BE1024465A1 - Vaccin - Google Patents

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BE1024465A1 BE20165782A BE201605782A BE1024465A1 BE 1024465 A1 BE1024465 A1 BE 1024465A1 BE 20165782 A BE20165782 A BE 20165782A BE 201605782 A BE201605782 A BE 201605782A BE 1024465 A1 BE1024465 A1 BE 1024465A1
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Elisabeth Marie Monique Bertaud
Ralph Leon Biemans
Nicolas Jean Benoit Moniotte
Laurent Strodiot
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Glaxosmithkline Biologicals Sa
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Abstract

La présente invention concerne le domaine des vaccins à conjugués de saccharides capsulaires pneumococciques. Plus précisément, la présente invention concerne des polysaccharides capsulaires dimensionnés de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A, en particulier des polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A dont la taille moyenne (par exemple, Mw) est située entre 100 et 1000 kDa, conjugués de manière appropriée à une protéine porteuse.

Description

(71) Demandeur(s) :
GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA
1330, RIXENSART
Belgique (72) Inventeur(s) :
BERTAUD Elisabeth Marie Monique
1330 RIXENSART
Belgique
BIEMANS Ralph Leon 1330 RIXENSART Belgique
MONIOTTE Nicolas Jean Benoit
1330 RIXENSART
Belgique
STRODIOT Laurent 1330 RIXENSART Belgique (54) VACCIN (57) La présente invention concerne le domaine des vaccins à conjugués de saccharides capsulaires pneumococciques. Plus précisément, la présente invention concerne des polysaccharides capsulaires dimensionnés de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A, en particulier des polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6Adont la taille moyenne (par exemple, Mw) est située entre 100 et 1000 kDa, conjugués de manière appropriée à une protéine porteuse.
Figure l: Evaluation de:conjugués PS6A dans une formulation 14V AIPO4 dans le modèle de souris Balb/G avec co^administration d'infanrix Hexa. EUSÄ anti-PS6A.
Figure BE1024465A1_D0001
Figure 1
BE2016/5782
VACCIN
La présente invention concerne des polysaccharides capsulaires dimensionnés de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A, en particulier des polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A ayant une taille moyenne (par exemple, Mw) située entre
Domaine de l'invention
100 et 1 000, 110 et 750, 150 et 500, 180 et 600, 210 et
490 , 210 et 450, 180 et 400, 210 et 400, 210 et 370, 220
et 360, 230 et 350, 240 et 340, 240 et 320, 240 et 310
ou 250 et 310 kDa. Elle concerne en outre des
polysaccharides capsulaires dimensionnés de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A conjugués à une protéine porteuse, des compositions immunogènes, des vaccins et des procédés de préparation des polysaccharides capsulaires dimensionnés de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A. Elle concerne également l'utilisation des compositions immunogènes et des vaccins de l'invention en thérapie et des procédés d'immunisation contre une infection par Streptococcus pneumoniae.
Contexte de l'invention
Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) est une bactérie à Gram positif responsable d'une très grande morbidité et mortalité (en particulier, chez les nourrissons et les personnes âgées), en provoquant des maladies invasives, telles qu'une pneumonie, une bactériémie et une méningite, et d'autres maladies non invasives, telles que l'otite moyenne aiguë. Environ 800 000 enfants meurent chaque année à cause d'une
BE2016/5782 maladie à pneumocoques, en particulier dans les pays émergeant (O-Brien et al. 2009 Lancet 374 : 893-902) . Le nombre croissant de souches résistant aux antibiotiques (Linares et al. 2010 Cin. Microbiol. Infect. 16 : 402410) et la gravité des maladies à pneumocoques font de la vaccination l'intervention la plus efficace.
Les principaux syndromes cliniques provoqués par
S. pneumoniae sont parfaitement connus et décrits dans tous les ouvrages médicaux classiques (Fedson DS, Muscher DM dans : Plotkin SA, Orenstein WA, Editeurs. Vaccines. 4ème Edition. Philadelphia WB Saunders Co, 2004a : 529-588). Par exemple, une maladie invasive à pneumocoques (IPD) est définie comme étant toute infection dans laquelle S. pneumoniae est isolé à partir du sang ou d'autre site normalement stérile (Musher DM. Streptococcus pneumoniae. Dans Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (éds). Principles and Practice of infectious diseases (5ème éd.). New York, Churchill Livingstone, 2001, p 2128-2147) . Il est connu que la bronchopneumopathie obstructive chronique (BPOC) englobe plusieurs affections (obstruction des voies respiratoires, bronchite chronique, bronchiolite ou maladie des petites voies respiratoires et emphysème) qui souvent coexistent (Wilson et al., Eur. Respir. J. 2001 ; 17 : 995-1007) . Les patients souffrent d'une exacerbation de leur affection qui est généralement associée à une augmentation de l'essoufflement avec, souvent, un accroissement de la toux pouvant produire du mucus ou des expectorations purulentes (Wilson, Eur Respir J 2001 17 : 995-1007). La BPOC est définie sur le plan physiologique par la présence d'une obstruction
BE2016/5782 irréversible ou partiellement réversible des voies respiratoires chez les patients atteints de bronchite chronique et/ou d'emphysème (Standards for the diagnosis and care of patients with chronic obstructive pulmonary disease. American Thoracic Society. Am J Respir Crit Care Med. 1995 Nov ; 152(5 Pt 2) : S77-121) . Les exacerbations de la BPOC sont souvent provoquées par une infection bactérienne (par exemple, à pneumocoques) (Sethi S, Murphy TF. Bacterial infection in chronic obstructive pulmonary disease in 2000 : a state-of-theart review. Clin. Microbiol. Rev. 2001 avr ; 14(2) : 336-63) .
Le pneumocoque est encapsulé par un polysaccharide lié chimiquement qui confère la spécificité du sérotype. Il existe plus de 90 sérotypes connus de pneumocoques, et la capsule est le principal déterminant de virulence pour les pneumocoques, car la capsule protège la surface interne de la bactérie contre le complément, mais elle est elle-même peu immunogène. Il est considéré qu'un taux d'anticorps anti-polysaccharide est prédictif de la protection contre une maladie invasive à pneumocoques (Jodar et al. Vaccine (21) 2003, p. 3264-3272) . Après l'autorisation initiale d'un vaccin conjugué heptavalent contenant les sérotypes 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F (PCV7), deux vaccins conjugués antipneumococciques (PCV) conçus pour élargir la couverture ont été autorisés. Le vaccin conjugué antipneumococcique décavalent à protéine D d'Haemophilus Influenzae (PCV10) contient les sérotypes 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14 et 23F conjugués à la protéine D non typable d'H. influenzae, plus le sérotype 18C conjugué à l'anatoxine tétanique et le sérotype 19F
BE2016/5782 conjugué à l'anatoxine diphtérique. Le vaccin conjugué antipneumococcique 13-valent (PCV13) contient les sérotypes PCV7 (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F) plus les sérotypes 1, 3, 5, 6A, 7F et 19A, conjugués à la substance à réaction croisée CRM197.
Un objet de la présente invention est de développer des polysaccharides améliorés de Streptococcus pneumoniae et des vaccins conjugués améliorés à polysaccharides de Streptococcus pneumoniae.
Les isolats de S. pneumoniae de sérogroupe 6, notamment les isolats de sérogroupes 6A, 6B, 6C et 6D, sont importants car on les trouve fréquemment dans les infections (Song et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, mai 2011, p. 1758-1764). Le document WO 2009/000 826 A2 divulgue un polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A présentant une taille de 1100 à 1540 (Da x 103) conjugué à la protéine D et un polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6B présentant une taille de 1069 à 1391 (Da x 103) conjugué à la protéine D (voir le tableau 2 du document WO 2009/000 826 A2). A la fois le polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A et le polysaccharide capsulaire de
Streptococcus pneumoniae de sérotype 6B décrits dans le document WO 2009/000 826 A2 sont des polysaccharides natifs. La seule différence entre les structures chimiques des sérotype 6A et 6B est la liaison entre les motifs rhamnose et ribitol. Comme la structure du polysaccharide 6A est très similaire à celle du polysaccharide 6B, on a tout d'abord cru qu'un PS6A natif (polysaccharide 6A) devrait être utilisé pour la
BE2016/5782 conjugaison car un PS6B natif (polysaccharide 6B) est utilisé pour la conjugaison. Dans l'essai FinlP, il a été démontré que PHiD-CVIO contenant 6B conjugué à la protéine D est efficace contre le sérotype 6B (Palmu et al. Lancet 2013 ; 381 : 214-22). Cependant, de manière inattendue, la présente invention propose un polysaccharide 6A dimensionné de Streptococcus pneumoniae présentant des propriétés améliorées. Les inventeurs ont découvert que grâce à l'utilisation d'un polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A (PS6A) ayant une taille particulière, il est possible d'obtenir un conjugué présentant une immunogénicité élevée qui est filtrable.
Brève description des figures
Figure 1 : Evaluation de conjugués de PS6A dans une formulation 14-valent (14V) à A1PO4 dans le modèle de souris Balb/c avec co-administration d'Infanrix™ Hexa. ELISA anti-PS6A.
Figure 2(A) : Immunogénicité de PS6A-CRM197 dans le modèle de souris Balb/c. Résultats ELISA.
Figure 2(B) : Immunogénicité de PS6A-CRM197 dans le modèle de souris Balb/c. Résultats OPA.
Figure 3(A) : Evaluation of PS6A-CRM197. Résultats
ELISA.
Figure 3(B) : Evaluation of PS6A-CRM197. Résultats
OPA.
Description de l'invention
La présente invention propose un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de
BE2016/5782 sérotype 6A. Dans un aspect, la présente invention propose un polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A, dans lequel la taille moyenne (Mw) du polysaccharide de S. pneumoniae de sérotype 6A est située entre 100 et 1000, 110 et 750, 150 et 500, 180 et 600, 210 et 490, 210 et 450, 180 et 400, 210 et 400, 210 et 370, 220 et 360, 230 et 350, 240 et 340, 240 et 320, 240 et 310 ou 250 et 310 kDa.
Le terme « polysaccharide », tout au long de la présente description, fait référence à un glucide complexe composé d'une chaîne de saccharides liés les uns aux autres par des liaisons glycosidiques. Le polysaccharide peut contenir au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 ou 50 saccharides ou plus.
Dans le cadre de l'invention, un « polysaccharide natif » est un polysaccharide qui n'a pas subi un traitement (par exemple, une post-purification) ayant pour but de réduire la taille du polysaccharide. La taille du polysaccharide peut diminuer légèrement pendant les procédures normales de purification ou par dégradation lors d'une conjugaison. Un tel saccharide est encore natif. Ce n'est que si le polysaccharide est soumis à des techniques de dimensionnement que le polysaccharide n'est pas considéré comme natif.
Dans le cadre de l'invention, un « polysaccharide dimensionné » est un polysaccharide qui a été soumis à un traitement (par exemple, une post-purification) ayant pour but de réduire la taille du polysaccharide. Les polysaccharides peuvent être dimensionnés par des techniques de dimensionnement mécanique ou chimique. Les techniques de dimensionnement mécanique pouvant être
BE2016/5782 utilisées comprennent les techniques à haute pression (tel que la microfluidisation, 1'Emulsiflex™, l'homogénéisation à haute pression ou l'homogénéisation de Gaulin) et la sonication. Les techniques de dimensionnement chimique pouvant être utilisées comprennent l'hydrolyse acide (par exemple, par traitement avec de l'acide acétique) ou le traitement avec un periodate. Le terme « periodate » comprend à la fois le periodate et l'acide périodique ; le terme comprend également à la fois le métaperiodate (ICy-) et 1 ' orthoperiodate (ICy5-) et les divers sels de periodate (par exemple, le periodate de sodium et le periodate de potassium). Les plages de poids moléculaires décrites dans le présent document font référence aux polysaccharides purifiés avant conjugaison (par exemple, avant activation quand une activation est mise en œuvre).
Dans le cadre de la présente invention, « dimensionné d'un facteur allant jusqu'à x2 » signifie que le saccharide est soumis à un traitement destiné à réduire la taille du saccharide, mais tout en conservant une taille supérieure à la moitié de la taille du polysaccharide natif. Les termes tels que « dimensionné d'un facteur allant jusqu'à » x3, x4, etc., doivent être interprétés de la même manière, c'est-à-dire que le saccharide est soumis à un traitement destiné à réduire la taille du polysaccharide mais tout en conservant une taille supérieure au tiers, au quart, etc., Respectivement, de la taille du polysaccharide natif.
Le terme « poids moléculaire » ou « poids moléculaire moyen » ou « taille moyenne » d'un polysaccharide fait référence dans le présent document
BE2016/5782 combinaison, et les du NaCl 0,2 M. Les au poids moléculaire moyen en poids (Mw) du polysaccharide, mesuré par MALLS (diffusion de lumière laser à angles multiples) avant la conjugaison.
La technique MALLS est connue dans l'art et est habituellement mise en œuvre comme décrit ci-dessous. Pour une analyse MALLS des polysaccharides pneumococciques, deux colonnes (TSKG6000 et 5000PWxI) peuvent être utilisées en saccharides sont élués dans saccharides sont détectés en utilisant un détecteur à diffusion de lumière (par exemple, le Wyatt Dawn DSP (traitement des signaux numériques) équipé d'un laser à argon de 10 mW à 488 nm) et un réfractomètre interférométrique (par exemple, le Wyatt Otilab DSP (traitement des signaux numériques) équipé d'une cellule P100 et d'un filtre rouge à 498 nm).
Le détecteur à diffusion laser mesure les intensités lumineuses diffusées à 16 angles par la solution macromoléculaire et, par ailleurs, un réfractomètre interférométrique placé en ligne permet la détermination de la quantité d'échantillon éluée. A partir de ces intensités, la taille et la forme des macromolécules en solution peuvent être déterminées.
Le poids moléculaire moyen en poids (Mw) est défini comme étant la somme des poids de toutes les espèces, multipliée par leur poids moléculaire respectifs et divisée par la somme des poids de toutes les espèces.
a) Poids moléculaire moyen en poids : -MwV JF.
BE2016/5782
b) Poids moléculaire moyen en nombre : -MnS·/ : :iil
c) Rayon quadratique moyen rayon au carré défini par :
-Rw- et r2w est le ?îî, J
R2w ou
V (-m±- est la masse d'un centre de diffusion i et ri- est la distance entre le centre de diffusion i et le centre de gravité de la macromolécule).
d) La polydispersité est définie comme étant le rapport -Mw/Mn-.
Tel qu'utilisé dans le présent document, le terme « traitement » (y compris ses variations, par exemple « traiter » ou « traité ») fait référence à l'un quelconque parmi les suivants : (i) la prévention d'une infection ou d'une ré-infection, comme dans un vaccin traditionnel, (ii) la réduction de la gravité ou l'élimination des symptômes, (iii) le retardement de la réapparition des symptômes, et (iii) l'élimination substantielle ou complète du pathogène ou du trouble en question chez un sujet. Par conséquent, un traitement peut être effectué de manière prophylactique (avant une infection) ou thérapeutique (après une infection).
BE2016/5782
Dans le cadre de la présente invention, « le traitement ou la prévention des exacerbations d'une BPOC » ou « la réduction de la gravité des exacerbations d'une BPOC » fait référence à une réduction de l'incidence ou de la fréquence des exacerbations d'une BPOC (par exemple, une réduction de fréquence de 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20 % ou plus) ou à une réduction de la gravité des exacerbations d'une BPOC (par exemple, l'obstruction des voies respiratoires, une bronchite chronique, une bronchiolite ou une maladie des petites voies respiratoires et un emphysème), par exemple chez un groupe de patients immunisés avec les compositions immunogènes ou les vaccins de l'invention.
Polysaccharides_capsulaires_dimensionnés_de
Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A
Les polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A peuvent être dimensionnés par des techniques de dimensionnement mécanique ou chimique. Dans un mode de réalisation, les polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A sont dimensionnés par une technique de dimensionnement chimique. Les techniques de dimensionnement chimique pouvant être utilisées comprennent un traitement avec de l'acide acétique ou un traitement avec un periodate. Dans un aspect, les polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention sont dimensionnés par un traitement avec un periodate. Le terme « periodate » comprend à la fois le periodate et l'acide périodique ; le terme comprend également à la fois le métaperiodate (ICy-) et 1 ' orthoperiodate (ICy5-)
BE2016/5782 et les divers sels de periodate (par exemple, le periodate de sodium et le periodate de potassium). Dans un autre aspect, les polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention sont dimensionnés par un traitement avec de l'acide acétique. Dans un mode de réalisation, les polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention sont dimensionnés par une technique de dimensionnement mécanique, par exemple en utilisant une technique à haute pression. Les techniques à haute pression comprennent la micro-fluidisation, l'homogénéisation à haute pression ou l'homogénéisation de Gaulin. Dans un aspect, le polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention est dimensionné par homogénéisation à haute pression. L'homogénéisation à haute pression permet d'obtenir des taux de cisaillement élevés en pompant le courant du procédé à travers un trajet d'écoulement ayant des dimensions suffisamment petites. Le taux de cisaillement est augmenté par l'utilisation d'une pression d'homogénéisation appliquée plus élevée, et le temps d'exposition peut être augmenté par la remise en circulation du courant d'alimentation à travers 1'homogénéisateur. La technique d'homogénéisation à haute pression est décrite dans Cho et al. (Int. J. Mol. Sei. 2014, 15). Dans un autre aspect de l'invention, le polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention est dimensionné par homogénéisation de Gaulin. L'homogénéisation de Gaulin peut être mise en œuvre en utilisant la technique décrite dans Lander et al. (Biotechnol. Prog. 2000, 16, 80-85).
BE2016/5782
Dans un autre aspect, le polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention est dimensionné par microfluidisation (par exemple, comme décrit dans les exemples ci-dessous).
Les polysaccharides capsulaires dimensionnés de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de la présente invention présente une taille moyenne (Mw) située entre 100 et 1000, 110 et 750, 150 et 500, 180 et 600, 210 et 490, 210 et 450, 180 et 400, 210 et 400, 210 et 370, 220 et 360, 230 et 350, 240 et 340, 240 et 320, 240 et 310 ou 250 et 310 kDa. Le dimensionnement est par un facteur d'au plus x20, xlO, x8, x6, x5, x4, x3 ou x2. Par exemple, le dimensionnement peut être effectué d'un facteur situé entre x2 et x6, x2 et x5, x2 et x4, ou x3 et x6, x3 et x5 ou x3 et x4. Dans un aspect, le polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention est dimensionné par un facteur d'au plus x5. Les plages de poids moléculaires décrites dans le présent document font référence au poids moléculaire des polysaccharides capsulaires purifiés de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A avant conjugaison (par exemple, avant activation quand une activation est mise en œuvre).
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention est antigénique (tel que déterminé par ELISA), par exemple en ayant un indice d'antigénicité situé entre 70 et 200 %, de préférence entre 90 % et 150 % (par exemple, entre 120 et 144 %). Comme expliqué dans les exemples ci-dessous, l'indice d'antigénicité est mesuré par rapport au polysaccharide capsulaire natif de Streptococcus pneumoniae de sérotype
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6A auquel il est attribué un indice d'antigénicité de 100 % (également représenté par 1,0 dans les tableaux ci-dessous).
Polysaccharides capsulaires conjugués de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A
De manière appropriée, le polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention est conjugué à une protéine porteuse. La protéine porteuse peut être choisie dans le groupe constitué par la TT (anatoxine tétanique), la DT (anatoxine diphtérique), CRM197, le fragment C de TT, PhtD (protéine D de la triade à histidine pneumococcique), les fusions PhtDE (une fusion de PhtD et de PhtE (protéine E à histidine pneumococcique) en particulier celles décrites dans le document WO 01/98 334 et WO 03/54 007), la pneumolysine détoxifiée et la protéine D. Dans un aspect de l'invention, le polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A est conjugué à une protéine porteuse choisie dans le groupe constitué par la TT (anatoxine tétanique), la DT (anatoxine diphtérique), CRM197, le fragment C de TT et PhtD (protéine D de la triade à histidine pneumococcique). Dans un autre aspect de l'invention, le polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention est conjugué à la DT ou à CRM197. Dans un autre aspect de l'invention, le polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention est conjugué à CRM197.
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CRM197 est une forme non toxique de l'anatoxine diphtérique, mais qui est impossible à distinguer de l'anatoxine diphtérique (DT) sur le plan immunologique. Des analogues génétiquement détoxifiés de la toxine diphtérique comprennent CRM197 et d'autres mutants décrits dans les documents US 4 709 017, US 5 843 711, US 5 601 827 et US 5 917 017. CRM197 est produit par C. diphteriae infecté par la phase non toxigène ßl97toxcréée par la mutagenèse à la nitrosoguanidine du carynéphage toxigène b (Uchida et al Nature New Biology (1971) 233 ; 8-11). La protéine CRM197 possède le même poids moléculaire que l'anatoxine diphtérique, mais diffère de celle-ci par la substitution d'une seule base dans le gène structurel. Celle-ci entraîne une substitution d'acide aminé glycine pour glutamine en position 52 qui rend le fragment A incapable de se lier au NAD et donc non toxique (Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46 : 69-94, Rappuoli. Applied and Environmental Microbiology sept 1983 p 560-564).
Le fragment C de TT est un fragment carboxy-terminal non toxique de la chaîne lourde de la toxine tétanique. La toxine tétanique est un peptide unique d'environ 150 kDa, qui est constitué de 1315 résidus d'acide aminé. Le clivage de la toxine tétanique par la papaïne donne deux fragments ; l'un d'entre eux, le fragment C, fait environ 50 kDa. Le fragment C de TT est décrit plus en détail dans Neubauer et al. Biochim. Brophys. Acta 1981, 27, 141-148.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A est conjugué à la protéine porteuse par
BE2016/5782 l'intermédiaire d'un lieur, par exemple un lieur bifonctionnel (contenant deux extrémités réactives). Le lieur est facultativement hétérobifonctionnel (présentant différents groupes réactifs à chaque extrémité) ou homobifonctionnel (présentant des groupes réactifs identiques à chaque extrémité d'un bras espaceur), par exemple en ayant un groupe amino réactif et un groupe acide carboxylique réactif, 2 groupes amino réactifs ou deux groupes acide carboxylique réactifs. Le lieur contient, par exemple, entre 4 et 20, 4 et 12, 5 et 10 atomes de carbone. Un lieur possible est l'ADH (dihydrazide de l'acide adipique). D'autres lieurs comprennent le B-propionamido (document WO 00/10 599), la nitrophényl-éthylamine (Gever et al (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165 : 171-288), les halogénures d'haloalkyle (document US 4 057 685), les liaisons glycosidiques (documents US 4 673 574, US 4 808 700), 1 ' hexane-diamine et l'acide 6-aminocaproïque (document US 4 459 286) . Dans un autre mode de réalisation, le polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention est directement conjugué à la protéine porteuse. Dans un aspect, le polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention est liée à la protéine porteuse par l'intermédiaire d'une liaison isourée. Une liaison iso-urée est formée par la réaction entre un ester de cyanate se trouvant sur le polysaccharide et un groupe amino se trouvant sur le support. Une « liaison iso-urée » fait ici référence à une liaison stable.
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Compositions immunogènes
Dans un mode de réalisation, la présente invention propose une composition immunogène comprenant un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A (ou un conjugué) de l'invention
Généralement, les compositions immunogènes de l'invention comprendront des antigènes à base de polysaccharide capsulaire (conjugués de manière appropriée), les polysaccharides dérivant d'au moins dix sérotypes de S. pneumoniae. Le nombre de polysaccharides capsulaires de S. pneumoniae peut varier de 10 sérotypes différents (ou valences « V ») à 23 sérotypes différents (23V, une composition à 23-valent) . Dans un mode de réalisation, la composition immunogène comprend 10 ou plus, 11 ou plus, 12 ou plus, 13 ou plus, 14 ou plus, 15 ou plus ou 15 ou plus de 15 polysaccharides capsulaires provenant de différents sérotypes de S. pneumoniae. Dans un mode de réalisation, il y a 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 sérotypes différents de S. pneumoniae. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention peut comprendre des polysaccharides conjugués de S. pneumoniae et des saccharides non conjugués de S. pneumoniae. Dans un mode de réalisation, le nombre total de sérotypes de saccharides est inférieur ou égal à 23.
