EA020817B1 - Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae - Google Patents

Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae Download PDF

Info

Publication number
EA020817B1
EA020817B1 EA200901576A EA200901576A EA020817B1 EA 020817 B1 EA020817 B1 EA 020817B1 EA 200901576 A EA200901576 A EA 200901576A EA 200901576 A EA200901576 A EA 200901576A EA 020817 B1 EA020817 B1 EA 020817B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
immunogenic composition
conjugated
vaccine
toxoid
Prior art date
Application number
EA200901576A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200901576A1 (ru
EA200901576A8 (ru
Inventor
Ральф Леон Бьеманс
Филипп Винсент Эрман
Ян Пулман
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0712428A external-priority patent/GB0712428D0/en
Priority claimed from GB0712435A external-priority patent/GB0712435D0/en
Priority claimed from GB0712420A external-priority patent/GB0712420D0/en
Application filed by Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. filed Critical Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Publication of EA200901576A1 publication Critical patent/EA200901576A1/ru
Publication of EA200901576A8 publication Critical patent/EA200901576A8/ru
Publication of EA020817B1 publication Critical patent/EA020817B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/116—Polyvalent bacterial antigens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

В настоящем изобретении раскрыта иммуногенная композиция для лечения или предупреждения заболевания, вызванного инфекцией Streptococcus pneumoniae, содержащая по меньшей мере 11 конъюгатов капсульных сахаридов S. pneumoniae, представляющих собой капсульный сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, включающих конъюгаты капсульных сахаридов из серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 23F, 19А и 19F, где 19А конъюгирован с первым бактериальным анатоксином, 19F конъюгирован со вторым бактериальным анатоксином, 7 или 8 капсульных сахаридов S. pneumoniae конъюгированы с белком D и где иммуногенная композиция содержит 3, 4, 5 или 6 белков-носителей, выбранных из следующего перечня: столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, CRM197, пневмолизин и PhtD или их слитые белки. Также описана вакцина, включающая иммуногенную композицию по изобретению, и способ ее изготовления.

