EA023059B1 - Способ конъюгирования бактериальных полисахаридов с белками-носителями - Google Patents
Способ конъюгирования бактериальных полисахаридов с белками-носителями Download PDFInfo
- Publication number
- EA023059B1 EA023059B1 EA201290692A EA201290692A EA023059B1 EA 023059 B1 EA023059 B1 EA 023059B1 EA 201290692 A EA201290692 A EA 201290692A EA 201290692 A EA201290692 A EA 201290692A EA 023059 B1 EA023059 B1 EA 023059B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- saccharide
- bacterial saccharide
- bacterial
- buffer
- conjugate
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
Abstract
В изобретении предложен способ конъюгирования бактериальных сахаридов, включая сахариды Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae, посредством восстановительного аминирования.
Description
Настоящее изобретение относится к способу конъюгирования. В частности, оно относится к конъюгированию сахаридов и белков посредством восстановительного аминирования.
Предшествующий уровень техники
Бактериальные капсульные полисахариды широко применялись в иммунологии в течение многих лет для предупреждения бактериального заболевания. Проблемой такого применения однако является Тнезависимая природа иммунного ответа. Эти антигены являются соответственно слабо иммуногенными у детей младшего возраста. Эта проблема была решена путем конъюгирования полисахаридных антигенов с белком-носителем (источник эпитопов Т-хелперов), который можно затем использовать, чтобы вызвать Т-зависимый иммунный ответ, даже на первом году жизни.
Известны различные методы конъюгирования в данной области техники. Конъюгаты могут быть получены способами прямого восстановительного аминирования, которые описаны в υδ 200710184072 (Наи8Йог£Т), υδ 4365170 (1еиши§8) и υδ 4673574 (Аийег8ои). Другие способы описаны в ЕР 0161188, ЕР208375 и ЕР 0477508. Способ конъюгирования альтернативно может быть основан на активации гидроксильных групп сахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (СИАР) с образованием цианатного эфира. Такие конъюгаты описаны в опубликованной РСТ заявке νθ 93/15760 ишГогтей δе^ν^се8 ишуег8Йу и νθ 95/08348 и νθ 96/29094 (см. также СЬи С. е! а1. 1пТес1. 1ттипИу, 1983, 245-256).
Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление антигена, (2) восстановление антигена и белка-носителя с образованием конъюгата. Стадия окисления может включать взаимодействие с периодатом, однако окисление периодатом может привести к уменьшению размера (νθ 94/05325).
Краткое изложение сущности изобретения
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что применение более низких концентраций периодата в присутствии низшего фосфата может приводить к сохранению размера и/или сохранению эпитопов.
В первом аспекте изобретения предложен способ конъюгирования бактериального сахарида (сахаридов), включающий стадии:
a) взаимодействия бактериального сахарида с 0,001-0,7; 0,005-0,5; 0,01-0,5; 0,1-1,2; 0,1-0,5; 0,1-0,2; 0,5-0,8; 0,1-0,8; 0,3-1,0 или 0,4-0,9 молярными эквивалентами периодата с образованием активированного бактериального сахарида;
b) смешивания активированного бактериального сахарида с белком-носителем;
c) взаимодействия активированного бактериального сахарида и белка-носителя с восстановителем с образованием конъюгата;
или
a) взаимодействия бактериального сахарида с 0,001-0,7; 0,005-0,5; 0,01-0,5; 0,1-1,2; 0,1-0,5; 0,1-0,2; 0,5-0,8; 0,1-0,8; 0,3-1,0 или 0,4-0,9 молярными эквивалентами периодата с образованием активированного бактериального сахарида;
b) смешивания активированного бактериального сахарида с линкером;
с') взаимодействия активированного бактериального сахарида с линкером при использовании восстановителя с образованием соединения бактериальный сахарид-линкер;
й) взаимодействия соединения бактериальный сахарид-линкер с белком-носителем с образованием конъюгата;
где стадия а) протекает в буфере, который не содержит аминогруппу и имеет концентрацию 1-100 мМ.
Во втором аспекте изобретения предложен конъюгат, полученный способом по изобретению.
В третьем аспекте изобретения предложен конъюгат, полученный способом по изобретению.
В четвертом аспекте изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая конъюгат по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.
В пятом аспекте изобретения предложена вакцина, содержащая иммуногенную композицию по изобретению.
В шестом аспекте изобретения предложено применение иммуногенной композиции по изобретению или вакцины по изобретению в предупреждении или лечении бактериального заболевания.
В седьмом аспекте изобретения предложено применение иммуногенной композиции по изобретению или вакцины по изобретению в изготовлении лекарственного средства для предупреждения или лечения бактериального заболевания.
В восьмом аспекте изобретения предложен способ предупреждения или лечения бактериальной инфекции, включающий введение иммуногенной композиции по изобретению или вакцины по изобретению пациенту.
В девятом аспекте изобретения предложен активированный бактериальный сахарид, содержащий повторяющуюся структурную единицу формулы (I)
- 1 023059
где активированный бактериальный сахарид содержит η повторяющихся структурных единиц и η составляет от 2 до 2400, от 500 до 2000, от 750 до 1500, от 1000 до 2000 или от 1500 до 2300;
где по меньшей мере 0,001; 0,01; 0,1; 0,5; 1; 2; 5; 10 или 30%, но менее чем 0,001; 0,01; 0,1; 0,5; 1; 2; 5; 10; 30 или 50% δί представляют собой а остальные представляют собой
где δ2 представляет собой либо —-^ΗΟ^Ι—Осн.
либо
и где δ3 представляет собой либо либо
Описание графических материалов
Фиг. 1. Размер полисахаридов 23Р и 6В после обработки периодатом. Линия, помеченная треугольниками, показывает размер 6В в 10 мМ фосфатном буфере, линия, помеченная ромбами, показывает размер 23Р в 10 мМ фосфатном буфере, и линия, помеченная квадратами, показывает размер 23Р в 100 мМ фосфатном буфере.
Фиг. 2. Сравнение иммуногенности конъюгатов 23Р, полученных посредством конъюгирования либо с помощью ΡΌΛΡ. либо путем восстановительного аминирования. На графике а) изображены результаты ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ). На графике Ь) изображены результаты анализа опсонофагоцитирующей активности.
Фиг. 3. Оценка иммуногенности Р806В-СКМ, конъюгированного с использованием способов конъюгирования, описанных в примере 4, на модели с мышами линии Ва1Ь/с.
Фиг. 4. Оценка иммуногенности Р806В-СКМ, конъюгированного с использованием способов конъюгирования, описанных в примере 4, на модели с морскими свинками.
Подробное описание изобретения
Изобретение относится к улучшенному способу конъюгирования антигена с белком-носителем. В частности, согласно изобретению предложен способ конъюгирования бактериального сахарида (сахаридов), включающий стадии:
a) взаимодействия бактериального сахарида с 0,001-0,7; 0,005-0,5; 0,01-0,5; 0,1-1,2; 0,1-0,5; 0,1-0,2; 0,5-0,8; 0,1-0,8; 0,3-1,0 или 0,4-0,9 молярными эквивалентами периодата с образованием активированного бактериального сахарида;
b) смешивания активированного бактериального сахарида с белком-носителем;
c) взаимодействия активированного бактериального сахарида и белка-носителя с восстановителем с образованием конъюгата;
или
- 2 023059
a) взаимодействия бактериального сахарида с 0,001-0,7; 0,005-0,5; 0,01-0,5; 0,1-1,2; 0,1-0,5; 0,1-0,2; 0,5-0,8; 0,1-0,8; 0,3-1,0 или 0,4-0,9 молярными эквивалентами периодата с образованием активированного бактериального сахарида;
b) смешивания активированного бактериального сахарида с линкером;
с') взаимодействия активированного бактериального сахарида с линкером при использовании восстановителя с образованием соединения бактериальный сахарид-линкер;
ά) взаимодействия соединения бактериальный сахарид-линкер с белком-носителем с образованием конъюгата;
где стадия а) протекает в буфере, который не содержит аминогруппу и имеет концентрацию 1-100 мМ.
Термин периодат включает как периодат, так и йодную кислоту. Этот термин также включает как метапериодат (Ю4 -), так и ортопериодат (Юб5-), однако в одном конкретном воплощении периодат, используемый в способе по изобретению, представляет собой метапериодат. Термин периодат также включает различные соли периодата, включая периодат натрия и периодат калия. В одном воплощении используемый периодат представляет собой метапериодат натрия. Когда антиген взаимодействует с периодатом, периодат окисляет вицинальные гидроксильные группы с образованием карбонильных или альдегидных групп и вызывает расщепление С-С связи. По этой причине термин взаимодействие антигена с периодатом включает окисление периодатом вицинальных гидроксильных групп.
Для целей изобретения активированный бактериальный сахарид представляет собой бактериальный сахарид, который был активирован посредством стадии а) способа по изобретению.
Для целей изобретения термин конъюгат обозначает бактериальный сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем. В одном воплощении бактериальный сахарид связан непосредственно с белком-носителем. Во втором воплощении бактериальный сахарид связан с белком посредством спейсера/линкера.
Буфер, используемый на стадии а), представляет собой буфер, не содержащий аминогруппу. В одном воплощении буфер выбран из перечня, состоящего из фосфатного буфера, боратного буфера, ацетатного буфера, карбонатного буфера, малеатного буфера и цитратного буфера. Во втором воплощении буфер представляет собой неорганический буфер. Термин неорганический буфер включает любой буферный раствор, где буферная емкость обусловлена присутствием соединения, которое не содержит углерод. Неорганические буферы по изобретению включают фосфатный буфер и боратный буфер. В одном воплощении буфер представляет собой фосфатный буфер.
В одном воплощении буфер имеет концентрацию 1-100, 5-80, 1-50, 1-25, 10-40, 1-10, 5-15, 8-12, 1020, 5-20, 10-50, приблизительно 10 или приблизительно 20 мМ. В дополнительном воплощении рН на стадии а) составляет 2,5-8,0, 5,0-7,0, 5,5-6,5, 5,8-6,3 или приблизительно б,0.
Термин сахарид в этом описании может обозначать полисахарид, тейхоевую кислоту или олигосахарид и включает все три наименования. Он может обозначать липополисахарид (ЛПС) или липоолигосахарид (ЛОС). Перед использованием полисахариды могут быть выделены из какого-либо исходного штамма или выделены из конкретного исходного штамма и подвергнуты изменению размера до некоторой степени известными способами (см., например, ЕР 497524 и ЕР 497525; ЗЬоикии Сйеи δζιι е! а1.- СагЬоЬубга!е КекеагсЬ, νοί. 152, р. 7-20 (1986)), например посредством микрофлюидизации. Олигосахариды имеют небольшое число повторяющихся структурных единиц (типично 5-30 повторяющихся структурных единиц) и типично являются гидролизованными полисахаридами.
В одном воплощении бактериальный сахарид представляет собой бактериальный капсульный сахарид. В одном воплощении настоящего изобретения бактериальный сахарид имеет происхождение из стрептококка группы В, У1Ьгю сЬо1егае, 81гер1ососсик риеитошае (Б.риеитотае), НаеторЬйик шЛие^ае (Н.шЛие^ае), №155епа тетидШФк (КтетидШФк), 81арЬу1ососсик аигеик (Б.аигеик), энтерококков, §а1тоие11а VI или §1арЬу1ососсик ерШегпиШк (§.ер1бегт1Ш5). В дополнительном воплощении бактериальный сахарид имеет происхождение из Б.риеишошае, НлиЛие^ае, КтетидШФк, Б.аигеик, энтерококков, §а1тоие11а VI или Б.ерШегпиШк. В еще одном дополнительном воплощении бактериальный сахарид представляет собой бактериальный капсульный сахарид, выбранный из перечня, состоящего из: серогруппы А (МеиА), В (МеиВ), С (МеиС), ^135 (Меи^) или Υ (МеиУ) N. шешидШФк, группы 1а, 1Ь, II, III, IV, V, VI или VII стрептококка группы В, §1арЬу1ососсик аигеик типа 5, §1арЬу1ососсик аигеик типа 8, §а1шоие11а 1урЫ (VI сахарид), У1Ьпо сЬо1егае или Н. тЛиег^ае тип Ь. В одном воплощении бактериальный сахарид представляет собой капсульный сахарид из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 8, 9Ν, 9^ 10А, 11А, 12Р, 14, 15В, 17Р, 18С, 19А, 19Р, 20, 22Р, 23Р или 33Р §1гер1ососсик риеитошае. В дополнительном воплощении бактериальный сахарид представляет собой капсульный сахарид §.риеитошае, выбранный из группы, состоящей из 5, 6В, 6А, 7Р, 9V, 14 или 23Р. Возможно, бактериальный сахарид по изобретению представляет собой капсульный сахарид §.риеитошае 23Р, 6В или 6А. В одном воплощении бактериальный сахарид представляет собой капсульный сахарид §.риеитошае 23Р. В одном воплощении бактериальный сахарид представляет собой капсульный сахарид §.риеитошае 6В. В одном воплощении бактериальный сахарид представляет собой капсульный сахарид §.риеитошае 6А. В еще одном дополнительном воплощении бактериальный сахарид представляет собой полисахарид или олигосахарид НаешорЬйик тЛиеи- 3 023059 ζΆε Ь (ШЬ). В одном воплощении бактериальный сахарид содержит вицинальные антидиолы.
