KR20050086427A

KR20050086427A - 폐렴균의 감염 치료 또는 예방용 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20050086427A
Application number: KR1020057008095A
Authority: KR
Inventors: 미카엘 씨. 첸; 장-지윤 치오우; 종밍 리; 동-셍 첸
Original assignee: 시너지 아메리카 인코포레이티드
Priority date: 2002-11-07
Filing date: 2003-11-06
Publication date: 2005-08-30
Also published as: EP1558280A4; JP2012139221A; EP1558280B1; HK1074005A1; CA2504938C; US20040213803A1; TW200418502A; CA2504938A1; CN1711105A; CN100443116C; TWI315986B; AU2003291365B2; AU2003291365A1; US7585669B2; ES2451620T3; WO2004043376A2; US20080199952A1; JP2010057501A; WO2004043376A3; JP2006506989A

Abstract

본 발명은 폐렴균 감염의 치료 및 예방을 위한 폴리펩타이드, 다당류-폴리펩타이드 접합체 및 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 포유류에 투여시, 항-폐렴균 면역 반응을 유도한다. 본 발명의 조성물은 개체에 백신을 주사하는 예방학적인 측면으로 사용되거나 및/또는 감염된 개체에서 치료학적 면역 반응을 유도하는 치료학적인 측면으로 사용될 수 있다.

Description

폐렴균의 감염 치료 또는 예방용 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING OR PREVENTING PNEUMOCOCCAL INFECTION}

이건 출원은 2002년 11월 7일 출원한 미국 가출원번호 제 60/424,497호를 우선권으로 주장한다. 선출원의 전체 내용은 원용에 의해 본원에 통합된다.

본 발명은 폴리펩타이드, 폐렴균 다당류-폴리펩타이드 접합체, 폐렴균 폴리펩타이드를 코딩하는 발현 벡터, 항-폐렴균 면역 반응을 유발하는 방법 및 폐렴균 감염을 치료 및 예방하는 방법에 관한 것이다.

스트렙토코커스 뉴모니아(S. pneumoniae)는 흔히 어린이, 노인 및 면역결핍성 개체에서 세균성 폐렴, 뇌막염, 중이염 및 균혈증을 발생시킨다. 스트렙토코커스 뉴모니아는, 캡슐 다당류를 토대로 약 90개의 혈청형으로 분류될 수 있다. 그러나, 일반적으로 약 30 종의 스트렙토코커스 분리형에 의해 질병이 유발된다. 세계 보건 기구는 폐렴균 뇌막염 및 패혈증으로 매년 백만명의 어린이가 사망하고 있으며, 그중 98%가 개발도상국에서 발생되는 것으로 추산하고 있다. 항생제 내성을 갖는 폐렴균주의 출현으로, 항생제와 더불어 폐렴균 감염을 치료 및 예방할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다.

도 1은 혈청형 14의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역화한 마우스에서 유발된 항-뉴몰리신 IgG 항체 생성을 나타낸 그래프이다.

도 2는 혈청형 14의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역화한 마우스에서 유발된 항-뉴몰리신 IgG 항체 생성을 나타낸 그래프이다.

도 3은 혈청형 18C의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역화한 마우스에서 유발된 항-뉴몰리신 IgG 항체 생성을 나타낸 그래프이다.

도 4는 혈청형 18C의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역화한 마우스에서 유발된 항-뉴몰리신 IgG 항체 생성을 나타낸 그래프이다.

도 5는 혈청형 19F의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역화한 마우스에서 유발된 항-뉴몰리신 IgG 항체 생성을 나타낸 그래프이다.

도 6은 혈청형 19F의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역화한 마우스에서 유발된 항-뉴몰리신 IgG 항체 생성을 나타낸 그래프이다.

도 7은 혈청형 23F의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역화한 마우스에서 유발된 항-뉴몰리신 IgG 항체 생성을 나타낸 그래프이다.

도 8은 혈청형 23F의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역화한 마우스에서 유발된 항-뉴몰리신 IgG 항체 생성을 나타낸 그래프이다.

도 9는 혈청형 4의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역화한 마우스에서 유발된 항-뉴몰리신 IgG 항체 생성을 나타낸 그래프이다.

도 10은 혈청형 4의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역화한 마우스에서 유발된 항-뉴몰리신 IgG 항체 생성을 나타낸 그래프이다.

도 11은 혈청형 6B의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역화한 마우스에서 유발된 항-뉴몰리신 IgG 항체 생성을 나타낸 그래프이다.

도 12는 혈청형 6B의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역화한 마우스에서 유발된 항-뉴몰리신 IgG 항체 생성을 나타낸 그래프이다.

