CN108348592B

CN108348592B - 疫苗

Info

Publication number: CN108348592B
Application number: CN201680061235.9A
Authority: CN
Inventors: E.M.M.贝尔托; R.L.比曼斯; N.J.B.莫尼奥特; L.B.J.斯特罗迪奥特
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2015-10-21
Filing date: 2016-10-19
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2036-10-19
Also published as: GB201518684D0; US20240131136A1; BR112018007812A2; CN108348592A; WO2017067962A1; EP3365002A1; JP2018531315A; CA3002421A1; BE1024465B1; BE1024465A1; MX2018004939A; US11844828B2; US20180303923A1; JP6938487B2

Abstract

本发明属于肺炎球菌荚膜糖缀合物疫苗领域。具体地，本发明涉及大小分级的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖，特别是这样的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖，其具有100‑1000 kDa的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖的平均大小（例如M_W），且合适地缀合至载体蛋白。

Description

疫苗

发明领域

本发明涉及大小降低的肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）血清型6A荚膜多糖，特别是具有100-1000、110-750、150-500、180-600、210-490、210-450、180-400、210-400、210-370、220-360、230-350、240-340、240-320、240-310或250-310 kDa之间的平均大小(例如Mw)的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖。其另外涉及与载体蛋白缀合的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖、免疫组合物、疫苗和用于制备大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖的方法。其还涉及本发明的免疫组合物和疫苗在治疗中的用途和针对肺炎链球菌感染进行免疫的方法。

发明背景

肺炎链球菌 (S. pneumoniae)是与相当高的致病率和致死率（尤其在婴儿和老年人中）有关的革兰氏阳性细菌，其导致侵入性疾病诸如菌血症和脑膜炎、肺炎以及其他非侵入性疾病诸如急性中耳炎。约800,000名儿童每年由于肺炎球菌疾病而死亡，特别是在新兴国家中(O-Brien等人2009 Lancet 374:893-902)。抗生素抗性菌株的数目渐增(Linares等人2010 Cin.Microbiol.Infect.16:402-410)和肺炎球菌疾病的严重性使得接种成为最有效的干预。

由肺炎链球菌引起的主要临床症状是广为认可且在所有标注医学教科书中讨论(Fedson DS, Muscher DM.In:Plotkin SA, Orenstein WA, editors.Vaccines.第四版Philadelphia WB Saunders Co, 2004a:529-588)。例如，将侵袭性肺炎球菌疾病（IPD）定义为其中从血液或另一通常无菌部位中分离到肺炎链球菌的任何感染(Musher DM.Streptococcus pneumoniae.In Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (编辑).Principles and Practice of Infectious diseases (第5版).New York, ChurchillLivingstone, 2001, 第2128-2147页)。慢性阻塞性肺病（COPD）公认为涵盖通常共存的几种病况（气道阻塞、慢性支气管炎、毛细支气管炎或小气道疾病和肺气肿）(Wilson等人,Eur.Respir.J. 2001; 17:995-1007)。患者遭受其病况恶化，通常伴有呼吸急促增加，并且经常咳嗽增加，这可能产生粘液和脓痰(Wilson, Eur Respir J 2001 17:995-1007)。COPD通过患有慢性支气管炎和/或肺气肿的患者中存在不可逆或部分可逆的气道阻塞来生理学上定义(Standards for the diagnosis and care of patients with chronicobstructive pulmonary disease.American Thoracic Society.Am J Respir Crit CareMed.1995 Nov;152(5 Pt 2):S77-121)。COPD的恶化通常由细菌性(例如肺炎球菌) 感染而导致(Sethi S, Murphy TF.Bacterial infection in chronic obstructive pulmonarydisease in 2000: a state-of-the-art review.Clin Microbiol Rev. 2001 Apr;14(2):336-63)。

肺炎球菌由化学连接的多糖荚膜化，其赋予血清型特异性。存在超过90种已知的肺炎球菌血清型，并且荚膜是肺炎球菌主要致病力决定因素，这是由于荚膜不仅保护细菌内表面免受补体，而且其自身还是弱免疫原性的。抗多糖抗体水平已经被认为是预测针对侵入性肺炎球菌疾病的保护(Jodar等人Vaccine, (21) 2003, 第3264-3272页)。在含有血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F (PCV7)的7价缀合物疫苗初始许可后，设计用于扩大覆盖的两种肺炎球菌缀合物疫苗（PCV）已经获得许可。10价肺炎球菌流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae ）蛋白D缀合物疫苗(PCV10)含有缀合至不可分型的流感嗜血杆菌蛋白D的血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F，以及缀合至破伤风类毒素的血清型18C和缀合至白喉类毒素的血清型19F。13价肺炎球菌缀合物疫苗（PCV13）含有PCV7 (4、6B、9V、14、18C、19F、23F)血清型以及血清型1、3、4、6A、7F和19A，其缀合至交叉反应物质CRM197。

本发明的目标是开发改进的肺炎球菌多糖疫苗和改进的肺炎球菌多糖缀合物疫苗。

肺炎链球菌血清群6隔离群，包括血清型6A、6B、6C和6D的隔离群是重要的，因为它们通常在感染中发现(Song等人JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2011,第1758–1764页)。WO2009/000826A2公开了缀合至蛋白D具有大小1100-1540 (Da x 10³)的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖和缀合至蛋白D具有大小1069-1391 (Da x 10³)的肺炎链球菌血清型6B荚膜多糖(参见WO2009/000826A2的表2)。描述于WO2009/000826A2的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖和肺炎链球菌血清型6B荚膜多糖都是天然多糖。血清型6A和6B的化学结构区别仅在于鼠李糖和核糖醇单元之间的连接。由于多糖6A的结构与多糖6B非常相似，因此最初认为天然PS6A（多糖6A）应该用于缀合，因为天然PS6B（多糖6B）用于缀合。在FinIP试验中，含有缀合至蛋白D的6B的PHiD-CV10被证实针对血清型6B是有效的(Palmu等人Lancet2013; 381:214-22)。然而，令人惊奇地，本发明提供了具有改进特性的大小降低的肺炎链球菌6A多糖。本发明人已经发现通过使用具有特定大小的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖（PS6A），可以获得具有高免疫原性且可过滤的缀合物。

附图简述：

图1 在共施用InfanrixTM Hexa的Balb/c小鼠模型中在14价(14V) AlPO4制剂中评价PS6A缀合物。ELISA 抗-PS6A。

图2(A) 在Balb/c小鼠模型ELISA结果中的PS6A-CRM197的免疫原性。

图2(B) 在Balb/c小鼠模型OPA结果中PS6A-CRM197的免疫原性。

图3(A) PS6A-CRM197 ELISA结果的评价。

图3(B) PS6A-CRM197 OPA结果的评价。

发明描述

本发明提供大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖。在一方面，本发明提供肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌血清型6A多糖的平均大小(Mw)在100-1000、110-750、150-500、180-600、210-490、210-450、180-400、210-400、210-370、220-360、230-350、240-340、240-320、240-310或250-310 kDa之间。

术语“多糖”在整个说明书中指由通过糖苷键连接在一起的糖的链构成的复杂碳水化合物。多糖可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50或更多个糖。

为了本发明的目的，“天然多糖”指还未经受加工（例如后纯化）的多糖，所述加工目的是降低多糖的大小。多糖可以在正常纯化程序过程中或者在缀合过程中通过降解而在大小上略微降低。这样的糖仍然是天然的。只有当多糖经受大小降低(sizing)技术时，多糖才不被认为是天然的。

为了本发明的目的，“大小降低的多糖”指已经受加工（例如后纯化）的多糖，所述加工目的是降低多糖的大小。多糖可以通过机械或化学大小降低技术而被大小降低。可采用的机械大小降低技术包括高压技术（诸如微流化、Emulsiflex^TM、高压均化或Gaulin均化）和超声处理。可采用的化学大小降低技术包括酸水解（例如用乙酸处理）或用高碘酸处理。术语“高碘酸(periodate)”包括高碘酸盐(periodate)和高碘酸(periodic acid)；该术语也包括偏高碘酸(IO₄ ^-)和原高碘酸(IO₆ ^5-)以及高碘酸的各种盐（例如高碘酸钠和高碘酸钾）。本文所述的分子量范围指缀合前（例如，在其中进行活化的活化之前）经纯化的多糖。

为了本发明的目的，“以最高x2的系数大小降低”意指糖经受这样的加工，所述加工旨在降低糖的大小，但保留大小超过天然多糖大小的一半。术语诸如“以最高x3、x4等的系数大小降低”应以同样方式解释，即糖经受这样的加工，所述加工旨在降低多糖的大小，但保留大小分别超过天然多糖大小的三分之一、四分之一等。

如本文所用的术语多糖的“分子量”或“平均分子量”或“平均大小”指在缀合前测量的通过MALLS（多角度激光散射）测量的多糖的重均分子量(M_w)。

MALLS技术是本领域已知的且通常如下文所述进行。对于肺炎球菌多糖的MALLS分析，可以将两种柱(TSKG6000和5000PWxl)组合使用并且将多糖在0.2M NaCl中洗脱。使用光散射检测器(例如装备有488nm处的10mW氩激光器的Wyatt Dawn DSP (Digital SignalProcessing))和干涉折射计(例如装备有P100小室和在498nm处的红色滤镜的WyattOtilab DSP (Digital Signal Processing))检测多糖。

激光散射检测器测量通过大分子溶液以16个角度散射的光强，并且另一方面，在线安装的干涉折射计允许测定洗脱样品的量。从这些强度，可以测定溶液中大分子的大小和形状。

将以重量计的平均分子量(M_w)定义为所有种类的重量乘以其各自分子量之和除以所有种类的重量之和。

a) 重均分子量：-M_w-

b) 数均分子量:-M_n-

c) 均方根半径:-Rw- 和 r²w为通过以下定义的平方半径：

(-m_i- 为散射中心i的质量，且-r_i- 为

散射中心i和大分子的重力中心之间的距离)。

d) 多分散性定义为比率 -M_w/M_n-。

如本文所用，术语"治疗(treatment)" (包括其变体例如"治疗(treat)"或"治疗(treated)")意指以下中的任一种或多种：(i) 预防个体中的感染或再感染，如在传统疫苗中，（ii）降低个体中症状的严重性或消除个体中的症状，（iii）延迟个体中症状的复发和（iii）实质上或完全消除个体中所讨论的病原体或病症。因此，治疗可以是预防性（在感染前）或治疗性（感染后）起效的。

为了本发明的目的，“治疗或预防COPD的恶化”或“降低COPD恶化的严重性”指降低COPD恶化的发生或速率（例如，以0.1、0.5、1、2、5、10、20%或更多的速率降低）或降低COPD恶化的严重性（例如气流阻塞、慢性支气管炎、毛细支气管炎或小气道疾病和肺气肿），例如在用本发明的免疫原性组合物或疫苗免疫的患者群组中。

大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖

肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖可以通过机械或化学大小降低技术而被大小降低。在一个实施方案中，通过化学大小降低技术将本发明的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖大小降低。可采用的化学大小降低技术包括用乙酸处理或用高碘酸处理。在一个方面，通过用高碘酸处理将本发明的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖大小降低。术语“高碘酸(periodate)”包括高碘酸盐(periodate)和高碘酸(periodic acid)；该术语也包括偏高碘酸(IO₄ ^-)和原高碘酸(IO6^5-)以及高碘酸的各种盐（例如高碘酸钠和高碘酸钾）。在另一个方面，通过用乙酸处理将本发明的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖大小降低。在一个实施方案中，通过机械大小降低技术（例如使用高压技术）将本发明的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖大小降低。高压技术包括微流化、高压均化或Gaulin均化。在一个方面，通过高压均化将本发明的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖大小降低。高压均化通过将工艺物料流泵送经过具有足够小尺寸的流道而实现高剪切速率。通过使用更大的施加的均化压力来增加剪切速率，并且通过将进料流再循环经过均化器来增加暴露时间。高压均化技术描述于Cho等人(Int. J. Mol.Sci.2014, 15)。在本发明的另一个方面，通过Gaulin均化将本发明的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖大小降低。Gaulin均化可以使用描述于以下的技术来进行：Lander等人Biotechnol.Prog.2000, 16, 80-85).在另一方面，通过微流化将本发明的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖大小降低（例如，如下文实施例中所述）。

大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖具有100-1000、110-750、150-500、180-600、210-490、210-450、180-400、210-400、210-370、220-360、230-350、240-340、240-320、240-310或250-310 kDa之间的平均大小(M_w)。大小降低通过不超过x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3或x2的系数。例如，大小降低可以为x2-x6、x2-x5、x2-x4或x3-x6、x3-x5或x3-x4的系数。在一个方面，通过不超过x5的系数将本发明的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖大小降低。本文所述的分子量范围指缀合前（例如，在其中进行活化的活化之前）经纯化的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖的分子量。

在一个实施方案中，本发明的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖是抗原性的（如通过ELISA所测定），例如具有70 -200 %、优选90%-150% (例如120-144%)的抗原性指数。如下文实施例中所解释的，相对于天然肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖（其指定为100%的抗原性指数（下表中也表示为1.0））测量抗原性指数。

缀合的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖

适合地，将本发明的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合至载体蛋白。载体蛋白可以选自TT（破伤风类毒素）、DT（白喉类毒素）、CRM197、TT的片段C、PhtD（肺炎球菌组蛋白三联体蛋白D）、PhtDE融合体（PhtD和PhtE（肺炎球菌组氨酸蛋白E）的融合体，特别是WO 01/98334和WO 03/54007中描述的那些）、脱毒的肺炎球菌溶血素和蛋白D。在本发明的一个方面，将大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合至选自以下的载体蛋白：TT（破伤风类毒素）、DT（白喉类毒素）、CRM197、TT的片段C和PhtD（肺炎球菌组蛋白三联体蛋白D）。在本发明的另一个方面，将本发明的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合至DT或CRM197。在本发明的另一个方面，将本发明的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合至CRM197。

CRM197是白喉毒素的无毒形式，但与白喉毒素（DT）在免疫学上是无法区分的。白喉毒素的遗传脱毒的类似物包括CRM197和描述于US 4,709,017、US 5,843,711、US 5,601,827和US 5,917,017中的其他突变体。CRM197由通过非产毒相β197tox（通过产毒的棒状噬菌体b(carynephage b)的亚硝基胍诱变而产生）感染的白喉杆菌(C. diphtheriae)产生(Uchida 等人 Nature New Biology (1971) 233; 8-11)。CRM197蛋白具有与白喉毒素相同的分子量，但与其区别在于结构基因中的单碱基改变。这导致在位置52处氨基酸从甘氨酸改变为谷氨酰胺，使得片段A无法结合NAD且因而是无毒的(Pappenheimer 1977, AnnRev, Biochem.46; 69-94, Rappuoli Applied and Environmental Microbiology Sept1983 p560-564)。

TT的片段C是破伤风毒素重链的无毒羧基末端片段。破伤风毒素是大约150 kDa的单肽，其由1315个氨基酸残基组成。破伤风毒素通过木瓜蛋白酶切割产生两个片段；其中之一为片段C，大约50 kDa。TT的片段C进一步描述于Neubauer等人Biochim.Biophys.Acta 1981, 27, 141–148。

在一个实施方案中，本发明的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖经接头例如双官能接头（具有两个反应性末端）缀合至载体蛋白。接头任选是异双官能（任一末端具有不同的反应基团）或同双官能（间隔臂的任一末端具有相同的反应基团），例如，一个反应性氨基和一个反应性羧酸基团、2个反应性氨基或2个反应性羧酸基团。接头例如具有4-20、4-12、5-10个碳原子。可能的接头是ADH（己二酸二酰肼）。其他接头包括B-丙酰胺基(WO 00/10599)、硝基苯基-乙胺 (Gever 等人 (1979) Med.Microbiol.Immunol.165; 171-288)、卤代烷基卤化物(US4057685)、糖苷键(US4673574, US4808700)、己二胺和6-氨基己酸(US4459286)。在另一实施方案中，将本发明的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖直接缀合至载体蛋白。在一个方面，通过异脲连接将本发明的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖大小降低。异脲连接通过多糖上的氰酸酯和载体上的氨基之间的反应形成。本文提及“异脲连接”是指稳定的连接。

免疫原性组合物

在一个实施方案中，本发明提供包含本发明的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖（或缀合物）的免疫原性组合物。