Бактериальный сахарид может быть либо природным полисахаридом, либо может быть уменьшен в размере не более чем в 2, 4, 6, 8, 10 или 20 раз (например, посредством микрофлюидизации [например, с помощью аппарата ЕтиШЯех С-50] или другого известного способа [например, теплового, химического, окислительного, ультразвукового способов]). В одном воплощении бактериальный сахарид микрофлюидизируют перед стадией а). Олигосахариды могут быть уменьшены значительно позже (например, посредством известных тепловых, химических или окислительных способов).
Для целей изобретения природный полисахарид относится к бактериальному сахариду, который не был подвергнут процессу, целью которого является уменьшение размера сахарида. Полисахарид может быть слегка уменьшен в размере во время обычных процедур очистки. Такой сахарид еще считается природным. Только если полисахарид подвергали способам, которые уменьшают размер сахарида, полисахарид не считают природным.
Среднемассовая молекулярная масса бактериального сахарида, подходящего для конъюгирования способом по изобретению, может составлять от 20 до 2000, от 30 до 1000, от 40 до 500, от 50 до 400, от 75 до 300 или от 1000 до 2000 кДа. В случае природного капсульного сахарида 23Р из 8.рпеитошае средняя молекулярная масса природного полисахарида составляет 750-1500 или 1200-1300 кДа. В случае природного сахарида ШЬ средняя молекулярная масса природного полисахарида составляет от 100 до 250 кДа. Молекулярная масса или средняя молекулярная масса сахарида относится здесь к среднемассовой молекулярной массе (Мю) бактериального сахарида, измеренной перед конъюгированием посредством МАЬЬ§ (детектор по рассеянию света лазера под многими углами). Методика МАЬЬ§ хорошо известна в данной области техники. Для МАЬЬ§-анализа сахаридов могут быть применены в комбинации две колонки (Т8К06000 и 5000Р^Мх1). и сахариды элюируют в воде. Сахариды детектируют, применяя детектор рассеяния света (например, \УуаП Эа\уп ΌδΡ, оборудованный 10 мВт аргоновым лазером при 488 нм) и инферометрический рефрактометр (например, \Ууа11 0И1аЬ Ό8Ρ, оборудованный ячейкой Р100 и красным фильтром на 498 нм). МАЬЬБ-анализы могут быть проведены при использовании Т8КСМР\\х1 и 50 мМ Ыа/КР04, 200 мМ ЫаС1 с рН 7,0 в качестве элюирующего буфера со скоростью элюирования 0,75 мл/мин при использовании детектора ΒΙ/ΌΛ\νΝ-ΕΟ§. В одном воплощении полидисперсность сахарида составляет 1-1,5; 1-1,3; 1-1,2; 1-1,1 или 1-1,05, а после конъюгирования с белкомносителем полидисперсность конъюгата составляет 1,0-2,5; 1,0-2,0; 1,0-1,5; 1,0-1,2; 1,5-2,5; 1,7-2,2 или 1,5-2,0. Все измерения полидисперсности проводят посредством МАЬЬ§.
Обработка периодатом может приводить к уменьшению размера бактериального сахарида (эффект изменения размера). В одном воплощении способ по изобретению уменьшает этот эффект изменения размера. Это наблюдается для бактериального сахарида 23Р из §1гер1ососси5 рпеитошае (как в примере 1). По этой причине в одном воплощении средняя молекулярная масса бактериального сахарида по изобретению составляет 1-1100, 100-470, 200-300, 600-1100 или 800-1000 кДа после стадии а) (измеренная посредством МАРЬ§, как описано выше). В одном воплощении средняя молекулярная масса сахарида 23Р составляет 100-470 или 200-300 кДа после стадии а). В одном воплощении средняя молекулярная масса бактериального сахарида ШЬ составляет от 1 до 50 или от 5 до 10 кДа после стадии а).
Термин белок-носитель включает в себя как небольшие пептиды, так и большие полипептиды (более 10 кДа). Белок-носитель может представлять собой любой пептид или белок. Он может содержать один или несколько Т-хелперных эпитопов. Белок-носитель может представлять собой столбнячный анатоксин (ТТ), фрагмент С столбнячного анатоксина, нетоксичные мутанты столбнячного токсина (примечание: для целей этого изобретения считают, что все такие варианты ТТ представляют собой один и тот же тип белка-носителя), полипептиды, содержащие Т-клеточные эпитопы столбнячного анатоксина, такие как N19 (νΟ 2006/067632), дифтерийный анатоксин (ΌΤ), СКМ197, другие нетоксичные мутанты дифтерийного токсина [такие как СКМ176, СКМ197, СКМ228, СКМ45 (ИсЫба е1 а1. 1. Вю1. Сйет. 218; 3838-3844, 1973); СКМ9, СКМ45, СКМ102, СКМ103 и СКМ107 и другие мутации, описанные №сйо118 и Уои1е в СепеОсаПу Епдшеегеб Тохию. Еб: Ргапке1, Маесе1 Эеккег 1пс., 1992; делеция или мутация О1и-148 на Акр, О1п или §ег и/или А1а 158 на О1у, и другие мутации, раскрытые в И8 4709017 или 4950740; мутация по меньшей мере одного или нескольких остатков Ьук 516, Ьук 526, РЬе 530 и/или Ьук 534 и другие мутации, раскрытые в И8 5917017 или 6455673; или фрагмент, раскрытый в И8 5843711] (примечание: для целей этого изобретения считают, что все такие варианты ΌΤ представляют собой один и тот же тип белка-носителя), пневмококковый пневмолизин (Кио е1 а1. (1995) 1иГес1 1ттип, 63; 2706-13), ОМРС (менингококковый белок наружной мембраны, обычно получаемый из Ν. тешпдШбб серогруппы В - ЕР 0372501), синтетические пептиды (ЕР 0378881, ЕР 0427347), белки теплового шока (νΟ 93/17712, νΟ 94/03208), коклюшные белки (νΟ 98/58668, ЕР 0471177), цитокины, лимфокины, факторы роста или гормоны (νΟ 91/01146), искусственные белки, содержащие множественные человеческие СЭ4+ Тклеточные эпитопы из антигенов, имеющих происхождение от различных патогенов (Ра1ид1 е1 а1. (2001) Еиг 1 1ттипо1, 31; 3816-3824), такие как белок N19 (Вага1бо1 е1 а1. (2004) 1пГес1 1ттип, 72; 4884-7), пневмококковый поверхностный белок РкрА (νΟ 02/091998), белки поглощения железа (νΟ 01/72337), токсин А или В С.бЖсбе (νΟ 00/61761), белок Ό ШшЯиешае (ЕР 594610 и νΟ 00/56360), пневмококковый РЫА. (νΟ 98/18930, также называемый §р36), пневмококковый РЫЭ (раскрытый в νΟ 00/37105 и также
- 4 023059 называемый 8ρ036Ό), пневмококковый РЫВ (раскрытый в Ж') 00/37105 и также называемый 8р036В) или РЫБ (раскрытый в ^О 00/30299 и также называемый ВУН-3).
В одном воплощении согласно изобретению белок-носитель выбран из группы, состоящей из: столбнячного анатоксина (ТТ), фрагмента С столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина (ΌΤ), СНМ197, пневмолизина (Р1у), белка Ό, РЫБ, РЫБЕ и N19. В дополнительном воплощении белокноситель представляет собой СНМ197. В еще одном дополнительном воплощении белок-носитель представляет собой столбнячный анатоксин (ТТ).
В одном воплощении стадию а) проводят в темноте.
Когда антиген взаимодействует с периодатом, периодат окисляет вицинальные гидроксильные группы с образованием карбонильных или альдегидных групп и вызывает расщепление С-С связи. Стадия окисления (стадия а)) может протекать, как описано ниже:
Использование низких концентраций буфера, в частности фосфатного буфера, и небольших количеств периодата может уменьшать эффект изменения размера, описанный выше.
Капсульные сахариды 81гер1ососси§ риеишошае содержат вицинальные гидроксильные группы, которые могут быть окислены периодатом, как можно увидеть из структур повторяющихся участков, показанных ниже: Р81
В одном воплощении менее чем 0,001; 0,01; 0,1; 0,5; 1; 2; 5; 10; 30 или 50% вицинальных диолов бактериального сахарида окисляется во время стадии а).
В одном воплощении карбонильная группа, образованная на стадии а), взаимодействует с аминогруппой белка-носителя на стадии с). Это может протекать согласно следующей схеме реакции:
ΝβΒΗ,ΟΝ
РЗ-СН + ΗΤΙ- Белок- -РЗ-СН -ЦН-Бело|с·
2' носитель 2 носитель
- 6 023059
В одном воплощении бактериальный сахарид присутствует в концентрации от 0,2 до 14, от 8 до 12, от 10 до 12, от 1 до 4, от 0,2 до 1, или от 0,4 до 0,6, или приблизительно 11, или приблизительно 0,5 г/л на стадии а). В одном воплощении начальная концентрация белка-носителя на стадии Ь) составляет от 0,5 до 35, от 25 до 35, от 0,5 до 5, или от 0,8 до 2, или приблизительно 32, или 1 г/л. В дополнительном воплощении начальная концентрация активированного бактериального сахарида на стадии Ь) составляет от 0,2 до 20, от 10 до 28, или от 0,2 до 4, или от 1 до 2 , или приблизительно 15, или 1,6 г/л. В дополнительном воплощении начальное соотношение активированного бактериального сахарида и белка-носителя на стадии Ь) составляет от 2,0:1 до 0,1:1; от 1,8:1 до 0,4:1; от 1,4:1 до 1,6:1, от 1:1 до 1,4:1; от 1,8:1 до 1,6:1; от 0,8:1 до 0,4:1; от 0,7:1 до 0,5:1 или от 0,7:1 до 0,6:1 мас./мас. В дополнительном воплощении конечное соотношение белка-носителя и бактериального сахарида после стадии с) или с') составляет от 0,5:1 до 4:1; от 0,8:1 до 3,2:1; от 0,5:1 до 1,8:1; от 1,4:1 до 1,8:1; от 1:1 до 1,2:1 или от 2,5:1 до 3,5:1.
В одном воплощении температура реакции на стадии а) составляет 4-40, 10-32, 17-30 или 22-27°С. Типично эту температуру поддерживают на всем протяжении стадии а). Температура реакции во время стадии с) составляет 4-40, 10-32, 17-30 или 22-27°С. Типично эту температуру поддерживают на всем протяжении стадии с).
В одном воплощении стадия а) способа по изобретению протекает менее чем за 30, от 5 до 25, от 15 до 25 ч, от 30 мин до 25 ч, от 1 до 35, от 10 до 20 или от 15 до 20 ч, приблизительно 18 или приблизительно 1 ч. В одном воплощении стадия с) способа по изобретению протекает за 10-60, 10-20, 20-60, 3050 или 35-45 ч.
Конъюгирование может также быть осуществлено посредством добавления гетеро- или гомобифункционального линкера при использовании химических процессов по изобретению. Один конец линкера будет взаимодействовать с активированным антигеном посредством восстановительного аминирования, тогда как другой конец линкера может взаимодействовать с белком-носителем при использовании любого типа химических процессов. По этой причине линкер будет содержать по меньшей мере одну активную аминогруппу; если линкер является гомобифункциональным, то он будет содержать две активные аминогруппы; если линкер является гетеробифункциональным, то он будет содержать одну активную аминогруппу и другую активную группу, в одном воплощении эта вторая активная группа представляет собой активную карбонильную группу. В одном воплощении линкер составляет от 1 до 20 ангстрем в длину. В дополнительном воплощении линкер имеет от 4 до 20, от 4 до 12 или от 5 до 10 атомов углерода. Возможный линкер представляет собой дигидразид адипиновой кислоты (ΑΌΗ). Другие линкеры включают В-пропионамидо (\УО 00/10599), нитрофенилэтиламин (Сеует с1 а1. (1979) Мей. МюгоЬю1. 1ттипо1. 165; 171-288), галогеналкилгалогениды (И8 4057685), гликозидные связи (И8 4673574, и8 4808700), гександиамин и 6-аминокапроновую кислоту (И8 4459286).
В основном могут быть использованы следующие типы химических групп белка-носителя для сочетания/конъюгирования в качестве второй активной группы:
A) Карбоксильная (например, через аспарагиновую или глутаминовую кислоту). В одном воплощении эту группу связывают с аминогруппой линкера с помощью химических процессов с карбодиимидами, например, с помощью ΕΌΑΟ (1 -этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид).
Примечание: вместо вышеупомянутого ΕΌΑΟ может быть использован любой подходящий карбодиимид.
B) Аминогруппа (например, через лизин). В одном воплощении эту группу связывают с карбоксильной группой линкера с помощью химических процессов с карбодиимидами, например, с помощью ΕΌΑΟ В другом воплощении эту группу связывают с гидроксильными группами, активированными ΟΌΑΡ или ΟΝΒτ на линкере; с линкерами, имеющими альдегидную группу; с линкерами, имеющими сукцинимидную эфирную группу.
C) Сульфгидрильная (например, через цистеин). В одном воплощении эту группу связывают с бром- или хлорацетилированным линкером с помощью химических процессов с малеимидами. В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином.
Ό) Белок может быть модифицирован так, чтобы содержать алкинильную или азидную группу, которая может быть конъюгирована с линкером посредством клик-химии (описана в ТейаНебгоп 1ейет5 (.Типе 2005) 46:4479-4482).
Примечание: вместо вышеупомянутого ЕОАС может быть использован любой подходящий карбодиимид.