Dans un mode de réalisation, le vaccin antipneumococcique multivalent de l'invention comprendra des polysaccharides (conjugués de manière appropriée)
choisis parmi les sérotypes suivants : 1, 2, 3, 4, 5,
6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14 , 15B, 17F, 18C,
19A, 19F, 20, 22F, 23F et 33F, même si l'on comprendra
BE2016/5782 qu'un ou deux autres sérotypes puissent être utilisés à la place en fonction de l'âge de la personne recevant le vaccin et de l'emplacement géographique où le vaccin sera administré. Dans un mode de réalisation, le vaccin peut être un vaccin 11-valent. Par exemple, un vaccin
11- valent peut comprendre des polysaccharides de sérotypes 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F et 23F. Un mode de réalisation, le vaccin peut être un vaccin
12- valent ou 13-valent. Un vaccin 12- ou 13-valent pédiatrique (pour nourrisson) peut également comprendre la formulation à 11 valences complétée avec les sérotypes 19A, ou 22F, ou 15, ou 19A et 22F, ou 19A et 15, ou 22F et 15, tandis qu'un vaccin 13-valent pour personnes âgées peut comprendre la formulation à 11 valences complétée
avec les sérotypes 19A et 22F, 8 et 12F, ou 8 et 15B, ou
8 et 19A, ou 8 et 22F, ou 12F et 15, ou 12F et 19A, ou
12F et 22F, ou 15 et 19A, ou 15 et 22F. Dans un mode de
réalisation, le vaccin peut être un vaccin 14-valent ou 15-valent. Un vaccin 14- ou 15-valent pédiatrique peut comprendre la formulation à 11 valences décrites cidessus complétées avec les sérotypes 3, 19A et 22F ; les sérotypes 8, 19A et 22F ; les sérotypes 12F, 19A et 22F ; les sérotypes 15, 19A et 22F ; les sérotypes 3, 8, 19A et 22F ; les sérotypes 3, 12F, 19A et 22F ; les sérotypes 3, 15, 19A et 22F. Dans un mode de réalisation, le vaccin peut être un vaccin 16-valent. Un vaccin 16-valent peut comprendre la formulation à 11 valences décrites cidessus complétées avec les sérotypes 3, 15B, 19A, 22F et 23F. Un vaccin 16-valent peut comprendre la formulation à 11 valences décrites ci-dessus complétées avec les sérotypes 3, 15B, 19A, 22F et 33F. Dans un mode de
BE2016/5782 réalisation, le vaccin peut être un vaccin 19-valent. Un vaccin 19-valent peut comprendre la formulation à 11 valences décrites ci-dessus complétées avec les sérotypes 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 19A, 22F et 23F. Un vaccin 19-valent peut comprendre la formulation à 11 valences décrites ci-dessus complétées avec les sérotypes 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 19A, 22F et 33F. Dans un mode de réalisation, le vaccin peut être un vaccin 20-valent. Un vaccin 20-valent peut comprendre la formulation à 11 valences décrites ci-dessus complétées avec les sérotypes 3, 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 19A, 22F et 23F. Un vaccin 20-valent peut comprendre la formulation à 11 valences décrites ci-dessus complétées avec les sérotypes 3, 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 19A, 22F et 33F. Dans un mode de réalisation, le vaccin peut être un vaccin 21-valent.
Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend des polysaccharides capsulaires dérivés des sérotypes 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F et 23F (conjugués de manière appropriée) Dans un autre mode de réalisation de l'invention, au moins 12 antigènes saccharidiques (conjugués de manière appropriée) sont inclus, par exemple des polysaccharides capsulaires dérivés des sérotypes 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F et 23F. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, au moins 12 antigènes saccharidiques (conjugués de manière appropriée) sont inclus, par exemple des polysaccharides capsulaires dérivés des sérotypes 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A et 23F. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, au moins 13 antigènes polysaccharidiques
BE2016/5782 (conjugués de manière appropriée) sont inclus, par exemple un vaccin peut comprendre des polysaccharides capsulaires dérivés des sérotypes 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F et 23F, bien que d'autres antigènes saccharidiques, par exemple, 23-valents (tels que les sérotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F et 33F), soient également envisagés par l'invention. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, au moins 15 antigènes saccharidiques (conjugués de manière appropriée) sont inclus, par exemple des polysaccharides capsulaires dérivés des sérotypes 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F et 33F. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, au moins 15 antigènes saccharidiques (conjugués de manière appropriée) sont inclus, par exemple des polysaccharides capsulaires dérivés des sérotypes 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F et 33F. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, au moins 16 antigènes saccharidiques (conjugués de manière appropriée) sont inclus, par exemple des polysaccharides capsulaires dérivés des sérotypes 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F et 33F. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène comprend un (poly)saccharide capsulaire (conjugué) de sérotype 33F de S. pneumoniae. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène comprend un (poly)saccharide capsulaire (conjugué) de sérotype 15C de S. pneumoniae. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène comprend un (poly)saccharide capsulaire (conjugué) de sérotype 12F de S. pneumoniae. Dans un
BE2016/5782 mode de réalisation, il y a 10 à 23 sérotypes différents de polysaccharides capsulaires de S. pneumoniae (conjugués de manière appropriée).
Protéines porteuses
Des exemples de protéine porteuse pouvant être utilisées dans la présente invention sont la DT (anatoxine diphtérique), la TT (anatoxine tétanique) ou le fragment C de TT, la DT, CRM197, d'autres mutants ponctuels de DT, tels que CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218 ; 3838-3844, 1973) ; CRM 9,
CRM 45, CRM102, CRM 103 et CRM107 et autres mutations décrites par Nicholls et Youle dans Genetically Engineers Toxins, Ed : Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992 ; la délétion ou mutation de Glu-148 en Asp, Gin ou Ser et/ou Ala 158 en Gly et autres mutations décrites dans le document US 4 709 017 ou US 4 950 740 ; la mutation d'au moins un ou plusieurs résidus Lys 516, Lys 526, Phe 530 et/ou Lys 534 et d'autres mutations décrites dans le document US 5 917 017 ou US 6 455 673 ; ou la fragment de DT décrit dans le document US 5 843 711, la pneumolysine pneumococcique (Kuo et al (1995) Infect Immun 63 ; 2706-13) comprenant la pneumolysine (ply) détoxifiée d'une quelconque manière, par exemple, la pneumolysine détoxifiée au GMBS (dPly-GMBS) (WO 04 081 515, PCT/EP2005/010 258) ou la pneumolysine détoxifiée au formaldéhyde (dPly-formaldéhyde), les protéines de la famille Pht (triade à histidine pneumococcique) (PthX), comprenant PhtA, PhtB, PhtD, PhtE et les fusions des protéines Pht, par exemple les fusions PhtDE, les fusions PhtBE (WO 01/98 334 et
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WO 03/54 007), (Pht A à E sont décrites plus en détail ci-dessous), OMPC (protéine de la membrane externe du méningocoque - généralement extraite de N. meningitidis sérogroupe B - document EP 0 372 501), le porine PorB de Neisseria meningitidis, PD (protéine D de Haemophilus influenzae - voir, par exemple, le document EP 0 594 610 B) , ou les équivalents immunologiquement fonctionnels de celle-ci, des peptides synthétiques (EP 0 378 881, EP 0 427 347), les protéines de choc thermique (WO 93/17 712, WO 94/03 208), les protéines pertussiques (WO 98/58 668, EP 0 471 177), les cytokines, les lymphokines, les facteurs de croissance ou les hormones (WO 91/01 146), des protéines artificielles comprenant de multiples épitopes de lymphocytes T CD4+ humains provenant de divers antigènes dérivés de pathogènes (Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31 ; 38163824) telles que la protéine N19 (Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72 ; 4884-7), la protéine pneumococcique de surface PspA (WO 02/091 998), les protéines fixant le fer (WO 01/72 337), la toxine A ou B de Clostridium difficile (WO 00/61 761) .
Dans un mode de réalisation, dans la composition immunogène de l'invention, chaque saccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae est conjugué à une protéine porteuse choisie indépendamment dans le groupe constitué par DT, CRM197, TT, le fragment C de TT, dPly (pneumolysine détoxifiée), PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, PhtDE OmpC, PorB et la protéine D d'Haemophilus influenzae. Dans un autre mode de réalisation, chaque saccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae est conjugué à une protéine porteuse choisie indépendamment dans le
BE2016/5782 groupe constitué par TT, DT, CRM197, le fragment C de TT, PhtD, les fusions PhtDE (en particulier celles décrites dans les documents WO 01/98 334 et WO 03/54 007), la pneumolysine détoxifiée et la protéine D. Dans un autre mode de réalisation, chaque saccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae est conjugué à une protéine porteuse choisie indépendamment dans le groupe constitué par TT, DT, CRM197, PhtD, la pneumolysine détoxifiée et la protéine D. Dans un autre mode de réalisation, chaque saccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae est conjugué à une protéine porteuse choisie indépendamment dans le groupe constitué par TT, DT, CRM197, PhtD et la protéine D. Dans un autre mode de réalisation, chaque saccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae est conjugué à une protéine porteuse choisie indépendamment dans le groupe constitué par TT, DT, CRM197 et la protéine D.
Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend deux ou plus de deux protéines de support différentes. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend 2, 3, 4, 5 ou 6 protéines de support différentes Chaque type de protéine porteuse peut jouer le rôle de support pour plus d'un polysaccharide, lesdits polysaccharides pouvant être de sérotypes identiques ou différents. Dans un mode de réalisation, deux ou plus de deux sérotypes différents de polysaccharide peuvent être conjugués à la même protéine porteuse, soit à la même molécule de protéine porteuse (molécules de support auxquelles sont conjugués 2 ou plus de 2 sérotypes différents de polysaccharide) [voir, par exemple, le
BE2016/5782 document WO 04/083 251], soit des molécules différentes de la même protéine porteuse (chaque molécule de support protéique étant conjuguée seulement à un sérotype de saccharide).
Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend la protéine D de Haemophilus influenzae (PD), par exemple la séquence de protéine D représentés sur la figure 9 (figures 9a et 9b ensemble, 364 acides aminés) du document EP 0 594 610 (SEQ ID NO : 1) . L'inclusion de cette protéine dans la composition immunogène peut fournir un niveau de protection contre l'otite moyenne associée à Haemophilus influenzae (Pyrmula et al Lancet 367 ; 740-748 (2006)). La protéine D peut être utilisée sous la forme d'une protéine pleine longueur ou sous la forme d'un fragment (par exemple, la protéine D peut être telle que décrite dans le document WO 0 056 360) . Par exemple, une séquence de protéine D peut comprendre (ou consister en) le fragment de protéine D décrit dans le document EP 0 594 610 qui commence à la séquence SSHSSNMANT (SerSerHisSerSerAsnMetAlaAsnThr) (SEQ ID NO. 3), et qui est dépourvu des 19 acides aminés N-terminaux, tel que représenté sur la figure 9 du document EP 0 594 610, facultativement avec le tripeptide MDP à partir de NSI fusionné à l'extrémité N-terminale dudit fragment de protéine D (348 acides aminés) (SEQ ID NO : 2) . Dans un aspect, la protéine D ou le fragment de protéine D est non lipidé. La protéine D peut être présente dans la composition immunogène sous la forme d'une protéine libre ou d'une protéine porteuse. Dans un aspect, la protéine D est présente dans la composition immunogène
BE2016/5782 sur la forme d'une protéine libre. Dans un autre aspect, la protéine D est présente à la fois sous la forme d'une protéine porteuse et d'une protéine libre. Dans un autre aspect, la protéine D est présente la forme d'une protéine porteuse pour un ou plusieurs des polysaccharides. Dans un autre aspect, 2 à 9 des polysaccharides capsulaires choisis parmi différents sérotypes sont conjugués à la protéine D. Dans un autre aspect, la protéine D est présente sous la forme d'une protéine porteuse pour la majorité des polysaccharides, par exemple 6, 7, 8, 9 ou plus de 9 des polysaccharides peuvent être conjugués à la protéine D.
Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention contient 2 à 8, 2 à 7, 2 à 6, 2 à 5, 3 à 5, 4 à 5, 2 à 4, 2 à 3, 3 à 4 or 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 conjugués de sérotype de saccharide capsulaire dans lesquels la protéine D est la protéine porteuse. Par exemple, 2 à 8, 2 à 7, 2 à 6, 2 à 5, 3 à 5, 4 à 5, 2 à 4, 2 à 3, 3 à 4 ou 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 polysaccharides choisis parmi les sérotypes 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F et 23F sont conjugués à la protéine D. Par exemple, des poly-saccharides de sérotypes 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14 et 23F sont conjugués à la protéine D.
Dans un mode de réalisation, des polysaccharides
issus au me >ins des sérotypes 1 et 3, let 4, 1 et 5 , 1
et 6A , 1 et 6B , 1 et 7, 1 et 9V, 1 et 14, 1 et 22F, 1 et
23F, 3 et 4 , 3 et 5, 3 et 6A, 3 et 6B, 3 et 7F, 3 et 9V,
3 et 14, 3 et 22F, 3 et 23F, 4 et 5, 4 et 6A, 4 et 6B,
4 et 7F, 4 et 9V, 4 et 14, 4 et 22 F, 4 et ; 23F, 5 et 6A,
5 et 6B, 5 et 7F, 5 et 9V, 5 et 14 , 5 et 2. 2F, 5 et 2 3F,
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6A et 6B, 6A et 7F, 6A et 9V, 6A et 14, 6A et 22F, 6A et
23F, 6B et 7F, 6B et 9V, 6B et 14, 6B et 22F, 6B et 23F,
7F et 9V, 7F et 14, 7F et 22F, 7F et 23F, 9V et 14 , 9V
et 22F, 9V et 23F, 14 et 22F, 14 et 23F ou 22F et 23F
sont conjugués à la protéine D
Dans un mode de réalisation, des polysaccharides issus au moins des sérotypes 1, 3 et 4 ; 1, 3 et 5 ; 1, 3 et 6A ; 1, 3 et 6B ; 1, 3 et 7F ; 1, 3 et 9V ; 1, 3 et 14 ; 3, 4 et 7F ; 3, 4 et 5 ; 3, 4 et 7F ; 3, 4 et 9V ; 3, 4 et 14 ; 4, 5 et 7F ; 4, 5 et 9V ; 4, 5, et 14 ; 5, 7F et 9V ; 5, 7F et 14 ; 7F, 9V et 14 ; 1, 3, 4 et 5 ;
3, 4, 5 et 7F ; 4, 5, 7F et 9V ; 4, 5, 7F et 14 ; 4, 5, 9V et 14 ; 4, 7F, 9V et 14 ; 5, 7F, 9V et 14 ; ou 4, 5, 7F, 9V et 14 sont conjugués à la protéine D.
Par exemple, dans une composition immunogène lovaient de S. pneumoniae, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 des polysaccharides capsulaires de différents sérotypes sont conjugués à la protéine D. Par exemple, dans une composition immunogène 11-valent de S. pneumoniae, 2, 3,
4, 5, 6, 7 ou 8 des polysaccharides capsulaires de différents sérotypes sont conjugués à la protéine D. Par exemple, dans une composition immunogène 12-valent de
5, pneumoniae, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 des polysaccharides capsulaires de différents sérotypes sont conjugués à la protéine D. Par exemple, dans une composition immunogène 13-valent de S. pneumoniae, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 des polysaccharides capsulaires de différents sérotypes sont conjugués à la protéine D. Par exemple, dans une composition immunogène 14-valent de S. pneumoniae, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 des polysaccharides capsulaires de différents sérotypes sont conjugués à la protéine D. Par
BE2016/5782 exemple, dans une composition immunogène 15-valent de
S. pneumoniae, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 des polysaccharides capsulaires de différents sérotypes sont conjugués à la protéine D. Par exemple, dans une composition immunogène 16-valent de S. pneumoniae, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 des polysaccharides capsulaires de différents sérotypes sont conjugués à la protéine D. Par exemple, dans une composition immunogène 17-valent de S. pneumoniae, 2, 3,
4, 5, 6, 7 ou 8 des polysaccharides capsulaires de différents sérotypes sont conjugués à la protéine D. Par exemple, dans une composition immunogène 18-valent de
5. pneumoniae, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 des polysaccharides capsulaires de différents sérotypes sont conjugués à la protéine D. Par exemple, dans une composition immunogène 19-valent de S. pneumoniae, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 des polysaccharides capsulaires de différents sérotypes sont conjugués à la protéine D. Facultativement, les sérotypes conjugués à la protéine D sont choisis dans les groupes décrits ci-dessus.
Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend au moins un saccharide capsulaire conjugué à l'anatoxine tétanique (TT) . Dans un autre mode de réalisation, un saccharide capsulaire 18C est conjugué à la TT, facultativement dans lequel 18C est le seul saccharide dans la composition à être conjugué à l'anatoxine tétanique (TT)
Dans un aspect de la présente invention, le sérotype 19F est conjugué à la DT ou à CRM197. Dans un autre aspect, le sérotype 19F est conjugué à la DT. Dans un aspect, les sérotypes restants de saccharides de la composition immunogène peuvent tous être conjugués à une
BE2016/5782 ou plusieurs protéines porteuses qui ne sont pas la DT (c'est-à-dire, 19F est le seul être conjugué à la DT). Dans un mode de réalisation, 19F est conjugué à la DT ou à CRM197, et les sérotypes restants sont conjugués aux protéines porteuses choisies indépendamment parmi PhtD, PD (protéine D) , TT (anatoxine tétanique), DT (anatoxine diphtérique) et CRM197. Dans un autre mode de réalisation, 19F est conjugué à la DT ou à CRM197, et les sérotypes restants sont conjugués aux protéines porteuses choisies indépendamment parmi PD, TT, DT et CRM197. Dans un autre mode de réalisation, 19F est conjugué à la DT ou à CRM197, et les sérotypes restants sont conjugués aux protéines porteuses choisies indépendamment parmi PD, TT et CRM197 (par exemple, comme décrit dans les documents WO 2007/071 710 A2 et WO 2007/071 707 A2).
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention et le polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6B sont conjugués à des protéines porteuses différentes. Dans un autre mode de réalisation, le polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention est conjugué à CRM197. Dans un autre mode de réalisation, un conjugué de polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6B est présent, mais il n'est pas conjugué à la DT ou à CRM197. Dans un autre mode de réalisation, le polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A est conjugué à CRM197 et le polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6B est conjugué à une protéine
BE2016/5782 porteuse différente de CRM197. Dans un autre mode de réalisation, le polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A est conjugué à CRM197 et le polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6B est conjugué à une protéine porteuse choisie parmi PhtD, PD (protéine D), TT (anatoxine tétanique) ou DT (anatoxine diphtérique). Dans un autre mode de réalisation, le polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A est conjugué à CRM197 et le polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6B est conjugué à la protéine D.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la protéine porteuse conjuguée à un ou plusieurs des polysaccharides capsulaires de S. pneumoniae est un membre des protéines de la famille des triades polyhistidine (Pht) , des fragments ou des protéines de fusion de celle-ci. Les protéines PhtA, PhtB, PhtD ou PhtE peuvent avoir une séquence d'acides aminés partageant 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité avec une séquence divulguée dans le document WO 00/37 105 ou WO 00/39 299 (par exemple, avec la séquence d'acides aminés 1 à 838 ou 21 à 838 de SEQ ID NO : 4 du document WO 00/37 105 pour PhtD). Par exemple, les protéines de fusion sont composées de 2, 3 ou 4 des protéines PhtA, PhtB, PhtD, PhtE pleine longueur ou de leurs fragments. Des exemples de protéines de fusion sont PhtA/B, PhtA/D, PhtA/E, PhtB/A, PhtB/D, PhtB/E, PhtD/A, PhtD/B, PhtD/E, PhtE/A, PhtE/B et PhtE/D, dans lesquelles les protéines sont liées avec la première
BE2016/5782 mentionnée à l'extrémité N-terminale (voir, par exemple, le document WO 01/98 334).
Quand des fragments de protéines Pht sont utilisés (séparément ou dans une protéine de fusion), chaque fragment contient facultativement un ou plusieurs motifs de triade d'histidine et/ou des régions en superhélice de ces polypeptides. Un motif de triade d'histidine est la partie du polypeptide qui présente la séquence HxxHxH, où H est l'histidine et x est un acide aminé différent de l'histidine. Une région en superhélice est une région prédite par l'algorithme « Coils » Lupus, A et al (1991) Science 252 ; 1162-1164. Dans un mode de réalisation, le fragment comprend un ou plusieurs motifs de triade d'histidine et au moins une région en superhélice. Dans un mode de réalisation, le fragment contient exactement ou au moins 2, 3, 4 ou 5 motifs de triade d'histidine (facultativement, avec la séquence Pht native entre les 2 ou plus de 2 triades, ou une séquence intra-triade qui est à plus de 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 % identique à une séquence Pht intra-triade pneumococcique native - par exemple, la séquence intra-triade représentée par SEQ ID NO : 4 dans le document WO 00/37 105 pour PhtD). Dans un mode de réalisation, le fragment contient exactement ou au moins 2, 3 ou 4 régions en superhélice. Dans un mode de réalisation, une protéine Pht divulguée dans le présent document comprend la protéine pleine longueur à laquelle la séquence signal est fixée, la protéine pleine longueur mature de laquelle le peptide signal est retiré (par exemple, 20 acides aminés à l'extrémité N-terminale), des variants naturels de la protéine Pht et des fragments immunogènes de la
BE2016/5782 protéine Pht (par exemple, les fragments décrits cidessus ou des polypeptides comprenant au moins 15 ou 20 acides aminés contigus provenant d'une séquence d'acides aminés de WO 00/37 105 (SEQ ID NO : 4, 6, 8 ou 10) ou de WO 00/39 299 (SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10 ou 14), ledit polypeptide étant capable de déclencher une réponse immunitaire spécifique pour ladite séquence d'acides aminés dans WO 00/37 105 ou WO 00/39 299).
En particulier, le terme « PhtD », tel qu'utilisé dans le présent document, comprend la protéine pleine longueur à laquelle la séquence signal est fixée, la protéine pleine longueur mature de laquelle le peptide signal est retiré (par exemple, 20 acides aminés à l'extrémité N-terminale), des variants naturels de PhtD et des fragments immunogènes de PhtD (par exemple, les fragments décrits ci-dessus ou des polypeptides comprenant au moins 15 ou 20 acides aminés contigus provenant d'une séquence d'acides aminés de PhtD dans WO 00/37 105 ou WO 00/39 299, ledit polypeptide étant capable de déclencher une réponse immunitaire spécifique pour ladite séquence d'acides aminés de PhtD dans WO 00/37 105 ou WO 00/39 299) (par exemple, SEQ ID NO : 4 de WO 00/37 105 ou SEQ ID NO : 14 de WO 00/39 299 pour PhtD). Toutes les formes de PhtD mentionnées ci-dessus peuvent être utilisées dans la présente invention.
Procédés de conjugaison
Les conjugués de saccharide présents dans les compositions immunogènes de l'invention peuvent être préparés par les procédés de conjugaison de la présente invention ou selon l'une quelconque des techniques de
BE2016/5782 couplage connues. Le procédé de conjugaison peut comprendre l'activation du saccharide avec le tétrafluoroborate de l-cyano-4-diméthylaminopyridinium (CDAP) pour former un ester de cyanate. Le saccharide activé peut ainsi être couplé directement, ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur (lieur), à un groupe amino se trouvant sur la protéine porteuse. Par exemple, l'espaceur peut être une cystamine ou une cystéamine pour donner un polysaccharide thiolé qui peut être couplé au support par l'intermédiaire d'une liaison thioéther obtenue après réaction avec une protéine porteuse activée par un maléimide (en utilisant, par exemple, le GMBS (ester de N-hydroxy-succinimide de l'acide 4-maléimidobutyrique)) ou une protéine porteuse haloacétylée (en utilisant, par exemple, le SIAB ( (4iodoacétyl)aminobenzoate de succinimidyle), ou le SIA (iodoacétate de succinimidyle) , ou le SBAP (3(bromoacétamide)-propionate de succinimidyle)). Dans un mode de réalisation, l'ester de cyanate (facultativement préparé par la chimie au CDAP) est couplé à 1'hexane diamine ou à l'ADH (dihydrazide de l'acide adipique) et le saccharide amino-dérivatisé est conjugué à la protéine porteuse en utilisant la chimie au carbodiimide (par exemple, le l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDAC or EDC)) via un groupe carboxyle se trouvant sur la protéine porteuse. De tels conjugués sont décrits dans la demande PCT publiée WO 93/15 760 Uniformed Services University et les documents WO 95/08 348 et WO 96/29 094.
