＣＱ、緩衝液Ｓｍｆｆ中で２）　　回洗浄し、回収 し、最終的にはＫＣｌ２／　ＣａＣｆｆ、緩衝液１ｍｒｌ中約５ＸＩＯ’個の濃 度にプラトプラストを再懸濁した。

工程８　：　５１９００プロトプラストの形質転換工程７で作製した５１９００ プラトプラストの一部５００μａを１．５ｍｆｆのポリプロピレン管中、λＡＮ ８ａ、　ｐｓＴＡｌＯまたはｐｓＴＡ１４のＤＮＡｌ０〜３０μｇ（ＴＥ緩衝液 中）と混合した。７０Ｍ　ＫＣＱ。

５０＋ｏＭ　ＣａＣＱｘ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ、　ｐ９７．５中５０％ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−４０００、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　 Ｃｏ、）の等容を加え、混合物を氷上に３０分間装いた。ついで混合物をＫＣＱ ／ＣａＣＱ２緩衝液１．５＋ｍ１２に希釈し、その一部を、唯一の窒素源として ２０ｍ１Ｊ　ＮａＮ０ａおよび浸透圧安定剤として０．７Ｍ　ＫＣＱを補充した ＡＭＭアガールに分散させた。

プレートを２６℃で７〜１０日間インキュベートし、硝酸利用トランスホーマン トを硝酸非利用体のバックグランドから生育させた。形質転換積度は、Ａ、ｎ１ ｄｕｌａｎｓ　ｎｉａ　Ｄ遺伝子クローンλＡＮ８ａまたはＡ、ｎｉｇｅｒ遺伝 子クローンりＳＴＡＩＯを用いた場合は外来ＤＮＡ　１μ９あたり約１０個のト ランスホーマントであったが、Ｌ！ｕ土柱遺伝子クロりンｐｓＴＡ１４のＤＮＡ 　１μ９あたりではわずか約２個であった。

５１９００　）ランスホーマント単離体は一般に胞子形成能が改善され、コロニ ーの形態は明らかに変化した。

５１９００の形質転換はまた、Ｍａｎｉａｔｉｓら（前出）の記載した標準的方 法を用いたサザンブロツテイングおよび形質転換工程体のゲノムＤＮＡの、λＡ Ｎ８ａ１ｐｓＴＡｌＯまたはｐｓＴＡｔ４ＤＮＡの３ａｐ標識７ラグメントとの ハイブリダイゼーションを用いて確認した。プローブフラグメントの標識は工程 ３の記載とほぼ同様にして行った。ハイブリダイゼーション条件は、５ＸＳＳＣ ，５Ｘデンハルト溶液、５９ｍＭリン酸緩衝液ｐｉ（６，５，２０ｕｙ／１ｔｒ （ｔの超音波処理ニシン精子ＤＮＡとした。プロットは６５℃において、０．１ ％ＳＤＳの存在下５ＸＳＳＣから最終塩濃度０．１ＸＳＳＣまで数段階で洗浄し た。

これらの方法でのトランスホーマントの分析により、λＡＮ８ａ、ｐｓＴＡｌＯ またはｐｓＴＡ１４の外来性ＤＮＡはＰ、ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ−ｕｍ　５１９０ ０受容株ゲノムに挿入されていることが明らかにされた。制限分析では、各トラ ンスホーマントにより挿入部位が異なること、また挿入事象の数は各トランスホ ーマントにより変動することが示された。

実施例　２ 天然硝酸レダクターゼ遺伝子に基づ＜　Ａｃｒｅａ＋ｏｎｉｕ＋ｓ　ｃｈｒｙ− ｓｏｇｅｎｕｍの同種形質転換系 Ａ、ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　Ｍ８６５０株（ＡＴＣＣ１４５５３）をＱｕｅｅ ｎｊｒら（Ｍｉ−ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｌｅｉｖｅ、　Ｌ編、Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃ−ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗａｓｈｉｎ ｇｔｏｎ　ＤＣ，４６８〜４７２頁、　１９８５）に記載されているように、Ｄ ｅｌａａｉｎの特定液体培地中で生育させた。菌糸を収穫し、高分子量ＤＮＡを 例１の工程２の記載と同様にして単離した。