Восстановители, которые подходят для применения в способе по изобретению, включают цианборгидриды, такие как цианборгидрид натрия, боранпиридиновый комплекс или боргидридную ионообменную смолу. В одном воплощении восстановитель представляет собой цианборгидрид натрия. В одном воплощении используют от 0,5 до 2, от 0,6 до 1,5 или от 0,8 до 1,2 или приблизительно 1,0 молярный эквивалент цианборгидрида натрия на стадии с). В дополнительном воплощении восстановитель включает триацетоксиборгидрид натрия, в дополнительном воплощении используют от 2 до 10 или от 3 до 9 молярных эквивалентов или приблизительно 2,5 молярного эквивалента триацетоксиборгидрида натрия на стадии с).
Перед стадией с) активированный бактериальный сахарид и белок-носитель могут быть лиофили- 7 023059 зированы. В одном воплощении активированный бактериальный сахарид и белок-носитель лиофилизируют вместе. Это может происходить перед стадией Ь) или после стадии Ь). В одном воплощении лиофилизация протекает в присутствии невосстанавливающего сахара, возможные невосстанавливающие сахара включают сахарозу, трегалозу, рафинозу, стахиозу, мелезитозу, декстран, маннит, лактит и палатинит. В дополнительном воплощении невосстанавливающий сахар выбран из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы или маннита.
В одном воплощении стадии Ь) и/или с) проводят в растворителе ДМСО (диметилсульфоксид). В дополнительном воплощении стадии Ь) и/или с) проводят в растворителе ДМФА (диметилформамид). Растворитель ДМСО или ДМФА может быть использован для повторного растворения активированного бактериального сахарида и белка-носителя, которые были лиофилизированы.
В конце стадии с) могут присутствовать непрореагировавшие карбонильные группы, оставшиеся в конъюгатах, они могут быть блокированы с помощью подходящего блокирующего агента. В одном воплощении этот блокирующий агент представляет собой боргидрид натрия (ΝαΒΗ.4). например, продукт стадии с) может быть подвергнут взаимодействию с боргидридом натрия в течение 15 мин-15 ч, 15 -45 мин, 2-10 или 3-5 ч, приблизительно 30 мин или приблизительно 4 ч. В дополнительном воплощении блокировки достигают посредством смешивания продукта стадии с) с приблизительно 2 молярными эквивалентами или 1,5-10 молярными эквивалентами ΝαΒΗ4.
Согласно изобретению также предложена дополнительная стадия е) очистки конъюгата, которая может включать диафильтрацию, например диафильтрацию с отсечением 100 кДа. В дополнение или альтернативно стадия е) может включать ионообменную хроматографию. В дополнительном воплощении стадия е) может включать вытеснительную хроматографию. В одном воплощении способ по пп.1-51 включает дополнительную стадию ί), где конъюгат стерильно фильтруют.
Конъюгат можно также смешивать с дополнительными антигенами. В одном воплощении дополнительные антигены включают по меньшей мере 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 сахаридов §.рпеитошае, выбранных из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 8, 9Ν, 9У, 10А, 11 А, 12Р, 14, 15В, 17Р, 18С, 19А, 19Р, 20, 22Р, 23Р и 33Р. В одном воплощении дополнительные антигены включают сахариды §.риеитошае 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р. В одном воплощении дополнительные антигены включают сахариды §.риеитошае 4, 6В, 9У, 14, 18С и 19Р. В одном воплощении дополнительные антигены включают сахариды §.рпеитошае 4, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р. В одном воплощении дополнительные антигены включают сахариды §.риеитошае 1, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р. В одном воплощении дополнительные антигены включают сахариды §.рпеитошае 1, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С и 19Р. В одном воплощении дополнительные антигены включают сахариды §.рпеитошае 1, 4, 5, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р. В одном воплощении дополнительные антигены включают сахариды §.риеитошае 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А, 19Р и 23Р. В одном воплощении дополнительные антигены включают сахариды 8.рпеитошае 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А и 19Р. В одном воплощении дополнительные антигены включают сахариды §.рпеитошае 1, 3, 4, 5, 6А, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А, 19Р и 23Р. В одном воплощении дополнительные антигены включают сахариды §.рпеитошае 1, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А, 19Р и 23Р. В одном воплощении дополнительные антигены включают сахариды §.рпеитошае 1, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А и 19Р. В одном воплощении дополнительные антигены включают сахариды 8.рпеитошае 1, 4, 5, 6А, 7Р, 9У, 14, 18С, 19А, 19Р и 23Р.
Любые сахариды, перечисленные как дополнительные антигены, возможно, конъюгированы с белком-носителем либо способом по изобретению, либо другим способом. Возможно, эти дополнительные антигены конъюгированы с белками-носителями, перечисленными выше.
В одном воплощении дополнительные антигены включают капсульный сахарид §.риеитошае 1, конъюгированный с белком Ό или СРМ197. В одном воплощении дополнительные антигены включают капсульный сахарид §.рпеитошае 3, конъюгированный с белком Ό, СКМ197, пневмолизином, или РЫЭ или его фрагментом, или слитым белком. В одном воплощении дополнительные антигены включают капсульный сахарид §.рпеитотае 4, конъюгированный с белком Ό или СРМ197. В одном воплощении дополнительные антигены включают капсульный сахарид §.рпеитошае 5, конъюгированный с белком Ό или СРМ197. В одном воплощении дополнительные антигены включают капсульный сахарид 8.рпеитошае 6В, конъюгированный с белком Ό или СКМ197. В одном воплощении дополнительные антигены включают капсульный сахарид §.рпеитошае 7Р, конъюгированный с белком Ό или СКМ197. В одном воплощении дополнительные антигены включают капсульный сахарид §.рпеитошае 9У, конъюгированный с белком Ό или СКМ197. В одном воплощении дополнительные антигены включают капсульный сахарид §.рпеитошае 14, конъюгированный с белком Ό или СКМ197. В одном воплощении дополнительные антигены включают капсульный сахарид §.рпеитошае 23Р, конъюгированный с белком Ό или СКМ197. В одном воплощении дополнительные антигены включают капсульный сахарид 8.рпеитошае 18С, конъюгированный со столбнячным анатоксином или СКМ197. В одном воплощении дополнительные антигены включают капсульный сахарид §.рпеитошае 19А, конъюгированный с пневмолизином или СКМ197. В одном воплощении дополнительные антигены включают капсульный сахарид §.рпеитошае 22Р, конъюгированный с СКМ197, или РЫЭ или его фрагментом, или слитым белком. В одном воплощении дополнительные антигены включают капсульный сахарид §.рпеитошае 6А, конъ- 8 023059 югированный с пневмолизином или белком Н.тЛисп/ас. возможно белком Ό, или РЬЮ, или его слитым белком, или СРМ197. В одном воплощении дополнительные антигены включают капсульный сахарид 8.риеитошае 6С, конъюгированный с пневмолизином или белком НапЛисп/ас. возможно белком Ό, или РЬЮ, или его слитым белком, или СРМ197. В одном воплощении дополнительные антигены включают капсульный сахарид 8.риеитошае 19Р, конъюгированный с дифтерийным анатоксином (ИТ).
Дополнительные антигены могут также включать белки 81герЮсоссик риеитошае. В одном воплощении дополнительные антигены включают по меньшей мере один белок, выбранный из группы, состоящей из полигистидинового триадного семейства (РЬ!Х), семейства холинсвязывающих белков (СЬрХ), укороченных СЬрХ, Ьу!Х-семейства, укороченных Ьу1Х, химерных белков (или слитых конструкций) укороченных СЬрХ-укороченных Ьу1Х, пневмолизина (Р1у), РкрА, РкаА, 8р128, 8р101, 8р130, 8р125 и8р133.
Дополнительные антигены могут также включать антигены из дополнительных бактериальных видов. В одном воплощении вакцина или иммуногенная композиция содержит антигены, имеющие происхождение из 81герЮсоссик риеитошае (8.риеитотае), НаеторЬйик тПиеп/ае (НТиЯиещае), №1ккепа тетидШФк (КтетидЬтШк), ЕксЬепсЫа соЬ (Е.соЬ), МогахеЬа са!аггЬаЬк (М.са!аггЬаЬк), возбудителей столбняка, дифтерии, коклюша, 8!арЬу1ососсик ерИепшЫк (8.ер1Йегт1Й1к), энтерококков, Ркеийотоиак кр. или 8!арЬу1ососсик аигеик (8.аигеик).
В одном воплощении дополнительные антигены включают антигены М.са1аггЬаЪк, предпочтительными антигенами М.са!аггЬаЬк являются: ОМР106 |\7О 97/41731 (Аи!ех) & АО 96/34960 (РМС)]; ОМР21; ЬЬрА & ЬЬрВ [АО 98/55606 (РМС)]; ТЬрА & ТЬрВ [АО 97/13785 & АО 97/32980 (РМС)]; СорВ [Не1т1иеи МЕ, е! а1. (1993) 1иГесЕ 1ттии. 61:2003-2010]; ИкрА1/2 [АО 93/03761 (ишуегкйу оГ Техак)]; и ОтрСИ. Примеры антигенов нетипируемых штаммов НаеторЬйик 1иЯиеи7ае, которые могут быть включены в комбинированную вакцину (особенно для предупреждения среднего отита), включают: белок фимбрин [(И8 5766608 - О1но 8!а!е КекеагсЬ Роиийайои)] и слитые конструкции, содержащие его пептиды [например, ЬВ1(Г)-пептидные слитые конструкции; И8 5843464 (О8И) или АО 99/64067]; ОМР26 [АО 97/01638 (Сойеск)]; Р6 [ЕР 281673 (81а1е ишуегкйу оГ №ν Уогк)]; ТЬрА и ТЬрВ; №а; Нт^1,2; Нар и Ό15.
В дополнительном воплощении дополнительные антигены включают дифтерийный анатоксин (ИТ), столбнячный анатоксин (ТТ) и коклюшные компоненты [типично обезвреженный коклюшный анатоксин (РТ) и филаментозный гемагглютинин (РНА) с возможным пертактином (РИЛ) и/или агглютинином 1+2], например, продаваемая вакцина ЮТ’АЫКТХ-ПТРаТМ (8тйЬК1теВеесЬат Вю1одюа1к), которая содержит антигены ИТ, ТТ, РТ, РНА и РИЛ, или с цельноклеточным коклюшным компонентом, например, как продаваемая 8тйЬК1шеВеесЬат Вю1од1са1к к.а., такая как ТгйаипхТМ. В дополнительном воплощении дополнительные антигены включают поверхностный антиген гепатита В (НерВ).
В дополнительном воплощении дополнительные антигены включают РКР капсульный сахарид НлпЛиеп/ае (НФ).
В дополнительном воплощении дополнительные антигены включают по меньшей мере один капсульный сахарид из НтептфиФк А, С, А или Υ. В дополнительном воплощении дополнительные антигены включают по меньшей мере один конъюгат капсульного сахарида из ХлпешпдШЫк А, С, А или Υ.
Конъюгат также может быть смешан с адъювантом. Подходящие адъюванты включают соли алюминия (фосфат алюминия или гидроксид алюминия), монофосфориллипид А (например, 3И-МРЕ), сапонины (например, Ц821), эмульсии типа масло-в-воде, пузырьковые препараты или препараты везикул наружной мембраны грамотрицательных бактериальных штаммов (таких как те, о которых сообщается в АО 02/09746), липид А или его производные, фосфаты алкилглюкозамина или комбинации двух или более этих адъювантов, но не ограничены ими.
В дополнительном воплощении конъюгат по изобретению смешан с фармацевтически приемлемым эксципиентом.
В дополнительном аспекте изобретения предложен конъюгат, получаемый способом по изобретению. В дополнительном аспекте изобретения предложен конъюгат, полученный способом по изобретению. Согласно изобретению также предложена иммуногенная композиция, содержащая конъюгат по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент. В одном воплощении фармацевтически приемлемый эксципиент не включает хлорид, в дополнительном воплощении фармацевтический эксципиент не включает хлорид натрия. В одном воплощении фармацевтический эксципиент включает буфер, выбранный из группы, состоящей из малеата, трис-буфера или цитрата. В дополнительном воплощении буфер представляет собой малеатный буфер.
Иммуногенная композиция по изобретению может содержать дополнительные антигены, в частности те, которые описаны выше как дополнительные антигены. Иммуногенная композиция может содержать адъювант, в частности такой, как описан выше.
Согласно изобретению также предложена вакцина, содержащая иммуногенную композицию по изобретению.
Вакцинные препараты, содержащие иммуногенные композиции по настоящему изобретению, могут применяться для защиты или лечения млекопитающего, чувствительного к инфекции, посредством вве- 9 023059 дения указанной вакцины системным или мукозальным путем. Эти способы введения могут включать инъекцию посредством внутримышечного, внутрибрюшинного, внутрикожного или подкожного путей введения или посредством мукозального введения в ротовую полость/пищеварительный, респираторный, мочеполовой тракты. Возможно интраназальное введение вакцин для лечения пневмонии или среднего отита (поскольку носоглоточное носительство пневмококков можно более эффективно предупредить, ослабляя тем самым инфекцию на самой ранней стадии). Хотя вакцину по изобретению можно вводить в виде однократной дозы, ее компоненты можно также вводить совместно в одно и то же время или в разные моменты времени (например, конъюгаты пневмококковых сахаридов можно вводить по отдельности в одно и то же время или через 1-2 недели после введения любого бактериального белкового компонента вакцины для оптимального координирования иммунных ответов по отношению друг к другу). Помимо одного пути введения, можно применять 2 разных пути введения. Например, сахариды или конъюгаты сахаридов можно вводить в/м (внутримышечно) или в/к (внутрикожно), а бактериальные белки можно вводить и/н (интраназально) или в/к. Кроме того, вакцины по изобретению можно вводить в/м в случае примирующих доз и и/н в случае бустерных доз.