Dans un mode de réalisation, au moins un des polysaccharides capsulaires de S. pneumoniae est
BE2016/5782 directement conjugué à une protéine porteuse (par exemple, en utilisant une des chimies décrites cidessus) . Dans un mode de réalisation, au moins un des polysaccharides capsulaires de S. pneumoniae est directement conjugué par le tétrafluoroborate de l-cyano-4-diméthylaminopyridinium (CDAP). Dans un mode de réalisation, la majorité des polysaccharides capsulaires, par exemple 5, 6, 7, 8, 9 ou plus de 9, sont liés directement à une protéine porteuse par le CDAP (voir les documents WO 95/08 348 et WO 96/29 094).
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide de Streptococcus pneumoniae est conjugué à la protéine porteuse par l'intermédiaire d'un lieur, par exemple un lieur bifonctionnel. Le lieur est facultativement hétérobifonctionnel ou homobifonctionnel, par exemple en contenant un groupe amino réactif et un groupe acide carboxylique réactif, 2 groupes amino réactifs ou deux groupes acide carboxylique réactifs. Le lieur contient, par exemple, entre 4 et 20, 4 et 12, 5 et 10 atomes de carbone. Un lieur possible est l'ADH (dihydrazide de l'acide adipique). D'autres lieurs comprennent le B-propionamido (document WO 00/10 599), la nitrophényléthylamine (Gever et al (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165 : 171-288), les halogénures d'haloalkyle (document US 4 057 685), les liaisons glycosidiques (documents US 4 673 574, US 4 808 700), 1 ' hexane-diamine et l'acide 6-aminocaproïque (document US 4 459 286). Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention peut comprendre un polysaccharide capsulaire 18C conjugué à la protéine porteuse par l'intermédiaire d'un lieur, le lieur étant facultativement l'ADH. Dans un
BE2016/5782 mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention peut comprendre un polysaccharide capsulaire 22F conjugué à la protéine porteuse par l'intermédiaire d'un lieur, le lieur étant facultativement l'ADH (par exemple, comme décrit dans le document
WO 2007/071 711 A2).
D'autres techniques appropriées utilisent les carbodiimides, les hydrazides, les esters activés, le norborane, l'acide p-nitrobenzoïque, le N-hydroxysuccinimide, le N-hydroxysulfosuccinimide (S-NHS) , l'EDC, le tétrafluoroborate d'O-(N-succinimidyl)-1,1,3,3tétraméthyluronium (TSTU). Un grand nombre est décrit dans le document WO 98/42 721. La conjugaison peut impliquer un lieur carbonyle qui peut être formé par la réaction d'un groupe hydroxyle libre du polysaccharide avec le carbonyldiimidazole (CDI) (Bethell et al J. Biol. Chem. 1979, 254 ; 2572-4, Hearn et al J. Chromatogr. 1981. 218 ; 509-18), puis réaction avec une protéine pour former une liaison carbamate. Ceci peut impliquer la réduction de la terminaison anomère pour donner un groupe hydroxyle primaire, une protection/déprotection facultative du groupe hydroxyle primaire, la réaction du groupe hydroxyle primaire avec le CDI pour former un intermédiaire CDI-carbamate et le couplage de l'intermédiaire CDI-carbamate avec un groupe amino se trouvant sur une protéine.
Les conjugués peuvent également être préparés par des procédés d'amination réductrice directe, comme décrit dans les documents US 4 365 170 (Jennings) et US 4 673 574 (Anderson). D'autres procédés sont décrits
BE2016/5782 dans les documents EP-0-161-188, EP-208 375 et EP-0477 508.
Un autre procédé implique le couplage d'un polysaccharide dérivatisé avec le dihydrazide d'acide adipique (ADH) et activé par le bromure de cyanogène (ou CDAP) à une protéine porteuse par condensation en présence d'un carbodiimide (Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256), par exemple, en utilisant l'EDAC.
Dans un mode de réalisation, au moins un polysaccharide de S. pneumoniae est conjugué à une protéine porteuse par l'intermédiaire d'un lieur en utilisant CDAP et EDAC. Par exemple, 18C ou 22F peuvent être conjugués à une protéine par l'intermédiaire d'un lieur (par exemple ceux contenant deux groupes hydrazino à leur extrémité, comme ADH) en utilisant CDAP et EDAC, comme décrit ci-dessus. Quand un lieur est utilisé, le CDAP peut être utilisé pour conjuguer le polysaccharide au lieur et l'EDAC peut être utilisé pour conjuguer le lieur à une protéine ou, en variante, l'EDAC peut être utilisé en premier pour conjuguer le lieur à la protéine, après quoi le CDAP peut être utilisé pour conjuguer le lieur au saccharide.
Dans un mode de réalisation, un groupe hydroxyle (de manière appropriée, un groupe hydroxyle activé, par exemple un groupe hydroxyle activé pour former un ester de cyanate [par exemple, avec le CDAP]) se trouvant sur un polysaccharide est lié à un groupe amino ou carboxylique une protéine, soit (par l'intermédiaire se trouvant sur directement, soit indirectement d'un lieur). Quand un lieur est présent, un groupe hydroxyle se trouvant sur un polysaccharide est lié, de
BE2016/5782 manière appropriée, à un groupe amino se trouvant sur un lieur, par exemple en utilisant une conjugaison en présence de CDAP. Un autre groupe amino se trouvant sur le lieur (par exemple, ADH) peut être conjugué à un groupe acide carboxylique se trouvant sur une protéine, par exemple en utilisant la chimie des carbodiimides, par exemple l'EDAC. Dans un mode de réalisation, le ou les saccharides capsulaires pneumococciques sont tout d'abord conjugués au lieur, avant que le lieur soit conjugué à la protéine porteuse. En variante, le lieur peut être conjugué au support avant d'être conjugué au saccharide.
Une combinaison de techniques peut également être utilisée, certains conjugués saccharide-protéine étant préparés par le CDAP, et certains par amination réductrice.
En général, les types suivants de groupes chimiques sur une protéine porteuse peuvent être utilisés pour un couplage/une conjugaison :
A) un carboxyle (par exemple, par l'intermédiaire de l'acide aspartique ou de l'acide glutamique). Dans un mode de réalisation, ce groupe est lié directement aux groupes amino se trouvant sur les polysaccharides ou lié à un groupe amino se trouvant sur un lieur avec la chimie des carbodiimides, par exemple avec l'EDAC.
B) un groupe amino (par exemple, par l'intermédiaire de la lysine) . Dans un mode de réalisation, ce groupe est lié directement aux groupes carboxyle se trouvant sur les polysaccharides ou lié à un groupe carboxyle se trouvant sur un lieur avec la chimie des carbodiimides, par exemple avec l'EDAC. Dans
BE2016/5782 un autre mode de réalisation, ce groupe est lié directement aux groupes hydroxyle activés par le CDAP ou CNBr se trouvant sur les polysaccharides ou lié à ces groupes se trouvant sur un lieur ; aux polysaccharides ou aux lieurs contenant un groupe aldéhyde ; aux polysaccharides ou aux lieurs contenant un groupe ester de succinimide.
C) un sulfhydryle (par exemple, par l'intermédiaire de la cystéine). Dans un mode de réalisation, ce groupe est lié à un polysaccharide bromo- ou chloro-acétylé ou à un lieur par la chimie des maléimides. Dans un mode de réalisation, ce groupe est activé/modifié avec la bisdiazobenzidine.
D) un groupe hydroxyle (par exemple, par
1' intermédiaire de la tyrosine) Dans un mode de
réalisation, ce groupe est activé/modifié avec la
bisdiazobenzidine.
E) un groupe imidazolyle (par exemple, par
l'intermédiaire de 1'histidine) Dans un mode de
réalisation, ce groupe est activé/modifié avec la
bisdiazobenzidine.
F) un groupe guanidyle (par exemple, par
l'intermédiaire de 1' arginine).
G) un groupe indolyle (par exemple, par
l'intermédiaire du tryptophane).
Sur un saccharide, en général, les groupes suivants peuvent être utilisés pour un couplage : OH, COOH ou NH2. Des groupes aldéhyde peuvent être générés après différents traitements connus dans l'art, par exemple avec du périodate, par hydrolyse acide, avec le peroxyde d'hydrogène, etc.
BE2016/5782
Approches de couplage direct :
Saccharide-OH + CNBr ou CDAP -> ester de cyanate + NH2Protéine -> conjugué
Saccharide-aldéhyde + NPh-Protéine -> base de Schiff + NaCNBH3 -> conjugué
Saccharide-COOH + NPh-Protéine + EDAC -> conjugué Saccharide-NH2 + COOH-Protéine + EDAC -> conjugué
Approches de couplage indirect par l'intermédiaire d'un espaceur (lieur)
Saccharide-OH + CNBr ou CDAP -> ester de cyanate + NH2--NH2 -> saccharide-NH2 + COOH-Protéine + EDAC ->
conj ugué
Saccharide-OH + CNBr ou CDAP -> ester de cyanate + NH2--SH -> saccharide-SH + SH-Protéine (protéine native ayant une cystéine exposée ou obtenue après modification des groupes amino de la protéine par SPDP, par exemple) -> saccharide-S-S-Protéine
Saccharide-OH + CNBr ou CDAP --> ester de cyanate + NH2--SH -> saccharide---SH + maléimide-Protéine (modification des groupes amino) -> conjugué
Saccharide-OH + CNBr ou CDAP --> ester de cyanate + NH2--SH -> saccharide---SH + Protéine haloacétylée ->
conj ugué
BE2016/5782
Saccharide-COOH + EDAC + NH2---NH2 -> saccharide---NH2 +
EDAC + COOH-Protéine -> conjugué
Saccharide-COOH + EDAC + NH2-SH -> saccharide-SH + SHProtéine (protéine native ayant une cystéine exposée ou obtenue après modification des groupes amino de la protéine par SPDP, par exemple) -> saccharide-S-SProtéine
Saccharide-COOH + EDAC + NH2-SH -> saccharide---SH + maléimide-Protéine (modification des groupes amino) -> conj ugué
Saccharide-COOH + EDAC + NH2-SH -> saccharide-SH + Protéine haloacétylée -> conjugué
Saccharide-aldéhyde + NH2---NH2 -> saccharide-NH2 + EDAC + COOH-Protéine -> conjugué.
Remarque : au lieu de l'EDAC ci-dessus, n'importe quel carbodiimide approprié peut être utilisé.
En résumé, les types de groupe chimique de la protéine porteuse qui peuvent être généralement utilisés pour un couplage avec un polysaccharide sont les groupes
amino (par exemple, sur les résidus lysine^ ) , les groupes
COOH (par exemple, sur les résidus acide aspartique et
acide glutamique) et les groupes SH (s'ils sont
accessibles) (par exemple, sur les résidus cystéine).
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention est conjugué à la protéine porteuse (par exemple, CRM-197) en utilisant la chimie au CDAP. Dans
BE2016/5782 un aspect, la chimie au CDAP utilise un rapport CDAP/PS6A situé entre 1/2 et 3/1, 1/1,5 et 2/1, par exemple de 1/1. Dans un autre aspect, la conjugaison en présence de CDAP est réalisée en utilisant un temps de couplage situé entre 50 et 130 minutes, 60 et 130 minutes, ou 110 et 130 minutes. Par conséquent, la présente invention propose également un procédé de préparation d'un conjugué de polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A (par exemple, un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention) comprenant la conjugaison d'un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A à une protéine porteuse (par exemple, CRM-197) ou à un lieur (par exemple, ADH) en utilisant la chimie au CDAP avec un rapport CDAP/PS (polysaccharide) situé entre 1/2 et 3/1, 1/1,5 et 2/1, par exemple de 1/1.
Dans un autre aspect, la présente invention propose un procédé de préparation d'un conjugué de polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A (par exemple, un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention) comprenant la conjugaison d'un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A à une protéine porteuse (par exemple, CRM-197) en utilisant la chimie au CDAP avec un rapport CDAP/PS (polysaccharide) situé entre 1/2 et 3/1, 1/1,5 et 2/1, par exemple de 1/1. Dans un aspect, la présente invention propose également un procédé de préparation d'un conjugué de polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A (par exemple,
BE2016/5782 un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention, tel qu'un polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A ayant une taille moyenne (par exemple, Mw) située entre 100 et 1000, 110 et 750, 150 et 500, 180 et 600, 210 et 490, 210 et 450, 180 et 400, 210 et 400, 210 et 370, 220 et 360, 230 et 350, 240 et 340, 240 et 320, 240 et 310 ou 250 et 310 kDa) comprenant la conjugaison d'un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A à une protéine porteuse (par exemple, CRM-197) ou à un lieur (par exemple, ADH) en utilisant la chimie au CDAP avec un temps de couplage situé entre 50 et 130 minutes, 60 et 130 minutes, ou 110 et 130 minutes.
Dans un autre aspect, la présente invention propose un procédé de préparation d'un conjugué de polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A (par exemple, un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention, tel qu'un polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A ayant une taille moyenne (par exemple, Mw) située entre 100 et 1000, 110 et 750, 150 et 500, 180 et 600, 210 et 490, 210 et 450, 180 et 400, 210 et 400, 210 et 370, 220 et 360, 230 et 350, 240 et 340, 240 et 320, 240 et 310 ou 250 et 310 kDa) comprenant la conjugaison d'un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A à une protéine porteuse (par exemple, CRM-197) en utilisant la chimie au CDAP avec un temps de couplage situé entre 50 et 130 minutes, 60 et 130 minutes, ou 110 et 130 minutes. Dans un aspect, le pH pour l'activation
BE2016/5782 et le couplage est situé entre pH 8 et pH 9, de manière appropriée le pH est de 9,5. Dans un autre aspect, la conjugaison est réalisée en présence de NaCI. Par exemple, dans du NaCI 0,1 à 3 M, du NaCI 0,1 à 2,5 M, du NaCI 1,5 à 2,5 M ou du NaCI 2 M.
La présente invention propose également un procédé de préparation d'un conjugué de polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A comprenant (a) la conjugaison d'un polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A (par exemple, un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention) à une protéine porteuse (par exemple, CRM197) et (b) une diafiltration contre une solution présentant une concentration en NaCI inférieure à 150 mM (par exemple, inférieure à 100 mM de NaCI, inférieure à 50 mM de NaCI, inférieure à 10 mM de NaCI) ou en utilisant de l'eau (par exemple, WFI, eau pour injection) .
Dans un autre aspect, la présente invention propose d'une solution comprenant 6A-CRM197 dans moins de 150 mM de NaCI. Par exemple, moins de 100 mM de NaCI, moins de 50 mM de NaCI, moins de 10 nM de NaCI, ou en l'absence de chlorure de sodium. Dans un autre aspect, la présente invention propose une composition immunogène de l'invention (par exemple, 6A-CRM197) comprenant moins de 150 mM de NaCI. Par exemple, moins de 100 mM de NaCI, moins de 50 mM de NaCI, moins de 10 mM de NaCI, ou en l'absence de chlorure de sodium.
Rapport protéine porteuse sur polysaccharide
BE2016/5782
Dans un mode de réalisation, le rapport protéine porteuse sur polysaccharide de S. pneumoniae est situé entre 1/5 et 5/1 ; par exemple entre 1/0,5 et 4/1, 1/1 et 3,5/1, 1,2/1 et 3/1, 1,5/1 et 2,5/1 ; par exemple entre 1/2 et 2,5/1 ; 1/1 et 2/1 (en poids/poids). Dans un mode de réalisation, la majorité des conjugués, par exemple 6, 7, 8, 9 ou plus de 9 des conjugués, présente un rapport protéine porteuse sur polysaccharide qui est supérieur à 1/1, par exemple de 1,1/1, 1,2/1, 1,3/1, 1,4/1, 1,5/1 ou 1,6/1.
Dans un mode de réalisation, le rapport protéine porteuse sur polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A dans les compositions immunogènes de l'invention est situé entre 5/1 et 1/5, 4/1 et 1/1 ou 2/1 et 1/1, 1,5/1 et 1/1, 1,4/1 et 1,3/1 (par exemple, 1,2/1, 1,5/1) (en poids/poids).
Le rapport polysaccharide sur protéine porteuse (en poids/poids) dans un conjugué peut être déterminé en utilisant le conjugué. La quantité de protéine est déterminée en utilisant un essai de Lowry (par exemple, Lowry et al. (1951) J. Biol. Chem. 193, 265-275 ou Peterson et al. Analytical Biochemistry 100, 201-220 (1979)) et la quantité de polysaccharide est déterminée en utilisant un essai au résorcinol (Monsigny et al. (1988) Anal. Biochem. 175, 525-530). Le rapport protéine/polysaccharide final (en poids/poids) sur le conjugué stérilisé est déterminé par le rapport des concentrations de Lowry/résorcinol.
Taille des polysaccharides capsulaires dans la composition immunogène
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Les polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae comprennent des motifs oligosaccharidiques répétitifs qui contiennent jusqu'à 8 fragments glucidiques. Pour une vue d'ensemble des motifs oligosaccharidiques pour les sérotypes clés de Streptococcus pneumoniae, voir JONES, Christopher. Vaccines based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bacteria. An. Acad. Bras. Ciênc., juin 2005, vol. 77, no. 2, p. 293-324. Tableau II ISSN 0001-3765. Dans un mode de réalisation, un polysaccharide capsulaire peut être un polysaccharide pleine longueur, cependant dans d'autres il peut être plus court que la chaîne polysaccharidique native de motifs répétitifs. Dans un mode de réalisation, les conjugués de polysaccharide capsulaire de sérotype de Streptococcus pneumoniae post-conjugaison doivent être facilement filtrables à travers un filtre de 0,2 micron, de façon qu'un rendement de plus de 95 % soit obtenu après la filtration par rapport à l'échantillon avant la filtration.
En plus du conjugué de polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A de l'invention, la composition immunogène de l'invention peut comprendre un ou plusieurs conjugués de (poly)saccharide issus de sérotypes de Streptococcus pneumoniae différents de 6A (par exemple, 6B et/ou 23F), dans lesquels la taille moyenne (par exemple, le poids moléculaire moyen en poids ; Mw) du (poly)saccharide avant la conjugaison est supérieure à 80 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 300 kDa, 400 kDa, 500 kDa, 700 kDa ou 1000 kDa. Par exemple, la composition immunogène de l'invention
BE2016/5782 peut comprendre un ou plusieurs conjugués de (poly)saccharide issus de sérotypes de Streptococcus pneumoniae différents de 6A, dans lesquels la taille moyenne (par exemple, le poids moléculaire moyen en poids ; Mw) du (poly)saccharide avant la conjugaison est située entre 80 kDa et 100 kDa, 100 et 200 kDa, 200 et 300 kDa, 300 et 400 kDa, 400 et 500 kDa, 500 et 1000 kDa ou 1000 et 1400 kDa. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène comprend (i) un conjugué de polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A et (ii) un ou plusieurs conjugués de (poly) saccharide ayant une taille moyenne de saccharide avant la conjugaison de 50 à 1600, 80 à 1400, 100 à 1000, 150 à 500, ou 200 à 400 kDa (il doit être noté que quand la taille moyenne est Mw, l'unité « kDa » doit être remplacée ici par « xlO3 ») .
Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend un polysaccharide de
S. pneumoniae de sérotype 1 présentant une taille moyenne (Mw) située entre 100 et 1000, 200 et 800, 250 et 600, ou 300 et 400 kDa. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend un polysaccharide de S. pneumoniae de sérotype 4 présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 500, 60 et 300, 70 et 150, ou 75 et 125 kDa. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend un polysaccharide de S. pneumoniae de sérotype 5 présentant une taille moyenne (Mw) située entre 100 et 1000, 100 et 700, 100 et 350, ou 150 et 300 kDa. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend un polysaccharide de S. pneumoniae
BE2016/5782 de sérotype 6B présentant une taille moyenne (Mw) située entre 200 et 1800, 500 et 1800, 600 et 1800, 900 et 1660, ou 1000 et 1400 kDa. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend un polysaccharide de S. pneumoniae de sérotype 7F présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 1000, 100 et 750, 150 et 500, ou 200 et 300 kDa. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend un polysaccharide de S. pneumoniae de sérotype 9V présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 1000, 100 et 750, 150 et 500, 200 et 400, ou 250 et 300 kDa. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend un polysaccharide de S. pneumoniae de sérotype 14 présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 1000, 100 et 750, 150 et 500, ou 200 et 250 kDa. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend un polysaccharide de S. pneumoniae de sérotype 18C présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 1000, 50 et 750, 50 et 500, 50 et 190, 50 et 150 ou 80 et 110 kDa. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend un polysaccharide de S. pneumoniae 19A présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 800, 110 et 700, 110 et 300, 120 et 200, 130 et 180, 140 et 160 ou 80 et 130 kDa. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend un polysaccharide de
S. pneumoniae de sérotype 19F présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 1000, 100 et 750, 100 et 500, 100 et 190 ou 120 et 180 kDa. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention
BE2016/5782 comprend un polysaccharide de S. pneumoniae de sérotype 23F présentant une taille moyenne (Mw) située entre 500 et 1500, 600 et 1500, 700 et 1300, 900 et 1250, 800 et 1100, ou 900 et 1000 kDa. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend un polysaccharide de S. pneumoniae de sérotype 22F présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 800, 110 et 700, 110 et 300, 120 et 200, 130 et 180, 150 et 170, 100 et 190, 100 et 150, 95 et 125 ou 100 et 115 kDa.
Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend 1 ou plusieurs polysaccharides capsulaires natifs issus de différents sérotypes de S. pneumoniae. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène comprend des polysaccharides de Streptococcus pneumoniae issus d'au moins 10 sérotypes conjugués à une protéine porteuse, dans lesquels au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 des sérotypes de polysaccharide de S. pneumoniae sont des polysaccharides natifs. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend un polysaccharide capsulaire natif de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6B. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend un polysaccharide capsulaire natif de Streptococcus pneumoniae de sérotype 23F.
Dans un aspect de l'invention, la composition immunogène comprend des polysaccharides de Streptococcus pneumoniae issus d'au moins 10 sérotypes conjugués à une protéine porteuse, dans lesquels au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 des sérotypes de polysaccharide de
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S. pneumoniae dimensionnée .
S. pneumoniae sont dimensionnés par un facteur allant jusqu'à x2, x3, x4, x5, x6, x7, x8, x9 ou xlO. Dans un mode de réalisation de cet aspect, la majorité des polysaccharides, par exemple 6, 7, 8 ou plus de 8 des sérotypes de polysaccharide, sont dimensionnés par un facteur allant jusqu'à x2, x3, x4, x5, x6, x7, x8, x9 ou xlO. Par exemple, le dimensionnement peut être d'un facteur situé entre x2 et x6, x2 et x5, x2 et x4, ou x3 et x6, x3 et x5 ou x3 et x4.
Dans un mode de réalisation, la majorité des polysaccharides de S. pneumoniae dans la composition immunogène est dimensionnée. Dans un mode de réalisation, la majorité des sérotypes de polysaccharide de dans la composition immunogène est Dans un aspect, les polysaccharides de
S. pneumoniae dans la composition immunogène sont dimensionnés par clivage mécanique, par exemple par microfluidisation ou sonication. Dans un autre aspect, les polysaccharides de S. pneumoniae dans la composition immunogène sont dimensionnés par clivage chimique, par exemple par un traitement avec de l'acide acétique ou un periodate. Le dimensionnement est effectué d'un facteur d'au plus x20, xlO, x8, x6, x5, x4, x3 ou x2.
Dans un mode de réalisation, la composition immunogène comprend des conjuguées de S. pneumoniae qui sont un mélange de polysaccharides natifs et de polysaccharides qui sont dimensionnés d'un facteur d'au plus x20, xlO, x8, x6, x5, x4, x3 ou x2. Dans un aspect de ce mode de réalisation, la majorité des polysaccharides, par exemple 6, 7, 8, 9, 10 ou plus de
BE2016/5782 des polysaccharides, est dimensionnée d'un facteur allant jusqu'à x2, x3, x4, x5 ou x6.