通常，本发明的免疫原性组合物将包含荚膜多肽抗原（合适缀合的），其中所述多肽衍生自肺炎链球菌的至少十种血清型。肺炎链球菌荚膜多肽的数目范围可以从10种不同的血清型（或价“v”）至23种不同的血清型（23v，23价组合物）。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含来自不同肺炎链球菌血清型的10或更多种、11或更多种、12或更多种、13或更多种、14或更多种、15或更多种或15或更多种荚膜多糖。在一个实施方案中，存在10、11、12、13、14或15种不同的肺炎链球菌血清型。在另一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物可以包含缀合的肺炎链球菌多糖和未缀合的肺炎链球菌多糖。在一个实施方案中，糖血清型的总数少于或等于23。

在一个实施方案中，本发明的多价肺炎球菌疫苗将包含选自以下血清型的多糖（合适缀合的）：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、15C、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，尽管应理解取决于接受疫苗的受体年龄和疫苗将施用的地理位置，一种或两种其他血清型可以进行替换。在一个实施方案中，疫苗可以是11价疫苗。例如，11价疫苗可以包含来自血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的多糖。在一个实施方案中，疫苗可以是12价或13价疫苗。12或13价儿科（婴儿）疫苗还可以包括补充有血清型19A、或22F、或15、或19A和22F、或19A和15、或22F和15的11价制剂，而13价老年人疫苗可以包括补充有血清型19A和22F、8和12F、或8和15、或8和19A、或8和22F、或12F和15、或12F和19A、或12F和22F、或15和19A、或15和22F的11价制剂。在一个实施方案中，疫苗可以是14价或15价疫苗。14或15价儿科疫苗可以包括补充有血清型3、19A和22F；血清型8、19A和22F；血清型12F、19A和22F；血清型15、19A和22F；血清型3、8、19A和22F；血清型3、12F、19A和22F；血清型3、15、19A和22F的上述11价制剂。在一个实施方案中，疫苗可以是16价疫苗。16价疫苗可以包括补充有血清型3、15B、19A、22F和23F的上述11价制剂。16价疫苗可以包括补充有血清型3、15B、19A、22F和33F的上述11价制剂。在一个实施方案中，疫苗可以是19价疫苗。19价疫苗可以包括补充有血清型8、10A、11A、12F、15B、19A、22F和23F的上述11价制剂。19价疫苗可以包括补充有血清型8、10A、11A、12F、15B、19A、22F和33F的上述11价制剂。在一个实施方案中，疫苗可以是20价疫苗。20价疫苗可以包括补充有血清型3、8、10A、11A、12F、15B、19A、22F和23F的上述11价制剂。20价疫苗可以包括补充有血清型3、8、10A、11A、12F、15B、19A、22F和33F的上述11价制剂。在一个实施方案中，疫苗可以是21价疫苗。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含衍生自血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F（合适缀合的）的荚膜多糖。在本发明的进一步的实施方案中，包括至少12种糖抗原（合适缀合的），例如，衍生自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的荚膜多糖。在本发明的进一步的实施方案中，包括至少12种糖抗原（合适缀合的），例如，衍生自血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜多糖。在本发明的进一步的实施方案中，包括至少13种多肽抗原（合适缀合的），例如疫苗可以包含衍生自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的荚膜多糖，尽管其他糖抗原例如23价（诸如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F）也在本发明考虑之内。在本发明的进一步的实施方案中，包括至少15种糖抗原（合适缀合的），例如，衍生自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的荚膜多糖。在本发明的进一步的实施方案中，包括至少15种糖抗原（合适缀合的），例如，衍生自血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的荚膜多糖。在本发明的进一步的实施方案中，包括至少16种糖抗原（合适缀合的），例如，衍生自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的荚膜多糖。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含肺炎链球菌的血清型33F的（缀合的）荚膜（多）糖。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含肺炎链球菌的血清型15C的（缀合的）荚膜（多）糖。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含肺炎链球菌的血清型12F的（缀合的）荚膜（多）糖。在一个实施方案中，存在10至23种不同的肺炎链球菌荚膜多肽血清型（合适缀合的）。

载体蛋白

可用于本发明中的载体蛋白的实例是DT（白喉类毒素）、TT（破伤风类毒素）或TT的片段C、DT、CRM197、其他DT点突变体，诸如CRM176、CRM228、CRM45 (Uchida 等人 J.Biol.Chem.218; 3838-3844, 1973)；CRM 9、CRM 45、CRM102、CRM 103 和CRM107和由Nicholls和Youle于Genetically Engineered Toxins, 编辑:Frankel, Maecel DekkerInc, 1992中描述的其他突变；Glu-148缺失或突变为Asp、Gln或Ser和/或Ala 158缺失或突变为Gly以及公开于US 4709017或US 4950740中的其他突变；至少一个或多个残基Lys516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突变以及公开于US 5917017或US 6455673的其他突变；或公开于US 5843711的DT的片段、肺炎球菌肺炎球菌溶血素(Kuo 等人 (1995) InfectImmun 63; 2706-13)包括以一些方式脱毒的肺炎球菌溶血素(Ply)，例如GMBS脱毒的肺炎球菌溶血素(dPly-GMBS) (WO 04081515、PCT/EP2005/010258)或甲醛脱毒的肺炎球菌溶血素(dPly-formol)、Pht (肺炎球菌组氨酸三联体)家族蛋白(PhtX)，包括PhtA, PhtB、PhtD、PhtE和Pht蛋白的融合体，例如PhtDE融合体、PhtBE融合体(WO 01/98334和WO 03/54007)、(Pht A-E下文更详细描述) OMPC (脑膜炎球菌外膜蛋白 – 通常提取自脑膜炎奈瑟球菌血清群B – EP0372501)、脑膜炎奈瑟球菌PorB、PD (流感嗜血杆菌D – 参见例如, EP 0 594610 B)、或其免疫功能等同物、合成肽(EP0378881、EP0427347)、热激蛋白(WO 93/17712、WO94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(WO 91/01146)、包含来自各种病原体衍生抗原的多种人CD4+ T细胞表位的人工蛋白(Falugi 等人 (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824)诸如N19蛋白(Baraldoi 等人(2004) Infect Immun 72; 4884-7)、肺炎球菌表面蛋白PspA (WO 02/091998)、铁摄取蛋白(WO 01/72337)、艰难梭菌的毒素A或B(WO 00/61761)。

在一个实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中，每一肺炎链球菌荚膜糖缀合至独立地选自DT、CRM 197、TT、TT的片段C、dPly (脱毒的肺炎球菌溶血素)、PhtA、PhtB、PhtD、PhtE、PhtDE OmpC、PorB和流感嗜血杆菌蛋白D的载体蛋白。在进一步的实施方案中，每一肺炎链球菌荚膜糖缀合至独立地选自TT、DT、CRM197、TT的片段C、PhtD、PhtDE融合体(特别是描述于WO 01/98334和WO 03/54007中的那些)、脱毒的肺炎球菌溶血素和蛋白D的载体蛋白。在进一步的实施方案中，每一肺炎链球菌荚膜糖缀合至独立地选自TT、DT、CRM197、PhtD、脱毒的肺炎球菌溶血素和蛋白D的载体蛋白。在进一步的实施方案中，每一肺炎链球菌荚膜糖缀合至独立地选自TT、DT、CRM197、PhtD和蛋白D的载体蛋白。在进一步的实施方案中，每一肺炎链球菌荚膜糖缀合至独立地选自TT、DT、CRM197和蛋白D的载体蛋白。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含两种或更多种不同的载体蛋白。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含2、3、4、5或6种不同的载体蛋白。每一类型的载体蛋白可以用作超过一种多糖的载体，所述多糖可以来自相同或不同的血清型。在一个实施方案中，两种或更多种不同多糖血清型可以缀合至相同的载体蛋白，或者缀合至载体蛋白的相同分子（载体分子具有2种或更多种不同的多糖血清型与其缀合）[参见例如WO 04/083251]或者缀合至相同载体蛋白的不同分子（蛋白载体的每一分子仅具有糖的一种血清型与其缀合）。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含来自流感嗜血杆菌的蛋白D（PD），例如，来自EP 0594610的图9（图9a和9b一起，364个氨基酸）的蛋白D序列(SEQ ID NO:1)。免疫原性组合物中包括该蛋白提供了针对流感嗜血杆菌相关的中耳炎的保护水平(Pyrmula 等人 Lancet 367; 740-748 (2006))。蛋白D可以作为全长蛋白或作为片段来使用（例如，蛋白D可以如WO0056360中所述）。例如，蛋白D序列可以包含描述于EP0594610的蛋白D片段（或由其组成），所述蛋白D片段开始于序列SSHSSNMANT (SerSerHisSerSerAsnMetAlaAsnThr)(SEQ ID NO.3)，并且缺乏EP0594610的图9的19个N末端氨基酸，任选地来自NS1的三肽MDP融合至所述蛋白D片段的N末端（384个氨基酸）(SEQ ID NO:2)。在一方面，蛋白D或蛋白D的片段是未脂化的。蛋白D可以作为游离蛋白或作为载体蛋白存在于免疫原性组合物中。在一方面，蛋白D作为游离蛋白存在于免疫原性组合物中。在另一方面，蛋白D作为载体蛋白且作为游离蛋白两者存在。在进一步的方面，蛋白D作为多糖的一种或多种的载体蛋白存在。在进一步的方面，选自不同血清型的2-9种荚膜多糖与蛋白D缀合。在进一步的方面，蛋白D作为大部分多糖的载体蛋白存在，例如，6、7、8、9或更多种多糖可以缀合至蛋白D。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含其中蛋白D是载体蛋白的2-8、2-7、2-6、2-5、3-5、4-5、2-4、2-3、3-4或2、3、4、5、6、7或8种荚膜糖血清型缀合物。例如，选自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的2-8、2-7、2-6、2-5、3-5、4-5、2-4、2-3、3-4或2、3、4、5、6、7或8种多糖缀合至蛋白D。例如，来自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F的多糖缀合至蛋白D。

在一个实施方案中，来自至少血清型1和3、1和4、1和5、1和6A、1和6B、1和7、1和9V、1和14、1和22F、1和23F、3和4、3和5、3和6A、3和6B、3和7F、3和9V、3和14、3和22F、3和23F、4和5、4和6A、4和6B、4和7F、4和9V、4和14、4和22F、4和23F、5和6A、5和6B、5和7F、5和9V、5和14、5和22F、5和23F、6A和6B、6A和7F、6A和9V、6A和14、6A和22F、6A和23F、6B和7F、6B和9V、6B和14、6B和22F、6B和23F、7F和9V、7F和14、7F和22F、7F和23F、9V和14、9V和22F、9V和23F、14和22F、14和23F或22F和23F的多糖缀合至蛋白D。

在一个实施方案中，来自至少血清型1、3和4；1、3和5；1、3和6A；1、3和6B；1、3和7F；1、3和9V；1、3和14；3、4和7F；3、4和5；3、4和7F；3、4和9V；3、4和14；4、5和7F；4、5和9V；4、5,和14；5、7F和9V；5、7F和14；7F、9V和14；1、3、4和5；3、4、5和7F；4、5、7F和9V；4、5、7F和14；4、5、9V和14；4、7F、9V和14；5、7F、9V和14；或4、5、7F、9V和14的多糖缀合至蛋白D。

例如，在10价肺炎链球菌免疫原性组合物中，来自不同血清型的2、3、4、5、6、7或8种荚膜多糖缀合至蛋白D。例如，在11价肺炎链球菌免疫原性组合物中，来自不同血清型的2、3、4、5、6、7或8种荚膜多糖缀合至蛋白D。例如，在12价肺炎链球菌免疫原性组合物中，来自不同血清型的2、3、4、5、6、7或8种荚膜多糖缀合至蛋白D。例如，在13价肺炎链球菌免疫原性组合物中，来自不同血清型的2、3、4、5、6、7或8种荚膜多糖缀合至蛋白D。例如，在14价肺炎链球菌免疫原性组合物中，来自不同血清型的2、3、4、5、6、7或8种荚膜多糖缀合至蛋白D。例如，在15价肺炎链球菌免疫原性组合物中，来自不同血清型的2、3、4、5、6、7或8种荚膜多糖缀合至蛋白D。例如，在16价肺炎链球菌免疫原性组合物中，来自不同血清型的2、3、4、5、6、7或8种荚膜多糖缀合至蛋白D。例如，在17价肺炎链球菌免疫原性组合物中，来自不同血清型的2、3、4、5、6、7或8种荚膜多糖缀合至蛋白D。例如，在18价肺炎链球菌免疫原性组合物中，来自不同血清型的2、3、4、5、6、7、8或9种荚膜多糖缀合至蛋白D。例如，在19价肺炎链球菌免疫原性组合物中，来自不同血清型的2、3、4、5、6、7、8或9种荚膜多糖缀合至蛋白D。任选地，缀合至蛋白D的血清型选自上述组。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含缀合至破伤风类毒素（TT）的至少一种荚膜糖。在另一个实施方案中，荚膜糖18C缀合至TT，任选地其中18C是组合物中缀合至破伤风类毒素（TT）的唯一的糖。

在本发明的一个方面中，血清型19F缀合至DT或CRM197。在另一方面，血清型19F缀合至DT。在一个方面，免疫原性组合物的其余糖血清型可以全部缀合至不是DT的一种或多种载体蛋白（即仅19F缀合至DT）。在一个实施方案中，19F缀合至DT或CRM197，并且其余血清型缀合至独立地选自PhtD、PD（蛋白D）、TT（破伤风类毒素）、DT（白喉类毒素）和CRM197的载体蛋白。在另一个实施方案中，19F缀合至DT或CRM197，并且其余血清型缀合至独立地选自PD、TT、DT和CRM197的载体蛋白。在进一步的实施方案中，19F缀合至DT或CRM197，并且其余血清型缀合至独立地选自PD、TT和CRM197的载体蛋白（例如，如描述于WO2007/071710A2和WO2007/071707A2）。

在一个实施方案中，本发明的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖和肺炎链球菌血清型6B荚膜多糖缀合至不同的载体蛋白。在进一步的实施方案中，本发明的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖直接缀合至CRM197。在进一步的实施方案中，存在肺炎链球菌血清型6B荚膜多糖，但不缀合至DT或CRM197。在进一步的实施方案中，大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合至CRM197并且肺炎链球菌血清型6B荚膜多糖肺炎链球菌血清型缀合至CRM197之外的载体蛋白。在进一步的实施方案中，大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合至CRM197并且肺炎链球菌血清型6B荚膜多糖肺炎链球菌血清型缀合至选自PhtD、PD (蛋白D)、TT (破伤风类毒素)或DT（白喉类毒素）的载体蛋白。在进一步的实施方案中，大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合至CRM197并且肺炎链球菌血清型6B荚膜多糖缀合至蛋白D。

在本发明的一个实施方案中，缀合至一种或多种肺炎链球菌荚膜多糖的载体蛋白是多聚组氨酸三联体家族（Pht）蛋白的成员、其片段或融合蛋白。PhtA、PhtB、PhtD或PhtE蛋白可以具有与WO 00/37105或WO 00/39299中公开的序列（例如，与WO 00/37105的PhtD的SEQ ID NO: 4的氨基酸序列1-838或21-838）具有80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。例如，融合蛋白由PhtA、PhtB、PhtD、PhtE的2、3或4种的全长或片段构成。融合蛋白的实例是PhtA/B、PhtA/D、PhtA/E、PhtB/A、PhtB/D、PhtB/E、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E、PhtE/A、PhtE/B和PhtE/D，其中所述蛋白在N末端与第一个提及的连接（例如见WO01/98334）。

在使用Pht蛋白片段的位置（单独地或作为融合蛋白的部分），每一片段任选包含此类多肽的一个或多个组氨酸三联体基序和/或卷曲螺旋区域。组氨酸三联体基序是具有序列HxxHxH的多肽的部分，其中H为组氨酸并且x为组氨酸之外的氨基酸。卷曲螺旋区是通过“螺旋”算法预测的区域Lupus, A等(1991) Science 252; 1162-1164。在一个实施方案中，片段包括一个或多个组氨酸三联体基序以及至少一个卷曲螺旋区域。在一个实施方案中，片段包含正好或至少2、3、4或5个组氨酸三联体基序（任选地，具有2个或多个三联体之间的天然Pht序列、或与天然的肺炎球菌三联体内Pht序列 — 例如，WO 00/37105对于PhtD的SEQ ID NO: 4中所示的三联体内序列 — 具有大于50、60、70、80、90或100 %同一性的三联体内序列）。在一个实施方案中，所述片段包含正好或至少2个、3个或4个卷曲螺旋区。在一个实施方案中，本文公开的Pht蛋白包括连接信号序列的全长蛋白、去除信号肽（例如N末端的20个氨基酸）的成熟全长蛋白、Pht蛋白的天然存在的变体和Pht蛋白的免疫原性片段（例如，如上所述的片段或包含来自WO00/37105 (SEQ ID NOs 4、 6、 8或10)或WO00/39299(SEQ ID NOs 2、 4、 6、 8、 10或14)中的氨基酸序列的至少15或20个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽能够引发针对WO00/37105或WO00/39299中的所述氨基酸序列的特异性的免疫应答）。