Содержание белковых антигенов в вакцине будет обычно находиться в пределах 1-100 мкг, возможно 5-50 мкг, наиболее типично в пределах 5-25 мкг. После первичной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустерных иммунизаций через адекватные промежутки времени.
Получение вакцины в общем описано в Уассше Όβδί^η (ТЬе киЪипй апб абщуай арргоасй (ебк Ро\\е11 М.Р. & Ые^тап М.1.) (1995) Р1епит Ргекк Ые\у Уогк). Инкапсуляция в липосомы описана Ри11ег1оп, патент США 4235877.
Хотя вакцины по настоящему изобретению можно вводить любым путем, введение описываемых вакцин в кожу (в/к) составляет одно из воплощений настоящего изобретения. Человеческая кожа содержит наружную ороговевшую кутикулу, называемую роговым слоем, которая покрывает эпидермис. Ниже этого эпидермиса находится слой, называемый дермой, который, в свою очередь, покрывает подкожную ткань. Исследователи показали, что инъекция вакцины в кожу, и ,в частности, в дерму, стимулирует иммунный ответ, что также может быть связано с рядом дополнительных преимуществ.
Внутрикожная вакцинация описанной здесь вакциной образует дополнительный аспект настоящего изобретения.
Стандартная методика внутрикожной инъекции, процедура манту, включает стадии очистки кожи и затем при оттягивании одной рукой и, направляя срез тонкой иглы (калибр 26-31) вверх, введения иглы под углом 10-15°. Как только срез иглы введен, стержень иглы опускают и продвигают дальше, осуществляя легкое надавливание, чтобы приподнять его под кожей. Затем очень медленно вводят жидкость, образуя таким образом пузырек или вздутие на поверхности кожи, после чего медленно извлекают иглу.
Совсем недавно были описаны устройства, специально разработанные для введения жидких агентов в кожу или через нее, например устройства, описанные в АО 99/34850 и ЕР 1092444, а также устройства для струйных инъекций, описанные, например, в АО 01/13977; И8 5480381, И8 5599302, И8 5334144, И8 5993412, И8 5649912, И8 5569189, И8 5704911, И8 5383851, И8 5893397, И8 5466220, И8 5339163, И8 5312335, И8 5503627, И8 5064413, И8 5520639, И8 4596556, И8 4790824, И8 4941880, И8 4940460, АО 97/37705 и АО 97/13537. Альтернативные способы внутрикожного введения вакцинных препаратов могут включать стандартные шприцы и иглы или устройства, сконструированные для баллистической доставки твердых вакцин (АО 99/27961), или трансдермальные пластыри (АО 97/48440; АО 98/28037); или накладываемые на поверхность кожи (трансдермальная или чрескожная доставка, АО 98/20734; АО 98/28037).
Когда вакцины по настоящему изобретению предназначены для введения в кожу или, более конкретно, в дерму, вакцина находится в малом объеме жидкости, в частности в объеме от приблизительно 0,05 до 0,2 мл.
Содержание антигенов в кожных или внутрикожных вакцинах по настоящему изобретению может быть аналогично обычным дозам, установленным для внутримышечных вакцин (см. выше). Однако как раз особенностью кожных или внутрикожных вакцин является то, что эти препараты могут быть низкодозовыми. Соответственно белковые антигены в низкодозовых вакцинах, возможно, присутствуют в таких небольших количествах, как 0,1-10 или 0,1-5 мкг на дозу; а сахаридные (возможно, конъюгированные) антигены могут присутствовать в диапазоне 0,01-1 или от 0,01 до 0,5 мкг сахарида на дозу.
Употребляемый здесь термин внутрикожная доставка означает доставку вакцины в область дермы в коже. Однако вакцина не обязательно будет локализована исключительно в дерме. Дерма представляет собой слой в коже, расположенный на расстоянии от приблизительно 1,0 до приблизительно 2,0 мм от поверхности кожи человека, но между индивидуумами и в разных частях организма имеет место определенная степень изменчивости. В общем случае можно ожидать достижения дермы, пройдя на 1,5 мм ниже поверхности кожи. Дерма расположена между роговым слоем и эпидермисом на поверхности и подкожным слоем, лежащим ниже. В зависимости от способа доставки вакцина может быть, в конечном счете, локализована исключительно или в основном в дерме или она может, в конечном счете, быть распределена в эпидермисе и дерме.
В одном аспекте изобретения предложен вакцинный набор, содержащий флакон, который содержит
- 10 023059 иммуногенную композицию по изобретению, возможно в лиофилизированной форме, и дополнительно содержащий флакон, который содержит адъювант, который описан в изобретении. Предусматривается, что в этом аспекте изобретения адъювант будет использован для разведения лиофилизированной иммуногенной композиции.
Дополнительный аспект изобретения представляет собой способ иммунизации человекареципиента против заболевания, вызываемого бактериальной инфекцией, включающий введение реципиенту иммунопротективной дозы иммуногенной композиции или вакцины или применение набора по изобретению. Дополнительный аспект изобретения представляет собой способ иммунизации человекареципиента против инфекции, вызываемой З.рпеитошае и/или НаеторЫ1и8 тПиеп/ае. включающий введение реципиенту иммунопротективной дозы иммуногенной композиции или вакцины, или применение набора по изобретению.
Дополнительный аспект изобретения представляет собой иммуногенную композицию по изобретению для применения в лечении или предупреждении бактериального заболевания. Дополнительный аспект изобретения представляет собой иммуногенную композицию по изобретению для применения в лечении или предупреждении заболевания, вызываемого инфекцией З.рпеитошае и/или НаеторЫ1и8 тйиешае.
Дополнительный аспект изобретения представляет собой применение иммуногенной композиции, или вакцины, или набора по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения бактериальных заболеваний. Дополнительный аспект изобретения представляет собой применение иммуногенной композиции, или вакцины, или набора по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией З.рпеитошае и/или НаеторЫ1и8 тЛиеп/ае.
Согласно изобретению также предложен активированный бактериальный сахарид, содержащий повторяющуюся структурную единицу формулы (I)
где активированный бактериальный сахарид содержит η повторяющихся структурных единиц, и η составляет от 2 до 2400, от 20 до 2000, от 50 до 1500, от 1000 до 2000, от 1000 до 2500 или от 1500 до 2300; где по меньшей мере 0,001; 0,01; 0,1; 0,5; 1; 2; 5; 10 или 30%, но менее чем 0,001; 0,01; 0,1; 0,5; 1; 2; 5; 10; 30 или 50%
81 представляют собой а остальные представляют собой где 82 представляет собой либо либо и где 83 представляет собой либо
либо б
сн3
В одном воплощении менее чем 0,001; 0,1; 0,5; 1; 2; 3; 5; 10; 30 или 50% δ2 представляют собой
- 11 023059
В одном воплощении менее чем 0,1; 0,5; 1; 2; 3; 5; 10; 30 или 50% 83 представляют собой
Примерно или приблизительно определяют как находящиеся в пределах 10% больше или меньше величины, заданной для целей изобретения.
Авторами изобретения подразумевается, что термины содержащий, содержат и содержит здесь возможно заменять на термины состоящий из, состоят из и состоит из соответственно в каждом случае.
Воплощения, относящиеся к вакцинным композициям по изобретению, здесь также применимы к воплощениям, относящимся к иммуногенным композициям по изобретению, и наоборот.
Все источники информации или заявки на патенты, приведенные в этом описании изобретения к патенту, включены здесь посредством ссылки.
Для возможности лучшего понимания изобретения предложены следующие примеры. Эти примеры приведены только в целях иллюстрации и не должны быть истолкованы как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Примеры
Пример 1. Окисление 23Р и 6В периодатом.
Полисахариды (Ρδ) 23Р или 6В растворяли в 100 мМ КН2РО4 (рН 7,4), 10 мМ КН2РО4 или ^Р1 (вода для инъекций) с образованием растворов с концентрацией 2 мг Ρδ/мл. Раствор инкубировали в течение 2 ч при перемешивании при комнатной температуре. По истечении этого времени значение рН доводили до рН 6,0 с помощью 1 н. НС1. Периодат добавляли в виде порошка или в жидкой форме (10 мг/мл в ^Р1) в различных количествах для достижения ряда молярных соотношений (табл. 1). Растворы инкубировали в течение 17 ч при комнатной температуре (20-25°С), по истечении этого времени образцы диализировали или подвергали диафильтрации против ^Р1.
Высокоэффективную гель-фильтрационную хроматографию в сочетании с детектором коэффициента преломления и детектором по рассеянию света лазера под многими углами (МАЬЬЗ) применяли для измерения молекулярной массы. Наполнители колонок для эксклюзионной хроматографии (Т8К5000Р^ХЬ-То8оЬ) применяли для характеристики распределения размеров молекул полисахарида (элюция со скоростью 0,5 мл/мин в 0,2М ИаС1 - 0,02% ΝαΝ3).
В табл. 1 и на фиг. 1 показаны результаты этих экспериментов. Они демонстрируют, что для сахарида 23Р существенное изменение размера происходит при окислении с использованием высоко молярных эквивалентов периодата в 100 мМ фосфатном буфере. Этот эффект изменения размера может быть уменьшен путем снижения концентрации фосфатного буфера или молярных эквивалентов используемого периодата.
Таблица 1
23Р | §8 | ||||||
Образец | Молярный эквивалент периодата | Буфер | Размер (кДа) | Образец | Молярный эквивалент периодата | Буфер | Размер (кДа) |
23Р природный | 0 | Вода | 861 | 6В | 0 | 10 мМ фосфатный | 1022 |
23Р природный | 0 | 10 мМ фосфатный | 847 | 6В | 0,1 | 10 мМ фосфатный | 975 |
23Р природный | 0 | 100 мМ фосфатный | 860 | 6В | 0,2 | 10 мМ фосфатный | 990 |
23Р АТСС (Американская коллекция типовых культур) природный | 0 | 100 мМ фосфатный | 1655 | 6В | 0,3 | 10 мМ фосфатный | 961 |
23Р | 1 | 100 мМ фосфатный | менее 1 | 6В | 0,75 | 10 мМ фосфатный | 868 |
23Р | 1 | Вода | 36 | ||||
23Р | 1,2 | 100 мМ фосфатный | менее 1 | ||||
23Р АТСС | 1 | 100 мМ фосфатный | 2 | ||||
23Р АТСС | 0,125 | 100 мМ фосфатный | 39 | ||||
23Р | 0,1 | 10 мМ фосфатный | 466,9 | ||||
23Р | 0,15 | 10 мМ фосфатный | 398,5 | ||||
23Р | 0,2 | 10 мМ фосфатный | 336 | ||||
23Р | 0,5 | 10 мМ фосфатный | 179,1 |
Пример 2. Конъюгирование 23Р с СКМ197 посредством восстановительного аминирования и с по- 12 023059 мощью ί'ΌΛΡ.
Восстановительное аминирование.
г Ρδ 23Ρ растворяли в 500 мл 10 мМ ΚΗ2ΡΟ4, рН 7,15. Этот раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Значение рН доводили до 6,0 с помощью 1М НС1. 111 мг периодата (Να1Ο4, 0,4 молярных эквивалента периодата) добавляли к раствору Ρδ 23Ρ, и этот раствор инкубировали в течение 17 ч в темноте при комнатной температуре для окисления Ρδ 23Р. Затем раствор подвергали диафильтрации против νΡΙ.
Активированный Ρδ 23Р лиофилизировали с белком СРМ197 (в соотношении СКМ/Ρδ (мас./мас.): 0,625) в присутствии стабилизатора.
900 мг лиофилизированной смеси Ρδ 23Р/СКМ197 растворяли посредством добавления 350 мл растворителя ДМСО и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Для восстановления смеси Ρδ 23Р/СКМ197 добавляли 1 молярный эквивалент ΝαΒΗ,ί’Ν (735 мкл раствора с концентрацией 100 мг/мл в νΡΙ). Раствор инкубировали в течение еще 40 ч при комнатной температуре (15-25°С) при перемешивании. По истечении этого времени добавляли 2 молярных эквивалента ΝαΒΗ4 (100 мг/мл в νΡΙ), и раствор инкубировали в течение 4 ч при комнатной температуре. Добавляли 2200 мл 150 мМ ΝαΟ перед диафильтрацией (отсечение 100 кДа) и очисткой с помощью ΌΕΆΕ (диэтиламиноэтил). Представляющие интерес фракции объединяли и фильтровали через фильтр на 0,22 мкм.
ΟΟΛΡ.
200 мг микрофлюидизированного Ρδ 23Ρ растворяли в воде до достижения концентрации 10 мг/мл. К этому раствору добавляли ΝαΟ в конечной концентрации 2М.
Добавляли достаточное количество раствора ΟΟΛΡ (100 мг/мл свежеприготовленного в ацетонитриле/νΡΙ, 5/50 об./об.) для достижения соотношения ί'ΌΛΡ:Ρδ 0,75 мг/мг Ρδ.
Через 90 с значение рН повышали до рН 9,5 посредством добавления 0,1 н. ΝαΟΗ. Спустя 3 мин добавляли достаточное количество СКМ197 (10 мг/мл в 0,15М ΝαΟ) для достижения соотношения 1,5 (СКМ197^ мас./мас.), поддерживали значение рН 9,5. Этот раствор инкубировали в течение 1 ч при рН 9,5.