Dosage
En général, la composition immunogène de l'invention peut comprendre une dose de chaque conjugué de saccharide située entre 0,1 et 20 pg, 1 et 10 pg ou 1 et 3 pg de saccharide.
Dans un mode de réalisation, dans la composition immunogène de la présente invention, la dose du conjugué de polysaccharide 6A de Streptococcus pneumoniae est située entre 1 et 10 pg, 1 et 5 pg, ou 1 et 3 pg de saccharide (par exemple, 2 pg).
Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention contient chaque saccharide capsulaire de S. pneumoniae à une dose située entre 0,1 et 20 pg ; 0,5 et 10 pg ; 0,5 et 5 pg ou 1 et 3 pg de saccharide. Dans un mode de réalisation, les polysaccharides capsulaires peuvent être présents à des doses différentes, par exemple certains polysaccharides capsulaires peuvent être présents à une dose d'environ ou exactement de 1 pg ou certains polysaccharides capsulaires peuvent être présents à une dose d'environ ou exactement de 3 pg. Dans un mode de réalisation, les polysaccharides de sérotypes 3, 18C et 19F sont présents à une dose plus élevée que les autres polysaccharides. Dans un mode de réalisation, les polysaccharides de sérotypes 4, 18C et 19F sont présents à une dose plus élevée que les autres polysaccharides. Dans un aspect de ce mode de réalisation, les sérotypes 3, 18C et 19F sont présents à une dose d'environ ou exactement de 3 pg,
BE2016/5782 tandis que les autres polysaccharides dans la composition immunogène sont présents à une dose d'environ ou exactement de 1 pg. Dans un aspect de ce mode de réalisation, les sérotypes 4, 18C et 19F sont présents à une dose d'environ ou exactement de 3 pg, tandis que les autres polysaccharides dans la composition immunogène sont présents à une dose d'environ ou exactement de 1 pg.
Dans le cadre de la présente invention, « environ » ou « approximativement » signifie à plus ou moins 10 % du chiffre donné.
Protéines de Streptococcus pneumoniae
La composition immunogène de l'invention peut également comprendre des protéines de Streptococcus pneumoniae, appelées ci-après protéines de Streptococcus pneumoniae de l'invention. Ces protéines peuvent être utilisées comme protéines porteuses, ou elles peuvent être présentes sous forme de protéines libres, ou elles peuvent être présentes à la fois sous forme de protéines porteuses et de protéines libres. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend en outre une ou plusieurs protéines de S. pneumoniae conjuguées ou non conjuguées. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend en outre une ou plusieurs protéines de S. pneumoniae non conjuguées. Par exemple, les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre une pneumolysine non conjuguée, par exemple dPly, et PhtD pneumococcique non conjugué.
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Les protéines de Streptococcus pneumoniae de l'invention sont exposées en surface, au moins pendant une partie du cycle biologique du pneumocoque, ou sont des protéines qui sont sécrétées ou libérées par le pneumocoque. Dans un mode de réalisation, les protéines de l'invention sont choisies parmi les catégories suivantes, telles que les protéines contenant un motif LXXC de séquence signal de type II (où X est un acide aminé quelconque, par exemple la famille des triades polyhistidine (Phtx)), les protéines se liant à la choline (par exemple, CbpX, PcpA), les protéines contenant un motif de séquence signal de type I (par exemple, SplOl), les protéines contenant un motif LPXTG (où x est un acide aminé quelconque, par exemple Spl28, Spl30) et les toxines (par exemple, Ply). Les exemples préférés dans ces catégories (ou motifs) sont les protéines suivantes, ou immunologiquement fonctionnels, composition immunogène de l'invention peut comprendre une ou plusieurs protéines de S. pneumoniae choisies parmi la famille des triades polyhistidine (PhtX), la famille des protéines se liant à la choline (CbpX), les CbpX tronquées, la famille LytX des autolysines pneumococciques (LytA (N-acétylmuramoyl-l-alanine amidase), LytB, LytC), les LytX tronquées, les protéines chimères CbpX tronquée-LytX tronquée, la pneumolysine détoxifiée (Ply), PspA, PsaA, Spl28, SplOl, Spl30, Spl25 et Spl33. Dans un autre mode de réalisation, la leurs équivalents Par conséquent, la composition immunogène de l'invention comprend 2 ou plus de 2 protéines choisies dans le groupe constitué par la famille des triades polyhistidine (PhtX) , la famille des
BE2016/5782 protéines se liant à la choline (CbpX), les CbpX tronquées, la famille des LytX, les LytX tronquées, les protéines chimère CbpX tronquée-LytX tronquée (ou les fusions), la pneumolysine (Ply), PspA, PsaA et Spl28. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène comprend 2 ou plus de 2 protéines choisies dans le groupe constitué par la famille des triades polyhistidine (PhtX), la famille des protéines se liant à la choline (CbpX), les CbpX tronquées, la famille des LytX, les LytX tronquées, les protéines chimères CbpX tronquée-LytX tronquée (ou les fusions), la pneumolysine (Ply) et Spl28.
La famille des Pht (triade polyhistine) comprend les protéines PhtA, PhtB, PhtD et PhtE. La famille est caractérisée par une séquence de lipidation, deux domaines séparés par une région riche en proline et plusieurs triades d'histidine, éventuellement impliquées dans une liaison aux métaux ou aux nucléosides ou dans une activité enzymatique, (3 à 5) régions en superhélice, une région N-terminale conservée et une extrémité Cterminale hétérogène. Elle est présente dans toutes les souches de pneumocoques testées. Des protéines homologues ont également été trouvées dans d'autres Streptocoques et chez Nesseiria. Dans un mode de réalisation de l'invention, la composition immunogène comprend PhtD. Cependant, on comprendra que les termes Pht A, B, D et E font référence aux protéines possédant les séquences divulguées dans les citations ci-dessous, ainsi qu'à leurs variants naturels qui présentent une homologie de séquence qui est au moins identique à 90 % aux protéines décrites ci-dessous, par exemple les
BE2016/5782 acides aminés 21 à 838 de SEQ ID NO : 4 de WO 00/37 105. Dans un mode de réalisation, elle est identique à au moins 95 % et, dans un autre mode de réalisation, elle est identique à 97 %.
En ce qui concerne les protéines PhtX, PhtA est divulguée dans le document WO 98/18 930, et est également appelée Sp36. Comme indiqué ci-dessus, c'est une protéine appartenant à la famille des triades polyhistidine qui contient le motif signal de type II, LXXC. PhtD est divulguée dans le document WO 00/37 105, et est également appelée SpO36D. Comme indiqué ci-dessus, c'est également une protéine appartenant à la famille des triades polyhistidine qui contient le motif signal de type II, LXXC. PhtB est divulguée dans le document WO 00/37 105, et est également appelée SpO36B. Un autre membre de la famille de PhtB est le polypeptide de dégradation C3, divulgué dans le document WO 00/17 370. Cette protéine appartient également à la famille des triades polyhistidine et contient le motif signal de type II, LXXC. Un équivalent immunologiquement fonctionnel préféré est la protéine Sp42 divulguée dans le document WO 98/18 930. Une PhtB tronquée (d'environ 79 kD) , que l'on considère appartenir également à la
famille des PhtX, est divulguée dans le document
WO 99/15 675. PhtE est divulguée dans le document
WO 00/30 299, et est appelée BVH-3. Quand une protéine
Pht quelconque est mentionnée dans le présent document, cela signifie que les fragments immunogènes, ou leurs fusions, de la protéine Pht peuvent être utilisés. Par exemple, une référence à PhtX comprend les fragments
BE2016/5782 immunogènes ou leurs fusions provenant de n'importe quelle protéine Pht.
Dans un mode de réalisation, la protéine de S. pneumoniae choisie parmi un ou plusieurs membres de la famille des triades polyhistidine est PhtD. Le terme « PhtD », tel qu'utilisé dans le présent document, comprend la protéine pleine longueur à laquelle la séquence signal est fixée ou la protéine pleine longueur mature de laquelle le peptide signal est retiré (par exemple, 20 acides aminés à l'extrémité N-terminale), et ses fragments immunogènes, variants et/ou protéines de fusion, par exemple SEQ ID NO : 4 de WO 00/37 105. Dans un aspect, PhtD est la protéine pleine longueur à laquelle la séquence signal est fixée, par exemple SEQ ID NO : 4 de WO 00/37 105. Dans un autre aspect, PhtD est une séquence comprenant la protéine pleine longueur mature de laquelle le peptide signal est retiré (par exemple, 20 acides aminés à l'extrémité N-terminale), par exemple les acides aminés 21 à 838 de SEQ ID NO : 4 de WO 00/37 105. De manière appropriée, la séquence de PhtD comprend une méthionine N-terminale. La présente invention comprend également les polypeptides PhtD qui sont des fragments immunogènes de PhtD, des variants de PhtD et/ou des protéines de fusion de PhtD. Par exemple, comme décrit dans les documents WO 00/37 105, WO 00/39 299, US 6 699 703 et WO 09/12 588.
Quand des fragments immunogènes des protéines PhtD sont utilisés (séparément ou dans une protéine de fusion), ces fragments immunogènes auront une longueur d'au moins environ 15, d'au moins environ 20, d'au moins environ 40, ou d'au moins environ 60 résidus d'acide aminé
BE2016/5782 contigus, par exemple provenant d'une séquence d'acide aminé de PhtD décrite dans le document WO 00/37 105 ou WO 00/39 299, comme SEQ ID NO : 4 de WO 00/37 105. Dans un mode de réalisation de l'invention, les fragments immunogènes de la protéine PhtD comprennent au moins environ 15, au moins environ 20, au moins environ 40, ou au moins environ 60 résidus d'acide aminé contigus de la séquence représentée par SEQ ID NO : 4 de WO 00/37 105, dans lequel ledit polypeptide est capable de déclencher une réponse immunitaire spécifique pour ladite séquence d'acides aminés. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène de l'invention comprend un fragment immunogène de PhtD, par exemple décrit dans les documents WO 09/12 601, WO 01/98 334 et WO 09/12 588. Quand des fragments immunogènes de protéines PhtD sont utilisés (séparément ou dans une protéine de fusion), chaque fragment immunogène contient facultativement un ou plusieurs motifs de triade d'histidine de ces polypeptides. Un motif de triade d'histidine est la partie du polypeptide qui présente la séquence HxxHxH, où H est l'histidine et x est un acide aminé différent de l'histidine. Dans un mode de réalisation de la présente invention, le ou chaque fragment immunogène contient exactement ou au moins 2, 3, 4 ou 5 motifs de triade d'histidine (facultativement, avec la séquence native de PhtD entre les 2 ou plus de 2 triades, ou une séquence intra-triade), le fragment immunogène étant à plus de 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 % identique à une séquence PhtD intra-triade pneumococcique native (par exemple, la séquence intra-triade représentée par SEQ ID NO : 4 dans le document WO 00/37 105). Les
BE2016/5782 fragments immunogènes des protéines PhtD contiennent facultativement une ou plusieurs régions en superhélice de ces polypeptides. Une région en superhélice est une région prédite par l'algorithme « Coils » Lupus, A et al (1991) Science 252 ; 1162-1164. Dans un mode de réalisation de la présente invention, chaque fragment immunogène contient exactement ou au moins 2, 3 ou 4 régions en superhélice. Dans un mode de réalisation de la présente invention, le ou chaque fragment immunogène contient exactement ou au moins 2, 3 ou 4 régions en superhélice, le fragment immunogène étant à plus de 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96 ou 100 % identique à une séquence PhtD pneumococcique native (par exemple, la séquence représentée par SEQ ID NO : 4 dans le document WO 00/37 105) . Dans un autre mode de réalisation de la présente invention, le fragment immunogène comprend un ou plusieurs motifs de triade d'histidine et au moins 1, 2, 3 ou 4 régions en superhélice.
Quand le polypeptide PhtD est un variant, la variation se situe généralement dans une partie de celuici différente des résidus de la triade d'histidine et de la région en superhélice, bien que des variations dans une ou plusieurs de ces régions puissent être faites. Selon la présente invention, un variant polypeptidique comprend des séquences dans lesquelles un ou plusieurs acides aminés sont substitués et/ou supprimés et/ou insérés par rapport à la séquence de type sauvage. Une substitution d'acide aminé peut être conservative ou non conservative. Dans un aspect, la substitution d'acide aminé est conservative. Des substitutions, des délétions, des insertions ou n'importe quelle combinaison de
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SEQ ID NO : 4 réalisation, un mode de comprend des celles-ci peuvent être combinées dans un unique variant, du moment que le variant est un polypeptide immunogène. Les variant de PhtD comprennent généralement n'importe quel fragment immunogène ou n'importe quelle variation de PhtD qui partage une identité de séquence d'acides aminés d'au moins 80, 90, 95, 96, 98 ou 99 % avec une séquence de PhtD de type sauvage, par exemple de WO 00/37 105. Dans la présente invention fragments immunogènes et/ou des variants dans lesquels plusieurs 5 à 10, 1 à 5, 1 à 3, 1 à 2 ou 1 acide (s) aminé (s) est/sont substitué (s), supprimé (s) ou ajouté (s) dans n'importe quelle combinaison. Dans un autre mode de réalisation, la présente invention comprend des fragments immunogènes et/ou des variants qui comprennent un épitope de lymphocyte B ou de lymphocyte T. Ces épitopes peuvent être prédits en utilisant une combinaison de prédiction de structure 2D, par exemple en utilisant le programme PSIPRED (de David Jones, Brunei Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunei University, Uxbridge UB8 3PH, RU) et l'indice antigénique calculé sur la base du procédé décrit par Jameson et Wolf (CABIOS 4 : 181-186 [1988]).
Dans un mode de réalisation de l'invention, PhtD et ses fragments immunogènes, variants et/ou protéines de fusion comprennent une séquence d'acides aminés partageant une identité d'au moins 80, 85, 90, 95, 96,
97, 98, 99 ou 100 % avec la séquence d'acides aminés 21 à 838 de SEQ ID NO : 4 de WO 00/37 105. Dans un autre mode de réalisation, PhtD et ses fragments immunogènes, variants et/ou protéines de fusion possèdent une
BE2016/5782 séquence d'acides aminés partageant une identité d'au moins 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % avec la séquence d'acides aminés 21 à 838 de SEQ ID NO : 4 de WO 00/37 105. De manière appropriée, PhtD et ses fragments immunogènes, variants et/ou protéines de fusion comprennent une séquence d'acides aminés contenant une méthionine N-terminale. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, PhtD et ses fragments immunogènes, variants et/ou protéines de fusion comprennent au moins environ 15, au moins environ 20, au moins environ 40, ou au moins environ 60 ou au moins environ 100, ou au moins environ 200, ou au moins environ 400 ou au moins environ 800 résidus d'acide aminé contigus de la séquence représentée par SEQ ID NO : 4 dans le document WO 00/37 105.
La pneumolysine (Ply) est une toxine multifonctionnelle ayant des activités cytolytiques (hémolytiques) et d'activation du complément distinctes (Rubins et al., Am. Respi. Cit Care Med, 153 : 1339-1346 toxine n'est sécrétée par les (1996)). La pneumocoques, pas mais elle est libérée après la lyse des pneumocoques sous l'action d'une autolysine. Ses effets la stimulation de la inflammatoires par les comprennent, production par exemple, des cytokines monocytes humains, l'inhibition du battement des cils sur l'épithélium respiratoire humain, la diminution de l'activité bactéricide et la migration des neutrophiles, la lyse des érythrocytes, qui implique la liaison au cholestérol. Comme c'est une toxine, elle doit être détoxifiée (c'est-à-dire, qu'elle doit être non toxique pour les humains quand elle est fournie à une dose
BE2016/5782 appropriée pour une protection) avant qu'elle soit administrée in vivo. L'expression et le clonage de la pneumolysine de type sauvage ou native sont connus dans l'art. Voir, par exemple, Walker et al. (Infect Immun. 55 : 1184-1189 (1987)), Mitchell et al. (Biochim Brophys Acta, 1007 : 67-72 (1989) et Mitchell et al (NAR, 18 : 4010 (1990)). La détoxification de Ply peut être effectuée par des moyens chimiques, par exemple par soumission à un traitement au formaldéhyde ou au glutaraldéhyde, ou combinaison des deux (WO 04 081 515, PCT/EP 2005/010 258). Ces procédés sont connus dans l'art pour diverses toxines. En variante, ply peut être génétiquement détoxifiée. Par conséquent, l'invention englobe les dérivés de protéines pneumococciques qui peuvent être, par exemple, des protéines mutées. Le terme « muté » est utilisé ici pour désigner une molécule qui a subi une délétion, une addition ou une substitution d'un ou de plusieurs acides aminés en utilisant des techniques connues de mutagenèse dirigées ou tout autre procédé classique. Par exemple, comme décrit ci-dessus, une protéine ply mutante peut être modifiée de manière à être biologiquement inactive tout en conservant ces épitopes immunogènes, voir, par exemple, le document WO 90/06 951, Berry et al. (Infect Immun, 67 : 981-985 (1999)) et le document WO 99/03 884.
Tel qu'utilisé dans le présent document, il est entendu que le terme « Ply » désigne une pneumolysine mutée et une pneumolysine détoxifiée (dPly), appropriées pour une utilisation médicale (c'est-à-dire, toxique).
non
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1' origine été pneumococciques
En ce qui concerne les protéines se liant à la choline (CbpX), les membres de cette famille ont à identifiés comme des protéines qui pouvaient être purifiées par chromatographie d'affinité avec la choline. Toutes les protéines se liant à la choline sont liées de manière non covalente aux fragments phosphorylcholine de l'acide téichoïque des parois cellulaires et de l'acide lipotéichoïque associé aux membranes. Sur le plan de la structure, elles ont plusieurs régions en commun sur toute la famille, bien que la nature exacte des protéines (séquence d'acides aminés, longueur, etc.) puisse varier. En général, les protéines se liant à la choline comprennent une région N-terminale (N) , des régions à répétition conservées, une région riche en proline (P) et une région conservée se liant à la choline (C) , constituée de multiples répétitions, qui représente environ la moitié de la protéine. Tel qu'utilisé dans la présente demande, le terme « famille de protéines se liant à la choline (CbpX) » est choisi dans le groupe constitué par les protéines se liant à la choline identifiées dans le document WO 97/41 151, la protéine A se liant à la choline, CbpA (également appelée PbcA (protéine A de liaison C3) , SpsA (protéine de liaison IgA sécrétoire de Streptococcus pneumoniae}, PspC (protéine C de surface des pneumocoques), la protéine D se liant à la choline (CbpD) et la protéine G se liant à la choline (CbpG). CbpA est divulguée dans le document
WO 97/41 151. CbpD et CbpG sont divulguées dans le
document WO 00/29 434 . PspC est divulguée dans le
document WO 97/09 994 . PbcA est divulguée dans le
BE2016/5782 document WO 98/21 337. SpsA est une protéine se liant à la choline divulguée dans le document WO 98/39 450. Dans un mode de réalisation, la protéine se liant à la choline est CbpA. Une autre protéine se liant à la choline est la protéine A pneumococcique se liant à la choline (PcpA) (Sanchez-Beato et al FEMS Microbiology Letters 164 (1998) 207-214).
Un autre mode de réalisation préféré est les CbpX tronquées, où « CbpX » est CbpA, CbpD ou CbpG et « tronquées » fait référence aux protéines CbpX dépourvues de 50 % ou plus de la région se liant à la choline (C) . Un autre mode de réalisation préféré est les PcpA tronquées, où « tronquées » fait référence aux protéines PcpA dépourvues de 50 % ou plus de la région se liant à la choline (C). Dans un mode de réalisation, les CbpX tronquées et les PcpA sont dépourvues de la totalité de la région se liant à la choline. Dans un autre mode de réalisation, les CbpX tronquées et les PcpA sont dépourvues (i) de la région se liant à la choline et (ii) également d'une partie de la moitié N-terminale de la protéine, mais elles conservent au moins une région à répétition. Dans un autre mode de réalisation, la protéine tronquée comporte au moins 2 régions à répétition. Des exemples de ces modes de réalisation préférés sont illustrés dans le document WO 99/51 266 ou WO 99/51 188, bien que d'autres protéines se liant à la choline dépourvues d'une région similaire se liant à la choline soient également envisagées dans le cadre de la présente invention.
La famille des LytX comprend les protéines associées à la membrane associées à la lyse cellulaire.
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Le domaine N-terminal comprend le(s) domaine(s) se liant à la choline, bien que la famille des LytX ne présente pas toutes les caractéristiques que l'on trouve chez la famille des CbpA décrite ci-dessus, par conséquent, pour la présente invention, on considère que la famille des LytX est distincte de la famille des CbpX. Par rapport à la famille des CbpX, le domaine C-terminal contient le domaine catalytique de la famille des protéines LytX. La famille comprend LytA, LytB et LytC. En ce qui concerne la famille des LytX, LytA est divulguée dans Ronda et al., Eur. J Biochem, 164 : 621-624 (1987) . LytB est divulguée dans le document WO 98/18 930, et est également appelée Sp46. LytC est également divulguée dans le document WO 98/18 930, et est également appelée Sp91. Un membre préféré de cette famille est LytC.
Un autre mode de réalisation préféré est les LytX tronquées, où « LytX » est LytA, LytB et LytC et « tronquée » fait référence aux protéines LytX dépourvues de 50 % ou plus de la région se liant à la choline. De manière appropriée, ces protéines sont dépourvues de la totalité de la région se liant à la choline. Un autre mode de réalisation préféré de la présente invention comprend les protéines chimères (ou les fusions) CbpX tronquée-LytX tronquée. Dans un mode de réalisation, la protéine chimère CbpX tronquée-LytX tronquée comprend les régions de répétition de CbpX et la partie C-terminale (Cterm, c'est-à-dire dépourvue des domaines se liant à la choline) de la LytX (par exemple, LytCCterm ou Sp91Cterm) . Dans un autre mode de réalisation, CbpX est choisie dans le groupe constitué par CbpA, PbcA, SpsA et Pspc. Dans un autre mode de
BE2016/5782 réalisation, c'est CbpA. Dans un mode de réalisation, LytX est LytC (également appelée Sp91). Un autre mode de réalisation de la présente invention est une PspA ou des PsaA tronquées dépourvues du domaine se liant à la choline (C) et qui sont exprimées sous la forme d'une protéine de fusion avec LytX. Dans un mode de réalisation, LytX est LytC.
PsaA et ses variants à délétion transmembranaire ont été décrits par Berry & Paton, Infect Immun 1996 déc ; 64(12) : 5255-62. PspA et ses variants à délétion transmembranaire ont été décrits, par exemple, dans les
documents US 5 804 193, WO 92/14 488 et WO 99/53 940.
Spl28 et Spl30 sont décrites dans le document
WO 00/76 540. Spl25 est un exemple de protéine
pneumococcique de surface contenant le motif ancré dans la paroi cellulaire, LPXTG (c'est-à-dire, leucineproiine-X-thréonine-glycine, où X est n'importe quel acide aminé). Les protéines appartenant à cette classe de protéines pneumococciques de surface contenant ce motif se sont avérées utiles dans le contexte de la présente invention et sont donc considérées comme des protéines supplémentaires de l'invention. Spl25 est elle-même divulguée dans le document WO 98/18 930, et est également appelée ZmpB - une métalloprotéinase de zinc. SplOl est divulguée dans le document WO 98/06 734 (où elle a la référence #y85993). Elle est caractérisée par une séquence signal de type I. Spl33 est divulguée dans le document WO 98/06 734 (où elle a la référence #y85992). Elle est également caractérisée par une séquence signal de type I.