Description

Настоящее изобретение относится к усовершенствованной вакцине 8!гер!ососси§ рпеитошае. Предшествующий уровень техники
Дети в возрасте младше 2 лет не вырабатывают иммунный ответ на большинство полисахаридных вакцин, поэтому необходимо придание этим полисахаридам иммуногенности путем химической конъюгации с белковым носителем. Сочетание полисахарида, Т-независимого антигена, с белком, Т-зависимым антигеном, придает полисахариду свойства Т-зависимости, включая переключение изотипа, созревание аффинности и сенсибилизацию.
Однако проблемы могут иметь место при повторном введении полисахаридно-белковых конъюгатов или комбинации полисахаридно-белковых конъюгатов с образованием поливалентных вакцин. Например, сообщали, что полисахаридная вакцина Наеторййик тЛиеп/ае типа Ь (РКР), в которой использован столбнячный анатоксин (ТТ) в качестве белка-носителя, была испытана в диапазоне дозировки с одновременной иммунизацией (свободным) ТТ и вакциной на основе конъюгата пневмококковый полисахарид-ТТ, следуя стандартной схеме для детей младшего возраста. Когда дозировка пневмококковой вакцины была увеличена, иммунный ответ на полисахаридный участок РКР конъюгатной вакцины ШЬ был снижен, что указывает на иммунную интерференцию полисахарида, возможно, за счет применения одного и того же белка-носителя (Падай е! а1., 1п1ес! 1ттип. (1998); 66: 2093-2098).
Также доказано, что эффект дозировки белка-носителя на гуморальный ответ на сам белок является многосторонним. Сообщали, что у детей увеличение дозировки четырехвалентного конъюгата столбнячного анатоксина привело в результате к сниженному ответу на столбнячный носитель (Оадап е! а1. см. выше). Классический анализ этих эффектов комбинированных вакцин описан как эпитопная супрессия, индуцированная носителем, которая не полностью понятна, но ее считают результатом избыточного количества белка-носителя (Райот, Уассше 17: 126 (1999)). Как оказалось, это приводит к конкуренции Вклеток на белок-носитель и В-клеток на полисахарид за Тй-клетки. Если В-клетки на белок-носитель преобладают, доступных Тй-клеток недостаточно для обеспечения необходимой помощи В-клеткам, специфичным к полисахариду. Однако наблюдаемые иммунологические эффекты противоречивы, поскольку суммарное количество белка-носителя в некоторых случаях повышает иммунный ответ, а в других случаях снижает иммунный ответ.
Следовательно, остаются технические сложности при комбинировании множественных полисахаридных конъюгатов в едином эффективном вакцинном препарате.
81гер1ососси8 рпеитошае представляет собой грамположительную бактерию, ответственную за значительную заболеваемость и смертность (в частности, в молодом и пожилом возрасте), вызывая инфекционные заболевания, вызванные инвазивной микрофлорой, такие как пневмония, бактериемия и менингит, и заболевания, связанные с колонизацией, такие как острый средний отит. Частоту пневмококковой пневмонии в США для людей в возрасте старше 60 лет оценивают как от 3 до 8 на 100000. В 20% случаев она приводит к бактериемии и другим проявлениям, таким как менингит, при смертности, близкой к 30% даже при лечении антибиотиками.
Пневмококк инкапсулирован химически сшитым полисахаридом, который придает специфичность серотипа. Существует 90 известных серотипов пневмококков, и капсула является главной детерминантой вирулентности для пневмококков, поскольку капсула не только защищает внутреннюю поверхность бактерий от комплемента, но сама по себе является слабо иммуногенной. Полисахариды представляют собой Т-независимые антигены и не могут претерпевать процессинг или презентацию на молекулах главного комплекса гистосовместимости (МНС) для взаимодействия с Т-клетками. Они могут, однако, стимулировать иммунную систему посредством альтернативного механизма, в который вовлечено сшивание поверхностных рецепторов на В-клетках.
В нескольких экспериментах было показано, что защита против инфекционного заболевания, вызванного инвазией пневмококков, показывает наиболее сильную корреляцию с антителом, специфичным к капсуле, и эта защита специфична для серотипа.
81гер1ососси8 рпеитошае является наиболее распространенным возбудителем инфекционного заболевания, вызванного инвазией бактерий, и среднего отита у детей младшего и ясельного возраста. Подобным образом, пожилые люди вырабатывают слабые иммунные ответы на пневмококковые вакцины [Кодйтапп е! а1. (1987), 1. Оегоп1о1. 42:265-270], следовательно, в этой группе населения повышена заболеваемость бактериальной пневмонией [Уегдйеке апк Вегк (1983), Мекюше (ВаШтоге), 62:271-285].
Таким образом, задачей настоящего изобретения является разработка усовершенствованного препарата полисахаридной конъюгатной вакцины против множественных серотипов 81гер!ососси8 рпеитотае.
- 1 020817
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция для лечения или предупреждения заболевания, вызванного инфекцией 81гер!ососси8 рпеитотае, содержащая по меньшей мере 11 конъюгатов капсульных сахаридов 8. риеитошае, представляющих собой капсульный сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, включающих конъюгаты капсульных сахаридов из серотипов 1, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 23Р, 19А и 19Р, где 19А конъюгирован с первым бактериальным анатоксином, 19Р конъюгирован со вторым бактериальным анатоксином, 7 или 8 капсульных сахаридов 8. риеитошае конъюгированы с белком Ό и где иммуногенная композиция содержит 3, 4, 5 или 6 белков-носителей, выбранных из следующего перечня: столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, СКМ197, пневмолизин и РЫЭ или их слитые белки.
В одном воплощении иммуногенной композиции по изобретению первый бактериальный анатоксин представляет собой белок, отличный от второго бактериального анатоксина.
В частности, первый бактериальный анатоксин выбран из группы, состоящей из столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина, СКМ197, коклюшного анатоксина, бактериального цитолизина и пневмолизина.
В еще одном воплощении иммуногенной композиции по изобретению второй бактериальный анатоксин выбран из группы, состоящей из столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина, СКМ197, коклюшного анатоксина, бактериального цитолизина и пневмолизина.
В еще одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит конъюгат капсульного сахарида 8. риеитошае серотипа 22Р.
В еще одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит конъюгат капсульного сахарида 3 8. риеитошае.
В еще одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит конъюгат капсульного сахарида 6А 8. риеитошае.
В еще одном воплощении иммуногенной композиции по изобретению 3 различных белка-носителя отдельно конъюгированы по меньшей мере с 3 различными капсульными сахаридами 8. риеитошае различных серотипов.
В еще одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит один или более чем один неконъюгированный или конъюгированный белок 8. риеитошае.
В частности, указанный один или более чем один белок 8. риеитошае выбран из семейства полигистидиновых триад (РН1Х). семейства белков, связывающих холин (СЬрХ), укороченных СЬрХ, семейства Ьу1Х, укороченных Ьу1Х, химерных белков укороченный СЬрХ - укороченный Ьу1Х, детоксифицированного пневмолизина (Р1у), РкрА, РкаА, 8р128, 8р101, 8р130, 8р125 и 8р133.
В конкретном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит пневмолизин в виде свободного белка или белка-носителя.
В другом конкретном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит белок РШХ в виде свободного белка или белка-носителя.
В еще одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит адъювант.
Согласно настоящему изобретению также предложена вакцина для лечения или предупреждения заболевания, вызванного инфекцией 8!гер!ососси8 рпеитотае, включающая иммуногенную композицию по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ изготовления вакцины по изобретению, включающий стадию смешивания иммуногенной композиции по изобретению с фармацевтически приемлемым эксципиентом.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Иммуногенность конъюгата у пожилых макак-резусов (уровни пост-ΙΙ анти-Р8 1§С).
Гистограмма, показывающая иммуногенность 11-валентного конъюгата у пожилых макак резусов. Более светлыми столбиками представлена ГСК (геометрическая средняя концентрация) после двух инокуляций 11-валентным конъюгатом в адъюванте, представляющем собой фосфат алюминия. Более темными столбиками представлена ГСК после двух инокуляций 11-валентным конъюгатом в адъюванте С.
Фиг. 2. Иммуногенность конъюгата у пожилых макак-резусов (частоты В-клеток памяти пост-ΙΙ анти-Р83).
Гистограмма, показывающая В-клетки памяти для Р83 после инокуляции 11-валентным конъюгатом в адъюванте С или в адъюванте, представляющем собой фосфат алюминия.
Фиг. 3. Иммуногенность Р819Р у мышей Ва1Ь/с (уровни пост-111 Ι§0).
Гистограмма, показывающая иммуногенность против полисахарида 19Р у мышей Ва1Ь/С для 4валентных несмешанных полисахаридов и 4-валентных конъюгатов бР1у.
Фиг. 4. Иммуногенность Р822Р у мышей Ва1Ь/с (уровни пост-111 Ι§0).
Гистограмма, показывающая иммуногенность против полисахарида 22Р у мышей Ва1Ь/С для 4валентных несмешанных полисахаридов и 4-валентных конъюгатов РЫЭ.
Фиг. 5. Сывороточные уровни антитела анти-Р8 1§С.
- 2 020817
Гистограмма, показывающая ответ анти-22Р 1§С у мышей Ва1Ь/с.
Фиг. 6. Опсонофагоцитарные титры анти-22Р у мышей Ва1Ь/с.
Гистограмма, показывающая опсонофагоцитарные титры анти-22Р у мышей Ва1Ь/с.
Фиг. 7. Сравнение ответов 1§С, индуцированных у молодых мышей С57В1 после III иммунизации с новыми адъювантами или А1РО4.
Гистограмма, сравнивающая ответы 1§С, индуцированные у молодых мышей С57В1 после иммунизации 13-валентной конъюгатной вакциной, включенной в препарат в различных адъювантах. Столбики находятся в том же порядке, который указан в правой колонке.
Фиг. 8. Протективная эффективность комбинации белков РЫЭ и 6Р1у против колонизации легких типом 19Р у макак-резусов.
Гистограмма, показывающая протективную эффективность различных комбинаций вакцин в модели пневмонии макак. Категория умершие включает макак, которые умерли бы, если бы не введение терапии антибиотиками.
Фиг. 9. Ответ сывороточного анти-РМЭ 1§С.
Гистограмма, показывающая ответ анти-РМЭ 1§С у мышей Ва1Ь/с после иммунизации конъюгатами 22Р-РМО или 22Р-АН-РЫЭ.
Фиг. 10. Защита против контрольного заражения пневмококком типа 4 у мышей.
Защита против контрольного заражения пневмококком типа 4 у мышей после иммунизации 22РР1Ш) или 22Е-АН-РНЮ.
Фиг. 11. Защита против летального контрольного заражения штаммом 3/43 8. риеитошае после иммунизации РМЭ и пассивной иммунизации антителами против полисахарида серотипа 3.
Фиг. 12. Защита против летального контрольного заражения штаммом 1/57 8. риеитошае после иммунизации РМЭ и пассивной иммунизации антителами против полисахарида серотипа 1.
Фиг. 13. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 19А у пожилых мышей С57В1аск, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами.
Фиг. 14. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 22Р у пожилых мышей С57В1аск, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами.
Фиг. 15. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 19А у мышей Ва1Ь/с, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами. Столбик 2 - 11У + 19А-6Р1у §тЬ§ + 22Р-РЫО 0,1 мкг/50 мкл; столбик 4 - 11У + 19А-6Р1удтЬ§ + 22Р-РМО-Е 0,1 мкг/50 мкл; столбик 62 - 11У + 19Α-ΌΤ + 22Е-РЭ 0,1 мкг/50 мкл.
Фиг. 16. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 22Р у мышей Ва1Ь/с, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами.
Фиг. 17. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 19А у морских свинок, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами.
Фиг. 18. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 22Р у морских свинок, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами.
Фиг. 19. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 19А у мышей Ва1Ь/с, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами.
Фиг. 20. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 22Р у мышей Ва1Ь/с, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами.
Фиг. 21. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 19А у мышей ОР1, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами.
Фиг. 22. Опсонофагоцитарные титры против серотипа 22Р у мышей ОР1, иммунизированных поливалентными конъюгатными вакцинами.
Подробное описание изобретения
Термин капсульный сахарид включает капсульные полисахариды и олигосахариды, производные от капсульного полисахарида. Олигосахарид содержит по меньшей мере 4 сахарных остатка. Термины конъюгат и конъюгированный относятся к капсульному сахариду, ковалентно связанному с белкомносителем.
Для целей данного изобретения иммунизация человека-хозяина против обострений ХОБЛ (хроническая обструктивная болезнь легких), либо лечение или предупреждение обострений ХОБЛ, либо уменьшение тяжести обострений ХОБЛ относится к снижению заболеваемости или частоты обострений ХОБЛ (например, снижение частоты на 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20% или более), например, в пределах группы пациентов, иммунизированных композициями или вакцинами по изобретению.
Термин бактериальный анатоксин включает бактериальные токсины, которые инактивированы либо за счет генетической мутации, либо химической обработкой, либо конъюгацией. Пригодные бактериальные анатоксины включают столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, коклюшный анатоксин, бактериальные цитолизины или пневмолизин. Описаны мутации пневмолизина (Р1у), которые снижают токсичность пневмолизина (\УО 90/06951, \УО 99/03884). Подобным образом, известны генетические мутации дифтерийного токсина, которые снижают его токсичность (см. ниже). Генетически детоксифицированные аналоги дифтерийного токсина включают СКМ197 и другие мутации, описанные в И8
- 3 020817
4709017, υδ 5843711, υ8 5601827 и υ8 5917017. СКМ197 представляет собой нетоксичную форму дифтерийного токсина, но она иммунологически неотличима от дифтерийного токсина. СКМ197 продуцируется С. ЛрЙЪепае при инфекции нетоксигенной фазой β197ΐοχ-, образованной в результате мутагенеза нитрозогуанидином токсигенного коринефага Ь (исЫба е( а1. Ыа1иге №\ν Βίοίοβν (1971) 233; 8-11).
Белок СКМ197 имеет такую же молекулярную массу, как дифтерийный токсин, но отличается от него единственной заменой основания в структурном гене. Это приводит к замене аминокислоты глицина на глутамин в положении 52, которая образует фрагмент А, неспособный связывать ΝΆΌ и, следовательно, нетоксичный (РаррепНеппег 1977, Апп Кеу, ВюсНет. 46; 69-94, КарриоН ЛррПеб апб ΕηνίΓοηтеп1а1 МюгоЬюкду 8ер1 1983, р. 560-564).
Первый и второй бактериальный анатоксин могут быть одинаковыми или разными. Где первый и второй бактериальный анатоксин являются разными, это означает, что они имеют различные аминокислотные последовательности.
Например, 19А и 19Р могут быть конъюгированы со столбнячным анатоксином и столбнячным анатоксином; дифтерийным анатоксином и дифтерийным анатоксином; СКМ197 и СКМ197, пневмолизином и пневмолизином, столбнячным анатоксином и дифтерийным анатоксином; столбнячным анатоксином и СКМ197; столбнячным анатоксином и пневмолизином; дифтерийным анатоксином и столбнячным анатоксином; дифтерийным анатоксином и СКМ197, дифтерийным анатоксином и пневмолизином; СКМ197 и столбнячным анатоксином, СКМ197 и дифтерийным анатоксином; СКМ197 и пневмолизином; пневмолизином и столбнячным анатоксином; пневмолизином и дифтерийным анатоксином или пневмолизином и СКМ197 соответственно.
Иммуногенная композиция по изобретению содержит 7 или 8 конъюгатов капсульных сахаридов, в которых белок Ό является белком-носителем. Например, сахарид из серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 9У,
14, 18С, 19А, 19Р, 22Р или 23Р конъюгирован с белком Ό. Например, 7 или 8 сахаридов, выбранных из серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А, 19Р, 22Р и 23Р, конъюгированы с белком Ό.
В одном воплощении половина либо меньше половины конъюгатов капсульных сахаридов, присутствующих в иммуногенной композиции по изобретению, содержит белок Ό в качестве белка-носителя. Например, в 14-валентной вакцине 8. рпеииюшае 7 капсульных сахаридов из различных серотипов конъюгировано с белком Ό. Например, в 15-валентной вакцине 8. рпеииюшае 7 капсульных сахаридов из различных серотипов конъюгировано с белком Ό. Например, в 16-валентной вакцине 8. рпеииюшае 7 или 8 капсульных сахаридов из различных серотипов конъюгировано с белком Ό. Например, в 17валентной вакцине 8. рпеииюшае 7 или 8 капсульных сахаридов из различных серотипов конъюгировано с белком Ό. Например, в 18-валентной вакцине 8. рпеииюшае 7 или 8 капсульных сахаридов из различных серотипов конъюгировано с белком Ό. Например, в 19-валентной вакцине 8. рпеииюшае 7 или 8 капсульных сахаридов из различных серотипов конъюгировано с белком Ό. Возможно, серотипы, конъюгированные с белком Ό, выбраны из групп, описанных выше.
Типично вакцина рпеииюшае по настоящему изобретению содержит капсульные сахаридные антигены (возможно конъюгированные), где сахариды имеют происхождение по меньшей мере от одиннадцати серотипов 8. рпеииюшае. Число капсульных сахаридов 8. рпеииюшае может находиться в диапазоне от 11 различных серотипов (или ν, валентностей) до 23 различных серотипов (23ν). В одном воплощении присутствует 11, 12, 13, 14 или 15 различных серотипов. В другом воплощении изобретения вакцина может содержать конъюгированные сахариды 8. рпеииюшае и неконъюгированные сахариды 8. рпеииюшае. Возможно, общее число сахаридных серотипов меньше или равно 23. Например, вакцина может содержать 11, 12, 13, 14 или 16 конъюгированных сахаридов и 12, 11, 10, 9 или 7 неконъюгированных сахаридов соответственно.
В одном воплощении поливалентная пневмококковая вакцина по изобретению выбрана из приведенных ниже серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 8, 9Ν, 9У, 10А, 11 Л, 12Р, 14, 15, 17Р, 18С, 19А, 19Р, 20, 22Р, 23Р и 33Р, хотя понятно, что один или два серотипа могут быть заменены в зависимости от возраста реципиента, получающего вакцину, и от географического положения, где вводят вакцину. Например, 11валентная вакцина может также включать сахариды из серотипа 3 или 19А. 12- или 13-Валентная педиатрическая (детская) вакцина может также включать 11-валентный препарат (содержащий сахарид из серотипа 3) с добавлением серотипов 6А и 19А, либо 6А и 22Р, либо 19А и 22Р, либо 6А и 15, либо 19А и
15, либо 22Р и 15, тогда как 13-валентная вакцина для пожилых может включать 11-валентный препарат с добавлением серотипов 19А и 22Р, 8 и 12Р, либо 8 и 15, либо 8 и 19А, либо 8 и 22Р, либо 12Р и 15, либо 12Р и 19А, либо 12Р и 22Р, либо 15 и 19А, либо 15 и 22Р.
В следующем воплощении изобретения включают по меньшей мере 12 или 13 сахаридных антигенов, например, вакцина может включать капсульные сахариды, имеющие происхождение из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А, 19Р и 23Р или капсулыные сахариды, имеющие происхождение из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А, 19Р, 22Р и 23Р, хотя дополнительные сахаридные антигены, например, 23-валентные (такие как серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 8, 9Ν, 9У, 10А, 11Л, 12Р, 14, 15, 17Р, 18С, 19А, 19Р, 20, 22Р, 23Р и 33Р), также рассмотрены изобретением.
Иммуногенная композиция по настоящему изобретению содержит белок Ό (ΡΌ) из НаеиюрНПиз шПиеп/ае (см., например, ЕР 0594610 фиг. 9). ΗаетοрЬ^1и8 шЛиеп/ае является ключевым организмом- 4 020817 возбудителем среднего отита, и авторы настоящего изобретения показали, что включение данного белка в вакцину §1гер1ососси8 рпеитошае обеспечит уровень защиты против среднего отита, обусловленного НаеторЫ1и8 тЛиеп/ае (Ругти1а е1 а1. Ьапсе! 367; 740-748 (2006)). Белок Ό может присутствовать в вакцинной композиции в виде свободного белка. В следующем аспекте белок Ό присутствует и в качестве белка-носителя, и в виде свободного белка. Белок Ό можно использовать в виде полноразмерного белка или в виде фрагмента (АО 0056360). В следующем аспекте белок Ό присутствует в качестве белканосителя для большинства сахаридов, например, 7 или 8 сахаридов может быть конъюгировано с белком Ό. В данном аспекте белок Ό может также присутствовать в виде свободного белка.
Каждый тип белка-носителя может действовать в качестве носителя более чем для одного сахарида, где эти сахариды могут быть одинаковыми или разными. Например, серотипы 3 и 4 могут быть конъюгированы с одним и тем же белком-носителем, либо с одной и той же молекулой белка-носителя, либо с различными молекулами одного и того же белка-носителя. В одном воплощении два или более чем два различных сахарида могут быть конъюгированы с одним и тем же белком-носителем, либо с одной и той же молекулой белка-носителя, либо с различными молекулами одного и того же белка-носителя.
Любые капсульные сахариды §1гер1ососси8 рпеитошае, присутствующие в иммуногенной композиции по изобретению помимо 19А и 19Р, могут быть конъюгированы с белком-носителем, независимо выбранным из группы, состоящей из ТТ, ΌΤ, СКМ197, фрагмента С ТТ, РЫЭ, РЫВЕ или слитых РЫЫЕ (в частности, тех, которые описаны в АО 01/98334 и АО 03/54007), детоксифицированного пневмолизина и белка Ό. Более полный перечень белков-носителей, которые можно использовать в конъюгатах по изобретению, представлен ниже.
Белок-носитель, конъюгированный с одним или более чем одним капсульным сахаридом §1гер1ососсик рпеитошае в конъюгатах, присутствующих в иммуногенных композициях по изобретению, возможно является членом семейства полигистидиновых триад (РН1) белков, их фрагментов или слитых белков. Белки РЫА, РЫВ, РЫЭ или РЫЕ могут иметь аминокислотную последовательность, обладающую 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% идентичностью с последовательностью, раскрытой в АО 00/37105 или АО 00/39299 (например, с аминокислотной последовательностью 1-838 или 21-838 8ЕО ГО ЫО: 4 АО 00/37105 для РЬГО). Например, слитые белки состоят из полноразмерных белков или фрагментов 2, 3 или 4 из РЫЛ, РЫВ, РЬГО, РЫЕ. Примерами слитых белков являются РЫА/В, РЫАГО, РЫА/Е, РЫВ/А, РЫВГО, РЫВ/Е. РЬГО/А. РЫГО/В, РЫГО/Е, РЫЕ/А, РЫЕ/В и РЫЕГО, где белки сшиты с упомянутым первым белком при Ν-конце (см., например, АО 01/98334).
При использовании фрагментов белков РЫ (отдельно или в виде части слитого белка) каждый фрагмент содержит один или более чем один мотив гистидиновой триады и/или суперспирализованные участки таких полипептидов. Мотив гистидиновой триады представляет собой участок полипептида, который имеет последовательность НххНхН, где Н представляет собой гистидин и х представляет собой аминокислоту, отличную от гистидина. Суперспирализованный участок представляет собой участок, предсказанный алгоритмом Спирали Ьирик, А. е1 а1. (1991), §шепсе 252; 1162-1164. В воплощении фрагмент или каждый фрагмент включает один или более чем один мотив гистидиновой триады, а также по меньшей мере один суперспирализованный участок. В воплощении фрагмент или каждый фрагмент содержит точно или по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 мотивов гистидиновой триады (возможно с нативной последовательностью РЫ между 2 или более чем двумя триадами, либо последовательность между триадами, которая более чем на 50, 60, 70, 80, 90 или 100% идентична нативной пневмококковой последовательности РЫ между триадами, например, последовательности между триадами, показанной в 8ЕО ГО ЫО: 4 АО 00/37105 для РЬГО). В воплощении фрагмент или каждый фрагмент содержит точно или по меньшей мере 2, 3 или 4 суперспирализованных участка. В воплощении белок РЫ1, раскрытый в данном изобретении, содержит полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например, 20 аминокислот при Ыконце), природные варианты белка РП1 и иммуногенные фрагменты белка РП1 (например, фрагменты, которые описаны выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15 или 20 непрерывных аминокислот из аминокислотной последовательности в АО 00/37105 (8ЕО ГО ЫО: 4, 6, 8 или 10) или АО 00/39299 (8ЕО ГО ЫО: 2, 4, 6, 8, 10 или 14), где указанный полипептид способен вызывать иммунный ответ, специфичный для указанной аминокислотной последовательности в АО 00/37105 или АО 00/39299.
В частности, термин РЬГО, при использовании здесь, включает полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например, 20 аминокислот при Ν-конце), природные варианты белка РЫ и иммуногенные фрагменты белка РП1 (например, фрагменты, которые описаны выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15 или 20 непрерывных аминокислот из аминокислотной последовательности в АО 00/37105 (ЛЕО ГО ЫО: 4, 6, 8 или 10) или АО 00/39299 (ЛЕО ГО ЫО: 2, 4, 6, 8, 10 или 14), где указанный полипептид способен вызывать иммунный ответ, специфичный для указанной аминокислотной последовательности в АО 00/37105 или АО 00/39299 (например, ЛТ) ГО ЫО: 4 АО 00/37105 или ЛТ) ГО ЫО: 14 АО 00/39299 для РЬГО). Все вышеупомянутые формы РЫ® можно использовать в настоящем изобретении.
- 5 020817
Если белок-носитель является одним и тем же для 2 или более чем двух сахаридов в композиции, эти сахариды могут быть конъюгированы с одной и той же молекулой белка-носителя (молекулы носителя, с которыми конъюгировано 2 или более чем два различных сахарида) [см., например, \7О 04/083251]. Альтернативно сахариды могут быть каждый по отдельности конъюгированы с различными молекулами белка-носителя (каждая молекула белка-носителя, с которой конъюгирован только один тип сахарида).
Примерами белков-носителей, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются ΌΤ (дифтерийный анатоксин), ТТ (столбнячный анатоксин) или фрагмент С ТТ, ΌΤ СКМ197 (мутант ΌΤ), другие точечные мутации ΌΤ, такие как СКМ176, СКМ228, СКМ 45 (ИеМа е! а1. 1. ΒίοΙ. Сйет. 218; 3838-3844, 1973); СКМ 9, СКМ 45, СКМ102, СКМ 103 и СКМ107 и другие мутации, описанные №сйо11к и Уои1е в Оепейса11у Епдшеетей Τοχίηκ, Εά: Ртаике1, Маесе1 Эеккег 1пс, 1992; делеция или мутация О1и148 на Акр, О1п или Зег и/или А1а 158 на О1у и другие мутации, раскрытые в ИЗ 4709017 или ИЗ 4950740; мутация по меньшей мере одного или более чем одного остатка Ьук 516, Ьук 526, Рйе 530 и/или Ьук 534 и другие мутации, раскрытые в ИЗ 5917017 или ИЗ 6455673; или фрагмент, раскрытый в ИЗ 5843711, пневмококковый пневмолизин (Кио е1 а1. (1995), 1пГес! 1ттип 63; 2706-13), включая р1у, детоксифицированный каким-либо способом, например ЙРЬУ-ОМВЗ (\7О 04081515, РСТ/ЕР2005/010258) или ЙРЬУформол, РЫХ. включая Рй!А, Рй!В, РйЮ, Рй1Е и слитые белки Рй1. например слитые белки РйЮЕ, слитые белки Рй1ВЕ (\7О 01/98334 и \7О 03/54007) (Рй! А-Е более подробно описаны ниже), ОМРС (менингококковый наружный мембранный белок, обычно выделенный из N. тешпдйтФк серогруппы В - ЕР 0372501), РогВ (от N. тешпдШФк), РЭ (белок Ό НаеторйЛик шЛиеп/ае - см., например, ЕР 0594610 В) или его иммунологически функциональные эквиваленты, синтетические пептиды (ЕР 0378881, ЕР 0427347), белки теплового шока (\7О 93/17712, \7О 94/03208), коклюшные белки (\7О 98/58668, ЕР 0471177), цитокины, лимфокины, факторы роста или гормоны (\7О 91/01146), искусственные белки, содержащие множественные эпитопы Т клеток человека ί'Ό4+ от различных антигенов патогенного происхождения (Ра1ид1 е! а1. (2001), Еиг 1. 1ттипо1 31; 3816-3824), такие как белок N19 (Вата1Ло1 е! а1. (2004), 1пГес1 1ттип 72; 4884-7), пневмококковый поверхностный белок РкрА (\7О 02/091998), белки накопления железа (\7О 01/72337), токсин А или В С. ЛЛйсЛе (\7О 00/61761).
Авторы №цкка е! а1. РеЮЛпс 1пГесйоик Э1кеаке 1оитпа1. 23(11): 1008-14, 2004 Μν. описали 11валентную пневмококковую вакцину со всеми серотипами, конъюгированными с РО. Однако авторы настоящего изобретения показали, что опсонофагоцитарная активность была улучшена для антител, индуцированных конъюгатами, в которых 19Р конъюгирован с ΌΤ, по сравнению с 19Р, конъюгированным с РО. Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что большую перекрестную реактивность 19А наблюдают с 19Р, конъюгированным с ΌΤ. Следовательно, признаком композиции по настоящему изобретению является то, что серотип 19Р конъюгирован с бактериальным анатоксином, например ТТ, пневмолизином, ΌΤ или СКМ197. В одном аспекте серотип 19Р конъюгирован с ΌΤ. Признаком изобретения также является то, что серотип 19А конъюгирован с бактериальным анатоксином, например ТТ, пневмолизином, ΌΤ или СКМ197. Остальные серотипы сахаридов иммуногенной композиции могут быть все конъюгированы с одним или более чем одним белком-носителем, который не представляет собой ΌΤ (т.е. только 19Р конъюгирован с ΌΤ), или могут быть распределены между одним или более чем одним белком-носителем, который не представляет собой ΌΤ, и самим ΌΤ. В одном воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ197, а остальные серотипы распределены между РО и ТТ, либо ΌΤ, либо СКМ197. В следующем воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ197, и не более чем один сахарид конъюгирован с ТТ. В одном аспекте данного воплощения указанный один сахарид представляет собой 18С или 12Р. В следующем воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ197, и не более чем два сахарида конъюгировано с ТТ. В следующем воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ197, а остальные серотипы распределены между РО, ТТ и ΌΤ или СКМ197. В следующем воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ197, а остальные серотипы распределены между РО, ТТ и пневмолизином. В следующем воплощении 19Р конъюгирован с ϋΤ или СКМ197, а остальные серотипы распределены между РО, ТТ и СКМ197. В следующем воплощении 19Р конъюгирован с ϋΤ или СКМ197, а остальные серотипы распределены между РО, ТТ, пневмолизином и возможно РйЮ или слитым белком РйЮ/Е. В следующем воплощении 19Р конъюгирован с ϋΤ или СКМ197, 19А конъюгирован с пневмолизином или ТТ, а остальные серотипы распределены между РО, ТТ, пневмолизином и возможно РйЮ или слитым белком РйЮ/Е. В следующем воплощении 19Р конъюгирован с ϋΤ или СКМ197, 19А конъюгирован с пневмолизином или ТТ, один дополнительный сахарид конъюгирован с ТТ, один дополнительный сахарид конъюгирован с РйЮ или РйЮ/Е, а все другие сахариды конъюгированы с РО. В следующем воплощении 19Р конъюгирован с ϋΤ или СКМ197, 19А конъюгирован с пневмолизином, один дополнительный сахарид конъюгирован с ТТ, один дополнительный сахарид конъюгирован с пневмолизином, 2 дополнительных сахарида конъюгировано с РйЮ или РйЮ/Е, и все другие сахариды конъюгированы с РО.
Термин сахарид везде в данном описании может означать полисахарид или олигосахарид и включает оба. Полисахариды выделяют из бактерий, и они могут быть до некоторой степени отсортированы по размеру известными способами (см., например, ЕР 497524 и ЕР 497525) и возможно путем микрофлюидизации. Полисахариды могут быть отсортированы по размеру с целью уменьшения вязкости в
- 6 020817 полисахаридных образцах и/или улучшения фильтруемости конъюгированных продуктов. Олигосахариды имеют низкое число повторяющихся звеньев (типично 5-30 повторяющихся звеньев) и типично представляют собой гидролизованные полисахариды.
Капсульные полисахариды 81гер1ососси8 рпеитошае содержат повторяющиеся олигосахаридные звенья, которые могут содержать вплоть до 8 сахарных остатков. Обзор олигосахаридных звеньев для ключевых серотипов 81гер1ососси8 рпеитошае см. в ΙΟΝΕ8, СНгЫорНег. Уасстез Ьазеб оп Ше се11 ынГасе сагЬоЬубга1е8 о£ раШодетс Ьас1епа. Ап, Асаб. Вга8. Слёпс. .Типе 2005, уо1. 77, по. 2, р. 293-324. ТаЬ1е II Ι88Ν 0001-3765. В одном воплощении капсульный сахаридный антиген может представлять собой полноразмерный полисахарид, однако, в других он может представлять собой одно олигосахаридное звено или более короткую цепь, чем сахарид нативной длины, повторяющихся олигосахаридных звеньев. В одном воплощении все сахариды, присутствующие в вакцине, представляют собой полисахариды. Полноразмерные полисахариды могут быть отсортированы по размеру, т.е. их размер может быть уменьшен различными способами, такими как обработка кислотным гидролизом, обработка пероксидом водорода, сортировка по размеру ЕншЫЛех® с последующей обработкой пероксидом водорода с получением олигосахаридных фрагментов, или микрофлюидизация.
Авторы изобретения также отметили, что данная область техники сосредоточена на использовании олигосахаридов для легкости получения конъюгата. Авторы изобретения обнаружили, что путем использования конъюгатов нативных или слегка отсортированных по размеру полисахаридов можно реализовать одно или более чем одно из приведенных ниже преимуществ: 1) конъюгат, обладающий высокой иммуногенностью, который является фильтруемым, 2) отношение полисахарида к белку в конъюгате может быть изменено таким образом, что отношение полисахарида к белку (мас./мас.) в конъюгате можно увеличить (что может воздействовать на эффект супрессии носителя), 3) иммуногенные конъюгаты, склонные к гидролизу, можно стабилизировать путем использования для конъюгации сахаридов большего размера. Использование полисахаридов большего размера может привести в результате к большему сшиванию с носителем конъюгата и может уменьшить высвобождение свободного сахарида из конъюгата. Конъюгатные вакцины, описанные на уровне техники, имеют тенденцию к деполимеризации полисахаридов перед конъюгацией в целях улучшения конъюгации. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что вакцины на основе сахаридных конъюгатов, сохраняющие больший размер сахарида, могут обеспечить хороший иммунный ответ против пневмококкового заболевания.
Иммуногенная композиция по изобретению может, таким образом, содержать один или более чем один сахаридный конъюгат, где средний размер (средневесовая молекулярная масса; Мте) каждого сахарида перед конъюгацией выше 80, 100, 200, 300, 400, 500 или 1000 Да. В одном воплощении конъюгат после конъюгации должен быть легко фильтруемым через 0,2-микронный фильтр, так что после фильтрования получают выход более чем 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с образцом до фильтрования.
Для целей настоящего изобретения нативный полисахарид относится к сахариду, который не подвергнут процессу, целью которого является уменьшение размера сахарида. Полисахарид может слегка уменьшиться в размере во время обычных процедур очистки. Такой сахарид является по-прежнему нативным. Только если полисахарид подвергнут методикам сортировки по размеру, этот полисахарид не следует считать нативным. Размер нативного полисахарида составляет, например, 250-2000 кДа, 4001500 кДа, 750-1250 кДа, 300-600 кДа, 500-1000 кДа или 1000-1500 кДа, где различные серотипы имеют разные размеры нативного полисахарида, что должно быть понятно специалисту в данной области техники.
Для целей настоящего изобретения отсортирован по размеру с коэффициентом вплоть до х2 означает, что сахарид подвергают процессу, предназначенному для уменьшения размера сахарида, но сохранения размера, составляющего более половины размера нативного полисахарида. х3, х4 и т.д. следует интерпретировать таким же образом, сахарид подвергают процессу, предназначенному для уменьшения размера сахарида, но сохранения размера, составляющего более трети, четверти и т.д. размера нативного полисахарида.
В одном аспекте изобретения иммуногенная композиция содержит сахариды 81гер1ососси8 рпеитотае по меньшей мере от 11 серотипов, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или каждый сахарид 8. рпеитошае представляет собой нативный полисахарид.
В одном аспекте изобретения иммуногенная композиция содержит сахариды 81гер1ососси8 рпеитотае по меньшей мере от 11 серотипов, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или каждый сахарид 8. рпеитошае отсортирован по размеру с коэффициентом х2, х3, х4, х5, х6, х7, х8, х9 или х10. В одном воплощении данного аспекта большинство сахаридов, например 6, 7, 8 или более, отсортировано по размеру с коэффициентом вплоть до х2, х3, х4, х5, х6, х7, х8, х9 или х10.
Молекулярная масса или средняя молекулярная масса сахарида здесь относится к средневесовой молекулярной массе (Мте) сахарида, измеренной до конъюгации, и ее измеряют с помощью МАТЬ8 (рассеивания лазерного излучения с кратными углами).
Методика МАТЬ8 хорошо известна в данной области техники, и ее типично осуществляют, как описано в примере 2. Для анализа МАТЬ8 пневмококковых сахаридов можно использовать две колонки (Т8К06000 и 5000Р^Мх1) в комбинации, и сахариды элюируют в воде. Сахариды обнаруживают, исполь- 7 020817 зуя детектор светорассеивания (например, ХУуаО Ба\\п Б8Р, оборудованный 10 мВт аргоновым лазером при 488 нм) и интерферометрический рефрактометр (например, ХУуаО ОЬ1аЪ Б8Р, оборудованный ячейкой Р100 и красным фильтром при 498 нм).
В одном воплощении сахариды 8. рпеитотае представляют собой нативные полисахариды или нативные полисахариды, которые уменьшены в размере во время процесса обычной экстракции.
В одном воплощении сахариды 8. рпеитотае сортируют по размеру путем механического расщепления, например, с помощью микрофлюидизации или обработки ультразвуком. Микрофлюидизация и обработка ультразвуком обладают преимуществами в том, что уменьшение размера нативных полисахаридов большего размера достаточно для получения фильтруемого конъюгата. Сортировка по размеру происходит с коэффициентом не более чем х20, х10, х8, х6, х5, х4, х3 или х2.
В одном воплощении иммуногенная композиция содержит конъюгаты 8. рпеитотае, которые получены из смеси нативных полисахаридов и сахаридов, которые отсортированы по размеру с коэффициентом не более чем х20. В одном аспекте данного воплощения большинство сахаридов, например 6, 7, 8 или более, отсортировано по размеру с коэффициентом х2, х3, х4, х5 или х6.
В одном воплощении сахарид 8!гер!ососси§ рпеитотае конъюгирован с белком-носителем через линкер, например бифункциональный линкер. Линкер возможно является гетеробифункциональным или гомобифункциональным, имея, например, реакционную аминогруппу и реакционную группу карбоновой кислоты, 2 реакционные аминогруппы или две реакционные группы карбоновой кислоты. Линкер имеет, например, число атомов углерода между 4 и 20, 4 и 12, 5 и 10. Возможным линкером является дигидразид адипиновой кислоты (АБН). Другие линкеры включают В-пропионамидо (\УО 00/10599), нитрофенилэтиламин (Сеуег е! а1. (1979), Меб. МюгоЪю1. 1ттипо1. 165; 171-288), галогениды галогеноалкилов (И8 4057685), гликозидные линкеры (И8 4673574, И8 4808700), гександиамин и 6-аминокапроновую кислоту (И8 4459286). В одном воплощении АБН используют в качестве линкера для конъюгации сахарида из серотипа 18С.