После этой стадии сочетания к смеси добавляли 10 мл 2М раствора глицина, и значение рН доводили до рН 9,0 (ослабление рН). Раствор перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Конъюгат очищали, применяя фильтр на 5 мкм с последующей очисткой на колонке δορΙιαεΓγΙ δ400ΗΚ (ХК50/100), которая удаляет небольшие молекулы и неконъюгированные полисахариды и белок. Скорость потока фиксировали при 150 мл/ч. Элюцию достигали применением 150 мМ ΝαΟ. Представляющие интерес фракции объединяли и фильтровали с помощью МШраск 20. Полученный конъюгат имел конечное соотношение СΚМ197/Ρδ мас./мас. 1,35 мас.
Пример 3. Иммуногенность конъюгатов 23Р-СКМ197, полученных посредством восстановительного аминирования и с помощью ί'ΌΛΡ.
Конъюгаты получали способами, описанными в примере 2. Самок морских свинок иммунизировали внутримышечно три раза (на 0,14 и 28 сутки) с использованием 0,25 мкг конъюгатов Ρδ 23Р-СКМ197. У животных отбирали кровь на 42 сутки и измеряли антителогенез, направленный против Ρδ 23Ρ, посредством ΕΟδΆ и ОРА (анализ опсонофагоцитирующей активности).
ΕΟδΆ.
Микропланшеты покрывали очищенным пневмококковым полисахаридом в ΡΒδ буфере (фосфатносолевой буфер). Планшеты промывали четыре раза 0,9% ΝαΟ и 0,05% Твин 20. Сыворотки инкубировали в течение 1 ч при 37°С с ί’Ρδ (хемилюминесцентный субстрат пероксидазы) (об./об.) в ΡΒδ-0,05% Твин 20. Сыворотки добавляли в микролунки и серийно разводили (двукратный шаг разведения) в ΡΒδ0,05% Твин. Планшеты инкубировали при перемешивании в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшеты промывали, как указано выше, и добавляли конъюгат пероксидазы с антителами против 1§О морских свинок, затем планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. После промывания добавляли субстрат (4 мг ΟΡΌΆ (орто-фенилендиамин) в 10 мл 0,1М цитрата рН 4,5 и 5 мкл Н2О2) в каждую лунку на 15 мин. Реакцию останавливали добавлением 1 н. НС1. Поглощение считывали при 490-620 нм с использованием спектрофотометра. Проявляющаяся окраска прямо пропорциональна количеству антител, присутствующих в сыворотке. Уровень анти-Ρδ 1§О, присутствующий в сыворотках, определяли путем сравнения с контрольной кривой сыворотки, добавляемой в каждый планшет, и выражали в мкг/мл.
Результаты анализировали статистически, приняв однородность дисперсии (проверяли с помощью критерия Кохрана) и нормальность (проверяли при использовании критерия Шапиро-Уилкса). Все статистические вычисления проводили при использовании Лиоуа (дисперсионный анализ) (Тикеу-ΗδΌ (критерий Тьюки достоверно значимой разницы)) после логарифмического преобразования концентрации 1§О.
Опсонофагоцитоз.
Образцы сыворотки нагревали в течение 45 мин при 56°С для инактивации любого оставшегося эндогенного комплемента. 25-микролитровые аликвоты каждого образца сыворотки, разбавленного 1:2, серийно разводили (двукратно) в 25 мкл буфера для ОРА (ΗΒδδ (сбалансированный солевой раствор
- 13 023059
Хенкса) - 14,4% инактивированной ΡΒδ (фетальная бычья сыворотка)) на лунку 96-луночного микротитрационного планшета с круглым дном. Затем в разведенные сыворотки добавляли 25 мкл смеси активированных НЬ-60 клеток (1x10' клеток/мл), свежеразмороженного пневмококкового рабочего посевного материала и свежеразмороженного комплемента крольчат в соотношении, например, 4:2:1 (об./об./об.) с получением конечного объема 50 мкл. Аналитический планшет инкубировали в течение 2 ч при 37°С при ротационном перемешивании (210 об/мин) для стимулирования фагоцитарного процесса. Реакцию останавливали посредством помещения микропланшета на лед в течение по меньшей мере 1 мин. Затем 20 мкл аликвоту из каждой лунки планшета переносили в соответствующую лунку 96-луночного микропланшета с плоским дном и добавляли 50 мкл бульона Тодда-Хьюитта с 0,9% агара в каждую лунку. После инкубирования в течение ночи при 37°С и в атмосфере с 5% СО2 подсчитывали появившиеся на поверхности агара колонии пневмококка, применяя автоматическую систему анализа изображений (Κδ 400, 2е188. ОЬегкосЬеп, Оегтаиу). Восемь лунок без образца сыворотки использовали в качестве бактериальных контролей для определения числа пневмококков на лунку. Определяли среднее число КОЕ (колониеобразующая единица) в контрольных лунках и использовали для подсчета цитолитической активности для каждого образца сыворотки. Титр ОРА для образцов сыворотки определяли посредством реципрокного разбавления сыворотки, способной обеспечивать 50% лизис пневмококков. Опсонофагоцитарный титр подсчитывали, применяя 4-параметрический анализ подбора кривой.
Результаты анализировали статистически, приняв однородность дисперсии (проверяли с помощью критерия Кохрана) и нормальность (проверяли при использовании критерия Шапиро-Уилкса). Все статистические вычисления проводили при использовании Аиоуа (Тикеу-ΗδΌ) по логарифмическому преобразованию концентрации 1§О для ΕΟδΑ и критерия Крускала-Уоллиса по логарифму разведения для ОРА.
Значительно более высокий антителогенез был индуцирован у морских свинок после иммунизации Ρδ 23Р-СКМ197, конъюгированным посредством восстановительного аминирования, чем Ρδ 23РСКМ197, конъюгированным с помощью СОАР, как показано на фиг. 2.
Таблица 2
Анализ | 23Р-СКМ197, полученный посредством восстановительного аминирования | 23Р-СКМ197, полученный с помощью СЭАР |
Титр ЕИ5А (мкг/мл) | 213,3 | 40,5 |
ОРА (50% лизис) | 9232 | 591 |
Пример 4. Дополнительный пример восстановительного аминирования 23Р.
23Р-СКМ-КА-116.
150 мг природного Ρδ 23Р (Ρδ 23РР114) растворяли до достижения концентрации 2 мг/мл в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 4 ч. После растворения значение рН доводили до рН 6,0 с помощью 1 н. НС1. Затем добавляли 0,4 молярного эквивалента периодата (№1О4) в раствор Ρδ и инкубировали в течение 17 ч в темноте при 25°С. Затем раствор подвергали диафильтрации (отсечение 30 кДа) против VРI, и окисленный Ρδ фильтровали на 0,22 мкм мембране.
мг окисленного Ρδ и 75 мг СКМ197 лиофилизировали вместе (соотношение СКМ/Ρδ мас./мас.:1,5/1) в присутствии стабилизатора. Смесь лиофилизированных Ρδ и СКМ197 растворяли в 20 мл ДМСО в течение 2 ч при комнатной температуре (15-25°С). Затем добавляли 1 молярный эквивалент ТАВ (триацетоксиборгидрид натрия) (13,7 мг) и после перемешивания в течение 17 ч добавляли 2 молярных эквивалента №ВН4 (100 мг/мл в 0,1М №ОН) с последующим инкубированием при комнатной температуре в течение 30 мин. Раствор разбавляли в 5 раз посредством добавления VРI с последующей диафильтрацией (отсечение 30 кДа) против 10 мМ фосфатного буфера, 150 мМ ИаС1 рН 7,2. Конъюгат затем загружали на БЕАЕ смолу и элюировали в 10 мМ фосфатном буфере, 500 мМ ИаС1 рН 7,2. Конъюгат окончательно фильтровали на 0,22 мкм мембране. Полученный конъюгат имеет конечное соотношение СКМ/Ρδ мас./мас.:2,3/1.
Для дальнейших конъюгатов добавляли вторую стадию диафильтрации после ЭЕАЕ колонки для замены буфера (150 мМ ИаС1 в качестве конечного буфера).
Пример 5. Конъюгирование 6В с СКМ197 посредством восстановительного аминирования (с различными соотношениями белок:сахарид и микрофлюидизированными до различных размеров сахаридами 6В) и с помощью СОАГ.
6В-СКМ-КА-122.
200 мг микрофлюидизированного Ρδ 6В (84 кДа; 11,7 мг/мл) разводили до достижения концентрации 2 мг/мл в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,2). Значение рН доводили до рН 6,0 с помощью 1 н. НС1. Затем добавляли 0,1 молярного эквивалента периодата (№1О4) в раствор Ρδ и инкубировали в течение 17 ч в темноте при комнатной температуре. Затем раствор подвергали диафильтрации (отсечение 30 кДа) против VРI. 50 мг Ρδ и 30 мг СКМ197 лиофилизировали вместе (соотношение СКМ/Ρδ мас./мас.:0,6/1) в присутствии стабилизатора. Смесь лиофилизированных Ρδ и СКМ197 растворяли в 20 мл ДМСО в течение 3 ч при комнатной температуре. Затем добавляли 2,5 молярного эквивалента ТАВ (триацетоксиборгидрид натрия) (38,7 мг) и после перемешивания в течение 16 ч добавляли 2 молярных эквивалента
- 14 023059
NаВН4 (100 мг/мл в 0,1М №ОН) с последующим инкубированием при комнатной температуре в течение 30 мин. Раствор разбавляли в 4 раза посредством добавления \УН с последующей диафильтрацией (отсечение 100 кДа). Конъюгат затем фильтровали на 0,22 мкм мембране. Полученный конъюгат имеет конечное соотношение СКМ/Р8 мас./мас.:1,1/1.
6В-СРМ-КЛ-123.
Микрофлюидизированный Р8 6В (84 кДа) конъюгировали с СКМ197, как описано для 6В-СКМ-КА122, за исключением того, что стадию лиофильной сушки проводили при использовании начального соотношения СКМ197/Р8 2/1 мас./мас. и использовали 30 мл ДМСО для растворения на стадии растворения в ДМСО (вместо 20 мл). Полученный конъюгат имел конечное соотношение СКМ/Р8 мас./мас.:3,0/1.
6В-СРМ-КЛ-124.
200 мг микрофлюидизированного Р8 6В (350 кДа; 11,7 мг/мл), имеющего молекулярную массу 350 кДа, разводили до достижения концентрации 2 мг/мл в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,2). Значение рН доводили до рН 6,0 с помощью 1 н. НС1. Затем добавляли 0,1 молярного эквивалента периодата (№1О4) в раствор Р8 и инкубировали в течение 17 ч в темноте при комнатной температуре. Затем раствор подвергали диафильтрации (отсечение 100 кДа) против \УН. 50 мг Р8 и 60 мг СКМ197 лиофилизировали вместе (соотношение СКМ/Р8 мас./мас.:1,2/1) в присутствии стабилизатора. Смесь лиофилизированных Р8 и СКМ197 растворяли в 20 мл ДМСО в течение 5 ч при комнатной температуре. Затем добавляли 2,5 молярного эквивалента ТАВ (триацетоксиборгидрид натрия) (38,7 мг) и после перемешивания в течение 16 ч добавляли 2 молярных эквивалента NаВН4 (100 мг/мл в 0,1М №ЮН) с последующим инкубированием в течение 30 мин при комнатной температуре. Раствор разбавляли в 4 раза посредством добавления \УН с последующей диафильтрацией (отсечение 100 кДа). Конъюгат затем фильтровали на 0,22 мкм мембране. Полученный конъюгат имеет конечное соотношение СКМ/Р8 мас./мас.:1,6/1.
6В-СКМ-КА.-125.
Микрофлюидизированный Р8 6В (350 кДа) конъюгировали с СКМ197, как описано для 6В-СКМКА.-124, за исключением того, что стадию лиофильной сушки проводили при использовании начального соотношения СКМ197/Р8 2/1 мас./мас. и растворение в ДМСО проводили, используя 33 мл (вместо 20 мл). Полученный конъюгат имел конечное соотношение СКМ/Р8 мас./мас.:2,9/1.
6В-СКМ-003.
мг микрофлюидизированного Р8 6В разводили до достижения концентрации 10 мг/мл в воде (10 мг/мл). Добавляли Ν;·ιί'.Ί в твердой форме до достижения конечной концентрации 2М. Добавляли раствор СГОАР (100 мг/мл свежеприготовленного в ацетонитриле/ХУН, 50/50 об./об.) для достижения соответствующего соотношения СЭАР/Р8 (1,5 мг/мг Р8). Через 1,5 мин рН повышали до рН 9,5 посредством добавления 0,1 н. №ЮН и обеспечивали это значение рН до момента добавления СКМ197. Спустя 3 мин добавляли СКМ197 (10 мг/мл в 0,15 М №С1) для достижения соотношения СКМ197/Р8 2 мас./мас.; значение рН поддерживали на уровне рН 9,5. Раствор оставляли в течение 2 ч при регулировании рН.
После стадии сочетания добавляли к смеси 2,5 мл 2М раствора глицина. Значение рН доводили до значений ослабленного рН (рН 9,0). Раствор перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем конъюгат фильтровали, применяя фильтр на 5 мкм, и вводили в колонку 8еркасгу1 8400НК (ХК50/100) для удаления небольших молекул (включая ОМАР (диметиламинопиридин)) и неконъюгированных Р8 и белка. Скорость потока фиксировали при 30 мл/ч. Элюцию проводили в 150 мМ №С1. Представляющие интерес фракции объединяли и фильтровали на МШраск 20. Полученный конъюгат имел конечное соотношение СКМ197/Р8 мас./мас.:1,5/1.
6В-СКМ-КА-144.