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Les protéines de l'invention peuvent également être avantageusement combinées. Par « combinées », on entend que la composition immunogène comprend toutes les protéines provenant des combinaisons suivantes, sous forme de protéines porteuses ou de protéines libres, ou un mélange des deux. Par exemple, dans une combinaison de deux protéines telle que décrite ci-dessous, les deux protéines peuvent être utilisées comme protéines porteuses, ou les deux protéines peuvent être présentes sous forme de protéines libres, ou les deux peuvent être présentes sous forme de protéine porteuse et de protéine libre, ou l'une peut être présente sous la forme d'une protéine porteuse et d'une protéine libre tandis que l'autre n'est présente que sous la forme d'une protéine porteuse ou que sous la forme d'une protéine libre, ou l'une peut être présente sous la forme d'une protéine porteuse et l'autre sous la forme d'une protéine libre. Quand une combinaison de trois protéines est donnée, les mêmes possibilités existent. Les combinaisons préférés comprennent, mais sans s'y limiter, PhtD + les régions de répétition de CbpX, PhtD + Ply, PhtD + Spl28, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + les régions de répétition de CbpX, PhtA + les régions de répétition de CbpX -protéines de fusion ou chimères de Sp91Cterm, PhtA + Ply, PhtA + Spl28, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, les régions de répétition de CbpX + LytC, les régions de répétition de CbpX + PspA, les régions de répétition de CbpX + PsaA, les régions de répétition de CbpX + Spl28, les régions de répétition de CbpX + LytC, les régions de répétition de CbpX + PspA, les régions de répétition de CbpX + PsaA, les régions de répétition de CbpX + Spl28, les régions
BE2016/5782 de répétition de CbpX + PhtD, les régions de répétition de CbpX + PhtA. Dans un mode de réalisation, les régions de répétition de CbpX proviennent de CbpA. Dans un autre mode de réalisation, c'est à partir de CbpA. D'autres combinaisons comprennent des combinaisons avec 3 protéines, comme PhtD + les régions de répétition de CbpX + Ply, et PhtA + les régions de répétition de CbpX + PhtD. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène comprend une pneumolysine détoxifiée et PhtD ou PhtE en tant que protéines porteuses. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène comprend une pneumolysine détoxifiée et PhtD ou PhtDE sous forme de protéines libres.
La teneur totale en antigènes protéiques dans le vaccin sera généralement située dans la plage allant de 1 à 100 pg, ou de 5 à 80 pg, par exemple dans la plage allant de 50 à 70 pg. Par exemple, dans un aspect, la composition immunogène de l'invention comprend 26 pg à 45 pg (par exemple, 26 pg à 40 pg, 28 pg à 35 pg ou environ 30 pg) de chaque protéine de S. pneumoniae, par dose pour les humains. Dans un autre aspect, la composition immunogène comprend 26 pg à 45 pg (par exemple, 26 pg à 40 pg, 28pg à 35 pg ou environ 30 pg) de PhtD, par dose pour les humains. Dans un autre aspect, la composition immunogène de l'invention comprend 26 pg à 45 pg (par exemple, 26 pg à 40 pg, 28pg à 35 pg ou environ 30 pg) de pneumolysine (par exemple dPly), par dose pour les humains.
Par le terme « dose pour les humains », on entend une dose qui est dans un volume approprié pour une utilisation chez les humains. Généralement, celle-ci est
BE2016/5782 située entre 0,25 et 1,5 ml. Dans un mode de réalisation, une dose pour les humains est de 0,5 ml. Dans un autre mode de réalisation, une dose pour les humains est supérieure à 0,5 ml, par exemple de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 ml. Dans un autre mode de réalisation, une dose pour les humains est située entre 1 ml et 1,5 ml. Dans un autre mode de réalisation, en particulier quand la
composition immunogène est destinée à la population
pédiatrique, une dose pour les humains peut être
inférieure à 0,5 ml, par exemple entre 0, 25 et 0,5 ml.
Adj uvants
Les compositions immunogènes de la présente
invention peuvent être adjuvantées, en particulier quand elles sont destinées à être utilisées chez les personnes âgées, mais également chez les nourrissons. Par conséquent, un autre aspect est une composition immunogène de l'invention qui comprend en outre un adjuvant. Les adjuvants appropriés comprennent un sel d'aluminium, tel qu'un gel d'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium ou l'alun, mais un adjuvant approprié peut également être un sel de calcium, de magnésium, de fer ou de zinc, ou peut être une suspension insoluble de tyrosine acylée, ou des sucres acylés, des polysaccharides rendus anioniques ou cationiques, ou des polyphosphazènes. Dans un aspect de l'invention, l'adjuvant est un sel d'aluminium, par exemple le phosphate d'aluminium. Dans un autre aspect, l'adjuvant comprend (pour une dose de 0,5 ml), 100 à 750, 200 à 500, ou 300 à 400 pg d'Al (aluminium) sous forme de phosphate d'aluminium.
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Dans un mode de réalisation, l'adjuvant est un inducteur préférentiel d'une réponse de type Thl. Des taux élevés de cytokines de type Thl ont tendance à favoriser l'induction de réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigées contre un antigène donné, tandis que des taux élevés de cytokines de type Th2 ont tendance à favoriser l'induction de réponses immunitaires humorales dirigées contre l'antigène. Les systèmes d'adjuvants appropriés qui favorisent principalement une réponse Thl comprennent : le lipide A monophosphorylé ou un dérivé de celui-ci, en particulier, le lipide A monophosphorylé 3-dés-O-acylé (3D-MPL) (pour sa préparation, voir le document GB 2 220 211 A) ; et une combinaison du lipide A monophosphorylé, de manière appropriée le lipide A monophosphorylé 3-dés-O-acylé, avec soit un sel d'aluminium (par exemple, le phosphate d'aluminium ou l'hydroxyde d'aluminium), soit une émulsion huile-danseau. Dans de telles combinaisons, l'antigène et le 3DMPL sont contenus dans les mêmes structures particulaires, ce qui permet une délivrance plus efficace des signaux antigéniques et immunostimulants. Des études ont montré que le 3D-MPL est capable de renforcer davantage l'immunogénicité d'un antigène adsorbé sur de l'alun [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16 : 708-14 ; document EP 689 454-B1] .
La composition immunogène peut comprendre un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A (et facultativement un immunostimulant) adsorbé sur un sel métallique (comme un sel d'aluminium, par exemple le phosphate d'aluminium ou
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1'hydroxyde d'aluminium). Le terme « immunostimulant », tel qu'utilisé dans le présent document, fait référence à une substance qui stimule une réponse immunitaire, en particulier un adjuvant qui stimule le système immunitaire d'un animal hôte (par exemple, un humain) auquel elle est administrée, et qui augmente donc l'effet protecteur produit par un antigène administré à cet animal, par rapport à l'effet qui serait produit par l'administration de l'antigène seul. Pour les formulations de vaccin à base d'aluminium, l'antigène est généralement adsorbé sur un sel d'aluminium pendant une heure à température ambiante et sous agitation.
Adj uvant s_comprenant_des_immunostimulants supplémentaires
L'adjuvant de l'invention peut comprendre des immunostimulants, tels que des saponines (par exemple, le QS21) et/ou le 3D-MPL. Des exemples d'immunostimulants sont décrits dans le présent document et dans « Vaccine Design — The Subunit and Adjuvant Approach » 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M.F., and Newman, M.J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X. Dans un aspect de la présente invention, l'adjuvant comprend du QS21, le lipide A monophosphorylé (MPL), un phospho-lipide et un stérol, présenté sous la forme d'un liposome.
Le QS-21 est une fraction de saponine purifiée à partir d'extraits d'écorce de l'arbre d'Amérique du Sud Quillaja saponaria. Le QS21 comprend généralement deux isomères principaux qui partagent un triterpène, un trisaccharide ramifié et une chaîne acyle pseudodimère
BE2016/5782 glycosylée. Les deux formes isomères diffèrent en ce qui concerne la constitution du sucre terminal au sein du segment tétrasaccharidique linéaire, l'isomère principal (QS-21-Api) incorporant un résidu ß-D-apiose, et l'isomère mineur (QS-21-Xyl) se terminant par un substituant ß-D-xylose. (Cleland, J.L. et al. J. Pharm. Sei. 1996, 85, 22-28) . Le QS21 peut être préparé par purification CLHP à partir du Quil A™. Il a été décrit que le Quil A™ possède une activité d'adjuvant par Dalsgaard et al. en 1974 (« Saponin adjuvants », Archiv, für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p 243-254). Des procédés de production du QS21 sont décrits dans le document US 5 057 540 (où le QS21 est appelé QA21) et dans le document EP 0 362 278. Dans un mode de réalisation, les compositions immunogènes de l'invention contiennent du QS21 sous une forme sensiblement pure, c'est-à-dire que le QS21 comprend au moins 90 %, par exemple au moins 95 %, ou au moins 98 % de la composition immunogène (c'est-à-dire que la composition de QS21 contient au moins 90 %, par exemple au moins 95 %, ou au moins 98 % de QS21) . La dose de QS21 est capable de manière appropriée de renforcer de réponse immunitaire dirigée contre un antigène chez un humain. En particulier, une quantité appropriée de QS21 est une quantité qui améliore le potentiel immunologique de la composition par rapport à une composition non adjuvantée, ou par rapport à la composition adjuvantée avec une autre quantité de QS21, bien qu'étant acceptable à partir d'un profil de réactogénicité. Le QS21 peut être utilisé, par exemple, en une quantité de 1 à 100 pg
BE2016/5782 par dose de composition, par exemple en une quantité de à 50 pg par dose de composition.
Le lipide A monophosphorylé (MPL) est un dérivé non toxique du lipopolysaccharide (LPS) de bactéries à Gram négatif, par exemple Salmonella minnesota R595. Il conserve les propriétés adjuvantes du LPS tout en étant moins toxique (Johnson et al. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Suppl : S512-S516) . Le MPL est composé d'une série d'espèces de lipide A 4-monophosphorylé chez qui l'étendue et la position des substitutions d'acide gras varient. Il peut être préparé par le traitement du LPS avec un acide faible et une hydrolyse basique, puis par purification du LPS modifié. Par exemple, le LPS peut être mis à reflux dans une solution d'acide minéral de force modérée (par exemple, de l'HCl 0,1 M) pendant une période d'environ 30 minutes. Ce procédé entraîne la déphosphorylation de la position 1, et la décarbohydratation de la position 6'. Le terme « lipide A monophosphorylé (MLP) », tel qu'utilisé dans le présent document, comprend les dérivés du lipide A monophosphorylé. Les dérivés du lipide A monophosphorylé comprennent le 3D-MPL et les dérivés synthétiques.
Le 3D-MPL est le lipide A monophosphorylé 3-0désacylé (lipide A monophosphorylé 3-dés-O-acylé). Sur le plan chimique, c'est un mélange de lipide A monophosphorylé 3-désacylé contenant 4, 5 ou 6 chaînes acylées. Le 3D-MPL est disponible sous le nom commercial de MPL® chez GlaxoSmithKline Biologicals North America. Lipide A monophosphorylé 3-O-désacylé (3D-MPL). Il présente une toxicité davantage réduite, tout en conservant des propriétés adjuvantes, et peut
BE2016/5782 généralement être préparé par hydrolyse alcaline douce, voir par exemple document US 4 912 094. L'hydrolyse alcaline est généralement réalisée dans un solvant organique, comme un mélange de chloroforme/méthanol, par saturation avec une solution aqueuse de base faible, comme le carbonate de sodium 0,5 M à pH 10,5. Pour de plus amples informations sur la préparation du 3D-MPL, voir les documents GB 2 220 211 A et WO 02 078 637 (Corixa Corporation). Dans un aspect de la présente invention, une petite particule 3D-MPL peut être utilisée. Une petite particule de 3D-MPL a une taille de particule telle qu'elle peut être stérilisée par filtration à travers un filtre de 0,22 pm. De telles préparations sont décrites dans la demande de brevet international No. WO 94/21 292. Dans un mode de réalisation, les compositions immunogènes de l'invention comprennent le lipide A monophosphorylé 3-O-désacylé (3D-MPL).
La dose d'un lipide A monophosphorylé (MPL) , par exemple le 3D-MPL, est de manière appropriée capable de renforcer une réponse immunitaire dirigée contre un antigène chez un humain. En particulier, une quantité appropriée de lipide A monophosphorylé (MLP), par exemple de 3D-MPL, est une quantité qui améliore le potentiel immunologique de la composition par rapport à la composition non adjuvantée, ou par rapport à la composition adjuvantée avec une autre quantité de MPL, tout en étant acceptable à partir d'un profil de réactogénicité. Un lipide A monophosphorylé (MPL), par exemple le 3D-MPL, peut être utilisé, par exemple, en une quantité de 1 à 100 pg par dose de composition, par
BE2016/5782 exemple en une quantité de 10 à 50 pg par dose de composition.
Des liposomes peuvent être préparés à partir de phospholipides (tels que la dioléoyl phosphatidyl choline, DOPC) et d'un stérol, par exemple le cholestérol, en utilisant des techniques connues dans l'art. Ces supports liposomiques peuvent porter le QS21 et/ou un lipide A monophosphorylé (MPL), par exemple le 3D-MPL. Les compositions appropriées de l'invention sont celles dans lesquelles des liposomes sont initialement préparés sans MPL (comme décrit dans le document WO 96/33 739), et le MPL est ensuite ajouté, de manière appropriée sous forme de petites particules de moins de 100 nm ou de particules susceptibles d'être stérilisées par filtration à travers une membrane de 0,22 pm. Le MPL n'est donc pas contenu au sein de la membrane des vésicules (connu sous le nom de MPL out) . Les compositions dans lesquelles le MPL est contenu au sein de la membrane des vésicules (connu sous le nom de MPL in) forment également un aspect de l'invention. Les protéines de S. pneumoniae non conjuguées peuvent être contenues au sein de la membrane des vésicules ou contenues hors de la membrane des vésicules. De manière appropriée, les antigènes solubles se trouvent à l'extérieur et les antigènes hydrophobes ou lipidés sont à l'intérieur ou à l'extérieur de la membrane. L'encapsulation dans les liposomes est décrite dans le document US 4 235 877.
Les liposomes de la présente invention peuvent comprendre un phospholipide, par exemple une phosphatidylcholine, qui peut être non cristallin à
BE2016/5782 température ambiante, par exemple la phosphatidylcholine de jaune d'œuf, la dioléoyl phosphatidylcholine ou la dilauryl phosphatidylcholine. De manière appropriée, le phospholipide est la dioléoylphosphatidylcholine (DOPC). Un autre aspect est une composition immunogène de l'invention comprenant 0,1 à 10 mg, 0,2 à 7, 0,3 à 5, 0,4 à 2, ou 0,5 à 1 mg (par exemple, 0,4 à 0,6, 0,9 à 1,1, 0,5 ou 1 mg) de phospholipide.
Les liposomes de la présente invention peuvent comprendre un stérol. Le stérol augmente la stabilité de la structure du liposome. De manière appropriée, les stérols comprennent le β-sitostérol, le stigmastérol, 1'ergostérol, 1'ergocalciférol et le cholestérol. Ces stérols sont décrits dans l'art, par exemple le cholestérol est décrit dans le Merck Index, llème Edn., page 341, en tant que stérol d'origine naturelle que l'on trouve dans les graisses animales. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le stérol est le cholestérol. Traditionnellement, le stérol peut être ajouté lors de la formulation de la préparation d'antigènes en utilisant du QS21 dilué dans le stérol, comme décrit dans le document WO 96/33 739. Dans un mode de réalisation, les compositions immunogènes de l'invention comprennent 0,025 à 2,5, 0,05 à 1,5, 0,075 à 0,75, 0,1 à 0,3, ou 0,125 à 0,25 mg (par exemple, 0,2 à 0,3, 0,1 à 0,15, 0,25 ou 0,125 mg) d'un stérol.
Dans un mode de réalisation, l'adjuvant comprend (pour une dose de 0,5 ml) 0,1 à 10 mg, 0,2 à 7, 0,3 à 5, 0,4 à 2, ou 0,5 à 1 mg (par exemple, 0,4 à 0,6, 0,9 à
1,1, 0,5 ou 1 mg) d'un phospholipide (par exemple, la
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DOPC), 0,025 à 2,5, 0,05 à 1,5, 0,075 à 0,75, 0,1 à 0,3, ou 0,125 à 0,25 mg (par exemple, 0,2 à 0,3, 0,1 à 0,15, 0,25 ou 0,125 mg) d'un stérol (par exemple, le cholestérol), 5 à 60, 10 à 50, ou 20 à 30 pg (par exemple, à 15, 40 à 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 pg) d'un lipide A monophosphorylé (par exemple, le 3D-MPL), et 5 à 60, 10 à 50, ou 20 à 30 pg (par exemple, 5 à 15, 40 à 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 pg) d'une saponine (par exemple, le
QS21).
Les liposomes de l'invention seront de manière appropriée contenus dans un milieu liquide. Le milieu liquide comprend les liquides physiologiquement acceptables, tels que l'eau, les solutions aqueuses de sel et les solutions tampons, par exemple une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) etc. Par exemple, les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre de l'eau et du PBS.
Dans un aspect de l'invention, l'adjuvant est AS01B (voir, par exemple, le document WO 96/33 739) . Dans un autre aspect de l'invention, l'adjuvant est AS01E (voir, par exemple, le document WO 2007/068 907) .
Dans certains cas, il peut être avantageux que les compositions immunogènes et les vaccins de la présente invention contiennent en outre un agent de stabilisation, par exemple d'autres émulsifiants/ tensioactifs, comme l'acide caprylique (Merck index lOème Edition, entrée no. 1739), parmi lesquels la tricapryline est particulièrement préférée.
Adjuvants de type émulsion huile-dans-eau
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Il a été suggéré que les adjuvants de type émulsion huile-dans-eau étaient en tant que tels utiles comme compositions adjuvantes (document EP 0 399 843B). En outre, des combinaisons d'émulsions huile-dans-eau et d'autres agents actifs ont été décrits en tant qu'adjuvants pour les vaccins (documents WO 95/17 210 ; WO 98/56 414 ; WO 99/12 565 ; WO 99/11 241). D'autres adjuvants de type émulsion huileuse ont été décrits, tels que des émulsions eau-dans-huile (documents US 5 422 109 ; EP 0 480 982 B2) et des émulsions émulsion eau-dans-huile-dans-eau (documents US 5 424 067 ; EP 0 480 981 B) . Tous forment des systèmes d'émulsion huileuse préférés (en particulier quand ils contiennent des tocols) qui sont appropriés comme adjuvants pour une utilisation dans les compositions de la présente invention.
Une émulsion huileuse appropriée (par exemple, une émulsion huile-dans-eau) comprend une huile non toxique métabolisable, telle que le squalane, un tocophérol tel que 1'alpha-tocophérol, et facultativement un émulsifiant (ou un tensioactif) tel que le polysorbate 80 (Tween™ 80). Un stérol (par exemple, le cholestérol) peut être inclus. Dans un aspect de l'invention, il est proposé un vaccin ou une composition immunogène comprenant un polysaccharide capsulaire dimensionné de S. pneumoniae de sérotype 6A et une composition d'adjuvant comprenant une émulsion huile-dans-eau, dans laquelle l'émulsion huile-dans-eau comprend 0,5 à 11 mg d'une huile métabolisable (comme le squalène), 0,5 à 12 mg d'un tocol (comme 1'alpha-tocophérol) et 0,4 à
BE2016/5782 mg d'un agent émulsifiant (comme le monooléate de sorbitane polyoxyéthyléné), par dose pour les humains.
Pour qu'une composition huile-dans-eau quelconque soit appropriée pour une administration humaine, la phase huileuse du système d'émulsion doit comprendre une huile métabolisable. La signification du terme huile métabolisable est connue dans l'art. Métabolisable peut être défini comme « étant capable d'être transformé par le métabolisme » (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25ème édition (1974)). L'huile peut être n'importe quelle huile végétale, huile de poisson, huile animale ou huile synthétique, qui est non toxique pour le receveur et qui est capable d'être transformée par le métabolisme. Les noix, les semences et les graines sont des sources courantes d'huiles végétales. Les huiles synthétiques font également partie de la présente invention et peuvent comprendre les huiles disponibles dans le commerce, telles que NEOBEE®, et d'autres. Une huile métabolisable particulièrement appropriée est le squalène. Le squalène (2,6,10,15,19,23-hexaméthyl-2,6,10,14,18,22tétracosahexaène) est une huile insaturée que l'on trouve en grande quantité dans l'huile de foie de requins, et en moindre quantité dans l'huile d'olive, l'huile de germe de blé, l'huile de son de riz et les levures, et est une huile particulièrement préférée pour une utilisation dans la présente invention. Le squalène est une huile métabolisable, c'est-à-dire que c'est un intermédiaire dans la biosynthèse du cholestérol (Merck index, lOème Edition, entrée no. 8619). De manière appropriée, l'huile métabolisable est présente dans la
BE2016/5782 composition d'adjuvant en une quantité de 0,5 à 10 mg, par exemple de 1 à 10, 2 à 10, 3 à 9, 4 à 8, 5 à 7, ou à 6 mg (par exemple, de 2 à 3, 5 à 6, ou 9 à 10 mg).
L'émulsion huile-dans-eau comprend de manière appropriée un tocol. Les tocols sont connus dans l'art et sont décrits dans le document EP 0 382 271. De manière appropriée, le tocol est 1 ' alpha-tocophérol ou un dérivé de celui-ci, tel que le succinate d'alpha-tocophérol (également connu sous le nom de succinate de vitamine E) . Ledit tocol est présent de manière appropriée dans la composition d'adjuvant en une quantité de 0,5 à 11 mg, par exemple de 1 à 11, 2 à 10, 3 à 9, 4 à 8, 5 à 7, 5 à (par exemple, de 10 à 11, 5 à 6, 2,5 à 3,5 ou 1 à 3 mg). Dans un mode de réalisation spécifique, le tocol est présent en une quantité de 5,94 mg ou de 2,38 mg. Dans un autre mode de réalisation, ledit tocol est présent de manière appropriée dans la composition de
vaccin (ou immunogène) en une quantité de 0,5 à 11 mg,
par exemple de 1 à 11, 2 à 10, 3 à 9, 4 à 8, 5 à 7, 5 à
6 (par exemple, de 10 à 11, 5 à 6, 2, 5 à 3,5 ou 1 à
mg) .
L'émulsion huile-dans-eau peut comprendre en outre un agent émulsifiant. L'agent émulsifiant peut être de manière appropriée le monooléate de sorbitane polyoxyéthyléné. Dans un mode de réalisation particulier, l'agent émulsifiant peut être choisi dans le groupe comprenant : le polysorbate 80 (Tween™ 80). Ledit agent émulsifiant est présent de manière appropriée dans la composition d'adjuvant en une quantité de 0,1 à 5, 0,2 à 5, 0,3 à 4, 0,4 à 3 ou 2 à 3 mg (par exemple, de 0,4 à 1,2, 2 à 3 ou 4 à 5 mg) d'agent émulsifiant.
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Le procédé de production des émulsions huile-danseau est connu de l'homme du métier. Classiquement, le procédé comprend le mélange de la phase huileuse contenant le tocol avec un tensioactif, tel qu'une solution de PBS/Tween™80, puis une homogénéisation au moyen d'un homogénéisateur. Un procédé comprenant le passage du mélange deux fois à travers une aiguille de seringue pourrait être approprié pour homogénéiser un petit volume de liquide. De même, le procédé d'émulsification dans un microfluidiseur (machine M110S Microfluidics, maximum de 50 passages, pendant une période de 2 minutes à une pression d'entrée maximale de 6 bar (pression de sortie d'environ 850 bar) pourrait être adapté par l'homme du métier pour produire des volumes plus petits ou plus grands d'émulsion.
Dans une émulsion huile-dans-eau, l'huile et l'émulsifiant doivent être dans un support aqueux. Par exemple, le support aqueux peut être une solution physiologique tamponnée au phosphate.
Dans un mode de réalisation, les systèmes d'émulsion huile-dans-eau de la présente invention présentent une petite taille de gouttelette d'huile dans la plage sous-micronique. De manière appropriée, les tailles des gouttelettes seront dans la plage allant de 120 à 750 nm, ou de 120 à 600 nm de diamètre. Dans un mode de réalisation, l'émulsion huile-dans-eau contient des gouttelettes d'huile parmi lesquelles au moins 70 % par intensité ont un diamètre inférieur à 500 nm, ou au moins 80 % par intensité ont un diamètre inférieur à 300 nm, ou au moins 90 % par intensité ont un diamètre situé dans la plage allant de 120 à 200 nm.
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La taille des gouttelettes d'huile, c'est-à-dire le diamètre, selon la présente invention est donnée par intensité. Il existe plusieurs manières de déterminer le diamètre de la taille des gouttelettes d'huile par intensité. L'intensité est mesurée au moyen d'un instrument de dimensionnement, de manière appropriée par diffusion dynamique de la lumière, comme le Malvern Zetasizer 4000, ou de manière appropriée le Malvern Zetasizer 3000HS. Une première possibilité consiste à déterminer le diamètre moyen z (ZAD) par diffusion dynamique de la lumière (PCS, spectroscopie de corrélation photonique) ; ce procédé donne en plus l'indice de polydispersité (PDI), et le ZAD et le PDI sont calculés tous les deux avec l'algorithme des cumulants. Ces valeurs ne nécessitent pas de connaître l'indice de réfraction des particules. Un second moyen consiste à calculer le diamètre de la gouttelette d'huile en déterminant la répartition granulométrique totale grâce à un autre algorithme, soit le Contin, ou moindres carrés non négatifs (NNLS), soit l'algorithme « Malvern » automatique (l'algorithme par défaut fourni par l'instrument de dimensionnement). La plupart du temps, comme l'indice de réfraction des particules d'une composition complexe est inconnu, seule la répartition des intensités est prise en compte, et si nécessaire les moyens d'intensité provenant de cette répartition.
Les dérivés ou mutations de lipopolysaccharide (LPS) ou de lipooligosaccharide (LOS) ou les dérivés de lipide A décrits dans le présent document sont conçus pour être moins toxiques (par exemple, le 3D-MPL) que lipopolysaccharides natifs.
les
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Dans un mode de réalisation, l'adjuvant utilisé pour la composition de l'invention comprend une émulsion huile-dans-eau préparée à partir d'une huile métabolisable (comme le squalène), un émulsifiant (tel que le Tween™ 80) et facultativement un tocol (tel que 1'alpha-tocophérol). Dans un mode de réalisation, l'adjuvant comprend (pour une dose de 0,5 ml) 0,5 à 15,
I à 13, 2 à 11, 4 à 8, ou 5 à 6 mg (par exemple, 2 à 3, 5 à 6, ou 10 à 11 mg), une huile métabolisable (comme le squalène), 0,1 à 10, 0,3 à 8, 0,6 à 6, 0,9 à 5, 1 à 4, ou 2 à 3 mg (par exemple, 0,9 à 1,1, 2 à 3 ou 4 à 5 mg), un émulsifiant (comme le Tween™ 80) et facultativement 0,5 à 20, 1 à 15, 2 à 12, 4 à 10, 5 à 7 mg (par exemple,
II à 13, 5 à 6, ou 2 à 3 mg) d'un tocol (comme 1'alphatocophérol) .
L'adjuvant peut comprendre en outre facultativement 5 à 60, 10 à 50, ou 20 à 30 pg (par exemple, 5 à 15, 40 à 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 pg) d'un dérivé de lipide A (par exemple, le 3D-MPL).
L'adjuvant peut contenir facultativement 0,025 à
2, 5, 0,05 à 1,5, 0,075 à 0,75, 0,1 à 0,3, ou 0,125 à
0, 25 mg (par exemple, 0,2 à 0,3, 0,1 à 0,15, 0,25 ou
0, 125 mg) d'un stérol (par exemple, le cholestérol), 5
à 60, 10 à 50, ou 20 à 30 pg (par exemple, 5 à 15, 40 à
50 , 10, 20, 30, 40 ou 50 pg) d'un dérivé de lipide A
(par exemple, le 3D-MPL) , et 5 à 60, 10 à 50, ou 2 0 à
pg (par exemple, 5 à 15, 40 à 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 pg) d'une saponine (par exemple, le QS21).
Dans un mode de réalisation, l'adjuvant utilisé pour la composition de l'invention comprend du phosphate d'aluminium et un dérivé de lipide A (comme le 3D-MPL).
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Cet adjuvant peut comprendre (pour une dose de 0,5 ml) 100 à 750, 200 à 500, ou 300 à 400 pg d'Al sous forme de phosphate d'aluminium, et 5 à 60, 10 à 50, ou 20 à 30 pg (par exemple, 5 à 15, 40 à 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 pg) d'un dérivé de lipide A (par exemple, le 3D-MPL).
Procédé d'administration
Les préparations vaccinales contenant les compositions immunogéniques de la présente invention peuvent être utilisées pour protéger ou traiter un mammifère sensible à une infection, en administrant ledit vaccin par voie systémique ou muqueuse. Ces administrations peuvent inclure une injection par voie intramusculaire (IM), intrapéritonéale (IP), intradermique (ID) ou sous-cutanée (SC) ; ou par administration par les muqueuses dans les tractus buccal/alimentaire, respiratoire, génito-urinaire. Bien que le vaccin de l'invention puisse être administré en monodose, ses composants peuvent également être coadministrés ensemble, en même temps ou à des moments différents (par exemple, les conjugués de saccharide pneumococcique peuvent être administrés séparément, en même temps ou 1 à 2 semaines après l'administration d'un quelconque composant protéique bactérien du vaccin pour une coordination optimale des réponses immunitaires les unes par rapport aux autres). Pour une co-administration, l'adjuvant Thl facultatif peut être présent dans l'une quelconque ou toutes les différentes administrations. En plus d'une seule voie d'administration, 2 voies d'administration différentes peuvent être utilisées. Par exemple, les conjugués de polysaccharide peuvent être
BE2016/5782 administrés IM (ou ID) et les protéines bactériennes peuvent être administrées IN (ou ID) . De plus, les vaccins de l'invention peuvent être administrés IM pour les doses de primovaccination et IN pour les doses de rappel.
Après une vaccination initiale, les sujets peuvent recevoir une ou plusieurs immunisations de rappel espacées de manière appropriée.
Vaccin
La présente invention propose en outre un vaccin contenant les compositions immunogènes de l'invention et un excipient ou support pharmaceutiquement acceptable.
Les excipients et supports pharmaceutiquement acceptables sont bien connus et peuvent être choisis par l'homme du métier. Par exemple, l'excipient ou le support pharmaceutiquement acceptable peut comprendre un tampon, comme le Tris (triméthamine), un phosphate (par exemple, le phosphate de sodium), un acétate, un borate (par exemple, le borate de sodium), un citrate, la glycine, 1'histidine et un succinate (par exemple, le succinate de sodium), de manière appropriée le chlorure de sodium, 1'histidine, le phosphate de sodium ou le succinate de sodium. L'excipient pharmaceutiquement acceptable peut comprendre un sel, par exemple le chlorure de sodium, le chlorure de potassium ou le chlorure de magnésium. Facultativement, l'excipient pharmaceutiquement acceptable contient au moins un composant qui stabilise la solubilité et/ou la stabilité. Des exemples d'agents de solubilisation/ stabilisation comprennent les détergents, par exemple la laurel sarcosine et/ou un
BE2016/5782 tween (par exemple, le Tween 80). Des exemples d'agents de stabilisation comprennent également les poloxamères (par exemple, le poloxamère 124, le poloxamère 188, le poloxamère 237, le poloxamère 338 et le poloxamère 407). L'excipient pharmaceutiquement acceptable peut comprendre un tensioactif non ionique, par exemple les esters de sorbitane d'acide gras polyoxyéthylénés, le polysorbate-80 (Tween 80), le polysorbate-60 (Tween 60), le polysorbate-40 (Tween 40) et le polysorbate-20 (Tween 20), ou les alkyléthers polyoxyéthylénés (de manière appropriée le polysorbate-80) . D'autres agents de solubilisation/stabilisation comprennent l'arginine, les polyols vitrifiants (comme le saccharose, le tréhalose et équivalents). L'excipient pharmaceutique peut être un conservateur, par exemple le phénol, le 2-phénoxyéthanol, or le thiomersal. D'autres excipients pharmaceutiquement acceptables comprennent des sucres (par exemple, le lactose, le saccharose), et des protéines (par exemple, la gélatine et l'albumine). Les supports pharmaceutiquement acceptables comprennent l'eau, les solutions salées, le dextrose aqueux et les solutions de glycérol. De nombreux excipients et supports pharmaceutiquement acceptables sont connus dans l'art et sont décrits, par exemple, dans Remington's Pharmaceutical Sciences, par E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 5ème Edition (975) .
Selon un autre aspect de l'invention, il est proposé un procédé de préparation de la composition immunogène ou du vaccin de l'invention, comprenant l'étape de mélange du polysaccharide capsulaire de S. pneumoniae
BE2016/5782 (conjugués) de l'invention, facultativement avec un excipient ou support pharmaceutiquement acceptable.
Des préparations vaccinales sont décrites d'une manière générale dans Vaccine Design (« The subunit et adjuvant approach » (éds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995)
Plenum Press New York). L'encapsulation au sein de liposomes est décrite par Fullerton, brevet US 4 235 877.
Les vaccins de la présente invention peuvent être stockés en solution ou lyophilisés. Dans un mode de réalisation, la solution est lyophilisée en présence d'un sucre, tel que le saccharose ou le lactose. De manière davantage préférée, elles sont lyophilisées et reconstituées extemporanément avant d'être utilisées. La lyophilisation peut donner une composition (vaccin) plus stable et peut éventuellement entraîner une augmentation des titres en anticorps en présence de 3D-MPL et en l'absence d'un adjuvant à base d'aluminium.
Dans un aspect de l'invention, il est proposé une trousse de vaccin, comprenant une fiole contenant une composition immunogène de l'invention, facultativement sous forme lyophilisée, et comprenant en outre une fiole contenant un adjuvant tel que décrit dans le présent document. Il est envisagé que dans cet aspect de l'invention, l'adjuvant soit utilisé pour reconstituer la composition immunogène lyophilisée.
Bien que les vaccins de la présente invention puissent être administrés par n'importe quelle voie, l'administration des vaccins décrits dans la peau (ID) forme un mode de réalisation de la présente invention. La peau humaine comprend une cuticule « cornée » externe, appelée la couche cornée, qui recouvre l'épiderme. Sous
BE2016/5782 cet épiderme se trouve une couche appelée le derme, qui à son tour recouvre le tissu sous-cutané. Les chercheurs ont montré que l'injection d'un vaccin dans la peau, et en particulier dans le derme, stimule une réponse immunitaire, ce qui peut également être associé à un certain nombre d'avantages supplémentaires. Une vaccination intradermique avec les vaccins décrits dans le présent document forme une caractéristique préférée de la présente invention.
La technique classique d'injection intradermique, la « procédure de Mantoux », comprend les étapes consistant à nettoyer la peau, et ensuite à l'étirer avec une main, et avec le biseau d'une aiguille de calibrer étroit (calibre de 25 à 31) orienté vers le haut, l'aiguille est insérée à un angle de 10 à 15°. Dès que le biseau de l'aiguille est inséré, le cylindre de l'aiguille est abaissé et davantage avancé, tout en exerçant une légère pression pour l'élever sous la peau. Le liquide est ensuite injecté très lentement pour ainsi former une cloque ou une bosse sur la surface de la peau, puis l'aiguille est retirée lentement.
Plus récemment, des dispositifs spécialement conçus pour administrer des agents liquides dans ou travers la peau ont été décrits, par exemple les dispositifs décrits dans les documents WO 99/34 850 et EP 1 092 444, également les dispositifs d'injection par jet décrits, par exemple, dans les documents WO 01/13 977 ;
US 5 480 381, US 5 599 302, US 5 334 144, US 5 993 412,
us 5 649 912, US 5 569 189, US 5 704 911, US 5 383 851,
us 5 893 397, US 5 466 220, US 5 339 163, US 5 312 335,
us 5 503 627, US 5 064 413, US 5 520 639, US 4 596 556,
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US 4 790 824, US 4 941 880, US 4 940 460, WO 97/37 705 et WO 97/13 537. D'autres procédés d'administration intradermique des préparations vaccinales peuvent comprendre les seringues et aiguilles classiques, ou des dispositifs conçus pour une administration balistique de vaccins solides (document WO 99/27 961), ou des timbres transdermiques (documents WO 97/48 440 ; WO 98/28 037) ; ou appliqués sur la surface de la peau (délivrance transdermique ou transcutanée, documents WO 98/20 734 ; WO 98/28 037).
Quand les vaccins de la présente invention doivent être administrés par la peau, ou plus précisément dans le derme, le vaccin est dans un faible volume de liquide, en particulier un volume entre environ 0,05 ml et 0,2 ml.
La teneur de la composition immunogène dans les vaccins cutanés ou intradermiques de la présente invention peut être similaire aux doses classiques que l'on trouve dans les vaccins intramusculaires (voir cidessus) . Cependant, une des caractéristiques des vaccins cutanés ou intradermiques est que les formulations peuvent être à « faible dose ». Par conséquent, les antigènes protéiques dans les vaccins à « faible dose » sont présents de manière appropriée en une petite quantité de 0,1 à 10 pg, ou de 0,1 à 5 pg par dose ; et les antigènes polysaccharidiques (conjugués de manière appropriée) peuvent être présents dans la plage allant de 0,01 à 1 pg, et de manière appropriée entre 0,01 et 0,5 pg de saccharide par dose.
Tel qu'utilisé dans le présent document, le terme « délivrance intradermique » signifie délivrance du vaccin ou de la composition immunogène dans la région du
BE2016/5782 derme de la peau. Cependant, le vaccin ou la composition immunogène ne sera pas nécessairement situé exclusivement dans le derme. Le derme est la couche de la peau située entre environ 1,0 et environ 2,0 mm par rapport à la surface de la peau humaine, mais il existe une certaine quantité de variation d'un individu à l'autre et d'une partie du corps à l'autre. En général, on peut s'attendre à atteindre le derme en allant 1,5 mm sous la surface de la peau. Le derme se trouve entre la couche cornée et l'épiderme à la surface et la couche sous-cutanée en-dessous. Selon le mode d'administration, le vaccin ou la composition immunogène peut rester finalement uniquement ou principalement dans le derme, ou il/elle peut finalement se diffuser dans l'épiderme et le derme.
La présente invention propose en outre un vaccin amélioré pour prévenir ou améliorer l'otite moyenne provoquée par Haemophilus influenzae par l'ajout de protéines d'Haemophilus influenzae, par exemple la protéine D sous forme conjuguée. Un ou plusieurs antigènes protéiques de Moraxella catarrhalis peuvent également être inclus dans le vaccin ou la composition immunogène de l'invention, sous une forme libre ou conjuguée. Par conséquent, la présente invention est un procédé amélioré permettant de déclencher une réponse immunitaire dirigée contre l'otite moyenne chez le nourrisson.
Des exemples d'antigènes protéiques préférés de Moraxella catarrhalis pouvant être inclus dans un vaccin combiné ou une composition immunogène de l'invention (en particulier pour la prévention de l'otite moyenne) sont :
BE2016/5782 la protéine 106 de membrane externe (OMP106) [WO 97/41 731 (Antex) & WO 96/34 960 (PMC) ] ; la protéine 21 de membrane externe (OMP21) ou ses fragments (WO 0 018 910) ; la protéine A se liant à la lactoferrine (LbpA) et/ou la protéine B se liant à la lactoferrine (LbpB) [WO 98/55 606 (PMC)] ; la protéine A se liant à la transferrine (TbpA) et/ou la protéine B se liant à la transferrine (TbpB) [WO 97/13 785 et WO 97/32 980 (PMC)] ; la protéine CopB de Moraxella catarrhalis [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61 : 20032010] ; la protéine Al ubiquitaire de surface (UspAl) et/ou la protéine A2 ubiquitaire de surface (UspA2) [WO 93/03 761 (University of Texas)] ; la protéine CD de membrane externe (OmpCD) ; HasR (PCT/EP 99/03 824) ; PilQ (PCT/EP 99/03 823) ; la protéine 85 de membrane externe (OMP85) (PCT/EP 00/01 468) ; lipo06 (GB 9 917 977.2) ; lipolO (GB 9 918 208.1) ; lipoll (GB 9 918 302.2) ; lipol8 (GB 9 918 038.2) ; la protéine P6 de membrane externe (P6) (PCT/EP 99/03 038) ; l'antigène D15 de surface (D15) (PCT/EP 99/03 822) ; la protéine Al de membrane externe (OmpAl) (PCT/EP 99/06 781) ; Hly3 (PCT/EP 99/03 257) ; et la protéine E de membrane externe (OmpE). Des exemples de protéines non typables de Haemophilus Influenzae ou des fragments de celles-ci pouvant être inclus dans un vaccin combiné (en particulier pour la prévention de l'otite moyenne) comprennent : la protéine fimbrine [(US 5 766 608 - Ohio State Research Foundation)] et les fusions comprenant des peptides en provenant [par exemple, les fusions du peptide LB1 (f) ; US 5 843 464 (OSU) ou WO 99/64 067] ; la protéine 26 de membrane
BE2016/5782 externe (OMP26) [WO 97/01 638 (Cortecs)] ; P6 [EP 281 673 (State University of New York)] ; TbpA et/ou TbpB ; l'adhésine de H. influenzae (Hia) ; les fibrilles de surface de Haemophilus (Hsf) ; la protéine Hin47 de Haemophilus influenzae ; la protéine Hif de Haemophilus influenzae ; la protéine Hmwl de Haemophilus influenzae ; la protéine Hmw2 de Haemophilus influenzae ; la protéine Hmw3 de Haemophilus influenzae ; la protéine Hmw4 de Haemophilus influenzae ; l'adhésine d'autotransporteur (Hap) de Haemophilus influenzae ; D15 (WO 94/12 641) ;
P2 ; et P5 (WO 94/26 304).
Procédé de traitement et d'utilisation
La présente invention propose un procédé de traitement ou de prévention d'une infection par Streptococcus pneumoniae chez un sujet en ayant besoin, comprenant l'administration audit sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition immunogène ou du vaccin de l'invention. La présente invention propose également un procédé d'immunisation d'un hôte humain contre une infection par Streptococcus pneumoniae, comprenant l'administration à l'hôte d'une dose immunoprotectrice de la composition immunogène ou du vaccin de l'invention. La présente invention propose également un procédé d'induction d'une réponse immunitaire dirigée contre Streptococcus pneumoniae (par exemple, Streptococcus pneumoniae sérotype 6A) chez un sujet, le procédé comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace de la composition immunogène ou du vaccin de l'invention.
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Dans un mode de réalisation, la présente invention est un procédé amélioré permettant de déclencher une réponse immunitaire chez les nourrissons (définis comme ayant 0 à 2 ans dans le contexte de la présente invention) par l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition immunogène ou d'un vaccin de l'invention. Dans un mode de réalisation, la réponse immunitaire est protectrice (c'est-à-dire qu'elle peut prévenir ou réduire une infection provoquée par S. pneumoniae) . Dans un mode de réalisation, le vaccin est un vaccin pédiatrique
Dans un mode de réalisation, la présente invention est un procédé amélioré permettant de déclencher une réponse immunitaire (protectrice) chez les personnes âgées (dans le contexte de la présente invention, un patient est considéré âgé s'il a 50 ans ou plus, généralement plus de 55 ans, et plus généralement plus de 60 ans) par l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace de la composition immunogène ou du vaccin de l'invention.
Dans un mode de réalisation, la présente invention propose un procédé de protection d'un sujet contre une maladie provoquée par une infection par Streptococcus pneumoniae, ou un procédé de prévention d'une infection par Streptococcus pneumoniae, ou un procédé de réduction de la gravité ou de retardement du début d'au moins un symptôme associé à une infection provoquée par Streptococcus pneumoniae, les procédés comprenant l'administration à un sujet d'une quantité immunogène d'une composition immunogène ou d'un vaccin de 1'invention.
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Dans un mode de réalisation, la présente invention propose des compositions immunogènes et des vaccins de l'invention pour une utilisation dans la prévention ou le traitement d'une maladie provoquée par une infection par S. pneumoniae. Dans un mode de réalisation, la présente invention propose l'utilisation d'une composition immunogène ou d'un vaccin de l'invention dans la fabrication d'un médicament pour la prévention (ou le traitement) d'une maladie provoquée par une infection par S. pneumoniae.
La maladie provoquée par une infection par S. pneumoniae peut être choisie parmi la pneumonie, une maladie pneumococcique invasive (IPD), les exacerbations d'une bronchopneumopathie obstructive chronique (BPOC), l'otite moyenne, la méningite, la bactériémie, la pneumonie et/ou la conjonctivite. Quand l'hôte humain la maladie peut être choisie parmi la méningite, la bactériémie, la pneumonie et/ou la conjonctivite. Quand l'hôte humain est une personne âgée, la maladie peut être choisie parmi la pneumonie, une maladie pneumococcique invasive (IPD) et/ou les exacerbations d'une bronchopneumopathie obstructive chronique (BPOC).
Les modes de réalisation concernant ici « les compositions vaccinales » de l'invention sont également applicables aux modes de réalisation concernant les « compositions immunogènes » de l'invention, et vice versa.
Des modes de réalisation de l'invention sont en outre décrits dans les paragraphes numérotés suivants.
est un nourrisson, l'otite moyenne,
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Paragraphe 1 : un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A, dans lequel la taille moyenne (Mw) du polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A est située entre 180 et 400, 210 et 400, 210 et 370, 220 et 360, 230 et 350, 240 et 340, 240 et 320, 240 et 310 ou 250 et 310 kDa.
Paragraphe 2 : un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon le paragraphe 1, qui a été dimensionné par une technique de dimensionnement mécanique.
Paragraphe 3 : un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon le paragraphe 1 ou le paragraphe 2, conjugué à une protéine porteuse (par exemple, CRM-197).
Paragraphe 4 : un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon le paragraphe 3, dans lequel le polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A est conjugué directement à la protéine porteuse.
Paragraphe 5 : un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon l'un quelconque des paragraphes 3 à 4, dans lequel le polysaccharide 6A est conjugué à la protéine porteuse ou à un lieur en utilisant la chimie au CDAP.
Paragraphe 6 : un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon l'un quelconque des paragraphes 3 à 5, dans lequel le polysaccharide capsulaire de sérotype 6A (PS6A) est conjugué à la protéine porteuse ou à un lieur en
BE2016/5782 utilisant la chimie au CDAP avec un rapport CDAP/PS6A situé entre 1/2 et 3/1, 1/1,5 et 2/1, ou de 1/1.
Paragraphe 7 : un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon l'un quelconque des paragraphes 3 à 6, dans lequel le polysaccharide capsulaire de sérotype 6A est conjugué à la protéine porteuse ou au lieur en utilisant la chimie au CDAP, dans laquelle la réaction a été réalisée avec un temps de couplage situé entre 50 et 130 minutes, 60 et 130 minutes ou 110 et 130 minutes.
Paragraphe 8 : un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon l'un quelconque des paragraphes 3 à 7, dans lequel le rapport protéine porteuse sur polysaccharide capsulaire de sérotype 6A est situé entre 5/1 et 1/5, 4/1 et 1/1 ou 2/1 et 1/1, 1,5/1 et 1/1, 1,4/1 et 1,3/1 (par exemple, 1,2/1, 1,5/1) (en poids/poids).
Paragraphe 9 : un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon les paragraphes 1 à 8, dans lequel le polysaccharide capsulaire 6A est dimensionné d'un facteur d'au plus x5.
Paragraphe 10 : un procédé de préparation d'un conjugué de polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A comprenant la conjugaison d'un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A à une protéine porteuse ou à un lieur en utilisant la chimie au CDAP avec un rapport CDAP/PS situé entre 1/2 et 3/1, 1/1,5 et 2/1, ou de 1/1.
Paragraphe 11 : un procédé selon le paragraphe 10, dans lequel la réaction a été réalisée avec un temps de
BE2016/5782 couplage situé entre 50 et 130 minutes, 60 et 130 minutes ou 110 et 130 minutes.
Paragraphe 12 : un procédé de préparation d'un conjugué de polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A comprenant (a) la conjugaison d'un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A à une protéine porteuse et (b) une diafiltration contre une solution présentant une concentration en NaCl inférieure à 150 mM
Paragraphe 13 : une composition immunogène comprenant un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon les paragraphes 1 à 9 ou un polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A obtenu par un procédé selon l'un quelconque des paragraphes 10 à 12 conjugué à une protéine porteuse.
Paragraphe 14 : une composition immunogène selon le paragraphe 13, comprenant 10 ou plus de 10, 11 ou plus de 11, 12 ou plus de 12, 13 ou plus de 13, 14 ou plus de 14, 15 ou plus de 15, ou 16 ou plus de 16 conjugués de polysaccharide capsulaire provenant de différents sérotypes de S. pneumoniae.
Paragraphe 15 : une composition immunogène selon le paragraphe 13 ou le paragraphe 14, comprenant 1 ou plus de 1 conjugué de polysaccharide capsulaire natif provenant de S. pneumoniae.
Paragraphe 16 : une composition immunogène selon le paragraphe 15, comprenant un polysaccharide capsulaire natif de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6B.
Paragraphe 17 : une composition immunogène selon le paragraphe 15 ou 16, comprenant un polysaccharide
BE2016/5782 capsulaire natif de Streptococcus pneumoniae de sérotype
23F.
Paragraphe 18 : une composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 17, qui comprend un polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6B présentant une taille moyenne (Mw) située entre 500 et 1800, 900 et 1660 ou 1000 et 1400 kDa.
Paragraphe 19 : une composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 18, qui comprend un polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 23F présentant une taille moyenne (Mw) située entre 500 et 1500, 600 et 1500, 700 et 1300, 900 et 1250, 800 et 1100 ou 900 et 1000 kDa.
Paragraphe 20 : une composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 19, qui comprend un polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae : (a) de sérotype 1 présentant une taille moyenne (Mw) située entre 100 et 1000, 200 et 800, 250 et 600, ou 300 et 400 kDa ; (b) de sérotype 4 présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 500, 60 et 300, 70 et 150, ou 75 et 125 kDa ; (c) de sérotype 5 présentant une taille moyenne (Mw) située entre 100 et 1000, 100 et 700, 100 et 350, ou 150 et 300 kDa ; (d) de sérotype 7F présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 1000, 100 et 750, 150 et 500, ou 200 et 300 kDa ; (e) de sérotype 9V présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 1000, 100 et 750, 150 et 500, 200 et 400, ou 250 et 300 kDa ; (f) de sérotype 14 présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 1000, 100 et 750, 150 et 500, ou 200 et 250 kDa ; (g) de 18C présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 1000, 50 et 750, 50 et
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500, 50 et 190, 50 et 150 ou 80 et 110 kDa (h) de sérotype 19F présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 1000, 100 et 750, 100 et 500, 100 et 190 ou 120 et 180 kDa ; et/ou (i) de sérotype 19A présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 800 kDa, 110 et 700, 110 et 300, 120 et 200, 130 et 180, 140 et 160 ou 80 et 130 kDa.
Paragraphe 21 : une composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 20, qui comprend en outre un sérotype 22F capsulaire de Streptococcus pneumoniae présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 800 kDa, 110 et 700 kDa, 110 et 300, 120 et 200, 130 et 180, 150 et 170, 100 et 190, 100 et 150, 95 et 125 ou 100 et 115 kDa.
Paragraphe 22 : une composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 21, comprenant 2, 3, 4, 5 ou 6 protéines porteuses différentes.
Paragraphe 23 : une composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 22, dans laquelle une ou plusieurs ou toutes les protéines porteuses sont choisies dans le groupe constitué par : l'anatoxine diphtérique (DT), CRM197, l'anatoxine tétanique (TT), le fragment C de TT, dPly, PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, PhtDE OmpC, PorB et la protéine D de Haemophilus influenzae.
Paragraphe 24 : une composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 23, dans laquelle le polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6B est conjugué à une protéine porteuse (par exemple, la protéine D) différente de la protéine porteuse à laquelle le polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A est conjugué.
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Paragraphe 25 : une composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 24, comprenant un saccharide de sérotype 1 conjugué à la protéine D, un saccharide de sérotype 4 conjugué à la protéine D, un saccharide de sérotype 5 conjugué à la protéine D, un saccharide de sérotype 6B conjugué à la protéine D, un saccharide de sérotype 7F conjugué à la protéine D, un saccharide de sérotype 9V conjugué à la protéine D, un saccharide de sérotype 14 conjugué à la protéine D et un saccharide de sérotype 23F conjugué à la protéine D.
Paragraphe 26 : une composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 25, comprenant le sérotype 19F conjugué à l'anatoxine diphtérique.
Paragraphe 27 : une composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 26, dans laquelle la composition comprend un saccharide capsulaire 18C conjugué à l'anatoxine tétanique (TT), facultativement dans laquelle 18C est le seul saccharide dans la composition conjugué à l'anatoxine tétanique (TT), facultativement par l'intermédiaire d'un lieur ADH.
Paragraphe 28 : une composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 27, comprenant en outre un ou plusieurs saccharides capsulaires de S. pneumoniae d'un ou de plusieurs sérotypes choisis parmi le sérotype 33F, le sérotype 15 et le sérotype 12F, conjugués à une ou plusieurs protéines porteuses.
Paragraphe 29 : une composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 28, dans laquelle la dose du conjugué de saccharides 6A est située entre 1 et 10 pg, 1 et 5 pg, ou 1 et 3 pg de saccharide (par exemple, 2 pg) .
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Paragraphe 30 : une composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 29, qui comprend en outre une ou plusieurs protéines de S. pneumoniae, conjuguées ou non conjuguées, choisies parmi : la famille des triades polyhistidine (PhtX), la famille des protéines se liant à la choline (CbpX), les CbpX tronquées, la famille des LytX, les LytX tronquées, les protéines chimères CbpX tronquée-LytX tronquée, la pneumolysine détoxifiée (Ply), PspA, PsaA, Spl28, SplOl, Spl30, Spl25 et Spl33.
Paragraphe 31 : une composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 30, qui comprend en outre un adjuvant.
Paragraphe 32 : une composition immunogène selon le paragraphe 31, dans laquelle l'adjuvant comprend (pour une dose de 0,5 ml) 100 à 750, 200 à 500 ou 300 à 400 pg d'Al (aluminium) sous forme de phosphate d'aluminium.
Paragraphe 33 : un vaccin comprenant la composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 32 et un excipient ou support pharmaceutiquement acceptable
Paragraphe 34 : un procédé de préparation du vaccin selon le paragraphe 33, qui comprend l'étape de mélange de la composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 32 avec un excipient ou support pharmaceutiquement acceptable.
Paragraphe 35 : un procédé de traitement ou de prévention d'une infection par Streptococcus pneumoniae chez un sujet en ayant besoin, comprenant l'administration audit sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition immunogène
BE2016/5782 selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 32 ou du vaccin selon le paragraphe 33.
Paragraphe 36 : un procédé d'immunisation d'un hôte humain contre une infection par Streptococcus pneumoniae, comprenant l'administration à l'hôte d'une dose immunoprotectrice de la composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 32 ou du vaccin selon le paragraphe 34.
Paragraphe 37 : un procédé d'induction d'une réponse immunitaire dirigée contre Streptococcus pneumoniae sérotype 6A chez un sujet, le procédé comprenant l'administration d'une quantité efficace sur le plan thérapeutique ou prophylactique de la composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 32 ou du vaccin selon le paragraphe 33.
Paragraphe 38 : la composition immunogène selon l'un quelconque des paragraphes 13 à 32 ou le vaccin selon le paragraphe 33, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d'une maladie provoquée par une infection par Streptococcus pneumoniae.
Paragraphe 39 : une utilisation de la composition immunogène des paragraphes 12 à 32 ou du vaccin du paragraphe 33, dans la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'une maladie provoquée par une infection par Streptococcus pneumoniae.
Toutes les références et demandes de brevet citées dans la présente demande de brevet sont incorporées à la présente à titre de référence.
Afin de mieux comprendre la présente invention, les exemples suivants sont présentés. Ces exemples ont seulement un but illustratif, et ne doivent pas être
BE2016/5782 considérés comme une limite à la portée de l'invention d'une quelconque manière que ce soit.
Exemples
Exemple 1 - préparation d'un polypeptide dimensionné
Dimensionnement
Un appareil homogénéisateur EMULSIFLEX C-50 a été utilisé pour réduire le poids moléculaire et la viscosité du polysaccharide avant l'étape d'activation (microfluidisation). L'efficacité du dimensionnement dépend de la pression du circuit et du nombre total de cycle. La cellule d'homogénéisation de l'EMULSIFLEX C-50 a été remplacée par une cellule ayant une géométrie fixe (chambre d'interaction Microfluidics F20Y-75 pm pour E01 à E07 ; chambre d'interaction Microfluidics F30Y-125 pm pour E08). Le but du dimensionnement est de réduire le poids moléculaire et la viscosité du polysaccharide sans diminution critique de son antigénicité.
La réduction en cours de procédé a été suivie par viscosimétrie (rhéomètre Brookfield Programmable DV III) Quand la viscosité cible a été atteinte, le polysaccharide dimensionné a été caractérisé par HP-SECRI (chromatographie d'exclusion stérique à haute performance, indice de réfraction).
Les caractérisations en cours de procédé de Mw ont été réalisées par HP-SEC-RI (colonne TSK5000PWxl + colonne de garde). L'élution a été réalisée en utilisant 50 mM Na/K2PO4, 500 mM NaCl pH 7,6 à un débit de 0,6 ml/minute. La détection a été réalisée par un
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100 détecteur d'indice de réfraction. Cette caractérisation est basée sur la détermination d'un temps de rétention relatif (RRT) . Le RRT est calculée par rapport à des dextranes étalonnés ayant un poids moléculaire dans la plage linéaire de séparation d'une colonne TSK5000PWxl. Le RRT est défini par la formule suivante :
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RT (hmw dext) = temps de rétention d'un dextrane de poids moléculaire élevé (dextrane de 1730 Kda)
RT (lmw dext) = temps de rétention d'un dextrane de poids moléculaire bas (dextrane de 150 Kda).
Le polysaccharide natif de sérotype 6A a été dissous dans 15 mg/ml pendant 4 heures dans de la WFI (eau pour injection) à température ambiante. Après 4 heures de dilution, le pH de la solution a été ajustée à
6,5 +/- 0,5 avant son transfert dans une pièce froide pour poursuivre la dissolution pendant une nuit. Avant le dimensionnement, la solution du polysaccharide natif de sérotype 6A a été clarifiée sur un filtre de 5 pm.
Le polysaccharide de sérotype 6A a ensuite été dimensionné par un Emulsiflex doté d'une cellule d'homogénéisation Microfluidics F30Y-125 pm à une pression située entre 2900 et 3800. Le dimensionnement a été arrêté quand la viscosité du polysaccharide a atteint la valeur cible pour la viscosité (8,35 ou 12,4).
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Le nombre de cycles nécessaires dépendait de la cible.
Par exemple, 32,5 cycles ont été nécessaires pour
atteindre une viscosité de 12,4 cps en utilisant une
pression de 2900 psi. Pour cet échantillon, la
détermination en cours de procédé du temps de rétention
relatif par HP -SEC-RI a donné une valeur de 0,28.
Le polysaccharide 6A dimensionné a été filtré sur une membrane Millipak 20 (échelle de 5 g) (coupure à 0,22 pm) à un débit de 10 ml/minute.
La teneur en polysaccharide dans la solution de polysaccharide de sérotype 6A a été déterminée avec précision par un procédé colorimétrique (résorcinol) avant son utilisation dans une conjugaison. Le polysaccharide dimensionné a été caractérisé par HP-SECMALLS ou estimé au moyen d'une courbe d'étalonnage de dextranes et détermination de l'activité antigénique (tableau 1) .
Antigénicité
Les échantillons à tester et de références ont été mis en incubation dans des microplaques de titrage préalablement revêtues avec des anticorps monoclonaux dirigés contre le polysaccharide de sérotype 6A (PS6A) de S. pneumoniae. Des anticorps polyclonaux anti-PS6A de lapin ont ensuite été ajoutés. Les complexes antigène/anticorps ont été révélés en utilisant un antiIg de lapin de chèvre à peroxydase liée. Le développement de la couleur a ensuite été réalisé par le système orthophénylènediamine/PhCd réagissant avec peroxydase. La coloration a été mesurée par spectrophotométrie (absorbances à 490 et 620 nm) . La courbe du
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102 polysaccharide a été comparée à la courbe de référence (un lot de polysaccharide natif utilisé comme référence, tandis qu'un autre lot de polysaccharide natif a été utilisé comme témoin interne) afin de déterminer la concentration en polysaccharide.
Mesure du poids moléculaire et de la polydispersité par MALLS
Le poids moléculaire (Mw) a été déterminé par diffusion de lumière laser (SEC-MALLS). Dans un premier temps, les analyses ont été réalisées sur une TSK5000PWXL (+ colonne de garde) en utilisant une solution de NaCl 0,2 M + 0,02 % d'azoture comme tampon d'élution. Les analyses finales ont été réalisées sur une colonne TSKGMPWxl (+ colonne de garde) avec un chargement de 100 μΐ de polysaccharide (1 mg/ml) en utilisant 50 mM Na/KoPCy, 200 mM NaCl pH 7,0 comme tampon d'élution et un débit de 0,75 ml/minute.
La détection a été réalisée avec un spectrophotomètre laser et un réfractomètre interférométrique (Wyatt Otilab DSP équipé d'une cellule P100 et d'un filtre rouge à 498 nm).
Le poids moléculaire moyen en nombre (Mn) a également été obtenu par MALLS. La polydispersité du polysaccharide dimensionné a été obtenue sous la forme du rapport Mw/Mn.
Un dn/dc théorique de 0,14 a tout d'abord été utilisé. Quand il y a eu détermination, la valeur expérimentale de 0,151 a été utilisée.
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Exemple 2 : production de conjugués 6A avec différents supports
a) Polysaccharide natif de S. pneumoniae de sérotype 6A 5 par rapport à polysaccharide dimensionné de
S. pneumoniae de sérotype 6A
Les conditions d'activation et de couplage utilisées pour produire les différents conjugués 6A sont données dans le tableau 2.
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Le rapport protéine/PS6A final (en poids/poids) pour les conjugués résultants était :
PS6A-PD003 : 0,6/1 (PS6A natif, M» par MALLS de
1106 kDa)
PS6A-PhtDQ0i : 1,4/1 (PS6A natif, M® par MALLS de
1106 kDa)
PS6A-PhtD008 : 2,7/1 (PS6A dimensionné, lot E01)
PS6A-dPly010 : 1,65/1 (PS6A dimensionné, lot EOl)
b) Polysaccharide dimensionné conjugué à différents supports
Les conditions d'activation et de couplage utilisées pour produire les différents conjugués PS6A sont données dans le tableau 3.
Tableau 3 : Conditions spécifiques d'activation/couplage/désactivation de conjugués de PSGA-Protéine D/CRMl97/PhtD
Support. PD (lot PDLSGÖ1 et lot PDLS0G2) (conjugué PS6APD) :: CRM197 (lot CRM025) ( conj ugué PS 6A-CRM197)
Conc. en PS6?t (mg/ml) 10,0 10,0:
Dissolution de PS6A NaCI 2 M Na C i 2 M
Concentration en protéine porteuse (mg/ml) 10, 0 10,0
Rapport initial protéine porteuse/PS6A (en poids/poids) 1,5/1 1,5/1
Conc. en CDAP (mg/mg de PS) 1,5 1
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BE2016/5782
Temps de couplage j 120 minutes 12>U minutes
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Le rapport protéine/FS6A final (en poids/poids) pour les conjugués résultants était :
PS6A-PD/LS001 et PS6A-PD/LS002 : 1,6/1 (PS6A dimensionné, lot EÖ6)
PS6A-CRM197/025 : 1,3/1 (PS6A dimensionné, lot E03)
Conjugué PSSAas-PhtP (lot 6A~PhtDlO6) ·
Dans un second procédé de conjugaison, PS6A a été lié à la protéine porteuse PhtD par l'intermédiaire d'un lieux — dihydrazide de l'acide adipique (ADH) ; ce conjugué a été nommé PS6A&.B-PhtD.
Dérivâtisation de PS6A
L'activation et le couplage ont été réalisés à 25 °C sous agitation continue dans un bain d'eau à température régulée. Le PS6A microfluidisé a été dilué pour obtenir une concentration finale en polysaccharide de 10 mg/ml
ZL- v dans de l'eau pour injection (WFI) et la solution a été ajustée à un pH de 6,0 + 0,2 avec du .HCl 0,1 N. Une solution de CDAP (100 mg/ml fraîchement préparée, dans le mélange acétonitrile/WFI, 50/50) a été ajoutée pour atteindre le rapport CDAP/PS approprié (1/1, en poids/poids).
Le pH a été augmenté jusqu'au pH d'activation de
9,00 ± 0,05 par ajout de NaOH 0,2 M. Après 3 minutes, l'ADH a été ajouté pour atteindre le rapport ADH/PS approprié (8,9/1 en poids/poids) ; le pH a été ajusté au 3 0 pH de couplage de 9,0. Le pH de la solution a été ajusté
109
BE2016/5782 pendant 1 heure. Le dérivé PSaa a ensuite été dialysé contre du NaCl 0,2 M.
Couplage
De la PhtD à 7,5 mg/ml dans du NaCl 0,2 M a été ajoutée au dérivé PSôAah (PS6Ä avec le lieur ÄDH) afin d'atteindre un rapport PhtD/PSöÄAH de 3/1 (en poids/poids) . Le pH a été ajusté à 5,0 ± 0,05 avec du HCl. La solution d'EDAC (SOi mg/ml dans leTris-HCl 0,1 M pH 7,5) a été ajoutée manuellement en 10 minutes (20 pi/minute) pour atteindre 0,5 mg d/ EDAC/mg de PS6Aah. La solution résultante a été mise en incubation pendant 45 minutes à température ambiante et sous agitation, tout en ajustant le pH. La solution a été neutralisée par ajout de 1 ml de Tris-HCl 1 M pH 7,5 et laissée 30 minutes à température ambiante.
Avant l'élution sur Sephacryl S400HR, le conjugué a. été clarifié en utilisant un filtre 5 pm Minisart. Le conjugué résultant PS6A*H-PhtD106 présentait un rapport final PhtD/PSôA de 2,84 (en poids/poids).
Un temps de rétention relatif cible a été choisi (RRT 150-Π30 d'environ 0,50). Plusieurs conjugués (6APhtD004 (polysaccharide natif) et 6A~PhtD008 (polysaccharide dimensionné) (comme décrit ci-dessus) ont été produits avec un polysaccharide dimensionné et ont été comparé au conjugué produit avec le PS6A natif.
Exemple 3_: évaluaiion préclinique des réponses anti g
PS6A
Des groupes de 4 0 souris ont été immunisés IM au jour 0, 14- et 28 avec des formulations 14-valent (îiVj
110
BE2016/5782 contenant des conjugués PS6A (.à. 1/10 de la dose pour les humains) en utilisant de l'AlPCg comme adjuvant. Les titres ELISA en IgG ant.i-PS6A et les titres d'opsonophagocyte (OP) ont été mesurés dans les sérums individuels collectés au jour 42.
La formulation 14V contenait les conjugués suivants :
1-PD, 3-PD, 4-PD, 5-PD, 6B-PD, 7F-PD, 9V-PD, 14-PD, ISC-TTâh, 19A-dPly, 12F- DI, 2 2 F-PhtD, 23F-PD. Le sérotype
6A a été conjugué à PD, PhtD ou dPly servant de support.
Les résultats sont résumés sur la figure I, réponse anti-PS6A par ELISA.
Conclusions
Les titres ELISA en IgG antr-PSSA les plus élevés ont été obtenus avec ie conjugué PS6A--PD produit avec un polysaccharide natif (1106 kDa). L'évaluation a montré une tendance vers une plus faible immunogénicité pour les conjugués contenant un polysaccharide dimensionné.
En utilisant la PhtD comme support, un titre SLISA en IgG anti-PS plus faible a été observé avec le conjugué produit avec un polysaccharide dimensionné (14V (6ΆPhtD/008 en utilisant le lot E01) . Ensuite, comme décrit dans les exemples suivants, un changement de cible de dimensionnement a été étudié pour produire un PS6A, avec une robustesse du procédé et de l'immunogénicité des conjugués résultants. Les expériences suivantes ont été mises en œuvre pour évaluer un polysaccharide dimensionné possédant un poids moléculaire plus élevé que le PS6A du lot E01.
Ill
BE2016/5782
Exemple 4 : évaluation de conjugués PS6¾ dimensionnéCRM197
Pour chaque conjugué, les paramètres de la conjugaison sont présentés dans le tableau 4 (concentrations en PS6A et en support, rapport initial support/PS6A (en poids/poids), temps de couplage et rapport CDAP/PS6A (en poids/poids).
Préparation des solutions 10 ® Solution de CDAP
Juste avant l'activation, une solution de tétrafluoroborate de cyanodiaminopyridiniur« (CDAP) a été préparée à 100 mg/ml dans le mélange acétonitrile/eau pour injection (50/50 (en volume/volume)).
Activation
Le PS6A natif ou dimensionné a été dilué à une concentration définie et le pH de la solution a été ajusté à 6,0 ± 0,2. Au temps 0, la solution de CDAP a été ajoutée manuellement afin d'obtenir un rapport CDAP/PS5A (en poids/poids) défini.
Après 1,5 minute, le pH a été augmenté jusqu'à la
valeur de pH d'act iv; 3tion par ajeu t de EaOR.
A 4,5 minutes, la solution de protéine (à une
concentrâtio n et un tampon définis) a été ajoutée afin
d'obtenir un rapport protéine./ PS6A (en poids/poids) fixe.
Le pH de la solution a été ajusté à 1: 3 valeur du pH de
couplage p< sndant une durée défi nie (temps de
couplage - voir le tableau 4).
Au temps T = temps de couplage + 4 minutes 30, une solution de glycine 2 M pH 9,0 a été ajoutée pour .12
BE2016/5782 désactiver la réaction.
Après minutes de désactivation, le conjugué a été directement injecté sur une colonne de purification ou laissé pendant une nuit sous agitation continue à une température de +2 à +8 °C avant la purification.
Purification
Avant la purification, la solution de conjugué a été filtrée à travers une membrane de 5 pm ou 10 nm afin d'éliminer les agrégats et les particules. Le conjugué a ensuite été purifié sur une colonne de Sephacryl S400HR (hauteur du lit : 100 cm + /-- 10 cm) en utilisant du NaCl 150 irM comme éluant. Le conjugué a ensuite été stérilisé par filtration sur une membrane de PVDF (poly(difluorure de vinylidene)) de 0,22 pm. La masse stérilisée (masse conjuguée) a été stockée à +2-8 ’C jusqu'à la formulation.
Caractérisation
Le rapport protéine/polysaccharide final (en poids/poids) sur le conjugué stérilisé a été déterminé par le rapport des concentrations de Lowry/résorcinol. L'antigénicité et la teneur en PS libre (polysaccharide) ont été déterminées en utilisant les procédés décrits ci-dessous dans le présent document. Les données sont présentées dans le tableau 5.
Test d'antigénicité
Il a été: attribué au polysaccharide natif une valeur d'indice d'antigénicité de 100 % corrélation entre l'indice l'immunogénicité n'avait pas
Dans la mesure où la d'antigénicité et été établie, la
BE2016/5782 détermination de 1'antigénicité du polysaccharide dimensionné a été réalisée sous la forme d/une valeur indicative. L'objectif était de maintenir cette valeur aussi élevée, que possible. Cette valeur a été déterminée par ELISA.
L'antigénicité du polysaccharide a été déterminée dans une ELISA de type sandwich (voir l'exemple 1 pour la mesure de l'antigénicité}.
Teneur en PS libre par BLISA
Après la réaction du conjugué avec un sérum antisupport, le complexe a été précipité en utilisant du
fate d'ammonium saturé (SAS ) . Après cent rifugation
teneur en PS06A libre a θ Ϊ.Θ obtenue par E LISA (anti
anti-PS, voir .1 a partie ; 2.8 .1.2) sur le surnageant
pourcentage de PS libre a été calculé de manier
proportionnelle par rapport à la teneur totale en PS mesurée par le procédé au résorcinol.
L'absence de conjugué dans le surnageant a 20 également été contrôlée par une ELISA Cf-support/a~PSÛ6A.
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Le premier ensemble de conjugués (PS6A-CRM197/015, PS6A-CRM197/016) a été produit avec le polysaccharide natif (Mw par MALLS de 990 kDa) et présentait des limitations en termes de rapport CRM/PS final à atteindre et d/aptitude à la filtration des conjugués résultants (tableau 5).
Un deuxième ensemble de conjugués (PS6A-CRM197/017, PS6A-CRM1 97/019, PSOA-CRMl97/020,
PSOA-CRMl97/018, PS6A-CRM197/021 ) été un produit en utilisant polysaccharide dimensionné (lot E01). En augmentant le rapport CDAP/PS et/ou le rapport initial CRM/PS, le rapport CRM/PS final et le rendement en polysaccharide souhaités ont pu être atteints. Les meilleures conditions (PS6A-CRM197/021.) ont été reproduites avec les nouveaux lots de polysaccharide dimensionné, mais ils avaient un poids moléculaire plus élevé (lot E03) que le précédent. Cependant, un problème de filtration a été observé. Il a été découvert qu'en réduisant le temps de couplage ou le rapport CDAP/PS6A, il était possible de résoudre le problème de filtration.
Un troisième ensemble de conjugués (PS6A-CRM197/Q22, PS6A-CRM197/Q23, PS6A-CRM197/024) a été produit en utilisant un polysaccharide dimensionné de sérotype 6A (lot E03) . Les meilleures conditions {PS6A-CRM197/024) étaient les suivantes : concentration, en polysaccharide de 10 mg/ml dans du NaCl 2 M, un rapport CDAP/PS de 1/1 (en poids/poids) , une concentration en CRM de 10 mg/ral dans 10 mM de K/K2PO4 pH 7,2, 0,2 M de NaCl, un rapport initiai CRM/PS de 1,5/1 (en poids/poids), un pE pour l'activation et le couplage de 9,5 et un temps de couplage de 120 minutes. Les conjugués résultants
12Ö
BE2016/5782 présentaient un rapport CRM/PS final d'environ 1,2/1 (en poids/pords) pour un rendement global d'environ 65 %.
Exemple 5 ; production de conjugués 6Ά dimensionné5 CRM197 à une échelle de 200 mg
Une augmentation jusqu'à une échelle de PS de 200 mg a été réalisée (tableau 6 et tableau 7).
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Les données obtenues à partir d'une échelle de PS de 200 mg étaient conformes aux données obtenues à petite échelle. Les conjugués résultants présentaient un rapport CRM/PS final situé entre 1,25 et 1,32/1, pour un rendement global en polysaccharide de 56 %. En termes de stabilité, aucun problème n'est apparu dans les analyses HP-SEC ou en ce qui concerne la teneur en polysaccharide libre par ELISA (données non disponibles avec le procédé chimique).
Sur la base de ces résultats, d'autres lots (voir le tableau 5 ci-dessous) ont été produits dans les conditions suivantes : concentration en polysaccharide de 10 mg/ml dans du NaCI 2 M, un rapport CDÄP/PS de 1/1 (en poids/poids), une concentration en CRM de 10 mg/ml dans 10 mM de K/K2PO4 pH 7,2, 0,2 M de NaCI, un rapport initial CRM/PS de 1,5/1 (en poids/poids), un pH pour l'activation et le couplage de 9,5 et un temps de couplage de 120 minutes.
0 Exemple 6 : immunogénic;
conjugués de PS6A ehe2 les souris
Différents conjugués de PS6A dimensionné ont été évalués chez des souris Balb/c (sous la forme d'une formulation monovalente) : conjugués 6A-CRM197 (PS6A25 CRM025), 6A-PD (PS6A-PDLS001 (E06) ) , 6A--PD (PS6APDLS002(E06)), 6A-PhtD (PS6A-PhtDÛ08) et 6ASH~PhtD (PS6APhtDîO ê (E04 ) ) , PSLA-PhtD (PS6A-PhtDlOO(EQ 6) ) produits avec un PS dimensionné.
souris Balb/c ont été immunisées trois fois (jour
0-14-28) avec 0,3 pg de différents conjugués de PS6A adsorbés sur Ä1PO«. Les titres en IgG anti-PSSA par EL.ISÄ
6
BE2016/5782 et les titres d'opsonophaqoeytose (OP) ont. été mesurés dans des sérums individuels collectés au jour 42. Les résultats sont présentés sur les figures 2A et 2B. Une réponse en anticorps significativement plus élevée a été induite par PS6A-ÄH-PhtD (CDAP/EDAC) et PS6A-CRM 025 (CDAP) en EL I S A et OPA.
Exemple 7 : _ca r a et é r i s a tlon de PS6A dimensionné
Concentration en CRM197
Décongélation de CRM197
La masse purifiée est stockée à -20 °C à une concentration de 1,917 rag/ml dans 10 m.M de K/K2PO4 pH 7,2.
7,5 g de la masse purifiée ont été décongelés pendant une nuit à +27+8 °C.
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Concentration par UF
L'ultrafiltration a été réalisée à température 20 ambiante sur un dispositif centramate.
La membrane d'ultrafiltration était une membrane OMEGA medium screen de 0,09 m2 avec une coupure à 10 kDa (2 membranes). Le débit de circulation était de 1200 ml/minute et la pression transmembranaire appliquée l'expérience était située entre 7 et 10 psi. masse de CRM197 a été 7,5 fois plus concentrée atteindre une concentration d'environ 15 mg/ml (cible pour la conjugaison > 10 mg/ml).
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127
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Filtration sur 0,22 pm
Après l'ultrafiltration, la masse concentrée a été stérilisée par filtration sur un filtre Millipack 20 (PVDF) de 0,22 pm â 20 ml/minute. Elle a ensuite été stockée à -20 °C jusqu'à son utilisation dans le couplage.
Le PS6A dimensionné a été caractérisé par le test suivant : MALLS et teneur antigène par ELISA. La stabilité a été évaluée après deux mois à -70 °C (T = 0 comparé à T = 2 mois). Aucun problème de stabilité n'est observé quand le PS6A dimensionné est stocké à -70 °C. Les résultats de la caractérisâtion du PS6A dimensionné sont résumés dans le tableau 8.
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BE2016/5782
Deux conjugués (DQ6ADLA0Ö1, D0 6AD<1A002 ); ont été produits à une échelle de PS de 2 g en utilisant un lot de PS6A dimensionné et un lot comme support. Les conditions de la conjugaison sont décrites ci-après.
La réaction a été réalisée à 25 +/- 1 °C dans un bioréacteur de 1 1.
g de PS6A dimensionné ont été dilués à 10 mg/ml dans du NaCl 2 M et le pH de la solution a été ajusté à 6,0 + /- 0,2 avec une solution de HCl à 0,05 N.
A T = 0, 2 g de CDAP en solution (solution à 100 mg/ml dans le mélange CH 3 CN/Hz O 50/50) ont été ajoutés manuellement la solution (rapport CLAP/PS = 1,0/1 en poids/poids).
A T - ï minute 30, le pH a été augmenté jusqu'à
9,5 +/- 0,05 par ajout de NaOH 0,5 N. Il a fallu environ 90 secondes pour atteindre le pH cible.
A ? = 4 minutes 30, 3 g de CRM197 (solution à 10 mg/ml dans 10 mM de KH2PO4/K2HPO4 pH 7,2, 2 M de NaCl) ont été ajoutés à la solution de PS6A activé en une minute afin d'atteindre un rapport CRM197/PS6A de 1,5/1 en poids/poids. Le pH a été ajusté à 9,5 +/- 0,05 pendant 120 minutes.
A T — 124 minutes 3(1, 100 ml d'une solution de glycine 2 M pH 9,0 ont été ajoutés pour désactiver le conjugué (rapport Gly/PS = 7,5/1 en poids/poids). Après 30 minutes de désactivation, le pH du mélange a été ajusté à 6,5 +/- 0,2 en utilisant du HCl 5 N. Quand le pH s'est stabilisé, le conjugué a été laissé pendant une nuit sous agitation continue à +2/+8 °C avant clarification and purification.
130
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Purification
Avant 1'élution sur Sephacryl S400HR, le conjugué a été clarifié en utilisant un filtre 10 pm Kleenpack HSC i l à- 5 Q: mi /minut e.
Le conjugué ensuite été injecté sur une Sephacryl S400HR. 1/élution a été réalisée avec une solution de
NaCl à 0,15 M et le pool collecté était basé sur une .e coefficient de distribution Ve == volume d'élution,
Vo = volume mort, Vt - volume total de la colonne.
Les critères suivants ont été utilisés pour la collecte du pool : à partir d'une DOzsoum = 0,05 ÜA jusqu/à une valeur de Kd de 0,28.
valeur de Kd. Kd est (Kd: = (W - Vß) /(Vt - V)
Stérilisation par filtration
Avant la filtration, la masse a été ramenée à température ambiante.
Les lots ont été filtrés sur une membrane de
stérilisation Opticap 4 (1900 cm2, PVDF) à un débit de
0 40 ml/minute. Le filtre a été rincé avec un tampon au
NaCl 0,15 M avant la filtration. Après la filtration, 200 ml de NaCl 0,15 M ont été passés à travers le filtre pour limiter ia perte de matière. Aucun problème n'est apparu pendant la filtration.
Evaluation préelinique
Des groupes de 48 souris Balb/c femelles (âgées de 4 semaines) ont été immunisés IM aux jours 0, 14 et 28 avec des formulations de conjugué adsorbé (AIPCU) contenant 0,1 pg de D06ADJAÖÖ1, D06ADJA002, PS6ACRMLS001 (produit avec le PS6A dimensionné, lot E07),
131
BE2016/5782
PS6A-CRMLS002 (produit avec le PS6A dimensionné, lot E07) ou PS6A-PDLS0Q1 (comme référence).
Les tans d'IgG anti-PSOA (figure 3A) et les- titres d’opsono-phagocytose (figure 3B) ont été mesurés dans des sérums individuels collectés au jour 42. Aucune différence significative n'a été observée en ce qui concerne les réponses en anticorps induites par le PS6ACRM produit selon l'exemple 7, en comparaison avec le PS6A-CRM produit selon l'exemple 8 en E.LISÄ et en OPA.
Exemple 8 : préparation d'un conjugué SA
Un conjugué 6A dimensionné (lot E06AÄDJA059) a été produit à une échelle de PS de 15 g dans un réacteur de 15 1 en utilisant ies paramètres de conjugaison 6A dimensionnée produit à une échelle de PS de 200 mg (voir l'exemple 5). le conjugué a ensuite été purifié sur une colonne de Sephacryl S4QQHA (colonne BPG450 (GE Healthcare)) en utilisant du NaCl 150 mM comme éluant.
Le conjugué a ensuite : été stérilisé par filtration sur
une membrane en PDVF de 0,22 pm et stocké à 2-8 °C. , Le
conjugué a été coï scentré (5x) et soumis à une
diafiitration (10 vol .urnes de diafiitration) contre WFL
( e a u p o u r i n j e c t ί ο n ) en utilisant une membrane 10 kDa
MWCO OMEGA PES (T-series, PALI). Le rétentat a ensuite 25 été filtré sur une membrane de 0,22 pm.
BE2016/5782
SEQ ID NO 1: MsfLysLeyLys'i'hrLeuAbLeuSerLeuLeuAlaAiaGiyValLeuAlaGiy'
CysS&rSerHfsSerSerAsnMetAiaAsnrhrC3nMett.ysSertepLysi!s
1ieite^aHsArgGlyAjaSerGiyTy±euProGiuHfsThrLsüGli®erLysAla
LeuAlaPheAtaGInGfoAlaAspTyrLeuGksGinA&pLeuAiakfefThrLysAspGIy
ArgLeuVaf/aOteHt&ÄspHfePheLeuAspGiyleuTbrAspVaSAiaLysLysPhe·
PK^sAfgHisÄrgLysAspGlyA’gTyrTyrVafiä&ÄspPheThrLeuLysGtaite
GinSerL&uGâuMetThrGiuAsnPheGluIhii.ysAspGîyLÿsGînAlaGinVaiT'^'
ProAsnAfgPhePraLeuTrpLysSeFHisPheArgileHbThfPheGfuAspGiufle
GtuPheJ ieGinGiyLeuGi u LysSerïft f GiyLysL ysVs! Glyife T yrProGI ui ie
LÿsAtaProTfpPhsHtsHisGmAsnGiyLysAspOeAjaAJaQuThiteuLysVai
LesuLysLysTyrGiyTyrAspLysLysThrAspMetVarTyrLeuGInThrPheAspPhe
AsrtGiüLeuLysAftglteLysThrGiuLeuLeuProGInMetôîyMstAspLeisLysLeu
ValGinLeUiJeAlaTyrThrÄspTrpLysGluThrGhiGitiLysÄspProLysGiyTyf
T φ Va! AsnTyrAsnT yrAspT rpMeïPheLysPfoGi yAlaEfelAlaGWalVaiLys
T yrAiaAsp GiyVaiGlyProG IvTf pTyrMeiLeuValAsnLvsGîuGi uSeri_y sPro
AspAsniieVaïTyrThrProLeuVaÎLysGiuLauAlaGfnTyrAsnVaiGtifyatHjs
FroTyrThrVaWgLysAspAiaLeuProGiuPhePheThrAspVatAsnGfnMeiTyr
AspAialeüLeuAsnLysSerGïÿAiaThrGiyVaiPheÎhrÂspPhePYôAspThrGty
VaâGiuPheLeuLysGiyifeLys
SEQ fD NO. 2: MetAspProSerSerHfeSerSerAsnMelAiaAsnTis'GinMetLysSerAspLysiie liei!eAl3HisAfgG!yAlaSeFGiyTyrLeuPr&SiuHisThrLeitG!üSerLysAja
LeuAia PheAfaG i iiGia AiaÄspTyrteuGäuGlnÄspLeuAiaMetThrLysAspöly
ArgLeuVaN'aliieHtsAspHisPh&LeuAspGNLsuThrAspVaiAiaLysLysPhe
P?oHssAfgHisArgLysÄspGiyÄrgTyrTyrVa:heÄspPhsThrLeuLysGiul!e
GiRSarLeuGluMsîThrGksAsnPheGiuThrLysAspGiyLysGin^aGInVaiTyr
ProAsnArgPhePfoLeuTrpLysSerHsPheArgiteHisThrPbeGEuAspGlijiie
GiuPheiieGInGlyLsuGiuLysSsrThfGiyiLysLysVatGfyfeTyrProGIbHe
LysAiaProTspPheHtsHsGin AsnG iyly&Aspfi eAla AiaGfuT hrteulysVai
LeuLysLysT yrGiyTyrAspLysLysThrAspMetVaiTyrLeu GinThrPheAspPbe ^isnGfüLeilyLvXfgjieLysTSifGOLeüLeuPToGiäiMetGäyMstAspLeLsLysLöii
ValGInLeu ÎfeAiaTyrîhïAspTrptysGluThfGfnGiu Lys AspProLysGiyTyr
TrpValAsnTyrAsnTyrÄspTrpMeiPheLysProßfyAlaktetAiaGJuValVaiLys
TyrAiaAspGfyValGtyP roG iyïqjTyrMeîLeuVaf AsnLysG! uGiuSertysPro
AspAsnifeVan’yrThrProLeuVafLysGfuleuAlaGtnTyTAsnValGiLtVaiHrs
PfoTyrThrVaiArgLysAspAiaLei^roGluPhePheThrAspVatAsnGinMetTyr
ÂspAiaLeuLeuAsriLysSerGlyAîaThrGlyVaiPheTriFAspPLfeProAspThîGly
VaiGiuPheLeu LysGlyMetys
SEQ IDNO. 3: SerSerHisSeFSerAsnMefAiaAsoThr

Claims (34)

  1. REVENDICATIONS
    133
    BE2016/5782
    1. Polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A, dans lequel la taille moyenne (Mw) du polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A est située entre 210 et 400, 210 et 370, 220 et 360, 230 et 350, 240 et 340, 240 et 320, 240 et 310 ou 250 et 310 kDa.
  2. 2. Polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon la revendication 1, qui a été dimensionné par une technique de dimensionnement mécanique.
  3. 3. Polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon la revendication 1 ou la revendication 2, conjugué à une protéine porteuse (par exemple, CRM-197).
  4. 4. Polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon la revendication 3, dans lequel le polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A est conjugué directement à la protéine porteuse.
  5. 5. Polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon l'une quelconque des revendications 3 à 4, dans lequel le polysaccharide 6A est conjugué à la protéine porteuse ou à un lieur en utilisant la chimie au CDAP.
  6. 6. Polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, dans lequel le polysaccharide capsulaire de sérotype 6A (PS6A) est conjugué à la protéine porteuse ou à un lieur en
    134
    BE2016/5782 utilisant la chimie au CDAP avec un rapport CDAP/PS6A situé entre 1/2 et 3/1, 1/1,5 et 2/1, ou de 1/1.
  7. 7. Polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, dans lequel le polysaccharide capsulaire de sérotype 6A est conjugué à la protéine porteuse ou au lieur en utilisant la chimie au CDAP, dans laquelle la réaction est réalisée avec un temps de couplage situé entre 50 et 130 minutes, 60 et 130 minutes ou 110 et 130 minutes.
  8. 8. Polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, dans lequel le rapport protéine porteuse sur polysaccharide capsulaire de sérotype 6A est situé entre 5/1 et 1/5, 4/1 et 1/1 ou 2/1 et 1/1, 1,5/1 et 1/1, 1,4/1 et 1,3/1 (par exemple, 1,2/1, 1,5/1) (en poids/poids).
  9. 9. Polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel le polysaccharide capsulaire 6A est dimensionné d'un facteur d'au plus x5.
  10. 10. Procédé de préparation d'un conjugué de polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A comprenant la conjugaison d'un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A à une protéine porteuse ou à un lieur en utilisant la chimie au CDAP avec un rapport CDAP/PS situé entre 1/2 et 3/1, 1/1,5 et 2/1, ou de 1/1.
  11. 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel la réaction est réalisée avec un temps de couplage situé
    135
    BE2016/5782 entre 50 et 130 minutes, 60 et 130 minutes ou 110 et 130 minutes .
  12. 12. Procédé de préparation d'un conjugué de polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A comprenant (a) la conjugaison d'un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A à une protéine porteuse et (b) une diafiltration contre une solution présentant une concentration en NaCl inférieure à 150 mM.
  13. 13. Composition immunogène comprenant un polysaccharide capsulaire dimensionné de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou un polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à
    12 conjugué à une protéine porteuse.
  14. 14. Composition immunogène selon la revendication 13, comprenant 10 ou plus de 10, 11 ou plus de 11, 12 ou plus de 12, 13 ou plus de 13, 14 ou plus de 14, 15 ou plus de 15, ou 16 ou plus de 16 conjugués de polysaccharide capsulaire provenant de différents sérotypes de S. pneumoniae.
  15. 15. Composition immunogène selon la revendication
    13 ou la revendication 14, comprenant 1 ou plus de 1 conjugué de polysaccharide capsulaire natif provenant de S. pneumoniae.
  16. 16. Composition immunogène selon la revendication 15, comprenant un polysaccharide capsulaire natif de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6B.
  17. 17. Composition immunogène selon la revendication 15 ou la revendication 16, comprenant un polysaccharide
    136
    BE2016/5782 capsulaire natif de Streptococcus pneumoniae de sérotype
    23F.
  18. 18. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, qui comprend un polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6B présentant une taille moyenne (Mw) située entre 500 et 1800, 900 et 1660 ou 1000 et 1400 kDa.
  19. 19. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 18, qui comprend un polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 23F présentant une taille moyenne (Mw) située entre 500 et 1500, 600 et 1500, 700 et 1300, 900 et 1250, 800 et 1100 ou 900 et 1000 kDa.
  20. 20. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 19, qui comprend un polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae : (a) de sérotype 1 présentant une taille moyenne (Mw) située entre 100 et 1000, 200 et 800, 250 et 600, ou 300 et 400 kDa ; (b) de sérotype 4 présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 500, 60 et 300, 70 et 150, ou 75 et 125 kDa ; (c) de sérotype 5 présentant une taille moyenne (Mw) située entre 100 et 1000, 100 et 700, 100 et 350, ou 150 et 300 kDa ; (d) de sérotype 7F présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 1000, 100 et 750, 150 et 500, ou 200 et 300 kDa ; (e) de sérotype 9V présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 1000, 100 et 750, 150 et 500, 200 et 400, ou 250 et 300 kDa ; (f) de sérotype 14 présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 1000, 100 et 750, 150 et 500, ou 200 et 250 kDa ; (g) de sérotype 18C présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 1000, 50 et
    137
    BE2016/5782
    750, 50 et 500, 50 et 190, 50 et 150 ou 80 et 110 kDa (h) de sérotype 19F présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 1000, 100 et 750, 100 et 500, 100 et 190 ou 120 et 180 kDa ; et/ou (i) de sérotype 19A présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 800 kDa, 110 et 700, 110 et 300, 120 et 200, 130 et 180, 140 et 160 ou 80 et 130 kDa.
  21. 21. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 20, qui comprend en outre un sérotype 22F capsulaire de Streptococcus pneumoniae présentant une taille moyenne (Mw) située entre 50 et 800 kDa, 110 et 700 kDa, 110 et 300, 120 et 200, 130 et 180, 150 et 170, 100 et 190, 100 et 150, 95 et 125 ou 100 et 115 kDa.
  22. 22. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 21, comprenant 2, 3, 4, 5 ou 6 protéines porteuses différentes.
  23. 23. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 22, dans laquelle une ou plusieurs ou toutes les protéines porteuses sont choisies dans le groupe constitué par : l'anatoxine diphtérique (DT), CRM197, l'anatoxine tétanique (TT), le fragment C de TT, dPly, PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, PhtDE OmpC, PorB et la protéine D de Haemophilus influenzae.
  24. 24. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 23, dans laquelle le polysaccharide capsulaire de Streptococcus pneumoniae de sérotype 6B est conjugué à une protéine porteuse (par exemple, la protéine D) différente de la protéine porteuse à laquelle le polysaccharide capsulaire de
    Streptococcus pneumoniae de sérotype 6A est conjugué.
  25. 25. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 24, comprenant un saccharide de
    138
    BE2016/5782
    sérotype 1 conj ugué à la protéine D, un saccharide de sérotype 4 conj ugué à la protéine D, un saccharide de sérotype 5 conj ugué à la protéine D, un saccharide de sérotype 6B conj ugué à la protéine D, un saccharide de sérotype 7F conj ugué à la protéine D, un saccharide de sérotype 9V conj ugué à la protéine D, un saccharide de sérotype 14 conj ugué à la protéine E ) et un saccharide de sérotype 23F conjugué à la protéine D. 26. Composition immunogène selon l'une quelconque
    des revendications 13 à 25, comprenant le sérotype 19F conjugué à l'anatoxine diphtérique.
  26. 27. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 26, dans laquelle la composition comprend un saccharide capsulaire 18C conjugué à l'anatoxine tétanique (TT), facultativement dans laquelle 18C est le seul saccharide dans la composition conjugué à l'anatoxine tétanique (TT), facultativement par l'intermédiaire d'un lieur ADH.
  27. 28. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 27, comprenant en outre un ou plusieurs saccharides capsulaires de S. pneumoniae d'un ou de plusieurs sérotypes choisis parmi le sérotype 33F, le sérotype 15 et le sérotype 12F, conjugués à une ou plusieurs protéines porteuses.
  28. 29. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 28, dans laquelle la dose du conjugué de saccharides 6A est située entre 1 et 10 pg, 1 et 5 pg, ou 1 et 3 pg de saccharide (par exemple, 2 pg)
    139
    BE2016/5782
  29. 30. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 29, qui comprend en outre une ou plusieurs protéines de S. pneumoniae, conjuguées ou non conjuguées, choisies parmi : la famille des triades polyhistidine (PhtX), la famille des protéines se liant à la choline (CbpX), les CbpX tronquées, la famille des LytX, les LytX tronquées, les protéines chimères CbpX tronquée-LytX tronquée, la pneumolysine détoxifiée (Ply), PspA, PsaA, Spl28, SplOl, Spl30, Spl25 et Spl33.
  30. 31. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 30, qui comprend en outre un adj uvant.
  31. 32. Composition immunogène selon la revendication 31, dans laquelle l'adjuvant comprend (pour une dose de 0,5 ml) 100 à 750, 200 à 500 ou 300 à 400 pg d'Al (aluminium) sous forme de phosphate d'aluminium.
  32. 33. Vaccin comprenant la composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 32 et un excipient ou support pharmaceutiquement acceptable.
  33. 34. Procédé de préparation du vaccin selon la revendication 33, qui comprend l'étape de mélange de la composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 32 avec un excipient ou support pharmaceutiquement acceptable.
    35. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 13 à 32 ou vaccin selon la revendication 33, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d'une maladie provoquée par
    une infection par Streptococcus pneumoniae.
  34. 36. Utilisation de la composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 12 à 32 ou du vaccin
    140
    BE2016/5782 selon la revendication 33, dans la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'une maladie provoquée par une infection par Streptococcus pneumoniae.
    141
    BE2016/5782
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