Ｍ８６５０ゲノムライブラリーは、例１の工程２の記載と同様に標準的技術（Ｍ ａｎｉａｔｉｓら、前出）を用い、部分５ａｕ３Ａｌ消化７ラグメント（１５〜 ２０ｋｂ）をλＥＭＢＬ３のＢａ＋ｎＨｌクローニング部位にリゲーシ遍ンさせ ることによって構築した。

ｉｎ　　ｖｉｔｒｏパッケージングを行った組換えファージ粒子（約１．３ｘ　 ｌＯ’ｐｆｕ）を広く入手できる大腸菌Ｎ１２５９株中で増殖させ、薬Ｉ　Ｘ　 １０”ｐｆｕ／ａ（ｌの増幅ライブラリーを得た。

スクリーニングには、標準的方法（Ｍａｎｉａｔｆｓら、前出）を用い、それぞ れ約２　Ｘ　１０’ｐｆｕを含有する１２個のグレート（径９　ｃｍ）を準備し た。各プレートの二重濾紙インプレッションをニトリルセルロース上に置いた。

濾紙は、以下のグレハイブリダイゼーシコン緩衝液：　５　Ｘ５ＳＰＥ　（０， ９ＭＮａ（，１２，５０ｍＭ　ＮａＨ，ＰＯ，，５ｍＭ　ＥＤＴＡ）、６％ＰＥ Ｇ６０００．０．５％ドライミルク粉末、１％ＳＤＳ、　０．１２５％ＮａＰＯ イ２５０ｊ’ｇ／ｌ１ｊ２超音波処理ニシン精子ＤＮＡをか紙缶に約Ｉ＋１２用 いて、５６℃で約４時間プレハイプリダイゼーシ黛ンを行った。

ライブラリーはＡ、ｎ１ａｄｕｌａｎｓ硝酸レダクターゼ遺伝子内からの２．４ ｋｂ　Ｘｂａ　Ｉ　７ラグメントでスクリーニングした。この７ラグメントは実 施例１の工程１の記載と同様にして単離した。単離された７ラグメント（２５ｎ ｇ）は、混合ヘキサマーオリゴヌクレオチド（Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍａ　Ｋｉｔｅ Ａ園ｅｒｓｈａｗ）から製造業者の指針に従いランダムプライミングでタレノウ ポリメラーゼを用いてｊｊｐ放射性標識した。ライブラリーフィルターは放射性 プローブを含む新鮮なプレハイブリダイゼーシａン緩衝液中５６℃で−夜ハイブ リダイズした。ハイブリダイズしなかったプローブからのバックグランド放射能 は、５　Ｘ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ。

Ｑ　、　ｌ　％５ＳＰＥ（約１０ｍＱ／？紙）を含をする緩衝液中５６°ｃ−ｒ ２０分ノ洗浄を２回、３　Ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ、　０．１％５ＳＰＥ中 ５６°Ｃで２０分の洗浄を２回行って除去した。洗浄したが紙は、増感スクリー ンを用いてＸ線写真フィルムに一７０’Ｃで３日間露出しｔ；。

多数の陽性グラーク候補が同定された。これらをプラーク精製し、さらに２ラウ ンドのハイブリダイゼーションスクリーニングの間に再試験した。２個の強力な 陽性クローンがこの方法で確認された。このひとつをλ５ＴＡ６と命名し、以下 の実験に使用しｌ；。λ５ＴＡ６内に存在するλ５ＴＡ６の７ア一ジ株を作製し 、標準方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出）を用いてＤＮＡを単離した。約５μｇ のλ５ＴＡ６　ＤＮＡを、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱｐＨ７，５，７ｍＭ　 ＭｇＣｆｆ２．５０＋ｎＭ　Ｎａ（４，７ｎ＋Ｍ２−メルカグトエタノールを含 む５０μｇの反応液中、２５単位のＥｃｏＲＩにより、３７℃で２時間消化した 。消化生成物ヲ０．８％アガローススラブゲル上電気泳動によって分別した。ヨ ウ化ナトリウム−ガラス法（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ　＆　Ｇｉ−＋１ｅｓｐｉｅ 、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｒｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６：　６１５−６１９ ．１９７９）により、市販のキッド（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ　；　Ｂｉｏ　Ｉ吋ｒ ｎｃ、Ｐｏ　Ｂｏｘ２２８４、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ　９２０３８．　Ｕ ＳＡ）を用いて８．８ｋｂフラグメントを回収した。

様にして２．５単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いてリゲーションさせた。リゲ ーション生成物を用いて大腸菌ＤＨ５株を形質転換した。アンピリジン抵抗性コ ロニーヲ、Ｍａｎｉａ−ｔｉｓら（前出）によって記載されたアルカリＳＯＳ分 解法により、プラスミドＤＮＡの存在についてスクリーニングした。λ５ＴＡ６ からの８．８ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントをもつプラスミド単離体を同定し、 ｐＳＴＡ　７００と命名した。ｐＳＴＡ　７００のＡ、ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ 　ＤＮＡ部分の制限酵素地図を第３図に示す。この地図は例示の目的だけのもの で、限られた数の制限酵素を使用し、また特定の制限酵素の部位はすべてが示さ れていない場合もある。地図は考察の補助として示しｔ；ものである。プラスミ ドｐＳＴＡ　７００はブタベスト協定の規定によりＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅ ｒｉａに１９８９年１月２３日、受入番号ＮＣｌＢ４Ｏ１０３として寄託された 。

ｐＳＴＡ　７００内にｎｉａ　Ｄ遺伝子が存在することは上述のようにして実施 したサザンブロッティングによって確認された。ｐＳＴＡ　７００プラスミドは ＥｃｏＲＩ　、　Ｂｇ上りまたはＢａｍＨｌで消化されたＡ、ｃｈｒｙｓｏｇｅ ｎｕｍゲノムＤＮＡのプローブとして使用した。このプローブは、これらの消化 物中に、ｐＳＴＡ　ｌの２．４ｋｂ　Ｘｂａ　Ｉフラグメントをプローブとして 用いた場合Ｉこ得られたのと同一のバンドパターンを与えた。

すなわち８．８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント、８．０および３．８ｋｂ内にｎ ｉａ　Ｄ遺伝子を伴うＡ、ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　ＤＮＡが存在する３七を確 証するものであり、またクローンの過程で大きな再配列は起こらなかったことを 示している。

ｎｉａ　Ｄ遺伝子のｐＳＴＡ　７００内での位置はサザンブロッティングによっ てさらに限局させた。この場合に使用したプローブはＡ、ｎ１ｄｕｌａｎｓ　ｎ ｉａ　Ｄ遺伝子の１２４ｂｐ　Ｐｓｔ　Ｉ　−ＡｃｃＩ７ラグメントであった。

この７ラグメントは、菌および植物硝酸レダクターゼ間で高度に保存されている ｎｉａ　Ｄ遺伝子の領域を含んでいる。この７ラグメントの位置は第１図に示す 。５μ９のｐＳＴＡ　Ｉ　ＤＮＡを、ｌＯｎＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ　ｐＨ７，５， ７ｍＭ　Ｍｇｃ１２．．６０ｍＭ　ＮａＣＱ、　　７　ｍＭ２−メルカプ消化生 成物は２％アガロースゲル上電気泳動によって分割し％　Ｇｅｎｅｃｌｅａｎを 用いて１２４ｂｐ７ラグメントを回収した。

このフラグメントはランダムブライミング法を用いてｓｉｐで放射標識した。プ レバイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび濾紙洗浄は上述のよ うに行った。サザンハイプリダイゼーション実験によりｐＳＴＡ７００の１．３ ｋｂ　Ｂｇｌ　ＩＩフラグメントはｎｉａ　Ｄ特異的プローブフラグメントと相 同性であった。

なから（２２０ｒｐｍ）、２８℃で５〜８日間生育させた。分生胞子はプフナー 漏斗上滅菌したＷｈａｔｍａｎ　Ｎｏ、　１濾紙を通して真空濾過することによ って得た。炉液を滅菌フラスコに集め、分生子を遠心分離で回収した。Ｍ８６５ ０の培養液１００ｍ＜２から、この方法では約２Ｘ１０”個の分生子が得られた 。分生子は少量ずつ分けて、凍結保存剤として１０％メタノールを用い液体窒素 上に保存した。

約ｌＯ畠個の非変異分生子を、ｌＯ＋ｎＭグルタミン酸および４７０ｍＭ亜塩素 酸ナトリウムを補充したアスペルギルス最小培地、ＡＭＭ　（Ｃ１ｕｔｔｅｒｂ ｕｃｋ、前出、実施例１の工程６に記載上、約１０７測 グを行った。２８℃で１２〜１４日間インキュベーションしたのち、自然誘発亜 塩素酸抵抗性変異体を単離した。変異体の最初の特性づけはＢｉｒｋｅｔｔ　＆ 　Ｒｏｗｌａｎｄｓ（前出）の報告した単一窒素生育試験を用いて行った。ｎｉ ｒ　Ａ，　ｃｒｎ　Ａおよびａｒｅ　Ａ型変異体はｎｉａ　Ｄおよびｃｎｘ変異 体と識別できた（Ａ．ｎ１ｄｕｌａｎｓ遺伝子の名称は標準として用いられる） 。

この生育試験は、Ａ　、　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍがヒボキサンチン（Ａ。

ｎ１ｄｕｌａｎｓと異なる）まｔ；はアデニン（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍと 異なる）上では生育しなかったので、ｎｉａ　Ｄと凹工型変異体は直ちに識別で きなかった。旦１±と上型変異体の識別には、唯一の窒素源としてプリンを代替 に用いる単一表現型検定を開発した。ＡＭＭをベースとした培地中、炭素源とし てキナ酸（１％）、窒素源としてイノシン（２ｍＭ）をキシダ〜ゼＩ酵素活性を 欠くものと思われる。この酵素はモリブデン含有補因子を要求し、これは硝酸レ ダクターゼ活性にも共通して要求されるからである。プリンヒドロキシダーゼＩ はヒポキサンチンを、キサンチン、尿酸へと異化する（Ｌｅｗｉｓら、Ｅｕｒｏ 、Ｊ、ＢｉｏｃｈｅＩＩ＋、　９１　：　３１１〜３１６、１９７８）。プリン ヒドロキシダーゼ！の検定はＭｅｎｄｅ　ｌ＆　Ｍｕｌｌｅｒ　（Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、ＰＩａｎｔｚｅｎ　１７０　：　５３８”５４１゜１９ ７６）の記載にほぼ従って実施した。簡単に説明すると、Ａ、ｃｈｒｙｓｏｇｅ ｎｕｍ　Ｍ８６５０ｈよびｎｉａ　Ｄまたは生変異体候補を液体アスペルギルス 完全培地（Ｃ１ｕｔｔｅｒｂｕｃｋ、　１９７４前出）中、２８°ｃ１２００ｒ ｐｍで２４時間生育させ、遠心分離で収穫し、５００ｍＭ尿酸を補充した液体Ａ ＭＭ中に再懸濁し、２８℃、２９０ｒｐｒＤでさらに３，５時間インキュベート した。菌糸体を収穫し、液体窒素中で微粉末に粉砕し、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ％ｌ ０ｍＭ　２−メルカプトエタノーノ呟１　％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含有す る０、１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７，５中に、菌糸体湿重量１ｇあたり緩衝 液２ＩＩＩＩ２テ抽出した。５Ｗ２７０−ター（６Ｘ　１４ｍＩ２チューブ、Ｂ ｅｃｋｒｎａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて２０００Ｏｒｐｍ、　　４ ℃で２０分間遠心分離したのち、抽出液（１００μＱ部分）を標準法（たとえば Ｈａｍｅｓ　＆　Ｒｉｃｋｗｏｏｄ、　Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉ ｓｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　 ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｌｏｎｄｏｎ、　１９８１参照）で調製しｌ；非変性７％ポリアクリルアミドチ ューブゲル上に負荷した。ブロモフェノールブルー追跡染料がゲルの底部に達す るまで５ｍＭで電気泳動しｔ；のち、ゲルを、２ｍＭヒポキサンチン、１１１１ Ｍニトロテトラゾリウムブルー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）およ びＯ，１ｍＭ７エナジンメトキサル７エート（Ｓｉｇｍａ）を含有する０、１Ｍ ピロリジン酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ８０中暗所でプリンヒドロキシダーゼＩ活 性を染色した。試験した一部の単離体はこの試験でプリンヒドロキシラーゼ活性 を欠くことが明らかにされｃｎｘ変異体に帰属された。１土工変異体をさらに特 性づけるため、単離体はまた、Ｃｏｖｅ　＆　Ｃｏｄｄｉｎ−ｇｔｏｎ　（Ｂｉ ｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　１１０　：　３１２〜３１Ｌ　１ ９６５）およびＷｒａｙ　＆　Ｆｉｌｎｅｒ（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　１１９： 　７１５〜７２５．１９７０）によって記載された方法を用いて、ＮＡＤＰＨ一 連結シトクロムＣレダクタ活性の硝酸レダクターゼ酵素属性についても試験した 。プリンヒトミキシラーゼＩの活性は保持したいたがＮＡＰＰＨ−４結シトクロ ムＣレダクターゼ活性のレベルは著しく低下していＩ；単離体がｎｉａ　Ｄ変異 体に帰属された。プリンヒドロキシラーゼ活性は低下しているが、ＮＡＤＰＨ一 連結シトクロムＣレダクターゼ活性は野生型のレベルを示す単離体しＣｎＸ変異 体と一致した。

従い、硝酸性利用性の復帰率をスクリーニングした。安定な変異体の復帰頻度、 復帰体７卉生胞子は１０−”未満と同定された。これらの単離体のひとつをＡ、 ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍＭ１１６０株と命名し、完全なｎ１ａＤ遺伝子を含有す るベクターによる形質転換の適当な受容株として使用した。この株は、ブダペス ト協定の規定により、Ｃｏｍｍｏｎｗｅａ　］　ｔｈＭｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ　 　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ＣｕＨｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに、１９８９年１ 月２３日付で受入番号ＣＭＩＣＣ３３０１７８として寄託された。

１１１６０株を、１００ｉｆｆのＤｅｍａｉｎｓ培地（Ｑｕｅｅｎｅｒら、前出 ）中分生子の接種（約１０８個）から、２９０ｒｐａ＋で振盪しながら２８℃で 約４０時間生育させた。菌糸体を滅菌モスリン中に収穫し、蒸留水で洗浄し、０ ．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７，１，１０ｍＭジチオスレイトール中に、 菌糸体湿重量１９あたり緩衝液５０ｒｉ（ｌで再懸濁した。これを２８℃で穏や かに振盪したのち、菌糸体を回収し、０．７Ｍ　ＫＣＱ、　５ＩＩｇ／ｒｘ（Ｉ Ｎｏｖｏｚｙｍｅ　２３４（Ｎｏｖｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ）含有０．１Ｍクエン 酸リン酸緩衝液ｐＨ８，５中に５０１Ｑ／ｇ菌糸体で再懸濁した。これを穏やか に振盪しながら、２８℃でさらに６０分間インキュベートした。

得られたプロトプラストは、わずかに減圧にして焼結ガラスフィルター（孔度ｌ ）に通して収穫し、３０００ｒｐｍでｌＯ０分間ペレットして集めた。ペレット を１７Ｍ　ＫＣｌ中で３回洗浄しｌＸｌ０’プロトプラスト／ｍＱの濃度に再懸 濁し　！二　。

プロトプラスト懸濁液の一部１００μＱを１．５ｍ１２のポリプロピレンチュー ブに移し、ＣａＣＱｚを最終濃度５０ｍＭになるように加えた。２０ｕＱ未満の ＴＥ緩衝液中λ５ＴＡ６またはλ５ＴＡ７００ノイずレカノＤＮＡ　ｉｏμを量 、１０ｕＱ　ＰＥＧ溶液〔５０％ＰＥＧ４０００（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏ、）、５０ｍＭ　ＣａＣＱｘ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２．　ｐＨ ７，５）を加えて手で混合した。外来性ＤＮＡを含まない対照サンプルも設けた 。混合物を室温で２０分間インキュベートしたのち、９００μａのＰＥＧ溶液を 加えた。２０分間インキュベートしたのち、プロトプラスト混合物の０．１ｍ１ ２部分を最小培地プレート（ＡＭＭ、窒素源として１０＋ｌ１Ｍ　ＮａＮ０．、 浸透圧安定剤として１１％スクロース補充）上に分散させｔ二。プレートを２８ ℃で２１日までインキュベートした。トランスホーマントのコロニーは通常、１ ０日以内にわずかなバックグランド生育を抜は出して旺盛に生育した。

上述した基本的操作では定常的にＤＮＡ　１９９から約２〜４個のトランスホー マントが得られるがｐＳＴＡ　７００　ＤＮＡはλ５ＴＡ６よりわずかに高い形 質転換頻度を示す。形質転換プロトコロールを改変すると頻度が改善される。す なわち、 （ｉ）　　冷ショック：プロトプラスト、ＤＮＡおよびＰＥＧ溶液の最初の２０ 分間のインキュベーションは氷上で行う。

（ム）熱ショック：最初の２０分間のインキュページコン後、９００μＱのＰＥ Ｇ溶液の添加前Ｊ＋、混合物を３５℃の水浴に２分間移す。

実施例１の工程８におけるように、トランスホーマントコロニーは硝酸塩を補充 した最小培地上で継代培養して精製した。外来性ＤＮＡの取り込みは、ハイブリ ダイゼーションプローブとしてインプットベクターＤＮＡλＥＭＢＬ３マｆ：は ｐＵｃ１８を用いてトランスホーマントのゲノムＤＮＡまサザンブロッティング を行って証明した。ハイブリダイゼーション条件およびプローブの製造は実施例 １の工程３８よび８に記載した通りとした。

参考に以下の図面を添付した。

の方向は矢印で示す。横線は本文中に述べた組換え構築体中に存在するこの領域 の部分を表している。本印を付したＸｂａ　Ｉ　、　　Ｐｓｔ　ＩおよびＡＣＣ Ｉ部位はハイブリダイゼーションプローブとして使用した（本文参照）フラグメ ントの範囲を示すものである。

地図はプラスミドｐｓＴＡｌＯがもつＡ、ｎｉｇｅｒ　ＤＮＡのフラグメントを 示す。ｎｉａ　Ｄ構造遺伝子はその位置に斜線を施して示す。転写の方向はＡ、 ｎ１ｄｕｌａｎｓ　ｎｉａ　Ｄ遺伝子からの５′および３′末端特異的グローブ のハイブリダイゼーションによって推定した。

第３図：　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ｎｉａ　Ｄ遺伝子座の制限 酵素のｌｌｉ、８ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントである。ｎｉａ　Ｄａ成遺伝子 の位置は斜線領域である。転写の方向（矢印）はＤＮＡ配列分析およびＡ、ｎ１ ｄｕＩａｎｓ　ｎ４ａ　Ｄ遺伝子との比較によって推定した。

ＦＩＧ、１ 国際調査報告 に＋ｗｍｍｓ１ＭＮ’ｆｆｌ”””　ＰＣＴ／ＥＰ　９０１００３７２２国際調 査報告 ユニバーシティオブセントアンドル−ズ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）最初は硝酸レダクターゼの発見を欠いていた同一種の細胞（ｎｉａＤ−細 胞）から硝酸レダクターゼを発現でさるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏ ｇｅｎｕｍまたはＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの細胞を得る方 法において、上記ｎｉａＤ−細胞に、硝酸レダクターゼをコードするマーカー遺 伝子がその選ばれた宿主細胞でのその遺伝子の発現の調節配列に作動性に連結さ れて包含されているベクターＤＮＡを導入し、このようにして形質転換された細 胞を唯一の窒素源として硝酸塩を含有する適当な培地上でその生育能によって選 択する方法。
2. （２）硝酸レダクターゼをコードするマーカー遺伝子は、選ばれた形質転換宿主 と同一種から単離する請求項（１）記載の方法。
3. （３）硝酸レダクターゼをコードするマーカー遺伝子はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ 　ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌ−ｌ ｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍお よびＡｃｒｅ−ｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍから選ばれる株から単離 される請求項（１）および（２）のいずれかに記載の方法。
4. （４）硝酸レダクターゼをコードするマーカー遺伝子はｐＳＴＡｌ（ＮＣＩＭＢ 　４０１０２）、ｐＳＴＡ１０、ｐＳＴＡ１４およびｐＳＴＡ　７００（ＮＣＩ ＭＢ　４０１０３）から選ばれるプラスミド中に含有される請求項（１）〜（３ ）のいずれかに記載の方法。
5. （５）ｎｉａＤ−細胞はＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍもしくはＡ．ｃｈｒｙｓｏ ｇｅ−ｎｕｍの抗生物質産生株またはそれらの硝酸レダクターゼ欠損変異株であ る請求項（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
6. （６）ｎｉａＤ−細胞はＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　Ｓ１９００株（ＣＭＩＣ Ｃ３３０１７７）およびＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　Ｍ１１６０株（ＣＭＩＣ Ｃ　３３０１７８）から選ばれる請求項（５）記載の方法。
7. （７）ｎｉａＤ−細胞に工業的に重要な遺伝子を、その遺伝子および硝酸レダク ターゼ遺伝子の両者が発現されるようにさらに導入する請求項（１）〜（６）の いずれかに記載の方法。
8. （８）工業的に重要な遺伝子は、抗生物質生合成に関与する遺伝子、細胞の生育 の改善をもたらす遺伝子、細胞の新規な基質上での生育を可能にする遺伝子およ び生成する代謝物を変化させる遺伝子から選ばれる請求項（７）記載の方法。
9. （９）遺伝子は酸素ＡＣＶシンテターゼ、イソペニシリンＮシンテターゼ、デア セトキシセファロスポリンＣシンテターゼまたはＤＡＣアセチルトランスフェラ ーゼをコードする遺伝子から選ばれる請求項（７）記載の方法。
10. （１０）硝酸レダクターゼをコードするマーカー遺伝子と工業的に重要な遺伝子 は同一のベクター上に存在する請求項（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
11. （１１）硝酸レダクターゼをコードするマーカー遺伝子と工業的に重要な遺伝子 は異なるベクター上に存在する請求項（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
12. （１２）Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍまたはＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質 転換株を培養し、培養培地から所望のペニシリンまたはセファロスポリンを単離 するペニシリンまたはセファロスポリン抗生物質の製造方法において、Ｐ．ｃｈ ｒｙｓｏｇｅｎｕｍまたはＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換株は請求項（ １）〜（１１）のいずれかに記載の方法によって作製する方法。
13. （１３）硝酸レダクターゼの発現が欠損しているＰ．ｃｈｒｙｓ−ｏｇｅｎｕｍ またはＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの細胞の形質転換用ベクターＤＮＡであって 、硝酸レダクターゼをコードするマーカー遺伝子はその遺伝子の発現の調節配列 と作動性に連結しているベクターＤＮＡ。
14. （１４）そらに工業的に重要な遺伝子がマーカー遺伝子に読み取り枠が一致して 連結している請求項（１３）記載のベクターＤＮＡ。
15. （１５）工業的に重要な遺伝子は、抗生物質生合成に関与する遺伝子、細胞の生 育の改善をもたらす遺伝子、細胞の新規な基質上での生育を可能にする遺伝子お よび生成する代謝物を変化させる遺伝子から選ばれる請求項（１４）記載のベク ターＤＮＡ。
16. （１６）硝酸レダクターゼをコードするマーカー遺伝子は意図された形質転換宿 主と同一種の由来する請求項（１３）〜（１５）のいずれかに記載のベクターＤ ＮＡ。
17. （１７）プラスミドｐＳＴＡｌ（ＮＣＩＭＢ　４０１０２）またはプラスミドｐ ＳＴＡ　７００（ＮＣＩＭＢ　４０１０３）である請求項（１３）記載のベクタ ーＤＮＡ。
18. （１８）請求項（１３）〜（１７）のいずれかに記載のベクターＤＮＡを含有す るＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍまたはＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換株 。
19. （１９）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　Ｓ１９００株（Ｃ ＭＩＣＣ　３３０１７７）または（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ ｕｍ　Ｍ１１６０株（ＣＭＩＣＣ３３０１７８）。