г микрофлюидизированного Р8 6В (245 кДа; 9,47 мг/мл) разводили до достижения концентрации 2 мг/мл в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,2). Значение рН доводили до рН 6,0 с помощью 1 н. НС1. Затем добавляли 0,1 молярного эквивалента периодата (Ν:·ι1Ο4) в раствор Р8 и инкубировали в течение 18 ч в темноте при комнатной температуре. Затем раствор подвергали диафильтрации против \УН (8аг1осоп 8Псе200 Нубгокай 100 кДа). 200 мг окисленного Р8 и 240 мг СКМ197 лиофилизировали вместе (соотношение СКМ/Р8 мас./мас.:1,2/1) в присутствии стабилизатора. Смесь лиофилизированных Р8 и СКМ197 растворяли в 80 мл ДМСО в течение 6 ч при 25°С. Затем добавляли 2,5 молярного эквивалента ТАВ (триацетоксиборгидрид натрия) (154,9 мг) и после перемешивания в течение 16 ч при 25°С добавляли 2 молярных эквивалента NаВН4 (100 мг/мл в 0,1М №ГОН) и инкубировали в течение 30 мин. Раствор разбавляли в 5 раз в \УН и через 30 мин подвергали диафильтрации десять раз с 150 мМ №·ιθ и затем пять раз с 10 мМ РО4 (К/К2), рН 7,2 и 150 мМ №·ιθ (8айогш8 8айосоп 8Нсе 200 Нубгокай 100 кДа). Затем концентрат загружали на ЭЕАЕ колонку (ХК26/40). Колонку промывали буфером 10 мМ РО4(К/К2), рН 7,2/150 мМ №С1. Конъюгат элюировали буфером 10 мМ РО4 (К/К2), рН 7,2/500 мМ №С1. Элюат концентрировали и подвергали диафильтрации с 5 объемами 150 мМ №·ιθ и затем фильтровали на фильтре на 0,22 мкм. Полученный конъюгат имеет конечное соотношение СКМ/Р8 мас./мас.:1,6/1.
Пример 6. Иммуногенность конъюгатов 6В-СКМ197, полученных посредством восстановительного аминирования и с помощью СО АР.
Группу из 40 самок мышей линии Ва1Ь/с (4-недельные) иммунизировали внутримышечно три раза на 0,14 и 28 сутки с использованием 0,1 мкг конъюгатов Р8 6В, полученных посредством восстанови- 15 023059 тельного аминирования или с помощью СЭЛР. приготовленных в виде препаратов на А1РО4. Ρδ 6Β-ΡΌ использовали в качестве эталона. У мышей отбирали кровь на 42 сутки и измеряли антителогенез, направленный против каждого антигена, посредством ΕΠδΑ и ОРА.
Группу из 20 самок морских свинок (150 г от НагОсу) иммунизировали внутримышечно три раза на 0,14 и 28 сутки с использованием 0,25 мкг конъюгатов Ρδ 6Β, полученных посредством восстановительного аминирования или с помощью СЭАР, с добавлением в качестве адъюванта А1РО4. Ρδ 6Β-ΡΌ использовали в качестве эталона. У морских свинок отбирали кровь на 42 сутки и измеряли антителогенез, направленный против каждого антигена, посредством ΕΠδΑ и ОРА.
ОРА на мышах и морских свинках.
Образцы сыворотки нагревали в течение 45 мин при 56°С для инактивации любого оставшегося эндогенного комплемента. 25-микролитровые аликвоты каждого образца сыворотки, разбавленного 1:2, двукратно серийно разводили в 25 мкл буфера для ОРА (ΗΒδδ -14,4% инактивированной ΡΒδ) на лунку 96-луночного микротитрационного планшета с круглым дном. Затем в разведенные сыворотки добавляли 25 мкл смеси активированных НЬ-60 клеток (1х107 клеток/мл), свежеразмороженного пневмококкового рабочего посевного материала и свежеразмороженного комплемента крольчат в соотношении, например, 4/2/1 об./об./об. с получением конечного объема 50 мкл. Аналитический планшет инкубировали в течение 2 ч при 37°С при ротационном перемешивании (210 об/мин) для стимулирования фагоцитарного процесса. Реакцию останавливали посредством помещения микропланшета на лед в течение по меньшей мере 1 мин. Затем 20 мкл аликвоту из каждой лунки планшета переносили в соответствующую лунку 96луночного микропланшета с плоским дном и добавляли 50 мкл бульона Тодда-Хьюитта с 0,9% агара в каждую лунку. После инкубирования в течение ночи при 37°С и в атмосфере с 5% СО2 подсчитывали появившиеся на поверхности агара колонии пневмококка, применяя автоматическую систему анализа изображений (Κδ 400, Ζβίδδ, ОЪеткосйеи, Сетшаиу). Восемь лунок без образца сыворотки использовали в качестве бактериальных контролей для определения числа пневмококков на лунку. Определяли среднее число КОЕ в контрольных лунках и использовали для подсчета цитолитической активности для каждого образца сыворотки. Титр ОРА для образцов сыворотки определяли посредством реципрокного разбавления сыворотки, способной обеспечивать 50% лизис пневмококков. Опсонофагоцитарный титр подсчитывали, применяя 4-параметрический анализ подбора кривой.
В табл. 3 описаны уровни СМС (среднее геометрическое концентраций), полученные в результате иммунизации мышей линии Ра1Ъ/с конъюгатами, полученными способами по примеру 4.
Таблица 3
<31 | 02 | ОЗ | 04 | 05 | Об | |
Субъект /результат | Р806В-СКМ122 (Соотношение 1/1,Р8 84кДа) | Р306В-СКМ123 (Соотношение 3/1, РЗ 84 кДа) | Р306В-СКМ124 (Соотношение 1,5/1, Р8 350 кДа) | Р806В-СВМ125 (Соотношение 2,9/1, РЗ 350 кДа) | Р806В- СКМООЗ (СйАР) | ΡδΟβΒ-Ρϋ |
ОМС (мкг/мл) | 0.83 | 0.37 | 1.18 | 0,64 | 0,31 | 0,10 |
Респондеры (%) | 31/40 | 26/40 | 33/40 | 29/40 | 9/40 | 15/40 |
Иммуногенность этих конъюгатов у мышей линии Βа1Ъ/с показана на фиг. 3. Совместно на фиг. 3 и в табл. 3 продемонстрировано, что на модели с мышами конъюгаты, полученные посредством восстановительного аминирования, сопоставимы с конъюгатами, полученными с помощью ΟΟΑΡ. В частности, на фиг. 3 продемонстрировано, что иммуногенность конъюгатов, полученных посредством восстановительного аминирования, была выше, чем иммуногенность конъюгата, полученного с помощью ί',ΌΑΡ.
В табл. 4 описаны уровни СМС, полученные в результате иммунизации морских свинок конъюгатами, полученными способами по примеру 4.
Таблица 4
01 | 02 | <33 | 64 | 65 | Об | |
Субъект /результат | Р806В-СРМ122 (Соотношение 1/1, Р5 84кДа) | Р808В-СКМ123 (Соотношение 3/1, Р3 84 кДа) | Ρ806ΒΌΡΜ124 (Соотношение 1,5/1, РЗ 350 КДа) | Р306В-СРМ125 (Соотношение 2,9/1, Р5 350 кДа) | Р306В- СРМООЗ (СВАР) | Р506В-РО |
ОМС (мкг/мл) | 3,51 | 7,70 | 2,84 | 19,93 | 3,70 | 1,55 |
Респондеры (%> | 20/20 | 20/20 | 20/20 | 20/20 | 20/20 | 20/20 |
Иммуногенность этих конъюгатов у морских свинок показана на фиг. 4. Аналогичные экспериментам, проведенным на модели с мышами, результаты в табл. 4 и на фиг. 4 показывают, что конъюгаты, полученные посредством восстановительного аминирования, сопоставимы с конъюгатами, полученными с помощью ί-ΠΑΡ, в частности Ρδ06Β-ί'.'ΡΜ125 продемонстрировал значительно более высокие уровни СМС и иммуногенность, чем конъюгат, полученный с помощью ΓΌΑΡ.
Пример 7. Конъюгирование ШЪ со столбнячным анатоксином посредством восстановительного аминирования
ШЪ-Ю4-Ь8080.
2,9 г Ρδ (дозировка орсина, серия ΑНIΒСΡΑ007) растворяли в 260 мл 10 мМ фосфатного буфера (Ла/КД, рН 6,2 в течение 4 ч 30 мин при комнатной температуре и затем в течение ночи при 4°С. Наблюдение за вязкостью проводили во время растворения. Через 4 ч растворения вязкость, по-видимому, была стабильной. Ρδ разбавляли до концентрации 10 мг/мл фосфатным буфером и затем окисляли в темноте с помощью 0,07 молярного эквивалента Ла1О4 в течение 60 мин. Окисленный Ρδ подвергали диафильтрации (8айогш8 Нуйтокат! 2 кДа) против 3,5 объемов фосфатного буфера и затем фильтровали на фильтре
- 16 023059 на 0,22 мкм. Число повторяющихся структурных единиц, полученных после окисления, оценивали с помощью 'Н-ЯМР. и оно, как обнаружили, составляло приблизительно 21.
НтЪ-ТТ-Ь§210, 212 и 213.
200 мг окисленного Р8 (14,56 мг/мл) смешивали с 300 мг ТТ (31,18 мг/мл; соотношение ТТ/Ρδ мас./мас.:1,5/1) и разбавляли до достижения концентрации 4 мг/мл с помощью 36,64 мл 10 мМ фосфатного буфера (Ыа/К2), рН 6,2. Раствор лиофилизировали в присутствии стабилизатора. Смесь лиофилизированных Р§ и ТТ растворяли в 20 мл ДМСО в течение 6 ч при 25°С. Затем добавляли 10 мг-экв. ТАВ (триацетоксиборгидрид натрия) (38,7 мг) и после перемешивания в течение 16 ч добавляли 2 молярных эквивалента ЫаВН4 (100 мг/мл в 0,1М ΝαΟΗ) с последующим инкубированием в течение 30 мин при комнатной температуре. Раствор разбавляли в 3 раза посредством добавления \УН с последующей стадией диафильтрации (5 объемов \УН с последующими 5 объемами 10 мМ ацетатного буфера, 150 мМ №С1, рН 6,2, Μ\νίΌ (номинальное отсечение по молекулярной массе) 100 кДа).
Образец затем загружали на смолу 8ерЬаету1 8300НК. Элюцию проводили в 10 мМ ацетатном буфере при использовании 150 мМ ΝαΟ (рН 6,2). Представляющие интерес фракции объединяли и фильтровали на фильтре на 0,22 мкм. Полученные конъюгаты имели конечное соотношение ТТ/Ρδ мас./мас.:2,1/1.
Claims (16)
1. Способ конъюгирования бактериального сахарида, включающий стадии:
a) взаимодействия бактериального сахарида с 0,001-0,7 молярными эквивалентами периодата с образованием активированного бактериального сахарида;
b) взаимодействия активированного бактериального сахарида и белка-носителя с восстановителем с образованием конъюгата;
или
а) взаимодействия бактериального сахарида с 0,001-0,7 молярными эквивалентами периодата с образованием активированного бактериального сахарида;
Ъ') взаимодействия активированного бактериального сахарида с линкером при использовании восстановителя с образованием соединения бактериальный сахарид-линкер;
c) взаимодействия соединения бактериальный сахарид-линкер с белком-носителем с образованием конъюгата;
где стадия а) протекает в буфере, который не содержит аминогруппу и имеет концентрацию 1-100 мМ, и где бактериальный сахарид представляет собой капсульный сахарид δ.рηеитοη^ае 6В.
2. Способ по п.1, где рН на стадии а) составляет 3,5-8,0, 5,0-7,0 или 5,5-6,5 или приблизительно 6,0.
3. Способ конъюгирования бактериального сахарида, включающий стадии:
a) взаимодействия бактериального сахарида с 0,001-0,7 молярными эквивалентами периодата с образованием активированного бактериального сахарида;
b) взаимодействия активированного бактериального сахарида и белка-носителя с восстановителем с образованием конъюгата;
или
а) взаимодействия бактериального сахарида с 0,001-0,7 молярными эквивалентами периодата с образованием активированного бактериального сахарида;
Ъ') взаимодействия активированного бактериального сахарида с линкером при использовании восстановителя с образованием соединения бактериальный сахарид-линкер;
c) взаимодействия соединения бактериальный сахарид-линкер с белком-носителем с образованием конъюгата;
где стадия а) протекает в буфере, который не содержит аминогруппу и имеет концентрацию 1-100 мМ при рН 5,5-6,5, и где бактериальный сахарид представляет собой капсульный сахарид δ.рηеитοη^ае 23Р или 6В.
4. Способ по п.1 или 3, где буфер выбран из группы, состоящей из фосфатного буфера, малеатного буфера, ацетатного буфера, карбонатного буфера и цитратного буфера, возможно где буфер имеет концентрацию 1-50, 1-25, 1-10, 5-15, 8-12 или 10-50 мМ или приблизительно 10 мМ.
5. Способ по любому из пп.1-4, где средняя молекулярная масса бактериального сахарида составляет 1-1100, 100-470, 200-300, 600-1100 или 800-1000 кДа после стадии а).
6. Способ по любому из пп.1-5, где средняя молекулярная масса сахарида 23Р составляет 100-470 или 200-300 кДа после стадии а).
7. Способ по любому из пп.1-6, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из столбнячного анатоксина, фрагмента С столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина, СКМ197, пневмолизина, белка Ό, РЫИ, РИФЕ и N19.
8. Способ по любому из пп.1-7, где восстановитель включает цианборгидрид натрия или триацетоксиборгидрид натрия.
9. Способ по любому из пп.1-8, включающий дополнительную стадию е) очистки конъюгата.