具体地，如本文所用的术语“PhtD”包括连接信号序列的全长蛋白、去除信号肽（例如N末端的20个氨基酸）的成熟全长蛋白、PhtD的天然存在的变体和PhtD的免疫原性片段（例如，如上所述的片段或包含来自WO00/37105或WO00/39299中的PhtD氨基酸序列的至少15或20个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽能够引发针对WO00/37105或WO00/39299中的所述PhtD氨基酸序列（例如，对于PhtD，WO 00/37105的SEQ ID NO: 4或WO 00/39299的SEQ IDNO: 14）的特异性的免疫应答）。上述所有形式的PhtD可用于本发明中。

缀合方法

本发明的免疫原性组合物中存在的糖缀合物可以通过本发明的缀合方法或任何已知的偶联技术来制备。缀合方法可以依赖于用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐（CDAP）活化糖以形成氰酸酯。活化的糖可以因此直接或经间隔物（接头）偶联至载体蛋白上的氨基。例如，间隔物可以是胱胺或半胱胺，以获得硫醇化多糖，其可以经由硫醚键偶联至载体，所述硫醚键在与马来酰亚胺活化的载体蛋白（例如使用GMBS（4-马来酰亚胺基丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯））或卤代乙酰化载体蛋白（例如使用SIAB（琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯）、或SIA（琥珀酰亚胺基碘乙酸酯）或SBAP（琥珀酰亚胺基-3-(溴代乙酰胺)丙酸酯））反应后获得。在一个实施方案中，氰酸酯（任选通过CDAP化学作用制备）由己二胺或ADH（己二酸二酰肼）偶联，并且经由在蛋白载体上的羧基，使用碳二亚胺（例如1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDAC或EDC））化学作用，使氨基衍生的糖缀合至载体蛋白。此类缀合物在PCT公开申请WO 93/15760 Uniformed Services University以及WO 95/08348和WO 96/29094中描述。

在一个实施方案中，至少一种肺炎链球菌荚膜多糖直接缀合至载体蛋白（例如，使用上述化学作用之一）。在一个实施方案中，至少一种肺炎链球菌荚膜多糖通过1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐 (CDAP)直接缀合。在一个实施方案汇总，大部分荚膜多糖例如5、6、7、8、9或更多种通过CDAP直接连接至载体蛋白（参见WO 95/08348和WO 96/29094）。

在一个实施方案中，肺炎链球菌多糖经接头例如双官能接头缀合至载体蛋白。接头任选是异双官能或同双官能的，具有例如一个反应性氨基和一个反应性羧酸基团、2个反应性氨基或2个反应性羧酸基团。接头例如具有4-20、4-12、5-10个碳原子。可能的接头是ADH（己二酸二酰肼）。其他接头包括B-丙酰胺基(WO 00/10599)、硝基苯基-乙胺 (Gever 等人 (1979) Med.Microbiol.Immunol.165; 171-288)、卤代烷基卤化物(US4057685)、糖苷键(US4673574, US4808700)、己二胺和6-氨基己酸(US4459286)。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物可以包含18C荚膜多糖，其经接头缀合至载体蛋白，任选地接头是ADH。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物可以包含22F荚膜多糖，其经接头缀合至载体蛋白，任选地接头是ADH（例如，如WO2007/071711A2中所述）。

其他合适的技术使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷（norborane）、对-硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基磺基琥珀酰亚胺（S-NHS）、EDC、O-(N-琥珀酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐（TSTU）。许多在WO 98/42721中描述。缀合可以涉及羰基接头，其可以通过糖的游离羟基与羰基二咪唑 (CDI)的反应形成（Bethell等人J. Biol. Chem.1979，254；2572-4，Hearn等人J. Chromatogr. 1981. 218；509-18），随后为与蛋白的反应，以形成氨基甲酸酯连接。这可以涉及异头末端还原至伯羟基，伯羟基与CDI的伯羟基反应的任选保护/脱保护，以形成CDI氨基甲酸酯中间产物，并且使CDI氨基甲酸酯中间产物与蛋白上的氨基偶联。

缀合物还可以通过直接还原胺化方法进行制备，如US 4365170（Jennings）和US4673574（Anderson）中描述的。其他方法在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中描述。

进一步方法涉及通过碳二亚胺缩合（Chu C.等人Infect. Immunity，1983 245256），例如使用EDAC，由己二酸二酰肼（ADH）衍生的溴化氰（或CDAP）活化的糖与蛋白载体的偶联。

在一个实施方案中，至少一种肺炎链球菌多糖使用CDAP和EDAC经接头缀合至载体蛋白。例如，18C或22F可以使用CDAP和EDAC如上述经接头（例如在其末端具有两个肼基的那些诸如ADH）缀合至蛋白。当使用接头时，可以使用CDAP将多糖缀合至接头并且随后可以使用EDAC将接头缀合至蛋白，或者可选地，可以首先使用EDAC将接头缀合至蛋白，随后可以使用CDAP将接头缀合至糖。

在一个实施方案中，将多糖上的羟基（合适地，经活化的羟基，例如活化以产生氰酸酯[例如用CDAP]的羟基）直接或间接（经接头）连接至蛋白上的氨基或羧基。当存在接头时，多糖上的羟基例如通过使用CDAP缀合合适地连接至接头上的氨基。接头例如ADH中的其他氨基可以缀合至蛋白上的羧酸基团，例如通过使用碳二亚胺化学作用，例如通过使用EDAC。在一个实施方案中，肺炎球菌荚膜糖首先缀合至接头，随后将接头缀合至载体蛋白。可选地，可以将接头缀合至载体，随后缀合至糖。

还可以使用技术组合，其中通过CDAP制备一些糖-蛋白缀合物，且通过还原胺化制备另一些。

通常，蛋白载体上以下类型的化学基可以用于偶联/缀合：

A）羧基（例如经天冬氨酸或谷氨酸）。在一个实施方案中，将该基团直接连接至多糖上的氨基或用碳二亚胺化学作用例如用EDAC连接至接头上的氨基。

B）氨基（例如经赖氨酸）。在一个实施方案中，将该基团直接连接至多糖上的羧基或用碳二亚胺化学作用例如用EDAC连接至接头上的羧基。在另一个实施方案中，该基团直接连接至多糖上由CDAP或CNBr活化的羟基或者连接至接头上的此类基团；连接至具有醛基的多糖或接头；连接至具有琥珀酰亚胺酯基团的多糖或接头。

C）巯基（例如经半胱氨酸）。在一个实施方案中，用马来酰亚胺化学作用将该基团与溴或氯乙酰化的多糖或接头连接。在一个实施方案中，该基团由双重氮联苯胺活化/修饰。

D）羟基（例如经由酪氨酸）。在一个实施方案中，该基团由双重氮联苯胺活化/修饰。

E）咪唑基（例如经由组氨酸）。在一个实施方案中，该基团由双重氮联苯胺活化/修饰。

F）胍基（例如经由精氨酸）。

G）吲哚基（例如经由色氨酸）。

在糖上，一般地，下述基团能够用于偶联：OH、COOH或NH₂。醛基能够在本领域已知的不同处理后生成，所述处理例如：高碘酸、酸水解、过氧化氢等。

直接偶联方法：

糖-OH + CNBr或CDAP -----> 氰酸酯 + NH₂-蛋白 ----> 缀合物

糖-醛 + NH₂-蛋白 ----> 希夫碱+ NaCNBH3 ----> 缀合物

糖-COOH + NH₂-蛋白 + EDAC ----> 缀合物

糖-NH₂ + COOH-蛋白 + EDAC ----> 缀合物

经间隔物（接头）的间接偶联方法：

糖-OH + CNBr或CDAP ---> 氰酸酯 + NH₂----NH₂ ----> 糖----NH₂ + COOH-蛋白 + EDAC -----> 缀合物

糖-OH + CNBr或CDAP ----> 氰酸酯 + NH₂-----SH -----> 糖----SH + SH-蛋白 (具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或通过例如SPDP修饰蛋白的氨基后获得) ----->糖-S-S-蛋白

糖-OH + CNBr或CDAP ---> 氰酸酯 + NH₂----SH -------> 糖----SH + 马来酰亚胺-蛋白 (氨基的修饰) ----> 缀合物

糖-OH + CNBr或CDAP ---> 氰酸酯 + NH₂-----SH ---> 糖-SH + 卤代乙酰化-蛋白 ----> 缀合物

糖-COOH + EDAC + NH₂-----NH₂ ---> 糖------NH₂ + EDAC + COOH-蛋白 ---->缀合物

糖-COOH + EDAC+ NH₂----SH -----> 糖----SH + SH-蛋白 (具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或通过例如SPDP修饰蛋白的氨基后获得) -----> 糖-S-S-蛋白

糖-COOH + EDAC+ NH₂----SH -----> 糖----SH + 马来酰亚胺-蛋白 (氨基的修饰) ----> 缀合物

糖-COOH + EDAC + NH₂----SH ---> 糖-SH + 卤代乙酰化-蛋白 ----> 缀合物

糖-醛 + NH₂-----NH₂ ----> 糖---NH2 + EDAC + COOH-蛋白 ----> 缀合物

注意：可以用任何合适的碳二亚胺代替上文的EDAC。

总之，一般可以用于与多糖偶联的蛋白载体化学基团的类型是氨基（例如在赖氨酸残基上）、COOH基团（例如在天冬氨酸和谷氨酸残基上）和SH基团（如果可接近的话）（例如在半胱氨酸残基上）。

在一个实施方案中，使用CDAP化学作用将本发明的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合至载体蛋白（例如CRM-197）。在一方面，CDAP化学作用使用1：2-3：1、1：1.5-2：1，例如1：1的CDAP:PS6A比率。在另一方面，使用50-130分钟、60-130分钟或110-130分钟的偶联时间进行CDAP缀合。因此，本发明还提供制备肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合物（例如本发明的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖）的方法，其包括将大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合至载体蛋白（例如CRM-197）或接头（例如ADH），其使用CDAP化学作用使用1：2-3：1、1：1.5-2：1，例如1：1的CDAP:PS（多糖）比率。

在另一方面，本发明提供制备肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合物（例如本发明的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖）的方法，其包括将大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合至载体蛋白（例如CRM-197），其使用CDAP化学作用使用1：2-3：1、1：1.5-2：1，例如1：1的CDAP:PS（多糖）比率。在一方面，本发明还提供制备肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合物（例如本发明的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖，诸如具有100-1000、110-750、150-500、180-600、210-490、210-450、180-400、210-400、210-370、220-360、230-350、240-340、240-320、240-310或250-310 kDa的平均大小（例如M_w）的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖）的方法，其包括将大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合至载体蛋白（例如CRM-197）或接头（例如ADH），其使用CDAP化学作用使用50-130分钟、60-130分钟或110-130分钟的偶联时间。

在另一方面，本发明提供制备肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合物（例如本发明的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖，诸如具有100-1000、110-750、150-500、180-600、210-490、210-450、180-400、210-400、210-370、220-360、230-350、240-340、240-320、240-310或250-310 kDa的平均大小（例如M_w）的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖）的方法，其包括将大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合至载体蛋白（例如CRM-197），其使用CDAP化学作用使用50-130分钟、60-130分钟或110-130分钟的偶联时间。在一方面，用于活化和偶联的pH为pH8-pH9，合适地为pH9.5。在另一方面，缀合在NaCl存在的情况下进行。例如，在0.1-3M NaCl、0.1-2.5M NaCl、1.5-2.5M NaCl或2M NaCl中。

本发明还提供制备肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合物的方法，其包括（a）将肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖（例如本发明的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖）缀合至载体蛋白（例如CRM-197）和（b）对于具有低于150mM的NaCl浓度（例如，低于100nMNaCl、低于50mM NaCl、低于10mM NaCl）的溶液或使用水（例如，WFI，注射用水）进行渗滤。

在另一方面，本发明提供在少于150mM NaCl中包含6A-CRM197的溶液。例如，少于100mM NaCl、少于50mM NaCl、少于10nM NaCl、或者不存在氯化钠。在另一方面，本发明提供包含少于150mM NaCl的本发明的免疫原性组合物（例如6A-CRM197）。例如，少于100mMNaCl、少于50mM NaCl、少于10mM NaCl、或者不存在氯化钠。

载体蛋白与多糖的比率

在一个实施方案中，载体蛋白与肺炎链球菌多糖的比率为1:5-5:1；例如1:0.5-4:1、1:1-3.5:1、1.2:1-3:1、1.5:1-2.5:1；例如1:2-2.5:1；1:1-2:1（w/w；重量/重量）。在一个实施方案中，大部分缀合物，例如6、7、8、9或更多种缀合物具有大于1:1、例如1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1或1.6:1的载体蛋白与多糖的比率。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物中载体蛋白与肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖的比率为5:1-1:5、4:1-1:1或2:1-1:1、1.5:1-1:1、1.4:1-1.3:1 (例如1.2:1、1.5:1) (w/w)。

可以使用缀合物来测定缀合物中多糖与载体蛋白的比率（w/w）。使用Lowry测定(例如Lowry 等人 (1951) J. Biol. Chem. 193, 265-275或Peterson 等人 AnalyticalBiochemistry 100, 201-220 (1979))测定蛋白的量，并且使用间苯二酚测定(Monsigny等人(1988) Anal. Biochem. 175, 525-530)测定多糖的量。通过Lowry/间苯二酚浓度的比率测定灭菌的缀合物上最终的蛋白/多糖比率(w/w)。

免疫原性组合物中荚膜多糖的大小

肺炎链球菌的荚膜多糖包含可以含有高至8个糖残基的重复寡糖单元。对于关键肺炎链球菌血清型的寡糖单元的综述，参见JONES, Christopher.Vaccines based on thecell surface carbohydrates of pathogenic bacteria.An.Acad.Bras.Ciênc., June2005, vol.77, no.2, 第293-324页.Table II ISSN 0001-3765。在一个实施方案中，荚膜多糖可以是全长荚膜多糖，然而，在其他实施方案中，其可以是比天然长度多糖链更短的重复单元。在一个实施方案中，缀合后的肺炎链球菌血清型荚膜多肽缀合物应该可以容易地经0.2微米滤器过滤，使得相比于过滤前的样品，过滤后获得超过95%的产率。

除了本发明的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖，本发明的免疫原性组合物可以包含来自6A之外的肺炎链球菌血清型（例如6B和/或23F）的一种或多种（多）糖缀合物，其中缀合前的（多）糖的平均大小（例如重均分子量；M_W）为大于80kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa、700kDa或1000kDa。例如，本发明的免疫原性组合物可以包含来自6A之外的肺炎链球菌血清型的一种或多种（多）糖缀合物，其中缀合前的（多）糖的平均大小（例如重均分子量；M_W）为80-100kDa、100-200kDa、200-300kDa、300-400kDa、400-500kDa、500-1000kDa或1000-1400kDa。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含（i）大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合物和（ii）缀合前具有50-1600、80-1400、100-1000、150-500或200-400 kDa的平均大小的一种或多种（多）糖缀合物(注意当平均大小是M_w 时，‘kDa’单位应在本文用‘x10³’替代)。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含具有100-1000、200-800、250-600或300-400 kDa的平均大小（M_w）的血清型1肺炎链球菌多糖。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含具有50-500、60-300、70-150或75-125 kDa的平均大小（M_w）的血清型4肺炎链球菌多糖。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含具有100-1000、100-700、100-350或150-300 kDa的平均大小（M_w）的血清型5肺炎链球菌多糖。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含具有200-1800、500-1800、600-1800、900-1660或1000-1400 kDa的平均大小（M_w）的血清型6B肺炎链球菌多糖。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含具有50-1000、100-750、150-500或200-300 kDa的平均大小（M_w）的血清型7F肺炎链球菌多糖。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含具有50-1000、100-750、150-500、200-400或250-300 kDa的平均大小（M_w）的血清型9V肺炎链球菌多糖。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含具有50-1000、100-750、150-500或200-250kDa的平均大小（M_w）的血清型14肺炎链球菌多糖。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含具有50-1000、50-750、50-500、50-190、50-150或80-110 kDa的平均大小（M_w）的18C肺炎链球菌多糖。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含具有50-800、110-700、110-300、120-200、130-180、140-160或80-130 kDa的平均大小（M_w）的19A肺炎链球菌多糖。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含具有50-1000、100-750、100-500、100-190或120-180 kDa的平均大小（M_w）的血清型19F肺炎链球菌多糖。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含具有500-1500、600-1500、700-1300、900-1250、800-1100或900-1000 kDa的平均大小（M_w）的血清型23F肺炎链球菌多糖。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含具有50-800、110-700、110-300、120-200、130-180、150-170、100-190、100-150、95-125或100-115 kDa的平均大小（M_w）血清型22F肺炎链球菌多糖。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含来自不同肺炎链球菌血清型的一种或多种天然荚膜多糖。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含缀合至载体蛋白的来自至少10种血清型的肺炎链球菌多糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8或9种肺炎链球菌多糖血清型是天然多糖。在另一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含天然肺炎链球菌荚膜血清型6B多糖。在另一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含天然肺炎链球菌荚膜血清型23F多糖。

在本发明的一个方面，免疫原性组合物包含缀合至载体蛋白的来自至少10种血清型的肺炎链球菌多糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8或9种肺炎链球菌多糖血清型以高至x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的系数进行大小降低。在该方面的一个实施方案中，大部分的多糖，例如6、7、8或更多种多糖血清型通过高至x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的系数进行大小降低。例如，大小降低可以为x2-x6、x2-x5、x2-x4、或x3-x6、x3-x5或x3-x4的系数。

在一个实施方案中，将免疫原性组合物中的大部分肺炎链球菌多糖大小降低。在一个实施方案中，将免疫原性组合物中的大部分肺炎链球菌多糖血清型大小降低。在一方面，通过机械切割将免疫原性组合物中的肺炎链球菌多糖大小降低，例如，通过微流化或超声处理。在另一方面，通过化学切割将将免疫原性组合物中的肺炎链球菌多糖大小降低，例如，用乙酸或高碘酸处理。大小降低通过不超过x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3或x2的系数。

在一个实施方案中，免疫原性组合物包含作为天然多糖和通过不超过x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3或x2的系数大小降低的多糖的混合物的肺炎链球菌缀合物。在该实施方案的一个方面中，大部分的多糖，例如6、7、8、9、10或更多种多糖通过高至x2、x3、x4、x5或x6的系数进行大小降低。

剂量

通常，本发明的免疫原性组合物可以包含0.1-20μg、1-10μg或1-3μg糖的剂量的每一糖缀合物。

在一个实施方案中，在本发明的免疫原性组合物中，肺炎链球菌6A多糖缀合物的剂量为1-10 μg、1-5 μg或1-3 μg的糖(例如2μg)。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物以0.1-20μg；0.5-10μg；0,5-5μg或1-3μg糖的剂量包含每一肺炎链球菌荚膜糖。在一个实施方案中，荚膜多糖可以以不同剂量存在，例如，一些荚膜多糖可以以约或正好1μg的剂量存在，或者一些荚膜多糖可以以约或正好3μg的剂量存在。在一个实施方案中，来自血清型3、18C和19F的多糖以比其他多糖更高的剂量存在。在一个实施方案中，来自血清型4、18C和19F的多糖以比其他多糖更高的剂量存在。在该实施方案的一个方面中，血清型3、18C和19F以约或正好3μg的剂量存在，而免疫原性组合物中的其他多糖以约或正好1μg的剂量存在。在该实施方案的一个方面中，血清型4、18C和19F以约或正好3μg的剂量存在而免疫原性组合物中的其他多糖以约或正好1μg的剂量存在。

将“约”或“大约”定义为在本发明的目的的给定数值的10％或多或少之内。

肺炎链球菌蛋白

本发明的免疫原性组合物还可以包含肺炎链球菌蛋白，本文称为本发明的肺炎链球菌蛋白。此类蛋白可以用作载体蛋白，或可以作为游离蛋白存在，或可以作为载体蛋白和游离蛋白两者存在。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物还包含一种或多种未缀合的或缀合的肺炎链球菌蛋白。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物还包含一种或多种未缀合的肺炎链球菌蛋白。例如，本发明的免疫原性组合物包含非缀合的肺炎球菌溶血素例如dPly和非缀合的肺炎球菌PhtD。

本发明的肺炎链球菌蛋白或者是表面暴露的，至少在肺炎球菌的部分生命周期过程中，或者是由肺炎球菌分泌或释放的蛋白。在一个实施方案中，本发明的蛋白选自以下类别，诸如具有LXXC（其中X是任何氨基酸，例如，多聚组氨酸三联体家族(PhtX)）的II类信号序列基序的蛋白、胆碱结合蛋白（例如，CbpX、PcpA）、具有I类信号序列基序的蛋白（例如Sp101）、具有LPXTG基序的蛋白（其中X是任何氨基酸，例如Sp128、Sp130）和毒素（例如Ply）。这些类别（或基序）内优选的实例是以下蛋白或其免疫功能等同物。因此，本发明的免疫原性组合物可以包含选自以下的一种或多种肺炎链球菌蛋白：多聚组氨酸三联体家族（PhtX）、胆碱结合蛋白家族（CbpX）、CbpX截短物、肺炎球菌自溶素LytX家族(LytA (N-乙酰胞壁酸-l-丙氨酸酰胺酶)、LytB、LytC)、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、脱毒的肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133。在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含两种或更多种选自以下的蛋白：多聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白（或融合蛋白）、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA和Sp128。在进一步的实施方案中，免疫原性组合物包含两种或更多种选自以下的蛋白：多聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白（或融合蛋白）、肺炎球菌溶血素(Ply)和Sp128。

Pht (多聚组氨酸三联体)家族包含蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。该家族表征为脂化序列、由富含脯氨酸区分隔的两个结构域和可能参与金属或核苷酸结合或酶活性的几个组氨酸三联体、（3-5个）卷曲螺旋区、保守的N末端和异质的C末端。它存在于已测试的所有肺炎球菌菌株中。同源蛋白也已在其他链球菌和奈瑟氏球菌（Neisseria）中发现。在本发明的一个实施方案中，免疫原性组合物包含PhtD。然而，应当理解术语PhtA、B、D和E指具有在以下引用文献中公开的序列的蛋白以及其变体，所述变体具有与下文所述蛋白例如WO00/37105的SEQ ID NO: 4的氨基酸21-838为至少90%相同的序列同源性。在一个实施方案中，它是至少95%相同且在另一个实施方案中，它是97%相同。

关于PhtX蛋白，PhtA公开于WO98/18930且也指Sp36。如上文所述，它是来自多聚组氨酸三联体家族的蛋白并且具有LXXC的II型信号基序。PhtD公开于WO00/37105，并且也指Sp036D。如上文所述，它也是来自多聚组氨酸三联体家族的蛋白并且具有II型LXXC信号基序。PhtB公开于WO00/37105，并且也指Sp036B。如同公开于WO 00/17370中，PhtB家族的另一成员是C3降解多肽。该蛋白也来自多聚组氨酸三联体家族并且具有II型LXXC信号基序。优选的免疫功能等同物是公开于WO98/18930的蛋白Sp42。PhtB截短物（大约79kD）公开于WO99/15675，其也被认为是PhtX家族的成员。PhtE公开于WO00/30299，并且被称为BVH-3。如果本文提及任何Pht蛋白，其意指可以使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。例如，提及PhtX包括来自任何Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。

在一个实施方案中，选自多组氨酸三联体家族的一个或多个成员的肺炎链球菌蛋白是PhtD。如本文使用的术语“PhtD”包括附有信号序列的全长蛋白或信号肽（例如在N末端的20个氨基酸）去除的成熟全长蛋白、和其免疫原性片段、变体和/或融合蛋白，例如WO00/37105的SEQ ID NO:4。在一方面，PhtD是附有信号序列的全长蛋白，例如WO00/37105的SEQID NO:4。在另一方面，PhtD是包含信号肽（例如在N末端的20个氨基酸）去除的成熟全长蛋白的序列，例如WO00/37105的SEQ ID NO:4的氨基酸21-838。适合地，PhtD序列包含N末端甲硫氨酸。本发明还包括PhtD多肽，其是PhtD的免疫原性片段、PhtD的变体和/或PhtD的融合蛋白。例如，如WO00/37105、WO00/39299、US6699703和WO09/12588中描述。

在使用PhtD蛋白免疫原性片段的时（单独地或作为融合蛋白的部分），这些免疫原性片段将是长度为至少约15个、至少约20个、至少约40个或至少约60个连续的例如来自WO00/37105或WO00/39299中的PhtD氨基酸序列的氨基酸残基，诸如WO00/37105的SEQ IDNO:4。在本发明的一个实施方案中，PhtD蛋白的免疫原性片段包含至少约15个、至少约20个、至少约40个、或至少约60个连续的WO00/37105的SEQ ID NO: 4中显示的序列的氨基酸残基，其中所述多肽能够引起对所述氨基酸序列特异性的免疫应答。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含例如描述于WO05/12601、WO05/98334、WO10/12588中的PhtD的免疫原性片段。在使用PhtD蛋白免疫原性片段的时（单独地或作为融合蛋白的部分），每一免疫原性片段任选包含此类多肽的一个或多个组氨酸三联体基序。组氨酸三联体基序是具有序列HxxHxH的多肽的部分，其中H为组氨酸并且x为组氨酸之外的氨基酸。在本发明的一个实施方案中，所述或每一免疫原性片段包含正好或至少2、3、4或5个组氨酸三联体基序（任选地，具有2个或多个三联体之间的天然PhtD序列、或三联体内序列），其中所述免疫原性片段与天然的肺炎球菌三联体内PhtD序列（例如显示于WO00/37105的SEQ ID NO: 4的三联体内序列）具有大于50、60、70、80、90或100％同一性。PhtD蛋白的免疫原性片段任选包含一个或多个此类多肽的卷曲螺旋区。卷曲螺旋区是通过“螺旋”算法预测的区域Lupus, A等(1991) Science 252; 1162-1164。在本发明的一个实施方案中，每一免疫原性片段包含正好或至少2个、3个或4个卷曲螺旋区。在本发明的一个实施方案中，所述或每一免疫原性片段包含正好或至少2个、3个或4个卷曲螺旋区，其中所述免疫原性片段与天然的肺炎球菌PhtD序列（例如显示于WO00/37105的SEQ ID NO: 4中的序列）具有大于50、60、70、80、90、95、96或100％同一性。在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性片段包括一个或多个组氨酸三联体基序以及至少1个、2个、3个或4个卷曲螺旋区。

在其中PhtD多肽为变体的情况下，尽管可以形成一个或多个这些区域中的变异，但变异通常在其的一部分而非在组氨酸三联体残基和卷曲螺旋区中。根据本发明，多肽变体包括与野生型序列相比其中一个或多个氨基酸被取代和/或缺失和/或插入的序列。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。在一方面，氨基酸取代是保守的。取代、缺失、插入或其任何组合可以在单一变体中组合，只要该变体是免疫原性多肽。PhtD的变体通常包括PhtD的任何免疫原性片段或变体，其与野生型PhtD序列例如WO00/37105的SEQ ID NO:4具有至少80、90、95、96、98或99％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，本发明包括免疫原性片段和/或变体，其中几个、5-10个、1-5个、1-3个、1-2个或1个氨基酸以任何组合取代、缺失或加入。在另一个实施方案中，本发明包括包含B细胞或T细胞表位的免疫原性片段和/或变体。此类表位可以使用2D结构预测例如使用PSIPRED程序(来自David Jones, BrunelBioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, UxbridgeUB8 3PH, UK)和基于由Jameson和Wolf描述的方法计算的抗原指数(CABIOS 4:181-186[1988])的组合来预测。

在本发明的一个实施方案中，PhtD及其免疫原性片段、变体和/或其融合蛋白包含与WO00/37105的SEQ ID NO:4的氨基酸序列21-838具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。在本发明的另一个实施方案中，PhtD及其免疫原性片段、变体和/或其融合蛋白具有与WO00/37105的SEQ ID NO:4的氨基酸序列21-838具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。适合地，PhtD及其免疫原性片段、变体和/或其融合蛋白包含具有N末端甲硫氨酸的氨基酸序列。在本发明的另一个实施方案中，PhtD及其免疫原性片段、变体和/或其融合蛋白包含至少约15个、至少约20个、至少约40个、或至少约60个或至少约100个、或至少约200个、或至少约400个或至少约800个连续的显示于WO00/37105的SEQ ID NO:4中的序列的氨基酸残基。

肺炎球菌溶血素（Ply）是具有不同的溶细胞的（溶血的）和补体活化活性的多功能的毒素(Rubins 等人, Am. Respi. Cit Care Med, 153:1339-1346 (1996))。该毒素不由肺炎球菌分泌，但其在肺炎球菌在自溶素影响下裂解时被释放。它的作用包括例如由人单核细胞产生的炎性细胞因子的刺激、人呼吸上皮上纤毛的拍打的抑制和杀菌活性的降低及中性粒细胞的迁移，以及在血细胞的裂解中，其涉及结合胆固醇。由于其是毒素，它需要脱毒（例如，当以适合于保护的剂量提供时对人是无毒的），随后其可以体内施用。野生型或天然肺炎球菌溶血素的表达和克隆是本领域已知的。例如，见Walker等人(Infect Immun,55:1184-1189 (1987)), Mitchell 等人(Biochim Biophys Acta, 1007:67-72 (1989)和Mitchell等(NAR, 18:4010 (1990))。Ply的脱毒可以通过化学方法进行，例如进行福尔马林或戊二醛处理或两者组合(WO 04081515、PCT/EP2005/010258)。对于各种毒素的此类方法是本领域公知的。可选地，Ply可以遗传脱毒。因此，本发明包含例如可以是突变的蛋白的肺炎球菌蛋白的衍生物。本文使用术语“突变的”来意指这样的分子，其已经使用定点诱变的已知技术或任何其他常规方法经历了一个或多个氨基酸的缺失、添加或取代。例如，如上文描述，可以改变突变体Ply蛋白，从而使它是生物学失活的而同时仍保持它的免疫原性表位，例如见WO90/06951、Berry等人(Infect Immun, 67:981-985 (1999))和WO99/03884。

如本文所用，应理解术语“Ply”包括适合于医学用途（即非毒性的）的突变的肺炎球菌溶血素和脱毒的肺炎球菌溶血素（dPly）。

关于胆碱结合蛋白家族（CbpX），该家族的成员最初被鉴定为能用胆碱亲和层析纯化的肺炎球菌蛋白。所有胆碱结合蛋白非共价结合于细胞壁磷壁酸和膜结合脂磷壁酸的磷酸胆碱部分。虽然蛋白的确切性质（氨基酸序列、长度等）可以不同，但在整个家族它们具有数个在结构上共同的区域。一般而言，胆碱结合蛋白包含N末端区（N）、保守重复区、富含脯氨酸区（P）和保守的胆碱结合区（C），该胆碱结合区由多个重复组成，其约占该蛋白的一半。如本申请中使用的，术语“胆碱结合蛋白家族（CbpX）”选自：如WO97/41151中所鉴定的胆碱结合蛋白、胆碱结合蛋白A、CbpA（也称为PbcA（C3结合蛋白A）、SpsA（肺炎链球菌分泌IgA结合蛋白）、PspC（肺炎球菌表面蛋白C））、胆碱结合蛋白D（CbpD）和胆碱结合蛋白G（CbpG）。CbpA公开于WO97/41151中。CbpD和CbpG公开于WO00/29434中。PspC公开于WO97/09994中。PspA公开于WO98/21337中。SpsA为公开于WO98/39450中的胆碱结合蛋白。在一个实施方案中，胆碱结合蛋白是CbpA。另一种胆碱结合蛋白是肺炎球菌胆碱结合蛋白A(PcpA)(Sanchez-Beato 等人 FEMS Microbiology Letters 164 (1998) 207-214)。

另一个优选的实施方案是CbpX截短物，其中“CbpX”是CbpA、CbpD或CbpG并且“截短物”指缺少胆碱结合区（C）的50％或更多的CbpX蛋白。另一个优选的实施方案是PcpA截短物，其中“截短物”指缺少胆碱结合区（C）的50％或更多的PcpA蛋白。在一个实施方案中，CbpX截短物或PcpA截短物缺少整个胆碱结合区。在另一个实施方案中，CbpX截短物或PcpA截短物缺少(i)胆碱结合区和(ii)以及蛋白的N末端一半的部分，仍保留至少一个重复区。在另一个实施方案中，截短物具有至少两个重复区。此类优选的实施方案的实例说明于WO99/51266或WO99/51188，然而，认为其他缺少类似胆碱结合区的胆碱结合蛋白也在本发明的范围内。