Сахаридные конъюгаты, присутствующие в иммуногенных композициях по изобретению, могут быть получены с помощью любой известной методики сочетания. Способ конъюгации может быть основан на активации сахарида 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборатом (СБАР) с образованием эфира цианата. Активированный сахарид можно, таким образом, подвергать сочетанию непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида, который можно подвергать сочетанию с носителем через тиоэфирную связь, полученную после взаимодействия с белком-носителем, активированным малеимидом (например, используя малеимидобутирилоксисукцинимидный эфир (СМВ8)), или галогеноацетилированным белком-носителем (например, используя йодацетамид [например, этилйодацетамид НС1], либо Ν-сукцинимидилбромацетат, либо Νсукцинимидил-(4-йодацетил)аминобензоат (81АВ), либо Ν-сукцинимидилйодацетат (81А), либо сукцинимидил-(3-бромацетамидо)пропионат (8ВАР)). Возможно цианатный эфир (возможно полученный с помощью химии СБАР) подвергают сочетанию с гександиамином или АБН, и аминопроизводное сахарида конъюгируют с белком-носителем, используя химию карбодиимидов (например, 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимид (ЕБАС или ЕБС)), посредством карбоксильной группы на белкеносителе, такие конъюгаты описаны в опубликованной заявке РСТ \УО 93/15760 ИпЛогтеб 8егуюе5 Итуегкйу, а также \УО 95/08348 и \УО 96/29094.
Другие пригодные методики включают карбодиимиды, карбиниды, гидразиды, активные эфиры, норборнан, паранитробензойную кислоту, Ν-гидроксисукцинимид, 8-ΝΗ8, ЕБС, тетрафторборат Ο-(Νсукцининимидил)-^^№,№-тетраметилурония (Т8ТИ). Многие описаны в \УО 98/42721. Конъюгация может включать карбонильный линкер, который может быть образован путем взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с СБ1 (Ве!Ье11 е! а1. 1. Вю1. СЬет. 1979, 254; 2572-4, Неагп е! а1. 1. СЬгота!одг. 1981, 218; 509-18) с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. Это может включать восстановление апомерного конца до первичной гидроксильной группы, возможную защиту/удаление защиты первичной гидроксильной группы взаимодействием первичной гидроксильной группы с СБ1 с образованием промежуточного карбамата СБ1 и сочетание промежуточного карбамата СБ1 с аминогруппой на белке.
Конъюгаты могут быть также получены способами прямого восстановительного аминирования, как описано в и8 4365170 (1ептп§8) и И8 4673574 (Апбегкоп). Другие способы описаны в ЕР 0161188, ЕР 208375 и ЕР 0477508.
Следующий способ включает сочетание сахарида, активированного цианогенбромидом (или СБАР), преобразованного гидразидом адипиновой кислоты (АБН), с белком-носителем путем карбодиимидной конденсации (СЬи С. е! а1.1пТес1. 1ттипЪу, 1983 245 256), например, используя ЕБАС.
В одном воплощении гидроксильную группу (возможно активированную гидроксильную группу, например гидроксильную группу, активированную с получением цианатного эфира [например, используя СБАР]) на сахариде подвергают сочетанию с амино- или карбоксильной группой на белке либо прямо, либо косвенно (посредством линкера). Где присутствует линкер, гидроксильную группу на сахариде возможно подвергают сочетанию с аминогруппой на линкере, например, путем использования конъюга- 8 020817 ции СЭЛР. Следующую аминогруппу в линкере, например, ΛΌΗ, можно конъюгировать с группой карбоновой кислоты на белке, например, путем использования химии карбодиимидов, например, путем использования ЕЭЛС. В воплощении пневмококковый капсульный сахарид(ы) сначала конъюгируют с линкером, после чего линкер конъюгируют с белком-носителем. Альтернативно линкер может быть конъюгирован с носителем перед конъюгацией с сахаридом.
Можно также использовать комбинацию методик, где некоторые сахаридно-белковые конъюгаты получают с помощью СЭЛР. а некоторые путем восстановительного аминирования.
Как правило, приведенные ниже типы химических групп на белке-носителе можно использовать для сочетания/конъюгации.
A) Карбоксил (например, через аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту). В одном воплощении эту группу подвергают сочетанию с аминогруппами прямо на сахаридах или с аминогруппой на линкере с помощью химии карбодиимидов, например с БОАС.
Б) Аминогруппу (например, через лизин). В одном воплощении эту группу подвергают сочетанию с карбоксильными группами прямо на сахаридах или с карбоксильной группой на линкере с помощью химии карбодиимидов, например с БОАС. В другом воплощении эту группу подвергают сочетанию с гидроксильными группами, активированными СЭАР или САВг прямо на сахаридах или с такими группами на линкере; с сахаридами или линкерами, имеющими альдегидную группу; с сахаридами или линкерами, имеющими группу эфира сукцинимида.
B) Сульфгидрил (например, через цистеин). В одном воплощении эту группу подвергают сочетанию с бром- или хлорацетилированными сахаридами или линкерами с помощью химии малеимида. В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином.
Г) Гидроксильную группу (например, через тирозин). В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином.
Д) Имидазолильную группу (например, через гистидин). В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином.
Е) Гуанидильную группу (например, через аргинин).
Ж) Индолильную группу (например, через триптофан).
На сахариде, как правило, для сочетания можно использовать приведенные ниже группы: ОН, СООН или ΝΗ2. Альдегидные группы можно образовать после различных обработок, известных в данной области техники, таких как периодат, кислотный гидролиз, пероксид водорода и т.д.
- 9 020817
Методы прямого сочетания:
Сахарид-ОН + ΟΝΒγ или СОАР---> цианатный эфир + ЫНг-Белок —>
конъюгат
Сахарид-альдегид + ИНг-Белок —> Шиффово основание + ΝθΟΝΒΗΗ — > конъюгат
Сахарид-СООН + ΝΗ2-Ββποκ + ЕОАС —> конъюгат Сахарид-ΝΗί + СООН-Белок + ЕОАС —> конъюгат Методы косвенного сочетания через спейсер (линкер):
Сахарид-ОН + СИВг или СОАР —> цианатный эфир + МН2—ΝΗ2 —>
сахарид—ΝΗ2 + СООН-Белок + ЕОАС —> конъюгат
Сахарид-ОН + СЫВг или СОАР > цианатный эфир + ΝΗ2—ЗН —>
сахарид—ЗН + ЗН-Белок (нативный балок с доступным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка, например, ЗРОР) —> саха рид-3-3-Белок
Сахарид-ОН + СИВг или СОАР —> цианатный эфир + ΝΗ2—5Н---->
сахарид—ЗН + малеимид-Белок (модификация аминогрупп) —> конъюгат
Сахарид-ОН + СЫВг или СОАР —> цианатный эфир + ΝΗ2—ЗН —>
Сахарид-3 Н + галогеноацетилированный-Белок —-> Конъюгат
Сахарид-СООН + ЕОАС + ΝΗ2----ΝΗ2 —> сахарид----ΝΗ2 + ЕОАС +
СООН-Рго! —> конъюгат
Сахарид-СООН + ЕОАС+ ΝΗ2—ЗН —> сахарид—ЗН + ЗН-Белок (нативный белок с доступным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка, например, ЗРОР)---> сахарид-8-З-Белок
Сахарид-СООН + ЕОАС+ ΝΗ2—ЗН —> сахарид—ЗН + малеимидБелок (модификация аминогрупп) —> конъюгат
Сахарид-СООН + ЕОАС + ΝΗ2—ЗН — > Сахарид-ЗН + галогеноацетилированный-Белок —> Конъюгат
Сахарид-Альдегид + ΝΗ2---ΝΗ2 —> сахарид—ΝΗ2 + ЕОАС + СООНБелок —> конъюгат
Примечание: вместо вышеуказанного ЕОАС можно использовать любой подходящий карбо диимид. В итоге, типы химической группы белка-носителя, которые можно, как правило, использовать для сочетания с сахаридом, представляют собой аминогруппы (например, на остатках лизина), группы СООН (например, на остатках аспарагиновой и глутаминовой кислоты) и группы 8Н (если доступны) (например, на остатках цистеина).
Возможно отношение белка-носителя к сахариду 8. рпеитошае составляет от 1:5 до 5:1; от 1:2 до 2,5:1; от 1:1 до 2:1 (мас./мас.). В одном воплощении большинство конъюгатов, например 6, 7, 8, 9 или большее число конъюгатов, имеет отношение белка-носителя к сахариду, которое выше чем 1:1, например 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1 или 1,6:1.
В одном воплощении по меньшей мере один сахарид 8. риеитошае конъюгирован с белкомносителем посредством линкера, используя СОАР и ЕОАС. Например, 18С может быть конъюгирован с белком посредством линкера (например, линкеров с двумя группами гидразино на их концах, таких как АОН), используя СОАР и ЕОАС, как описано выше. Когда используют линкер, СОАР можно использовать для конъюгации сахарида с линкером, и ЕОАС можно затем использовать для конъюгации линкера с белком, либо альтернативно ЕОАС можно использовать сначала для конъюгации линкера с белком, после чего можно использовать СОАР для конъюгации линкера с сахаридом.
Как правило, иммуногенная композиция по изобретению может содержать дозу каждого сахаридного конъюгата от 0,1 до 20 мкг, от 1 до 10 мкг или от 1 до 3 мкг сахарида.
В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит каждый капсульный сахарид 8. рпеитошае в дозе 0,1-20 мкг; 0,5-10 мкг; 0,5-5 мкг или 1-3 мкг сахарида. В воплощении капсульные сахариды могут присутствовать в различных дозировках, например, некоторые капсульные сахариды могут присутствовать в дозе примерно или точно 1 мкг, либо некоторые капсульные сахариды могут присутствовать в дозе примерно или точно 3 мкг. В одном воплощении сахариды от серотипов 3, 18С и 19Р (или 4, 18С и 19Р) присутствуют в более высокой дозе, чем другие сахариды. В одном аспекте данного воплощения серотипы 3, 18С и 19Р (или 4, 18С и 19Р) присутствуют в дозе примерно или точно
- 10 020817 мкг, тогда как другие сахариды в иммуногенной композиции присутствуют в дозе примерно или точно 1 мкг.
Около или примерно для целей изобретения определяют как в пределах 10% более или менее данной цифры.
В одном воплощении по меньшей мере один из капсульных сахаридов 8. риеитошае прямо конъюгирован с белком-носителем. Возможно по меньшей мере один из капсульных сахаридов 8. риеитошае прямо конъюгирован с помощью СЭЛР. В одном воплощении большинство капсульных сахаридов, например 5, 6, 7, 8, 9 или более, прямо связывают с белком-носителем с помощью СЭАР (см. АО 95/08348 и АО 96/29094).
Иммуногенная композиция может содержать белки 81гер!ососсик риеитошае, в данном изобретении называемые белками 8!гер!ососсик риеитошае по изобретению. Такие белки можно использовать в качестве белков-носителей, либо они могут присутствовать в виде свободных белков, либо могут присутствовать и в качестве белков-носителей, и в виде свободных белков. Белки 8!гер!ососсик риеитошае по изобретению либо представляют собой поверхностные белки, по меньшей мере, в течение части жизненного цикла пневмококка, либо представляют собой белки, которые секретируются или высвобождаются пневмококком. Возможно белки по изобретению выбраны из приведенных ниже категорий, таких как белки, имеющие мотив сигнальной последовательности типа II ЬХХС (где X представляет собой любую аминокислоту, например, семейства полигистидиновых триад (РЫХ)), белки, связывающие холин (СЬрХ), белки, имеющие мотив сигнальной последовательности типа I (например, 8р101), белки, имеющие мотив ЬРХТО (где X представляет собой любую аминокислоту, например 8р128, 8р130), и токсины (например, Р1у). Примерами в пределах данных категорий (или мотивов) являются приведенные ниже белки или их иммунологически функциональные эквиваленты.
В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один белок, выбранный из группы, состоящей из семейства полигистидиновых триад (РЫХ), семейства белков, связывающих холин (СЬрХ), укороченных вариантов СЬрХ, семейства Ьу1Х, укороченных вариантов Ьу!Х, химерных белков (или слитых белков) укороченный СЬрХ - укороченный Ьу1Х, пневмолизина (Р1у), РкрА, РкаА, 8р128, 8р101, 8р130, 8р125 и 8р133. В следующем воплощении иммуногенная композиция содержит 2 или более чем два белка, выбранных из группы, состоящей из семейства полигистидиновых триад (РЫХ), семейства белков, связывающих холин (СЬрХ), укороченных вариантов СЬрХ, семейства Ьу1Х, укороченных вариантов Ьу1Х, химерных белков (или слитых белков) укороченный СЬрХ укороченный Ьу1Х, пневмолизина (Р1у), РкрА, РкаА и 8р128. Еще в одном воплощении иммуногенная композиция содержит 2 или более чем два белка, выбранных из группы, состоящей из семейства полигистидиновых триад (РЫХ), семейства белков, связывающих холин (СЬрХ), укороченных вариантов СЬрХ, семейства Ьу1Х, укороченных вариантов Ьу1Х, химерных белков (или слитых белков) укороченный
СЬрХ - укороченный Ьу1Х, пневмолизина (Р1у) и 8р128.
Семейство РЫ (полигистидиновых триад) включает белки РЫА, РЫВ, РЫЭ и РЫЕ. Это семейство характеризуется последовательностью липидизации, двумя доменами, разделенными пролин-богатой областью, и несколькими гистидиновыми триадами, возможно, вовлеченными в связывание металлов или нуклеозидов или ферментативной активностью, (3-5) суперспирализованными участками, консервативным Ν-концом и гетерогенным С-концом. Они присутствуют во всех протестированных штаммах пневмококков. Гомологичные белки также обнаружены в других 81тер!ососс1 и №1ккепа. В одном воплощении изобретения белок РЫ по изобретению представляет собой РЫЭ. Понятно, однако, что термины РИ1 А, В, Ό и Е относятся к белкам, имеющим последовательности, раскрытые в приведенных ниже ссылках, а также их встречающимся в природе (и полученным человеком) вариантам, которые обладают гомологией последовательности, которая составляет по меньшей мере 90% идентичности со стандартными белками. Возможно она является по меньшей мере на 95% идентичной или по меньшей мере на 97% идентичной.
Что касается белков РЫХ, РЫА раскрыт в АО 98/18930, и его также называют 8р36. Как отмечено выше, он представляет собой белок из семейства полигистидиновых триад и имеет сигнальный мотив типа II ЬХХС. РЫЭ раскрыт в АО 00/37105, и его также называют 8р036И. Как отмечено выше, он представляет собой белок из семейства полигистидиновых триад и имеет сигнальный мотив типа II ЬХХС. РЫВ раскрыт в АО 00/37105, и его также называют 8р036В. Другим членом семейства РЫВ является С3разлагающий полипептид, как раскрыто в АО 00/17370. Этот белок также является белком из семейства полигистидиновых триад и имеет сигнальный мотив типа II ЬХХС. Например, иммунологически функциональным эквивалентом является белок 8р42, раскрытый в АО 98/18930. Укороченный РЫВ (примерно 79 кД) раскрыт в АО 99/15675, и его также считают членом семейства РЫХ. РЫЕ раскрыт в АО 00/30299, и его называют ВУН-3. Где в данном изобретении ссылаются на любой белок РЫ, это означает, что можно использовать его иммуногенные фрагменты или слитые белки РИ1. Например, ссылка на РЫХ включает его иммуногенные фрагменты из любого белка РН1 или слитые белки. Ссылка на РЫЭ или РЫВ также является ссылкой на слитые РЫЭЕ или РЫВЕ, как раскрыто, например, в АО 0198334.
Пневмолизин представляет собой многофункциональный токсин с отдельной цитолитической (ге- 11 020817 молитической) активностью и активностью активации комплемента (КиЬшз с1 а1., Ат. Кекрк Сй Саге Меб, 153:1339-1346 (1996)). Этот токсин не секретируется пневмококками, но высвобождается при лизисе пневмококков под влиянием автолизина. Его эффекты включают, например, стимуляцию продуцирования воспалительных цитокинов моноцитами человека, ингибирование биения ресничек на респираторном эпителии человека и снижение бактерицидной активности и миграции нейтрофилов. Наиболее очевидным эффектом пневмолизина является лизис эритроцитов, в который вовлечено связывание с холестерином. Поскольку он представляет собой токсин, необходима его детоксификация (т.е. нетоксичность для человека при обеспечении в дозировке, пригодной для защиты) перед его введением ίη νίνο. Экспрессия и клонирование пневмолизина дикого типа или нативного пневмолизина известны в данной области техники. См., например, Аа1кег е1 а1. (1пГес1 1ттип, 55:1184-1189 (1987)), МйсНе11 е1 а1. (ВюсЫт ВюрЬук Ас1а. 1007:67-72 (1989) и М11сПе11 е1 а1. (ЛАК, 18:4010 (1990)). Детоксификацию р1у можно проводить химическими способами, например подвергать обработке формалином или глутаральдегидом, либо комбинации этих обработок (АО 04081515, РСТ/ЕР2005/010258). Такие способы хорошо известны в данной области техники для различных токсинов. Альтернативно р1у можно детоксифицировать генетическим путем. Таким образом, изобретение включает производные пневмококковых белков, которые могут представлять собой, например, мутированные белки. Термин мутированный используют здесь для обозначения молекулы, которая претерпела делецию, добавление или замену одной или более чем одной аминокислоты с использованием хорошо известных методик сайт-направленного мутагенеза или любого другого общепринятого способа. Например, как описано выше, мутантный белок р1у может быть изменен таким образом, что он является биологически неактивным, при этом все же сохраняя его иммуногенные эпитопы, см., например, АО 90/06951, Веггу е1 а1. (1пГес1 1ттип, 67:981-985 (1999)) и АО 99/03884.
При использовании здесь, понятно, что термин Р1у относится к мутированному или детоксифицированному пневмолизину, пригодному для медицинского применения (т.е. нетоксичному).
Что касается семейства белков, связывающих холин (СЬрХ), члены этого семейства были исходно идентифицированы как пневмококковые белки, которые могут быть очищены аффинной хроматографией на холине. Все белки, связывающие холин, нековалентно связаны с фосфорилхолиновыми группировками тейхоевой кислоты клеточной стенки и мембраносвязанной липотейхоевой кислоты. Структурно они имеют несколько общих участков для всего семейства, хотя точная природа этих белков (аминокислотная последовательность, длина и т.д.) может варьировать. В целом белки, связывающие холин, содержат Ν-концевой участок (Ν), консервативные повторяющиеся участки (КТ и/или К2), участок, богатый пролином (Р), и консервативный участок связывания холина (С), состоящий из множественных повторов, который составляет примерно половину белка. Как используют в данном изобретении, термин семейство белков, связывающих холин (СЬрХ), выбран из группы, состоящей из белков, связывающих холин, которые идентифицированы в АО 97/41151, РЬсА, 8ркА, РкрС, СЬрА, СЬрЭ и СЬрО. СЬрА раскрыт в АО 97/41151. СЬрЭ и СЬрО раскрыты в АО 00/29434. РкрС раскрыт в АО 97/09994. РЬсА раскрыт в АО 98/21337. 8ркА представляет собой белок, связывающий холин, раскрытый в АО 98/39450. Возможно белки, связывающие холин, выбраны из группы, состоящей из СЬрА, РЬсА, 8ркА и РкрС.
Одно воплощение изобретения включает укороченные варианты СЬрХ, где СЬрХ определен выше, и укороченные варианты относятся к белкам СЬрХ, в которых отсутствует 50% или более участка связывания холина (С). Возможно в таких белках полностью отсутствует участок связывания холина. Возможно, в таких укороченных вариантах белка отсутствует (1) участок связывания холина и (2) также часть Ν-концевой половины белка, но все же сохранен по меньшей мере один повторяющийся участок (К1 или К2). Возможно укороченный вариант имеет 2 повторяющихся участка (К1 и К2). Примерами таких воплощений являются ΝΚ1χΚ2 и К1хК2, как проиллюстрировано в АО 99/51266 или АО 99/51188, однако, другие белки, связывающие холин, в которых отсутствует подобная область связывания холина, также рассмотрены в пределах объема данного изобретения.
Семейство Ьу1Х представляет собой мембраносвязанные белки, связанные с клеточным лизисом. Νконцевой домен включает домен(ы), связывающий холин, однако, семейство Ьу1Х не обладает всеми признаками, обнаруженными в семействе СЬрА, отмеченными выше, и, следовательно, для настоящего изобретения семейство Ьу1Х рассматривают отдельно от семейства СЬрХ. В противоположность семейству СЬрХ С-концевой домен содержит каталитический домен семейства белков Ьу1Х. Это семейство включает Ьу1А, В и С. В отношении семейства Ьу1Х, Ьу1А раскрыт в Копба е1 а1., Еиг 1. ВюсЬет, 164:621624 (1987). Ьу1В раскрыт в АО 98/18930, и его также называют 8р46. Ьу1С также раскрыт в АО 98/18930, и его также называют 8р91. Воплощение изобретения включает Ьу1С.
Другое воплощение включает укороченные варианты Ьу1Х, где Ьу1Х определен выше, и укороченные варианты относятся к белкам Ьу1Х, в которых отсутствует 50% или более участка связывания холина. Возможно в таких белках полностью отсутствует участок связывания холина. Еще одно другое воплощение данного изобретения включает химерные белки (или слитые белки) укороченный СЬрХ укороченный Ьу1Х. Возможно они включают ΝΚ1χΚ2 (или К1хК2) СЬрХ и С-концевой участок (Сбегит т.е. с отсутствующими доменами связывания холина) Ьу1Х (например, Ьу1СС1егт или 8р91С'1егт). Возможно СЬрХ выбран из группы, состоящей из СЬрА, РЬсА, 8ркА и РкрС.
- 12 020817
Возможно он представляет собой СЬрА. Возможно Ьу!Х представляет собой Ьу!С (также называемый 8р91). Другое воплощение настоящего изобретения составляет укороченный вариант РкрА или РкаА, в котором отсутствует домен связывания холина (С), и он экспрессируется в виде слитого белка с Ьу1Х. Возможно Ьу!Х представляет собой Ьу!С.
Что касается РкаА и РкрА, оба они известны в данной области техники. Например, РкаА и его трансмембранные делеционные варианты описаны Веггу & Ра!оп, 1пГес1 1ттип 1996 Эес; 64(12):5255-62. РкрА и его трансмембранные делеционные варианты раскрыты, например, в И8 5804193, АО 92/14488 и АО 99/53940.
8р128 и 8р130 раскрыты в АО 00/76540. 8р125 является примером поверхностного белка пневмококка с мотивом заякоривания в клеточной стенке ЬРХТО (где X представляет собой любую аминокислоту). Обнаружено, что любой белок в пределах данного класса поверхностных белков пневмококка с этим мотивом полезен в контексте данного изобретения, и, следовательно, его считают дополнительным белком по изобретению. Сам 8р125 раскрыт в АО 98/18930 и также известен как 2шрВ, цинковая металлопротеиназа. 8р101 раскрыт в АО 98/06734 (где он имеет ссылку # у85993). Он характеризуется сигнальной последовательностью типа I. 8р133 раскрыт в АО 98/06734 (где он имеет ссылку # у85992). Он также характеризуется сигнальной последовательностью типа I.
Примерами белковых антигенов Могахе11а са1аггИаЕк, которые можно включать в комбинированную вакцину (в частности, для предупреждения среднего отита), являются ОМР106 [АО 97/41731 (Ап1ех) и АО 96/34960 (РМС)]; ОМР21 или его фрагменты (АО 0018910); ЬЬрА и/или ЬЬрВ [АО 98/55606 (РМС)]; ТЬрА и/или ТЬрВ [АО 97/13785 и АО 97/32980 (РМС)]; СорВ [Не1тшеп МЕ, е1 а1. (1993), 1пГес1. 1ттип. 61:2003-2010]; ИкрА1 и/или ИкрА2 [АО 93/03761 (Итуегкйу оГ Техак)]; ОтрСЭ; НакК (РСТ/ЕР99/03824); РИО (РСТ/ЕР99/03823); ОМР85 (РСТ/ЕР00/01468); Иро06 (ОВ 9917977.2); Еро10 (ОВ 9918208.1); Цро11 (ОВ 9918302.2); Еро18 (ОВ 9918038.2); Р6 (РСТ/ЕР99/03038); Ό15 (РСТ/ЕР99/03822); Отр1А1 (РСТ/ЕР99/06781); Н1у3 (РСТ/ЕР99/03257) и ОтрЕ. Примеры антигенов или их фрагментов нетипируемых штаммов НаешорИЛик тЛиен/ае, которые можно включать в комбинированную вакцину (в частности, для предупреждения среднего отита), включают белок фимбрин [(И8 5766608 - ОИю 81а1е КекеагсИ РоипЛаЕоп)] и слитые белки, содержащие пептиды из него [например, слитые белки пептида ЬВ1(Г); И8 5843464 (О8И) или АО 99/64067]; ОМР26 [АО 97/01638 (Сойеск)]; Р6 [ЕР 281673 (84а4е ИшуегкПу оГ №\у Уогк)]; ТЬрА и/или ТЬрВ; Ша; НкГ; Нш47; НГ; Нт\у1; Нт\у2; Нт\у3; Нт\у4; Нар; Ό15 (АО 94/12641); Р2 и Р5 (АО 94/26304).
Белки по изобретению можно также полезно комбинировать. Под комбинированием подразумевают, что иммуногенная композиция включает все белки в пределах приведенных ниже комбинаций, либо в качестве белков-носителей, либо в виде свободных белков или смеси из двух белков. Например, в комбинации двух белков, как изложено здесь ниже, оба белка можно использовать в качестве белковносителей, либо оба белка могут присутствовать в виде свободных белков, либо оба могут присутствовать в качестве носителя и в виде свободного белка, либо один может присутствовать и в качестве белканосителя, и в виде свободного белка, тогда как другой присутствует только в качестве белка-носителя или только в виде свободного белка, либо один может присутствовать в качестве белка-носителя, а другой в виде свободного белка. Где приведена комбинация из трех белков, существуют подобные возможности. Комбинации включают, но не ограничены ими, РИФ + ЮК1хК2, РИФ + химерные или слитые белки ЮК1хК2-8р91С1егш, РИФ + Р1у, РИФ + 8р128, РИФ + РкаА, РИФ + РкрА, РИ1А + ЫК1хК2, РИ1А + химерные или слитые белки ЮК1хК2-8р91С1егш, РИ1А + Р1у, РИ1А + 8р128, РИ1А + РкаА, РИ1А + РкрА, ЮК1хК2 + ЬуЮ, ЮК1хК2 + РкрА, ЮК1хК2 + РкаА, ЮК1хК2 + 8р128, К1хК2 + ЬуЮ, К1хК2 + РкрА, К1хК2 + РкаА, К1хК2 + 8р128, К1хК2 + РИФ, К1хК2 + РНА. Возможно ЮК1хК2 (или К1хК2) принадлежат СЬрА или РкрС. Возможно эти участки принадлежат СЬрА. Другие комбинации включают комбинации 3 белков, такие как РИФ + ЮК1хК2 + Р1у, и РИ1А + ЮК1хК2 + РИФ. В одном воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и РИФ или РИФЕ в качестве белковносителей. В следующем воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и РИФ или РИФЕ в виде свободных белков.
В независимом аспекте в настоящем изобретении описана иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере четыре конъюгата капсульных сахаридов 8. рпеитошае, включающих сахариды от различных серотипов 8. рпеитошае, где по меньшей мере один сахарид конъюгирован с РИФ или его слитым белком, и иммуногенная композиция способна вызывать эффективный иммунный ответ против
РИФ.
Эффективный иммунный ответ против РИФ или его слитого белка измеряют, например, с помощью протективного анализа, такого как описан в примере 15. Эффективный иммунный ответ обеспечивает по меньшей мере 40, 50, 60, 70, 80 или 90% выживание через 7 суток после контрольного заражения гетерологичным штаммом. С учетом того, что штамм для контрольного заражения является гетерологичным, обеспечиваемая защита является следствием иммунного ответа против РИФ или его слитого белка.
Альтернативно эффективный иммунный ответ против РИФ измеряют с помощью ЕЬ18А, как описано в примере 14. Эффективный иммунный ответ дает ответ анти-РИФ 1дО по меньшей мере 250, 300, 350, 400, 500, 550 или 600 мкг/мл ГСК.
- 13 020817
Например, в иммуногенной композиции по меньшей мере 3, 4, 5 или 6 капсульных сахаридов 8. рпеитопбае от различных серотипов конъюгированы с РИФ или его слитым белком. Например, серотипы 22Р и 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7, дополнительно выбранные из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 8, 9Ν, 9У, 10А, 11А, 12Р, 14, 15, 17Р, 18С, 19А, 19Р, 20, 23Р и 33Р, конъюгированы с РИФ. В воплощении два или три из серотипов 3, 6А и 22Р конъюгированы с РИФ или его слитым белком.
В одном воплощении иммуногенной композиции по изобретению капсульные сахариды 8. рпеитопбае конъюгированы с РИФ или его слитым белком посредством линкера, например ΑΌΗ. В одном воплощении используют один из химических способов конъюгации, описанных ниже.
В одном воплощении иммуногенной композиции по изобретению, где капсульные сахариды 8. рпеитопбае конъюгированы с РИФ или его слитым белком, отношение РИФ к сахариду в конъюгате составляет от 6:1 до 1:5, от 6:1 до 2:1, от 6:1 до 2,5:1, от 6:1 до 3:1, от 6:1 до 3,5:1 (мас./мас.) или выше (т.е. содержит большую долю РИФ) 2,0:1, 2,5:1, 3,0:1, 3,5:1 или 4,0:1 (мас./мас.).
В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит пневмолизин.
Далее в настоящем изобретении предложена вакцина, содержащая иммуногенные композиции по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.
Вакцины по настоящему изобретению могут содержать адъюванты, в частности, когда они предназначены для применения у пожилого населения, а также для применения у детей младшего возраста. Пригодные адъюванты включают соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия, либо фосфат алюминия, либо квасцы, но могут также представлять собой соли других металлов, такие как соли кальция, магния, железа или цинка, либо могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированных сахаров, катионных или анионных производных сахаридов или полифосфазенов.
Адъювант возможно выбран таким образом, что является преимущественным индуктором ТН1 типа ответа. Такие высокие уровни цитокинов ТИ1-типа склонны способствовать индукции клеточноопосредованных иммунных ответов на данный антиген, тогда как высокие уровни цитокинов ТИ2-типа склонны способствовать индукции гуморальных иммунных ответов на антиген.
Различие иммунного ответа ТИ1 и ТИ2-типа не является абсолютным. В действительности индивидуум должен поддерживать иммунный ответ, который описан как преимущественно ТИ1 или преимущественно ТИ2. Однако часто удобно рассматривать семейства цитокинов относительно тех, которые описаны в мышиных Т-клеточных клонах СФ4 +уе Моктапп и СоГГтап (Моктапп, Т.К. апб СоГГтап, К.Ь. (1989), ТН1 апб ТН2 себбк: ббГГегепб раббегпк оГ бутрйокбпе кеегеббоп 1еаб бо ббГГетепб бипеббопаб рторетббек. (Аппиаб Кеубете оГ бттипободу, 7, р. 145-173)). Традиционно ответы ТИ1-типа связаны с продуцированием цитокинов ИФН-γ и ИЛ-2 Т-лимфоцитами. Другие цитокины, часто непосредственно связанные с индукцией иммунных ответов ТИ1-типа, не продуцируются Т-клетками, такие как ИЛ-12. Напротив, ответы ТИ2-типа связаны с секрецией ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10. Пригодные адъювантные системы, которые стимулируют преимущественно ТИ1 ответ, включают монофосфориллипид А или его производное (или детоксифицированный липид А в целом, см., например, УО 2005107798), в частности 3-де-Оацилированный монофосфориллипид А (3П-МРЬ) (его получение см. в ОВ 2220211 А); и комбинация монофосфориллипида А, возможно 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А, вместе либо с солью алюминия (например, фосфатом алюминия или гидроксидом алюминия), либо эмульсией масло-вводе. В таких комбинациях антиген и 3П-МРЬ содержатся в одних и тех же структурах в виде частиц, что дает возможность более эффективной доставки антигенного и иммуностимулирующих сигналов. Исследования показали, что 3П-МРЬ способен дополнительно усиливать иммуногенность антигена, адсорбированного на квасцах [ТИоебеп еб аб. Уассбпе (1998), 16:708-14; ЕР 689454-В1].
Усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, в частности комбинацию 0821 и 3П-МРЬ, как раскрыто в УО 94/00153, или менее реактогенную композицию, где 0821 погашен холестерином, как раскрыто в УО 96/33739. Особо эффективный адъювантный препарат, включающий 0821, 3П-МРЬ и токоферол в эмульсии масло-в-воде, описан в УО 95/17210. В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собой 0821. Препарат может также содержать эмульсию масло-в-воде и токоферол (УО 95/17210). Неметилированные СрО-содержащие олигонуклеотиды (УО 96/02555) и другие иммуномодуляторные олигонуклеотиды (УО 0226757 и УО 03507822) являются также преимущественными индукторами ТН1 ответа и пригодны для применения в настоящем изобретении.
Конкретные адъюванты представляют собой адъюванты, выбранные из группы солей металлов, эмульсий масло-в-воде, агониста То11-подобных рецепторов (в частности, агониста То11-подобного рецептора 2, агониста То11-подобного рецептора 3, агониста То11-подобного рецептора 4, агониста То11подобного рецептора 7, агониста То11-подобного рецептора 8 и агониста То11-подобного рецептора 9), сапонинов или их комбинаций.
Адъювант, который можно применять с вакцинными композициями по изобретению, представляет собой препараты пузырьков или наружных мембранных везикул из штаммов грамотрицательных бактерий, таких как заявлены УО 02/09746, в частности пузырьков Ν. тешпдбббббк. Адъювантные свойства пузырьков могут быть улучшены за счет сохранения ЛОС (липоолигосахарида) на их поверхности (на- 14 020817 пример, посредством экстракции низкими концентрациями детергента [например, 0-0,1% деоксихолатом]). ЛОС может быть детоксифицирован посредством мутаций ткЬВ(-) или ΗΐτΒ(-), обсуждаемых в νθ 02/09746. Адъювантные свойства могут быть также улучшены путем сохранения РогВ (и возможно удаления РогА) из менингококковых пузырьков. Адъювантные свойства могут быть также улучшены путем укорочения наружной сердцевинной сахаридной структуры ЛОС на менингококковых пузырьках, например, посредством мутации 1д!В(-), обсуждаемой в νθ 2004/014417. Альтернативно, вышеупомянутый ЛОС (например, выделенный из штамма ткЬВ(-) и/или 1д!В(-)) можно очистить и применять в качестве адъюванта в композициях по изобретению.
Следующий адъювант, который можно использовать с композициями по изобретению, может быть выбран из группы сапонина, липида А или его производного, иммуностимулирующего олигонуклеотида, алкилглюкозаминида фосфата, эмульсии масло-в-воде или их комбинаций. Следующий адъювант, который можно использовать с композициями по изобретению, представляет собой соль металла в комбинации с другим адъювантом. В воплощении адъювант представляет собой агонист То11-подобного рецептора, в частности агонист То11-подобного рецептора 2, 3, 4, 7, 8 или 9, или сапонин, в частности 0821. В воплощении адъювантная система включает два или более чем два адъюванта из вышеприведенного перечня. В частности, комбинации возможно содержат адъювант сапонин (в частности, 0821) и/или агонист То11-подобного рецептора 9, такой как иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий СрС. Другие комбинации включают сапонин (в частности, 0821) и агонист То11-подобного рецептора 4, такой как монофосфориллипид А, или его 3-деацилированное производное, 3О-МРЬ, или сапонин (в частности, 0821) и агонист То11-подобного рецептора 4, такой как алкилглюкозамидина фосфат.
В одном воплощении адъюванты представляют собой комбинации ЗО-МРЬ и 0821 (ЕР 0671948В1), эмульсии масло-в-воде, содержащие ЗЭ-МРЬ и 0821 (νθ 95/17210, νθ 98/56414), или ЗЭ-МРЕ включенный в препарат с другими носителями (ЕР 0689454В1). В одном воплощении адъювантные системы включают комбинацию ЗЭ-МРЬ, 0821 и олигонуклеотида СрС, как описано в И8 6558670, И8 6544518.
В одном воплощении адъювант представляет собой лиганд То11-подобного рецептора (ТЬК) 4 и, возможно, агонист, такой как производное липида А, в частности монофосфориллипид А или более конкретно 3-деацилированный монофосфориллипид А (ЗО-МРЬ).
ЗЭ-МРЬ имеется в продаже от фирмы С1ахо8тйЪК1ше Вю1одюа18 ЫогФ Атепса и, прежде всего, стимулирует ответы Т-клеток СЭ4+ с фенотипом ИФН-д (ТЫ). Он может быть получен в соответствии со способами, раскрытыми в СВ 2220211А. Химически он представляет собой смесь 3-деацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. В одном воплощении композиции по настоящему изобретению используют ЗЭ-ЫРЬ малого размера частиц. ЗЭ-ЫРЬ малого размера частиц имеет такой размер частиц, что его можно стерильно фильтровать через 0,22 мкм фильтр. Такие препараты описаны в международной патентной заявке νθ 94/21292. Синтетические производные липида А известны, и их считают агонистами ТЬК 4, включая, но не ограничиваясь ими:
ОМ 174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(К)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-о-фосфоно-в-Оглюкопиранозил]-2-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]-а-П-глюкопиранозилдигидрофосфат) (νθ
95/14026);
ОМ 294 ЭР (38,9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9(К)-[(К)-3гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1,10-бис-(дигидрофосфат) (νθ 99/64301 и νθ 00/0462);
ОМ 197 МР-Ас ЭР (38-,9Р)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(К)-3гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1 -дигидрофосфат 10-(6-аминогексаноат) (νθ 01/46127).
Другими лигандами ТЬК4, которые можно использовать, являются алкилглюкозаминида фосфаты (АСР), такие как раскрыты в νθ 9850399 или И8 6303347 (также раскрыты способы получения АСР) или фармацевтически приемлемые соли АСР, как раскрыто в И8 6764840. Некоторые АСР являются агонистами ТЬК.4, и некоторые являются антагонистами ТЬК4. И те и другие считают полезными в качестве адъювантов.
Другим иммуностимулятором для применения в настоящем изобретении является 0ш1 А и его производные. 0ш1 А представляет собой препарат сапонина, выделенного из южноамериканского дерева 0ш1а_)а 8аропайа МоНна. и был впервые описан как обладающий адъювантной активностью авторами ЭаНдаагД е! а1. в 1974 (8аротп афиуаШя, АгсЫу. ίϋτ Фе декат!е Уиик&гесЬипд, Уо1. 44, 8ргшдег Уег1ад, Вегйп, р. 243-254). С помощью ВЭЖХ выделены очищенные фрагменты 0ш1 А, которые сохраняют адъювантную активность без токсичности, связанной с 0ш1 А (ЕР 0362278), например 087 и 0821 (также известные как 0А7 и 0А21). 08-21 представляет собой природный сапонин, выделенный из коры 0ш11а]а каропапа Мо1ша, который индуцирует цитотоксические Т-клетки СЭ8+ (СТЬ), клетки ТЫ и преимущественный ответ антител 1дС2а, и является сапонином в контексте настоящего изобретения.
Описаны конкретные препараты 0821, которые составляют воплощение изобретения, и эти препараты дополнительно содержат стерин (νθ 96/33739). Сапонины, образующие часть настоящего изобретения, могут быть выделены в форме мицелл, смешанных мицелл (возможно с желчными кислотами), либо могут находиться в форме 18СОМ-матриксов (ЕР 0109942 В1), липосом или родственных коллоидных структур, таких как червеобразные или кольцеобразные мультимерные комплексы или липидно- 15 020817 слоистые структуры и ламеллы при образовании их с холестерином и липидом, либо в форме эмульсии масло-в-воде (например, как в АО 95/17210). Сапонины могут быть ассоциированы с солью металла, такой как гидроксид алюминия или фосфат алюминия (АО 98/15287). Возможно, сапонин представлен в форме липосомы, 18СОМ или эмульсии масло-в-воде.
Усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А (или детоксифицированного липида А) и производного сапонина, в частности, комбинацию 0821 и 3Ό-ΜΡΕ, как раскрыто в АО 94/00153, или менее реактогенную композицию, где 0821 блокирован холестерином, как раскрыто в АО 96/33739. Особенно эффективный адъювантный препарат, включающий токоферол с 0821 или без 0821 и/или 3Ό-ΜΡΕ в эмульсии масло-в-воде, описан в АО 95/17210. В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собой 0821.
Можно также использовать иммуностимулирующие олигонуклеотиды или любой другой агонист То11-подобного рецептора (ТЬК) 9. Олигонуклеотиды для использования в адъювантах или вакцинах по настоящему изобретению возможно представляют собой СрО-содержащие олигонуклеотиды, возможно содержащие два или более чем два динуклеотидных мотива СрО, разделенных по меньшей мере тремя, возможно по меньшей мере шестью или большим числом нуклеотидов. Мотив СрО представляет собой нуклеотид цитозин со следующим за ним нуклеотидом гуанином. Олигонуклеотиды СрО по настоящему изобретению типично представляют собой дезоксинуклеотиды. В воплощении межнуклеотидная связь в олигонуклеотиде представляет собой фосфородитиоатную или фосфоротиоатную связь, хотя фосфодиэфирные и другие межнуклеотидные связи находятся в пределах объема изобретения. В объем изобретения также включены олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных или фосфородитиоатных олигонуклеотидов описаны в И8 5666153, И8 5278302 и АО 95/26204.
Примеры олигонуклеотидов имеют приведенные ниже последовательности. Эти последовательности возможно содержат межнуклеотидные связи, модифицированные фосфоротиоатом.
О1_ЮО 1 (ЗЕО ГО N0:1): ТСС АТС АСС ТТС СТС АСС ТТ (СрС 1826)
ОИСО 2 (ЗЕО ГО N0:2): ТСТ ССС АСС СТС ССС САТ (СрС 1758)
ОИСО 3 (ЗЕО ГО N0:3): АСС САТ САС СТС ССС СОТ САС ССС АСС
АСС
ОИСО 4 (ЗЕО ГО N0:4): ТСС ТСС ТТТ ТСТ СОТ ТТТ СТС ОТТ (СрС
2006)
ОИСО 5 (ЗЕО ГО N0:5): ТСС АТС АСС ТТС СТС АТС СТ (СрС 1668)
ОИСО 6 (ЗЕО ГО N0:6): ТСС АСС ТТТ ТСС ССС ССС ССС С (СрС 5456)
Альтернативные олигонуклеотиды СрО могут содержать вышеприведенные последовательности, в которых присутствуют непоследовательные делеции или добавления. Олигонуклеотиды СрО, используемые в настоящем изобретении, можно синтезировать любым способом, известным в данной области техники (например, см. ЕР 468520). Такие олигонуклеотиды можно удобно синтезировать, используя автоматический синтезатор.
Адъювант может представлять собой эмульсию масло-в-воде или может содержать эмульсию масло-в-воде в комбинации с другими адъювантами. Масляная фаза эмульсионной системы возможно содержит метаболизируемое масло. Значение термина метаболизируемое масло хорошо известно в данной области техники. Метаболизируемое можно определить как способное к преобразованию посредством метаболизма (Эог1апб'5 ШийгаЮб МеФса1 Эхсйопату, А.В. 8апбет5 Сотрапу, 25'1' ебйюп (1974)). Масло может представлять собой любое растительное масло, рыбий жир, животное или синтетическое масло, которое нетоксично для реципиента и способно к преобразованию посредством метаболизма. Орехи, семена и зерно являются распространенными источниками растительных масел. Синтетические масла также составляют часть данного изобретения и могут включать имеющиеся в продаже масла, такие как ЯЕОВЕЕ® и другие. Сквален (2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен) представляет собой ненасыщенное масло, которое обнаруживают в больших количествах в жире печени акулы и в более низких количествах в оливковом масле, масле пшеничных проростков, масле рисовых отрубей и дрожжах, и это масло предназначено для использования в данном изобретении. Сквален является метаболизируемым маслом вследствие того факта, что он является промежуточным соединением в биосинтезе холестерина (Мегск шбех, 10*ЕбПюп, еШгу по. 8619).
Токолы (например, витамин Е) также часто используют в масляных эмульсионных адъювантах (ЕР 0382271 В1; И8 5667784; АО 95/17210). Препараты токолов, используемые в масляных эмульсиях (возможно в эмульсиях масло-в-воде) по изобретению, можно готовить, как описано в ЕР 0382271 В1, в которых токолы могут представлять собой дисперсии капель токола, возможно содержащие эмульгатор, возможно менее 1 мкм в диаметре. Альтернативно токолы можно использовать в комбинации с другим маслом для образования масляной фазы масляной эмульсии. Примеры масляных эмульсий, которые можно использовать в комбинации с токолом, описаны в данном изобретении, такие как вышеописанные метаболизируемые масла.
- 16 020817
Предположили, что адъюванты, представляющие собой эмульсию масло-в-воде, сами по себе полезны в качестве адъювантных композиций (ЕР 0399843 В), а также описаны комбинации эмульсий масло-в-воде и других активных агентов в качестве адъювантов для вакцин (νϋ 95/17210; νϋ 98/56414; νϋ 99/12565; νϋ 99/11241). Описаны другие адъюванты, представляющие собой масляную эмульсию, такие как эмульсии вода-в-масле (И8 5422109; ЕР 0480982 В2) и эмульсии вода-в-масле-в-воде (И8 5424067; ЕР 0480981 В). Все они образуют масляные эмульсионные системы (в частности, при включении токоферолов) с образованием адъювантов и композиций по настоящему изобретению.
В одном воплощении масляная эмульсия (например, эмульсии масло-в-воде) дополнительно содержит эмульгатор, такой как Твин 80 и/или стерин, такой как холестерин. В одном воплощении масляная эмульсия (возможно эмульсия масло-в-воде) содержит метаболизируемое нетоксичное масло, такое как сквалан, сквален или токоферол, такой как альфа-токоферол (и возможно и сквален, и альфа-токоферол) и возможно эмульгатор (или сурфактант), такой как Твин 80. Можно также включать стерин (например, холестерин).
Способ получения эмульсий масло-в-воде хорошо известен специалисту в данной области техники. Обычно этот способ включает смешивание токолсодержащей масляной фазы с сурфактантом, таким как раствор ЗФР/Твин 80™, с последующей гомогенизацией с использованием гомогенизатора; специалисту в данной области техники ясно, что способ, включающий пропускание смеси дважды через иглу шприца, должен быть пригоден для гомогенизации небольших объемов жидкости. В равной степени способ эмульгирования в микрофлюидизаторе (аппарат микрофлюидики М1108, максимум 50 пропусков за период 2 мин при максимальном давлении на входе 6 бар (6х 105 Па) (давление на выходе примерно 850 бар (850х 105 Па))) может быть адаптирован специалистом в данной области техники для получения меньших или больших объемов эмульсии. Адаптация может быть достигнута путем рутинного экспериментирования, включающего измерение полученной в результате эмульсии до достижения препарата с масляными каплями требуемого диаметра. В эмульсии масло-в-воде масло и эмульгатор должны находиться в водном носителе. Водный носитель может представлять собой, например, фосфатно-солевой буферный раствор.
Размер масляных капель, обнаруживаемых в стабильной эмульсии масло-в-воде, возможно составляет менее 1 мкм, может находиться в интервале, по существу, 30-600 нм, возможно, по существу, примерно 30-500 нм в диаметре, и возможно, по существу, 150-500 нм в диаметре, в частности примерно 150 нм в диаметре на основании измерения с помощью фотонно-корреляционной спектроскопии. В этом отношении 80% числа масляных капель должно находиться в этих интервалах, возможно более чем 90% и возможно более чем 95% числа масляных капель находятся в определенных интервалах размера. Количества компонентов, присутствующих в масляных эмульсиях по настоящему изобретению, общепринято находятся в интервале 0,5-20% или 2-10% масла (от суммарного объема дозы), такого как сквален; и, когда присутствует, от 2 до 10% альфа-токоферола; и от 0,3 до 3% сурфактанта, такого как полиоксиэтиленсорбитана моноолеат. Возможно отношение масло (например, сквален):токол (например, αтокоферол) равно или меньше 1, поскольку это обеспечивает более стабильную эмульсию. Эмульгатор, такой как Твин 80 или 8рап 85, может также присутствовать на уровне примерно 1%. В некоторых случаях может быть предпочтительно, чтобы вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор.
Примеры эмульсионных систем описаны в νϋ 95/17210, νϋ 99/11241 и νϋ 99/12565, где раскрыты эмульсионные адъюванты на основе сквалена, α-токоферола и Твин 80, возможно включенные в препарат с иммуностимуляторами 0821 и/или 3Э-МРР
Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения адъювант по изобретению может дополнительно содержать дополнительные иммуностимуляторы, такие как ЛПС или его производные, и/или сапонины. Примеры дополнительных иммуностимуляторов описаны в данном изобретении и в Уассше Эекидп - ТНе 8иЬипН и Афиуап! АрргоасН, 1995, РНагтасеиНса1 Вю!есНпо1оду, Уо1ите 6, Ебк. Ро\уе11, М.Р., апб №\утап, М.Т, Р1епит Ргекк, №\у Уогк апб Ьопбоп, Ι8ΕΝ 0-306-44867-Х.
В одном воплощении адъювантные и иммуногенные композиции согласно изобретению содержат сапонин (например, 0821) и/или производное ЛПС (например, 3Э-МРЕ) в масляной эмульсии, описанной выше, возможно со стерином (например, холестерином). Дополнительно масляная эмульсия (возможно эмульсия масло-в-воде) может содержать 8рап 85, и/или лецитин, и/или трикаприлин. Адъюванты, включающие эмульсию масло-в-воде, стерин и сапонин, описаны в νϋ 99/12565.
Типично для введения человеку сапонин (например, Р821) и/или производное ЛПС (например, 3ΌМРЬ) должны присутствовать в дозе иммуногенной композиции для человека в диапазоне от 1 до 200 мкг, как, например, 10-100 мкг или 10-50 мкг на дозу. Типично масляная эмульсия (возможно эмульсия масло-в-воде) должна содержать от 2 до 10% метаболизируемого масла. Возможно, она должна содержать от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% альфа-токоферола и от 0,3 до 3% (возможно 0,4-2%) эмульгатора (возможно Твин 80 [полиоксиэтиленсорбитана моноолеата]). Где присутствуют и сквален, и альфатокоферол, возможно отношение сквален:альфа-токоферол равно или меньше 1, поскольку это обеспечивает более стабильную эмульсию. 8рап 85 (сорбитана триолеат) может также присутствовать в эмульси- 17 020817 ях, используемых в изобретении, на уровне от 0,5 до 1%. В некоторых случаях может быть предпочтительно, чтобы иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор, например другие эмульгаторы/сурфактанты, включая каприловую кислоту (Мегск шкех 10* ЕкШои, еп!гу по. 1739), например трикаприлин.
Если включены сквален и сапонин (возможно Ц821), включение стерина (возможно холестерина) в препарат также обладает пользой, поскольку это дает возможность снизить суммарный уровень масла в эмульсии. Это приводит к сниженной стоимости получения, улучшению общего комфорта вакцинации, а также к качественным и количественным улучшениям полученных в результате иммунных ответов, таким как улучшенное продуцирование ИФН-γ. Соответственно, адъювантная система по настоящему изобретению типично содержит отношение метаболизируемое масло:сапонин (мас./мас.) в интервале от 200:1 до 300:1, а также настоящее изобретение можно использовать в форме низкого содержания масла, возможный интервал которого составляет от 1:1 до 200:1, возможно от 20:1 до 100:1 или, по существу, 48:1, и эта вакцина сохраняет полезные адъювантные свойства всех компонентов при значительно сниженном профиле реактогенности. Соответственно, некоторые воплощения имеют отношение сквален:Ц821 (мас./мас.) в интервале от 1:1 до 250:1, либо от 20:1 до 200:1, либо от 20:1 до 100:1, либо, по существу, 48:1. Возможно также включают стерин (например, холестерин), присутствующий в соотношении сапонин:стерин, как описано в данном изобретении.
Эмульсионные системы по настоящему изобретению возможно имеют малый размер масляных капель в субмикронном диапазоне. Возможно размеры масляных капель находятся в диапазоне от 120 до 750 нм или от 120-600 нм в диаметре.
Особенно эффективный адъювантный препарат (для конечного комбинирования с А1РО4 в иммуногенных композициях по изобретению) включает сапонин (например, Ц821), производное ЛПС (например, 30-МРЬ) и масляную эмульсию (например, сквален и альфа-токоферол в эмульсии масло-в-воде), как описано в \УО 95/17210 или в \УО 99/12565 (в конкретном адъювантном препарате 11 в примере 2, табл. 1).
Примеры агониста ТЬК2 включают пептидогликан или липопротеин. Имидазохинолины, такие как имиквимод и резиквимод, являются известными агонистами ТЬК7. Однонитевая РНК также является известным агонистом ТЬК (ТЬК8 у людей и ТЬК7 у мышей), тогда как двунитевая РНК и поли-1С (полиинозиновая - полицитидиловая кислота - коммерческий синтетический миметик вирусной РНК) являются примерами агонистов ТЬК3. 30-МРЬ является примером агониста ТЬК4, тогда как СРО является примером агониста ТЬК9.
Иммуногенная композиция может содержать антиген и иммуностимулятор, адсорбированные на соли металла. Вакцинные препараты на основе алюминия, где антиген и иммуностимулятор 3-де-Оацилированный монофосфориллипид А (3П-МРЬ) адсорбированы на одной и той же частице, описаны в ЕР 0576478 В1, ЕР 0689454 В1 и ЕР 0633784 В1. Тогда в этих случаях сначала антиген адсорбируют на соли алюминия с последующей адсорбцией иммуностимулятора 30-МРЬ на тех же частицах соли алюминия. Такие способы включают, во-первых, суспендирование 30-МРЬ путем обработки ультразвуком в водяной бане до тех пор, пока частицы не достигнут размера между 80 и 500 нм. Антиген типично адсорбируют на соли алюминия в течение одного часа при комнатной температуре при перемешивании. Затем суспензию 30-МРЬ добавляют к адсорбированному антигену, и препарат инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем держат при 4°С до использования.
В другом способе иммуностимулятор и антиген находятся на отдельных частицах металла, как описано в ЕР 1126876. Этот усовершенствованный способ включает адсорбцию иммуностимулятора на частице соли металла с последующей адсорбцией антигена на другой частице соли металла, после чего смешивают дискретные металлические частицы с образованием вакцины. Адъювант для использования в настоящем изобретении может представлять собой адъювантную композицию, содержащую иммуностимулятор, адсорбированный на частице соли металла, отличающуюся тем, что эти частицы соли металла, по существу, свободны от другого антигена. Кроме того, в настоящем изобретении предложены вакцины и характеризуются тем, что иммуностимулятор адсорбирован на частицах соли металла, которые, по существу, свободны от другого антигена, и тем, что частицы соли металла, на которых адсорбирован антиген, по существу, свободны от другого иммуностимулятора.
Соответственно, в настоящем изобретении описан адъювантный препарат, содержащий иммуностимулятор, который адсорбирован на частице соли металла, отличающийся тем, что композиция, по существу, является свободной от другого антигена. Кроме того, этот адъювантный препарат может представлять собой промежуточный препарат, который, при использовании такого адъюванта, требуется для получения вакцины. Соответственно, описан способ получения вакцины, включающий смешивание адъювантной композиции, которая представляет собой один или более чем один иммуностимулятор, адсорбированный на частице металла, с антигеном. Возможно антиген предварительно адсорбирован на соли металла. Такая соль металла может быть идентична или подобна соли металла, на которой адсорбирован иммуностимулятор. Возможно соль металла представляет собой соль алюминия, например фосфат алюминия или гидроксид алюминия.
- 18 020817
Далее в настоящем изобретении описана вакцинная композиция, содержащая иммуностимулятор, адсорбированный на первой частице соли металла, и антиген, адсорбированный на соли металла, отличающаяся тем, что первая и вторая частицы соли металла представляют собой отдельные частицы.
Производные ЛПС или ЛОС, либо мутации или производные липида А, описанные в данном изобретении, сконструированы таким образом, что являются менее токсичными (например, 3П-МРЬ), чем нативные липополисахариды, и являются взаимозаменяемыми эквивалентами в отношении любых применений этих группировок, описанных в данном изобретении.
В одном воплощении адъювант, используемый для композиций по изобретению, включает липосомный носитель (полученный с помощью известных методик из фосфолипидов (таких как диолеоилфосфатидилхолин |ЭОРС|) и возможно стерина [такого как холестерин]). Такие липосомные носители могут нести производные липида А [такие как 3П-МРЬ, см. выше] и/или сапонины (такие как 0821. см. выше). В одном воплощении адъювант содержит (на дозу 0,5 мл) 0,1-10 мг, 0,2-7, 0,3-5, 0,4-2 или 0,5-1 мг (например, 0,4-0,6, 0,9-1,1, 0,5 или 1 мг) фосфолипида (например, ЭОРС), 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3 или 0,125-0,25 мг (например, 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 или 0,125 мг) стерина (например, холестерина), 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3Э-МРЬ) и 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) сапонина (например, 0821).
Этот адъювант особенно пригоден для препаратов вакцин для пациентов пожилого возраста. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит конъюгаты сахаридов, имеющих происхождение, по меньшей мере, от всех перечисленных ниже серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р, 23Р, 1, 5, 7Р (и может также содержать один или более чем один из серотипов 3, 6А, 19А и 22Р), где ГСК титра антител, индуцированных против одного или более чем одного (или всех) компонента вакцины 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р, незначительно ниже таковой при индукции вакциной Ргеупаг® у вакцинированных людей.
В одном воплощении адъювант, используемый для композиций по изобретению, включает эмульсию масло-в-воде, полученную из метаболизируемого масла (такого как сквален), эмульгатора (такого как Твин 80) и возможно токола (такого как альфа-токоферол). В одном воплощении адъювант содержит (на дозу 0,5 мл) 0,5-15, 1-13, 2-11, 4-8 или 5-6 мг (например, 2-3, 5-6 или 10-11 мг) метаболизируемого масла (такого как сквален), 0,1-10, 0,3-8, 0,6-6, 0,9-5, 1-4 или 2-3 мг (например, 0,9-1,1, 2-3 или 4-5 мг) эмульгатора (такого как Твин 80) и возможно 0,5-20, 1-15, 2-12, 4-10, 5-7 мг (например, 11-13, 5-6 или 2-3 мг) токола (такого как альфа-токоферол).
Этот адъювант может возможно дополнительно содержать 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 515, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3П-МРЬ).
Эти адъюванты особенно пригодны для вакцинных препаратов для детей младшего возраста или пожилых. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит конъюгаты сахаридов, имеющих происхождение, по меньшей мере, от всех перечисленных ниже серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р, 23Р, 1, 5, 7Р (и может также содержать один или более чем один из серотипов 3, 6А, 19А и 22Р), где ГСК титра антител, индуцированных против одного или более чем одного (или всех) компонента вакцины 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р, незначительно ниже таковой при индукции вакциной Ргеупаг® у вакцинированных людей.
Этот адъювант может возможно содержать 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3 или 0,125-0,25 мг (например, 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 или 0,125 мг) стерина (например, холестерина), 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3П-МРЬ) и 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) сапонина (например, 0821).
Этот адъювант особенно пригоден для вакцинных препаратов для пациентов пожилого возраста. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит конъюгаты сахаридов, имеющих происхождение, по меньшей мере, от всех перечисленных ниже серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р, 23Р, 1, 5, 7Р (и может также содержать один или более чем один из серотипов 3, 6А, 19А и 22Р), где ГСК титра антител, индуцированных против одного или более чем одного (или всех) компонента вакцины 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р, незначительно ниже таковой при индукции вакциной Ргеупаг® у вакцинированных людей.
В одном воплощении адъювант, используемый для композиций по изобретению, содержит фосфат алюминия и производное липида А (такое как 3П-МРЬ). Этот адъювант может содержать (на дозу 0,5 мл) 100-750, 200-500, 400-500 или 300-400 мкг А1 в виде фосфата алюминия и 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3Э-МРЬ).
Этот адъювант особенно пригоден для вакцинных препаратов для детей младшего возраста или пожилых людей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит конъюгаты сахаридов, имеющих происхождение, по меньшей мере, от всех перечисленных ниже серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р, 23Р, 1, 5, 7Р (и может также содержать один или более чем один из серотипов 3, 6А, 19А и 22Р), где ГСК титра антител, индуцированных против одного или более чем одного (или всех) компонента вакцины 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р, незначительно ниже таковой при индукции вакциной
- 19 020817
Ргеупаг® у вакцинированных людей.
Вакцинные препараты, содержащие иммуногенные композиции по настоящему изобретению, можно применять для защиты или лечения млекопитающего, чувствительного к инфекции, путем введения указанной вакцины посредством системного пути или введения в слизистую оболочку. Эти введения могут включать инъекцию посредством внутримышечного (1М), внутрибрюшинного (ΙΡ), внутрикожного (ГО) или подкожного (8С) путей; или посредством введения в слизистую оболочку пероральных/пищеварительных, дыхательных, мочеполовых путей. Возможно интраназальное (ΙΝ) введение вакцин для лечения пневмонии или среднего отита (поскольку носоглоточное носительство пневмококков может быть более эффективно предупреждено, таким образом, ослабляя инфекцию на ее самой ранней стадии). Хотя вакцину по изобретению можно вводить в виде однократной дозы, ее компоненты можно также совместно вводить вместе, одновременно или в различные моменты времени (например, конъюгаты пневмококковых сахаридов можно вводить по отдельности, одновременно или через 1-2 недели после введения любого бактериального белкового компонента вакцины для оптимального координирования иммунных ответов по отношению друг к другу). Для совместного введения возможный адъювант ТЫ может присутствовать при любом или при всех из различных введений. Кроме единого пути введения, можно применять два различных пути введения. Например, сахариды или сахаридные конъюгаты можно вводить 1М (или ГО), а бактериальные белки можно вводить ΙΝ (или ГО). Кроме того, вакцины по изобретению можно вводить ГМ для примирующих доз и ΙΝ для бустер-доз.
Содержание белковых антигенов в вакцине типично будет находиться в интервале 1-100 мкг, возможно 5-50 мкг, например в интервале 5-25 мкг. После первичной вакцинации субъекты могут получить одну или несколько бустер-иммунизаций, адекватно разделенных.
Вакцинный препарат в общем описан в Уассше Эеыдп (ТЬе киЬипЪ апб аЬщуаШ арргоасЬ (еб§ Ро\\е11 М.Р. & №\утап М.1.) (1995), Р1епит Рге88 Νον Уогк). Инкапсулирование внутри липосом описано у Ри11ег1оп, патент США 4235877.
Вакцины или иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно хранить в растворе или лиофилизированными. В одном воплощении раствор лиофилизируют в присутствии сахара, действующего в качестве аморфного лиопротектора, такого как сахароза, трегалоза, глюкоза, манноза, мальтоза или лактоза. В одном воплощении раствор лиофилизируют в присутствии сахара, действующего в качестве аморфного лиопротектора, и наполнителя, обеспечивающего улучшенную структуру кека, такого как глицин или маннит. Присутствие кристаллического наполнителя позволяет укоротить циклы вымораживания-сушки в присутствии высокой концентрации соли. Примеры таких смесей для использования при лиофилизации иммуногенных композиций или вакцин по изобретению включают смеси сахароза/глицин, трегалоза/глицин, глюкоза/глицин, манноза/глицин, мальтоза/глицин, сахароза/маннит, трегалоза/маннит, глюкоза/маннит, манноза/маннит и мальтоза/маннит. Типично молярное отношение двух компонентов возможно составляет 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 или 1:6. Иммуногенные композиции по изобретению возможно содержат вышеописанные реагенты лиофилизации.
Вышеописанные стабилизирующие агенты и смеси стабилизирующих агентов могут дополнительно включать полимер, способный увеличивать температуру стеклоперехода (Тд') препарата, такой как поливинилпирролидон (ПВП), гидроксиэтилкрахмал или декстран, или полимер, действующий в качестве кристаллического наполнителя, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), например, имеющий молекулярную массу между 1500 и 6000, и декстран.
Иммуногенные композиции по изобретению возможно лиофилизируют и восстанавливают непосредственно перед применением. Результатом лиофилизации может быть более стабильная композиция (вакцина), и она может, возможно, приводить к более высоким титрам антител в присутствии 30-МРЬ и в отсутствие адъюванта на основе алюминия.
В одном аспекте изобретения описан вакцинный набор, включающий флакон, содержащий иммуногенную композицию по изобретению, возможно в лиофилизированной форме, и дополнительно включающий флакон, содержащий адъювант, как описано в данном изобретении. Рассматривают, что в данном аспекте изобретения адъювант следует использовать для восстановления лиофилизированной иммуногенной композиции.
Хотя вакцины по настоящему изобретению можно вводить любым путем, введение описанных вакцин в кожу (ГО) составляет одно воплощение настоящего изобретения. Кожа человека содержит наружную роговую кутикулу, называемую роговым слоем, под которым лежит эпидермис. Под эпидермисом находится слой, называемый дермой, под которым, в свою очередь, лежит подкожная ткань. Исследователи показали, что инъекция вакцины в кожу, в частности в дерму, стимулирует иммунный ответ, который может быть также связан с рядом дополнительных преимуществ. Внутрикожная вакцинация вакцинами, описанными здесь, образует возможный признак настоящего изобретения.
Общепринятая методика внутрикожной инъекции, метод Манту, включает стадии очистки кожи, а затем, вытягивая одной рукой и располагая скошенный конец иглы узкого калибра (калибра 26-31) кверху, иглу вводят под углом между 10-15°. Как только скошенный конец иглы введен, цилиндр иглы опускают и продвигают дальше, прилагая при этом легкое давление, чтобы поднять ее под кожу. Затем
- 20 020817 жидкость инъецируют очень медленно, образуя посредством этого пузырек или папулу на поверхности кожи, после чего медленно вытягивают иглу.
Более недавно описаны устройства, которые специально сконструированы для введения жидких агентов в кожу или через кожу, например устройства, описанные в \УО 99/34850 и ЕР 1092444, а также устройства для безыгольного впрыскивания, описанные, например, в \УО 01/13977; И8 5480381, И8 5599302, И8 5334144, И8 5993412, И8 5649912, И8 5569189, И8 5704911, И8 5383851, И8 5893397, И8 5466220, И8 5339163, И8 5312335, И8 5503627, И8 5064413, И8 5520639, И8 4596556, И8 4790824, И8 4941880, и8 4940460, \УО 97/37705 и \УО 97/13537. Альтернативные способы внутрикожного введения вакцинных препаратов могут включать общепринятые шприцы и иглы, либо устройства, сконструированные для баллистической доставки твердых вакцин (\УО 99/27961), или чрескожные пластыри (\УО 97/48440; \УО 98/28037); или нанесенные на поверхность кожи (чрескожная доставка \УО 98/20734; \УО 98/28037).
Когда вакцины по настоящему изобретению нужно вводить в кожу, или более конкретно в дерму, вакцина находится в небольшом объеме жидкости, в частности в объеме от примерно 0,05 до 0,2 мл.
Содержание антигенов в кожных или внутрикожных вакцинах по настоящему изобретению может быть подобно общепринятым дозам, которые находятся во внутримышечных вакцинах (см. выше). Однако признаком кожных или внутрикожных вакцин является то, что препараты могут представлять собой препараты низкой дозы. Соответственно, белковые антигены в вакцинах низкой дозы возможно присутствуют в столь малом количестве, как от 0,1 до 10 мкг или от 0,1 до 5 мкг на дозу; и сахаридные (возможно конъюгированные) антигены могут присутствовать в диапазоне 0,01-1 мкг или между 0,01 и 0,5 мкг сахарида на дозу.
При использовании здесь, термин внутрикожная доставка означает доставку вакцины в область дермы в коже. Однако вакцина не обязательно должна быть локализована исключительно в дерме. Дерма представляет собой слой в коже, локализованный между примерно 1,0 и примерно 2,0 мм от поверхности в коже человека, но существует некоторое количественное варьирование между индивидуумами и в различных частях тела. Как правило, можно ожидать достижения дермы путем вхождения на 1,5 мм ниже поверхности кожи. Дерма локализована между роговым слоем и эпидермисом на поверхности и подкожным слоем ниже. В зависимости от способа доставки вакцина может быть, в конечном счете, локализована исключительно или, в основном, внутри дермы, либо она может быть, в конечном счете, распределена внутри эпидермиса и дермы.
Далее в настоящем изобретении описана усовершенствованная вакцина для предупреждения или облегчения течения среднего отита, вызванного НаеторЬЛик тЛиеп/ае. в результате добавления белков НаеторЬЛик тЛиеп/ае, например белка Ό, в конъюгированной форме. Кроме того, далее в настоящем изобретении описана усовершенствованная вакцина для предупреждения или облегчения течения пневмококковой инфекции у детей младшего возраста (например, среднего отита) за счет того, что она основана на добавлении одного или двух пневмококковых белков в виде свободного или конъюгированного белка к конъюгатным композициям 8. рпеитотае по изобретению. Указанные пневмококковые свободные белки могут представлять собой те же или другие белки, чем белки 8. рпеитотае, используемые в качестве белков-носителей. Один или более чем один белковый антиген Могахе11а са1аггЬаП5 может быть также включен в комбинированную вакцину в свободной или конъюгированной форме. Таким образом, в настоящем изобретении описан усовершенствованный способ индукции (защитного) иммунного ответа против среднего отита у детей младшего возраста.
В другом воплощении настоящего изобретения описан усовершенствованный способ индукции (защитного) иммунного ответа у детей младшего возраста (определенного как возраст 0-2 года в контексте настоящего изобретения) путем введения безопасного и эффективного количества вакцины по изобретению [педиатрической вакцины]. Следующие воплощения настоящего изобретения включают разработку антигенных конъюгатных композиций 8. рпеитотае по изобретению для применения в медицине и применение конъюгатов 8. рпеитотае по изобретению при изготовлении лекарственного средства для предупреждения (или лечения) пневмококкового заболевания.
В другом воплощении настоящего изобретения описан усовершенствованный способ индукции (защитного) иммунного ответа у пожилого населения (в контексте настоящего изобретения пациента считают пожилым, если он находится в возрасте 50 лет или старше, типично старше 55 лет и чаще всего старше 60 лет) путем введения безопасного и эффективного количества вакцины по изобретению, возможно в сочетании с одним или двумя белками 8. рпеитотае, присутствующими в виде свободного или конъюгированного белка, где свободные белки 8. рпеитотае могут представлять собой те же или другие белки, чем любые белки 8. рпеитотае, используемые в качестве белков-носителей.
В изобретении также описан способ иммунизации человека-хозяина против заболевания, вызванного инфекцией 8. рпеитотае, и возможно НаеторЬЛик тЛиеп/ае, при котором хозяину вводят иммунопротективную дозу иммуногенной композиции или вакцины по изобретению.
В изобретении также описана иммуногенная композиция по изобретению для использования при лечении или предупреждении заболевания, вызванного инфекцией 8. рпеитотае и возможно НаеторЫ1и5 тЛиеп/ае.
- 21 020817
В изобретении также описано применение иммуногенной композиции или вакцины по изобретению при изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызванных инфекцией 8. рпеииюшае и возможно НаеиюрНФю тЛиеп/ае.
Термины содержащий, содержат и содержит здесь подразумеваются авторами изобретения как возможно заменяемые терминами состоящий из, состоят из и состоит из, соответственно, в каждом случае.
Воплощения в данном изобретении, относящиеся к вакцинным композициям по изобретению, также применимы к воплощениям, относящимся к иммуногенным композициям по изобретению, и наоборот.
Все ссылки или патентные заявки, цитируемые в описании данного патента, включены в данную заявку посредством ссылки.
В целях лучшего понимания изобретения приведены следующие примеры. Эти примеры предназначены только в целях иллюстрации и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.
Примеры
Пример 1. Экспрессия белка Ό.
Белок Ό ΗаетοрЬ^1и8 тЛиеп/ае.
Генетическая конструкция для экспрессии белка Ό.
Исходные материалы.
ДНК, кодирующая белок Ό.
Белок Ό является высококонсервативным среди всех серотипов и нетипируемых штаммов Н. 1пйиеп/ае. Вектор рН1С348, содержащий последовательность ДНК, кодирующую ген полноразмерного белка Ό, получен от Όγ. А. Ρο^8§^еη, кафедра медицинской микробиологии, Университет г. Лунд, больница общего профиля г. Мальме, Мальме, Швеция. Последовательность ДНК белка Ό опубликована ^аη8οη е( а1. (1991) 1п£есН Липши. 59: 119-125.
Экспрессионный вектор рМО 1.
Экспрессионный вектор рМО 1 представляет собой производное рВК322 (Ого88 е( а1., 1985), в который были введены регуляторные элементы для транскрипции и трансляции чужеродных генов, имеющие происхождение от бактериофага λ (8На(/1пап е( а1., 1983). Кроме того, ген устойчивости к ампициллину был заменен геном устойчивости к канамицину.
Штамм Е.той АК58.
Штамм Εχο1ί АК58 был получен путем трансдукции N99 штаммом фага Р1, предварительно выращенным на производном 8А500 (§а1Е::ТМ0, 1атЬάаΚ^1- с1857 ДН1). N99 и 8А500 представляют собой штаммы Ε^ο1ί К12, полученные из лаборатории Όγ. МаШп Кο8еηЬе^§'8 в Национальном институте здравоохранения.
Экспрессионный вектор рМО 1.
Для продуцирования белка Ό ДНК, кодирующая этот белок, клонирована в экспрессионном векторе рМО 1. Эта плазмида использует сигналы от ДНК фага лямбда для направления транскрипции и трансляции встроенных чужеродных генов. Этот вектор содержит промотор РЬ, оператор ОЬ и два сайта утилизации (МТ и ΝιιΐΚ) для ослабления эффектов полярности транскрипции при обеспечении белка N (Ою88 е( а1., 1985). Векторы, содержащие промотор РЬ, вводят в лизогенного хозяина Εχο1ί для стабилизации плазмидной ДНК. Лизогенные штаммы-хозяева содержат репликационно-дефектную ДНК фага лямбда, интегрированную в геноме ^^/иап е( а1., 1983). Хромосомная ДНК фага лямбда направляет синтез репрессорного белка с1, который связывается с репрессором ОЬ вектора и предотвращает связывание РНК полимеразы с промотором РЬ и посредством этого транскрипцию встроенного гена. Ген с1 экспрессионного штамма АК58 содержит температурно-чувствительный мутант, так что транскрипцию, направляемую РЬ, можно регулировать температурным сдвигом, т.е. повышение температуры в культуре инактивирует репрессор, и синтез чужеродного белка инициируется. Эта экспрессионная система дает возможность регулируемого синтеза чужеродных белков, в частности тех, которые могут быть токсичными для клетки (8Ь^таΐака & Кο8еηЬе^§, 1981).
Штамм Ε^ο1ί АК58.
Лизогенный штамм АК58 Ε^ο1ί. используемый для продуцирования белка-носителя Ό, является производным стандартного штамма ΝΙΗ Εχο1ί К12 N99 (Р- 8и- да1К2, 1ас2- (Нг-). Он содержит дефектный лизогенный фаг лямбда (да1Е::ТМ0, НппЬбаКП- с1857 ΔΗ1). Фенотип Кй- предотвращает остановку синтеза макромолекул хозяина. Мутация с1857 придает температурно-чувствительное повреждение репрессору с1. Делеция ΔН1 удаляет правый оперон фага лямбда и локусы хозяина Ью, пуг3 и сН1А. Штамм АК58 был получен путем трансдукции N99 штаммом фага Р1, предварительно выращенным на производном 8А500 (§а1Е::ТМ0, кнпЬбаКП- с1857 ΔΗ1). Введение дефектного лизогена в N99 было выбрано с тетрациклином вследствие присутствия транспозона ТШ0, кодирующего устойчивость к тетрациклину, в соседнем гене да1Е.
Конструирование вектора рМОМОРРГО.
- 22 020817
Вектор рМС 1, который содержит ген, кодирующий неструктурный белок 81 вируса гриппа (ρΜΟΝ8Ι), был использован для конструирования рМСМОРРтЭ. Ген белка Ό амплифицировали с помощью ПЦР из вектора рН1С348 Дайкон е! а1. 1991, 1пГес1. 1ттип. 59:119-125) с праймерами ПЦР, содержащими сайты рестрикции №о1 и ХЬа1 на 5' и 3' концах соответственно. Затем фрагмент №о1/ХЬа1 был введен в рМО№1 между №о1 и ХЬа1, таким образом, создавая слитый белок, содержащий 81 Νконцевую аминокислоту белка N81, за которыми следует белок РЭ. Этот вектор был обозначен рМО№1 РгЭ.
На основе вышеописанной конструкции была получена конечная конструкция для экспрессии белка Ό. Фрагмент ВатН1/ВатН1 был удален из рМСЖ1РГО. Этот гидролиз ДНК удаляет участок, кодирующий N81, за исключением первых трех Ν-концевых остатков. При сшивании вектора образуется ген, кодирующий слитый белок с последовательностью, показанной в \УО 07/71711, пример 1, с. 44.
Белок Ό не содержит лидерный пептид или Ν-концевой цистеин, к которому обычно присоединены липидные цепи. Следовательно, белок ни выделяется в периплазму, ни претерпевает липидизацию и остается в цитоплазме в растворимой форме.
Конечная конструкция рМС-МЭРРГО была введена в штамм-хозяин АК58 с помощью теплового шока при 37°С. Бактерии, содержащие плазмиду, отбирали в присутствии канамицина. Присутствие вставки ДНК, кодирующей белок Ό, демонстрировали путем расщепления выделенной плазмидной ДНК выбранными эндонуклеазами. Рекомбинантный штамм Е.сой обозначен как ЕСЭ4.
Экспрессия белка Ό находится под контролем промотора лямбда Р[/оператора Оь Штамм-хозяин АК58 содержит в геноме температурно-чувствительный ген с1, который блокирует экспрессию с лямбда Р[, при низкой температуре посредством связывания с Оь Как только температура повышается, с1 высвобождается от Оь и белок Ό экспрессируется.
Синтез в малом масштабе.
По окончании ферментации клетки концентрируют и замораживают.
Экстракцию из собранных клеток и очистку белка Ό проводили, как описано ниже. Замороженный осадок клеточной культуры оттаивают и ресуспендируют в растворе для разрушения клеток (цитратный буфер рН 6,0) до конечной ОЭ650=60. Суспензию дважды пропускают через гомогенизатор высокого давления Р=1000 бар (1000х105 Па). Гомогенат клеточной культуры осветляют центрифугированием, и клеточный дебрис удаляют фильтрованием. На первой стадии очистки фильтрованный лизат наносят на колонку для катионообменной хроматографии (8Р 8ерйагоке Рак! Р1оте). РЭ связывается с матриксом геля посредством ионного взаимодействия, и его элюируют путем ступенчатого повышения ионной силы буфера элюирования.
На второй стадии очистки примеси задерживаются на анионообменной матрице (Ц 8ерйагоке Рак! Р1оте). РЭ не связывается на геле и может быть собран в элюате.
На обеих стадиях колоночной хроматографии мониторинг сбора фракций осуществляют на основании ОЭ. Элюат анионообменной колоночной хроматографии, содержащий очищенный белок Ό, концентрируют путем ультрафильтрации.
Наконец, ультраконцентрат, содержащий белок Ό, пропускают через 0,2 мкм мембрану.
Крупномасштабный синтез.
Экстракцию из собранных клеток и очистку белка Ό проводили, как описано ниже. Собранную культуру охлаждают и непосредственно пропускают дважды через гомогенизатор высокого давления при давлении примерно 800 бар (800х 105 Па).
На первой стадии очистки гомогенат клеточной культуры разбавляют и наносят на колонку для катионообменной хроматографии (гранулы 8Р 8ерйагоке Βί§). РЭ связывается с матрицей геля посредством ионного взаимодействия, и его элюируют путем ступенчатого повышения ионной силы буфера элюирования и фильтруют.
На второй стадии очистки примеси задерживаются на анионообменной матрице (Ц 8ерйагоке Рак! Р1оте). РЭ не связывается на геле и может быть собран в элюате.
На обеих стадиях колоночной хроматографии мониторинг сбора фракций осуществляют на основании ОЭ. Элюат анионообменной колоночной хроматографии, содержащий очищенный белок Ό, концентрируют и подвергают диафильтрации путем ультрафильтрации.
Наконец, ультраконцентрат, содержащий белок Ό, пропускают через 0,2 мкм мембрану.
Пример 1а. Экспрессия РйГО.
Белок РйГО является членом семейства гистидиновых триад (Рй!) пневмококковых белков, характеризующегося присутствием гистидиновых триад (мотива НХХНХН). РйГО представляет собой молекулу из 838 аминокислот и несет 5 гистидиновых триад (см. аминокислотную последовательность в Меб1ттипе \УО 00/37105 8ЕЦ ГО NО: 4 и последовательность ДНК в 8ЕЦ ГО NО: 5). РйГО также содержит богатый пролином участок в середине (положение аминокислот 348-380). РйГО имеет 20-аминокислотную Ν-концевую сигнальную последовательность с мотивом ЬХХС.
Генетическая конструкция.
Последовательность гена зрелого белка Меб1ттипе РйГО (с аминокислоты 21 до аминокислоты
- 23 020817
838) переносили рекомбинантным путем в Е.соН, используя вектор собственной разработки рТСМР14, несущий промотор р/-. Штамм-хозяин Е.соН представляет собой АР58, который несет термочувствительный репрессор с1857, дающий возможность тепловой индукции промотора.
Полимеразную цепную реакцию осуществляли для амплификации гена рНГО из плазмиды МеФттипе (несущей ген рЫГО из 81гер1ососси5 рпеитошае штамм Ыогоау 4 (серотип 4), 8Е0 ГО ЫО: 5, как описано в АО 00/37105). Праймеры, специфичные только для гена рЫГО, использовали для амплификации гена рЫГО в двух фрагментах. Праймеры несут сайты рестрикции либо ЫНе1 и Крп1, либо Крп1 и ХЬа1. Эти праймеры не гибридизуются ни с одним нуклеотидом из вектора, но только с последовательностями, специфичными для гена рЫГО. Искусственный стартовый кодон АТС вводили, используя первый праймер, несущий сайт рестрикции ЫНе1. Затем полученные продукты ПЦР встраивали в клонирующий вектор рСЕМ-Т (Рготеда) и подтверждали последовательность ДНК. Затем осуществляли субклонирование фрагментов в экспрессионном векторе ТСМР14, используя стандартные методики, и вектор трансформировали в АР58 Е.соН.
Очистка РЫГО.
Очистку РЫГО осуществляют, как описано ниже.
Выращивание клеток Е.соН в присутствии канамицина: рост 30 ч при 30°С, затем индукция в течение 18 ч при 39,5°С.
Разрушение клеток Е.соН из цельной культуры при ОЭ±115 в присутствии ЭДТА 5 мМ и ФМСФ 2 мМ в качестве ингибиторов протеазы: Рапше, 2 пассажа, 1000 бар (1000х105 Па).
Улавливание антигена и удаление клеточного дебриса на хроматографии в режиме неплотной набивки ФгеатПпе О ХЬ при комнатной температуре (20°С); колонку промывают ЫаС1 150 мМ + Етр1деп 0,25% рН 6,5 и элюируют ЫаС1 400 мМ + Етр1деп 0,25% в 25 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,4.
Фильтрование на картридже 8аг1оЬгап 150 (0,45 + 0,2 мкм).
Связывание антигена на хроматографии с ΖΦ+ хелатирующей сефарозой ЕЕ 1МАС при рН 7,4 в присутствии 5 мМ имидазола при 4°С; колонку промывают имидазолом 5 мМ и Етр1деп 1% и элюируют 50 мМ имидазолом, оба раствора в 25 мМ калий-фосфатном буфере рН 8,0.
Слабая анионообменная хроматография в положительном режиме на ЕгаФоде1 ЕМЭ ДЭАЭ при рН 8,0 (25 мМ фосфат калия) при 4°С; колонку промывают 140 мМ ЫаС1 и элюируют при 200 мМ ЫаС1 при этом примеси (белки и ДНК) остаются адсорбированными на ионообменной смоле.
Концентрирование и ультрафильтрация с 2 мМ Ыа/К фосфатом рН 7,15 на мембране 50 кДа.
Стерилизующее фильтрование очищенного основного объема на фильтрационном картридже МННрак-20 0,2 мкм.
Пример 1б. Экспрессия пневмолизина.
Пневмококковый пневмолизин был получен и детоксифицирован, как описано в АО 2004/081515 и АО 2006/032499.
Пример 2. Получение конъюгатов.
В данной области техники хорошо известно, как получить очищенные пневмококковые полисахариды. Для целей данных примеров полисахариды были получены, по существу, как описано в ЕР 072513, или с помощью близко подобных способов. Перед конъюгацией полисахариды могут быть отсортированы по размеру с помощью микрофлюидизации, как описано ниже.
Условия активации и сочетания специфичны для каждого полисахарида. Они приведены в табл. 1. Полисахарид определенного размера (за исключением Р85, 6В и 23Е) растворяли в ЫаС1 2 М, ЫаС1 0,2 М или в воде для инъекций (ВДИ). Оптимальную концентрацию полисахарида оценивали для всех серотипов. Все серотипы, за исключением серотипа 18С, конъюгировали непосредственно с белком-носителем, как подробно описано ниже. Было получено два альтернативных конъюгата серотипа 22Е; один конъюгировали непосредственно, один через линкер ΆΌΗ.
Из исходного раствора 100 мг/мл в ацетонитриле или в растворе ацетонитрил/вода 50%/50% добавляли СЭАР (соотношение СЭАР/Р8 0,5-1,5 мг/мг Р8) к раствору полисахарида. Спустя 1,5 мин добавляли 0,2 М-0,3 М ЫаОН для получения специфичного рН активации. Активацию полисахарида осуществляли при данном значении рН в течение 3 мин при 25°С. Очищенный белок (белок Ό, РНГО, пневмолизин или ΌΤ) (количество зависит от исходного соотношения Р8/белок-носитель) добавляли к активированному полисахариду и проводили реакцию сочетания при специфичном рН в течение времени вплоть до 2 ч (в зависимости из серотипа) при регулировании рН. Затем к смеси с целью гашения непрореагировавших групп эфира цианата добавляли 2 М раствор глицина. Доводили рН до рН гашения (рН 9,0). Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25°С, а затем в течение ночи при 2-8°С при непрерывном медленном перемешивании.
Получение 18С.
18С сшивали с белком-носителем через линкер, представляющий собой дигидразид адипиновой кислоты (АЭН).
Полисахарид серотипа 18С подвергали микрофлюидизации перед конъюгацией.
Получение производного столбнячного анатоксина с ЕЭАС.
- 24 020817
Для получения производного столбнячного анатоксина очищенный ТТ разводили при 25 мг/мл в 0,2 М Ν;·ιΟ и добавляли спейсер АЭН до достижения конечной концентрации 0,2 М. Когда растворение спейсера было полным, рН доводили до 6,2. Затем добавляли ЕЭАС (1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимид) до достижения конечной концентрации 0,02 М, и смесь перемешивали в течение 1 ч при регулировании рН. Реакцию конденсации останавливали путем повышения рН вплоть до 9,0 в течение по меньшей мере 30 мин при 25°С.
Затем производное ТТ подвергали диафильтрации (10 кДа мембрана СО) с целью удаления остаточного реагента АЭН и ЕЭАС.
Наконец, общий объем ТТАН стерильно фильтровали до стадии сочетания и хранили при -70°С.
Химическое сочетание ТТАН с Р8 18С.
Подробности параметров конъюгации можно найти в табл. 1.
г микрофлюидизированного Р8 разводили при определенной концентрации в воде и доводили до 2 М Ν;·ιΟ добавлением порошка №С1.
Раствор СПАР (100 мг/мл свежеприготовленного раствора в ацетонитриле/ВДИ 50/50 об./об.) добавляли до достижения соответствующего соотношения СЭАР/Р8.
Значение рН повышали до рН активации 9,0 добавлением 0,3 М №ЮН и стабилизировали при данном рН до добавления ТТАН.
Через 3 мин добавляли производное ТТАН (20 мг/мл в 0,2 М №С1) до достижения соотношения ТТан/Р8 2; рН регулировали до достижения рН сочетания 9,0. Раствор оставляли на один час при регулировании рН.
Для гашения к смеси Р8/ТТЛН/СЭАР добавляли 2 М раствор глицина.
Доводили рН до рН гашения (рН 9,0).
Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25°С, а затем оставляли на ночь при 2-8°С при непрерывном медленном перемешивании.
Конъюгат Р822Ран-РЫО.
При втором способе конъюгации для данного сахарида (где первый представляет собой прямой способ конъюгации Р822-РЫО, показанный в табл. 1) 22Р сшивали с белком-носителем через линкер дигидразид адипиновой кислоты (АЭН). Полисахарид серотипа 22Р подвергали микрофлюидизации перед конъюгацией.
Получение производного Р8 22Р.
Активацию и сочетание проводили при 25°С при непрерывном перемешивании в водяной бане с регулируемой температурой.
Микрофлюидизированный Р822Р разводили до получения конечной концентрации Р8 6 мг/мл в 0,2 М Ν;·ιΟ и раствор доводили до рН 6,05±0,2 0,1н. НС1.
Раствор СПАР (100 мг/мл свежеприготовленного раствора в ацетонитриле/ВДИ 50/50 об./об.) добавляли до достижения соответствующего соотношения СЭАР/Р8 (1,5/1 мас./мас.).
Значение рН повышали до рН активации рН 9,00±0,05 добавлением 0,5 М №ЮН и стабилизировали при данном рН до добавления АЭН.
Через 3 мин добавляли АЭН до достижения соответствующего соотношения АЭН/Р8 (8,9/1 мас./мас.); рН регулировали до рН сочетания 9,0. Раствор оставляли на 1 ч при регулировании рН.
Производное Р8АН концентрировали и подвергали диафильтрации.
Сочетание.
РЫО при 10 мг/мл в 0,2 М Ν;·ιΟ добавляли к производному Р822ЕАН до достижения соотношения РЫО/Р822Ран 4/1 (мас./мас.). рН доводили до 5,0±0,05 НС1. Раствор ЕЭАС (20 мг/мл в 0,1 М Трис-НС1 рН 7,5) добавляли вручную за 10 мин (250 мкл/мин) до достижения 1 мг ЕЭАС/мг Р822ЕАН. Полученный в результате раствор инкубировали в течение 150 мин (хотя также использовали 60 мин) при 25°С при перемешивании и регулировании рН. Раствор нейтрализовали добавлением 1 М Трис-НС1 рН 7,5 (1/10 конечного объема) и оставляли на 30 мин при 25°С.
Перед элюированием на 8ерЬасгу1 8400НК конъюгат осветляли, используя 5 мкм фильтр МшкагЕ
Полученный в результате конъюгат имел конечное соотношение РЫФ/Р8 4:1 (мас./мас.), содержание свободного Р8 ниже 1% и антигенность (а-Р8/а-Р8) 36,3% и антигенность анти-РЬЮ 7,4%. Соотношение белка и полисахарида измеряли, используя метод Лоури и резорциновый метод, и антигенность определяли, используя сэндвич-Еи8А.
Очистка конъюгатов.
Конъюгаты очищали с помощью гель-фильтрации, используя колонку для гель-фильтрации 8ерЫасгу1 8400НК, уравновешенную 0,15 М Ν;·ιΟ (8500НК для 18С) для удаления небольших молекул (включая ОМАР) и неконъюгированного Р8 и белка. На основе различных молекулярных размеров компонентов реакции конъюгаты Р8-РЭ, Р8-ТТ, Р8-РЬФ, Р8-пневмолизин или Р8-ЭТ элюируют первыми, затем элюируют свободные Р8, затем свободный РЭ или свободный ОТ и, наконец, ОМАР и другие соли (№С1, глицин).
Фракции, содержащие конъюгаты, обнаруживают с помощью УФ280 нм. Фракции объединяют в со- 25 020817 ответствии с их Κά, стерильно фильтруют (0,22 мкм) и хранят при 2-8°С. Были определены соотношения РЗ/белок в препаратах конъюгатов.
Специфичные условия активации/сочетания/гашения конъюгатов РЗ З. рпеитотае-белок П/ТТ/ПТ/РНЮ/Р1\.
Где в ряду заголовка встречается цфлюид, это указывает на то, что сахарид был отсортирован по размеру с помощью микрофлюидизации перед конъюгацией. Размеры сахаридов после микрофлюидизации приведены в табл. 2.
Таблица 1
Специфичные условия активации/сочетания/гашения конъюгатов РЗ З. рпеитотае-белок □/Р'Р/П'Р/РНЮ/Р1\
Серотип 1 рфлюид 4 рфлюид 5 6А 6В 7Р рфлюид
Концентрация Р5 (мг/мл) 2,5 2,5 7,1 5,0 5,0 5,0
Растворение Р5 ВДИ вди ВДИ ЫаС1 2М ЫаС12М ΝβΟ 2М
Концентрация Ρϋ (мг/мл) 10,0 10,0 5,0 5,0 5,0 10,0
Исходное соотношение Ρϋ/Ρ8 (масс/масс) 1,5/1 1,5/1 1/1 1/1 1,1/1 1,2/1
Концентрация СОАР (мг/мг РЗ) 0,50 0,50 0,79 0,83 0,83 0,75
рН,=рНе=рН, 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0
Серотип 9ν рфлюид и рфлюид 18С рфлюид 19А рфлюид 19Р рфлюид 22Р рфлюид 23Р
Концентрация РЗ (мг/мл) 5,0 5,0 4,5 15,0 9,0 6,0 2,38
Растворение РЗ №С1 2М ЫаС! 2М №С1 2М №С1 2М №С1 2М ЫаС1 0,2М №С| 2М
Концентрация белканосителя (мг/мл) 10,0 10,0 20,0 (ТТ) 10,0 (Р!у) 20,0 (ОТ) 10,0 (РГЮ) 5,0
Исходное отношение белок- носитель/ РЗ (масс/масс) 1,2/1 1,2/1 2/1 2,5/1 1,5/1 3/1 1/1
Концентрация СОАР (мг/мг РЗ) 0,50 0,75 0,75 1,5 1,5 1,5 0,79
рН,=рНс=рН, 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Примечание: рН а, с, г соответствует рН для активации, сочетания и гашения соответственно.
Характеристика.
Каждый конъюгат был охарактеризован и соответствовал параметрам, описанным в табл. 2. Содержание полисахарида (мкг/мл) измеряли с помощью резорцинового теста, а содержание белка (мкг/мл) методом Лоури. Конечное соотношение РЗ/РЭ (мас./мас.) определено на основании соотношения концентраций.
Содержание свободного полисахарида (%).
Содержание свободного полисахарида конъюгатов, которые держали при 4°С или хранили в течение 7 суток при 37°С, определяли на надосадочной жидкости, полученной после инкубации с аантителами к белку-носителю и насыщенным сульфатом аммония с последующим центрифугированием.
Метод ЕЫЗА α-РЗ/а-РЗ использовали для количественного определения свободного полисахарида в надосадочной жидкости. Отсутствие конъюгата также контролировали с помощью ЕЫЗА а-белокноситель/а-РЗ.
Антигенность.
Антигенность на тех же конъюгатах анализировали в ЕЫЗА сэндвич-типа, где иммобилизованное и
- 26 020817 определяющее антитела представляли собой а-Р8 и α-белок соответственно.
- 27 020817
Содержание свободного белка (%).
Неконъюгированный белок-носитель может быть отделен от конъюгата во время стадии очистки. Содержание свободного остаточного белка определяли, используя эксклюзионную хроматографию размеров (Т8К 5000-РАХЬ) с последующим УФ-обнаружением (214 нм). Условия элюирования давали возможность разделения свободного белка-носителя и конъюгата. Затем определяли содержание свободного белка в общих объемах конъюгатов против калибровочной кривой (от 0 до 50 мкг/мл белканосителя). Свободный белок-носитель в % был получен, как описано ниже:
% свободного носителя = (свободный носитель (мкг/мл)/(суммарная концентрация соответствующего белка-носителя, измеренная по Лоури (мкг/мл) х 100%).
Стабильность.
Распределение молекулярной массы (Ка0 и стабильность определяли на гель-фильтрации ВЭЖХЭХР (Т8К 5000-РАХЬ) для конъюгатов, которые держали при 4°С или хранили в течение 7 суток при 37°С.
10/11/13/14-Валентная характеристика приведена в табл. 2 (см. примечание под таблицей).
Белковые конъюгаты можно адсорбировать на фосфате алюминия и объединять с получением конечной вакцины.
Таблица 2
Характеристики конъюгатов
Конъюгаты Размер Р5 (Да х103) Отношение носитель/Рб Своб. РЗ (ЕиЗА) Своб» носитель Антигенность РЗ (Е1Л5А) Размер конъюгата (кДа>
Р31-Р0 349-382* 1,5-1,6 1,0%-1,2% 3,9%-4,8% 87%-95% 1499- 1715
Р34-РЭ 93-100* 1,5-1,6 4,7-6,5% 3,2%-4,0% 90%-96% 1303- 1606
Ρ35-Ρϋ* 367-443 0,80 8,7-11,2% 2,2%-3,8% 93%-108% 1998- 2352
РЗбА-Ρϋ 1100-1540 0,61 4,5% н/о 45,9% н/о
Р36В- Р0*** 1069-1391 0,7-0,8 1,3-1,6% <2,0% 68%-75% 4778- 5235
Р37Р-Р0 255-264* 1,1-1,2 <1% <1,4% 58% 3907- 4452
Ρ39ν-Ρϋ 258-280* 1,3-1,5 <1% <1,3% 67%-69% 9073- 9572
Р314-Р0 232-241* 1,4 <1% <1,5% 70% 3430- 3779
Р518С-ГГ' 89-97* 2,2-2,4 1,5-2,2% <4% 46%-56% 5464- 6133
Р319А- Р1у* 151 3,2 <1% 29%
Ρ319ΡΌΤ 133-143* 1,4-1,5 4,1%-5,9% <1.2%- <1,3% 82%-88% 2059- 2335
Р522Р- РЬЮ* 159-167 2,17 5,8 н/о 37% н/о
Р322Р-АНРНЮ*159-167 3,66-4,34 <1% н/о 28-31% н/о
Р523Р- 914-980 0,5 1,4-1,9% 3,7%-4,9% 137%-154% 2933- 3152
* Размер Р8 после микрофлюидизации нативного Р8.
*** полисахарид, не отсортированный по размеру. н/о - не определяли.
10-Валентная вакцина была получена путем смешивания конъюгатов серотипа 1, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р (например, при дозе 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1 мкг сахарида, соответственно, на дозу для человека). 11-Валентная вакцина была получена путем дополнительного добавления конъюгата серотипа 3 из табл. 5 (например, при 1 мкг сахарида на дозу для человека). 13-Валентная вакцина была получена путем дополнительного добавления вышеописанных конъюгатов серотипов 19А и 22Р (где 22Р либо непосредственно сшит с РЬФ, либо альтернативно через линкер ΆΌΗ) [например, при дозе 3 мкг каждого из сахаридов на дозу для человека]. 14-Валентную вакцину можно было получить путем дополнительного добавления вышеописанного конъюгата серотипа 6А [например, при дозе 1 мкг сахарида на дозу для человека].
Пример 3. Данные, свидетельствующие о том, что включение белка Ό НаеторЫ1ик тЛиеп/ае в иммуногенную композицию по изобретению может обеспечить улучшенную защиту против острого среднего отита (ОСО).
Схема исследования.
В исследовании использовали вакцину 11Рп-РЭ, содержащую серотипы 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р, каждый конъюгированный с белком Ό от Н. тЛиеп/ае (ссылка на табл. 5 в примере 4). Субъектов рандомизировали на две группы для получения вакцины 11 Рп-РЭ или Натпх в возрасте при- 28 020817 мерно 3, 4, 5 и 12-15 месяцев. Все субъекты получали сопутствующую вакцину О8К ВЫощсаШ 1иГаппхНеха (ПТРа-НВУ-1РУ/Н1Ь) в возрасте 3, 4 и 5 месяцев. 1пГапп.х-Неха представляет собой комбинацию РеШап.х и ШЬ, смешанных перед введением. Наблюдение для анализа эффективности в соответствии с протоколом начинали через 2 недели после введения третьей дозы вакцины и продолжали до возраста 24-27 месяцев. Носоглоточное носительство 8. рпеитотае и Н. тЛиеп/ае оценивали в выбранной подгруппе субъектов.
Родителям советовали проконсультироваться с исследователем, если их ребенок был болен, страдал ушной болью, спонтанной перфорацией барабанной перепонки или спонтанными выделениями из уха. Если исследователь подозревал эпизод ОСО, ребенка немедленно посылали к специалисту ухо-горло-нос (ЛОР) для подтверждения диагноза.
Клинический диагноз ОСО был основан либо на внешнем виде барабанной перепонки (т.е. покраснения, вздутия, потери зрачковой реакции), либо на присутствии экссудата среднего уха (которое продемонстрировано с помощью простой или пневматической отоскопии или с помощью микроскопии). Кроме того, должны были присутствовать по меньшей мере два из приведенных ниже признаков или симптомов: ушная боль, выделения из уха, потеря слуха, лихорадка, вялость, раздражительность, анорексия, рвота или диарея. Если ЛОР специалист подтверждал клинический диагноз, образец жидкости среднего уха собирали с помощью тимпаноцентеза для бактериологического исследования.
Для субъектов с повторяющимися заболеваниями новый эпизод ОСО считали начавшимся, если прошло более чем 30 суток от начала предыдущего эпизода. Кроме того, эпизод ОСО считали новым бактериальным эпизодом, если изолированная бактерия/серотип отличались от предыдущего изолята, каким бы ни был интервал между двумя последовательными эпизодами.
Результаты испытания.
Было зачислено всего 4968 детей младшего возраста, 2489 в группу 11Рп-РЭ и 2479 в контрольную группу. Между двумя группами отсутствовали значительные различия в демографических характеристиках или факторах риска.
Клинические эпизоды и определение случая ОСО.
В течение протоколируемого периода наблюдения было зарегистрировано суммарно 333 эпизода клинического ОСО в группе 11Рп-РЭ и 499 в контрольной группе.
В табл. 3 представлена протективная эффективность вакцины 11Рп-РЭ и обеих 7-валентных вакцин, прежде испытанных в Финляндии (Екко1а е! а1. N Еп§1 1. Меб 2001; 344: 403-409, и Кбр1 е! а1. С1ш 1пГес1 Όίδ 2003 37:1155-64), против какого-либо эпизода ОСО и ОСО, вызванного различными серотипами пневмококка, Н. тЛиеп/ае, ΝΤΗί и М. са1аггНаЙ5.
Статистически значимое и клинически релевантное снижение на 33,6% общего бремени болезни ОСО было достигнуто при 11Рп-РЭ, независимо от этиологии (табл. 3).
Общая эффективность против эпизодов ОСО вследствие любого из 11 серотипов пневмококка, содержащегося в вакцине ИРп-РЭ, составляла 57,6% (табл. 3).
Другим важным открытием в настоящем исследовании является 35,6% защита, обеспечиваемая вакциной 11Рп-РЭ против ОСО, вызванного Н. тЛиеп/ае (и конкретно 35,3% защиты, обеспечиваемой ΝΤΗί). Это открытие имеет большое клиническое значение с учетом возросшей значимости Н. тЛиеп/ае как основного возбудителя ОСО в эру пневмококковых конъюгатных вакцин. Параллельно с защитой, обеспечиваемой против ОСО, вакцина 11Рп-РЭ также снижала носоглоточное носительство Н. тЛиеп/ае после бустер-дозы на втором году жизни. Эти открытия противоречат предшествующим наблюдениям в Финляндии, где для обеих 7-валентных пневмококковых конъюгатных вакцин наблюдали увеличение числа эпизодов ОСО вследствие Н. тЛиеп/ае (Екко1а е! а1. и Кбр1 е! а1.) как свидетельство этиологического замещения.
Четкую корреляцию между защитой против эпизодов ОСО вследствие Ηί и уровнями антител против белка-носителя Ό невозможно было установить, поскольку концентрации антител анти-РЭ 1дС после примирования у вакцинированных 11Рп-РЭ, у которых не было эпизодов Ηί ОСО, были, по существу, такими же, как уровни антител анти-РЭ 1дС после примирования, измеренные у вакцинированных 11РпРЭ, у которых развивался по меньшей мере один эпизод Ηί ОСО в течение периода наблюдения эффективности. Однако, хотя невозможно было установить корреляцию между биологическим воздействием вакцины и иммуногенностью 1§О анти-РЭ после примирования, разумно предположить, что белокноситель РЭ, который является высококонсервативным среди штаммов Н. 1пЛнеп/ае, в значительной степени внес вклад в индукцию защиты против Ηί.
Эффект на заболевание ОСО сопровождался эффектом на носоглоточное носительство, который имел сходную величину для вакцины серотипов пневмококка и Н. тЛиеп/ае (фиг. 1). Это снижение носоглоточного носительства Н. тЛиеп/ае у вакцинированных РЭ-конъюгатами подтверждает гипотезу о прямом протективном эффекте РЭ-конъюгатной вакцины против Н. тЛиеп/ае, даже если отсутствует корреляция протективной эффективности и иммунных ответов анти-РЭ 1дС, которые измерены с помощью ЕЫ8А.
В следующем эксперименте была использована модель среднего отита шиншилл с сывороточными пулами от детей младшего возраста, иммунизированных 11-валентным препаратом данного примера или
- 29 020817
10-валентной вакциной примера 2 (см. также табл. 1 и 2 и примечания под ними). Оба пула индуцируют значимое снижение процента животных со средним отитом по сравнению с сывороточным пулом до иммунизации. Отсутствует значимое различие между иммунными пулами 10- и 11-валентной вакцины. Это показывает, что обе вакцины обладают сходным потенциалом индукции защиты против среднего отита, вызванного нетипируемыми Н. тЛиеп/ае в данной модели.
Таблица 3
Тип эпизода ОСО 11РП-РО -РгеупагвПпОМ|““иич- 7ν-ΟΜΡ в ПпОМ ”'1'***’
η УЕ η УЕ η УЕ
11Рп- РЦ Кон- троль % 95% ДИ 7ν- СРМ Кон- троль % 95% ДИ 7ч- ОМР Кон- троль % 95% ДИ
и. иь и. иь IX иь
N 2455 2452 786 794 805 794
Любой ОСО 333 499 33,6 20,8 44,3 1251 1345 6 -4 16 1364 1345 -1 12 10
Любой ОСО С ЖСУ 322 474 32,4 19,0 43,6 1177 1267 7 -5 17 1279 1267 0 12 10
Пневмококк, подтвержденный в культуре 92 169 51,5 36,8 62,9 271 414 34 21 45 314 414 25 11 37
Пневмококковые серотипы вакцины^ 60 141 57,6 41,4 69,3 107 250 57 44 67 110 250 56 44 66
Другие бактериальные патогены
Н, /лЯиепгае 44 58 35,6 3,8 57,0 315 287 11 34 8 315 287 -9 32 10
Нетипируемые Н. тЛиетае (ΝΤΗί) 41 63 35,3 1,8 57,4 НП НП НП НП НП НП НП N0 НП НП
М. сзГзлдга//® 31 34 9,4 52,5 46,1 379 381 -1 19 15 444 381 16 36 2
НП = не опубликовано; N = число субъектов в когорте эффективности ССП (в соответствии с протоколом); п =число эпизодов; * Пневмококковые серотипы вакцины: для 11Рп-РИ =11 серотипов, для Ртеупат и 7у-ОМР = 7 серотипов; ЖСУ = жидкость среднего уха.
Пример 4. Выбор белка-носителя для серотипа 19Р.
Используемый анализ ЕЫ8А.
Способ ЕЫ8А ингибирования 22Р, по существу, был основан на анализе, предложенном в 2001 г. Сопсерсюп и РгаксЬ и был опубликован НепскаетЫ е1 а1., 2006, С.’1ииса1 апЛ Уассше 1ттипо1оду 13:356360. Кратко, очищенные пневмококковые полисахариды смешивали с метилированным человеческим сывороточным альбумином и адсорбировали на микротитрационных планшетах высокого связывания №.шс Мах18отр™ (КоккЛЛе, ИК) в течение ночи при 4°С. Планшеты блокировали 10% фетальной бычьей сывороткой (ФБС) в ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор) в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании. Образцы сыворотки разводили в ЗФР, содержащем 10% ФБС, 10 мкг/мл полисахарида клеточной стенки (ПКС) и 2 мкг/мл пневмококкового полисахарида серотипа 22Р (АТСС) и дополнительно разводили на микротитрационных планшетах тем же буфером. Внутренний стандарт, калиброванный против стандартной сыворотки 89-8Р, используя концентрации серотипического 1дО в 89-8Р, обрабатывали таким же путем и включали на каждый планшет. После отмывки связанные антитела обнаруживали, используя антитело против человеческого 1дО, конъюгированное с пероксидазой (81га1есН 8с1епЛПс ИЛ., 8оЬат, ИК), разведенное в 10% ФБС (в ЗФР), и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании. Окрашивание проявляли, используя готовый к употреблению однокомпонентный набор для иммунологического анализа, содержащий субстрат фермента пероксидазы тетраметилбензидин (ВюКаЛ, Негси1е8, СА, И8), в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали Н28О4 0,18 М и оптическую плотность считывали при 450 нм. Концентрации серотипического 1дО (в мкг/мл) в образцах вычисляли путем соотнесения точек оптической плотности с определенными пределами для кривой внутреннего стандарта сыворотки на основе модели 4параметрического логарифмического уравнения, вычисленного программой 8ойМах Рго™ (Мо1еси1аг Иеу1се8, 8иппууа1е, СА). Порог отсечения для ЕЬ18А составлял 0,05 мкг/мл 1дО для всех серотипов с учетом предела обнаружения и предела количественного определения.
Опсонофагоцитарный анализ.
На консультационном совещании ВОЗ в июне 2003 было рекомендовано использование анализа ОФА, как изложено в Котего-81ешег е1 а1. СПп И1адп ЬаЬ 1ттипо1 2003 10 (6): р. 1019-0214. Данный протокол использовали для тестирования активности ОФА серотипов в приведенных ниже тестах.
Получение конъюгатов.
В исследования 11Рп-РИ&ИК001 и 11Рп-РИ&И1-007 было включено три 11-валентных вакцинных препарата (табл. 4), в которых 3 мкг полисахарида 19Р было конъюгировано с дифтерийным анатоксином (19Р-ИТ), вместо 1 мкг полисахарида, конъюгированного с белком И (19Р-РИ). Параметры конъюгации для исследования 11Рп-РИ, 11 Рп-РИ&И1-001 и 11 Рп-РИ&И1-007 раскрыты в табл. 5, 6 и 7 соответственно.
Ответы антипневмококковых антител и активность ОФА против серотипа 19Р через один месяц после первичной вакцинации этими препаратами 19Р-ИТ показаны в табл. 8 и 9 соответственно. В табл. 10 показаны концентрации антител 22Р-ЕЬ18А и проценты субъектов, достигших порога 0,2 мкг/мл до и
- 30 020817 после бустер-вакцинации 23-валентными несмешанными полисахаридами.
Было показано, что опсонофагоцитарная активность явно улучшена для антител, индуцированных этими препаратами 19Р-ЭТ, что продемонстрировано на основании более высоких показателей серопозитивности (опсонофагоцитарные титры > 1:8) и ОФА ГЗТ (геометрического значения титров) через один месяц после первичной вакцинации (табл. 9). Через один месяц после бустер-вакцинации 23валентными несмешанными полисахаридами опсонофагоцитарная активность антител 19Р оставалась значительно лучшей для детей, примированных препаратами 19Р-ЭТ (табл. 11).
В табл. 12 представлены данные иммуногенности после бустер-дозы 11Рп-РЭ у детей ясельного возраста, предварительно примированных конъюгатами 19Р-ЭТ или 19Р-РЭ, по сравнению с 4й последовательной дозой Ртеупат®. С учетом выдающихся случаев, сообщенных после введения Ргеуиаг® в США, улучшенная опсонофагоцитарная активность против серотипа 19Р при конъюгации с белкомносителем ОТ может иметь преимущество для вакцины-кандидата.
В табл. 13 приведены данные ЕЬб8А и ОФА для конъюгата 19Р-ЭТ в отношении перекрестнореактивного серотипа 19А. Было обнаружено, что 19Р-ЭТ индуцирует более низкую, но значительную активность ОФА против 19А.
Таблица 4
Препараты пневмококковой конъюгатной вакцины, использованные в клинических исследованиях
Препарат Пневмококковый серотип мкг/белок-носитель АГмг
1 3 4 5 6В 7Р 9ν 14 18С 19Ρ 23Ρ
НРп-Ρϋ 1/РО 1/Ρϋ 1/Ρϋ 1/РО 1/РО 1/Ρϋ 1/Ρϋ 1/ΡΟ 1/ΡΟ 1/Ρϋ 1/Ρϋ <0.8
19ΡΌΤ форма 1 3/РО 3/Ρϋ 3/РО 3/РО ю/от 3/Ρϋ 3/Ρϋ 3/ρσ 3/ΡΟ 3/ϋΤ 5/ΟΤ 2 0,35
19ΡΌΤ форма 2 3/РО 2/РО 2/РО 3/Ρϋ 5/ОТ 3/Ρϋ 2/Ρϋ 2/Ρϋ 2/ΡΟ 3/ϋΤ 5/ΟΤ 2 0,35
19ΡΌΤ форма 3 3/Ρϋ 3/РО 3/РО з/Ρϋ 3/РО 3/Ρϋ 3/Ρϋ 3/ρσ 3/Ρϋ 3/ϋΤ 3/Ρϋ = 0.5
Таблица 5
Специфичные условия активации/сочетания/гашения конъюгатов Р8 8.рпеитотае-белок Э/ТТ/ЭТ
Серотип 1 нативный 3 рфпЮИД 4 нативный 5 нативный 6В нативный 7Е нативный
Конц. Ρ8 (мг/мл) 1,5 2 2,0 7,5 5,5 3,0
Растворение РЗ ЫаС1 150 мМ №С1 2М ВДИ ВДИ ЫаС1 2М ЫаС1 2М
Конц. РО (мг/мл) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Исходное отношение Ρ3/Ρϋ (масс/масс) 1/0,7 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1
Конц. СОАР (мг/мг Р5) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
рН„=рНс=рНг 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 8,8/8,8/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0
Время сочетания 60 мин 60 мин 45 мин 40 мин 60 мин 60 мин
Серотип 9У нативный 14 нативный 18С нативный 19Р нативный 23Р нативный
Конц. Р5 (мг/мл) 1,75 2,5 1,75 4,0 2,5
Растворение Р5 ЫаС1 2М №С1 2М ννπ ИаС1 2М ЫаС1 2М
Конц. РЭ (мг/мл) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Исходное отношение Р5/Р0 (масс/масс) 1/0,75 1/0,75 1/1,2 1/1 1/1
Конц. СОАР (мг/мг РЗ) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
рНа=рНс=рНг 8,5/8,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0
Время сочетания 60 мин 60 мин 45 мин 30 мин 60 мин
Таблица 6
Специфичные условия активации/сочетания/гашения конъюгатов Р8 8. рпеитотае-белок Э/ЭТ для исследования 11Рп-РЭ&0|-001
Серотип 1 рфлюид 3 рфлюид 4 рфлюид 5 рфлюид 6В рфлюид 7Е нативный
Конц. РЗ (мг/мл) 4 2,0 2,5 7,5 10 3,0
Растворение РЗ ЫаС1 2М ЫаС1 2М ЫаС1 2М ЫаС1 2М ЫаС1 2М ΝθΟΙ 2М
Конц. РО (мг/мл) 10,0 5,0 5,0 5,0 ЫаС1 2М 20 (ОТ) ЫаС1 2М 5,0
Исходное отношение Ρ3/Ρϋ (масс/масс) 1,2/1 1/1 1/1 1/1 1,5/1 1/1
Конц. СОАР (мг/мг РЗ) 1,50 0,75 1,5 2 1,5 0,75
рНа=рНс=рНг 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9/9/9
Время сочетания 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин
- 31 020817
Серотип нативный 14 нативный 18С рфлюид 19Р цфлюид 23Р цфлюид
Конц. РЗ (мг/мл) 1,75 2,5 5,0 9,0 10
Растворение РЗ НаС! 2М ΝθΟΙ 2М ЫаС1 2М ЫаС12М №С1 2М
Конц. Ρϋ (мг/мл) 5,0 5,0 5,0 20 (ϋΤ) 10 (ϋΤ)
Исходное отношение Ρδ/Ρϋ (масс/масс) 0,75/1 0,75/1 1,2/1 1,5/1 1,5/1
Конц. СОАР (мг/мг РЗ) 0,75 0,75 1,5 1,5 0,75
рНа=рНс=рНг 8,5/8,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Время сочетания 60 мин 80 мин 30 мин 60 мин 60 мин
Таблица 7
Специфичные условия активации/сочетания/гашения конъюгатов Р8 8. рпеитотае-белок Ό/ПТ для исследования 11Рп-РО&О1-007
Серотип 1 нативный 3 цфлюид 4 нативный 5 нативный 6В нативный 7Р рфлюид
Конц. РЗ (мг/мл) 1,5 2,0 2 7,5 5,5 5,0
Растворение РЗ ЫаС1 150 ШМ №С1 2М ВДИ вди ЫаС1 2М ЫаС1 2М
Конц. Ρϋ (мг/мл) 5,0 5,0 5,0 5,0 5 10
Исходное отношение Ρ5/Ρϋ (масс/масс) 0,7/1 1/1 1 1/1 1/1 1,2/1
Конц. СОАР (мг/мг РЗ) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
рНа=рНс=рНг 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 8,8/8,8/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5,/9,5/9
Время сочетания 60 мин 60 мин 45 мин 40 мин 60 МИН 60 мин
Серотип 9У цфлюид 14 цфлюид 18С нативный 19Р цфлюид 19Р цфлюид 23Р рфлюид
Конц. РЗ (мг/мл) 5,0 5,0 1,75 9,0 10,0 9,5
Растворение РЗ 1МаС1 2М №С1 2М ννπ ЫаС1 2М ИаС1 2М №С1 2М
Конц. Ρϋ (мг/мл) 10 10,0 5,0 20 (ОТ) 5,0 (Ρϋ) 10
Исходное отношение РЗ/РО (масс/масс) 1,2/1 1,2/1 1,2/1 1,5/1 1,2/1 1/1
Конц. СОАР (мг/мг РЗ) 0,5 0,75 0,75 1,5 0,75 0,75
рНа=рНс=рНг 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,( 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Время сочетания 60 мин 60 мин 45 мин 120 мин 120 мин 60 мин
Таблица 8
Процент субъектов с концентрацией антитела 19Р >0,20 мкг/мл и средние геометрические концентрации антитела 19Р (ГМК при 95% ДИ; мкг/мл) через один месяц после первичной вакцинации 1 мкг 19Р-РЭ. 3 мкг 19Р-ЭТ или Ргеупаг (2 мкг 19Р-СКМ) (общая когорта)
Группа 11РП-РО&ОМ01 (22Ρ-ΕΙ.Ι5Α) 11РП-РО&ОЮ07 (22Р-ЕиЗА)
N %й0,20 мкг/мл (95% ДИ) ГСК (мкг/мл) (95% ДИ) N % & 0,20 мкг/мл (95% ДИ) ГСК (мкг/мл) (95% ДИ)
НРп-Ρϋ 152 98 7 (95,3-99,8) 1,93 (1,67- 2,22) 50 100 (92,9-100) 2,78 (2,31- 3,36)
19Р40Т форма 1г 146 99,3 (96,2-100) 2,88 (2,45- 3,38)
19Ρ43Τ форма 2Г 150 96,0 (91,5-98,5) 2,43 (2,01- 2,94)
19Р-0Т форма Зг 50 96,0 (86,3-99,5) 3,70 (2,58- 5,30)
Ргеупаг 148 98,6 (95,2-99,8) 2,98 (2,60- 3,41) 41 97,6 (87,1-99,9) 2,91 (2,15- 3,94)
г Композиция различных препаратов представлена в табл. 4.
- 32 020817
Таблица 9
Процент субъектов с ОФА титром 19Р >1:8 и ГЗТ ОФА 19Р через один месяц после первичной вакцинации 1 мкг 19Р-РЭ. 3 мкг 19Р-ЭТ или Ргеупаг (2 мкг 19Р-СКМ) (общая когорта)
ΙΙΡη-Ρϋ&ϋϊ-ΟΟΙ 11РП-РО&И-007
Группа N г 1:8 (95% ДИ) ГЗТ (95% ДИ) N £1:8 (95% ДИ) ГЗТ (95% ДИ)
11РП-РЭ 136 84,6 (77,4-90,2) 77,8 (58,1- 104,4) 46 95,7 (85,2-99,5) 167,8 (118,1- 238,6)
19Ρ-ϋΤ форма Т 137 95,6 (90,7-98,4) 263,2 (209,4- 330,7)
19ΚΌΤ форма 2Г 139 92,1 (86,3-96,0) 218,9 (166,5- 287,9)
19ΡΌΤ форма Зг 49 91,8 (80,4-97,7) 403,1 (225,7- 719,9)
Ргеупаг 131 86,3 (79,2-91,6) 82,6 (61,1- 111,6) 38 81,6 (65,7-92,3) 65,0 (37,7- 112.2)
г Композиция различных препаратов представлена в табл. 4.
Таблица 10
Процент субъектов с концентрацией антитела 19Р > 0,20 мкг/мл и средние геометрические концентрации антитела 19Р (мкг/мл) до и через один месяц после бустера 23-валентными несмешанными полисахаридами у детей, примированных 1 мкг 19Р-РЭ, 3 мкг 19Р-ЭТ или Ргеупаг (2 мкг 19Р-СКМ) (общая когорта)
Первичная группа 11Рп-РО&К-002 (22Р ЕЫ5А)
До бустер-вакцинации Через один месяц после 23валентного Р$ бустера
N %£0,20 мкг/мл (95% ДИ) гск (мкг/мл) (95% ДИ) N % £ 0,20 мкг/мл (95% ДИ) ГСК (мкг/мл) (95% ДИ)
11Ρη-Ρϋ 70 77,1 (65,6-86,3) 0,67 (0,45-0,98) 67 94,0 (85,4-98,3) 11,50 (7,76-17,03)
19ΡΌΤ форма 1г 68 91,2 (81,8-96,7) 0,71 (0,54-0,94) 69 98,6 (92,2-100) 14,50 (Ю,47го,07)
19ΓΌΤ форма 2Г 74 81,1 (70,3-89,3) 0,59 (0,43-0,80) 72 95,8 (88,3-99,1) 9,90 (6,74-14,54)
Ргеупаг 65 64,6 (51,8-76,1) 0,40 (0,27-0,60) 67 100 (94,6-100) 9,40 (6,95-12,71)
г Композиция различных препаратов представлена в табл. 4.
Ргеупаг (2 мкг 19Р-СКМ) (общая когорта)
Таблица 11
Процент субъектов с ОФА титром 19Р > 1:8 и ГЗТ ОФА 19Р до и через один месяц после бустера 23валентными несмешанными полисахаридами у детей, примированных 1 мкг 19Р-РЭ, 3 мкг 19Р-ЭТ или
Первичная группа 11ΡΠ-Ρ0&0Ϊ-002
До бустер-вакцинации Через один месяц после 23валентного Р5 бустера
N %£1:8 (95% ДИ) ГЗТ (95% ДИ) N %£1:8 (95% ДИ) ГЗТ (95% ДИ)
11Ρη-Ρϋ 29 27,6 (12,7-47,2) 10,9 (5,0-23,7) 26 82,1 (63,1-93,9) 408,0 (157,3- 1058,3)
19ΡΌΤ форма 1г 19 47,4 (24,4-71,1) 18,1 (7,2-45,7) 18 94,4 (72,7-99,9) 1063,8 (386,6- 2927,5)
19ΡΌΤ форма 2Г 27 33,3 (16,5-54,0) 8,5 (4,7-15,3) 28 100 (87,7-100) 957,6 (552,8- 1659,0)
Ргеупаг 24 12,5 (2,7-32,4) 8,1 (3,4-19,6) 23 Я9 А (61,2-95,0) 380,9 (133,2- 1089,5)
г Композиция различных препаратов представлена в табл. 4.
- 33 020817
Таблица 12
Процент субъектов с концентрациями антител > 0,2 мкг/мл, ОФА > 1:8 и ГСК/ГЗТ против пневмококкового 19Р через один месяц после бустера 11Рп-РЭ или Ргеупаг у детей, примированных 1 мкг 19Е-РЭ, 3 мкг 19Ρ-ΌΤ или Ргеупаг (2 мкг 19Р-СКМ) (общая когорта)
Первичная группа 11РП-РО8И-002
22Е- анализ ЕЫЗА анализ ОФА
N % 2:0,20 мкг/мл (95% ДИ) ГСК (мкг/мл) (95% ДИ) N %£1;8 (95% ДИ) гзт (95% ДИ)
НРп-Ρϋ 70 100 (94,9-100) 4,52 (3,7-5,5) 21 100 (83,9-100) 255,6 (135,5- 481,9)
19ΡΌΤ форма 1г 66 98,5 (91,8-100) 3,45 (2,8-4,3) 23 95,7 (78,1-99,9) 374,0 (192,6- 726,2)
19ΡΌΤ форма 2Г 70 98,6 (92,3-100) 3,80 (2,9-4,9) 29 96,6 (82,2-99,9) 249,1 (144,7- 428,7)
Рю/паг 69 97,1 (89,9-99,6) 2,56 (2,0-3,3) 31 96,8 (83,3-99,9) 528,7 (319,4- 875,2)
г Композиция различных препаратов представлена в табл. 4.
Таблица 13
Процент субъектов с концентрациями антител > 0,2 мкг/мл, ОФА > 1:8 и ГСК/ГЗТ против пневмококкового 19А через один месяц после первичной вакцинации 1 мкг 19Р-Р0, 3 мкг 19Ρ-ΌΤ или Ргеупаг (2 мкг 19Р-СКМ) (общая когорта)
Группа ПРп-РМИ-ОО!
22Р- анализ ЕЫЗА анализ ОФА
N % 2:0.20 мкг/мл (95% ДИ) ГСК (рд/тЦ (95% ДИ) N %а1:8 (95% ДИ) ГЗТ (95% ДИ)
ΠΡη-Ρϋ 45 од о (16.4-44.3) 0.09 (0.07- 0.11) 52 7.7 (2.1-18.5) 5.2 (4.0-6.8)
19ΡΌΤ форма 2Г 51 29.4 (17.5-43.8) 0,11 (0.08- 0.16) 59 27.1 (16.4-40.3) 12.4 (7.6-20.3)
Ргеупаг 55 18.2 (9.1-30.9) 0.10 (0.08- 0.12) 61 3.3 (0.4-11.3) 4.6 (3.8-5.6)
г Композиция различных препаратов представлена в табл. 4.
Пример 5. Эксперименты с адъювантом в доклинических моделях: влияние на иммуногенность пневмококковых 11-валентных полисахаридных конъюгатов у пожилых макак-резусов.
Для оптимизации ответа, вызванного на конъюгатные пневмококковые вакцины у пожилого населения, фирмой С8К изготовлен препарат 11-валентной полисахаридной (Р8) конъюгатной вакцины с новым адъювантом, адъювантом С, см. ниже.
Группы из 5 пожилых макак-резусов (в возрасте от 14 до 28 лет) иммунизировали внутримышечно (1М) на сутки 0 и 28 500 мкл либо 11-валентных Р8 конъюгатов, адсорбированных на 315 мкг А1РО4, либо 11-валентных Р8 конъюгатов, смешанных с адъювантом С.
В обоих вакцинных препаратах каждый из 11-валентных Р8 конъюгатов состоял из приведенных ниже конъюгатов Р81-РП, Р83-РП, Р84-РП, Р85-РП, Р87Р-РО, Р89У-РО, Р814-РП, Р818С-РП, Р819Р-РП, Р823Р-ЭТ и Р86В-ЭТ. Вакцину применяли в дозе, составляющей 1/5 дозы вакцины для человека (5 мкг каждого сахарида на дозу для человека за исключением 6В [10 мкг]), конъюгированную в соответствии с условиями табл. 6 (пример 4), за исключением того, что 19Р был получен согласно приведенным ниже условиям способа СЭАР: сахарид, отсортированный по размеру, при 9 мг/мл, РО при 5 мг/мл, исходное отношение РЭ/Р8 1,2/1, концентрация СЭАР 0,75 мг/мг Р8, рНа=рНс=рНг 9,0/9,0/9,0 и время сочетания 60 мин.
Уровни анти-Р8 1§С по ЕЬ18А и опсонофагоцитарные титры дозировали в сыворотке, собранной на сутки 42. Частоты В-клеток памяти анти-Р83 измеряли с помощью ЕНзро! (твердофазного иммуноферментного спот-анализа) из клеток периферической крови, собранной на сутки 42.
Согласно результатам, представленным здесь ниже, адъювант С значительно улучшал иммуногенность 11-валентных Р8 конъюгатов по сравнению с конъюгатами с А1РО4 у пожилых макак. Этот новый адъювант усиливал ответы 1§С на Р8 (фиг. 1) и опсонофагоцитарные титры антитела (табл. 14). Также имеются данные, подтверждающие, что частота Р83-специфичных В-клеток памяти повышается в результате применения адъюванта С (фиг. 2).
- 34 020817
Таблица 14
Иммуногенность конъюгатов у пожилых макак-резусов (опсонофагоцитарные титры пост-11)
Р5 1 Р53 Р5 4 Р5 5 Р5б В Р57Р Р5 91/ Р51 4 Р3)8 С Р519 Р Р523 Р
11- доиммунный <8 5 <8 5 <8 16 <8 <8 <8 <8 <8
вален сутки 14 8 181 64 49 64 4096 42 37 169 64 <64
тный пост II
А1РО4
11- доиммунный 5 9 <8 5 8 37 <8 <8 <8 <8 <8
вален сутки 14 776 1351 891 676 6208 16384 111 161 7132 2048 <64
тный пост II
Αΰί-с
ЕПкро! В-клеток.
Принцип анализа основан на том факте, что В-клеток памяти созревают в плазматические клетки ш νίίΐΌ после культивирования с СрС в течение 5 суток. Образовавшиеся ш νίΙΐΌ антигенспецифические плазматические клетки можно легко обнаружить и, следовательно, подсчитать, используя ЕПкро! (твердофазный иммуноферментный спот-анализ) анализ В-клеток. Число специфичных плазматических клеток отражает частоту В-клеток памяти в начале культивирования.
Кратко, образовавшиеся ш νίΙΐΌ плазматические клетки инкубируют в культуральных чашках, покрытых антигеном. Антигенспецифические плазматические клетки образуют пятна антитело/антиген, которые обнаруживают с помощью общепринятого иммуноферментного метода и подсчитывают как Вклетки памяти.
В настоящем исследовании с целью покрытия культуральных чашек использованы полисахариды, чтобы подсчитать относительное количество В-клеток памяти. Результаты выражены в виде частоты Р8специфичных В-клеток памяти на миллион В-клеток памяти.
Исследование показывает, что адъювант С может быть способен уменьшить известную проблему бустерной способности Р83 (см. 51П 1п1егп;Цюпа1 8утро8шт оп Рпеитососш апД Рпеитососса1 О|5еа5е5, Арп1 2-6 2006, АПсе 8ргшд5, Сеп!га1 АикЧаНа).
Специфичности иммунных ответов против пневмококкового конъюгата серотипа 3. (8сЬиегтап Ь, Ргути1а К, Роо1тап 1. АЬкйас! Ьоок р. 245, РО10.06).
Пример 6. Эффективность детоксифицированного пневмолизина (ДР1у) в качестве белка-носителя для усиления иммуногенности Р8 19Р у молодых мышей Ва1Ь/с.
Группы из 40 самок мышей Ва1Ь/с (4-недельного возраста) иммунизировали 1М на сутки 0, 14 и 28 50 мкл либо 4-валентных несмешанных Р8, либо 4-валентных ДР1у-конъюгированных Р8, в обоих случаях смешанных с адъювантом С.
Оба вакцинных препарата состояли из 0,1 мкг (количество сахарида) каждого из приведенных ниже Р8: Р88, Р812Е, Р819Р и Р822Р.
Уровни анти-Р8 1дС по ЕЬ18А дозировали в сыворотках, собранных на сутки 42.
Ответ анти-Р819Р, показанный в качестве примера на фиг. 3, был значительно усилен у мышей, получавших 4-валентные ДР1у конъюгаты, по сравнению с мышами, иммунизированными несмешанными Р8. Такое же улучшение наблюдали для ответов анти-Р88, 12Р и 22Р 1дС (данные не представлены).
Пример 7. Эффективность пневмококкового белка Ό семейства гистидиновых триад (РПЮ) в качестве белка-носителя для усиления иммуногенности Р8 22Р у молодых мышей Ва1Ь/с.
Группы из 40 самок мышей Ва1Ь/с (4-недельного возраста) иммунизировали 1М на сутки 0, 14 и 28 50 мкл либо 4-валентных несмешанных Р8, либо 4-валентных РПГО-конъюгированных Р8, в обоих случаях смешанных с адъювантом С.
Оба вакцинных препарата состояли из 0,1 мкг (количество сахарида) каждого из приведенных ниже Р8: Р88, Р812Е, Р819Р и Р822Р.
Уровни анти-Р8 1дС по ЕЬ18А дозировали в сыворотках, собранных на сутки 42.