- 17 023059
10. Способ по любому из пп.1-9, включающий дополнительную стадию смешивания конъюгата с дополнительными антигенами, возможно где дополнительные антигены включают по меньшей мере 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 сахаридов 8.рпеитошае, выбранных из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 8, 9Ν, 9У, 10А, 11А, 12Р, 14, 15В, 17Р, 18С, 19А, 19Р, 20, 22Р, 23Р и 33Р.
11. Способ по п.10, где дополнительные антигены включают один или более чем один белок 8.рпеитотае, выбранный из группы, состоящей из полигистидинового триадного семейства (РЫХ), семейства холинсвязывающих белков (СЪрХ), укороченных СЪрХ, Ру1Х-семейства, укороченных Ьу1Х, химерных белков (или слитых конструкций) укороченных СЪрХ-укороченных Ьу1Х, пневмолизина (Р1у), РкрА, РкаА, 8р128, 8р101, 8р130, 8р125 и 8р133.
12. Способ по любому из пп.1-11, где конъюгат смешивают с адъювантом или фармацевтически приемлемым эксципиентом.
13. Конъюгат, получаемый способом по любому из пп.1-12.
14. Иммуногенная композиция, содержащая конъюгат по п.13 и фармацевтически приемлемый эксципиент, где фармацевтический эксципиент при необходимости включает малеатный буфер.
15. Применение иммуногенной композиции по п.14 в предупреждении или лечении бактериального заболевания.
16. Способ предупреждения или лечения бактериальной инфекции, включающий введение иммуногенной композиции по п.14 пациенту.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB1003922.0A GB201003922D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-03-09 | Conjugation process |
PCT/EP2011/053400 WO2011110531A2 (en) | 2010-03-09 | 2011-03-07 | Conjugation process |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201290692A1 EA201290692A1 (ru) | 2013-06-28 |
EA023059B1 true EA023059B1 (ru) | 2016-04-29 |
Family
ID=42136725
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201290692A EA023059B1 (ru) | 2010-03-09 | 2011-03-07 | Способ конъюгирования бактериальных полисахаридов с белками-носителями |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US8753645B2 (ru) |
EP (2) | EP2544708B1 (ru) |
JP (1) | JP5698770B2 (ru) |
KR (2) | KR20130038233A (ru) |
CN (1) | CN102883745A (ru) |
AU (1) | AU2011226160B2 (ru) |
BR (1) | BR112012022358B1 (ru) |
CA (1) | CA2791926C (ru) |
CY (2) | CY1116685T1 (ru) |
DK (2) | DK2544708T3 (ru) |
EA (1) | EA023059B1 (ru) |
ES (2) | ES2545221T3 (ru) |
GB (1) | GB201003922D0 (ru) |
HR (2) | HRP20150935T1 (ru) |
HU (2) | HUE027621T2 (ru) |
LT (1) | LT2815762T (ru) |
ME (1) | ME02204B (ru) |
MX (2) | MX2012010388A (ru) |
PL (2) | PL2815762T3 (ru) |
PT (2) | PT2815762T (ru) |
RS (1) | RS54188B1 (ru) |
SG (2) | SG183476A1 (ru) |
SI (2) | SI2815762T1 (ru) |
SM (1) | SMT201500211B (ru) |
WO (1) | WO2011110531A2 (ru) |
ZA (1) | ZA201206637B (ru) |
Families Citing this family (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MX339524B (es) | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
GB0505518D0 (en) * | 2005-03-17 | 2005-04-27 | Chiron Srl | Combination vaccines with whole cell pertussis antigen |
BRPI0612669B8 (pt) | 2005-06-27 | 2021-05-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | composição imunogênica, vacina, composição, e composição liofilizada |
GB201003922D0 (en) * | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Conjugation process |
PT3246044T (pt) | 2010-08-23 | 2021-02-15 | Wyeth Llc | Formulações estáveis de antigénios de rlp2086 de neisseria meningitidis |
MX362802B (es) | 2010-09-10 | 2019-02-13 | Wyeth Llc Star | Variantes no lipidadas de antigenos orf2086 de neisseria meningitidis. |
GB201103836D0 (en) * | 2011-03-07 | 2011-04-20 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Conjugation process |
SA115360586B1 (ar) | 2012-03-09 | 2017-04-12 | فايزر انك | تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها |
CA2865745C (en) | 2012-03-09 | 2018-01-09 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
CN104736180A (zh) * | 2012-05-22 | 2015-06-24 | 诺华股份有限公司 | 脑膜炎球菌血清组x偶联物 |
WO2014097099A2 (en) * | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Pfizer Inc. | Glycoconjugation process |
JP6446377B2 (ja) | 2013-03-08 | 2018-12-26 | ファイザー・インク | 免疫原性融合ポリペプチド |
PL404247A1 (pl) | 2013-06-07 | 2014-12-08 | Wrocławskie Centrum Badań Eit + Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością | Koniugat oligocukru LOS Bordetella pertussis i toksyny krztuśca i jego zastosowanie w profilaktyce i leczeniu zakażeń wywoływanych przez Bordetella pertussis |
MX369534B (es) | 2013-09-08 | 2019-11-11 | Pfizer | Composiciones de neisseria meningitidis y sus metodos. |
PL3096783T3 (pl) | 2014-01-21 | 2021-12-13 | Pfizer Inc. | Polisacharydy otoczkowe streptococcus pneumoniae i ich koniugaty |
US11160855B2 (en) | 2014-01-21 | 2021-11-02 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
SG11201604728XA (en) | 2014-01-21 | 2016-08-30 | Pfizer | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
KR102049825B1 (ko) * | 2014-01-21 | 2019-12-03 | 화이자 인코포레이티드 | 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 및 그의 접합체 |
US9107906B1 (en) | 2014-10-28 | 2015-08-18 | Adma Biologics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency |
RU2723045C2 (ru) | 2015-02-19 | 2020-06-08 | Пфайзер Инк. | Композиции neisseria meningitidis и способы их получения |
JP7164200B2 (ja) | 2016-03-31 | 2022-11-01 | ポゴナ, エルエルシー | サッカライド-ポリペプチドコンジュゲートの組成物およびその使用の方法 |
SG11201901394XA (en) | 2016-09-02 | 2019-03-28 | Sanofi Pasteur Inc | Neisseria meningitidis vaccine |
WO2018126229A2 (en) | 2016-12-30 | 2018-07-05 | Sutrovax, Inc. | Polypeptide-antigen conjugates with non-natural amino acids |
US11951165B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-04-09 | Vaxcyte, Inc. | Conjugated vaccine carrier proteins |
WO2018144438A1 (en) | 2017-01-31 | 2018-08-09 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Methods for production of capsular polysaccharide protein conjugates from streptococcus pneumoniae serotype 19f |
US10183070B2 (en) | 2017-01-31 | 2019-01-22 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
US10259865B2 (en) | 2017-03-15 | 2019-04-16 | Adma Biologics, Inc. | Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection |
PE20201338A1 (es) | 2017-12-06 | 2020-11-25 | Merck Sharp & Dohme | Composiciones que comprenden conjugados de polisacarido de streptococcus pneumoniae con proteina y metodos de uso de estos |
WO2020010016A1 (en) | 2018-07-04 | 2020-01-09 | Sutrovax, Inc. | Self-adjuvanted immunogenic conjugates |
WO2020010000A1 (en) | 2018-07-04 | 2020-01-09 | Sutrovax, Inc. | Improved methods for the preparation of immunogenic conjugates |
BR112020026899A2 (pt) | 2018-07-04 | 2021-03-30 | Vaxcyte, Inc. | Melhorias em conjugados imunogênicos |
CN113453708A (zh) | 2018-12-19 | 2021-09-28 | 默沙东公司 | 包含肺炎链球菌多糖-蛋白缀合物的组合物及其使用方法 |
US20230405137A1 (en) | 2020-11-10 | 2023-12-21 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
CA3221075A1 (en) | 2021-05-28 | 2022-12-01 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4356170A (en) * | 1981-05-27 | 1982-10-26 | Canadian Patents & Development Ltd. | Immunogenic polysaccharide-protein conjugates |
WO2006082530A2 (en) * | 2005-02-01 | 2006-08-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics Srl | Conjugation of streptococcal capsular saccharides to carrier proteins |
WO2007000322A1 (en) * | 2005-06-27 | 2007-01-04 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
US20070184071A1 (en) * | 2005-04-08 | 2007-08-09 | Wyeth | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
Family Cites Families (89)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4057685A (en) | 1972-02-02 | 1977-11-08 | Abbott Laboratories | Chemically modified endotoxin immunizing agent |
US4235877A (en) | 1979-06-27 | 1980-11-25 | Merck & Co., Inc. | Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit |
DE3071552D1 (en) | 1979-09-21 | 1986-05-22 | Hitachi Ltd | Semiconductor switch |
US4902506A (en) | 1983-07-05 | 1990-02-20 | The University Of Rochester | Immunogenic conjugates |
US4673574A (en) | 1981-08-31 | 1987-06-16 | Anderson Porter W | Immunogenic conjugates |
US4459286A (en) | 1983-01-31 | 1984-07-10 | Merck & Co., Inc. | Coupled H. influenzae type B vaccine |
US4695624A (en) | 1984-05-10 | 1987-09-22 | Merck & Co., Inc. | Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency |
US4808700A (en) | 1984-07-09 | 1989-02-28 | Praxis Biologics, Inc. | Immunogenic conjugates of non-toxic E. coli LT-B enterotoxin subunit and capsular polymers |
US4596556A (en) | 1985-03-25 | 1986-06-24 | Bioject, Inc. | Hypodermic injection apparatus |
US4709017A (en) | 1985-06-07 | 1987-11-24 | President And Fellows Of Harvard College | Modified toxic vaccines |
IT1187753B (it) | 1985-07-05 | 1987-12-23 | Sclavo Spa | Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente |
US5173294A (en) | 1986-11-18 | 1992-12-22 | Research Foundation Of State University Of New York | Dna probe for the identification of haemophilus influenzae |
US4950740A (en) | 1987-03-17 | 1990-08-21 | Cetus Corporation | Recombinant diphtheria vaccines |
US4941880A (en) | 1987-06-19 | 1990-07-17 | Bioject, Inc. | Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly |
US4790824A (en) | 1987-06-19 | 1988-12-13 | Bioject, Inc. | Non-invasive hypodermic injection device |
US4940460A (en) | 1987-06-19 | 1990-07-10 | Bioject, Inc. | Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly |
US5339163A (en) | 1988-03-16 | 1994-08-16 | Canon Kabushiki Kaisha | Automatic exposure control device using plural image plane detection areas |
DE3841091A1 (de) | 1988-12-07 | 1990-06-13 | Behringwerke Ag | Synthetische antigene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
CA2006700A1 (en) | 1989-01-17 | 1990-07-17 | Antonello Pessi | Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines |
AU651949B2 (en) | 1989-07-14 | 1994-08-11 | American Cyanamid Company | Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines |
US5064413A (en) | 1989-11-09 | 1991-11-12 | Bioject, Inc. | Needleless hypodermic injection device |
US5312335A (en) | 1989-11-09 | 1994-05-17 | Bioject Inc. | Needleless hypodermic injection device |
IT1237764B (it) | 1989-11-10 | 1993-06-17 | Eniricerche Spa | Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici. |
SE466259B (sv) | 1990-05-31 | 1992-01-20 | Arne Forsgren | Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal |
EP0471177B1 (en) | 1990-08-13 | 1995-10-04 | American Cyanamid Company | Filamentous hemagglutinin of bordetella pertussis as a carrier molecule for conjugate vaccines |
US5153312A (en) | 1990-09-28 | 1992-10-06 | American Cyanamid Company | Oligosaccharide conjugate vaccines |
CA2059692C (en) | 1991-01-28 | 2004-11-16 | Peter J. Kniskern | Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine |
CA2059693C (en) | 1991-01-28 | 2003-08-19 | Peter J. Kniskern | Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae |
US5552146A (en) | 1991-08-15 | 1996-09-03 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis |
GB9118204D0 (en) | 1991-08-23 | 1991-10-09 | Weston Terence E | Needle-less injector |
NZ249704A (en) | 1992-02-11 | 1996-11-26 | Jackson H M Found Military Med | A two carrier immunogenic construct comprising a 70+ kd molecule conjugated to at least 1 t-dependent antigen, preparation, compositions containing the construct |
IT1262896B (it) | 1992-03-06 | 1996-07-22 | Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini. | |
CA2135052A1 (en) | 1992-05-06 | 1993-11-11 | R. John Collier | Diphtheria toxin receptor-binding region |
US5383851A (en) | 1992-07-24 | 1995-01-24 | Bioject Inc. | Needleless hypodermic injection device |
IL102687A (en) | 1992-07-30 | 1997-06-10 | Yeda Res & Dev | Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them |
DK0658118T3 (da) | 1992-08-31 | 2002-05-06 | Baxter Healthcare Sa | Vaccine mod Neisseria meningitidis, gruppe C |
US5569189A (en) | 1992-09-28 | 1996-10-29 | Equidyne Systems, Inc. | hypodermic jet injector |