LytX家族是与细胞溶解相关的膜相关蛋白。N末端结构域包含一个或多个胆碱结合域，然而，LytX家族不具有上文提及的CbpA家族中发现的所有特征，并且因此对于本发明而言，认为LytX家族与CbpX家族不同。与CbpX家族相反，C末端结构域包含LytX蛋白家族的催化结构域。家族包含LytA、LytB和LytC。关于LytX家族，LytA公开于Ronda等, Eur JBiochem, 164:621-624 (1987)中。LytB公开于WO98/18930中，并且也被称为Sp46。LytC也公开于WO98/18930中，并且也被称为Sp91。该家族的优选成员是LytC。

另一个优选的实施方案是LytX截短物，其中“LytX”是LytA、LytB或LytC并且“截短物”指缺少胆碱结合区的50％或更多的LytX蛋白。合适地，此类蛋白缺少整个胆碱结合区。本发明的仍另一个优选的实施方案是CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白（或融合体）。在一个实施方案中，CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白包含CbpX的重复区和LytX的C末端部分(Cterm, 即, 缺少胆碱结合域)(例如LytCCterm或Sp91Cterm)。在另一个实施方案中，CbpX选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。在另一个实施方案中，其是CbpA。在一个实施方案中，LytX是LytC（也称作Sp91）。本发明的另一个实施方案是缺少胆碱结合域(C)并且表达为与LytX的融合蛋白的PspA或PsaA截短物。在一个实施方案中，LytX是LytC。

PsaA及其跨膜缺失变体已经由Berry和Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255-62所描述。PspA及其跨膜缺失变体已经例如在US 5804193、WO 92/14488和WO 99/53940中公开。

Sp128和Sp130公开于WO00/76540中。Sp125是具有LPXTG (即亮氨酸-脯氨酸-X-苏氨酸-甘氨酸其中X为任何氨基酸)的细胞壁锚定基序的肺炎球菌表面蛋白的实例。已经发现具有该基序的肺炎球菌表面蛋白的这一类中的任何蛋白均可用在本发明的背景中，并且因此被认为是本发明的进一步的蛋白。Sp125自身公开于WO98/18930中，并且也已知为ZmpB– 锌金属蛋白酶。Sp101公开于WO98/06734（其中它具有参考# y85993）。将它表征为I型信号序列。Sp133公开于WO98/06734（其中它具有参考# y85992）。将它也表征为I型信号序列。

本发明的蛋白也可以有益地组合。组合意指免疫原性组合物包含以下组合中的所有蛋白，或者作为载体蛋白或者作为游离蛋白或者是两者的混合物。例如，如下文所述的两种蛋白的组合中，两种蛋白可以作为载体蛋白使用，或者两种蛋白可以作为游离蛋白存在，或者两者可以作为载体和作为游离蛋白存在，或者一种可以作为载体蛋白和游离蛋白存在而另一种仅作为载体蛋白或仅作为游离蛋白存在，或者一种可以作为载体蛋白且另一种作为游离蛋白存在。当给出三种蛋白的组合时，存在类似的可能性。优选的组合包括但不限于PhtD + CbpX重复区、PhtD + Ply、PhtD + Sp128、PhtD + PsaA、PhtD + PspA、PhtA + CbpX重复区、PhtA + CbpX重复区-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtA + Ply、PhtA + Sp128、PhtA+ PsaA、PhtA + PspA、CbpX重复区+ LytC、CbpX重复区+ PspA、CbpX重复区+ PsaA、CbpX重复区+ Sp128、CbpX重复区+ LytC、CbpX重复区+ PspA、CbpX重复区+ PsaA、CbpX重复区+Sp128、CbpX重复区+ PhtD、CbpX重复区+ PhtA。在一个实施方案中，CbpX重复区来自CbpA。在另一个实施方案中，其来自CbpA。其他组合包括3种蛋白组合，诸如PhtD + CbpX重复区 +Ply和PhtA + CbpX重复区 + PhtD。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含脱毒的肺炎球菌溶血素和PhtD或PhtDE作为载体蛋白。在进一步的实施方案中，免疫原性组合物包含脱毒的肺炎球菌溶血素和PhtD或PhtDE作为游离蛋白。

疫苗中蛋白抗原的总含量通常在1-100μg的范围内，或5-80μg，例如在50-70μg的范围内。例如，在一方面，本发明的免疫原性组合物包含每人剂量26μg-45μg (例如26μg-40μg、28μg-35μg或约30μg)的每一肺炎链球菌蛋白。在另一方面，免疫原性组合物包含每人剂量26μg-45μg (例如26μg-40μg、28μg-35μg或约30μg)的PhtD。在另一方面，本发明的免疫原性组合物包含每人剂量26μg-45μg (例如26μg-40μg、28μg-35μg或约30μg)的肺炎球菌溶血素（例如dPly）。

术语“人剂量”表示在适合于人使用的体积中的剂量。通常，这为0.25-1.5 ml。在一个实施方案中，人剂量为0.5 ml。在进一步的实施方案中，人剂量高于0.5 ml，例如0.6、0.7、0.8、0.9或1 ml。在进一步的实施方案中，人剂量为1 ml-1.5 ml。在另一个实施方案中，尤其是当免疫原性组合物用于儿科人群，人剂量可以为少于0.5 ml诸如0.25-0.5 ml。

佐剂

本发明的免疫原性组合物可以是佐剂化的，特别是当旨在用于老年人群体但也用于婴儿群体时。因此，进一步的方面是还包含佐剂的本发明的免疫原性组合物。合适的佐剂包括铝盐诸如氢氧化铝凝胶或磷酸铝或明矾，但合适的佐剂还可以是钙盐、镁盐、铁盐或锌盐，或者可以是酰化酪氨酸、或酰化糖类、阳离子或阴离子衍生的多糖、或聚磷腈的不溶性悬浮液。在本发明的一个方面，佐剂为铝盐例如磷酸铝。在进一步的方面，佐剂包含（每0.5mL剂量）作为磷酸铝的100-750、200-500或300-400 μg Al（铝）。

在一个实施方案中，佐剂是Th1类型应答的优先诱导物。此类高水平的Th1类型细胞因子趋于促进诱导针对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的Th2类型细胞因子趋于促进诱导针对抗原的体液免疫应答。主要促进Th1应答的合适的佐剂系统包括：单磷酰脂质A或其衍生物，特别是3-脱-0-酰化单磷酰脂质A（3D-MPL）（对于其制备参见GB 2220211A）；和单磷酰脂质A、适合地3-脱-0-酰化单磷酰脂质A、连同铝盐（例如磷酸铝或氢氧化铝）或水包油乳状液的组合。在此类组合中，抗原和3D-MPL包含在相同的微粒结构中，允许更有效递送抗原和免疫刺激性信号。研究已显示3D-MPL能够进一步增强明矾吸附的抗原的免疫原性[Thoelen等人Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1]。

免疫原性组合物可以包含吸附至金属盐（诸如铝盐，例如磷酸铝或氢氧化铝）上的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖（和任选免疫刺激剂）。如本文所用的术语“免疫刺激剂”意指刺激免疫应答的物质，特别是佐剂，所述佐剂刺激将其所施用的宿主动物（例如人）的免疫系统，并且由此相比于单独施用抗原所产生的作用，增加通过对该动物施用的抗原所产生的保护性作用。对于基于铝的疫苗制剂，其中通常在室温且摇动下将抗原吸附至铝盐上持续1小时。

包含另外的免疫刺激剂的佐剂

本发明的佐剂可以包含免疫刺激剂，诸如皂苷（例如QS21）和/或3D-MPL。免疫刺激剂的实例描述于本文和在“Vaccine Design – The Subunit and Adjuvant Approach”1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, 编辑Powell, M.F., and Newman,M.J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X中。在本发明的一个方面，佐剂包含QS21、单磷酰脂质A（MPL）、磷脂和甾醇，其以脂质体的形式呈现。

QS-21是来自南美树皂树（Quillaja saponaria）的树皮提取物的纯化的皂苷组分。QS21通常包含两种主要的异构体，其具有三萜、支链三糖和糖基化的假二聚酰基链。两种异构形式区别在于线性四糖部分内末端糖的结构，其中主要的异构体QS-21-Api掺入β-D-芹菜糖残基，并且次要的异构体QS-21-Xyl在β-D-木糖取代基处终止。(Cleland, J. L.等 J. Pharm. Sci. 1996, 85, 22–28)。QS21可以通过HPLC纯化从Quil A^TM中制备。由Dalsgaard等在1974年将Quil A^TM描述为具有佐剂活性(“Saponin adjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung, 第44卷, Springer Verlag, Berlin, 第243-254页)。用于制备QS21的方法描述于US5057540 (其中QS21描述为QA21)和EP0362278中。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含以基本上纯的形式的QS21，也就是说，所述QS21占免疫原性组合物的至少90%、例如至少95%或至少98%（即QS21组合物包含至少90％，例如至少95％、或至少98％的QS21）。QS21的剂量能够合适地在人中增强对抗原的免疫应答。具体而言，合适的QS21量是这样的量，与非佐剂化的组合物相比，或者与用另一QS21量佐剂化的组合物相比，所述量改善了组合物的免疫潜力，同时从反应原性概况上是可接受的。例如，QS21可以以每组合物剂量1-100 µg的量例如以每组合物剂量10-50 µg的量使用。

单磷酰脂质A(MPL)是革兰氏阴性细菌例如明尼苏达沙门氏菌（Salmonella minnesota）R595的脂多糖(LPS)的无毒衍生物。它保持LPS的佐剂特性同时显示出降低的毒性(Johnson等1987 Rev. Infect.Dis.9 Suppl:S512-S516)。MPL由一连串4'-单磷酰脂质A种类组成，其在脂肪酸取代的范围和位置中不同。它可以通过用温和的酸和碱水解处理LPS随后通过纯化修饰的LPS来制备。例如，LPS可以在中等强度的无机酸溶液（例如0.1 M HCl）中回流大约30分钟的时期。该处理导致在1位的脱磷酸化和在6'位的脱糖化（decarbohydration）。如本文所用的术语“单磷酰脂质A(MPL)”包括单磷酰脂质A的衍生物。单磷酰脂质A的衍生物包括3D-MPL和合成的衍生物。

3D-MPL是3-O-脱酰单磷酰脂质A（或3 脱-0-酰化单磷酰脂质A）。化学上它是具有4、5或6个酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。3D–MPL可以由GlaxoSmithKlineBiologicals North America以商标MPL®购得。3-0-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。它具有进一步降低的毒性同时还保持佐剂性，并且通常可以通过温和的碱水解来制备，例如见US4912094。碱水解通常在有机溶剂诸如氯仿/甲醇的混合物中通过用弱碱的水溶液诸如以pH 10.5的0.5 M碳酸钠进行。对于3D-MPL制备的进一步的信息见GB2220211A 和WO02078637 (Corixa Corporation)。在本发明的一方面，可以使用小颗粒3 D-MPL。小颗粒3D-MPL具有可以使它经0.22μm滤器无菌过滤的颗粒大小。此类制备描述于国际专利申请号WO94/21292中。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含3-0-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。

单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL的剂量能够合适地在人中增强对抗原的免疫应答。具体而言，单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL的量是这样的量，与非佐剂化的组合物相比，或者与用另一MPL量佐剂化的组合物相比，所述量改善了组合物的免疫潜力，同时从反应原性概况上是可接受的。例如，单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL可以以每组合物剂量1-100 µg的量例如以每组合物剂量10-50 µg的量使用。

可以使用本领域已知的技术从磷脂（诸如二油酰磷脂酰胆碱, DOPC）和甾醇例如胆固醇来制备脂质体。此类脂质体载体可以携带QS21和/或单磷酰脂质A(MPL)例如3D-MPL。合适的本发明的组合物是那些组合物，其中最初在无MPL的情况下制备脂质体（如WO96/33739中所描述），并且随后加入MPL，适合地为小于100 nm颗粒的小颗粒或容易经0.22 µm膜无菌过滤的颗粒。因此MPL不包含在小泡膜内（已知为MPL在外）。其中MPL包含在小泡膜内（已知为MPL在内）的组合物也形成本发明的方面。非缀合的肺炎链球菌蛋白可以包含在小泡膜内或包含在小泡膜外部。合适地可溶性抗原在外部，并且疏水的或脂化的抗原包含在膜的内部或者外部。脂质体内的胶囊化描述于US4235877中。

本发明的脂质体包含磷脂，例如磷脂酰胆碱，其可以在室温下是非结晶的，例如卵黄磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱或二月桂基磷脂酰胆碱。适合地，磷脂是二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)。进一步的方面是包含0.1-10mg、0.2-7、0.3-5、0.4-2或0.5-1 mg (例如0.4-0.6、0.9-1.1、0.5-1 mg)磷脂的本发明的免疫原性组合物。

本发明的脂质体可以包含甾醇。甾醇提高脂质体结构的稳定性。合适的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化醇和胆固醇。这些甾醇是本领域中描述的，例如胆固醇公开于Merck Index，第11版，第341页，作为动物脂肪中发现的天然产生的甾醇。在本发明的一个具体实施方案中，甾醇是胆固醇。通常，如WO96/33739中所描述，可以在抗原制备过程中使用用甾醇猝灭的QS21来加入甾醇。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25 mg (例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25-0.125 mg)甾醇。

在一个实施方案中，佐剂包含（每0.5 mL剂量）0.1-10mg、0.2-7、0.3-5、0.4-2或0.5-1 mg (例如0.4-0.6、0.9-1.1、0.5或1 mg)磷脂(例如DOPC)、0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25 mg (例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125 mg)甾醇(例如胆固醇)、5-60、10-50或20-30 μg (例如5-15、40-50、10、20、30、40或50 μg) 脂质A衍生物(例如3D-MPL)和5-60、10-50或20-30 μg (例如5-15、40-50、10、20、30、40或50 μg)皂苷(例如QS21)。

本发明的脂质体将适合地包含在液体培养基中。液体培养基包含生理可接受液体诸如水、盐水溶液和缓冲溶液，例如磷酸缓冲盐水（PBS）等。例如，本发明的免疫原性组合物可以包含水和PBS。

在本发明的一方面，佐剂为AS01B (例如见WO96/33739)。在本发明的另一方面，佐剂为AS01E (例如见WO2007/068907)。

在一些情况下，可能有利的是本发明的免疫原性组合物和疫苗将还包含稳定剂，例如其他乳化剂/表面活性剂，包括辛酸(Merck目录第十版，登录号1739)，其中三辛精是特别优选的。

水包油乳状液佐剂

水包油乳状液佐剂本身已被建议可用作佐剂组合物(EP 0 399 843B)，而且水包油乳状液和其他活性剂的组合已经作为疫苗佐剂进行描述(WO 95/17210; WO 98/56414;WO 99/12565; WO 99/11241)。已经描述其他油乳状液佐剂，诸如油包水乳状液(US 5,422,109; EP 0 480 982 B2)和水包油包水乳状液(US 5,424,067; EP 0 480 981 B)。所有这些构成了适合作为用于本发明的组合物的佐剂的优选油乳状液系统（特别是当掺入母育酚时）。

合适的油乳状液（例如水包油乳状液）包含可代谢的、无毒的油，诸如角鲨烷、生育酚诸如α生育酚和任选乳化剂（或表面活性剂）诸如聚山梨酯80 (Tween^TM 80)。也可以包括甾醇（例如胆固醇）。在本发明的一个方面，提供包含大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖和含有水包油乳状液的佐剂组合物的疫苗或免疫原性组合物，其中所述水包油乳状液每人剂量包含0.5-11mg可代谢油（诸如角鲨烯）、0.5-12 mg母育酚（诸如α生育酚）和0.4-5mg乳化剂（诸如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯）。

为了任何水包油组合物适合于人施用，乳状液系统的油相必须包含可代谢油。术语可代谢油的含义是本领域已知的。可代谢的可以定义为‘能够通过新陈代谢来转化’(Dorland’s Illustrated Medical Dictionary, W.B.Sanders Company, 25th edition(1974))。油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油，其对于受体是无毒的并且能够通过新陈代谢来转化。坚果、种子和谷物是植物油的常见来源。合成油也是本发明的部分并且可以包括可商购油诸如NEOBEE® 及其他油。特别合适的可代谢油是角鲨烯。角鲨烯（2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯）是不饱和油，其大量发现于鲨鱼肝油中，以较低量于橄榄油、麦胚芽油、米糠油和酵母中，并且是用于本发明的尤其优选的油。角鲨烯是这样的可代谢油，即其是胆固醇的生物合成的中间体(Merck目录第十版，登录号8619)。合适地，可代谢油以0.5-10 mg的量存在于佐剂组合物中，例如1-10、2-10、3-9、4-8、5-7或5-6 mg (例如 2-3、5-6或9-10mg)。

水包油乳状液合适地包含母育酚。母育酚是本领域中已知的并描述于EP0382271。合适地，母育酚是α生育酚或其衍生物，诸如α生育酚琥珀酸酯（也称为维生素E琥珀酸酯）。所述母育酚以0.5-11 mg的量存在于佐剂组合物中，例如1-11、2-10、3-9、4-8、5-7、5-6 mg(例如 10-11、5-6、2.5-3.5或1-3 mg)。在特定的实施方案中，母育酚以约5.94 mg或约2.38mg的量存在。在进一步的实施方案中，所述母育酚以0.5-11 mg的量存在于疫苗（或免疫原性）组合物中，例如1-11、2-10、3-9、4-8、5-7、5-6 mg (例如 10-11、5-6、2.5-3.5或1-3mg)。

水包油乳状液可进一步包含乳化剂。乳化剂可以合适地为聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯。在特定的实施方案中，乳化剂可以选自：聚山梨酯80 (Tween^TM 80)。合适的乳化剂合适地以0.1-5、0.2-5、0.3-4、0.4-3或2-3 mg (例如0.4-1.2、2-3或4-5 mg)乳化剂的量存在于佐剂组合物中。

生产水包油乳状液的方法是本领域技术人员已知的。通常，所述方法包括混合含有母育酚的油相与表面活性剂诸如PBS/Tween80溶液，随后使用匀浆器均化。包括将混合物通过注射器针头两次的方法将适合于将小体积的液体均化。同样，微射流器(microfluidiser)（M110S Microfluidics机, 最大50次通过, 以最大6 bar的压力输入持续2分钟的时期（约850 bar的输出压力））可以由本领域技术人员适配来产生较小或较大的乳状液体积。

在水包油乳状液中，油和乳化剂应在含水载体中。含水载体可以例如是磷酸缓冲盐溶液。

在一个实施方案中，本发明的水包油乳状液系统具有亚微米范围的小油滴大小。合适地，微滴大小将为直径在120-750 nm范围中，或120-600 nm。在一个实施方案中，水包油乳状液包含其中以强度(intensity)计至少70％为直径小于500 nm，或以强度计至少80％直径小于300 nm，或以强度计至少90％直径范围在120-200 nm的油滴。

油滴大小即直径根据本发明以强度给出。存在通过强度测定油滴直径的几种方式。强度通过使用大小降低仪器测量，合适地通过动态光散射诸如Malvern Zetasizer4000或合适地Malvern Zetasizer 3000HS来测量。第一种可能性是通过动态光散射(PCS,光子关联光谱法)测定在z平均直径（ZAD）；该方法另外给出多分散性指数（PDI），并且用累计算法计算ZAD和PDI两者。这些值不需要粒子折射率的知识。第二种方法是计算油滴直径，其通过由另一算法测定整个离子大小分布，所述算法为Contin、或非负最小二乘（NNLS）、或自动"Malvern"算法（由大小降低仪器提供的默认算法）。大部分时候，由于复杂组合物的粒子折射率是未知的，所以仅考虑强度分布，并且如需要，强度意指源自该分布。

本文所述的脂多糖（LPS）或脂寡糖（LOS）衍生物或突变或脂质A衍生物指代比天然脂多糖毒性更低（例如3D-MPL）。

在一个实施方案中，用于本发明的组合物的佐剂包含从可代谢油（诸如角鲨烯）、乳化剂（诸如Tween^TM 80）和任选母育酚（诸如α生育酚）制成的水包油乳状液。在一个实施方案中，佐剂包含（每0.5 mL剂量）0.5-15、1-13、2-11、4-8或5-6mg (例如2-3、5-6或10-11mg)可代谢油（诸如角鲨烯）、0.1-10、0.3-8、0.6-6、0.9-5、1-4或2-3 mg (例如0.9-1.1、2-3或4-5 mg)乳化剂(诸如Tween^TM 80)和任选0.5-20、1-15、2-12、4-10、5-7 mg (例如11-13、5-6或2-3 mg)母育酚(诸如α生育酚)。

佐剂可以任选还包含5-60、10-50或20-30 μg (例如5-15、40-50、10、20、30、40或50 μg)脂质A衍生物（例如3D-MPL）。

佐剂可以任选包含0.025-2.5、0.05-1.5、0.075-0.75、0.1-0.3或0.125-0.25 mg(例如0.2-0.3、0.1-0.15、0.25或0.125 mg)甾醇(例如胆固醇)、5-60、10-50或20-30 μg(例如5-15、40-50、10、20、30、40或50 μg) 脂质A衍生物(例如3D-MPL)和5-60、10-50或20-30 μg (例如5-15、40-50、10、20、30、40或50 μg)皂苷(例如QS21)。

在一个实施方案中，用于本发明的组合物的佐剂包含磷酸铝和脂质A衍生物（诸如3D-MPL）。该佐剂可以包含（每0.5 mL剂量）作为磷酸铝的100-750、200-500或300-400 μgAl、和5-60、10-50或20-30 μg (例如5-15、40-50、10、20、30、40或50 μg)脂质A衍生物（诸如3D-MPL）。

施用方法

包含本发明的免疫原性组合物的疫苗制剂可以用于通过经全身性或黏膜途径施用所述疫苗来保护或治疗易于感染的哺乳动物。这些施用可以包括经肌内（IM）、腹膜内(IP)、皮内(ID)或皮下(SC)途径注射；或经向口腔/消化道、呼吸道、生殖泌尿道的黏膜施用。尽管本发明的疫苗可以作为单一剂量施用，其组分也可以在同一时间或以不同次数一同共施用（例如，肺炎球菌糖缀合物可以单独、在疫苗的任何细菌蛋白组分施用的同一时间或其后1-2周施用，以彼此相关的免疫应答的最适协调）。对于共施用，任选Th1佐剂可以存在于任何或所有不同施用中。除了施用的单一途径之外，可以使用2种不同的施用途径。例如，多糖缀合物可以IM（或ID）施用，并且细菌蛋白可以IN（或ID）施用。此外，本发明的疫苗可以肌内施用为致敏剂量并且鼻内施用为加强剂量。

初始接种后，个体可以接受一次或适当分隔开的几次加强免疫。

疫苗

本发明还提供包含本发明免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂或载体的疫苗。

药学上可接受的赋形剂和载体是众所周知的且可以由本领域技术人员选择。例如，药学上可接受的赋形剂或载体可以包括缓冲剂，诸如Tirs（缓血酸胺）、磷酸盐（例如磷酸钠）、乙酸盐、硼酸盐（例如硼酸钠）、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸和琥珀酸盐（例如琥珀酸钠），合适地为氯化钠、组氨酸、磷酸钠或琥珀酸钠。药学上可接受的赋形剂可以包括盐，例如氯化钠、氯化钾或氯化镁。任选地，药学上可接受的赋形剂含有至少一种稳定溶解度和/或稳定性的组分。增溶剂/稳定剂的实例包括去污剂，例如月桂基肌氨酸和/或Tween（例如Tween 80）。稳定剂的实例还包括泊洛沙姆（例如泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407）。药学上可接受的赋形剂可以包括非离子表面活性剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚山梨酯-80（Tween 80）、聚山梨酸酯-60（Tween 60）、聚山梨酸酯-40（Tween 40）和聚山梨酯-20（吐温20）或聚氧乙烯烷基醚（合适的聚山梨酸酯-80）。可替代的增溶剂/稳定剂包括精氨酸和玻璃形成多元醇（例如蔗糖、海藻糖等）。药学赋形剂可以是防腐剂，例如苯酚、2-苯氧基乙醇或硫柳汞。其他药学上可接受的赋形剂包括糖（例如乳糖、蔗糖）和蛋白质（例如明胶和白蛋白）。药学上可接受的载体包括水、盐水溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液。众多药学上可接受的赋形剂和载体是本领域已知的且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，E. W. Martin, Mack Publishing Co.,Easton, PA, 第五版(975)。

根据本发明的另一方面，提供了制备本发明的免疫原性组合物或疫苗的方法，其包括将本发明的肺炎链球菌荚膜多糖（缀合物）任选与药学上可接受的赋形剂或载体混合的步骤。

疫苗制剂通常描述于Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach"(Powell M. F.和Newman M.J.编辑)(1995) Plenum Press New York)中。在脂质体内封装由Fullerton, 美国专利4,235,877描述。

本发明的疫苗可以储存于溶液中或者是冷冻干燥的。在一个实施方案中，将溶液在糖诸如蔗糖或乳糖存在的情况下冻干。还进一步优选的是将它们冻干并在使用前临时重构。冻干可能导致更稳定的组合物（疫苗），并且可能在存在3D-MPL和不存在铝基佐剂的情况下导致更高的抗体滴度。

在本发明的一个方面，提供疫苗试剂盒，其包括含有本发明的免疫原性组合物的小瓶，任选以冷冻干燥形式，并且还包括含有如本文描述的佐剂的小瓶。预想在本发明的该方面中，将使用佐剂来重构冷冻干燥的免疫原性组合物。

尽管本发明的疫苗可以通过任何途径施用，所描述的疫苗向皮肤内（皮内）的施用形成了本发明的一个实施方案。人皮肤包含被称为角质层（stratum corneum）外“角质”层，其覆盖表皮。在该表皮下是被称为真皮的层，其依次覆盖皮下组织。研究人员已经显示向皮肤（并且具体是真皮）内注射疫苗刺激免疫应答，其还可以与多种额外优点相关。用本文描述的疫苗皮内接种形成本发明的优选特征。

皮内注射的常规技术“mantoux方法”包括清洁皮肤并随后用一只手伸展的步骤，并且使狭窄的计量针(26-31量规)的斜面向上，将针以10-15°的角插入。一旦针的斜面插入，针筒降低并且进一步向前，同时提供轻微压力以在皮肤下使其升高。随后液体由此非常缓慢地注入，在皮肤表面上形成疱或肿块，随后缓慢地抽出针。

更近期，已经描述了特异性设计为向皮肤内或穿过皮肤施用液体药剂的设备，例如描述于WO 99/34850和EP 1092444中的设备，以及例如描述于WO 01/13977; US 5,480,381、US 5,599,302、US 5,334,144、US 5,993,412、US 5,649,912、US 5,569,189、US 5,704,911、US 5,383,851、US 5,893,397、US 5,466,220、US 5,339,163、US 5,312,335、US5,503,627、US 5,064,413、US 5,520, 639、US 4,596,556、US 4,790,824、US 4,941,880、US 4,940,460、WO 97/37705和WO 97/13537中的快速注射设备。疫苗制剂的皮内施用的可选方法可以包括常规注射器和针、或设计用于固体疫苗发射递送的设备(WO 99/27961)、或透皮贴剂(WO 97/48440; WO 98/28037)；或用于皮肤表面的(透皮或经皮肤递送WO 98/20734 ; WO 98/28037)。

当将本发明的疫苗向皮肤（或者更具体而言向真皮内）施用时，疫苗为小的液体体积，具体为约0.05 ml-0.2 ml的体积。

皮肤或本发明的皮内疫苗中的免疫原性组合物含量可以与如在肌内疫苗中发现的常规剂量（见上文）相似。然而，皮肤或皮内疫苗的特征是制剂可以是“低剂量”。因此，“低剂量”疫苗中的蛋白抗原合适地以少至每剂量0.1-10μg或0.1-5 μg存在；并且多糖（合适缀合的）抗原可以以每剂量0.01-1μg和合适地0.01-0.5 μg糖的范围存在。

如本文所用，术语“皮内递送”表示疫苗或免疫原性组合物向皮肤中真皮区域递送。然而，疫苗或免疫原性组合物不是必须专有地位于真皮中。真皮是皮肤中位于人类皮肤表面约1.0-约2.0 mm处的层，但个体间和身体的不同部分中存在某一量的变化。通常，可以预期通过进入皮肤表面下1.5 mm可以到达真皮。真皮位于表面的角质层和表皮与下面的皮下层之间。根据递送模式，疫苗或免疫原性组合物可以最终唯一地或主要地位于真皮内，或者它可以最终分布于表皮和真皮内。

本发明进一步提供了一种改进的疫苗，用于通过加入流感嗜血杆菌蛋白质（例如缀合形式的蛋白质D）来预防或改善由流感嗜血杆菌引起的中耳炎。一种或多种卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）蛋白抗原也可以游离或缀合形式包含在本发明的疫苗或免疫原性组合物中。因此，本发明是引发婴儿中针对中耳炎的免疫应答的改进方法。

可以包含在本发明的组合疫苗或免疫原性组合物中（特别是用于预防中耳炎）的优选的卡他莫拉菌蛋白抗原的实例是：外膜蛋白106 (OMP106) [WO 97/41731 (Antex) &WO 96/34960 (PMC)]；外膜蛋白21 (OMP21)或其片段(WO 0018910)；乳铁蛋白结合蛋白A(LbpA)和/或乳铁蛋白结合蛋白B (LbpB) [WO 98/55606 (PMC)]；转铁蛋白结合蛋白A(TbpA)和/或转铁蛋白结合蛋白B (TbpB) [WO 97/13785 & WO 97/32980 (PMC)]；卡他莫拉菌CopB蛋白 [Helminen ME, 等人 (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010]；普遍存在的表面蛋白A1 (UspA1)和/或普遍存在的表面蛋白A2 (UspA2) [WO 93/03761(University of Texas)]；外膜蛋白CD (OmpCD)；HasR (PCT/EP99/03824)；PilQ (PCT/EP99/03823)；外膜蛋白85 (OMP85) (PCT/EP00/01468)；lipo06 (GB 9917977.2)；lipo10(GB 9918208.1)；lipo11 (GB 9918302.2)；lipo18 (GB 9918038.2)；外膜蛋白P6 (P6)(PCT/EP99/03038)；D15 表面蛋白(D15) (PCT/EP99/03822)；外膜蛋白A1 (OmpA1) (PCT/EP99/06781)；Hly3 (PCT/EP99/03257)和外膜蛋白E (OmpE)。可以包含于组合疫苗（尤其是用于预防中耳炎）中的非典型性流感嗜血杆菌蛋白或其片段的实例包括：丝束蛋白[(US5766608-Ohio State Research Foundation)]和包含来自其的肽的融合体[例如LB1(f)肽融合体；US 5843464 (OSU)或WO 99/64067]；外膜蛋白26 (OMP26) [WO 97/01638(Cortecs)]；P6 [EP 281673 (State University of New York)]；TbpA和/或TbpB；流感嗜血杆菌黏附素 (Hia)；嗜血杆菌表面纤丝(Hsf)；流感嗜血杆菌Hin47蛋白；流感嗜血杆菌Hif蛋白；流感嗜血杆菌Hmw1蛋白；流感嗜血杆菌Hmw2蛋白；流感嗜血杆菌Hmw3蛋白；流感嗜血杆菌Hmw4蛋白；流感嗜血杆菌自转运蛋白黏附素 (Hap)；D15 (WO 94/12641)；P2和P5(WO 94/26304)。

治疗方法及用途

本发明提供了用于治疗或预防有需要的个体的肺炎链球菌感染的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的本发明的免疫原性组合物或疫苗。本发明还提供了免疫人宿主抵抗肺炎链球菌感染的方法，包括向宿主施用免疫保护剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗。本发明还提供了在个体中诱导针对肺炎链球菌（例如肺炎链球菌血清型6A）的免疫应答的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本发明的免疫原性组合物或疫苗。

在一个实施方案中，本发明是通过施用治疗有效量的本发明的免疫原性组合物或疫苗来引发婴儿（在本发明的上下文中定义为0-2岁）的免疫应答的改进方法。在一个实施方案中，免疫应答是保护性的（即它可以预防或减少由肺炎链球菌引起的感染）。在一个实施方案中，疫苗是儿科疫苗。

在一个实施方案中，本发明是在老年人群中引发（保护性）免疫应答的改进方法（在本发明的背景下，如果患者年龄在50岁或超过50岁，通常在超过55岁并且更一般地超过60岁，则将其认为是老年人），所述方法通过施用治疗有效量的本发明的免疫原性组合物或疫苗。

在一个实施方案中，本发明提供了保护个体抵抗由肺炎链球菌感染引起的疾病的方法，或预防肺炎链球菌感染的方法，或降低至少一种与由肺炎链球菌引起的感染相关的症状的严重性或延迟其发作的方法，所述方法包括向个体施用免疫原性量的本发明的免疫原性组合物或疫苗。

在一个实施方案中，本发明提供了用于预防或治疗由肺炎链球菌感染引起的疾病的本发明的免疫原性组合物和疫苗。在一个实施方案中，本发明提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗在制备用于预防（或治疗）由肺炎链球菌感染引起的疾病的药物中的用途。

由肺炎链球菌感染引起的疾病可以选自肺炎、侵入性肺炎球菌疾病（IPD）、慢性阻塞性肺病（COPD）的恶化、中耳炎、脑膜炎、菌血症、肺炎和/或结膜炎。当人类宿主是婴儿时，该疾病可以选自中耳炎、脑膜炎、菌血症、肺炎和/或结膜炎。当人类宿主是老年人时，该疾病可以选自肺炎、侵入性肺炎球菌病（IPD）和/或慢性阻塞性肺病（COPD）的恶化。

本文中涉及本发明的“疫苗组合物”的实施方案也适用于涉及本发明的“免疫原性组合物”的实施方案，并且反之亦然。

本发明的实施方案进一步描述于以下编号的段中：

段1：大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖的平均大小（Mw）为180-400、210-400、210-370、220-360、230-350、240-340、240-320、240-310或250-310 kDa。

段2：根据段1的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖，其已经通过机械大小降低技术进行大小降低。

段3：根据段1或段2的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖，其缀合至载体蛋白（例如CRM-197）。

段4：根据段3的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖直接缀合至载体蛋白。

段5：根据段3-4中任一项的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖，其中所述6A多糖使用CDAP化学作用缀合至载体蛋白或缀合至接头。

段6：根据段3-5中任一项的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖，其中使用CDAP化学作用并使用1:2-3:1、1:1.5-2:1或1:1的CDAP:PS6A比率将所述血清型6A多糖（PS6A）缀合至载体蛋白或缀合至接头。

段7：根据段3-6中任一项的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖，其中使用CDAP化学作用将所述血清型6A荚膜多糖缀合至载体蛋白或缀合至接头，其中所述反应使用50-130分钟、60-130分钟或110-130分钟的偶联时间进行。

段8：根据段3-7中任一项的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖，其中载体蛋白与血清型6A荚膜多糖的比率为5:1-1:5、4:1-1:1或2:1-1:1、1.5:1-1:1、1.4:1-1.3:1(例如1.2:1、1.5:1) (w/w)。

段9：根据段1-8的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖，其中所述6A荚膜多糖通过不超过x5的系数进行大小降低。

段10：制备肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合物的方法，其包括使用CDAP化学作用并使用1:2-3:1、1:1.5-2:1或1:1的CDAP:PS比率将大小降低的肺炎链球菌血清型6A多糖缀合至载体蛋白或缀合至接头。

段11：根据段10的方法，其中所述反应使用50-130分钟、60-130分钟或110-130分钟的偶联时间进行。

段12：制备肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合物的方法，其包括（a）将大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合至载体蛋白和（b）针对具有低于150mM浓度的NaCl的溶液进行渗滤。

段13：免疫原性组合物，其包含根据段1-9的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖或通过段10-12中任一项的方法获得的缀合至载体蛋白的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖。

段14：根据段13的免疫原性组合物，其包含来自不同肺炎链球菌血清型的10或更多种、11或更多种、12或更多种、13或更多种、14或更多种、15或更多种或16或更多种荚膜多糖缀合物。

段15：根据段13或段14的免疫原性组合物，其包含1种或多种来自肺炎链球菌的天然荚膜多糖缀合物。

段16：根据段15的免疫原性组合物，其包含天然肺炎链球菌荚膜血清型6B多糖。

段17：根据段15或16的免疫原性组合物，其包含天然肺炎链球菌荚膜血清型23F多糖。

段18：根据段13-17中任一项的免疫原性组合物，其包含具有500-1800、900-1660或1000- 1400 kDa的平均大小（M_W）的肺炎链球菌荚膜血清型6B多糖。

段19：根据段13-18中任一项的免疫原性组合物，其包含具有500-1500、600-1500、700-1300、900-1250、800-1100或900-1100 kDa的平均大小（M_W）的肺炎链球菌荚膜血清型23F多糖。

段20：根据段13-19中任一项的免疫原性组合物，其包含来自以下的肺炎链球菌荚膜多糖：(a)血清型1，其具有平均大小(M_w)为100-1000、200-800、250-600或300-400 kDa;(b)血清型4，其具有平均大小(M_w)为50-500、60-300、70-150或75-125 kDa; (c)血清型5，其具有平均大小(M_w)为100-1000、100-700、100-350或150-300 kDa; (d)血清型7F，其具有平均大小(M_w)为50-1000、100-750、150-500或200-300 kDa; (e)血清型9V，其具有平均大小(M_w)为50-1000、100-750、150-500、200-400或250-300 kDa; (f)血清型14，其具有平均大小(M_w)为50-1000、100-750、150-500或200-250 kDa; (g) 18C，其具有平均大小(M_w)为50-1000、50-750、50-500、50-190、50-150或80-110 kDa (h)血清型19F，其具有平均大小(M_w)为50-1000、100-750、100-500、100-190或120-180 kDa; 和/或(i)血清型19A，其具有平均大小(M_w)为50-800kDa、110-700、110-300、120-200、130-180、140-160或80-130 kDa.

段21：根据段13-20中任一项的免疫原性组合物，其还包含具有50-800 kDa、110-700 kDa、110-300、120-200、130-180、150-170、100-190、100-150、95-125或100-115 kDa的平均大小（M_W）的肺炎链球菌荚膜血清型22F。

段22：根据段13-21中任一项的免疫原性组合物，其包含2、3、4、5或6种不同的载体蛋白。

段23：根据段13-22中任一项的免疫原性组合物，其中一种或多种或所有载体蛋白选自白喉类毒素（DT）、CRM197、破伤风类毒素（TT）、TT的片段C、dPly、PhtA、PhtB、PhtD、PhtE、PhtDE OmpC、PorB和流感嗜血杆菌蛋白D。

段24：根据段13-23中任一项的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌荚膜血清型6B多糖缀合至与肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合的载体蛋白不同的载体蛋白（例如蛋白D）。

段25：根据段13-24中任一项的免疫原性组合物，其包含缀合至蛋白D的血清型1糖、缀合至蛋白D的血清型4糖、缀合至蛋白D的血清型5糖、缀合至蛋白D的血清型6B糖、缀合至蛋白D的血清型7F糖、缀合至蛋白D的血清型9V糖、缀合至蛋白D的血清型14糖和缀合至蛋白D的血清型23F糖.

段26：根据段13-25中任一项的免疫原性组合物，其包含缀合至白喉类毒素的血清型19F。

段27：根据段13-26中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含缀合至破伤风类毒素（TT）的糖18C，任选地其中18C是组合物中唯一的缀合至破伤风类毒素（TT）的糖，任选经ADH接头。

段28：根据段13-27中任一项的免疫原性组合物，其还包含缀合至载体蛋白的以下一种或多种肺炎链球菌荚膜糖：血清型33F、血清型15和血清型12F。

段29：根据段13-28中任一项的免疫原性组合物，其中6A糖缀合物的剂量为1-10 μg、1-5 μg或1-3 μg糖(例如2 μg)。

段30：根据段13-29中任一项的免疫原性组合物，其还包含选自以下的一种或多种未缀合的或缀合的肺炎链球菌蛋白：多聚组氨酸三联体家族（PhtX）、胆碱结合蛋白家族（CbpX）、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、脱毒的肺炎球菌溶血素（Ply）、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133。

段31：根据段13-30中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。

段32：段31的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含（每0.5 mL剂量）作为磷酸铝的100-750、200-500或300-400 μg Al（铝）。

段33：疫苗，其包含段13-32中任一项的的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂或载体。

段34：制备根据段33的疫苗的方法，其包括将段13-32中任一项的免疫原性组合物与药学上可接受的赋形剂或载体混合的步骤。

段35：用于治疗或预防有需要的个体的肺炎链球菌感染的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的段13-32中任一项的免疫原性组合物或段33的疫苗。

段36：针对肺炎链球菌感染对人宿主进行免疫的方法，其包括向所述宿主施用免疫保护性剂量的段13-32中任一项的免疫原性组合物或段34的疫苗。

段37：在个体中诱导针对肺炎链球菌血清型6A的免疫应答的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的段13-32中任一项的免疫原性组合物或段33的疫苗。

段38：段13-32的免疫原性组合物或段33的疫苗，其用于治疗或预防由肺炎链球菌感染引起的疾病。

段39：段12-32的免疫原性组合物或段33的疫苗在制备用于治疗或预防由肺炎链球菌感染引起的疾病的药物中的用途。

本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请通过引用并入本文。

为了本发明可以更好地理解，描述以下实施例。这些实施例仅为说明目的，而不应以任何方式解释为限定本发明的范围。

实施例

实施例1-大小降低的多糖的制备

大小降低

使用匀浆器EMULSIFLEX C-50装置在活化步骤（微流化）之前降低多糖的分子量和粘度。大小降低的效率取决于回路压力和总循环次数。用具有固定几何形状的小室替代EMULSIFLEX C-50的均化小室(Microfluidics F20Y-75µm相互作用室用于E01至E07；Microfluidics F30Y-125µm相互作用室用于E08)。大小降低的目的在于降低多糖的分子量和粘度但不严格降低其抗原性。

大小降低后同进程进行粘度测量法(Brookfield Programmable DV III + 电流计)。当达到目标粘度，将大小降低的多糖通过HP-SEC-RI (高效尺寸排阻层析，折射率)表征。

M_w的同进程表征通过HP-SEC-RI (TSK5000PW_XL 柱 + 保护柱)进行。使用50mM Na/K₂PO₄、500mM NaCl pH 7.6以0.6ml/min的流速实现洗脱。通过折射率检测器实现检测。该表征基于测定相对保留时间（RRT）。对于具有在TSK5000PW_XL柱分离的线性范围内的分子量的经校正的葡聚糖计算RRT。RRT通过以下式来确定：

RT _{(大小降低的PS)} = 大小降低的PS（多糖）的保留时间

RT _{(HMW dext)} = 高分子量葡聚糖(葡聚糖1730 Kda)的保留时间

RT _{(LMW dext)} = 低分子量葡聚糖(葡聚糖150 Kda)的保留时间

将天然血清型6A多糖以15mg/ml室温下在4小时过程中溶解于WFI（注射用水）。4小时溶解后，将溶液pH调整为6.5 +/- 0.5，随后将其转移至冷室以继续溶液过夜。大小降低之前，将天然血清型6A多糖的溶液在5 µm滤器上澄清。

然后用具有Microfluidics F30Y-125μm均化小室的Emulsiflex在2900-3800的压力下将血清型6A多糖大小降低。当多糖粘度达到粘度目标值（8.35或12.4）时停止大小降低。所需的周期数取决于目标。例如，使用2900 psi的压力需要32.5个循环以达到12.4cps的粘度。对于该样品，通过HP-SEC-RI同进程测定相对保留时间得到0.28的值。

在Millipak 20（5g规模）膜（截止0.22μm）上以10ml/min的流速过滤大小降低的6A多糖。

通过比色法（间苯二酚）在用于缀合之前精确测定大小降低的血清型6A多糖溶液的多糖含量。大小降低的多糖通过HP-SEC-MALLS表征或通过葡聚糖校准曲线估计并测定抗原活性（表1）。

抗原性

将测试样品和参考样品在先前用针对肺炎链球菌多糖血清型6A（PS6A）产生的单克隆抗体包被的微量滴定板中温育。然后加入兔多克隆抗PS6A抗体。使用连接的山羊抗兔Ig过氧化物酶显示抗原-抗体复合物。然后通过系统邻苯二胺/H₂O₂与过氧化物酶反应进行显色。通过分光光度法测量显色（490和620nm处的吸光度）。将多糖曲线与参考曲线（一个天然多糖批次用作参考，而另一个天然多糖批次用作内部对照）进行比较以测定多糖浓度。

通过MALLS测量分子量和多分散性

通过激光散射(SEC-MALLS)测定分子量(M_w)。在第一次，在TSK5000PW_XL (+保护柱)上使用NaCl 0.2M + 0.02%叠氮化物作为洗脱缓冲液进行分析。在TSKGMPW_XL柱(+保护柱)上样100 μl多糖(1 mg/ml)用50 mM Na/K₂PO₄、200 mM NaCl pH 7.0作为洗脱缓冲液且流速为0.75 ml/min进行最后分析。

检测用激光分光光度计和干涉折射计(Wyatt Otilab DSP，装配有P100小室和498nm处的红色滤光器)实现。

数均分子量(M_n)也通过MALLS获得。大小降低的多糖的多分散性作为M_w/M_n比率获得。

首先使用0.14的理论dn/dc。当测定时，使用0.151的实验值。

表1:大小降低的PS6A表征

¹ RRT: 相对保留时间(HP-SEC-RI) -² HP-SEC-RI-³ 相对值相对于对应的天然多糖。备注：对于批次E06和E08在T0没有获得MALLS值。在T13M（时间=13分钟）或T12M（时间=12分钟）处的值可以认为是在相对保留时间范围内的代表值，并且对于两个样品粘度在T0（时间=0分钟）至T13M或T12M之间没有改变。ND表示“未测定到”。

实施例2：具有不同载体的6A缀合物的产生

a) 天然肺炎链球菌血清型6A多糖相对于大小降低的肺炎链球菌血清型6A多糖

用于产生不同6A缀合物的活化和偶联条件在表2中给出。

表2:肺炎链球菌血清型6A多糖-蛋白D/PhtD缀合物的具体活化/偶联/猝灭条件

所得的缀合物的最终蛋白/PS6A比率(w/w)为：

PS6A-PD003:0.6/1 (天然PS6A, M_W通过MALLS为1106kDa)

PS6A-PhtD004:1.4/1 (天然PS6A, M_W通过MALLS为1106kDa)

PS6A-PhtD008:2.7/1 (大小降低的PS6A, 批次E01)

PS6A-dPly010:1.65/1 (大小降低的PS6A, 批次E01)

b) 缀合至不同载体的大小降低的多糖

用于产生不同PS6A缀合物的活化和偶联条件在表3中给出。

表3:PS6A蛋白D/CRM197/PhtD缀合物的具体活化/偶联/猝灭条件

所得的缀合物的最终蛋白/PS6A比率(w/w)为：

PS6A-PD/LS001和PS6A-PD/LS002:1.6/1 (大小降低的PS6A, 批次E06)

PS6A-CRM197/025:1.3/1 (大小降低的PS6A, 批次E03)

PS6A_AH-PhtD缀合物 (批次 6A-PhtD106)

在第二缀合方法中，将PS6A经接头-己二酸二酰肼（ADH）连接至载体蛋白；该缀合物命名为PS6A_AH-PhtD。

PS6A衍生化

活化和偶联在25℃下在温控水浴中连续搅拌下进行。将经微流化的PS6A稀释以获得在注射用水（WFI）中的最终多糖浓度为10mg/ml，并且使用0.1N HCl将溶液调节至pH 6.0±0.2。加入CDAP溶液（在乙腈/WFI中新鲜制备的100mg/ml，50/50）以达到适当的CDAP/PS比率（1/1，w/w）。

通过添加0.2M NaOH将pH升高至活化pH 9.00±0.05。

3分钟后，加入ADH以达到合适的ADH/PS比率（8.9/1 w/w）；将pH调节至偶合pH9.0。在pH调控下将溶液静置1小时。将PS_AH 衍生物随后针对0.2M NaCl透析。

偶联

将以7.5 mg/ml于0.2M NaCl中的PhtD加入到PS6A_AH 衍生物中(具有ADH接头的PS6A)以达到PhtD/PS6A_AH比率为3/1 (w/w)。用HCl将pH调节至5.0 ± 0.05。将EDAC溶液(50mg/ml于0.1M Tris-HCl pH 7.5)在10分钟内手动添加(20 μl/min)以达到0.5 mg EDAC/mgPS6A_AH。将所得溶液在室温下在搅拌和pH调节下温育45分钟。通过加入1ml的1M Tris-HClpH 7.5并在室温下放置30分钟来中和溶液。

在Sephacryl S400HR上洗脱之前，使用5μm Minisart过滤器使缀合物澄清。所得的缀合物PS6A_AH-PhtD106具有最终PhtD/PS6A比率为2.84 (w/w)。

选择相对保留时间中的目标(RRT _150-1730 约0.50)。用大小降低的多糖制备几种缀合物（6A-PhtD004（天然多糖）和6A-PhtD008（大小降低的多糖）（如上所述），并与用天然PS6A产生的缀合物进行比较。

实施例3：抗PS6A应答的临床前评价

使用AlPO₄作为佐剂，在第0、14和28天，用含有PS6A缀合物（以人剂量的1/10）的14价（14V）制剂对40只小鼠的组进行IM免疫。在第42天收集的个体血清中测量抗-PS6A ELISAIgG滴度和调理吞噬作用（OP）效价。

14V制剂含有以下缀合物：

1-PD、3-PD、4-PD、5-PD、6B-PD、7F-PD、9V-PD、14-PD、18C-TT_AH、19A-dPly、19F-DT、22F-PhtD、23F-PD。血清型6A与作为载体的PD、PhtD或dPly缀合。

结果总结于图1 ELISA抗PS6A应答。

结论：

用天然多糖（1106kDa）产生的PS6A-PD缀合物获得最高的抗-PS6A ELISA IgG效价。评估显示具有大小降低的多糖的缀合物具有较低的免疫原性趋势。使用PhtD作为载体，用大小降低的多糖（14V（6A-PhtD/008，使用批号E01）产生的缀合物观察到较低的抗PSELISA IgG效价。随后，如以下实施例中所述，研究了大小降低目标的变化以产生具有过程稳健性和所得缀合物的免疫原性的PS6A。进行以下实验以评估来自批次E01的具有比PS6A更高分子量的大小降低的多糖。

实施例4：大小降低的PS6A-CRM197缀合物的评价

对于每种缀合物，缀合参数在表4中给出（PS6A和载体浓度，初始载体/PS6A比率（w/w），偶联时间和CDAP/S6A比率（w/w）

溶液的制备

• CDAP溶液

就在活化之前，在乙腈/注射用水（50/50（v/v））中以100mg/ml制备氰基二氨基吡啶鎓四氟硼酸盐（CDAP）溶液

活化

将天然或大小降低的PS6A以确定浓度稀释并且将溶液的pH设定为6.0 ± 0.2。在时间0时，手动添加CDAP溶液以获得确定的CDAP/PS6A比率（w/w）。

1.5分钟后，通过加入NaOH将pH升高至活化pH值。

在时间为4.5分钟时，加入蛋白溶液（在确定的浓度和缓冲液中）以获得固定的蛋白/PS6A比率（w/w）。在确定的时间期间（耦合时间-参见表4），在耦合pH值下调节溶液的pH。

在时间T =偶联时间+ 4min 30时，加入甘氨酸2M pH 9.0的溶液以猝灭反应。在猝灭30分钟后，将缀合物直接注射入纯化柱或在+2至+8℃连续搅拌下放置过夜，然后纯化。

纯化

在纯化之前，将缀合物溶液通过5μm或10μm膜过滤以去除聚集体和颗粒。然后在Sephacryl S400HR柱上纯化缀合物（床高：100厘米+/- 10厘米），使用NaCl 150mM作为洗脱剂。然后将缀合物在0.22μmPVDF（聚偏二氟乙烯）膜上无菌过滤。灭菌的部分(bulk)（缀合的部分）储存在+2-8℃直至配制。

表征

通过Lowry/间苯二酚浓度的比率测定灭菌的缀合物上最终的蛋白/多糖比率(w/w)。使用下文所述的方法测定抗原性和游离PS（多糖）含量。数据显示在表5中。

抗原性测试

天然多糖被指定为100％的抗原性指数值。在抗原性指数和免疫原性之间的相关性尚未建立的情况下，确定大小降低的多糖抗原性作为指示性值。目标是保持这个值尽可能高。该值由ELISA测定。

在夹心型ELISA中测定多糖的抗原性（测量抗原性参见实施例1）。

通过ELISA的游离PS含量

缀合物与抗载体血清反应后，使用饱和硫酸铵（SAS）沉淀复合物。离心后，通过ELISA（抗PS/抗PS，参见部分2.8.1.2）在上清液中测量游离PS06A含量。游离PS的百分比与间苯二酚法测得的总PS含量成比例计算。

通过α-载体/α-PS06A ELISA还控制上清液中不存在缀合物。

表4:在50mg规模下PS6A-CRM197缀合物的处理条件

注意：命名诸如“PS6ACRM197/024”表示来自批次024的PS6ACRM197。

表5:在50mg-PS规模下PS6A-CRM197缀合物的表征

第一组缀合物（PS6A-CRM197/015、PS6A-CRM197/016）是用天然多糖（经MALLS的M_W为990kDa）产生的，并且显示出所得缀合物的可获得的最终CRM/PS比率和可滤性方面的限制（表5）。

使用大小降低的多糖（批次E01）生产第二组缀合物（PS6A-CRM197/017、PS6A-CRM197/018、PS6A-CRM197/019、PS6A-CRM197/020、PS6A-CRM197/021）。通过增加CDAP/PS比率和/或初始CRM/PS比率，可以达到期望的最终CRM/PS比率和多糖产率。最佳条件（PS6A-CRM197/021）用新的大小降低的多糖批次（但具有比先前更高的分子量（批号E03））重现。但是观察到过滤问题。发现通过减少偶联时间或CDAP/PS6A比率，解决了过滤问题。

使用大小降低的血清型6A多糖（批号E03）产生第三组缀合物（PS6A-CRM197/022、PS6A-CRM197/023、PS6A-CRM197/024）。最佳条件（PS6A-CRM197/024）如下：在2M NaCl中的多糖浓度为10mg/ml，CDAP/PS比率为1/1（w/w），于10mM K/K₂ PO₄ pH7.2、0.2M NaCl中的CRM浓度为10mg/ml，初始CRM/PS比率为1.5/1（w/w），活化和偶联的pH为9.5，偶联时间为120分钟。所得缀合物对于约65%的总产率具有约1.2/1（w/w）的最终CRM/PS比率。

实施例5：在200mg规模下大小降低的6A-CRM197缀合物的产生

进行以200mg-PS规模的比例放大(表6和表7)。

表6:在200mg-PS规模下PS6A-CRM197缀合物的处理条件

表 7:在200mg-PS规模下PS6A-CRM197缀合物的表征

来自200mg-PS规模的数据与以小规模获得的数据一致。所得缀合物的最终CRM/PS比率为1.25至1.32/1，总多糖产率为56％。就稳定性而言，在HP-SEC分析或通过ELISA的游离多糖含量（用化学方法无法获得数据）中没有出现问题。

基于这些结果，在下列条件下产生进一步批次（参见下表5）：在2M NaCl中10mg/ml的多糖浓度，1/1（w/w）的CDAP/PS比率，于在10mM K/K₂PO₄pH 7.2、2M NaCl中的CRM浓度为10mg/ml，初始CRM/PS比率为1.5/1（w/w），活化和偶联的pH为9.5，偶联时间为120分钟。

实施例6：PS6A缀合物在小鼠中的免疫原性

在Balb/c小鼠中评价不同大小降低的PS6A缀合物（作为单价制剂）：用大小降低的PS产生的6A-CRM197(PS6A-CRM025)、6A-PD(PS6A-PDLS001(E06))、6A-PD(PS6A-PDLS002(E06))、6A-PhtD (PS6A-PhtD008)和6A_AH-PhtD (PS6A-PhtD106 (E04))、PS6A-PhtD (PS6A-PhtD100(E06))。

将34只Balb/c小鼠用0.3μg吸附在AlPO₄上的不同PS6A缀合物免疫三次（第0-14-28天）。在第42天收集的个体血清中测量抗-PS6A ELISA IgG滴度和调理吞噬作用（OP）效价水平。结果显示在图2A和2B中。在ELISA和OPA中，PS6A-AH-PhtD（CDAP/EDAC）和PS6A-CRM025（CDAP）诱导显著更高的抗体应答。

实施例7：大小降低的PS6A的表征

CRM197浓度

CRM197的融化

纯化的部分在-20℃下在10mM K/K₂PO₄ pH7.2中以1.917mg/ml的浓度储存。在+2/+8℃将7.5g纯化的部分解冻过夜。

通过UF浓缩

超滤是在室温下在centramate装置上实现的。

超滤膜是0.09m²具有10kDa截止的OMEGA中等筛选膜（2个膜）。循环流速为1200ml/min，运行过程中施加的跨膜压力为7-10 psi。

将CRM197部分7.5倍浓缩以达到约15mg/ml的浓度（缀合目标>10mg/ml）。

在0.22 µm上过滤

超滤后，将浓缩的部分以20ml/min在0.22μm Millipack 20过滤器（PVDF）上无菌过滤。然后将其储存在-20℃直至其用于偶联。

大小降低的PS6A通过以下测试来表征：通过ELISA的MALLS和抗原含量。在-70℃下2个月后评估稳定性（T = 0相比于T = 2个月）。当大小降低的PS6A储存在-70℃时没有观察到稳定性问题。大小降低的PS6A表征的结果总结在（表8）中。

表8:大小降低的PS6A的表征数据和稳定性

两种缀合物（D06ADJA001，D06ADJA002）以2g-PS规模使用大小降低的PS6A的批次和作为载体的批次来生产。以下描述缀合的条件。

反应在1L生物反应器中在25 +/- 1℃下进行。

将2g大小降低的PS6A在2M NaCl中以10mg/ml稀释，并用0.05N HCl溶液将溶液的pH调节至6.0 +/- 0.2。

在T = 0时，将2g溶液中的CDAP（在CH₃CN/H₂O 50/50中100mg/ml的溶液）手动加入到溶液中（CDAP/PS比率= 1.0/1w/w）。

在T = 1分钟30时，通过加入0.5N NaOH将pH增加至9.5 +/- 0.05。大约需要90秒以达到目标pH值。

在T = 4分钟30时，将3g的CRM197 (在10 mM KH₂PO₄/K₂HPO₄ pH 7.2、2M NaCl中10mg/ml的溶液)加入到活化的PS6A溶液1分钟，以实现CRM197/PS6A比率为1.5/1 w/w。在120分钟过程中将pH调节为9.5 +/- 0.05。

在T =124分钟30时，将100 ml 2M甘氨酸pH 9.0的溶液加入以猝灭缀合物(比率Gly/PS = 7.5/1 w/w)。猝灭30分钟后，使用5N HCl将混合物的pH调节为6.5 +/- 0.2。pH稳定时，将缀合物在+2/+8℃持续搅拌下放置过夜，随后澄清并纯化。

纯化

在Sephacryl S400HR上洗脱之前，使用10μm Kleenpack HDCII过滤器以50 ml/min使缀合物澄清。

随后将缀合物注射在Sephacryl S400HR上。用0.15M NaCl溶液完成洗脱并且收集合并物基于Kd值。Kd是分布系数(Kd = (V_e – V₀)/ (V_t-V) V_e= 洗脱体积，V₀ = 空隙体积,V_t = 柱的总体积。

对于合并物收集使用以下标准：从OD _280nm=0.05 AU至Kd值为0.28。

灭菌过滤

过滤之前，将所述部分恢复至室温。

将批次在Opticap 4”消毒膜（1900cm²，PVDF）上以40ml/min的流速过滤。过滤前用0.15M NaCl缓冲液润洗过滤器。过滤后，将200ml的0.15M NaCl通过过滤器以限制材料的损失。过滤过程中没有出现问题。

临床前评估

用含有0.1μg D06ADJA001、D06ADJA002、PS6A-CRMLS001（用大小降低的PS6A产生，批次E07）、PS6A-CRMLS002（用大小降低的PS6A产生，批号E07）或PS6A-PDLS001（作为基准）的吸附缀合物制剂（AlPO₄）在第0、14和28天将48只雌性Balb/c小鼠（4周龄）的组进行IM免疫。

在第42天收集的个体血清中测量抗-PS6A IgG水平（图3A）和调理吞噬滴度（图3B）。在ELISA和OPA中，在根据实施例7产生的PS6A-CRM相比于根据实施例5产生的PS6A-CRM诱导的抗体应答中，没有观察到显著差异。

实施例8：6A缀合物的制备

在15L反应器中，使用以200mg PS规模生产的大小降低的6A的缀合参数（参见实施例5），在15g PS规模下生产大小降低的6A缀合物（批次E06AADJA059）。然后使用NaCl 150mM作为洗脱液在Sephacryl S400HR柱（BPG450柱（GE Healthcare））上纯化缀合物。然后将缀合物在0.22μm PDVF膜上无菌过滤，并储存在2-8℃。将缀合物浓缩（5x）并使用10kDa MWCOOMEGA PES膜（T-系列，PALL）对WFI（注射用水）进行渗滤（10渗滤体积）。然后在0.22μm膜上过滤保留物。

Claims

1.免疫原性组合物，其包含大小降低的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型6A荚膜多糖和天然肺炎链球菌荚膜血清型6B多糖，其中所述肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖的平均大小(M_w)为250-310 kDa，并且其中所述大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖和所述天然肺炎链球菌荚膜血清型6B多糖各自缀合至载体蛋白，并且其中所述载体蛋白是CRM-197或PhtD。

2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖已经通过机械大小降低技术进行大小降低。

3.如权利要求1或权利要求2所述的免疫原性组合物，其中载体蛋白是CRM-197。

4.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖直接缀合至所述载体蛋白。

5.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述6A多糖使用CDAP化学作用缀合至载体蛋白或缀合至接头。

6.如权利要求1或权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述6A荚膜多糖大小降低不超过x5的系数。

7.制备肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合物的方法，其包括使用CDAP化学作用并使用1:2-3:1的CDAP:PS比率将大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合至载体蛋白或缀合至接头，其中所述肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖的平均大小(M_w)为250-310 kDa，并且其中所述载体蛋白是CRM-197或PhtD。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述CDAP化学作用使用50-130分钟的偶联时间进行。

9.制备肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合物的方法，其包括(a)将大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合至载体蛋白和(b)针对具有浓度低于150mM的NaCl的溶液进行渗滤，其中所述肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖的平均大小(M_w)为250-310 kDa，并且其中所述载体蛋白是CRM-197或PhtD。

10.免疫原性组合物，其包含如权利要求1-6中任一项所述的大小降低的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖或通过如权利要求7-9中任一项所述的方法获得的缀合至载体蛋白的肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖以及天然肺炎链球菌荚膜血清型6B多糖。

11.如权利要求10所述的免疫原性组合物，其包含来自不同肺炎链球菌血清型的10或更多种荚膜多糖缀合物。

12.如权利要求10或权利要求11所述的免疫原性组合物，其包含1种或多种来自肺炎链球菌的天然荚膜多糖缀合物。

13.如权利要求12所述的免疫原性组合物，其包含天然肺炎链球菌荚膜血清型23F多糖。

14.如权利要求10或权利要求11所述的免疫原性组合物，其包含具有500-1800的平均大小(M_W)的肺炎链球菌荚膜血清型6B多糖。

15.如权利要求10或权利要求11所述的免疫原性组合物，其中一种或多种或所有载体蛋白选自白喉类毒素(DT)、CRM197、破伤风类毒素(TT)、TT的片段C、dPly、PhtA、PhtB、PhtD、PhtE、PhtDE OmpC、PorB和流感嗜血杆菌蛋白D。

16.如权利要求10或权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌荚膜血清型6B多糖缀合至与肺炎链球菌血清型6A荚膜多糖缀合的载体蛋白不同的载体蛋白。

17.如权利要求10或权利要求11所述的免疫原性组合物，其还包含缀合至载体蛋白的以下一种或多种肺炎链球菌荚膜糖：血清型33F、血清型15和血清型12F。

18.权利要求10或权利要求11所述的免疫原性组合物，其还包含选自以下的一种或多种未缀合的或缀合的肺炎链球菌蛋白：多聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、脱毒的肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133。

19.如权利要求10或权利要求11所述的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。

20.疫苗，其包含如权利要求10-19中任一项所述的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂或载体。

21.制备如权利要求20所述的疫苗的方法，其包括将如权利要求10-19中任一项所述的免疫原性组合物与药学上可接受的赋形剂或载体混合的步骤。

22.如权利要求10-19中任一项所述的免疫原性组合物或如权利要求20所述的疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防有需要的个体中的肺炎链球菌感染，其包括向所述个体施用治疗有效量的如权利要求10-19中任一项所述的免疫原性组合物或如权利要求20所述的疫苗。

23.如权利要求10-19中任一项所述的免疫原性组合物或如权利要求20所述的疫苗在制备药物中的用途，所述药物针对肺炎链球菌感染对人宿主进行免疫，其包括向所述宿主施用免疫保护性剂量的如权利要求10-19中任一项所述的免疫原性组合物或如权利要求20所述的疫苗。

24.如权利要求10-19中任一项所述的免疫原性组合物或如权利要求20所述的疫苗在制备药物中的用途，所述药物在个体中诱导针对肺炎链球菌血清型6A的免疫应答，其包括施用治疗或预防有效量的如权利要求10-19中任一项的免疫原性组合物或如权利要求20所述的疫苗。

25.如权利要求10-19中任一项所述的免疫原性组合物或如权利要求20所述的疫苗，其用于治疗或预防由肺炎链球菌感染引起的疾病。

26.如权利要求10-19中任一项的免疫原性组合物或如权利要求20所述的疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防由肺炎链球菌感染引起的疾病。