Ответ анти-Р822Р, показанный в качестве примера на фиг. 4, был значительно усилен у мышей, получавших 4-валентные ДР1у конъюгаты, по сравнению с мышами, иммунизированными несмешанными Р8. Такое же улучшение наблюдали для ответов анти-Р88, 12Р и 22Р 1дС (данные не представлены).
Пример 8. Иммуногенность у пожилых мышей С57В1 13-валентных Р8 конъюгатов, содержащих 19А-ДР1у и 22Р-РЫП.
Группы из 30 пожилых мышей С57В1 (>69-недельного возраста) иммунизировали 1М на сутки 0, 14 и 28 50 мкл либо 11-валентных Р8 конъюгатов, либо 13-валентных Р8 конъюгатов, в обоих случаях смешанных с адъювантом С (см. ниже).
11-Валентный вакцинный препарат состоял из 0,1 мкг сахарида каждого из приведенных ниже конъюгатов: Р81-РП, Р83-РП, Р84-РП, Р85-РП, Р86В-РР, Р87Р-РР, Р89У-РЭ, Р814-РП, Р818С-ТТ, Р819Р-ЭТ и Р823Е-РЭ (см. табл. 1 и примечание к 11-валентной вакцине, обсуждаемой под табл. 2). 13Валентный вакцинный препарат содержал дополнительно 0,1 мкг конъюгатов Р819А-ДР1у и Р822Е-РП1Э (см. табл. 1 и примечание к 13-валентной вакцине, обсуждаемой под табл. 2 [используя непосредственно конъюгированный 22Е]). В группе 2 и 4 носитель пневмолизин был детоксифицирован обработкой
- 35 020817
СМВ8, в группе 3 и 5 это осуществляли с помощью формальдегида (способы, описанные в \УО 04/81515). В группах 2 и 3 РЬ1Б использовали для конъюгации Р822Р, в группах 4 и 5 использовали слитую конструкцию РЫБ_Е (конструкцию УР147 из \УО 03/054007). В группе 6 19А был конъюгирован с дифтерийным анатоксином, а 22Р с белком Б.
Уровни анти-Р819А и 22Р 1§С по ЕЬ18А оценивали в индивидуальных сыворотках, собранных на сутки 42, используя приведенную ниже методику. Ответ 1§С ЕЬ18А, полученный с другими Р8, измеряли в объединенных сыворотках.
Методики серологии мышей.
Уровни анти-Р819А 1§С по ЕЬ18А оценивали в сыворотках, собранных на сутки 42, используя методику, описанную ниже.
Микропланшеты покрывали в течение 2 ч при 37°С очищенным пневмококковым Р8 типа 19А (10 мкг/мл) в буфере ЗФР. Планшеты промывали 4 раза №С1 0,9% мМ-Твин 20 0,05%. Сыворотки инкубировали в течение 1 ч при 37°С с 50 мкг/мл СР8 (об./об.) в ЗФР 0,05% Твин 20. Сыворотки добавляли в лунки микропланшета и серийно разводили (стадия двукратного разведения) в ЗФР-БСА 0,05% Твин 0,05%. Планшеты инкубировали при встряхивании в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшеты промывали, как описано выше, и добавляли конъюгат 1§С против мыши - пероксидаза (разведенный 1/2500) и планшеты инкубировали в течение 30 мин при КТ. После отмывки в каждую лунку добавляли субстрат (4 мг ОРБА в 10 мл цитрата 0,1 М рН 4,5 и 5 мкл Н2О2) на 15 мин. Реакцию останавливали добавлением НС1 1н. Поглощение считывали при 490-620 нм, используя спектрофотометр. Проявленное окрашивание прямо пропорционально количеству антитела, присутствующего в сыворотке.
Уровень анти-Р819А 1§С, присутствующего в образцах сывороток, определяют путем сравнения со стандартной кривой и выражают в мкг/мл. Стандартную кривую строили для каждого планшета на основании результатов ЕЬ18А для известного количества добавленной сыворотки.
Уровни-Р822Р 1§С по ЕЬ18А оценивали в сыворотках, собранных на сутки 42, используя методику, описанную здесь ниже.
Микропланшеты покрывали в течение 2 ч при 37°С очищенным пневмококковым Р8 типа 22Р (10 мкг/мл) в буфере ЗФР. Планшеты промывали 4 раза №С1 0,9% мМ-Твин 20 0,05%. Сыворотки инкубировали в течение 1 ч при 37°С с 50 мкг/мл СР8 (об./об.) в ЗФР 0,05% Твин 20. Сыворотки добавляли в лунки микропланшета и серийно разводили (стадия двукратного разведения) в ЗФР-БСА 0,05% Твин 0,05%. Планшеты инкубировали при встряхивании в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшеты промывали, как описано выше, добавляли конъюгат 1§С против мыши - пероксидаза (разведенный 1/2500) и планшеты инкубировали в течение 30 мин при КТ. После отмывки в каждую лунку добавляли субстрат (4 мг ОРБА в 10 мл цитрата 0,1 М рН 4,5 и 5 мкл Н2О2) на 15 мин. Реакцию останавливали добавлением НС1 1н. Поглощение считывали при 490-620 нм, используя спектрофотометр. Проявленное окрашивание прямо пропорционально количеству антитела, присутствующего в сыворотке.
Уровень анти-Р822Р 1§С, присутствующего в неизвестных сыворотках, определяют путем сравнения со стандартной кривой сыворотки, добавленной в каждый планшет, и выражают в мкг/мл.
Иммунные ответы, направленные против всех других серотипов, определяли в соответствии с теми же методиками за исключением того, что сыворотки мышей объединяли.
Было показано, что 19А-бР1у и 22Р-РЫБ, вводимые в препарате 13-валентной конъюгатной вакцины, являются иммуногенными у пожилых мышей С57В1 (табл. 15). У мышей, получавших 13-валентный препарат, отсутствовало отрицательное влияние на иммунный ответ, индуцированный против других Р8, по сравнению с мышами, иммунизированными 11-валентным препаратом.
- 36 020817
Таблица 15
Иммуногенность Р8 у пожилых мышей С57В1 (пост-ΙΙΙ уровни 1дО)
Пожилые черные мыши С57
Е1Л5А ГРУППА 1 ГРУППА 2 ГРУППА 3 ГРУППА 4 ГРУППА 5 ГРУППА 6
11У 0.1 мкг/50 мкл АдС 11У 19А- 0Р1у дтЬз 22Р- РЬЮ 0,1 мкг/50 мкл АдС 11У 19А- ЙР1у формол 22Р- Р1ИО 0,1 мкг/50 мкл АдС 11У 19А- <1Р1у дтЬв 22Р- РЬШ-Е 0,1 мкг/50 мкл АдС 11У 19А-8Р1у формол 22Р- РЬФ-Е 0,1 мкг/50 мкл АдС 11У 19А-ОТ 22Ρ-Ρϋ 0,1 мкг/50 мкл АдС
1 средний пул 19,30 20,20 24,40 12,80 12,10 13,60
3 средний пул 6,32 4,84 5,21 6,74 2,38 2,54
4 средний пул 60,9 67,1 51,4 47,4 45,5 41,1
5 средний пул 1,34 3,81 3,06 2,75 1,26 1,23
6В средний пул 4,41 4,12 5,88 1,58 2,31 5,64
7Р средний пул 0,83 0,81 1,65 1,98 0,89 0,99
91/ средний пул 13,8 23,7 20,0 13,1 15,5 9,6
14 средний пул 25,73 42,96 34,12 32,53 23,97 15,60
18С средний пул 13,4 20,1 11,9 9,1 8,3 8,4
19Р средний пул 57,5 90,0 63,8 36,5 47,0 69,1
23Р средний пул НР НР НР НР НР НР
19А ГСК 0,06 0,09 0,25 0,15- 0,08 0,06- 0,23 0,19
ДИ 0,04-0,1 0,05-0,14 0,41 0,12 0,14-0,38 0,09-0,3
% серопозит. 33% 47% 83% 53% 80% 73%
22Р ГСК ДИ НР 5,81 3,2-10,6 3,76 1,8-7,9 0,54 0,3-1,1 0,85 0,4-1,7 2,02 1,2-3,4
% серопозит. 0% 97% 90% 77% 87% 97%
НР - экспериментальный результат не определен.
Методика ОФА мышей.
Образцы сыворотки нагревали в течение 45 мин при 56°С для инактивации какого-либо остаточного эндогенного комплемента. Аликвоты по 25 мкл разведенного 1:2 образца сыворотки двукратно серийно разводили в 25 мкл буфера ОФА (НВ88 (сбалансированный солевой раствор Хенкса) - 14,4% инактивированная ФБС) на лунку 96-луночного микротитрационного планшета с круглым дном. Затем к разведенным сывороткам добавляли 25 мкл смеси активированных клеток НЬ-60 (1х 107 клеток/мл), только что оттаянный рабочий посевной материал пневмококка и только что оттаянный комплемент крольчонка, например, в соотношении 4/2/1 (об./об./об.) до получения конечного объема 50 мкл. Аналитический планшет инкубировали в течение 2 ч при 37°С при встряхивании на орбитальном шейкере (210 об/мин) для стимуляции фагоцитарного процесса. Реакцию останавливали помещением микропланшета на лед по меньшей мере на 1 мин. Затем аликвоту 20 мкл из каждой лунки планшета переносили в соответствующую лунку 96-луночного микропланшета с плоским дном, и в каждую лунку добавляли 50 мкл бульон Тодда - Гевита - 0,9% агар. После инкубации в течение ночи при 37°С и 5% СО2 пневмококковые колонии, появляющиеся на агаре, считали, используя автоматизированную систему анализа изображений (К8 400, 2е188, ОЬе^кοсНеη. Германия). Восемь лунок без образца сыворотки использовали в качестве бактериальных контролей для определения числа пневмококков на лунку. Определяли среднее число КОЕ контрольных лунок и использовали для вычисления киллерной активности для каждого образца сыворотки. ОФА титр для образцов сыворотки определяли путем соответствующего разведения сыворотки, способной стимулировать 50% уничтожение пневмококков. Опсонофагоцитарный титр вычисляли путем использования анализа соответствия 4-параметрической кривой.
- 37 020817
Результаты опсонофагоцитарных анализов представлены на фиг. 13 и 14.
Пример 9. Иммуногенность у молодых мышей Ва1Ь/с 13-валентных Р8 конъюгатов, содержащих 19А-ЛР1у и 22Р-РИФ.
Группы из 30 молодых мышей Ва1Ь/с (4-недельного возраста) иммунизировали 1М на сутки 0, 14 и 28 50 мкл либо 11-валентных Р8 конъюгатов, либо 13-валентных Р8 конъюгатов, в обоих случаях смешанных с адъювантом С (см. ниже).
11-Валентный вакцинный препарат состоял из 0,1 мкг сахарида каждого из приведенных ниже конъюгатов: Р81-РП, Р83-РП, Р84-РП, Р85-РП, Р86В-Р1Т Р87Р-Р1Т Р89У-РП, Р814-РП, Р818С-ТТ, Р819Р-ЭТ и Р823Е-РЭ (см. табл. 1 и примечание к 11-валентной вакцине, обсуждаемой под табл. 2). 13Валентный вакцинный препарат содержал дополнительно 0,1 мкг конъюгатов Р819А-ЛР1у и Р822Е-РИФ (см. табл. 1 и примечание к 13-валентной вакцине, обсуждаемой под табл. 2 [используя непосредственно конъюгированный 22Р]). В группе 2 и 4 носитель пневмолизин был детоксифицирован обработкой ОМВ8, в группе 3 и 5 это осуществляли с помощью формальдегида (способы, описанные в АО 04/81515). В группах 2 и 3 РИФ использовали для конъюгации Р822Р, в группах 4 и 5 использовали слитую конструкцию РИФ_Е (конструкцию УР147 из АО 03/054007). В группе 6 19А был конъюгирован с дифтерийным анатоксином, а 22Р с белком Ό.
Уровни анти-Р819А и 22Р 1дО по ЕЬ18А дозировали в индивидуальных сыворотках, собранных на сутки 42. Ответ 1дО по ЕЬ18А, полученный с другими Р8, измеряли в объединенных сыворотках.
Было показано, что 19А-ЛР1у и 22Р-РИФ, вводимые в препарате 13-валентной конъюгатной вакцины, являются иммуногенными у молодых мышей Ва1Ь/с (табл. 16). У мышей, получавших 13-валентный препарат, отсутствовало отрицательное влияние на иммунный ответ, индуцированный против других Р8, по сравнению с мышами, иммунизированными 11-валентным препаратом.
Анализы ЕЬ18А проводили, как описано в примере 8.
Таблица 16
Иммуногенность Р8 у молодых мышей Ва1Ь/с (пост-ΙΙΙ уровни 1дО)
Мыши Ва1ЬС
ЕЫ5А ГРУППА 1 ГРУППА 2 ГРУППА 3 ГРУППА 4 ГРУППА 5 ГРУППА 6
1ΐν 0,1 мкг/50 мкл АдС 11У 19Ач1Р1у дшЬз 22Р-РКЮ 0,1 мкг/50 мкл АдС ιιν 19А- е1Р1у фор- мол 22Р- рщц 0,1 мкг/50 мкл АдС 11У 19А- с!Р1у дтЬз 22Р- РЛЮ-Е 0,1 мкг/50 мкл АдС ιιν 19А-ЦР1у формол 22Р- РЬЮ-Е 0,1 мкг/50 мкл АдС 11У 19А-ЦТ 22Р-РР 0,1 мкг/50 мкл АдС
1 средний пул 131,70 101,20 83,00 82,40 67,90 85,50
3 средний пул 21,85 10,38 12,53 8,83 8,73 14,98
4 средний пул 147,4 127,0 104,4 95,0 113,6 114,2
5 средний пул 21,38 20,29 18,26 18,95 18,02 23,04
6В средний пул 1,97 4,76 3,72 2,35 1,43 1,05
7Р средний пул 7,69 4,58 4,77 4,24 3,92 3,94
9Ψ средний пул 30,1 30,7 26,5 21,4 23,4 28,3
14 средний пул 28,78 27,67 26,23 21,54 24,34 13,73
18С средний пул 53,4 52,37 46,5 57,8 47,8 75,8
19Р средний пул 186,6 157,7 169,3 178,9 181,9 223,2
23Р средний пул 4,98 3,9 5,11 0,57 3,13 4,57
- 38 020817
гск ди % серопозит. ОЛ 0,2-0,6 93% 32,8 26,4-40,7 100% 26,1 20,6- 30,6 100% 21,6 17,5- 26,7 100% 18,9 15.1-23,5 100% 23,8 19,5- 28,5 100%
ГСК НР 3,99 3,76 6,27 8,70 18,76
ДИ 1,9-8,42 1,8-8 3,8-10,4 5,4-13,9 15,2- 23,1
% серопозит. 0% 93% 100% 100% 100% 100%
НР - экспериментальный результат не определен.
Методика ОФА мышей.
Образцы сыворотки нагревали в течение 45 мин при 56°С для инактивации какого-либо остаточного эндогенного комплемента. Аликвоты по 25 мкл разведенного 1:2 образца сыворотки двукратно серийно разводили в 25 мкл буфера ОФА (НВ88-14,4% инактивированная ФБС) на лунку 96-луночного микротитрационного планшета с круглым дном. Затем к разведенным сывороткам добавляли 25 мкл смеси активированных клеток НЬ-60 (1х 107 клеток/мл), только что оттаянный рабочий посевной материал пневмококка и только что оттаянный комплемент крольчонка, например, в соотношении 4/2/1 (об./об./об.) до получения конечного объема 50 мкл. Аналитический планшет инкубировали в течение 2 ч при 37°С при встряхивании на орбитальном шейкере (210 об/мин) для стимуляции фагоцитарного процесса. Реакцию останавливали помещением микропланшета на лед по меньшей мере на 1 мин. Затем аликвоту 20 мкл из каждой лунки планшета переносили в соответствующую лунку 96-луночного микропланшета с плоским дном и в каждую лунку добавляли 50 мкл бульон Тодда - Гевита -0,9% агар. После инкубации в течение ночи при 37°С и 5% СО2 пневмококковые колонии, появляющиеся на агаре, считали, используя автоматизированную систему анализа изображений (К8 400, 2е,кк. ОЬегкосйеп, Германия). Восемь лунок без образца сыворотки использовали в качестве бактериальных контролей для определения числа пневмококков на лунку. Определяли среднее число КОЕ контрольных лунок и использовали для вычисления киллерной активности для каждого образца сыворотки. ОФА титр для образцов сыворотки определяли путем соответствующего разведения сыворотки, способной стимулировать 50% уничтожение пневмококков. Опсонофагоцитарный титр вычисляли путем использования анализа соответствия 4-параметрической кривой.
Результаты представлены на фиг. 15 и 16.
Результаты в препаратах с квасцами.
Иммуногенность у молодых мышей Ва1Ь/с 13-валентных Р8 конъюгатов, содержащих 19А-бР1у и
22Р-РЫО.
Группы из 40 молодых мышей Ва1Ь/с (4-недельного возраста) иммунизировали 1М на сутки 0, 14 и 28 50 мкл либо 11-валентных Р8 конъюгатов, либо 13-валентных Р8 конъюгатов, в обоих случаях адсорбированных на А1РО4. Совместно вводили 1пГагупх Неха.
11-Валентный вакцинный препарат состоял из 0,1 мкг сахарида каждого из приведенных ниже конъюгатов: Р81-РО, Р83-РО, Р84-РО, Р85-РО, Р86В-РЭ, Р87Р-РЭ, Р89У-РЭ, Р814-РО, Р818С-ТТ, Р819Р-ЭТ и Р823Р-РЭ (см. табл. 1 и примечание к 11-валентной вакцине, обсуждаемой под табл. 2). 13Валентный вакцинный препарат содержал дополнительно 0,1 мкг конъюгатов Р819А-бР1у и Р822Р-РЙЮ (см. табл. 1 и примечание к 13-валентной вакцине, обсуждаемой под табл. 2 [используя непосредственно конъюгированный 22Р]). В группе 2 и 4 носитель пневмолизин был детоксифицирован обработкой СМВ8, в группе 3 и 5 это осуществляли с помощью формальдегида. В группах 2 и 3 РйГО использовали для конъюгации Р822Р, в группах 4 и 5 использовали слитую конструкцию РйГО_Е (конструкцию УР147 из XV О 03/054007). В группе 6 19А был конъюгирован с дифтерийным анатоксином, а 22Р с белком Ό.
Уровни анти-Р819А и 22Р 1§С по ЕЫ8А и опсонофагоцитарные титры измеряли в индивидуальных сыворотках, собранных на сутки 42. Ответ 1§С по ЕЫ8А, полученный с другими Р8, измеряли в объединенных сыворотках.
Было показано, что 19А-бР1у и 22Р-РЙГО, вводимые в препарате 13-валентной конъюгатной вакцины, являются иммуногенными и индуцируют опсонофагоцитарные титры у молодых мышей Ва1Ь/с (табл. 17 и фиг. 19-20). У мышей, получавших 13-валентный препарат, отсутствовало отрицательное влияние на иммунный ответ, индуцированный против других Р8, по сравнению с мышами, иммунизированными 11-валентным препаратом.
Опсонофагоцитарные анализы использовали для оценки сывороток, результаты представлены на фиг. 19 и 20.
- 39 020817
Таблица 17
Иммуногенность Р8 у молодых мышей Ва1Ь/с (пост-ΙΙΙ уровни 1дС)
ЕЫ5АПОСТШ ГРУППА 1 ГРУППА 2 ГРУППА 3 ГРУППА4 ГРУППА 5 ГРУППА6
1ΐν 1ΐν 19А-РГу ОМВ5 22Г-РМО ιιν 19А-0Иу формол 22Р-ИИО «V 19АчГР1у 0МВ8 22Р-РМОЕ ЙУ 19А-<1Р1у формол 22Ρ-ΡΙΛΟΕ ιιν 19ΑΌΤ 22Р-РО
1/10 НО 5С 1/10 НО 5С 1/10 НО $С 1/10 НО 6С 1/10 НО $С 1/10 НО 5С
1 Средний пул 37.535 35.312 56.839 39.781 35.739 30.270
3 Средний пул 9.093 9.574 7.991 10.548 7.502 8.217
4 Средний пул 25.422 27.439 25.795 31.274 34.295 31.589
5 Средний аул 9.256 8.568 9.6 7.551 8.869 8.309
6В Средний пул 0.552 0.423 0.565 0.264 0.263 0.435
7Р Средний пул 3.771 2.541 5.394 2.618 2.764 3.048
ον Средний пул 23.447 23.479 27.394 19.072 24.282 28.017
14 Средний аул 25.921 26.103 24.927 16.487 20.517 24.795
18С Средний аул 5.223 6.873 7.726 5.812 9.186 9.146
19Р Средний пул 51.271 70.498 88.336 73.879 96.521 66.484
23Р Средний пул 1.536 0.669 0.646 0.259 1.116 0.596
19А ГСК 95% ДИ % серокол. 0.055 ΝΤ 55% 1.797 1.206-2.678 100% 2.256 1.71-2977 100% 1.950 1.368-2,778 100% 2.128 1.478-3.064 100% 3.640 2793-4744 100%
22Р ГСК 95% ДИ % серопол. 0.05 005-005 0% 0.171 0.104-0.282 53% 0.097 0.0690.141 41% 9.924 7.19-13,695 100% 6.837 5.892-13.719 100% 11.993 9.079-15-842 100%
Иммуногенность у молодых мышей ОЕ1 13-валентных Р8 конъюгатов, содержащих 19А-НР1у и 22Е-РЫГО.
Группы из 40 молодых мышей ОЕ1 (4-недельного возраста) иммунизировали ΙΜ на сутки 0, 14 и 28 50 мкл либо 11-валентных Р8 конъюгатов, либо 13-валентных Р8 конъюгатов, в обоих случаях адсорбированных на А1РО4. Совместно вводили 1и£агуих Неха.
11-Валентный вакцинный препарат состоял из 0,1 мкг сахарида каждого из приведенных ниже конъюгатов: Р81-РП, Р83-РП, Р84-РП, Р85-РП, Р86В-РП, Р87Е-РО, Р89У-РП, Р814-РП, Р818С-ТТ, Р819Е-ЭТ и Р823Р-РЭ (см. табл. 1 и примечание к 11-валентной вакцине, обсуждаемой под табл. 2). 13Валентный вакцинный препарат содержал дополнительно 0,1 мкг конъюгатов Р819А-НР1у и Р822Е-РЫГО (см. табл. 1 и примечание к 13-валентной вакцине, обсуждаемой под табл. 2 [используя непосредственно конъюгированный 22Е]). В группе 2 и 4 носитель пневмолизин был детоксифицирован обработкой СМВ8, в группе 3 и 5 это осуществляли с помощью формальдегида (способы, описанные в АО 04/81515). В группах 2 и 3 РЫГО использовали для конъюгации Р822Е, в группах 4 и 5 использовали слитую конструкцию РЫГО_Е (конструкцию УР147 из АО 03/054007). В группе 6 19А был конъюгирован с дифтерийным анатоксином, а 22Е с белком Ό.
Уровни анти-Р819А и 22Е 1дС по ЕЫ8А и опсонофагоцитарные титры измеряли в индивидуальных сыворотках, собранных на сутки 42. Ответ 1дС по ЕЫ8А, полученный с другими Р8, измеряли в объединенных сыворотках.
Было показано, что 19А-НР1у и 22Е-РЫГО, вводимые в препарате 13-валентной конъюгатной вакцины, являются иммуногенными и индуцируют опсонофагоцитарные титры у молодых мышей ОЕ1 (табл. 18 и фиг. 21-22). У мышей, получавших 13-валентный препарат, отсутствовало отрицательное влияние на иммунный ответ, индуцированный против других Р8, по сравнению с мышами, иммунизированными 11-валентным препаратом.
Сыворотки также оценивали с помощью опсонофагоцитарного анализа, результаты представлены на фиг. 21 и 22.
- 40 020817
Таблица 18
Иммуногенность Р8 у молодых мышей ОЕ1 (пост-Ш уровни !дС)
ЕЫ5АПОСТШ ГРУППА 1 ГРУППА 2 ГРУППА 3 ГРУППА 4 ГРУППА 5 ГРУППА 6
ιιν ιιν ιιν ιιν
19А-Р1у 19А-Л*1у 19А-(1Р1у 19А-йР1у ιιν
СМВБ формол СМВ5 формол 19А-ОТ
11Υ 22Р-РИШ 22Р-РЫО 22Р-РЫОЕ 22Р-РМВЕ 22Р-Р0
1/10 НТ) 8С 1/10 НО 5С 1/10 НО 5С 1/10 НП5С 1/10 ИО 5С 1/10 ИЛ 5С
1 Средний пул 39.668 50.854 40384 30.108 34.753 34.487
3 Средний аул 5.562 6.266 7343 4.665 5.510 5.188
4 Средний пул 21.979 30.567 27.65 26.646 23.159 23.296
5 Средний аул 8.884 7.986 9.495 9.303 11418 8.984
6В Средний пул 3.158 4.139 3.48 2.44 3.784 3,137
7Г Средний пул 7.134 8.843 12.471 6.497 7.607 6.607
9У Средний пул 24.052 37,153 36348 35.168 29.746 26.592
14 Средний пул 293)27 46,05? 36.605 40.883 35.026 39.186
18С Средний пул 4.961 6.508 4.587 5.148 6.783 4,915
19Г Средний пул 48.667 74366 45561 63.845 68.155 47.703
23 К Средний пул 0.664 1.093 0.996 0.212 0.764 1579
19А гск 0.057 1349 2.266 1,864 3.751 2.434
95% ДИ КГ 1.132-3.020 1.439-3.569 1.157-3.004 2 8254.980 1.725-3435
% серепол. 48% 100% 98% 95% 100% 100%
22Р ГСК 0.064 11.190 16.196 12.431 17419 27490
95% ДИ ΝΤ 6.225-20.114 9.718-26.992 7.95-19439 12 056-24.879 22 044-34.281
% серонол. 225% 96.9% 975% 975% 100.0% 100%
Пример 10. Иммуногенность у морских свинок 13-валентных Р8 конъюгатов, содержащих 19А-бР1у и 22Е-РЫО.
Группы из 20 молодых морских свинок (линия Хартли; 5-недельного возраста) иммунизировали ГМ на сутки 0, 14 и 28 125 мкл либо 11-валентных Р8 конъюгатов, либо 13-валентных Р8 конъюгатов, в обоих случаях смешанных с адъювантом С (см. ниже).
11-Валентный вакцинный препарат состоял из 0,25 мкг сахарида каждого из приведенных ниже конъюгатов: Р81-РП, Р83-РП, Р84-РП, Р85-РП, Р86В-Р1У Р87Е-РО, Р89У-РП, Р814-РП, Р818С-ТТ, Р819Е-ЭТ и Р823Е-РО (см. табл. 1 и примечание к 11-валентной вакцине, обсуждаемой под табл. 2). 13Валентный вакцинный препарат содержал дополнительно 0,1 мкг конъюгатов Р819А-бР1у и Р822Е-РЫФ (см. табл. 1 и примечание к 13-валентной вакцине, обсуждаемой под табл. 2 [используя непосредственно конъюгированный 22Е]). В группе 2 и 4 носитель пневмолизин был детоксифицирован обработкой ОМВ8, в группе 3 и 5 это осуществляли с помощью формальдегида. В группах 2 и 3 РЫГЭ использовали для конъюгации Р822Е, в группах 4 и 5 использовали слитую конструкцию РЫГО_Е (конструкцию УР147 из АО 03/054007). В группе 6 19А был конъюгирован с дифтерийным анатоксином, а 22Е с белком Ό.
Уровни анти-Р819А и 22Е !дС по ЕЫ8А оценивали в индивидуальных сыворотках, собранных на сутки 42, используя приведенный ниже протокол. Ответ по ЕЫ8А, полученный с другими Р8, измеряли в объединенных сыворотках.
Методики серологии морских свинок.
Уровни анти-Р819А !дС по ЕЫ8А оценивали в сыворотках, собранных на сутки 42, используя методику, описанную здесь ниже.
Микропланшеты покрывали в течение 2 ч при 37°С очищенным пневмококковым Р8 типа 19А (10 мкг/мл) в буфере ЗФР. Планшеты промывали 4 раза Ν;·ιΟ 0,9% мМ-Твин 20 0,05%. Сыворотки инкубировали в течение 1 ч при 37°С с 50 мкг/мл СР8 (об./об.) в ЗФР 0,05% Твин 20. Сыворотки добавляли в лунки микропланшета и серийно разводили (стадия двукратного разведения) в ЗФР-БСА 0,05% Твин 0,05%. Планшеты инкубировали при встряхивании в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшеты промывали, как описано выше, и добавляли конъюгат ^О против морской свинки - пероксидаза (разведенный 1/1000) и планшеты инкубировали в течение 30 мин при КТ. После отмывки в каждую лунку добавляли субстрат (4 мг ОРЭА в 10 мл цитрата 0,1 М рН 4,5 и 5 мкл Н2О2) на 15 мин. Реакцию останавливали добавлением НС1 1н. Поглощение считывали при 490-620 нм, используя спектрофотометр. Проявленное окрашивание прямо пропорционально количеству антитела, присутствующего в сыворотке.
Уровень анти-Р819А [дО, присутствующего в неизвестной сыворотке, определяют путем сравнения со стандартной кривой сыворотки, добавленной на каждый планшет, и выражают в мкг/мл.
Уровни-Р822Е ^О по ЕЫ8А дозировали в сыворотках, собранных на сутки 42, используя методику, описанную здесь ниже.
Микропланшеты покрывали в течение 2 ч при 37°С очищенным пневмококковым Р8 типа 22Е (10 мкг/мл) в буфере ЗФР. Планшеты промывали 4 раза №С1 0,9% мМ-Твин 20 0,05%. Сыворотки инкубировали в течение 1 ч при 37°С с 50 мкг/мл СР8 (об./об.) в ЗФР 0,05% Твин 20. Сыворотки добавляли в лунки микропланшета и серийно разводили (стадия двукратного разведения) в ЗФР-БСА 0,05% Твин 0,05%. Планшеты инкубировали при встряхивании в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшеты промывали, как описано выше, и добавляли конъюгат ^О против морской свинки - пероксидаза (разведенный 1/1000) и планшеты инкубировали в течение 30 мин при КТ. После отмывки в каждую лунку добавляли субстрат (4 мг ОРЭА в 10 мл цитрата 0,1 М рН 4,5 и 5 мкл Н2О2) на 15 мин. Реакцию
- 41 020817 останавливали добавлением НС1 1н. Поглощение считывали при 490-620 нм, используя спектрофотометр. Проявленное окрашивание прямо пропорционально количеству антитела, присутствующего в сыворотке.
Уровень анти-Р822Р 1§С, присутствующего в неизвестных сыворотках, определяют путем сравнения со стандартной кривой сыворотки, добавленной на каждый планшет, и выражают в мкг/мл.
Иммунные ответы, направленные против всех других серотипов, определяли в соответствии с теми же методиками за исключением того, что сыворотки морских свинок объединяли.
Таблица 19
Иммуногенность Р8 у морских свинок (пост-ΙΙΙ уровни 1§С)
Морские свинки
ΕΙ.Ι8Α ГРУППА 1 ГРУППА 2 ГРУППА 3 ГРУППА 4 ГРУППА 5 ГРУППА 6
-ιιν 0,1 мкг/50 мкл Ад С ιιν 19А-с1Р1у дтЬв 22Р-РНЮ 0,1 мкг/50 мкл Ад С ιιν 19А-4Р1у формол 22Р-РПЮ 0,1 мкг/50 мкл АдС ιιν 19А-<1Р1у дтЬв 22Р- РЬЮ-Е 0,1 мкг/50 мкл АдС ιιν 19А-с1Р1у формол 22Ρ-Ρ(ήϋ- Е 0,1 мкг/50 мкл АдС ιιν 19А-ОТ 22Р-РЦ 0,1 мкг/50 мкл АдС
1 средний пул 78,00 77,21 76,15 68,77 68,59 81,04
3 средний пул 7,75 9,31 12,73 7,94 4,75 9,59
4 средний пул 130,7 94,4 132,6 166,8 85,0 101,3
5 средний пул 109,10 117,10 110,70 158,40 74,10 100,40
6В средний пул 3,14 4,26 14,4 7,63 6,3 7,52
7Р средний пул 154,2 216,0 240,0 181,0 142,0 179,1
θν средний пул 90,69 105,45 98,20 93,45 54,12 73,05
14 средний пул 71,19 77,18 46,53 59,67 38,47 53,69
18С средний пул 109,4 122,3 137,1 79,9 73,7 83,1
19Р средний пул 73,9 102,5 112,2 75,5 62,3 72,1
23Р средний пул 19,19 30,74 29,44 31,52 19,13 24,94
19А гск 0,4 25,58 41,49 14,25 27,49 6,74
ДИ % 0,24-0,68 12-54,5 24,4-70,5 5,9-34,6 16,6-45,4 4-11,3
серопозит. 75% 100% 100% 100% 100% 100%
22Р гск 0,12 2,51 3,67 45,74 30,68 96,38 73,5-
ДИ % 0,09-0,16 0,94-6,73 1,59-8,42 29,3-71,4 17-53,3 126,4
серопозит. 10% 95% 95% 100% 100% 100%
Опсонофагоцитарные анализы также использовали для тестирования сывороток, результаты представлены на фиг. 17 и 18.
Пример 11. Препараты, которые готовят и испытывают.
а) Готовят приведенные ниже препараты (используя 13-валентную вакцину из табл. 1 и серотип 3 из табл. 5, см. примечание к 14-валентной вакцине, обсуждаемой под табл. 2 [используя непосредственно конъюгированный 22Р или конъюгированный через линкер АБН]). Препараты сахаридов готовят с фосфатом алюминия и 3Б-МРЬ, как показано ниже.
- 42 020817
14У 25 мкг МРЬ Сумма ВАС Содержание алюминия -> ГР на дозу:
РЗ носитель мкг Ρ5 ΜΚΓ МРЬ отношение Ρ5/ΑΙ 1/χ мкг ΑΙ
1 РО 1 10 10
3 Ρϋ 1 10 10
4 Ρϋ 3 10 30
5 Ρϋ 1 10 10
6А Ρϋ 1 10 10
6В Ρϋ 1 10 10
7Р Ρϋ 1 10 10
9ν Ρϋ 1 10 10
14 Ρϋ 1 10 10
18С ТТдн 3 15 45
19А άΡΙγ 3 10 30
19Р ϋΤ 3 10 30
22Р РЫО 3 10 30
23Р ΡΟ 1 10 10
ВАС МРЬ 50/200 25 4 100
ГР Содержание алюминия Сумма = 355
14ν Сумма ВАС Содер Η 10 мкг МРЬ жание алюминия -> ΓΓ а дозу:
РЗ носитель мкгРЗ мкг МРЬ отношение Ρ8/ΑΙ 1/х мкг ΑΙ
1 ρϋ 1 10 10
3 РО 1 10 10
4 Ρϋ 3 10 30
5 Ρϋ 1 10 10
6А Ρϋ 1 10 10
6В Ρϋ 1 10 10
7Р Ρϋ 1 10 10
9У Ρϋ 1 10 10
14 Ρϋ 1 10 10
18С ΓΓαη 3 15 45
19А ιΙΡΙγ 3 10 30
19Р ϋΤ 3 10 30
22Р РЬГО 3 10 30
23Р ΡΟ 1 10 10
ВАС МРЬ 50/200 10 4 40
ЕР Содержание алюминия Сумма= 295
б) В тот же сахаридный препарат добавлены в качестве адъюванта каждый из следующих адъювантов.
В таблице, приведенной ниже, показана концентрация компонентов эмульсии на дозу 500 мкл.
Адъювант А1 Адъювант А2 Адъювант АЗ
Ингредиенты 250 мкл эмульсия м/в 125мкл эмульсия м/в 50мкл эмульсия м/в
альфа- токоферол 11,88 мг 5,94 мг 2,38 мг
сквален 10,7 мг 5,35 мг 2,14 мг
твин 80 4,85 мг 2,43 мг 0,97 мг
Ингредиенты Адъювант А4 250мкл Адъювант А5 250мкл Адъювант А6 125м кл Адъювант А7 50м кл
альфа- эмульсия м/в 11,88 мг эмульсия м/в 11,88 мг эмульсия м/в 5,94 мг эмульсия м/в 2,38 мг
токоферол сквален 10,7 мг 10,7 мг 5,35 мг 2,14 мг
твин 80 4,85 мг 4,85 мг 2,43 мг 0,97 мг
ЗЮ-МРЬ 50 мкг 25 мкг 25 мкг 10 мкг
в) Сахариды также включают в препарат с двумя адъювантами на основе липосом. Композиция адъюванта В1.
Качественно/Количественно (на дозу 0,5 мл).
- 43 020817
Липосомы:
ϋΟΡΟ 1 мг холестерин 0,25 мг
ЗОМРЬ 50 мкг
0521 50 мкг
КН2РО+1 3,124 мг Буфер
МагНРОд 1 0,290 мг Буфер №С12,922 мг (100 мМ)
ВДИ ς.5. до 0,5 мп Растворитель рН 6,1
1. Суммарная концентрация РО4 = 50 мМ.
Композиция адъюванта В2.
Качественно/Количественно (на дозу 0,5 мл).
Липосомы:
ϋΟΡΟ 0,5 мг холестерин 0,125 м г
3ϋΜΡί 25 мкг
0521 25 мкг
КНгРОд 1 3,124 мг Буфер ИагНРОд 10,290 мг Буфер №С1 2,922 мг (100 мМ)
ВДИ ς.δ. до 0,5 мл Растворитель рН 6,1
г) Сахариды также включают в препарат с адъювантом С (см. выше для других композиций, где использован этот адъювант).
Качественно/Количественно (на дозу 0,5 мл).
Эмульсия масло-в-воде: 50 мкл
Сквален 2,136 мг а-Токоферол 2,372 мг Твин 80 0,97 мг Холестерин 0,1 мг
3ϋΜΡί 50 мкг
0521 50 мкг
КН2РО41 0,470 мг Буфер №2НРО41 0,219 мг Буфер №С1 4,003 мг (137 мМ)
КСЮ, 101 мг (2,7 мМ)
ВДИ 4.8. до 0,5 мл Растворитель рН 6,8
Пример 12. Влияние химии конъюгации на иммуногенность конъюгата 22Р-РЫО у мышей Ва1Ь/с.
Группы из 30 самок мышей Ва1Ь/с иммунизировали внутримышечным (ΙΜ) путем на сутки 0, 14 и 28 13-валентными препаратами Р8, содержащими Р8 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А, 19Р, 22Р и 23Р (доза: 0,3 мкг сахарида/конъюгат для Р8 4, 18С, 19А, 19Р и 22Р и 0,1 мкг сахарида/конъюгат для других Р8).
Р8 18С конъюгирован со столбнячным анатоксином, 19Р с дифтерийным анатоксином, 19А с Р1у, детоксифицированным формолом, 22Р с РНЮ и другие Р8 с РЭ.
Сравнивали два препарата, состоящие либо из 22Р-РЫО, полученного прямым путем с помощью химии СЭЛР, либо из 22Ρ-ЛΗ-РЫ^ (ЛЭИ-производное Р8). Характеристики 13-валентной вакцины, полученной с 22Р, конъюгированным непосредственно или через спейсер АОК см. в примере 2, табл. 1 и
- 44 020817 примечаниях под табл. 2. В вакцинные препараты добавляли адъювант С.
Уровни анти-Р822Р 1§О по ЕЬ18А и опсонофагоцитарные титры измеряли в сыворотках, собранных на сутки 42.
Было показано, что 22Р-АН-РЬФ является значительно более иммуногенным, чем 22Р-РЬФ, в отношении как уровней 1§О (фиг. 5), так и опсонофагоцитарных титров (фиг. 6).
Пример 13. Влияние новых адъювантов на иммуногенность конъюгатов капсульных Р8 81гер1оссоссик рпеитотае.
Группы из 40 молодых мышей С57В1 иммунизировали внутримышечным (1М) путем на сутки 0, 14 и 28 13-валентными препаратами Р8, содержащими Р8 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А, 19Р, 22Р и 23Р (доза: 0,3 мкг сахарида/конъюгат для Р8 4, 18С, 19А, 19Р и 22Р и 0,1 мкг сахарида/конъюгат для других Р8).
Р8 18С конъюгирован со столбнячным анатоксином, 19Р с дифтерийным анатоксином, 19А с Р1у, детоксифицированным формолом, 22Р с РЬФ и другие Р8 с РЭ. Характеристики 13-валентной вакцины, полученной с 22Р, конъюгированным непосредственно, см. в примере 2, табл. 1 и примечаниях под таблицей.
Сравнивали четыре препарата с добавлением либо А1РО4, либо адъюванта А1, либо адъюванта А4, либо адъюванта А5.
Уровни анти-Р8, Р1у, РЬФ и РЭ 1§О по ЕЬ18А измеряли в сыворотках, собранных на сутки 42 и объединенных на группу. Для каждого антигена вычисляли приведенное ниже соотношение уровень 1§О, индуцированный новым испытуемым адъювантом/уровень 1§О, индуцированный А1РО4.
Все новые испытуемые адъюванты улучшали по меньшей мере в 2 раза иммунные ответы на конъюгаты серотипа 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А, 19Р и 22Р по сравнению с классическим препаратом А1РО4 (фиг. 7). В данном эксперименте не было получено надежного ответа на серотип 23Р.
Пример 14. Протективная эффективность комбинации РЬФ/детоксифицированный Р1у в модели пневмококковой пневмонии макак.
Группы из 6 макак-резусов (в возрасте от 3 до 8 лет), отобранных как обладающие самыми низкими уже существующими уровнями антитела анти-19Р, иммунизировали внутримышечно на сутки 0 и 28 либо 11-валентными Р8 конъюгатами (т.е. 1 мкг Р8 1, 3, 5, 6В, 7Р, 9У, 14 и 23Р, и 3 мкг Р8 4, 18С и 19Р [сахарида]), либо РЬФ (10 мкг) + детоксифицированный формолом Р1у (10 мкг), либо слитым опероном РЬФ/Е (10 мкг) и детоксифицированным формолом Р1у (10 мкг), либо одним адъювантом.
Р8 18С конъюгирован со столбнячным анатоксином, 19Р с дифтерийным анатоксином, 19А с Р1у, детоксифицированным формолом, 22Р с РЬФ и другие Р8 с РЭ. Характеристики 11-валентной вакцины см. в примере 2, табл. 1 и примечаниях под табл. 2. Во все препараты добавляли адъювант С.
Пневмококки типа 19Р (5-108 КОЕ) инокулировали в правое легкое на сутки 42. Колонии считали в бронхоальвеолярных лаважах, собранных на сутки 1, 3 и 7 после контрольного заражения. Результаты выражали в виде числа животных на группу, либо умерших, либо с колонизацией в легком, либо с клиренсом на сутки 7 после контрольного заражения.
Как показано на фиг. 8, хорошая защита, близкая к статистической значимости (несмотря на низкое число используемых животных), была получена с 11-валентными конъюгатами и комбинацией РЬФ+бР1у (р < 0,12, точный критерий Фишера) по сравнению с группой одного адъюванта.
Пример 15. Влияние химии конъюгации на ответ антитела анти-РЬФ и протективную эффективность против контрольного заражения типа 4 при индукции конъюгатами 22Р-РЬФ.
Группы из 20 самок мышей ОР1 иммунизировали внутримышечным путем на сутки 0 и 14 3 мкг либо 22Р-РЬФ (полученного прямым путем с помощью химии СЭАР), либо 22Р-АН-РЬФ (АЭНпроизводного Р8), либо одним адъювантом. Оба моновалентных конъюгата 22Р были получены способами примера 2 (см. также табл. 1 и 2). В каждый препарат добавляли адъювант С.
Уровни анти-РЬФ 1§О по ЕЬ18А измеряли в сыворотках, собранных на сутки 28.
Мышей подвергали контрольному заражению интраназально 5-106 КОЕ пневмококков типа 4 на сутки 29 (т.е. серотип пневмококка потенциально не был охвачен Р8, присутствующими в испытуемом вакцинном препарате). Мониторинг индуцированной смертности проводили вплоть до суток 10 после контрольного заражения.
Результаты, представленные на фиг. 9, демонстрируют, что 22Р-АН-РЬФ индуцировал значительно более высокий ответ анти-РЬФ 1§О по сравнению с 22Р-РЬФ. Это было отражено в лучшей защите против контрольного заражения типа 4 по сравнению с 22Р-РЬФ, как показано на фиг. 10.
Пример 16. Преимущество комбинирования полисахарида и белка при получении протективного иммунного ответа.
Потенциальный синергизм между иммунными ответами, направленными против РЬФ и капсульных полисахаридов, оценивали в модели летального контрольного заражения мышей 8. рпеитотае. Мышей внутримышечно иммунизировали три раза (сутки 0, 14 и 28) РЬФ. За час до контрольного заражения бактериями антиполисахаридные антитела пассивно переносили мышам (1Р, 200 мкл). Летальность, индуцированную 8. рпеитотае, прослеживали вплоть до 8 или 11 суток после контрольного за- 45 020817 ражения. Синергизм защиты представлен здесь для двух штаммов 8. рпеитошае (серотипа 3 и серотипа 1).
Модель контрольного заражения штаммом 3/43 8. рпеитошае.
В данном эксперименте мышей ОР1 иммунизировали РЬЮ, адсорбированным на А1РО4, и 1,25 мкг антител морской свинки анти-Р83 пассивно переносили за 1 ч до контрольного заражения 8. рпеитошае серотипа 3 (8рп 3/43).
Результаты представлены на фиг. 11. 70% летальность наблюдали у мышей, получивших только ЗФР. Умеренную защиту наблюдали в группе мышей, которые получили антитела анти-Р83, или мышей, иммунизированных РЬЮ. Синергизм, приводящий почти к полной защите, наблюдали у мышей с комбинированной активной и пассивной иммунизацией против РЬЮ и Р83 соответственно.
Модель контрольного заражения серотипом 1/57 8. Рпеитошае.
В данном эксперименте мышей ОР1 иммунизировали РЬЮ с добавлением в качестве адъюванта ТН1 адъюванта и антитела морской свинки анти-Р81 пассивно переносили за 1 ч до контрольного заражения 8. рпеитошае серотипа 1 (8рп 1/57).
Результаты представлены на фиг. 12. Высокую летальность наблюдали в контрольной группе, в которой мыши получили ТН1 адъювант (активная иммунизация) и только ЗФР (пассивная иммунизация). Умеренную защиту наблюдали в группе мышей, которые получили антитела анти-Р81 (55% выживание), или мышей, иммунизированных РЬЮ (25% выживание). Синергизм, приводящий почти к полной защите, наблюдали у мышей с комбинированной активной и пассивной иммунизацией против РЬЮ и Р83 соответственно.
Эти данные подтверждают синергетический эффект иммунных ответов, направленных против пневмококкового белка (т.е. РЬЮ) и капсульных полисахаридов в механизме защиты против инфекции 8. рпеитошае.
Пример 17. Влияние пневмококковых конъюгатов Р8-ТТ и Р8-ЭТ на иммунный ответ, направленный против остальных пневмококковых конъюгатов Р8-РЭ в 11-валентном препарате.
Препарат, содержащий 11 конъюгатов Р8-РЭ, сравнивали с препаратом, содержащим 7 конъюгатов Р8-РО, 2 Р8-ТТ (Р8 6В и 23Р) и 2 Р8-ЭТ (Р8 18С и 19Р) в обеих моделях иммуногенности мышей и морских свинок.
Мышей внутримышечно иммунизировали три раза 1/10 дозы вакцин для человека (0,1 мкг Р8). Образцы крови собирали на сутки 42 и иммунный ответ, направленный против каждого полисахарида, измеряли с помощью ЕЫ8А.
Морских свинок внутримышечно иммунизировали три раза 1/4 дозы вакцин для человека (0,25 мкг Р8). Совместно вводили Шаипх Неха, чтобы имитировать ситуацию человека. Образцы крови собирали на сутки 42 и иммунный ответ, направленный против каждого полисахарида, измеряли с помощью ЕЫ8А.
- 46 020817
Эксперимент № 3ΡΝ115 (р1тз 20040304) Эксперимент № 3ΡΝ116 (ρΐπτκ 20040308) Морская свинка
Мышь
ΕίΙ3Α Еи£А
Все на РО 1 мкг 6В-ТТАН 1 мкг 23Р-ТТАН 1 мкг 18С-ОТАН 1 мкг 19Р-ЭТ 1 мкг 1/4-РЭ 1 мкг другие на Ρϋ 1 мкг Все на РО 1 мкг 6В-ТТАН 1 мкг 23Р-ТТАН 1 мкг 18С-ЭТАН 1 мкг 19Е-ЭТ 1 мкг 1/4-Ρϋ 1 мкг другие на РЭ1 мкг
1 ГСК 95% ДИ % серопоз. 6,145 4,54-8,33 100% 19,951* 14,73-27,05 100% 1 ГСК 95% ДИ %серопоз. 8,244 4,745-14,324 100% 33,479* 21,507-52,114 100%
3 ГСК 95% ДИ % серопоз. 1,763 1,223-2,542 100% 2,483 1,693-3,643 100% 3 ГСК 95% ДИ %серопоз. 2,348 1,42-3,89 100% 1,619 0,54-3,13 100%
4 ГСК 95% ДИ % серопоз. 3,643 2,498-5,311 100% 11,849* 8,909-15,759 100% 4 ГСК 95% ДИ %серопоз. 9,211 6,535-15,238 100% 19,033 10.816-33,494 100%
5 ГСК 95% ДИ % серопоз. 2,291 1,575-3,332 100% 5,154* 3,829-6,939 100% 5 ГСК 95% ДИ %серопоэ. 14,04 9.967-19,776 100% 14,791 10,227-21,392 100%
5ВГСК 95% ДИ % серопоз. 0,048 0,031-0,075 44% 0,537* 0,342-0,843 100% 6ВГСК 95% ДИ %серопоз. 0,491 0,292-0,825 100% 1,667 0,746-3,726 100%
7РГСК 95% ДИ % серопоз. 0,297 0,22-0,41 100% 0,774 0,48-1,25 100% 7РГСК 95% ДИ %серопоз. 10,467 5,979-18,324 100% 37,49* 21,944-64.051 100%
9УГСК 95% ДИ % серопоз. 2,098 1,575-2,793 100% 8,098* 6,507-10,078 100% 9УГСК 95% ДИ %серопоз. 5,459 3.105-9,589 100% 10,309 6,183-17,187 100%
14 ГСК 95% ДИ % серопоз. 4,983 3,742-6,834 100% 9,327* 7,669-11,344 100% 14 ГСК 95% ДИ %серопоз. 1,235 0,686-2,224 100% 4,358* 2,073-9,181 100%
18С ГСК 96% ДИ % серопоз. 0,469 0,32-0,69 100% 3,274* 2,67-4,01 100% 18С ГСК 95% ДИ %серопоз. 7,769 5,617-10,745 100% 15,933* 12,036-21,092 100%
19Р ГСК 95% ДИ % серопоз. 3,052 2,14-4,35 100% 21,274* 16,54-27,37 100% 19Р ГСК 95% ДИ %серолоз. 2,373 1,297-4,341 100% 8,744* 5,128-14,908 100%
23Р ГСК 95% ДИ % серопоз. 0,072 0,044-0,117 38% 1,209 0,457-3,2 71% 23Р ГСК 95% ДИ %серопоз. 5,621 3,289-9,608 100% 33,791* 20,838-54,797 100%
Повышенный иммунный ответ, направленный против большинства полисахаридов, конъюгированных с РО, наблюдали как у мышей, так и у морских свинок в препарате, содержащем два полисахарида, конъюгированных с ТТ (Р8 6В и 23Р) и ОТ (Р8 18С и 19Р) по сравнению с препаратом 11-У РО. Эти различия были статистически значимыми против Р8 1, 4, 5, 9У и 14, а также против Р8 1, 7Р и 14 у мышей и морских свинок соответственно.
- 47 020817
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ГлаксоСмитКлайн Байолоджикалс с.а.
<120> Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов 51гер1ососсиз рпеитотае <130>УВ62501 <160> 6 <170> РазШЕО для Ψίηύοννϊ Версия 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400> 1
1сса(§ас§11сс1§ас§й 20 <210>2 <211> 18 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400> 2 (стссса§с@ (§с§сса( 18 <210> 3 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400> 3 асс^атдасд 1с§сс§§1§а с§§сассас§ 30 <210>4 <211>24 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность
- 48 020817 <220 <223> Праймер <400> 4 (С£1С(ДШ §1с§Ш1§1 сц(1 24 <210>5 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400 5
1сса1§ас§1£сс1§а1§с1 20 <210>6 <211>22 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер <400> б
1с§асв1Й1 суйсцсесес сё 22

Claims (15)

1. Иммуногенная композиция для лечения или предупреждения заболевания, вызванного инфекцией 81гер1ососси5 рпеитошае, содержащая по меньшей мере 11 конъюгатов капсульных сахаридов 8. рпеитошае, представляющих собой капсульный сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, включающих конъюгаты капсульных сахаридов из серотипов 1, 4, 5, 6В, 7Е, 9У, 14, 18С, 23Е, 19А и 19Е, где 19А конъюгирован с первым бактериальным анатоксином, 19Е конъюгирован со вторым бактериальным анатоксином, 7 или 8 капсульных сахаридов 8. рпеитошае конъюгированы с белком Ό и где иммуногенная композиция содержит 3, 4, 5 или 6 белков-носителей, выбранных из следующего перечня: столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, СКМ197, пневмолизин и РЫО или их слитые белки.
2. Иммуногенная композиция по п.1, где первый бактериальный анатоксин представляет собой белок, отличный от второго бактериального анатоксина.
3. Иммуногенная композиция по п.1 или 2, где первый бактериальный анатоксин выбран из группы, состоящей из столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина, СКМ197, коклюшного анатоксина, бактериального цитолизина и пневмолизина.
4. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-3, где второй бактериальный анатоксин выбран из группы, состоящей из столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина, СКМ197, коклюшного анатоксина, бактериального цитолизина и пневмолизина.
5. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-4, содержащая конъюгат капсульного сахарида 8. рпеитошае серотипа 22Е.
6. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-5, содержащая конъюгат капсульного сахарида 3 8. рпеитошае.
7. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-6, содержащая конъюгат капсульного сахарида 6А
8. рпеитошае.
8. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-7, где 3 различных белка-носителя отдельно конъюгированы по меньшей мере с 3 различными капсульными сахаридами 8. рпеитошае различных серотипов.
9. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-8, дополнительно содержащая один или более чем один неконъюгированный или конъюгированный белок 8. рпеитошае.
10. Иммуногенная композиция по п.9, где указанный один или более чем один белок 8. рпеитошае выбран из семейства полигистидиновых триад (РН1Х), семейства белков, связывающих холин (СЬрХ), укороченных СЬрХ, семейства Бу1Х, укороченных ЬуЕХ, химерных белков укороченный СЬрХ - укороченный ЬуЕХ, детоксифицированного пневмолизина (Р1у), РкрА, РкаА, 8р128, 8р101, 8р130, 8р125 и 8р133.
11. Иммуногенная композиция по п.10, содержащая пневмолизин в виде свободного белка или белка-носителя.
12. Иммуногенная композиция по п.10, содержащая белок РЫХ в виде свободного белка или белканосителя.
13. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-12, дополнительно содержащая адъювант.
- 49 020817
14. Вакцина для лечения или предупреждения заболевания, вызванного инфекцией 81гер!ососсик рпеитошае, включающая иммуногенную композицию по любому из пп.1-13 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
15. Способ изготовления вакцины по п.14, включающий стадию смешивания иммуногенной композиции по любому из пп.1-13 с фармацевтически приемлемым эксципиентом.
Иммуногенность 11 -валентного конъюгата у пожилых макак-резусов
EA200901576A 2007-06-26 2008-06-24 Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae EA020817B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0712428A GB0712428D0 (en) 2007-06-26 2007-06-26 Vaccine
GB0712435A GB0712435D0 (en) 2007-06-26 2007-06-26 Vaccine
GB0712420A GB0712420D0 (en) 2007-06-26 2007-06-26 Vaccine
PCT/EP2008/057997 WO2009000824A2 (en) 2007-06-26 2008-06-24 Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA200901576A1 EA200901576A1 (ru) 2010-06-30
EA200901576A8 EA200901576A8 (ru) 2014-09-30
EA020817B1 true EA020817B1 (ru) 2015-02-27

Family

ID=39816570

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200901576A EA020817B1 (ru) 2007-06-26 2008-06-24 Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae
EA201391788A EA201391788A1 (ru) 2007-06-26 2008-06-24 Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae
EA200901578A EA200901578A1 (ru) 2007-06-26 2008-06-24 Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201391788A EA201391788A1 (ru) 2007-06-26 2008-06-24 Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae
EA200901578A EA200901578A1 (ru) 2007-06-26 2008-06-24 Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae

Country Status (20)

Country Link
US (3) US9610339B2 (ru)
EP (4) EP2687228B1 (ru)
JP (4) JP5476295B2 (ru)
KR (2) KR20100045445A (ru)
CN (3) CN101883583B (ru)
AU (2) AU2008267210B2 (ru)
BR (2) BRPI0813307C1 (ru)
CA (3) CA2690710C (ru)
CY (1) CY1116901T1 (ru)
DK (1) DK2167121T3 (ru)
EA (3) EA020817B1 (ru)
ES (2) ES2626662T3 (ru)
HR (1) HRP20151122T1 (ru)
HU (1) HUE026853T2 (ru)
MX (1) MX2009013949A (ru)
PL (1) PL2167121T3 (ru)
PT (1) PT2167121E (ru)
RS (1) RS54349B1 (ru)
SI (1) SI2167121T1 (ru)
WO (3) WO2009000825A2 (ru)

Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR122012003821B8 (pt) * 2000-06-29 2021-05-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa composição imunogênica multivalente, uso da mesma, e, processo para produzir a composição imunogênica
TWI445545B (zh) 2005-04-08 2014-07-21 Wyeth Corp 多價肺炎球菌多醣-蛋白質共軛物組合物
ES2750243T3 (es) 2005-06-27 2020-03-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composición de vacuna que comprende polisacáridos capsulares naturales conjugados de N. Meningitidis
CN101378779B (zh) 2005-12-22 2015-09-02 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 疫苗
HUE026853T2 (en) 2007-06-26 2016-08-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine containing Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
AU2009335824B2 (en) * 2008-12-18 2013-07-04 Wyeth Llc Method for controlling Streptococcus pneumoniae polysaccharide molecular weight using carbon
CA2757620C (en) 2009-04-30 2016-04-26 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pneumococcal vaccine and uses thereof
ES2670576T3 (es) 2009-09-03 2018-05-31 Pfizer Vaccines Llc Vacuna de PCSK9
CA2784447A1 (en) * 2009-12-22 2011-06-30 Sanofi Pasteur Limited Adjuvanted immunogenic compositions and related methods
TW201136603A (en) * 2010-02-09 2011-11-01 Merck Sharp & Amp Dohme Corp 15-valent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine composition
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
GB201003924D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
SI2569008T1 (sl) 2010-05-14 2020-02-28 Baxalta Incorporated Himere OSPA in njihova uporaba v cepivih
US20140004142A1 (en) 2011-03-02 2014-01-02 Pfizer Inc. Pcsk9 vaccine
EP3912619A1 (en) 2011-05-11 2021-11-24 Children's Medical Center Corporation Modified biotin-binding protein, fusion proteins thereof and applications
JP6048845B2 (ja) 2011-06-01 2016-12-21 シャモン ユニヴァーシティー ジフテリア毒素の無毒性突然変異体ｃｒｍ１９７又はその断片を含む融合タンパク質
WO2013078172A1 (en) * 2011-11-23 2013-05-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Tempo-mediated glycoconjugation of an immunogenic composition against campylobacter jejuni
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
CN102759618A (zh) * 2012-07-18 2012-10-31 成都欧林生物科技股份有限公司 用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法
WO2014045621A1 (ja) * 2012-09-19 2014-03-27 国立大学法人大阪大学 肺炎球菌表面タンパク質ａを含む肺炎球菌ワクチン
GB201218660D0 (en) 2012-10-17 2012-11-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
EP2908855B1 (en) * 2012-10-17 2017-06-28 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition comprising 1 or more streptococcus pneumoniae capsular saccharide conjugates and a protein component comprising protein e and/or pila fromhaemophilus influenzae .
KR20140075196A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
KR20140075201A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
PL3363806T3 (pl) 2012-12-20 2022-12-19 Pfizer Inc. Sposób glikokoniugacji
US11576958B2 (en) 2013-02-07 2023-02-14 Children's Medical Center Corporation Protein antigens that provide protection against pneumococcal colonization and/or disease
US11708411B2 (en) 2013-12-20 2023-07-25 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines
US11160855B2 (en) * 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
IL283554B (en) 2014-01-21 2022-08-01 Pfizer Capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae and their conjugates
MX2020001138A (es) 2014-01-21 2021-09-30 Pfizer Polisacaridos capsulares de streptococcus pneumoniae y conjugados de los mismos.
PE20161095A1 (es) 2014-01-21 2016-10-26 Pfizer Composiciones inmunogenicas que comprenden antigenos de sacaridos capsulares conjugados y uso de los mismos
CA2939416A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Pfizer Inc. Immunogenic glycoprotein conjugates
CN103893751B (zh) * 2014-03-26 2016-04-20 天津康希诺生物技术有限公司 一种肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗及其制备方法
WO2015183676A1 (en) * 2014-05-29 2015-12-03 Kapre Subhash V Synthetic peptides as carriers for conjugation with polysaccharides
EP3000820A1 (en) * 2014-09-26 2016-03-30 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Synthetic vaccines against Streptococcus pneumoniae serotype 8
EP3197907B1 (en) * 2014-09-26 2019-09-04 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Vaccines against streptococcus pneumoniae serotype 8
US9815886B2 (en) 2014-10-28 2017-11-14 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
CN104306965B (zh) * 2014-10-31 2017-05-10 康希诺生物股份公司 预防肺炎链球菌感染性疾病的免疫原性组合物及制备方法
ES2945312T3 (es) 2015-01-15 2023-06-30 Pfizer Composiciones inmunogénicas para su uso en vacunas antineumocócicas
IL297740A (en) * 2015-05-04 2022-12-01 Pfizer Protein-polysaccharide conjugates of group b streptococcus, methods for preparing the conjugates, immunogenic preparations containing conjugates and their uses
MX2017015985A (es) * 2015-06-08 2018-08-15 Serum Inst Of India Private Ltd Metodos para mejorar la adsorcion de conjugados de polisacarido-proteina y formulacion de vacuna multivalente obtenida con los mismos.
WO2016198170A1 (en) * 2015-06-08 2016-12-15 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Vaccines against streptococcus pneumoniae serotype 5
CA2989230A1 (en) * 2015-06-23 2016-12-29 Biological E Limited Multivalent pneumococcal conjugate vaccine
KR20230058726A (ko) 2015-07-21 2023-05-03 화이자 인코포레이티드 접합된 캡슐형 사카라이드 항원을 포함하는 면역원성 조성물, 그를 포함하는 키트 및 그의 용도
KR20210011083A (ko) * 2015-09-10 2021-01-29 인벤트프라이즈 엘엘씨 다가 vlp 접합체
GB201518684D0 (en) * 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2017085586A1 (en) 2015-11-20 2017-05-26 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
CN106110317A (zh) * 2016-06-30 2016-11-16 武汉博沃生物科技有限公司 肺炎球菌‑百白破联合疫苗
SG11201900794PA (en) 2016-08-05 2019-02-27 Sanofi Pasteur Inc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EA039427B1 (ru) * 2016-08-05 2022-01-26 Санофи Пастер Инк. Поливалентная пневмококковая полисахаридно-белковая конъюгатная композиция
UA126385C2 (uk) 2016-09-30 2022-09-28 Байолоджикал І Лімітед Композиції полівалентної пневмококової вакцини, що містять кон'югати полісахарид-білок
KR102083973B1 (ko) * 2016-10-28 2020-04-23 주식회사 엘지화학 향상된 IgG 역가를 갖는 다가면역원성 조성물 및 이의 용도
KR20240110660A (ko) 2016-12-30 2024-07-15 박사이트, 인코포레이티드 비자연 아미노산을 갖는 폴리펩타이드-항원 접합체
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
CN110198735A (zh) 2017-01-20 2019-09-03 辉瑞公司 用于肺炎球菌疫苗中的免疫原性组合物
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
CA3061709A1 (en) 2017-03-28 2018-10-04 The Children's Medical Center Corporation A multiple antigen presenting system (maps)-based staphylococcus aureus vaccine, immunogenic composition, and uses thereof
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
AU2018280272C1 (en) * 2017-06-10 2021-05-06 Inventprise, Inc. Multivalent conjugate vaccines with bivalent or multivalent conjugate polysaccharides that provide improved immunogenicity and avidity
KR20200041311A (ko) 2017-06-23 2020-04-21 노소코미얼 백신 코포레이션 면역원성 조성물
CN117982633A (zh) 2017-12-06 2024-05-07 默沙东有限责任公司 包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的组合物及其使用方法
CN108003225A (zh) * 2017-12-11 2018-05-08 北京北生研生物制品有限公司 一种破伤风类毒素的精制方法
JP7288451B2 (ja) 2018-02-05 2023-06-07 サノフィ パスツール インコーポレイティッド 多価肺炎球菌多糖体－タンパク質複合体組成物
MX2020008198A (es) 2018-02-05 2020-09-22 Sanofi Pasteur Inc Composicion del conjugado proteina-polisacarido multivalente neumococica.
CA3096358A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Sk Bioscience Co., Ltd. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide and immunogenic conjugate thereof
CN108524926B (zh) * 2018-06-29 2021-06-29 康希诺生物股份公司 一种多价肺炎球菌结合疫苗的制剂组合及其应用
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
TW202019470A (zh) 2018-09-12 2020-06-01 美商艾芬尼維克斯公司 多價肺炎球菌疫苗
CA3120926A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Biological E Limited Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine
WO2020121159A1 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Pfizer Inc. Immunogenic multiple hetero-antigen polysaccharide-protein conjugates and uses thereof
EP3897705A2 (en) 2018-12-19 2021-10-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
EP3952906A1 (en) 2019-04-10 2022-02-16 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
KR20220042378A (ko) 2019-07-31 2022-04-05 사노피 파스퇴르 인코포레이티드 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물 및 그 사용 방법
US20230000966A1 (en) 2019-11-01 2023-01-05 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CA3171864A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Pfizer Inc. Purification of saccharides
MX2022010350A (es) 2020-02-23 2022-09-19 Pfizer Composiciones de esquerichia coli y sus metodos.
CN111304816B (zh) 2020-02-24 2022-01-14 刘舞 一种牵拉机构
JP2023537945A (ja) 2020-08-10 2023-09-06 インベントプライズ・インコーポレイテッド 出現血清型２４ｆを含む多価肺炎球菌複合糖質ワクチン
US20230383324A1 (en) 2020-10-22 2023-11-30 Pfizer Inc. Methods for purifying bacterial polysaccharides
MX2023004912A (es) 2020-10-27 2023-05-16 Pfizer Composiciones de escherichia coli y metodos de las mismas.
KR20230097160A (ko) 2020-11-04 2023-06-30 화이자 인코포레이티드 폐렴구균 백신에 사용하기 위한 면역원성 조성물
US20220202923A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Pfizer Inc. E. coli fimh mutants and uses thereof
WO2022234416A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
WO2022234405A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Pfizer Inc. Vaccination against bacterial and betacoronavirus infections
EP4346893A2 (en) 2021-05-28 2024-04-10 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
MX2023013434A (es) 2021-05-28 2023-12-12 Pfizer Composiciones inmunogenas que comprenden antigenos de sacarido capsular conjugados y sus usos.
CN115721709A (zh) * 2021-08-27 2023-03-03 康希诺生物股份公司 一种肺炎球菌结合疫苗制备方法
KR20240099160A (ko) 2021-09-09 2024-06-28 아피니백스, 인크. 다가 폐렴구균 백신
AU2023207315A1 (en) 2022-01-13 2024-06-27 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2023161817A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Pfizer Inc. Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides
WO2023218322A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Pfizer Inc. Process for producing of vaccine formulations with preservatives
WO2024084397A1 (en) 2022-10-19 2024-04-25 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
WO2024110827A1 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Pfizer Inc. Methods for preparing conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
US20240181028A1 (en) 2022-11-22 2024-06-06 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024116096A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Pfizer Inc. Pneumococcal conjugate vaccine formulations
WO2024166008A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990006951A1 (en) * 1988-12-16 1990-06-28 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
WO2003028760A2 (en) * 2001-10-01 2003-04-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
WO2003051392A2 (en) * 2001-12-18 2003-06-26 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae vaccine
WO2006110381A1 (en) * 2005-04-08 2006-10-19 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
WO2007071710A2 (en) * 2005-12-22 2007-06-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates

Family Cites Families (158)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4057685A (en) 1972-02-02 1977-11-08 Abbott Laboratories Chemically modified endotoxin immunizing agent
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
DE3071552D1 (en) 1979-09-21 1986-05-22 Hitachi Ltd Semiconductor switch
BE889979A (fr) 1981-08-14 1982-02-15 Smith Kline Rit Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
US4459286A (en) 1983-01-31 1984-07-10 Merck & Co., Inc. Coupled H. influenzae type B vaccine
US4695624A (en) 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4808700A (en) 1984-07-09 1989-02-28 Praxis Biologics, Inc. Immunogenic conjugates of non-toxic E. coli LT-B enterotoxin subunit and capsular polymers
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
IT1187753B (it) 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
US4950740A (en) 1987-03-17 1990-08-21 Cetus Corporation Recombinant diphtheria vaccines
EP0362278A4 (en) 1987-06-05 1990-05-14 Us Health FACTORS OF AUTOCRINE MOTILITY IN THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER.
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5785973A (en) 1988-02-01 1998-07-28 Praxis Biologics, Inc. Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DE3841091A1 (de) 1988-12-07 1990-06-13 Behringwerke Ag Synthetische antigene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
EP0378881B1 (en) 1989-01-17 1993-06-09 ENIRICERCHE S.p.A. Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
ES2068989T3 (es) 1989-02-04 1995-05-01 Akzo Nobel Nv Tocoles como adyuvante en vacunas.
CA2017507C (en) 1989-05-25 1996-11-12 Gary Van Nest Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
FR2649012B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Emulsions multiphasiques injectables
FR2649013B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable
WO1991001146A1 (en) 1989-07-14 1991-02-07 Praxis Biologics, Inc. Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
ATE128628T1 (de) 1990-08-13 1995-10-15 American Cyanamid Co Faser-hemagglutinin von bordetella pertussis als träger für konjugierten impfstoff.
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
CA2059693C (en) 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
CA2059692C (en) 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
CA2104014C (en) 1991-02-15 2000-05-02 David E. Briles Structural gene of pneumococcal protein
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
GB9105992D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
DE69333107T2 (de) 1992-02-11 2004-01-29 Jackson H M Found Military Med Dualer träger für immunogene konstrukte
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
MA22842A1 (fr) 1992-03-27 1993-10-01 Smithkline Beecham Biolog Procede de preparation de compositions de vaccin.
WO1993021769A1 (en) 1992-05-06 1993-11-11 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin receptor-binding region
WO1993025210A1 (en) 1992-06-18 1993-12-23 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines
CZ282235B6 (cs) 1992-06-25 1997-06-11 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Očkovací prostředek, jeho použití k výrobě vakcíny, způsob léčby patogenních infekcí tímto prostředkem a způsob jeho výroby
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
GB9224584D0 (en) 1992-11-23 1993-01-13 Connaught Lab Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases
AU685443B2 (en) 1993-03-23 1998-01-22 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Vaccine compositions containing 3-O deacylated monophosphoryl lipid A
ES2185658T3 (es) 1993-05-18 2003-05-01 Univ Ohio State Res Found Vacuna para la otitis media.
DE122009000058I1 (de) 1993-09-22 2009-12-31 Jackson H M Found Military Med Verfahren zur aktivierung von löslichem kohlenhydraten durch verwendung von neuen cyanylierungsreagenzien, zur herstellung von immunogenischen konstrukten
JP3967769B2 (ja) 1993-11-17 2007-08-29 オーエム・ファルマ グルコサミンジサッカライド、それらの製造法、それらを含む医薬組成物およびそれらの使用
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
US6455673B1 (en) 1994-06-08 2002-09-24 President And Fellows Of Harvard College Multi-mutant diphtheria toxin vaccines
ATE328890T1 (de) 1994-07-15 2006-06-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
ES2200059T3 (es) 1995-03-22 2004-03-01 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Produccion de construcciones inmunogenicas usando carbohidratos solubles activados mediante reactivos cianilados organicos.
GB9620795D0 (en) 1996-10-05 1996-11-20 Smithkline Beecham Plc Vaccines
UA56132C2 (ru) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиция вакцины (варианты), способ стабилизации qs21 по отношению к гидролизу (варианты), способ приготовления вакцины
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5695768A (en) 1995-06-07 1997-12-09 Alberta Research Council Immunostimulating activity of Streptococcus pneumoniae serotype 8 oligosaccharides
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
JP2000511411A (ja) 1996-05-01 2000-09-05 ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ 抗―肺炎球菌ワクチン用のコリン結合タンパク質
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
ZA975326B (en) 1996-06-18 1998-01-14 Alza Corp Device and method for enhancing transdermal flux of agents being delivered or sampled.
WO1998006734A1 (en) 1996-08-16 1998-02-19 Smithkline Beecham Corporation Novel prokaryotic polynucleotides, polypeptides and their uses
EP1400592A1 (en) 1996-10-31 2004-03-24 Human Genome Sciences, Inc. Streptococcus pneumoniae polynucleotides and sequences
AU5355398A (en) 1996-11-12 1998-06-03 Regents Of The University Of Minnesota C3 binding protein of (streptococcus pneumoniae)
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
CA2271167C (en) 1996-12-20 2007-01-09 Alza Corporation Device and method for enhancing transdermal agent flux
DE19708537A1 (de) 1997-03-03 1998-09-10 Biotechnolog Forschung Gmbh Neues Oberflächenprotein (SpsA-Protein) von Streptococcus pneumoniae etc.
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US6303347B1 (en) 1997-05-08 2001-10-16 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6764840B2 (en) 1997-05-08 2004-07-20 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
FR2763244B1 (fr) 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
JP2001502925A (ja) 1997-06-03 2001-03-06 コノート ラボラトリーズ リミテッド モラクセラのラクトフェリン受容体遺伝子
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
JP2001510031A (ja) 1997-07-21 2001-07-31 ノース・アメリカン・ヴァクシン・インコーポレーテッド ワクチンとしての修飾された免疫原ニューモリシン組成物
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
DE69838992T2 (de) 1997-09-05 2008-12-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A., Rixensart Öl-in-Wasser Emulsionen mit Saponinen
US6224880B1 (en) 1997-09-24 2001-05-01 Merck & Co., Inc. Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines
BR9812525A (pt) 1997-09-24 2000-07-25 Univ Minnesota Proteinase degradadora de complemento humano c3 de streptococcus pneumoniae
US5965714A (en) 1997-10-02 1999-10-12 Connaught Laboratories, Inc. Method for the covalent attachment of polysaccharides to protein molecules
CN1285753A (zh) 1997-12-02 2001-02-28 鲍德杰克特疫苗公司 透皮给药微粒疫苗组合物
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
US7018637B2 (en) 1998-02-23 2006-03-28 Aventis Pasteur, Inc Multi-oligosaccharide glycoconjugate bacterial meningitis vaccines
CA2325340A1 (en) 1998-04-07 1999-10-14 Medimmune, Inc. Derivatives of pneumococcal choline binding proteins for vaccines
BR9909910A (pt) 1998-04-07 2002-01-15 St Jude Childrens Res Hospital Polipeptìdeo compreendendo o aminoácido de um truncado de proteìna a de ligação à colina de terminal n, vacina derivada dele e seus empregos
CA2328399A1 (en) 1998-04-23 1999-10-28 University Of Alabama At Birmingham Pneumococcal surface protein c(pspc), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
WO1999064301A1 (fr) 1998-06-08 1999-12-16 Sca Emballage France Emballage a remise a plat rapide
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EE04489B1 (et) 1998-06-30 2005-06-15 Om Pharma Atsüülpseudodipeptiidid, nende valmistamise meetod ja neid sisaldavad farmatseutilised kompositsioonid
CA2340692A1 (en) 1998-08-19 2000-03-02 North American Vaccine, Inc. Immunogenic .beta.-propionamido-linked polysaccharide protein conjugate useful as a vaccine produced using an n-acryloylated polysaccharide
GB9818548D0 (en) 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
WO2000017370A1 (en) 1998-09-24 2000-03-30 Regents Of The University Of Minnesota HUMAN COMPLEMENT C3-DEGRADING POLYPEPTIDE FROM $i(STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE)
US6541616B1 (en) 1998-10-01 2003-04-01 Antex Biologics Inc. Moraxella catarrhalis protein, gene sequence and uses thereof
SI1126876T1 (sl) 1998-10-16 2007-08-31 Glaxosmithkline Biolog Sa Adjuvantni sistemi in vakcine
GB2359228A (en) 1998-11-17 2001-08-15 Schlumberger Technology Corp Transmitting information over a communication link
WO2000029434A2 (en) 1998-11-19 2000-05-25 St. Jude Children's Research Hospital PNEUMOCOCCAL CHOLINE BINDING PROTEINS, CbpG AND CbpD, DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USES THEREOF
PT1140157E (pt) 1998-12-21 2009-05-06 Medimmune Inc Proteínas de streptococcus pneumoniae e fragmentos imunogénicos para vacinas
CN100398653C (zh) 1998-12-23 2008-07-02 益得生物医学公司 新颖的链球菌抗原
DE60038166T2 (de) 1999-03-19 2009-03-12 Glaxosmithkline Biologicals S.A., Rixensart Impfstoff gegen bakterielle antigene
WO2000061761A2 (en) 1999-04-09 2000-10-19 Techlab, Inc. Recombinant clostridium toxin a protein carrier for polysaccharide conjugate vaccines
HU229255B1 (en) 1999-04-19 2013-10-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US6558670B1 (en) 1999-04-19 2003-05-06 Smithkline Beechman Biologicals S.A. Vaccine adjuvants
WO2000076540A2 (en) 1999-06-10 2000-12-21 Med Immune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and vaccines
US6319224B1 (en) 1999-08-20 2001-11-20 Bioject Medical Technologies Inc. Intradermal injection system for injecting DNA-based injectables into humans
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
US20040191834A1 (en) * 1999-10-28 2004-09-30 Laferriere Craig Antony Joseph Novel method
WO2001046127A1 (fr) 1999-12-22 2001-06-28 Om Pharma Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise
FR2806304B1 (fr) 2000-03-17 2002-05-10 Aventis Pasteur Conjugues polysaccharidiques du pneumocoque a usage vaccinal contre le tetanos et la diphterie
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
CN101260149B (zh) 2000-06-20 2016-05-11 魁北克益得生物医学公司 链球菌抗原
BR122012003821B8 (pt) 2000-06-29 2021-05-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa composição imunogênica multivalente, uso da mesma, e, processo para produzir a composição imunogênica
GB0108364D0 (en) 2001-04-03 2001-05-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine composition
GB0103170D0 (en) 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
EP1311522B1 (en) 2000-08-04 2006-03-22 Corixa Corporation New immunoeffector compounds
GB0022742D0 (en) 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1322656B1 (en) 2000-09-26 2008-01-16 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
WO2002078673A1 (fr) 2001-03-29 2002-10-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de production d'un medicament sous forme de granules fins
AU2002309706A1 (en) 2001-05-11 2002-11-25 Aventis Pasteur, Inc. Novel meningitis conjugate vaccine
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
US7262024B2 (en) 2001-12-20 2007-08-28 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
DE60234386D1 (de) 2002-02-04 2009-12-24 Corixa Corp Neue immuneffektor-verbindungen
TWI360424B (en) 2002-08-02 2012-03-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
AU2004219910B2 (en) 2003-03-13 2010-06-17 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Purification process for bacterial cytolysin
WO2004083251A2 (en) 2003-03-17 2004-09-30 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
GB0408977D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
RU2379052C2 (ru) 2004-04-30 2010-01-20 Чирон С.Р.Л. Вакцинация менингококковыми конъюгатами
CA2566409C (en) 2004-05-11 2012-12-04 Liana Juliana Josephine Steeghs Neisseria meningitidis igtb lipo-oligo-saccharides as adjuvant
GB0421083D0 (en) 2004-09-22 2004-10-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Purification process
ES2750243T3 (es) * 2005-06-27 2020-03-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composición de vacuna que comprende polisacáridos capsulares naturales conjugados de N. Meningitidis
WO2007026249A2 (en) * 2005-09-01 2007-03-08 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co Kg Multiple vaccination including serogroup c meningococcus
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
GB0607088D0 (en) * 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
HUE026853T2 (en) 2007-06-26 2016-08-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine containing Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990006951A1 (en) * 1988-12-16 1990-06-28 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
WO2003028760A2 (en) * 2001-10-01 2003-04-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
WO2003051392A2 (en) * 2001-12-18 2003-06-26 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae vaccine
WO2006110381A1 (en) * 2005-04-08 2006-10-19 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
WO2007071710A2 (en) * 2005-12-22 2007-06-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
EA200901578A1 (ru) 2010-08-30
RS54349B1 (en) 2016-02-29
BRPI0813307C1 (pt) 2021-05-25
WO2009000824A3 (en) 2009-03-05
CN101784282B (zh) 2015-07-08
BRPI0813307A2 (pt) 2014-12-23
WO2009000824A2 (en) 2008-12-31
WO2009000825A2 (en) 2008-12-31
PT2167121E (pt) 2015-12-02
WO2009000826A1 (en) 2008-12-31
EP2687228A3 (en) 2014-04-30
CA2690710A1 (en) 2008-12-31
EP2167120A2 (en) 2010-03-31
CA2690710C (en) 2016-10-18
EA200901576A1 (ru) 2010-06-30
HUE026853T2 (en) 2016-08-29
BRPI0813644B8 (pt) 2021-05-25
EP2170379B1 (en) 2017-03-22
EP2687228A2 (en) 2014-01-22
EP2167121B1 (en) 2015-09-02
US20100183662A1 (en) 2010-07-22
JP2014139192A (ja) 2014-07-31
EP2687228B1 (en) 2017-07-19
SI2167121T1 (sl) 2015-12-31
CN104873965B (zh) 2018-09-11
CN101883583B (zh) 2017-05-17
CA2690708A1 (en) 2008-12-31
US20100209450A1 (en) 2010-08-19
US9610340B2 (en) 2017-04-04
AU2008267208A1 (en) 2008-12-31
EA200901576A8 (ru) 2014-09-30
CN101883583A (zh) 2010-11-10
MX2009013949A (es) 2010-05-24
AU2008267210B2 (en) 2012-01-19
CA2690707A1 (en) 2008-12-31
US20100239604A1 (en) 2010-09-23
AU2008267208B2 (en) 2012-01-19
EP2170379A2 (en) 2010-04-07
EP2167121A1 (en) 2010-03-31
DK2167121T3 (en) 2015-11-23
EA201391788A1 (ru) 2014-08-29
JP2010531330A (ja) 2010-09-24
BRPI0813644B1 (pt) 2020-03-10
WO2009000825A3 (en) 2009-06-25
JP5489993B2 (ja) 2014-05-14
BRPI0813644A2 (pt) 2014-12-23
CN104873965A (zh) 2015-09-02
JP5476295B2 (ja) 2014-04-23
ES2552366T3 (es) 2015-11-27
JP5848790B2 (ja) 2016-01-27
CN101784282A (zh) 2010-07-21
KR20100045445A (ko) 2010-05-03
BRPI0813307B8 (pt) 2020-02-04
PL2167121T3 (pl) 2016-01-29
AU2008267210A1 (en) 2008-12-31
US9610339B2 (en) 2017-04-04
JP2010531331A (ja) 2010-09-24
JP2010531329A (ja) 2010-09-24
KR20100045446A (ko) 2010-05-03
KR101579947B1 (ko) 2015-12-28
BRPI0813307B1 (pt) 2020-01-21
HRP20151122T1 (hr) 2015-11-20
CY1116901T1 (el) 2017-04-05
ES2626662T3 (es) 2017-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA020817B1 (ru) Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae
KR101367237B1 (ko) 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 다당류 컨쥬게이트를 포함하는 백신
CN108348592B (zh) 疫苗
EA015551B1 (ru) Конъюгатные вакцины

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM TJ

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AZ BY KZ KG MD TM RU