US5334144A (en) | 1992-10-30 | 1994-08-02 | Becton, Dickinson And Company | Single use disposable needleless injector |
DE69431624T2 (de) | 1993-05-18 | 2003-07-10 | Univ Ohio State Res Found | Impfstoff gegen mittelohrentzündung |
ES2210262T3 (es) | 1993-09-22 | 2004-07-01 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Procedimiento que permite activar un glucido soluble con la ayuda de nuevos reactivos cianilantes para producir estructuras inmunogenas. |
WO1995024176A1 (en) | 1994-03-07 | 1995-09-14 | Bioject, Inc. | Ampule filling device |
US5466220A (en) | 1994-03-08 | 1995-11-14 | Bioject, Inc. | Drug vial mixing and transfer device |
US6455673B1 (en) | 1994-06-08 | 2002-09-24 | President And Fellows Of Harvard College | Multi-mutant diphtheria toxin vaccines |
US5917017A (en) | 1994-06-08 | 1999-06-29 | President And Fellows Of Harvard College | Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain |
US5565204A (en) | 1994-08-24 | 1996-10-15 | American Cyanamid Company | Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections |
US5599302A (en) | 1995-01-09 | 1997-02-04 | Medi-Ject Corporation | Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring |
WO1996029094A1 (en) | 1995-03-22 | 1996-09-26 | Andrew Lees | Producing immunogenic constructs using soluble carbohydrates activated via organic cyanylating reagents |
US6440425B1 (en) | 1995-05-01 | 2002-08-27 | Aventis Pasteur Limited | High molecular weight major outer membrane protein of moraxella |
US5730723A (en) | 1995-10-10 | 1998-03-24 | Visionary Medical Products Corporation, Inc. | Gas pressured needle-less injection device and method |
US5843464A (en) | 1995-06-02 | 1998-12-01 | The Ohio State University | Synthetic chimeric fimbrin peptides |
GB9513074D0 (en) | 1995-06-27 | 1995-08-30 | Cortecs Ltd | Novel anigen |
US6290970B1 (en) | 1995-10-11 | 2001-09-18 | Aventis Pasteur Limited | Transferrin receptor protein of Moraxella |
US5893397A (en) | 1996-01-12 | 1999-04-13 | Bioject Inc. | Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus |
US6090576A (en) | 1996-03-08 | 2000-07-18 | Connaught Laboratories Limited | DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella |
GB9607549D0 (en) | 1996-04-11 | 1996-06-12 | Weston Medical Ltd | Spring-powered dispensing device |
US7341727B1 (en) | 1996-05-03 | 2008-03-11 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same |
JP4012252B2 (ja) | 1996-06-18 | 2007-11-21 | アルザ コーポレイション | 薬剤の経皮放出又はサンプリングを高めるための装置 |
WO1998018930A2 (en) | 1996-10-31 | 1998-05-07 | Human Genome Sciences, Inc. | Streptococcus pneumoniae antigens and vaccines |
US5980898A (en) | 1996-11-14 | 1999-11-09 | The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command | Adjuvant for transcutaneous immunization |
CA2271167C (en) | 1996-12-20 | 2007-01-09 | Alza Corporation | Device and method for enhancing transdermal agent flux |
DK0959905T3 (da) | 1997-01-21 | 2010-04-06 | Sanofi Pasteur | Polysaccharid-peptid-konjugater |
US5993412A (en) | 1997-05-19 | 1999-11-30 | Bioject, Inc. | Injection apparatus |
WO1998055606A2 (en) | 1997-06-03 | 1998-12-10 | Connaught Laboratories Limited | Lactoferrin receptor genes of moraxella |
GB9713156D0 (en) | 1997-06-20 | 1997-08-27 | Microbiological Res Authority | Vaccines |
CA2312900A1 (en) | 1997-12-02 | 1999-06-10 | Powderject Vaccines, Inc. | Transdermal delivery of particulate vaccine compositions |
IT1298087B1 (it) | 1998-01-08 | 1999-12-20 | Fiderm S R L | Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni |
US7018637B2 (en) | 1998-02-23 | 2006-03-28 | Aventis Pasteur, Inc | Multi-oligosaccharide glycoconjugate bacterial meningitis vaccines |
GB9812613D0 (en) | 1998-06-11 | 1998-08-12 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
KR100704826B1 (ko) | 1998-08-19 | 2007-04-09 | 박스터 헬쓰케어 에스.에이. | N-아크릴로일화된 폴리사카라이드를 사용하여 제조된백신으로서 사용하기에 적합한 면역원성β-프로피온아미도-결합 폴리사카라이드 단백질 컨쥬게이트 |
JP4689044B2 (ja) | 1998-12-21 | 2011-05-25 | メディミューン,インコーポレーテッド | ワクチン用の肺炎連鎖球菌タンパク質と免疫原断片 |
EP1163000B1 (en) | 1999-03-19 | 2008-02-27 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Vaccine against antigens from bacteriae |
JP2002541808A (ja) | 1999-04-09 | 2002-12-10 | テクラブ, インコーポレイテッド | ポリサッカリド結合体ワクチンのための組換えトキシンaタンパク質キャリア |
US6319224B1 (en) | 1999-08-20 | 2001-11-20 | Bioject Medical Technologies Inc. | Intradermal injection system for injecting DNA-based injectables into humans |
US6494865B1 (en) | 1999-10-14 | 2002-12-17 | Becton Dickinson And Company | Intradermal delivery device including a needle assembly |
GB0007432D0 (en) | 2000-03-27 | 2000-05-17 | Microbiological Res Authority | Proteins for use as carriers in conjugate vaccines |
GB0103170D0 (en) | 2001-02-08 | 2001-03-28 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine composition |
GB0022742D0 (en) | 2000-09-15 | 2000-11-01 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
AU2002309706A1 (en) | 2001-05-11 | 2002-11-25 | Aventis Pasteur, Inc. | Novel meningitis conjugate vaccine |
KR20050086427A (ko) | 2002-11-07 | 2005-08-30 | 시너지 아메리카 인코포레이티드 | 폐렴균의 감염 치료 또는 예방용 조성물 및 방법 |
CN1798563A (zh) | 2003-05-15 | 2006-07-05 | 独立行政法人科学技术振兴机构 | 免疫刺激剂 |
US8048432B2 (en) | 2003-08-06 | 2011-11-01 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Polysaccharide-protein conjugate vaccines |
BRPI0413309B8 (pt) | 2003-08-06 | 2021-05-25 | The Government Of The Us Secretary Department Of Health And Human Services | método para a preparação de uma vacina conjugada de polissacarídeo-proteína |
GB0428394D0 (en) | 2004-12-24 | 2005-02-02 | Chiron Srl | Saccharide conjugate vaccines |
TWI445545B (zh) | 2005-04-08 | 2014-07-21 | Wyeth Corp | 多價肺炎球菌多醣-蛋白質共軛物組合物 |
US20070184072A1 (en) * | 2005-04-08 | 2007-08-09 | Wyeth | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
US20090010959A1 (en) | 2005-12-22 | 2009-01-08 | Ralph Leon Biemans | Pneumococcal Polysaccharide Conjugate Vaccine |
CN105267974A (zh) | 2007-06-20 | 2016-01-27 | 辉瑞爱尔兰制药公司 | 用于缀合疫苗的经过修饰的多糖 |
BRPI0813307C1 (pt) | 2007-06-26 | 2021-05-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | composição imunogênica, vacina, e, processo para fabricar a vacina |
GB201003922D0 (en) * | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Conjugation process |
-
2010
- 2010-03-09 GB GBGB1003922.0A patent/GB201003922D0/en not_active Ceased
-
2011
- 2011-03-07 SG SG2012062741A patent/SG183476A1/en unknown
- 2011-03-07 PT PT141810754T patent/PT2815762T/pt unknown
- 2011-03-07 ES ES11709065.4T patent/ES2545221T3/es active Active
- 2011-03-07 LT LTEP14181075.4T patent/LT2815762T/lt unknown
- 2011-03-07 ES ES14181075.4T patent/ES2636940T3/es active Active
- 2011-03-07 MX MX2012010388A patent/MX2012010388A/es active IP Right Grant
- 2011-03-07 MX MX2014009548A patent/MX351345B/es unknown
- 2011-03-07 DK DK11709065.4T patent/DK2544708T3/en active
- 2011-03-07 AU AU2011226160A patent/AU2011226160B2/en not_active Ceased
- 2011-03-07 PL PL14181075T patent/PL2815762T3/pl unknown
- 2011-03-07 BR BR112012022358-5A patent/BR112012022358B1/pt active IP Right Grant
- 2011-03-07 EP EP11709065.4A patent/EP2544708B1/en active Active
- 2011-03-07 HU HUE11709065A patent/HUE027621T2/en unknown
- 2011-03-07 SI SI201131268T patent/SI2815762T1/sl unknown
- 2011-03-07 HU HUE14181075A patent/HUE035971T2/en unknown
- 2011-03-07 US US13/581,824 patent/US8753645B2/en active Active
- 2011-03-07 JP JP2012556477A patent/JP5698770B2/ja active Active
- 2011-03-07 ME MEP-2015-121A patent/ME02204B/me unknown
- 2011-03-07 RS RS20150552A patent/RS54188B1/en unknown
- 2011-03-07 KR KR1020127026281A patent/KR20130038233A/ko active Application Filing
- 2011-03-07 EA EA201290692A patent/EA023059B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-03-07 PT PT117090654T patent/PT2544708E/pt unknown
- 2011-03-07 WO PCT/EP2011/053400 patent/WO2011110531A2/en active Application Filing
- 2011-03-07 CN CN2011800233222A patent/CN102883745A/zh active Pending
- 2011-03-07 DK DK14181075.4T patent/DK2815762T3/en active
- 2011-03-07 SG SG10201500413UA patent/SG10201500413UA/en unknown
- 2011-03-07 CA CA2791926A patent/CA2791926C/en active Active
- 2011-03-07 PL PL11709065T patent/PL2544708T3/pl unknown
- 2011-03-07 KR KR1020157036786A patent/KR20160005793A/ko not_active Application Discontinuation
- 2011-03-07 SI SI201130582T patent/SI2544708T1/sl unknown
- 2011-03-07 EP EP14181075.4A patent/EP2815762B1/en active Active
-
2012
- 2012-09-04 ZA ZA2012/06637A patent/ZA201206637B/en unknown
-
2014
- 2014-03-10 US US14/202,119 patent/US9265839B2/en active Active
- 2014-03-10 US US14/202,419 patent/US9265840B2/en active Active
-
2015
- 2015-09-07 HR HRP20150935TT patent/HRP20150935T1/hr unknown
- 2015-09-09 SM SM201500211T patent/SMT201500211B/xx unknown
- 2015-09-14 CY CY20151100798T patent/CY1116685T1/el unknown
-
2017
- 2017-07-28 HR HRP20171161TT patent/HRP20171161T1/hr unknown
- 2017-08-22 CY CY20171100888T patent/CY1119244T1/el unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4356170A (en) * | 1981-05-27 | 1982-10-26 | Canadian Patents & Development Ltd. | Immunogenic polysaccharide-protein conjugates |
WO2006082530A2 (en) * | 2005-02-01 | 2006-08-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics Srl | Conjugation of streptococcal capsular saccharides to carrier proteins |
US20070184071A1 (en) * | 2005-04-08 | 2007-08-09 | Wyeth | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
WO2007000322A1 (en) * | 2005-06-27 | 2007-01-04 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ANDERSON ET AL.: "Vaccines consisting of periodate-cleaved oligosaccharides from the capsule of Haemophilus influenzae type b coupled to a protein carrier: structural and temporal requirements for priming in the human infant.", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 137, no. 4, 1 August 1986 (1986-08-01), pages 1181-1186, XP55007229, ISSN: 0022-1767 the whole document * |
KIM J.S. ET AL.: "Monitoring activation sites on polysaccharides by GC-MS", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, ACADEMIC PRESS INC, NEW YORK, vol. 358, no. 1, 1 November 2006 (2006-11-01), pages 136-142, XP024942320, ISSN: 0003-2697, DOI: 10.1016/J.AB.2006.08.016 [retrieved on 2006-11-01] the whole document * |
STEINHOFF M.C. ET AL.: "A RANDOMIZED COMPARISON OF THREE BIVALENT STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE GLYCOPROTEIN CONJUGATE VACCINES IN YOUNG CHILDREN: EFFECT OF POLYSACCHARIDE SIZE AND LINKAGE CHARACTERISTICS" THE PEDIATRIC INFECTIOUS DISEASE JOURNAL, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, US, vol. 13, no. 5, 1 May 1994 (1994-05-01), pages 368-372, XP000600692, ISSN: 0891-3668, DOI: 10.1097/00006454-199405000-00007 the whole document * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA023059B1 (ru) | Способ конъюгирования бактериальных полисахаридов с белками-носителями | |
KR101511392B1 (ko) | 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물 | |
TWI789357B (zh) | 多價肺炎球菌多醣-蛋白質共軛物組成物(二) | |
KR101511393B1 (ko) | 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물 | |
KR101730749B1 (ko) | 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물 | |
JP5976017B2 (ja) | コンジュゲーション方法 | |
US20230338498A1 (en) | Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof | |
KR20190121330A (ko) | 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드-단백질 접합체의 면역원성의 증진 | |
KR20090094163A (ko) | 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물 | |
US20220233674A1 (en) | An immunogenic serotype 35b pneumococcal polysaccharide-protein conjugate and conjugation process for making the same | |
JP2022000449A (ja) | 多価肺炎球菌多糖体−タンパク質複合体組成物 | |
JP2021512870A (ja) | 多価肺炎球菌多糖体−タンパク質複合体組成物 | |
TW201811362A (zh) | 多價肺炎球菌多醣-蛋白質共軛物組成物(一) | |
KR20220016964A (ko) | 에스. 뉴모니아에 혈청형 29에 대해 보호하는 면역원성 조성물을 사용하여 환자를 치료하는 방법 | |
RU2774891C2 (ru) | Повышение иммуногенности конъюгатов полисахарид streptococcus pneumoniae-белок |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |