JP2000514308A - 新規原核生物ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規ポリペプチドおよびかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに組み換え法によるかかるポリペプチドの製造方法に関する。抗細菌化合物のスクリーニングのためのかかるポリペプチドの使用方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規原核生物ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそれらの使用 関連出願 本願は、１９９６年８月１６日出願の米国仮出願第６０／０２４０２２号の利 益を主張する。 発明の分野 本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびそ れらの製造および使用、ならびにそれらの変種、アゴニストおよびアンタゴニス ト、およびそれらの使用に関する。詳細には、これらの点および他の点において 、本発明は、配列表に示す新規ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。 発明の背景 ストレプトコッカス属（Streptococci）は医学的に重要な微生物属を形成して おり、ヒトにおいて、中耳炎、肺炎および髄膜炎を包含する、いくつかの型の疾 患を引き起こすことが知られている。ストレプトコッカス属の単離から１００年 以上も経過しているため、ストレプトコッカス・ニューモニアエは、より詳細な 研究がなされた微生物の一つである。例えば、事実、ＤＮＡが遺伝物質であると いう初期の見解の大部分は、この微生物を用いたGriffithならびに、Avery、Mac leodおよびMcCartyの研究において予言された。ストレプトコッカス・ニューモ ニアエに関する研究は膨大であるにも関わらず、この微生物の毒性に関しては多 くの疑問が残されている。ストレプトコッカスの遺伝子および遺伝子産物を抗生 物質の開発のための標的として用いることは、特に好ましい。 ストレプトコッカス・ニューモニアエ感染の頻度は過去２０年間に劇的に上昇 している。これは多剤耐性株の出現、および免疫系が低下した人の集団の増加に 起因している。いくつかのまたはすべての標準的な抗生物質に対して耐性を有す るスト レプトコッカス・ニューモニアエ株を単離することはもはやめずらしいことでは ない。この現象がこの生物に対する新しい抗菌剤、ワクチンおよび診断試験につ いての必要性を形成した。 明らかに、抗生物質活性に関して化合物をスクリーニングするのに有用である という目下の利益を有する、本発明新規化合物のごとき因子に対する必要性があ る。かかる因子は、感染、機能不全および疾病の発生におけるそれらの役割を調 べるのにも有用である。感染、機能不全または疾病の予防、改善または修正にお いて役割を果たしうる、かかる因子ならびにそれらのアンタゴニストおよびアゴ ニストに対する必要性もある。 本発明ポリペプチドは、表１に示す既知蛋白に対するアミノ酸配列相同性を有 する。 発明の概要 本発明の１の目的は、ポリペプチド、とりわけ、配列表に示す配列からなる群 より選択されるアミノ酸配列と、既知アミノ酸配列または表１に掲載された蛋白 のごとき他の蛋白の配列との間の相同性により新規ポリペプチドであると同定さ れたポリペプチドを提供することである。 本発明のさらなる目的は、新規ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、 特に、ストレプトコッカス・ニューモニアエのポリペプチドをコードするポリヌ クレオチドを提供することである。 本発明の特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、配列表に示す配 列からなる群より選択される配列、またはこれらの配列の変種を含むポリペプチ ドをコードする領域を含む。 本発明のもう１つの特に好ましい具体例において、配列表に示す配列からなる 群より選択されるアミノ酸配列、またはこれらの配列の変種を含む、ストレプト コッカス・ニューモニアエ由来の新規蛋白がある。 本発明のもう１つの態様によれば、寄託株に含まれるストレプトコッカス・ニ ューモニアエ０１００９９３株により発現可能な成熟ポリペプチドをコードする 単離核 酸分子が提供される。 本発明のさらなる態様において、本発明ポリペプチド、特にストレプトコッカ ス・ニューモニアエのポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供され、それ らにはｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが含まれる。本発明のさらなる具体例 において、本発明は、生物学的、診断学的、予防的、臨床的もしくは治療的に有 用なその変種、およびそれらを含んでなる組成物を包含する。 本発明のもう１つの態様によれば、治療または予防を目的とした、特に遺伝学 的免疫を目的とした、本発明ポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明のこ の態様の特に好ましい具体例には、本発明ポリペプチドの天然の対立遺伝子変種 およびそれによりコードされるポリペプチドがある。 本発明のもう１つの態様によれば、ストレプトコッカスの新規ポリペプチド、 ならびに生物学的、診断学的、予防的、臨床的もしくは治療的に有用なその変種 、およびそれらを含んでなる組成物が提供される。 本発明の特に好ましい具体例には、天然に存在する対立遺伝子によりコードさ れる本発明ポリペプチドの変種がある。 本発明のこの態様の好ましい具体例では、上記のポリペプチドの製造方法を提 供する。 本発明のさらに別の態様によれば、例えば、抗体を含め、抗菌剤として有用な かかるポリペプチドの阻害物質が提供される。 本発明の特定の好ましい具体例によれば、本発明ポリペプチドおよびポリヌク レオチドの発現評価のための、疾病の治療、例えば中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血 症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感 染のごとき髄膜炎の治療のための、遺伝学的変異のアッセイのための、ならびに 細菌、特にストレプトコッカス・ニューモニアエ細菌に対する免疫学的応答を生 起するための生物への本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与のため の、製品、組成物および方法が提供される。 本発明のこの態様および他の態様のある種の好ましい具体例によれば、特に、 厳密な条件下で本発明ポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするポリ ヌク レオチドが提供される。 本発明のある種の好ましい具体例において、本発明ポリペプチドに対する抗体 が提供される。 本発明の他の具体例において、本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに 結合し、あるいはそれらと相互作用して、それらの活性を阻害または促進する化 合物の同定方法であって、化合物とポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの間 の結合または他の相互作用を可能にする条件下で本発明ポリペプチドまたはポリ ヌクレオチドをスクリーニングすべき化合物と接触させ（かかる結合または他の 相互作用は、化合物とポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの結合または相互 作用に応答したシグナルの検出を可能にする第２の成分と関連がある）、ついで 、化合物とポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの結合または相互作用により 生じたシグナルの存在または不存在を検出あすることにより、化合物がポリペプ チドまたはポリヌクレオチドに結合するか、あるいはそれらと相互作用して、そ れらの活性を促進または阻害するかどうかを決定することを含む方法が提供され る。 本発明のさらにもう１つの態様において、本発明ポリペプチドおよびポリヌク レオチドのアゴニストおよびアンタゴニスト、好ましくは静菌的または殺菌的ア ゴニストおよびアンタゴニストが提供される。 本発明のさらなる態様では、細胞に、または多細胞生物に投与するための、本 発明ポリヌクレオチドまたはポリペプチド含む組成物を提供する。 開示した本発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾は、以下の記載 を読むこと、および本明細書のその他の部分を読むことにより、当業者に容易に 明らかとなろう。 用語 以下の説明は、本明細書、とりわけ実施例において汎用される特定の用語の理 解を容易にするために示すものである。 「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配列により形質転換もしくはトランス フェクションされた、または形質転換またはトランスフェクションすることので きる細 胞である。 当該分野にて周知であるように「同一性」は、配列を比較して測定されるよう な、二つまたはそれ以上のポリペプチド配列間または二つまたはそれ以上のポリ ヌクレオチド配列間の関係である。当該分野において、「同一性」とはまた、時 には、かかる配列の２つの鎖の間の合致により決定されるような２つのポリペプ チドまたはポリヌクレオチド配列間の関連性の程度をも意味する。「同一性」お よび「類似性」はともに下記既知方法(これらに限らない)により容易に算出でき る(Computational Molecular Biology，Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユニ バーシティー・プレス、ニューヨーク、1988年;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、1993年 ；Computer Analysis of Sequence Data,パートＩ，Griffin,A.M.およびGriffin ,H.G.編、ヒューマナ・プレス、ニュージャージー、1994年；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje,G.、アカデミック・プレス、1987年；およ びSequence Analysis Primer，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックト ン・プレス、ニューヨーク、1991年;およびCarillo,H.,およびLipman,D.,SIAM J .，Applied Math.，48:1073(1988)）。同一性を決定するための好ましい方法は 、試験する２つの配列間で最も良く適合するように設計される。同一性および類 似性を測定する方法は、公に利用できるコンピュータープログラムに集成されて いる。二つの配列間の同一性および類似性を測定する好ましいコンピュータープ ログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux,J.ら、Nucleic Acids Re search 12(1):387（1984）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA（Atschul,S.F.ら、J.M olec.Biol.215：403（1990）））を包含するが、これらに限定されるものではな い。BLAST XプログラムはNCBIおよび他のソースから公に利用できる（BLAST Man ual，Altschul，S.,et al.，NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894;Altschul，S.，e t al.，J．Mol．Biol．215:403-410(1990)）。一例として、対照ヌクレオチド配 列に対して、例えば少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有す るポリヌクレオチドを挙げると、そのポリヌクレオチド配列が対照ヌクレオチド 酸配列のヌクレオチド１００個ごとに５個までのヌクレオチドの変化を含みうる ことを除き、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は対照配列と同 一である。言い換えると、対照酸配列に対して少なくとも９５％同一であるヌク レオチド配列を有するポリペプチドを得るためには、対照配列中の５％までのヌ クレオチドが欠失または別のヌクレオチドと置換されていてもよく、あるいは対 照配列中の全ヌクレオチドのうち５％までの数のヌクレオチドが対照配列に挿入 されたものであってもよい。対照配列のこれらの変異は、対照ヌクレオチド配列 の５’または３’末端位置に存在していてもよく、あるいはそれらの末端位置の 問のいずれかの位置に存在していてもく、対照配列のヌクレオチドに散在してい てもよく、あるいは対照配列内の１個またはそれ以上の一連の群となっていても よい。同様に、対照アミノ酸配列に対して少なくとも例えば９５％の同一性を有 するアミノ酸配列を有するポリペプチドを例に挙げると、そのポリペプチド配列 が対照アミノ酸配列のアミノ酸１００個ごとに５個までのアミノ酸の変化を含み うることを除き、そのポリペプチドのアミノ酸配列は対照配列と同一である。言 い換えると、対照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配 列を有するポリペプチドを得るためには、対照配列中のアミノ酸の５％までが欠 失または他のアミノ酸と置換していてもよく、あるいは対照配列中の全アミノ酸 のうち５％までの数のアミノ酸が対照配列中に挿入されたものであってもよい。 対照配列におけるこれらの変化は、対照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ 末端位置に存在してもよく、あるいはそれらの末端間のいずれかの位置に存在し てもよく、対照配列中に散在していてもよく、あるいは対照配列内で１個または それ以上の一連の群をなしていてもよい。 「単離」とは、「人の手によって」天然の状態から変化させられた、すなわち 、天然物の場合、その本来の環境から変化または除去あるいはその両方が行われ たことを意味する。例えば、天然において生体に存在するポリヌクレオチドまた はポリペプチドは、「単離」されていないが、その天然状態で共存する物質から 分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に用いる用語 としての「単離」がなされている。 「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、一般に、修飾されていないＲＮＡも しくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、ポリリボ ヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをも意味する。従って、「ポ リヌク レオチド」は、とりわけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の 混合物または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖お よび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一 本鎖もしくはより典型的には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖 領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含 するがこれらに限らない。加えて、本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」は、 ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する 。かかる領域における鎖は同一の分子または異なる分子由来のものでよい。この 領域はこれらの分子の一つまたはそれ以上の全てを含んでいてもよいが、より典 型的にはいくつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一つは、 オリゴヌクレオチドであることがしばしばである。本明細書で用いる場合、「ポ リヌクレオチド」なる用語は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基を含有する、 前記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。このように、安定性または他の理由で 修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも、本明細書が意図するところの「 ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシン等の普通でない塩基、またはトリ チル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ（二つの例だけを示す）も、 本明細書での用語ポリペプチドである。当業者に既知の多くの有用な目的を提供 するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多くの修飾がなされていることは、明らかで あろう。「ポリヌクレオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポリヌクレ オチドのこのような化学的、酵素的または代謝的に修飾した形態、ならびにウイ ルス、とりわけ単純型細胞および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡおよ びＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしば、オリゴ ヌクレオチド（複数でも可）と称される短鎖ポリヌクレオチドを包含する。 本明細書で用いる「ポリペプチド」は、ペプチド結合により直鎖で互いに結合 している２個またはそれ以上のアミノ酸を含むペプチドまたは蛋白をいうのに用 いる。「ポリペプチド」は、当該分野で通常例えばペプチド、オリゴペプチドお よびオリゴマーとも称される短鎖、および多くの型があり、当該分野で一般的に 蛋白と称する長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、遺伝子によりコードされ る２０種のア ミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、プロセッシン グおよび他の翻訳後修飾のような自然の工程により、ならびに化学修飾によるも のを包含する。かかる修飾は基礎的なテキストおよびさらに詳細な論文ならびに 多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当業者に周知である。同じ タイプの修飾がポリペプチド中にいくつかの部位に同程度または種々の程度で存 在してもよいことが理解されるであろう。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖 、およびアミノもしくはカルボキシ末端を包含するポリペプチドのいずれの場所 にあってもよい。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボ シル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドま たはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホ チジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メ チル化、共有結合架橋形成、シスチン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル 化、ガンマーカルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化 、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白加水分解プロセッシング、 リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などの 転移ＲＮＡ媒介の蛋白へのアミノ酸付加、およびユビキチネーションがある。例 えば、Proteins-Structure and Molecular Properties、第2版、T.E.Creighton 、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク（1993）に記載されている。例えば 、Posttranslational Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson編、ア カデミック・プレス、ニューヨーク（1983）のWold,F.，Posttranslational Pro tein Modifications:Perspective and Prospects、 1〜12頁；Seifterら、Meth. Enzymol.182:626-646（1990）およびRattanら、Protein Synthesis：Posttransl ational Modifications and Aging，Ann．N．Y．Acad．Sci．663:48-62（1992） 参照。ポリペプチドは分枝状あるいは分枝ありまたはなしの環状であってもよい 。環状、分枝状、および分枝状かつ環状のポリペプチドは、翻訳後の天然プロセ スから生じるものであってもよく、同様に全く合成的な方法により製造されるも のであってもよい。 本明細書で用いる「変種」なる用語は、対照ポリヌクレオチドまたはポリペプ チドとは各々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的な特 性は 保持している。典型的なポリヌクレオチドの変種は、別の対照ポリヌクレオチド とはヌクレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列の変化は、対照ポリヌ クレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させるもので あってもよく、変化させないものであってもよい。以下に論じるように、ヌクレ オチドの変化は結果的に、対照配列によりコードされるポリペプチドにおけるア ミノ酸置換、付加、欠失、融合および末端切断を招く。典型的なポリペプチドの 変種は、別の対照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的には、差異は 、対照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体的に非常に類似しており、多くの 領域で同一なものに限られる。変種および対照ポリペプチドは、１またはそれ以 上の置換、付加、欠失が任意の組み合わせで起こることにより、アミノ酸配列が 変化し得る。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝学的コードによりコー ドされたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの 変種は、例えば対立遺伝子変種のような自然発生的なものでもよく、または自然 発生することが知られていない変種でもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプ チドの非自然発生変種は、突然変異技術または直接的合成、および当業者に知ら れた他の組み換え法により製造できる。 発明の説明 本明細書記載の各ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を抗菌化合物の発 見または開発に使用してもよい。適当な開始コドンおよび終止コドンを伴う配列 が発現される場合、コードされたポリペプチドを抗微生物剤のスクリーニングの ための標的として使用できる。さらに、好ましくはコードされた蛋白のアミノ末 端領域またはシャイン−ダルガーノ領域をコードしているＤＮＡ配列を用いてア ンチセンス配列を構築し、目的コーディング配列の発現を制御することもできる 。さらにそのうえ、本明細書開示の配列の多くはコーディング配列の上流および 下流の領域も提供する。これらの配列は細菌遺伝子発現の制御のための調節エレ メントの源として有用である。これらの配列は細菌遺伝子発現の制御のための調 節エレメントの源として有用である。便利には、制限酵素の作用によりかかる配 列を単離するか、ある いは化学合成によりかかる配列を合成し、ついで、プロモーター同定株に導入す る。これらの株は、制限部位の下流に位置するレポーター構造遺伝子配列を有し ており、活性プロモーターが挿入された場合、レポーター遺伝子が発現するであ ろう。 各配列を上記のごとく使用してもよいが、本発明はさらに特に有用な標的遺伝 子の同定のためのいくつかの手段を提供する。これらの方法の第１のものは、関 連生物における配列合致検索用の適当なデータベースを検索することを含む。よ って、相同体が存在する場合、この遺伝子のストレプトコッカス様形態はおそら く類似の役割を果たすであろう。例えば、別の生物の細胞表面蛋白に相同的であ ると同定されたストレプトコッカスの蛋白はワクチン候補として有用であろう。 本明細書開示の配列に対して相同性が確認されるかぎり、それらをコーディング 配列とともに報告する。 ＯＲＦ遺伝子発現 近年の方法は、細菌における一時的遺伝子発現の評価に使用できるようになっ ており、特に、研究室的条件および感染条件における生存性について適用されて いる。多くの方法を用いて生存そのものに必要な遺伝子、または感染の確立／維 持に必要な遺伝子を同定することができる。これらの方法の１つによる未知ＯＲ Ｆの同定によってその機能に関するさらなる情報が得られ、スクリーニング標的 としてさらに開発すべきＯＲＦの選択が可能になる。簡単に説明すると、これら の方法は以下のものを包含する： １）シグナチャータグ化突然変異法（Signature Tagged Mutagenesis：STM） この技法は、Henselら、Science269:400-403（1995）に記載されており、その 内容を出典明示により本明細書の一部とする。シグナチャータグ化突然変異誘発 は、所定感染モデルにおける感染の確立／維持に必要な遺伝子を同定するもので ある。 この技法は、種々の手段（例えばトランスポゾン）により、標的生物にランダ ムに突然変異を誘発し、独特なＤＮＡ配列タグを突然変異部位に非常に近接して 挿入することに基づく。細菌性突然変異体および感染宿主から回収した細菌の混 合集団からのタグは、増幅、放射性標識化およびハイブリダイゼーション分析に より検出 される。毒性を減じた突然変異体は、感染宿主から回収した細菌のプールのタグ の欠如により表される。 ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）において は、トランスポゾンシステムはあまり開発されていないので、タグ化突然変異体 を作るためのより有効な方法は、その内容を出典明示により本明細書の一部とす る、Morrisonら、J.Bacteriol.159:870（1984）に記載される挿入-複製突然変異 法を用いる。 ２）インビボ発現法（In Vivo Expression Technology：IVET） この技術はCamilliら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA．91:2634-2638（1994）お よびMahanら、Infectious Agents and Diseases 2:263-268（1994）に記載され ており、各々の内容を出典明示により本明細書の一部とする。IVETは、実験培養 と比較した場合、感染において重要な役割を有する、感染中にアップレギュレー ションする遺伝子を同定する。この技法により同定される配列は感染の確立/維 持に重要な役割を有する。 この技法では、標的生物のランダムな染色体フラグメントは、プラスミドベク ターのプロモーター不含リポーター遺伝子の上流でクローン化される。プールを 宿主に導入し、感染後の種々の時間に細菌を回収し、リポーター遺伝子発現の存 在を評価できる。発現したリポーター遺伝子の上流に担持される染色体フラグメ ントは、感染中に正常なアップレギュレーションをうけるプロモーターまたは遺 伝子部分を担持するはずである。組換え酵素遺伝子の上流を配列決定すると、ア ップレギュレーションされた遺伝子を同定できる。 ３）引き算ディスプレイ この技法は、その内容を出典明示により本明細書の一部とする、Chuangら、J. Bacteriol.175:2026-2036（1993）に記載されている。この方法はランダムプラ イムＲＴ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡの存在を同定することにより、生体に発現す る遺伝子を同定する。感染前および感染後のプロフィールを比較することにより 、感染中にアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされる遺伝子 を同定でき、ＲＴ−ＰＣＲ生成物が配列決定され、未知ＯＲＦに適合させられる 。 ４）トランスポゾン突然変異誘発による条件致死変異体の発生 この技法は、de Lorenzo,V.ら、Gene 123:17-24(1993)；Neuwald,A.F.ら、Gen e 125:69-73（1993）およびTakiff,H.E.ら、J.Bacteriol.174:1544-1553（1992 ）に記載されており（その内容を出典明示により本明細書の一部とする）、発現 が細胞の生存に必須である遺伝子を同定する。 この技法では、一方向または両方向でトランスポゾンから外側へ転写する、調 節可能なプロモーターを担持するトランスポゾンを生じる。これらのトランスポ ゾンを標的生物にランダムに挿入し、続いてプロモーター活性のインデューサー の存在下で挿入突然変異体を単離すると、発現が細胞の生存に必須である遺伝子 のコーディング領域とプロモーターとを分離するインサートが回収されることが 確認される。このインサートは生存できないので、引き続いてインデューサー不 含のレプリカ平板法でかかるインサートを同定する。トランスポゾンに隣接する 領域の配列決定により挿入部位を同定し、分断された遺伝子を同定する。インデ ューサー不存在下での成長中の細胞の過程/形態の変化を正確にモニターし、遺 伝子の可能な機能に関する情報を得る。このようなモニター観察には、フローサ イトメトリー（細胞分割、溶解、酸化還元能、ＤＮＡ複製）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、 蛋白、脂質、ペプチドグリカンへの放射性化学的標識前駆体の取り込み、既知の 細胞性ストレスに反応するリポーター酵素遺伝子融合物のモニター等がある。 ５）化学的突然変異法による条件致死突然変異体の発生 この技法は、出典明示により本明細書の一部とする、Beckwith,J.Methods in Enzymology204:3-18（1991）に記載されている。この技法では標的生物のランダ ム化学的突然変異を誘発し、生理学的温度（許容温度）とは異なる温度で増殖さ せ、続いてレプリカ平板法を行い、異なる温度（例えばｔｓ同定のためには４２ ℃、ｃｓ同定のためには２５℃）で成長させ、その時成長できなかった単離物（ 条件付き突然変異体）を同定する。前記のように、非許容温度での増殖における 変化を正確にモニターし、突然変異遺伝子の機能に関する情報を得る。標的生物 からのライブラリーにより条件致死突然変異を相補し、および相補遺伝子を配列 決定することにより、未知ＯＲＦと適合させることができる。 ６）ＲＴ−ＰＣＲ ストレプトコッカス・ニューモニアエのメッセンジャーＲＮＡを、細菌感染し た組織、例えば４８時間ネズミ・肺感染の組織から単離し、ランダムヘキサヌク レオチドでプライムしたＲＮＡサンプルの逆転写により、続いて遺伝子特異的プ ライマー対でのＰＣＲにより、ｍＲＮＡ種の各々の量を評価する。得られたＰＣ Ｒ生成物の定量化により特定のｍＲＮＡ種の存在および量を決定し、感染した組 織に転写された細菌遺伝子に関する情報を得る。遺伝子転写の分析は、感染の種 々の時間で実施でき、細菌による発病における遺伝子制御に関する詳細な知識を 得ることができ、遺伝子産物が新規な抗菌物質をスクリーニングする標的に相当 することが明快に理解できるようになる。用いたＰＣＲプライマーの遺伝子特異 的特性のために、細菌性ｍＲＮＡ調製物は遊離の哺乳動物ＲＮＡである必要はな いことが理解されるべきである。これにより研究者は、感染組織から簡単かつ迅 速にＲＮＡを調製して、細菌中で非常に短時間しか生育できない（半減期２分程 度）細菌性ｍＲＮＡ種を得ることができる。最適には、ＴＲＩゾール（ギブコ− ＢＲＬ）を非常に短時間存在させ、機械的に破壊することにより、細菌性ｍＲＮ Ａを感染ネズミ肺組織から調製し、続いてＴＲＩゾール試薬の製造者の指示に従 ってプロセッシングし、ＤＮＡａｓｅ処理して夾雑ＤＮＡを除去する。好ましく は、適宜標識した配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてノーザンをプ ロービングすることにより検出されるようなスタフィロコッカス・アウレウスの １６ＳリボソームＲＮＡ、好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスの１６Ｓ リボソームＲＮＡの最大量を得る条件を見出すことによりプロセッシングが最適 化される。典型的には、最適には８から２５サイクルで終了するＰＣＲ反応にお ける各ＰＣＲプライマー対には５’色素標識プライマーを用いる。ＰＣＲ生成物 は６％ポリアクリルアミドゲルで分離し、GeneScanner（ＡＢＩ製）を用いて検 出および定量する。 これらの方法のそれぞれは、個々の適用により長所または短所を有するかもし れない。当業者は個々の目的を考慮して最も適当な方法を選択するであろう。例 えば、いくつかの遺伝子は感染に必須であると認識されるかもしれないが、実際 には感染 の開始に必要であり、そのため、それらの生成物は確立され慢性化した感染を治 療するように開発される抗細菌剤をとしては比較的魅力に乏しい標的であるかも しれない。 本発明のＯＲＦに適用する場合、これらの技法を用いると、感染中に発現する 細菌性蛋白の種類、抗細菌治療に利用できる阻害物質の直接的同定が可能になる 。 本発明は、以下に非常に詳細に説明する、新規ポリペプチドおよびポリヌクレ オチドに関する。詳細には、本発明は、表１に示す既知ポリペプチドに対するア ミノ酸配列相同性により関連づけられるストレプトコッカス・ニューモニアエの 新規ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。特に本発明は、配列表に示 す配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有する 化合物に関し、さらに寄託株中のＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれによりコ ードされるアミノ酸配列に関する。 寄託物質 ストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993株を含有する寄託物は、ナショ ナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・ リミテッド（ＮＣＩＭＢという）、２３ストリート、マッカードライブ、アベル ディーンＡＢ２１ＲＹ、スコットランドに１９９６年４月１１日寄託し、ＮＣＩ ＭＢ受託番号４０７９４が付与された。寄託したことにより、寄託株をストレプ トコッカス・ニューモニアエ0100993株という。１９９６年４月１７日に、イー ・コリ（E.coli）中のストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993ＤＮＡライ ブラリーをＮＣＩＭＢに同様に寄託し、受託番号４０８００を付与された。スト レプトコッカス・ニューモニアエ株寄託物を、本明細書では「寄託株」または「 寄託株のＤＮＡ」という。 寄託株は配列表に示すポリヌクレオチドを含む全長遺伝子を含んでいる。寄託 株中に含まれるポリヌクレオチド配列ならびにそれによりコードされるポリペプ チドのアミノ酸配列は、本明細書の配列に関する任意の記載に矛盾する事象にお いて支配的である。 寄託株の寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条 約 の条件下でなされている。特許が発行されると何らの制限または条件もなく、最 終的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ.Ｓ. Ｃ.１１２条のもとに要求されるような、寄託が実施可能要件であることを承認 するものではない。 寄託物を製造、使用または販売するためにはライセンスが必要であるが、その ようなライセンスはここでは賦与されていない。 ポリペプチド 本発明ポリペプチドは配列表に示すポリペプチド（特に、成熟ポリペプチド） ならびにポリペプチドおよびフラグメント、詳細には本発明ポリペプチドの生物 学的活性を有するものを包含し、さらに配列表に示す配列からなる群より選択さ れるポリペプチド配列またはその重要部分に対して少なくとも５０％、６０％ま たは７０％、好ましくは配列表に示す配列からなる群より選択されるポリペプチ ド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドおよびフラグメ ント、より好ましくは配列表に示す配列からなる群より選択されるポリペプチド 配列に対して少なくとも９０％の類似性を有し（より好ましくは、少なくとも９ ０％の同一性を有し）、さらにより好ましくは配列表に示す配列からなる群より 選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９５％の類似性を有する（さら により好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する）ポリペプチドおよびフラ グメント、さらに通常には少なくとも３０個、より好ましくは少なくとも５０個 のアミノ酸を含むかかるポリペプチドの部分を包含する。 また本発明は式： Ｘ−（Ｒ₁）_n−（Ｒ₂）−（Ｒ₃）_n−Ｙ で示されるポリペプチドを包含し、式中のアミノ末端においてＸは水素であり、 カルボキシル末端においてＹは水素または金属であり、Ｒ₁およびＲ₃はアミノ酸 残基、ｎは１ないし２０００の整数であり、Ｒ₂は本発明アミノ酸配列、特に、 配列表に示す群より選択されるアミノ酸配列である。上の式において、Ｒ₂はそ のアミノ末端残基が左にあってＲ₁と結合し、そのカルボキシ末端残基が右にあ ってＲ₃ に結合するような方向とされる。いずれかのＲ基（Ｒは１より大）により示され るアミノ酸残基の伸長部分はヘテロポリマーであってもホモポリマーであっても よく、好ましくはヘテロポリマーである。特に好ましい具体例においてｎは１な いし１０００の整数である。 フラグメントは、前述のポリペプチドのアミノ酸配列のすべてではなく一部に 対して全く同一であるアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。ポリペプ チドについては、フラグメントは「独立して存在（free standing）」している か、または一部分もしくは領域を形成することにより、大型のポリペプチド内に 含まれていてもよく、最も好ましくは単一の連続した領域、すなわち大型の単一 ポリペプチドとして含まれる。 好ましいフラグメントは、例えば、配列表のアミノ酸配列の一部分を有する末 端切断されたポリペプチド、またはそれらの変種を包含するが、その例としては アミノ末端を含む一連の残基を切断、またはカルボキシル末端を含む一連の残基 を切断したものがある。宿主、とりわけストレプトコッカス・ニューモニアエに おける、本発明のポリペプチドの分解形態もまた好ましい。また、構造的または 機能的属性により特徴づけられたフラグメント、例えばアルファーヘリックスお よびアルファーヘリックス形成領域、ベータシートおよびベータシート形成領域 、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎 水性領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面形成 領域、基質結合領域、および高抗原性指標領域を含むフラグメントなども好まし い。 本発明ポリペプチドの活性を媒介し、あるいは活性を改善し、望ましくない活 性を減じられたフラグメントである生物学的に活性のあるフラグメントも好まし い。動物、とりわけヒトにおいて抗原的または免疫原的なフラグメントもまた含 まれる。個体、特にヒトにおけるストレプトコッカス・ニューモニアエの生存に 必須の機能、あるいは疾病を開始または維持する能力を付与する酵素の受容体ま たはドメインを含むフラグメントが特に好ましい。 本発明ポリペプチドのフラグメントである変種を、ペプチド合成による対応全 長ポリペプチドの製造に使用してもよく、それゆえ、これらの変種を全長のポリ ペプ チド製造のための中間体として用いてもよい。 標準的なアミノ酸の１文字および３文字表記に加えて、「Ｘ」または「Ｘａａ 」も使用する。「Ｘ」および「Ｘａａ」は、ポリペプチド配列中の当該表記位置 に２０種の天然アミノ酸のいずれかが存在することを意味する。 ポリヌクレオチド 本発明の別の態様は単離ポリヌクレオチドに関するものであり、それには配列 表の配列からなる群より選択される推定アミノ酸配列を有するポリペプチドをコ ードする単離ポリヌクレオチドおよびそれに密接に関連するポリヌクレオチドお よびそれらの変種が包含される。 本明細書に提供される情報を用いて、例えば配列表に示すポリヌクレオチド配 列を用い、出発物質としてストレプトコッカス・ニューモニアエ0100993細胞か らの染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列決定するために用いる 標準的なクローニングおよびスクリーニングを用いて、ポリペプチドをコードし ている本発明ポリヌクレオチドを得て、次いで、全長のクローンを得てもよい。 例えば、本発明ポリヌクレオチド配列、例えば配列表に示す配列を得るために、 イー・コリ（E.coli）またはいくつかの他の適切な宿主におけるストレプトコッ カス・ニューモニアエ0100993の染色体ＤＮＡのクローンの典型的なライブラリ ーを、部分配列に由来する、好ましくは１７量体またはそれ以上の長さの放射性 標識化オリゴヌクレオチドにてプローブする。プローブのＤＮＡに同一であるＤ ＮＡを担持するクローンは厳密な条件を用いて区別できる。元の配列から設計し た配列決定プライマーを用いてこのように同定した個々のクローンを配列決定す ることにより、両方向で配列が伸長できるようになり、全遺伝子配列を決定でき る。便利には、かかる配列決定はプラスミドクローンから調製した変性二本鎖Ｄ ＮＡを用いて実施する。適切な技法については、Maniatis,T.、Fitsch,F.F.およ びSambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第２版；コールド・ スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ ー、ニューヨーク（1989）に記載されている（Screening By Hybridization 1.9 0およびSequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70参照）。本発明の典型例にお いて、配列表に示すポリヌクレオチドが、ストレプトコッカス・ニューモニアエ 0100993由来のＤＮＡライブラリー中に見いだされた。 配列表に示すＤＮＡ配列は、配列表に示すアミノ酸残基数とほぼ同数のアミノ 酸からなる蛋白をコードしている読み枠を含んでいる。各読み枠（「ＯＲＦ」と いう）のスタートコドンおよびストップコドンは配列表に示す各ポリヌクレオチ ドの最初および最後の３個のヌクレオチドである。 本発明の特定のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、表１に示す既知蛋白 に構造的に関連している。これらの蛋白は、既知蛋白のなかでも表１に掲載する 相同体に対してより大きな相同性を示す。 本発明は、配列表の各コーディング配列に対して全長にわたり同一であるポリ ヌクレオチド配列を提供する。成熟ポリペプチドのコーディング配列またはそれ らのフラグメント、ならびにその他のコーディング配列を有する読み枠中の成熟 ポリペプチドのコーディング配列またはそのフラグメント、例えばリーダーまた は分泌配列、プレ、プロ、プレプロ蛋白配列をコードする配列も本発明により提 供される。ポリヌクレオチドは、例えば、転写された非翻訳配列、終止シグナル 、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化する配列、イントロン、ポリアデニル 化シグナル等の転写非翻訳配列、および付加アミノ酸をコードする付加コーディ ング配列等の非コーディング５'および３'配列等の非コーディング配列をも含有 しうるが、これらに限定するのではない。例えば、融合ポリペプチドの精製を促 すマーカー配列をコードすることもできる。本発明のある好ましい態様において 、マーカー配列は、ｐＱＥベクター(Qiagen,Inc.)中に提供されるようなヘキサ ーヒスチジンペプチド(Gentzら、Proc.Natl.Acad．Sci.，USA，86:821-824（198 9）に記載される）またはＨＡタグ（Wilsonら、Cell，37:767（1984））である 。本発明のポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子および遺伝子発現を調節する天 然の配列をも含むが、これらに限定するものではない。 本発明の好ましい具体例は、式： Ｘ−（Ｒ₁）_n−（Ｒ₂）−（Ｒ₃）_n−Ｙ で示されるポリヌクレオチドを包含し、分子の５’末端においてＸは水素であり 、分子の３’末端においてＹは水素または金属であり、Ｒ₁およびＲ₃は核酸残基 、ｎは１ないし３０００の整数であり、Ｒ₂は本発明核酸配列、特に配列表に示 す群より選択される核酸配列である。上のポリヌクレオチドの式において、Ｒ₂ はその５’末端残基が左にあってＲ₁に結合し、その３’末端残基が右にあって Ｒ₃に結合するような方向とされる。いずれかのＲ基（Ｒは１より大）により示 される核酸残基の鎖はヘテロポリマーであってもホモポリマーであってもよく、 好ましくはヘテロポリマーである。好ましい具体例においてｎは１ないし１００ ０の整数である。 上記した本明細書の用語「ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド」 は、本発明ポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含し 、詳細には、細菌のポリペプチド、より詳細には配列表に示すアミノ酸配列を有 するストレプトコッカス・ニューモニアエのポリヌクレオチドをコードする配列 を含むポリヌクレオチド包含する。該用語は、コーディング配列および／または 非コーディング配列を含んでいてもよいさらなる領域を伴った、ポリペプチドを コードしている単一の連続領域または不連続領域（例えば、組み込まれたファー ジまたは配列の挿入または配列の編集により分断されたもの）を含むポリヌクレ オチドを包含する。 さらに本発明は、配列表の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変種をコ ードする上記ポリヌクレオチドの変種にも関する。本発明ポリヌクレオチドのフ ラグメントである変種を用いて本発明の全長ポリヌクレオチドを合成してもよい 。 さらに特に好ましい具体例は、配列表のポリペプチドのアミノ酸配列を有する ポリペプチド変種をコードするポリヌクレオチドであり、その中には、いくつか 、少しの、５ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１または０個のアミノ 酸残基を置換、欠失または付加を任意の組み合わせで施したアミノ酸配列を有す る。中でもとりわけ好ましいものは、かかるポリヌクレオチドの特性および活性 を変化させないサイレント置換、付加および欠失である。 本発明のさらに好ましい具体例は、配列表に示すアミノ酸配列を有するポリペ プチドをコードしているポリヌクレオチドに対して、その全長にわたり少なくと も５０％、６０％または７０％の同一性があるポリヌクレオチド、およびかかる ポリヌ クレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドである。あるいはまた、寄託株の ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対してその全長にわたり少な くとも８０％同一である領域を含むポリヌクレオチド、およびそれに対して相補 的なポリヌクレオチドが最も非常に好ましい。この点に関して、全長で少なくと も９０％同一であるポリヌクレオチドがとりわけ好ましく、中でも少なくとも９ ５％の同一性を有するものが特に好ましく、さらに少なくとも９５％の同一性を 有するものの中でも少なくとも９７％であるのがより好ましく、中でも少なくと も９８％および少なくとも９９％であるのが特に好ましく、さらに少なくとも９ ９％であるのがより好ましい。 好ましい具体例は、配列表のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポ リヌクレオチドに対して少なくとも５０％の同一性を有するポリヌクレオチドで あって、エス・ニューモニアエ（S．pneumoniae）以外の原核生物種から得られ るポリヌクレオチド;および配列表のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の 同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオ チドであって、エス・ニューモニアエ（S．pneumoniae）以外の原核生物種から 得られるポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含 む単離ポリヌクレオチドである。 好ましい具体例は、配列表のＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実 質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードしているポ リヌクレオチドである。 本発明はさらに本明細書上述の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに 関する。この点に関して、本発明は特に厳密な条件で本明細書上述のポリヌクレ オチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で用いる「厳 密な条件」および「厳密なハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の 同一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％である場合のみに起こ るハイブリダイゼーションを意味する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例 としては、５０％ホルムアミド。５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５ｘデン ハーツ溶液、１０％ 硫酸デキストラン、および２０マイクログラム／ｍｌの変性し、剪断されたサケ 精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃で一晩インキュベーションし、続いて約６ ５℃で０.１ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄するものである。ハイブリダイゼー ションおよび洗浄条件は周知であり、Sambrookら、Molecular Cloning,A Labora tory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989 ）、とりわけその第１１章に実例が示されている。 本発明はまた、厳密なハイブリダイゼーション条件で、配列表に示すポリヌク レオチド配列に関する完全遺伝子を含む適当なライブラリーを、上記ポリヌクレ オチド配列またはそのフラグメントの配列を有するプローブでスクリーニングし 、ＤＮＡ配列を単離することにより得ることのできるポリヌクレオチド配列を必 須として含むポリヌクレオチドをも提供する。かかるポリヌクレオチドを得るた めに有用なフラグメントには、例えば本明細書の別の箇所において説明するプロ ーブおよびプライマー等がある。 本発明のポリヌクレオチドアッセイに関してここでさらに論じるが、例えば上 述の本発明ポリヌクレオチドを、ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ全長および ゲノムクローンを単離するための、および配列表に示すポリヌクレオチドに高度 な配列類似性を有するその他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離す るための、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプ ローブとして使用することができる。このようなプローブは通常少なくとも１５ 塩基を含む。好ましくはこのようなプローブは少なくとも３０塩基を有し、少な くとも５０塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプローブは少なくとも３ ０塩基を有し、５０塩基またはそれ以下である。 例えば、配列表に示すポリヌクレオチドを含む、あるいはこれに含まれる各遺 伝子のコーディング領域は、配列表に示すＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチ ドプローブを合成してスクリーニングすることにより単離できる。次いで、本発 明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡ 、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーのスクリーニングに用い、プロー ブがライブラリーのいずれのメンバーにハイブリダイゼーションするのかを決定 する。 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、例えば、疾病とりわけヒト の疾病の治療法および診断法の発見のための研究試薬および材料として使用でき 、とりわけポリヌクレオチドアッセイに関連して本明細書でさらに論じる。 配列表に示すポリヌクレオチドまたはポリペプチドに由来するオリゴヌクレオ チドである本発明ポリヌクレオチドを本明細書記載の方法に使用してもよいが、 好ましくはＰＣＲに使用して、本明細書で同定したポリヌクレオチドの全体また は一部が感染した組織に転写されるかどうかを決定する。かかる配列が、病原体 が達成した感染段階および感染型の診断にも有用であることが理解される。 また本発明は、さらなるアミノもしくはカルボキシル末端アミノ酸、または成 熟ポリペプチドに内在するアミノ酸を加えた成熟蛋白であるポリペプチドをコー ドできるポリヌクレオチドも提供する（例えば成熟形態が一つ以上のポリペプチ ド鎖を有する場合）。このような配列は、前駆体から成熟形態への蛋白のプロセ ッシングに役割を担い、蛋白の輸送を可能にし、蛋白の半減期を延長もしくは短 縮し、またはとりわけアッセイもしくは製造のための蛋白の操作を容易にするこ とができる。一般的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞性酵素によりプロ セッシングされ、成熟蛋白から取り除かれる。 １またはそれ以上のプロ配列と融合した成熟形態のポリペプチドを有する前駆 蛋白は、ポリペプチドの不活性形態でありうる。プロ配列が除去されると、通常 にはこのような不活性前駆体が活性化される。プロ配列のいくつかまたはすべて を活性化の前に除去できる。通常、このような前駆体はプロ蛋白と称される。 核酸塩基に関する標準記号Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕに加えて、また「Ｎ」なる語を 、本発明の特定のポリヌクレオチドを記載するのに用いることができる。「Ｎ」 は、隣接するヌクレオチド位置と一緒になって作用する場合、正確な読み枠を読 中で読まれる場合で、Ｎがそのような読み枠において未成熟終止コドンを形成す る効果を有する塩基でないことが好ましい場合を除き、４種のＤＮＡ塩基または ＲＮＡ塩基のいずれかがＤＮＡまたはＲＮＡ配列の当該位置にあることを意味す る。 要するに、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配列を加えた成熟 蛋白（プレ蛋白と称してもよい）、プレ蛋白のリーダー配列ではない１またはそ れ以 上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列および１またはそ れ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体であるプレプロ蛋白をコードしてい てもよく、プロ配列は通常ポリペプチドの活性および成熟形態を生成するプロセ ッシング段階で除去される。 ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含むベク ター、本発明ベクターで遺伝子操作される宿主細胞および組換え技法による本発 明のポリペプチドの製造にも関する。本発明ＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用 い、無細胞翻訳系を用いてこのような蛋白を製造できる。 組換え体を製造するために、宿主細胞を遺伝子操作して、発現系もしくはそれ らの一部、または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。ポリヌク レオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davisら、Basic Methods in Molecula r Biology（1986）；Sambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、 第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・ スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）のように、多くの標準的な実験マ ニュアルに記載される方法により行うことができ、例えばリン酸カルシウムトラ ンスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トラン スベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクシ ョン、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレープ負荷、バリス ティック導入および感染等がある。 適当な宿主の代表的なものには、細菌細胞、例えばストレプトコッカス属（St reptococci）、スタフィロコッカス属（Staphylococci）、エンテロコッカス属 （Enterococci）、イー・コリ（E.coli）、ストレプトミセス（Streptomyces） およびバチルス・ズブチリス（Bacillus subtiis）細胞；真菌細胞、例えば酵母 細胞およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞;昆虫細胞、例えばドロソフィ ラＳ２（Drosophila S2）およびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）細胞； 動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、 ２９３およびボウズ（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞等がある。 本発明のポリペプチドを製造するために非常に多くの発現系を使用できる。こ のようなベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例 えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母 エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ ュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノ ウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイル ス由来のベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来するベクター、例 えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター 、例えばコスミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物は発現を制御お よび引き起こす調節領域を含有していてもよい。この点に関して、一般的には、 宿主中にポリヌクレオチドを保持、伸長または発現するのに、および／またはポ リペプチドを発現するのに適した任意の系またはベクターを発現に使用できる。 周知のおよび通常的な種々の任意の技術により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿 入してもよく、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual（ 上述）に記載されている。 翻訳蛋白を、小胞体内腔、ペリプラスミックスペースまたは細胞外環境へ分泌 させるために、適当な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むことがで きる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的なものであってもく、あるいは 異種性のシグナルでもよい。 本発明のポリペプチドは周知の方法により、組換え細胞培養物から回収および 精製でき、その方法には、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽 出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー 、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィ ー等がある。高速液体クロマトグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポ リペプチドが単離および／または精製中に変性した場合、再び活性なコンホーメ ーションにするために、蛋白再生のための周知の技法を用いることができる。 診断アッセイ 本発明は、診断試薬として使用するための本発明ポリヌクレオチドの使用にも 関する。真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるかかるポリヌクレオチド の検出は、疾患の診断のための診断法を提供する。本発明遺伝子を含む生物に感 染した真核生物（本明細書において「個体」とも称する）とりわけ哺乳動物、特 にヒトを種々の方法によりＤＮＡレベルで検出できる。 診断用の核酸は、感染した個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟 骨および皮膚より得ることができる。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用してもよく 、あるいは分析の前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いることにより酵素的 に増幅できる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ方法で用いることができる。増 幅法を用いると、真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトに存在する原核生物株を 、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づけすることができる。対照配列 の遺伝子型と比較した場合の増幅産物の大きさの変化により、欠失および挿入を 検出できる。点突然変異は、標識化した本発明ポリヌクレオチド配列に増幅ＤＮ Ａをハイブリダイズさせることにより同定できる。完全に対合した配列はＲＮア ーゼ消化により、または融解温度の差により、誤対合二重らせんから区別できる 。変性剤含有または不含ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動度の変化 を検出することにより、または直接的なＤＮＡの配列決定により、ＤＮＡ配列の 差を検出してもよい。例えばeyersら、Science,230:1242（1985）参照。また、 特異的な位置での配列の変化を、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼ およびＳ１保護または化学的切断法によって明らかにしてもよい。例えばcotton ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-4401（1985）参照。 本発明の遺伝子の突然変異または多型性を担持する細胞を、種々の技術により 、ＤＮＡレベルで、例えばセロタイピングすることにより検出してもよい。例え ば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて突然変異を検出することができる。ＲＴ−ＰＣＲは自 動検出系、例えばGeneScan等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。ＲＮ ＡまたはｃＤＮＡを同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに用いてもよい。例を 挙げると、本発明ポリペプチドをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーは 、突 然変異を同定および分析するのに用いることができる。これらのプライマーを用 いて、感染個体から単離された本発明ＤＮＡを増幅してもよく、次いで、該遺伝 子をＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に供してもよい。このように、ＤＮＡ 配列における突然変異を検出し、感染の診断および感染性物質のセロタイピング および／または分類に使用することができる。 本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感染、より好ましくはストレプトコッカ ス・ニューモニアエによる感染、および最も好ましくは、中耳炎、結膜炎、肺炎 、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎、最も詳細には例えば脳脊髄 液の感染のごとき髄膜炎のような疾病の診断方法を提供し、該方法は、配列表の 配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルの上昇を個体由来の試料から検出す ることを特徴とする。本発明ポリヌクレオチドの発現の増加または低下は、ポリ ヌクレオチドの定量法として当該分野でよく知られたいずれかの方法、例えば増 幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびそ の他のハイブリダイゼーション法を用いて測定できる。 さらに、正常対照組織サンプルと比較して本発明ポリペプチドの過剰発現を検 出するための本発明診断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出してもよい 。宿主由来のサンプル中の蛋白レベルを決定するために用いることができるアッ セイ技法は、当業者に周知である。かかるアッセイ法には、ラジオイムノアセッ イ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ等が ある。 抗体 本発明ポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそれらを発現する細胞を免 疫源として用いて、かかるポリペプチドに免疫特異的な抗体を得ることができる 。本明細書で用いる「抗体」には、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、 キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントが 包含され、さらに免疫グロブリン発現ライブラリーの産物等のＦａｂフラグメン トも包含される。 本発明のポリペプチドに対して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープ が 付いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくはヒトはでない動物に通 常の実験法を用いて投与することにより得ることができる。連続的細胞系培養に より産生される抗体を提供する、当業者周知の技術を用いて、モノクローナル抗 体を調製することができる。例としては、Kohler，G.およびMilstein，C.,Natur e，256:495-497（1975）；Kozborら、Immunology Today，4:72（1983）；Coleら 、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss，Inc.、77-96頁（1 985）に記載されるような種々の技法がある。 一本鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）を 適用して、本発明ポリペプチドに対する一本鎖抗体を得ることができる。また、 トランスジェニックマウスまたはその他の生物、例えばその他の哺乳動物を用い てヒト化抗体等の抗体を発現させてもよい。 別法として、ファージディスプレイ技法を用いて、抗−ポリペプチドを有する ことにつきスクリーニングされたヒト・リンパ球のＰＣＲ増幅されたｖ遺伝子の レパートリーから、本発明ポリペプチドを認識することについてスクリーニング されたヒトから、あるいは無処理のライブラリーから、ポリペプチドに対する結 合活性を有する抗体遺伝子を選別することもできる（McCafferty,J.ら、Nature 348:552-554（1990）；Marks，J.ら、Biotechnology 10:779-783（1992））。こ れらの抗体の親和性はチェインシャフリング（chain shuffling）により改善す ることもできる（Clackson,T.ら、Nature 352:624-628（1991））。 二つの抗原結合ドメインが存在する場合、各ドメインは「二特異性」抗体と称 する異なるエピトープに対して指向される。 上記抗体を用いてポリペプチドを発現するクローンを単離または同定してもよ く、上記抗体を親和性クロマトグラフィーにより精製することができる。 従って、とりわけ本発明ポリペプチドに対する抗体を、感染、とりわけ細菌感 染、特に中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜 炎、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜炎のような疾病の治療に用 いてもよい。 ポリペプチド変種には抗原的、エピトープ的または免疫学的に等価な変種等が あ り、本発明の特定の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導体」な る用語は、本発明により蛋白またはポリペプチドに対して生成した場合、病原お よび哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗体により特 異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含する。本明細書で用いる 「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊椎動物において抗体を産生させるの に適した処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間での即時的な物理 的相互作用を妨害するように作用するペプチドまたはその等価物を包含する。 ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に等価な誘導体、またはそれらの融合 蛋白は、マウスまたはその他の動物例えばラットもしくはニワトリを免疫するた めの抗原として使用できる。融合蛋白はポリペプチドに安定性を付与できる。抗 原は、例えば抱合することにより、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アル ブミン(ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモシアニン（keyhole limpe t haemocyanin：ＫＬＨ）に結合することができる。あるいはまた、蛋白もしく はポリペプチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチド の多重コピーを含む多重抗原ペプチドは、免疫原性を改良するための十分な抗原 性を有しているので、キャリヤーを使用しなくてすむ。 好ましくは、抗体またはそれらの変種を、個体における免疫原性を減じるため に修飾する。例えば、個体がヒトである場合、最も好ましくは、抗体は「ヒト化 」されており；この場合、ハイブリドーマ由来の抗体の相補性決定領域がヒト・ モノクローナル抗体に移植されており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-525 （1986）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273（1991）に記載されている 。 本発明のポリヌクレオチドを遺伝学的免疫において使用する場合、例えばプラ スミドＤＮＡの筋肉への直接注射(Wolffら、Hum.Mol.Genet.1:363(1992);Mantho rpeら、Hum.Gene Ther.4:419（1963））、特異的蛋白キャリヤーとＤＮＡとの複 合体の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264:16985（1989））、リン酸カルシウムとの ＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshef、PNAS 83:9551（1986））、種々の形態のリ ポソーム中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243:375（1989））、微粒子爆 撃（Tangら、Nature 356:152（1992）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12:791（ 1993））および クローン化レトロウイルスベクターを用いたインビボ感染(Seegerら、PNAS 81:5 849（1984））等の適切な送達方法を用いるのが好ましい。 アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子 本発明ポリペプチドを用いて、例えば、細胞、無細胞標品、化学ライブラリー 、および天然産物混合物中における小型分子基質およびリガンドの結合を評価し てもよい。これらの基質およびリガンドは天然基質およびリガンドであってもよ く、構造上または機能上の模倣物であってもよい。例えば、Coligan et al.,Cur rent Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5(1991)参照。 また本発明は、本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用を増強（ア ゴニスト）または阻害（アンタゴニスト）する化合物、詳細には、静菌性および ／または殺菌性化合物を同定するための、化合物のスクリーニング方法をも提供 する。該スクリーニング方法は高処理量の方法である。例えば、アゴニストまた はアンタゴニストをスクリーニングするために、合成反応混合物、膜、細胞エン ベロープもしくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、または本発明ポリペプ チドおよび標識基質もしくはかかるポリペプチドのリガンドを含むそれらの調合 物を、本発明ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである可能性のあ る候補化合物の不存在下または存在下でインキュベーションする。候補分子が本 発明ポリペプチドにアゴナイズまたはアンタゴナイズする能力は、標識化リガン ドの結合の低下またはこのような基質からの生成物の産生の低下に反映される。 結合しても影響を及ぼさない分子、すなわち本発明ポリペプチドの効果を誘導し ない分子は、最も良好なアンタゴニストである可能性がある。結合性が良好で、 基質からの生成物の生成速度を高める分子はアゴニストである。基質からの生成 物の生成速度またはレベルはリポーターシステムを用いることにより強調できる 。この点に関して有用なリポーターシステムには、生成物に転換される比色測定 用標識化基質、本発明ポリヌクレオチドまたはポリペプチド活性の変化に応答す るリポーター遺伝子、および当該分野で周知の結合アッセイ等があるが、これら に限定するものではない。 本発明ポリペプチドのアンタゴニストのアッセイのもう１つの例は競争アッセ イ であり、競争阻害アッセイに適した条件下で、かかるポリペプチドおよび潜在的 アンタゴニストを、かかるポリペプチドに結合する分子、天然基質もしくはリガ ンド、または基質もしくはリガンド模倣物と混合する。例えば放射活性または比 色測定用化合物により本発明ポリペプチドを標識し、結合分子に結合した、また は生成物に変換されたかかるポリペプチドの数を正確に決定して、潜在的なアン タゴニストの効果を評価できる。 潜在的アンタゴニストには、本発明ポリペプチドに結合し、そのことによりそ の活性を阻害し消失させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体な どがある。また、潜在的アンタゴニストは、密接に関連した蛋白または抗体のご とき小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドであってもよく、それらは結合分子 の同じ部位に結合するが、本発明ポリペプチドにより誘導される活性を誘導せず 、それゆえ本発明ポリペプチドを結合から排除することによりかかるポリペプチ ドの作用を妨害する。 潜在的アンタゴニストには、ポリペプチドの結合部位に結合し、およびそれを 占領し、それにより細胞性結合分子への結合を妨害して、正常の生物学的活性を 妨害する小型分子等がある。小型分子の例としては、小型有機分子、ペプチド、 ペプチド様分子等があるが、これらに限定するものではない。その他の潜在的ア ンタゴニストにはアンチセンス分子等がある（これらの分子についての記載に関 してはOkano,J.,Neurochem.56:560（1991）；Oligodeoxy-nucleotides as Antis ense Inhibitors of Gene Expression,ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリ ダ州(1988)参照）。好ましい潜在的アンタゴニストには、本発明ポリペプチド関 連化合物および本発明ポリペプチドの変種等がある。 本明細書に示す各ＤＮＡ配列を、抗細菌化合物の発見および開発に使用しても よい。コードされている蛋白は、発現した場合、抗細菌剤のスクリーニングのた めの標的として使用できる。さらに、コードされている蛋白のアミノ末端領域ま たは各ｍＲＮＡのシャインーダルガノ配列または他の翻訳容易化配列をコードし ているＤＮＡ配列を用いてアンチセンス配列を構築し、目的コーディング配列の 発現を制御することもできる。 本発明は、感染の続発症に関与する病因および哺乳動物宿主間の最初の物理的 相互作用を妨害するための本発明ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻害物 質の使用を提供する。とりわけ本発明分子を、内在デバイス上の哺乳動物細胞外 マトリックス蛋白または傷における細胞外マトリックス蛋白への細菌の付着、詳 細にはグラム陽性細菌の付着の防止；例えば、哺乳動物チロシンキナーゼのホス ホリレーションを開始することによる、蛋白により媒介される哺乳動物細胞への 侵入のブロック（Rosenshine et al.，Infect．Immunol．60: 2211 (1992)）； 哺乳動物細胞外マトリックス蛋白と細菌蛋白との間の、組織ダメージを媒介する 細菌付着のブロック；内在デバイスの移植または他の外科的方法以外により開始 される、感染における通常の病状の進行のブロックに使用することができる。 本発明アンタゴニストおよびアゴニストを、例えば、感染、とりわけ細菌感染 、特に中耳炎、結膜炎、肺炎、菌血症、髄膜炎、静脈洞炎、膿胸および心内膜炎 、最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のごとき髄膜炎のような疾病の抑制および 治療に用いてもよい。 ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）（本明細書中、エッチ・ピ ロリともいう）菌は、胃癌、潰瘍、胃炎を発病している世界中の人々の３分の１ 以上の胃に感染している（国際癌研究機関（International Agency for Researc h on Cancer）（1994）Schistomoses，Liver Flukes and Helicobacter Pylori （International Agency for Research on Cancer，Lyon，France；http：／／w ww.uicc．ch／ecp／ecp2904．htm））。さらに、この国際癌研究機関は、最近に なって、ヘリコバクター・ピロリと胃腺癌の間の因果関係を認識し、その細菌を グループＩ（限定的）発癌物質と分類した。本発明により提供されるスクリーニ ング法を用いて見出される本発明の好ましい抗菌化合物、特に広スペクトルの抗 生物質は、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療に有用である。このような治療は ヘリコバクター・ピロリ誘発性癌、例えば胃腸癌の出現を減少させる。かかる治 療はまた胃潰瘍および胃炎も治癒する。 ワクチン 本発明の別の態様は、個体とりわけ哺乳動物における免疫学的反応を誘導する 方法に関し、該方法は、感染、詳細には細菌感染、最も詳細にはストレプトコッ カス・ニューモニアエ感染から個体を防御するための抗体および／またはＴ細胞 免疫応答を生じさせるに十分な本発明ポリペプチドまたはそのフラグメントもし くは変種を個体に接種することを特徴とする。かかる免疫学的応答が細菌の複製 を遅らせる方法も提供される。本発明のさらにもう１つの態様は、個体における 免疫学的応答の誘導方法に関し、該方法は、疾病が個体においてすでに確立され ているか否かにかかわらず、インビボで本発明ポリヌクレオチドまたはポリペプ チド、またはそのフラグメントもしくは変種を発現させるために、本発明ポリヌ クレオチドまたはポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは変種の発現を 指令する核酸ベクターをかかる個体に送達して、例えば、抗体および／またはＴ 細胞免疫応答（例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞または細胞毒性Ｔ細胞）を生じ させる免疫学的応答を誘導して、該個体を疾病から防御する抗体を産生させるこ とを特徴とする。迅速に遺伝子を所望細胞中に投与する方法としては、粒子上に コーディングすること等がある。かかる核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核 酸、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含んでいてもよい。 本発明のさらなる態様は、免疫学的反応を宿主内に誘導できる、または誘導さ れたた宿主に導入した場合、本発明ポリヌクレオチドまたはそれによりコードさ れている蛋白に対する免疫学的反応を該宿主に誘導する免疫学的組成物に関し、 その組成物は組換えポリヌクレオチドまたはそれによりコードされている蛋白を 含み、該ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされている蛋白に対する抗原 をコードし発現するＤＮＡを含む。免疫学的応答を治療的または予防的に用いて もよく、また免疫学的応答はＣＴＬまたはＣＤ４⁺Ｔ細胞から生じるような抗体 免疫または細胞性免疫の形態であってもよい。 本発明ポリペプチドまたはそれらのフラグメントを、それ自身は抗体を産生し ないが、第１の蛋白を安定化し、免疫原的および保護特性を有する融合蛋白を産 生する能力のある共存蛋白（co-protein）と融合させてもよい。好ましくは、か かる融合組換え蛋白は、抗原補蛋白、例えばヘモフィルス・インフルエンザエ(H emophilus influenzae)由来のリポ蛋白Ｄ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ )またはベーターガラクトシダーゼのごとき共存蛋白、蛋白を可溶化してそれら の産生および精製を促進する比較的大きな共存蛋白等を含む。さらに、共存蛋白 は免疫系において普遍的な刺激を提供するという意味で、アジュバントとして作 用することができる。共存蛋白は第１の蛋白のアミノまたはカルボキシいずれの 末端に結合していてもよい。 本発明は、本発明ポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよびSato Y.ら、Sci ence273:352(1966)に記載されているような免疫刺激ＤＮＡ配列を含む組成物、 とりわけワクチン組成物、および方法を提供する。 また、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニアエに感染した動物モデル において、かかる遺伝的免疫化実験に用られるＤＮＡ構築物中の細菌細胞表面蛋 白の不変領域をコードすることが示されている、説明したポリヌクレオチドまた はとりわけそれらのフラグメントを用いる方法を提供し、これらはとりわけ予防 的または治療的免疫反応を刺激することができる蛋白エピトープを同定するのに 有用である。この研究は、哺乳動物、とりわけヒトにおける細菌感染とりわけス トレプトコッカス・ニューモニアエ感染の予防薬または治療的処置の開発のため に、感染に抵抗しこれを一掃するのに成功した動物の必須器官から特に価値ある モノクローナル抗体をうまく調製することを可能にすると思われる。 ポリペプチドを宿主接種用抗原として用いて、例えば損傷組織への細菌の付着 を阻害することにより細菌の侵入に対して防御する特異的抗体を得てもよい。組 織損傷の例としては、例えば機械的、化学的もしくは熱的ダメージにより、また は内在デバイスの埋め込みにより引き起こされた皮膚または結合組織の創傷、ま たは粘膜、例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷等がある。 また本発明は、適切な担体と一緒になった免疫原性組換え蛋白を含有するワク チン処方を包含する。蛋白は胃で分解されうるので、非経口的に、例えば皮下、 筋肉内、静脈内または皮膚内等に投与するのが好ましい。非経口投与に適した処 方には、抗酸化剤、緩衝液、静細菌剤、および処方を個体の体液（好ましくは血 液）と等張にする溶質を含有していてもよい水性または非水性滅菌注射液、およ び懸濁化剤ま たは増粘剤を含有していてもよい水性または非水性滅菌懸濁液等がある。処方は １回投与または多回投与用容器、例えばシールしたアンプルおよびバイアルに入 れてよく、使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態として 保存してもよい。ワクチン処方は処方の免疫原性を高めるアジュバント系を含有 していてもよく、例えば水中油系または当該分野で周知のその他の系等がある。 投与量はワクチンの特異的活性に依存し、通常の実験法により容易に決定できる 。 本発明を特定の蛋白、例えば配列表に示す蛋白に関して説明したが、本発明は 天然に存在する蛋白および、実質的に組換え蛋白の免疫原特性に影響しない付加 、欠失または置換を施した類似の蛋白のフラグメントを包含することが理解され よう。 組成物、キットおよび投与 本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはそれらの アゴニストもしくはアンタゴニストを含む組成物にも関する。本発明ポリペプチ ドを、細胞、組織もしくは生物に用いられる未滅菌もしくは滅菌済み担体と混合 して、例えば対象への投与に適した医薬的担体と混合して用いることができる。 このような組成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポリペプチ ド、および医薬的に許容できる担体または賦形剤を含む。このような担体には生 理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール およびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限定するものではない。 処方は投与法に適したものにすべきである。さらに本発明は、１またはそれ以上 の上記本発明組成物成分を充填した１またはそれ以上の容器を含む診断用および 医薬用パックおよびキットにも関する。 本発明ポリペプチドおよびその他の化合物を、単独で、あるいは治療用化合物 等のその他の化合物と組み合わせて用いてもよい。 いずれかの有効かつ利便的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、経膣、静脈 内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮膚内の経路で医薬組成物を投与 してもよい。 治療において、または予防薬として、活性物質を注射用組成物として、例えば 好 ましくは等張の滅菌水性分散物として個体に投与できる。 別法として、組成物を局所適用用、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼軟 膏点眼液、点耳液、洗口剤、含浸包帯および縫合用の糸、ならびにエアロゾール 等の形態に処方してもよく、適当な慣用的な添加物、例えば保存剤、薬物の浸透 を補助する溶媒、ならびに軟膏およびクリームには軟化剤を含有していてもよい 。かかる局所用処方は、適合した慣用的な担体、例えばクリームまたは軟膏基剤 、およびローションにはエタノールまたはオレイルアルコールを含有していても よい。このような担体は重量で処方の約１％から約９８％であってよく、より通 常には重量で処方の約８０％までとする。 哺乳動物とりわけヒトに投与するために、活性物質の１日あたりの投与量は、 ０．０１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ る。医者はあらゆる場合、個体に最も適した実際の投与量を決定し、年齢、体重 および特に個体の反応性に応じて変化させる。上述の投与量は、平均的なケース の典型例である。もちろん、高用量および低用量の範囲が適合する個々の例もあ り、かかる例は本発明の範囲内である。 内在デバイスには外科的インプラント、補てつデバイスおよびカテーテル等が あり、即ち個体の体に導入し、長時間その位置に存在するものである。このよう なデバイスには、例えば人工関節、心臓弁、ペースメーカー、血管移植片、血管 カテーテル、脳脊髄液シャント、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析（cont inuous ambulatory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カテーテル等がある。 本発明の組成物を注射により投与し、内在デバイスの挿入の直前に、関連細菌 に対する全身的な効果を得てもよい。手術後、デバイスが体内に存在する期間中 、処置を続けてもよい。さらに、外科的手技中に広げるカバーに用いて、細菌性 創傷感染、とりわけストレプトコッカス・ニューモニアエの創傷感染を防御する こともできる。 多くの整形外科医は、補てつ関節を有するヒトについては、菌血症を生じうる 歯科的処置の前に抗生物質予防法を考慮すべきであると考えている。遅延性の重 篤な感染は、時々補てつ関節を失うに至る深刻な合併症であり、有意性のある罹 病率お よび死亡率を伴う。それゆえ、この状況において、予防的な抗生物質に代わるも のとして、活性物質の使用を拡張することが可能である。 上述の治療に加え、一般的には本発明組成物を創傷の治療薬として使用して、 創傷組織において曝露されたマトリックス蛋白に細菌が付着するのを防いでもよ く、歯科治療においては抗生物質による予防法に代えて、またはそれと組み合わ せて予防的に使用してもよい。 別法として、本発明の組成物を用いて挿入直前の内在デバイスを浸してもよい 。創傷または内在デバイスを浸すだめには、活性物質は１μｇ／ｍｌから１０ｍ ｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。 ワクチン組成物を便宜的に注射可能な形態にする。慣用的なアジュバントを用 いて免疫反応を高めてもよい。接種に適した単位投与量は、抗原０.５〜５μｇ ／ｋｇであり、このような投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが好まし い。本発明化合物については、指示した投与量範囲では、適切な個体への投与を 妨げるような不利な毒性効果は観察されない。 本明細書に開示した各文献を、参照によりその全体が本明細書に記載されてい るものとみなす。本願が優先権を主張しているいずれの特許出願も、参照により その全体が本明細書に記載されているものとみなす。 表 配列表に示す各ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する特定の適切なデ ータを下表にまとめる。 表１ 権利消滅していて利用可能な配列（右欄「Desc」参照）を有する配列表中の配 列との比較に基づき、本発明の各ＯＲＦによりコードされる各ポリペプチドに対 する最も密接な相同体をこの表に掲載する。有意な相同体が検出されなかった場 合、「不明」と記す。本発明ＯＲＦによりコードされる好ましいポリペプチド、 特に、かかるＯＲＦを用いて得れれるかまたはかかるＯＲＦによりコードされて いる全長蛋白 は、とりわけ掲載された相同体の生物学的機能を有している。表１に掲載した各 相同体の決定に使用した分析はBlastP、BlastXまたはMPSearchであり、それぞれ よく知られたものである。左欄には配列表の各ＤＮＡ配列の配列番号を記載する 。中欄には配列表の各配列のうち蛋白（ポリペプチド）配列を記載し、それをコ ードするＤＮＡ配列に対応している（該ＤＮＡ配列は左欄にある）。いくつかの 場合、ＤＮＡ配列は１つよりも多い蛋白配列をコードしており、そのような場合 、１回よりも多く掲載され、コードされる蛋白配列の次に掲載される。 実施例 以下の実施例は、別に詳細に記載したこと以外は、当業者に周知で慣用的な標 準的な技法を用いて実施する。実施例は例示であって、本発明を限定するもので はない。 実施例１：株の選択、ライブラリーの製造および配列決定 配列表に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドは、イー・コリ中のストレ プトコッカス・ニューモニアエの染色体ＤＮＡのクローンライブラリーより得た 。重複するストレプトコッカス・ニューモニアエＤＮＡを含有する２個またはそ れ以上のクローンからの配列データを用いて、配列表に示すＤＮＡ配列を構築し た。ライブラリーは常套手段、例えば以下の方法１および２により製造してもよ い。 全細胞ＤＮＡをストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３より、標 準法に従って単離し、以下に示す二つの方法のいずれかによりサイズ分画する。 方法１ 標準的方法に従ってサイズ分画するために、全細胞ＤＮＡをニードル（needle ）に通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの大きさのＤＮＡフラグメントを エキソヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼで処理することによって末端切断 し、ＥｃｏＲＩリンカーを付加する。フラグメントを、ＥｃｏＲＩで切断したベ クター、ラムダＺａｐＩＩに連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケー ジングし、次いでパッケージングしたライブラリーでイー・コリを感染させる。 ライブラリーを標準方法により増幅する。 方法２ 全細胞ＤＮＡをライブラリーベクターにクローニングするための一連のフラグ メントを得るのに適当な１つの制限酵素（例えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、Ａｌｕ Ｉ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）またはその組み合わせで部分的に加水分解し、かかるフ ラグメントを標準的方法に従ってサイズ分画する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡ に連結し、次いでそのフラグメントをＥｃｏＲＩで切断したベクター、ラムダＺ ａｐＩＩに連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケージングし、パッケ ージングしたライブラリーでイー・コリを感染させる。ライブラリーを標準方法 によ り増幅する。 実施例２：感染期間中のストレプトコッカス・ニューモニアエからの遺伝子発現 の決定 ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３に急性感染した４日目の マウス鼠蹊部由来の壊死脂肪組織を、カオトロピック剤およびＲＮＡａｓｅ阻害 剤の存在下で効果的に破砕し処理して動物ＲＮＡおよび細菌ＲＮＡの混合物を得 る。安定な調合物および高収率の細菌ＲＮＡを得るための破砕および処理の最適 条件は、その後のノーザンブロット上における１６Ｓ ＲＮＡに特異的な放射性 標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの使用にも用いる。得られ たＲＮＡについてのＲＮＡａｓｅ不含、ＤＮＡａｓｅ不含、ＤＮＡおよび蛋白不 含の調合物は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３の各遺伝子 の配列から設計されたユニークなプライマーペアーを用いる逆転写ＰＣＲ（ＲＴ −ＰＣＲ）に適する。 ａ）急性感染のマウス動物モデルからのストレプトコッカス・ニューモニアエ０ １００９９３感染組織の単離 体積１０ｍｌの滅菌栄養培地（No.20xoid）に、寒天培養プレートから単離し た個々のストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３のコロニーを撒く 。３７℃で１６〜２０時間培養物を好気的にインキュベーション（静置培養）す る。このストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３ブロス培養物（ブ ロス中に約１０⁸ｃｆｕ／ｍｌとなるよう希釈）０．５ｍｌを右前足の大腿部（ 鼠蹊部）に皮下注射することにより４週齢のマウス（メス、１８〜２２ｇ、ＭＦ １株）をそれぞれ感染させる。感染後２４時間は、マウスを定期的にモニターす べきであり、その後、研究終了まで毎日モニターすべきである。全身感染の徴候 、すなわち、昏睡、逆立った毛、群れからの離脱を示す動物を詳細にモニターす べきであり、徴候が瀕死状態に至る場合には動物を即座に除去すべきである。 傷害進展を示す外部から目で見てわかる徴候は感染２４〜４８時間後に現れる であろう。動物の腹部の試験により、皮膚下の膿瘍の盛り上がった輸郭が示され るであろう。局所的な傷害は右の下大腿部にとどまるはずであるが、場合によっ ては左 の下大腿部および上に広がって胸部に至るかもしれない。場合によっては、膿瘍 が皮膚層から破裂してくるかもしれない。このような場合、感染動物を即座に除 去し、可能ならば組織をサンプリングする。動物を除去しないと、膿瘍を覆って いる壊死皮膚組織が脱落し、腹部筋肉壁が露出するかもしれない。 感染から約９６時間後に、二酸化炭素による窒息を用いて動物を殺す。死亡と 組織処理／保存との間の時間を最短にするために、グループにおいてではなく、 個々にマウスを殺すべきである。死亡したマウスを仰向けに置き、７０％アルコ ールで毛を横向けに拭く。左下大腿部から腹部へと、はさみを用いる最初の皮膚 の切開を行い、次いで、胸部を切る。腹部から右の下大腿部への切開により切開 を完了する。腹膜を貫通しないように注意すべきである。鉗子で皮膚を固定し、 含むから皮膚を静かに引っ張る。腹膜を覆っているが通常には筋肉シートを完全 には貫通していない、露出した膿瘍を切除するが、内蔵を傷つけないように注意 する。 液体窒素中での迅速凍結の前に、膿瘍／筋肉シートおよび他の感染組織を切片 化する必要があるかもしれない。切片化によりプラスチック製収集バイアル中で の保存が容易となる。 ｂ）感染組織試料からのストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３Ｒ ＮＡの単離 ２ｍｌの凍結保存チューブ中の４〜６個の感染組織試料（各０．５〜０．７ｇ ）を−８０℃の貯蔵庫からドライアイス−エタノール浴中に取り出す。微生物安 全キャビネット中で試料を破砕し、残った試料をドライアイス−エタノール浴中 で保存する。組織試料中の細菌を破砕するために、TRIzol Reagent(Gibco BRL， Life Technologies)を添加し、次いで、０．１ｍｍジルコニア／シリカビーズを チューブにほとんどいっぱいになるまで満たし、ネジの部分にビーズか付かない ように注意してふたをして、良好な密閉状態を保ち、エアロゾル発生をなくす。 次いで、試料をMini-BeadBeater Type BX-4（Biospec Products）dehomojinaizu する。壊死脂肪組織を５０００ｒｐｍで１００秒間処理して細菌溶解物を得る。 インビボで増殖した細菌はインビトロで増殖したストレプトコッカス・ニューモ ニアエ（３０秒のビーズ処理で破砕される）よりも長時間 処理を要する。 ビーズ処理後、フーム−フード（fume-hood）中で開栓する前に、氷でチュー ブを冷却する。なぜなら、破砕中に熱が発生し、TRIzolが分解され、シアニドが 遊離する可能性があるためである。 次いで、２００ｍｌのクロロホルムを添加し、チューブを手で１５秒間振盪し て完全に混合する。室温で２〜３分後、チューブを１２０００ｘｇ、４℃で遠心 分離し、TRIzol Reagentの製造者による方法によりＲＮＡ抽出を続行する。すな わち、約０．６ｍｌの水相を滅菌エッペンドルフチューブに移し、０．５ｍｌの イソプロパノールを添加する。室温で１０分後、試料を１２０００ｘｇ、４℃で １０分遠心分離する。上清を取って捨て、次いで、ＲＮＡペレットを１ｍｌの７ ５％エタノールで洗浄する。短時間ボルテックス撹拌して試料を混合し、その後 ７５００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離する。エタノールを除去し、ＲＮＡペレッ トを５分以上減圧乾燥する。次いで、試料を１００マイクロリットルのＤＥＰＣ 処理水中に繰り返しピペッティングすることにより再懸濁し、次いで、５５℃で ５〜１０分置く。最後に氷上で少なくとも１分置いた後、２００ユニットのＲｎ ａｓｉｎ（Promega）を添加する。 ＲＮＡ調合物は−８０℃で１カ月まで保存される。長期保存には、プロトコー ルの洗浄段階における７５％エタノール中のＲＮＡ沈殿は−２０℃で少なくとも １年保存できる。 １％アガロースゲル上に試料を泳動することにより単離ＲＮＡの品質を評価す る。臭化エチジウム染色した１ｘＴＢＥゲルを用いて収集全ＲＮＡを可視化する 。感染組織からの細菌ＲＮＡの単離を示すために、１ｘＭＯＰＳ、２．２Ｍホル ムアルデヒドゲルで泳動を行い、Hybond-N（Amersham）に減圧ブロッティングす る。次いで、ブロットを、ストレプトコッカス・スレウスの１６Ｓ ｒＲＮＡに 特異的な³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブ（K．Greisen，M．Loeffelholz， A．Purohit and D．leong．J．Clin．（1994）Microbiol．32 335-351）とハイ ブリダイゼーションさせる。配列のオリゴヌクレオチドをプローブとして使用す る。ハイブリダイゼーションしているバンドのサイズを、インビボ増殖したスト レプトコッカス・ニューモニ アエ０１００９９３から単離された対照ＲＮＡのものとノーザンブロットにおい て比較する。全ＲＮＡ試料中において正しいサイズの細菌１６ＳｒＲＮＡバンド が検出でき、ＴＢＥゲル上で可視化した場合、哺乳動物ＲＮＡの分解が示される 。 ｃ）ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３由来のＲＮＡからのＤ ＮＡの除去 最終体積９０マイクロリットルのバッファー(２００ユニットのRnasin(Promeg a)を添加補足)中で、３ュニットのＤＮＡａｓｅＩ（増幅グレード）(Gibco BRL, Life Technologies)を用いて、氷上で１５分処理することにより、７３マイクロ リットルのＲＮＡ試料からＤＮＡを除去した。 製造者のプロトコールに従ってTRIzol LS試薬（Gibco BRL，Life Technologie s）によりＤＮＡaｓｅを不活性化し除去した。ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡを、 Ｒｎａｓｉｎを添加したＤＰＥＣ処理水７３マイクロリットル中に再懸濁した。 ｄ）感染組織由来のＲＮＡ試料からのｃＤＮＡの調製 製造者の指示に従って、ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡの試料１０マイクロリッ トルを、First Strand cDNA合成キット用のSuperScript Preamplification Syst em（Gibco BRL，Life Technologies）を用いて逆転写する。１ナノグラムのラン ダムヘキサマーを用いて各反応を開始する。SuperScriptII逆転写酵素を添加し ない対照も反応させる。＋／−ＲＴ双方の試料をＲＮａｓｅＨで処理し、次いで 、ＰＣＲ反応に供する。 ｅ）細菌ｃＤＮＡ種の存在を調べるためのＰＣＲの使用 下記成分を添加することにより氷上で０．２ｍｌのチューブにおいてＰＣＲ反 応物をセットアップする：４５マイクロリットルのPCR SUPERMIX（Gibco BRL，L ife Technologies）；マクロリットルの５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂（最終濃度２．５ｍ Ｍとする）；１マイクロリットルのＰＣＲプライマー（最適には、１８〜２５塩 基対の長さで、類似のアニーリング温度を有するように設計されたもの）（各プ ライマーは初発濃度１０ｍＭ）；および５マイクロリットルのｃＤＮＡ。 Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600においてＰＣＲ反応を行った：９５℃ で ５分、次いでそれぞれ９４℃、５０℃そして７２℃で３０秒を５０サイクル、そ の後７２℃で３分、次いで、保持温度４℃とする（最適には、ＰＣＲ生成物の出 現または欠乏を決定するためのサイクル数は３０〜５０回、ＲＴ反応からの初発 ｃＤＮＡ量の評価を行う場合には、最適には８〜３０サイクル）。次いで、１０ マイクロリットルの部分試料を１％ ＴＢＥゲルで泳動し、臭化エチジウム染色 する。ＰＣＲ生成物については、存在するならば、１００ｂｐのＤＮＡラダー(G ibco BRL，Life Technologies)との比較によりサイズを評価する。別法として、 便利には、標識ＰＣＲプライマー（例えば、５’末端を標識したもの）を用いて ＰＣＲ生成物を標識し、ＰＣＲ生成物の適当な部分試料をポリアクリルアミドゲ ルで泳動し、適当なゲルスキャンニングシステム（例えば、Perkin Elmerにより 提供されるGeneScanTMソフトウェアを用いたABI Prism^TM377 Sequencer）を用い てその存在および量を調べる。 ＲＴ／ＰＣＲ対照は＋／−逆転写酵素反応物、非転写ストレプトコッカス・ニ ューモニアエ０１００９９３ゲノム配列からＰＣＲ生成物を生じるように設計さ れた１６Ｓ ｒＲＮＡプライマーもしくはＤＮＡ特異的プライマーペアーを含ん でいてもよい。 プライマーペアーの効率を試験するために、それらをストレプトコッカス・ニ ューモニアエ０１００９９３全ＤＮＡを用いるＤＮＡ ＰＣＲに使用する。ＰＣ Ｒ反応をセットアップし、ｃＤＮＡの代わりに約１マイクログラムのＤＮＡを用 いて上記のごとく３５サイクルのＰＣＲ反応を行う。 ＤＮＡ ＰＣＲまたはＰＴ／ＰＣＲのいずれにおいても予想サイズの生成物を 生じないプライマーペアーはＰＣＲ反応できず、そのようなものとしては不均一 である。ＤＮＡ ＰＣＲで正しいサイズの生成物を生じるものは２つのクラスに 分類される：１．インビボで転写されない遺伝子であって、ＲＴ／ＰＣＲにおい て生成物を生じる再現性がないもの；および２．インビボで転写される遺伝子で あって、ＲＴ／ＰＣＲにおいて正しいサイズの生成物を再現性をもって生じ、＋ ＲＴ試料において−ＲＴ対照におけるシグナル（生じた場合には）よりも強力な シグナルを生じるもの。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/00 27/02 27/02 27/16 27/16 31/04 31/04 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/315 Ｃ０７Ｋ 14/315 16/12 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/68 Ａ６１Ｋ 31/70 ６２５ // Ａ６１Ｋ 31/70 ６２５ 39/395 Ｄ 39/395 Ｒ 48/00 48/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者 ノールズ，デイビッド・ジャスティン・チ ャールズ イギリス、アールエイチ１・６エルワイ、 サリー、レッドヒル、クロンクス・ヒル・ ロード45番、ダウンズビュー・ハウス (72)発明者 ロネット，マイケル・アーサー アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州カ レッジビル、ビクトリア・サークル18番 (72)発明者 ニコラス，リチャード・オークリー アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州カ レッジビル、カーメン・ドライブ355番 (72)発明者 ストドーラ，ロバート・キング アメリカ合衆国19301ペンシルベニア州フ ラワータウン、ホーズ・レイン309番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）配列表のアミノ酸配列を含むポリペプチドコードしているポリヌク レオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）配列表のポリヌクレオチド配列が得られると配列決定された、寄託株ス トレプトコッカス・ニューモニアエ中に含まれる遺伝子により発現される成熟ポ リペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一 性を有するポリヌクレオチド； （ｃ）配列表のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミ ノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドに対して相捕的である ポリヌクレオチド；および （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドの少なくとも １５個の連続した塩基を含むポリヌクレオチド からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。 ２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。 ３．ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。 ４.配列表に示す核酸配列からなる群より選択される核酸配列を含む請求項２ のポリヌクレオチド。 ５.配列表に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む ポリペプチドをコードしている請求項２のポリヌクレオチド。 ６．請求項１のポリヌクレオチドを含むベクター。 ７．請求項６のベクターを含む宿主細胞。 ８.請求項７の宿主細胞から上記ＤＮＡによりコードされているポリペプチド を発現させることを含む、ポリペプチドの製造方法。 ９．ポリペプチドまたはフラグメントの製造方法であって、ポリペプチドまた はフラグメントの生成に十分な条件下で請求項７の宿主を培養することを含む方 法。 １０.配列表に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対 し て少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。 １１.配列表に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含 むポリペプチド。 １２．請求項１０のポリペプチドに対する抗体。 １３.請求項１０のポリペプチドの活性または発現に対するアンタゴニストま たはアゴニスト。 １４.治療上有効量の請求項１０のポリペプチドを個体に投与することを含む 、個体の疾病の治療または予防方法。 １５.治療上有効量の請求項１３のアンタゴニストを個体に投与することを含 む、細菌ポリペプチドの阻害を必要とする個体の治療方法。 １６.個体における請求項１０のポリペプチドの発現または活性に関連した疾 病の診断方法であって、 （ａ）該ポリペプチドをコードしている核酸配列を決定すること、および／ま たは （ｂ）個体由来の試料中の該ポリペプチドの存在または量について分析するこ とを含む方法。 １７．請求項１０のポリペプチドと相互作用して、その活性を阻害または活性 化する化合物の同定方法であって、 化合物とポリペプチドとの間の相互作用を可能にする条件下で、ポリペプチド とスクリーニングすべき化合物とを接触させて化合物の相互作用を評価し（かか る相互作用はポリペプチドと化合物との相互作用に応答した検出可能シグナルを 提供しうる第２の成分に関連したものである）、 次いで、化合物とポリペプチドとの相互作用により生じるシグナルの存在また は不存在を検出することにより、化合物がポリペプチドと相互作用して、その活 性を活性化または阻害するかどうかを決定する ことを含む方法。 １８．哺乳動物における免疫学的応答を誘導する方法であって、抗体および／ またはＴ細胞免疫応答を生じさせて動物を疾病から防御するに十分な請求項１０ のス トレプトコッカスのポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変種を哺乳動 物に接種することを含む方法。 １９．哺乳動物における免疫学的応答を誘導する方法であって、請求項１０の ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変種をインビボで発現させて、抗 体および／またはＴ細胞免疫応答を生じさせる免疫学的応答を誘導して該動物を 疾病から防御するするために、請求項１０のポリペプチドまたはそのフラグメン トもしくは変種の発現を指令する核酸ベクターを送達することを含む方法。 ２０．配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９および７４からなる群 より選択されるポリヌクレオチド。 ２１．配列番号：３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９ 、３４０、３４１および４０３からなる群より選択されるポリペプチド。 ２２．ヌクレオチドが、 （ａ）配列表のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレ オチドに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）配列表のポリヌクレオチド配列が得られると配列決定された寄託株スト レプトコッカス・ニューモニアエ中に含まれる遺伝子により発現されるのと同じ 成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％ の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｃ）配列表のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミ ノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドに対して相捕的なポリ ヌクレオチド；および （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドの少なくとも １5個の連続した塩基を含むポリヌクレオチド からなる群より選択されるものである、請求項１の単離ポリヌクレオチド。 ２３．ヌクレオチドが、 （ａ）配列表のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレ オチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）配列表のポリヌクレオチド配列が得られると配列決定された寄託株スト レプトコッカス・ニューモニアエ中に含まれる遺伝子により発現されるのと同じ 成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％ の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｃ）配列表のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミ ノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドに対して相捕的なポリ ヌクレオチド；および （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドの少なくとも １５個の連続した塩基を含むポリヌクレオチド からなる群より選択されるものである、請求項１の単離ポリヌクレオチド。 ２４．（ａ）配列表のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリ ヌクレオチドに対して少なくとも５０％の同一性を有するポリヌクレオチドであ って、エス・ニューモニアエ以外の原核生物種から得られるポリヌクレオチド； （ｂ）配列表のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミ ノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであって、エス ・ニューモニアエ以外の原核生物種から得られるポリヌクレオチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して相捕的なポリヌクレオ チド からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。 ２５.表１に示すアミノ酸配列の１つを有する単離されたストレプトコッカス のポリペプチド。 ２６.請求項１のアミノ酸配列の１つをコードしている単離核酸および厳密な 条件下でそれにハイブリダイゼーション可能な核酸配列。 ２７.請求項２６の核酸配列を含む組み換えベクターおよびそれで形質転換ま たはトランスフェクションされた宿主細胞。 ２８．候補化合物を請求項１のポリペプチドと接触させ、ついで、該ポリペプ チドの生物学的活性を阻害しうる化合物を選択することを含む、抗微生物化合物 の同 定方法。 ２９．請求項２８の方法により同定される抗微生物化合物。