도 13은 혈청형 9V의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역화한 마우스에서 유발된 항-뉴몰리신 IgG 항체 생성을 나타낸 그래프이다.

도 14는 혈청형 9V의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역화한 마우스에서 유발된 항-뉴몰리신 IgG 항체 생성을 나타낸 그래프이다.

도 15는 혈청형 14의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체의 3차 주사후 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 14에 대한 항체 반응을 나타낸 그래프이다.

도 16은 슈도뉴몰리신 DNA 백신 접종에 있어서 프라임-부스트 면역법을 이용한 토끼에서의 뉴몰리신에 대한 항체 반응을 나타낸 그래프이다.

도 17은 폐렴균 표면 단백질 A DNA 백신을 코드화하는 발현벡터를 주산 한 후, 항체 반응을 나타낸 그래프이다

도 18은 오토리신 DNA 백신을 코드화하는 발현 벡터를 주사한 후, 항체 반응을 나타낸 그래프이다.

도 19는 혈청형 14 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역시킨 후 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 14로 시험감염(chanllenge)시킨 마우스에서의 세균 제거능을 나타낸 그래프이다.

도 20은 혈청형 14 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역시킨 후 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 7로 시험감염(chanllenge)시킨 마우스에서의 세균 제거능을 나타낸 그래프이다.

도 21은 혈청형 14 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역시킨 후 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 6B로 시험감염(chanllenge)시킨 마우스에서의 세균 제거능을 나타낸 그래프이다.

도 22는 혈청형 14 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역시킨 후 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 18C로 시험감염(chanllenge)시킨 마우스에서의 세균 제거능을 나타낸 그래프이다.

도 23은 혈청형 14 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역시킨 후 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 23F로 시험감염(chanllenge)하여 1시간 경과하였을때의 세균 제거능을 나타낸 그래프이다.

도 24는 혈청형 14 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역시킨 후 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 23F로 시험감염(chanllenge)하여 3시간 경과하였을때의 세균 제거능을 나타낸 그래프이다.

도 25는 혈청형 14 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역시킨 후 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 23F로 시험감염(chanllenge)하여 5시간 경과하였을때의 세균 제거능을 나타낸 그래프이다.

발명의 개요

일면에 있어서, 본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니아의 캡슐 다당류와 접합된 폴리펩타이드를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상기 폴리펩타이드는 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질의 약 400개 이상의 연속된 아미노산 단편을 포함하며, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 서열 KVEND(서열번호: 22)를 예를들면, 카르복시 말단에 포함하지 않으며 용혈성이 없으며, 상기 조성물은 포유류에 투여하였을 때 스트렙토코커스 뉴모니아에 대한 면역 반응(예, 체액성 면역반응 및/또는 세포성 면역 반응)을 유도한다. 상기 면역 반응은 예방학적 및/또는 치료학적 면역 반응일 수 있다.

스트렙토코커스 뉴모니아의 뉴몰리신 단백질은, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일예로, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 460번까지의 아미노산들을 포함한다. 다른 예로서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 464번까지의, 서열번호 1의 1에서 465번까지의, 서열번호 1의 1 에서 466번까지의, 서열번호 1의 1에서 469번까지의, 또는 서열번호 1의 1에서 470번까지의 아미노산들을 포함한다.

상기 폴리펩타이드에는 아미노산 서열 EDKVEND(서열번호 23) 또는 YPQVEDKVEND(서열번호 24)가 선택적으로 결핍되어 있을 수 있다.

일예로서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1에 있어서, 1에서 460번까지의, 1에서 464번까지의, 1에서 465번까지의, 1 에서 466번까지의, 1에서 469번까지의, 또는 1에서 470번까지의 아미노산 잔기들로 이루어진다.

일예로서, 상기 캡슐 다당류는 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시예에 있어서, 상기 캡슐 다당류는 혈청형 14이다. 다른 실시예에 있어서, 상기 캡슐 다당류는 혈청형 18C이다. 상기 조성물은 선택적으로 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F로 이루어진 군으로부터 선택되는 서로 다른 캡슐 다당류를 복수개 포함할 수 있다.

상기 조성물에 의해 유발되는 면역 반응은, 스트렙토코커스 뉴모니아의 캡슐 다당류, 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질, 또는 스트렙토코커스 뉴모니아 캡슐 다당류 및 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질에 대한 것일 수 있다.

다른 측면으로, 본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질의 400개 이상의 연속된 아미노산 단편을 함유하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 뉴클레오타이드 서열이, 작동가능하도록 연결된 프로모터를 포함하는 포유류 발현 벡터에 관한 것으로, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 서열 KVEND(서열번호: 22)를 예를들면 카르복시 말단에 포함하지 않고 용혈성이 없으며, 상기 발현 벡터를 포유류에 투여하였을 때 스트렙토코커스 뉴모니아에 대한 면역 반응(예, 체액성 면역반응 및/또는 세포성 면역 반응)을 유도한다. 상기 면역 반응은 예방학적 및/또는 치료학적 면역 반응일 수 있다.

스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일예로, 상기 코드화된 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 460번까지의 아미노산들을 포함한다. 다른 예로서, 상기 코드된 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 464번까지의, 서열번호 1의 1에서 465번까지의, 서열번호 1의 1 에서 466번까지의, 서열번호 1의 1에서 469번까지의, 또는 서열번호 1의 1에서 470번까지의 아미노산들을 포함한다.

상기 코드화된 폴리펩타이드에는 아미노산 서열 EDKVEND(서열번호 23) 또는 YPQVEDKVEND(서열번호 24)가 선택적으로 결핍되어 있을 수 있다.

상기 코드화된 폴리펩타이드에 의해 유발되는 면역 반응은 스트렙토코커스 뉴모니아의 뉴몰리신 단백질에 대한 것일 수 있다.

다른 측면으로, 본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니아의 오토리신 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 함유하는 뉴클레오타이드 서열이 작동가능하도록 연결된 프로모터를 포함하는 포유류 발현 벡터에 관한 것으로, 상기 폴리펩타이드는 상기 발현 벡터가 포유류에 투여되었을 때 스트렙토코커스 뉴모니아에 대한 면역 반응(예, 체액성 면역반응 및/또는 세포성 면역 반응)을 유도한다. 상기 면역 반응은 예방학적 및/또는 치료학적 면역 반응일 수 있다.

일예로서, 상기 코드화된 폴리펩타이드는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 예로서, 상기 코드화된 폴리펩타이드는 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진다.

다른 측면으로, 본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니아의 표면 단백질 A 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 함유하는 뉴클레오타이드 서열이 작동가능하도록 연결된 프로모터를 포함하는 포유류 발현 벡터에 관한 것으로, 상기 폴리펩타이드는 상기 발현벡터를 포유류에 투여하였을 때 스트렙토코커스 뉴모니아에 대한 면역 반응(예, 체액성 면역반응 및/또는 세포성 면역 반응)을 유도한다. 상기 면역 반응은 예방학적 및/또는 치료학적 면역 반응일 수 있다.

일예로서, 상기 코드화된 폴리펩타이드는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 예로서, 상기 코드화된 폴리펩타이드는 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진다.

다른 측면으로, 본 발명은 서열번호 1의 1에서 460번까지의, 1에서 464번까지의, 1에서 466번까지의 및 1에서 469번까지의 아미노산들로 이루어진 폴리펩타이드에 관한 것이다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 본원에 기재된 조성물을, 포유류에서 스트랩토코커스 뉴모니아에 대한 면역 반응이 유도되는 유효량으로, 포유류에 투여함으로써 포유류에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

일예로서, 상기 면역 반응은 상기 조성물내 존재하는 캡슐 다당류의 혈청형과는 서로 다른 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형(예, 혈청형 7, 6B, 18C 또는 23F) 1종 이상에 대하여 교차 반응성을 갖는다. 일예로서, 상기 면역 반응은 스트렙토코커스 속에 속하는 스트렙토코커스 뉴모니아를 제외한 1종 이상의 균주에 대해 교차 반응성을 갖는다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 본원에 기재된 발현 벡터(예, 뉴몰리신, 슈도뉴몰리신, 오토리신 또는 폐렴균의 표면 단백질A 발현 벡터)를, 포유류에서 스트랩토코커스 뉴모니아에 대한 면역 반응이 유도되는 유효량으로, 포유류에 투여함으로써 포유류에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기 면역 반응은 예방학적 및/또는 치료학적 면역 반응이다. 일예로, 상기 면역 반응은 스트렙토코커스 뉴모니아를 제외한 스트렙토코커스 속에 속하는 1종 이상의 균주에 대하여 교차 반응성을 갖는다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 폴리펩타이드 또는 이의 항원성 단편을 코딩하고 있는 핵산을 포함한 뉴클레오타이드 서열이 작동가능하도록 연결된 프로모터를 포함하는 포유류 발현 벡터를 투여하는 단계; 및 정제된 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 폴리펩타이드 또는 그것의 항원성 단편을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이고, 상기 병용 투여는 포유류에서의 스트렙토코커스 뉴모니아의 뉴몰리신에 대한 면역 반응을 유도한다.

일 실시예에 있어서, 상기 포유류에 상기 발현 벡터를 2회 이상, 3회 이상 또는 그 이상의 별도의 투여로 처방한다. 상기 투여는 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상 및 그 이상으로, 선택적으로 구별될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니아의 뉴몰리신 폴리펩타이드 또는 그것의 항원성 단편은, 상기 발현 벡터 투여 이후 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상 또는 그 이상 경과후 투여될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니아를 제외한 세균성 다당류가 접합된 폴리펩타이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 폴리펩타이드는 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질의 약 400개 이상으로 연속된 아미노산 단편을 포함하며, 상기 폴리펩타이드는 KVEND(서열번호 22)의 아미노산 서열이 결핍되어 있으며 용혈성이 없으며, 상기 조성물은 포유류에 투여하였을 때 스트렙토코커스 뉴모니아를 제외한 세균에 대하여 면역 반응을 유도한다. 일실시예로, 스트렙토코커스 뉴모니아를 제외한 세균은 폐렴균, 헤모필러스 인플루엔자 b형, 수막구균성 그룹 A, B 또는 C 및 그룹 B 스트렙토코커스 형 Ia, Ib, II, III, V 또는 VIII로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 조성물은 포유류에서 스트렙토코커스 뉴모니아를 제외한 세균에 대하여 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있는 함량으로 포유류에 투여함으로써, 포유류에서 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다.

다른 측면으로, 본 발명은 본원에 기재된 조성물 또는 폴리펩타이드에 결합하는(예, 선택적으로 결합한다) 정제된 항원에 관한 것이다. 예를 들어, 항체는 스트렙토코커스 뉴모니아의 캡슐 다당류에 접합된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 폴리펩타이드는 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질의 400개 이상의 연속된 아미노산 단편을 포함하며, 상기 폴리펩타이드는 KVEND(서열번호 22)의 아미노산 서열이 예를 들면, C-말단에 결핍되어 있고, 용혈성이 없으며, 상기 조성물은 포유류에 투여하였을 때 스트렙토코커스 뉴모니아에 대하여 면역 반응(예, 체액성 면역 반응 및/또는 세포성 면역 반응)을 유도한다. 이러한 항체는, 예컨대 단일클론 항체 또는 다중클론 항체일 수 있다. 하이브리도마와 같은 세포주는 본원에서 기재된 항체를 분비하도록 제조될 수 있다. 상기 항체는 포유류에 치료학적 또는 예방학적 유효량으로 정제된 항체를 투여함으로써 포유류에서 스트렙토코커스 뉴모니아 감염을 치료 또는 예방하는 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 잇점은, 일 예로서, 제1 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 다당류-폴리펩타이드 접합체는, 제2 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형의 감염에 대하여 예상치 못했던 교차-예방성(cross-protection)을 제공할 수 있다는 것이다. 이러한 교차-예방성은 1종 이상의 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형의 감염을 치료 및 예방함에 있어서 상기 접합체의 효능을 증가시킬 수 있다. 따라서, 다수의 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형에 대한 예방이 각 특이 혈청형에 대한 접합체를 필수적으로 제공하지 않고도 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 장점은, 일 예로서, 슈도뉴몰리신 폴리펩타이드에는 용혈성이 결핍되어 있다는 것이다. 따라서, 이러한 슈도뉴몰리신 접합체 및 발현 벡터는 천연의 용혈성 뉴몰리신 또는 일부 용혈성을 갖는 독성화된(toxoided) 뉴몰리신을 포함하는 조성물에 비하여, 독성이 감소되거나 또는 무독성이다.

본 발명의 또 다른 장점은, 일 예로서, 뉴몰리신 절단체(truncate)를 코딩하는 발현 벡터는 뉴몰리신 점 돌연변이를 코딩하는 핵산과는 대조적으로, 용혈성 독성 단백질을 코딩하도록 복구되지 않는다는 것이다. 뉴몰리신 절단체는 용혈성을 제공하는 뉴몰리신 부위가 결손되어 있으므로, 발현 벡터의 뉴클레오타이드 서열내 어떤 돌연변이도 독성을 재생할 수 없다.

특별히 언급하지 않는 한, 본원에서, 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일하다. 본원에서 기재된 바와 유사 또는 동등한 방법 및 물질은, 본 발명의 실시 및 검증에 사용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질은 아래에 기술되어 있다. 본원에서 언급된 모든 공개물, 특허 출원, 특허 및 그외 참고자료는 원용에 의해 그 전체로서 본원에 통합된다. 용어에서 상충되는 경우, 본 명세서에 사용된 것을 우선으로 한다. 또한 기술된 물질 및 방법은 단시 예시의 목적일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다.

그외 본 발명의 구성 및 장점은 하기 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 명확하게 이해될 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 폐렴균 감염의 치료 또는 예방에 있어서의 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 기재된 폴리펩타이드, 다당류-폴리펩타이드 접합체 및 발현 벡터는 포유류에 투여시 포유류에서 항-페렴균 면역 반응을 유발한다. 이러한 조성물은 예방학적으로 사용되어 개체에 백신 주사되거나 또는 치료학적으로 사용되어 감염된 개체에서 치료학적 면역 반응을 유도할 수 있다.

다당류-단백질 접합체

폴리펩타이드는 스트렙토코커스 뉴모니아의 캡슐 다당류에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 접합될 수 있다. 통상, 접합체의 폴리펩타이드 성분은: 스트렙토코커스 뉴모니아의 뉴몰리신 단백질의 일부 또는 스트렙토코커스 뉴모니아의 뉴몰리신 단백질 돌연변이 중 어느 하나를 포함하며; KVEND(서열번호 22)의 아미노산 서열이 결손되어 있으며; 및 용혈성이 없다. 상기 다당류-폴리펩타이드 접합체는 포유류에 투여시 스크렙토코커스 뉴모니아에 대하여 면역 반응을 발생시킨다. 상기 면역 반응은 상기 폴리펩타이드, 상기 다당류 또는 상기 폴리펩타이드와 상기 다당류의 조합체에 대한 것일 수 있다.

상기 접합체의 폴리펩타이드 성분은 재조합 DNA 기술을 이용하거나 천연물로부터 정제하거나 또는 화학적으로 합성하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 상기 폴리펩타이드 구성성분은 자연적으로 생성되는 스트렙토코커스 뉴모니아의 뉴몰리신 단백질과는 아미노산 서열상 차이가 있다. 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19A의 뉴몰리신 폴리펩타이드 서열은, 서열번호 1로 기재한다(참조 실시예 1). 접합체를 이루는 폴리펩타이드의 성분의 예로는, 서열번호 1의 1-460, 1-461, 1-462, 1-463, 1-464, 1-465, 1-466, 1-469 및 1-470의 아미노산들을 포함하나, 이에 한정되진 않는다.

절단된 또는 돌연변이된 형태의 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질을 코드화하는 핵산은 예컨대, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의하여 제조할 수 있다. 이러한 단백질을 코드화하는 핵산은, 특정 발현 시스템에서 주어진 코돈, 바람직하거나 또는 바람직하지 않은 코돈으로 선택될 수 있다. 즉, 상기 핵산은 코돈 1개 이상, 바람직하기로는 코돈들의 10% 이상 또는 20 % 이상이 변형된 것일 수 있으며, 이러한 서열은 E.coli, 효모, 인간, 곤충 또는 CHO 세포에서 발현을 위해 최적화된 것이다.

절단된 또는 돌연변이된 형태의 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질을 코드화하는 핵산은, (1) 폐렴균의 다른 단백질, 즉 오토리신, 표면 단백질A, 뉴라미니데이즈, 히알루로네이트 라이세이트, 콜린 결합성 단백질A, 또는 (2) 다른 생물에서 유래된, 비-폐렴균성 단백질, 예컨대 헤모필러스 인플루엔자 b, 수막구균 그룹 A, B, 또는 C, 또는 스트렙토코커스 그룹 B를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열에 융합될 수 있다. 이러한 융합된 단백질을 코드화하는 핵산은 발현 시스템에서 발현된다.

숙주는 이러한 운반체 폴리펩타이드에 대한 기존재성 항체(pre-existing antibody)가 결핍되어 있을 수 있으므로, 뉴몰리신 절단체는 다당류의 유용한 운반체일 수 있다. 뉴몰리신은 폐렴균 감염에 있어서 독성인자이며, 혈청형이 다른 폐렴균들에서 뉴몰리신의 항원성 다양성은 거의 없다.

인간과 같은 포유류에 투여시, 다당류-단백질 접합체는 다당류만을 단독으로 포유류에 투여하였을때 유도되는 면역 반응에 비하여, 강도, 형태 및/또는 지속력에서 있어서 보다 증가된 면역 반응을 유도한다. 따라서, 상기 폴리펩타이드 성분은, 이와같이 증강된 면역 반응을 유도할 수 있기에 충분한 크기를 가져야 한다. 천연의 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질의 단편에 있어서, 상기 단편은 적어도 8개 이상, 10개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 125개 이상, 150개 이상, 175개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 350개 이상, 400개 이상, 425개 이상, 450개 이상, 460개 이상, 465개 이상, 460개 이상, 465개 이상 및 그 이상의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다. 천연의 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질의 서열에 있어서, 변이성을 갖는 폴리펩타이드의 경우, 상기 폴리펩타이드는 천연의 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질, 즉 서열번호 1과 적어도 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 그 이상의 상동성을 갖을 수 있다.

상기 폴리펩타이드 성분은, 바람직하기로는 자연적으로 발생되는 스트렙토코커스 뉴모니아의 뉴몰리신 단백질내에 존재하는 용혈성이 결핍된 것이다. 통상, 상기 폴리펩타이드 성분은, 천연의 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질의 용혈성에 비하여 30% 미만의, 20% 미만의, 10% 미만의, 5% 미만의, 1% 미만의 또는 이보다 낮은 용혈성을 나타낸다. 용혈성은 실시예 3에 구체화한 바에 따라 측정할 수 있다. 대개, 폴리펩타이드의 용혈성은, 폴리펩타이드를 적혈구, 예를들면 양 적혈구와 함께 반응시키고, 상기 폴리펩타이드에 의해 유도된 용혈을 측정함으로써 결정할 수 있다(용혈성 분석을 예시한 것으로, Owem et al.(1994) FEMS Microbiology Letters 121:217-222를 참조).

상기 접합체의 다당류 성분은 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V,10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 19A, 20, 22F, 23A, 23F, 24F, 27, 33F 또는 34의 혈청형에 한정되진 않으나, 이들 중 어느 하나의 스트렙토코커스 뉴모니아 캡슐 다당류일 수 있다. 일예로서, 상기 캡슐 다당류는 형청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 또는 23F로부터 선택된다. 일예로서, 상기 다당류는 혈청형 14이다. 다른 예로서, 상기 다당류는 혈청형 18C이다. 1종 이상의 다른 캡슐 다당류는 하나의 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드에 접합될 수 있다. 예컨대, 다가 접합체는 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 또는 10 이상의 다른 캡슐 다당류를 포함할 수 있다. 다당류는 예컨대 단량성 연결(monomeric linkage, 다당류의 한쪽 말단에만 폴리펩타이드가 접착됨), 루프형 연결(단일 폴리펩타이드는 루프형 다당류에 접착됨), 또는 교차-연결(복수의 다당류가 복수의 폴리펩타이드에 접착됨)을 통하여 폴리펩타이드에 접합될 수 있다.

폴리펩타이드, 즉 실시예에서 기재된 슈도뉴몰리신 폴리펩타이드의 정제 방법 및 폴리펩타이드에 다당류를 접합하는 방법들은 실시예 4에 기재되어 있다. 폴리펩타이드 또는 다당류의 정제 및 접합 공정에 대한 추가적인 설명은, 예컨대 미국 특허 제 4,242,501, 4,686,102, 5,623,057 및 5,565,204에 기재되어 있다.

본원에서 접합체 또는 폴리펩타이드는 포유류에 투여하여 포유류에서의 스트렙토코커스 뉴모니아에 대한 면역 반응(예방학적 및/또는 치료학적 면역 반응)을 유도할 수 있다. 접합체 또는 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은, 이에 한정되는 것은 아니나, 생리 식염수 또는 그외 주사가능한 액체를 포함한 백신에 적합한, 약학적으로 허용가능한 담체, 완충액 또는 보존제내 형태로 전달될 수 있다. 백신에 사용되는 통상적인 첨가제 역시 함유될 수 있으며, 예컨대 락토스 또는 소르비톨과 같은 안정화제 및 알루미늄 포르페이트, 하이드록사이드 또는 설페이트 및 스테아릴 타이로신과 같은 면역성 반응을 증강시키는 보강제가 함유될 수 있다. 제조된 백신은 다수의 감염성 물질에 대하여 면역 반응을 유도하는, 다가 백신의 구성성분으로서 사용될 수 있다.

상기 조성물은 당업계에 공지된 모든 방법으로 투여될 수 있으며, 예컨대, 경구로, 근육내로, 정맥내로, 동맥내로, 경막내로, 진피내로, 복막내로, 비강내로, 허파내로, 안내로, 질내로, 창자내로 또는 피하내로 투여될 수 있다. 이들은 위장관 또는 호흡관으로 도입될 수 있으며, 예컨대 상기 접합체를 포함하는 용액 또는 가루의 흡입에 의해 도입될 수 있다. 예로서, 상기 조성물은 피부 패치를 통하여 투여될 수 있다.

약학적 조성물(예, 백신)은, 면역성 반응의 일환으로써 항체의 생성을 유도하기에 충분한 함량으로 투여된다. 특정 환자에 대한 투여량은 여러가지 요소, 즉 환자의 신체치수, 일반적인 건강, 성별, 신체 표면적, 나이, 투여되는 특정 약물, 투여 시간 및 경로, 현재 투여중인 그외 다른 약물에 따라 결정된다. 최적 투여량은 통상의 약물학자의 권한내에서 결정된다.

숙주 포유류에서 면역 반응을 유도하는 조성물의 효능은, 당업계에 널리 골지된 면역 반응 측정 방법으로 분석될 수 있다. 예를들면, 세포독성 T 세포의 생성은 표준 ⁵¹Cr 방출 분석으로, 세포내 사이토카인 발현 및 분비를 측정하거나 또는 주조직적합 복합체(MHC) 사량체를 이용하여 분석될 있다. ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 또는 ELISPOT(enzyme-linked immunospot)과 같은 표준 분석법을 사용하여, T 세포 활성화로 귀착되는 사이토카인의 프로파일을 측정할 수 있다. T 세포 증식은 ³H-티미딘 흡수와 같은 분석법과 그외 당업계에 공지된 분석법을 이용하여 측정할 수 있다. B 세포 반응은 ELISA와 같은 공지된 분석법을 이용하여 측정할 수 있다. 그외 방법들을 사용하여 병원체가 관련된 손상 또는 그외 병원체의 일반적인 수치(예, 접합체가 처리된 마우스의 시험감염시 폐렴균 제거능)에 대한 접합체의 효과를 평가할 수 있다.

본원의 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니아의 감염 또는 이러한 감염과 연관성 있는 증상의 예방 및 치료를 위한 약제 제조에 사용될 수 있다.

항체

다당류, 뉴몰리신 또는 이들의 조합체에 대한 항체는 제1 개체에서 제2 개체로 면역성을 부여(예, 스트렙토코커스 뉴모니아에 대한 제2 개체의 면역 반응 증가시키 위하여 또는 제2 개체가 면역기전손상 환자인 경우 반응을 제공하기 위하여)하기 위한, 예방학적 적용 및 치료학적 적용으로 사용될 수 있다. 다당류, 뉴몰리신 또는 이들 조합체에 대한 항체는 면역적격 숙주에서 (예, 본원의 접합체를 면역적격 숙주에 투여함으로써) 제조할 수 있으며, 상기 숙주로부터 수거하고, 치료 또는 예방이 필요한 수용체로 주입할 수 있으며, 따라서, 뉴몰리신 독소 뿐만 아니라 스트렙토코커스 뉴모니아 및 상기 접합체(예, 접합체의 다당류 성분)에 의하여 유도된 항체에 결합하는 그외 다른 세균에 대한 내성을 수용체에 부여한다.

본원의 조성물에 의해 발생되는 항체는, 약학적 조성물로 제형화시킬 수 있으며, 개체에 예방학적 또는 치료학적 면역 반응을 부여하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 약학적 조성물에 대한 적합한 성분 및 투여 방법은 본원에 기재되어 있다. 수동 면역에 있어서, 상기 약학적 조성물은 다중클론 항체 또는 단일클론 항체 또는 이들의 유도체 단편을 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 표준 임상적 방법에 의해 결정된 바에 따라, 항체, 단편 또는 유도체를 예방학적인 또는 치료학적인 유효량으로 포함한다.

폐렴균의 폴리펩타이드를 코드화하는 핵산

폐렴균의 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 다양체를 코드화하는 핵산은 포유류에서 예방학적 또는 치료학적 면역 반응을 형성시키기 위하여 포유류(예, 인간)에 투여될 수 있다. 상기 면역 반응은 항-폐렴균성 체액 및/또는 세포 면역 반응일 수 있다.

핵산 구조체로 코드화 가능한 폴리펩타이드로는, 본원의 접합체의 폴리펩타이드 성분, 실시예에 기재된 슈도뉴몰리신 폴리펩타이드와, 오토리신, 폐렴균의 표면 단백질A 및 이들의 단편 및 이들의 다양체가 있다. 또한 핵산은 상기 폴리펩타이드, 단편 또는 다양체들의 2종 이상의 조합을 코드화할 수 있다.

핵산 발현 구조체는 표준 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다. 조절 요소들은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 발현을 용이하게 하기 위하여 구조체내에 포함될 수 있다. 이러한 요소들로는 인간 또는 그외 포유류 세포에서 발현을 강화시키는 서열, 예컨대 프로모터, RNA 안정화 서열, 코딩 서열의 5' 및 3' 부위, 인트론(코드화 서열에 인접하여 또는 내부의 모든 위치에 위치될 수 있다.), 폴리(A) 부위와, 복제 기원 및 복제되는 구조체를 선별할 수 있는 선별마커를 코딩하는 1종 이상의 유전자를 포함하며, 이는 원핵 및/또는 진핵 숙주에서 선택할 수 있다. T7 중합효소 프로모터 또는 그외 프로모터 형(예, 조직-특이적 프로모터 또는 세포-특이적 프로모터, 예로는 근육-특이적 프로모터)은 선택적으로 코딩 서열의 5' 말단에 존재할 수 있으며, FLAG 또는 그외 mAb 결정인자를 코드화하는 서열이 코딩 서열의 3' 말단에 선택적으로 존재할 수 있다. 상기 구조체는 또한 그외 전사 신호 및 번역 신호, 예컨대 Kozak 서열을 포함할 수 있다.

상기 구조체는 또한 코딩된 폴리펩타이드를 세포내 특정 구획으로 가게 하는 표적성 신호를 코드화하는 서열을 포함하며, 표적성 신호는 상기 폴리펩타이드에 연결되어 있다. 표적성 신호는 코드화된 폴리펩타이드를 엔도플라스믹 레티큘럼(ER), 골지, 핵, 리소좀, 클래스 II 펩타이드 적재성 구획 또는 엔도솜으로 향하게 하며, 신호 펩타이드, ER 체류 펩타이드 및 리소좀-표적성 신호를 포함한다.

상기 핵산은 포유류 세포에서 발현가능한 모든 벡터내에 사용될 수 있다. 상기 벡터는, 플라스미드 또는 세균성 벡터과 같은 비-바이러스성 벡터, 삽입성 바이러스 벡터 또는 비-삽입성 바이러스 벡터일 수 있다. 적합한 벡터의 예로는 poDNA 포유류 발현 벡터(인비트로겐 사) 계열이 있으며, 이는 PCR 산물의 직접적이며 빠른 클로닝이 가능하다.

다양한 전달 시스템은, 폴리펩타이드를 코드화하는 핵산을 적합한 세포내로 전달시키기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 상기 폴리펩타이드를 코드화하는 핵산은, 희석제를 포함 또는 포함하지 않은 상태에서, 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 식염수 내의 형태로 전달되거나, 또는 콜로이달 현탁액 또는 가루 형태로 전달될 수 있다. 상기 핵산은 "노출된" 것이거나 또는 전달성 비히클과 결합된 것일 수 있으며, 지질, 리포좀, 마이크로스피어, 마이크로파티클, 마이크로캡슐, 금 입자, ISCOMS, 나노입자, 폴리머, 축합인자(condensing agent), 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, QS21, 흡수 증강 물질, 보강체 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 전달 시스템을 이용하여 전달될 수 있다. 핵산은 세포로, 예컨대 골격근 세포로, 생체내 또는 생체외에서 전기충격(electroporation)을 이용하여 전달될 수 있다.

상기 핵산은 표준법, 예컨대 Donnelly et al. , J. Immunol. Methods 176: 145, 1994, 및 Vitiello et al. , J. Clin. Invest. 95: 341, 1995에 기재된 바에 따라 투여될 수 있으며, 당업계에 공지된 모든 방식으로, 즉 경구, 근육내, 정맥내, 동맥내, 경막내, 진피내, 복막내, 비강내, 허파내, 안내, 질내, 창자내 또는 피하내의 경로로 적용대상자에게 전달될 수 있다. 이들은 위장관 또는 호흡관내로, 예컨대 핵산을 포함하는 용액 또는 가루의 흡입을 통하여 도입될 수 있다. 국부적 또는 전신으로 투여될 수 있다.

핵산 투여량 약 100-2000 ㎍을 개체에 투여될 것으로 여겨진다. 환자가 어른이면, 백신접종 요법은 마이크로파티클 형태로 전달시 플라스미드 DNA 10 - 1000 ㎍를 예컨대 근육내, 진피내, 흡입 또는 피하내로 투여하는 것을 포함하며, 또는 백신접종 요법은 노출된 플라스미드 약 10-2500 ㎍, 예컨대 100-2000, 또는 500-1000 ㎍를 근육내 또는 진피내로 3 내지 6회 전달하는 것을 포함할 수 있다. 의학계에서 공지된 바에 따라, 특정 환자에 대한 투여량은 환자의 신체치수, 일반적인 건강상태, 성별, 신체 표면적, 나이, 특정 투여 화합물, 투여 횟수 및 경로 및 그외 현재 투여되고 있는 약물을 포함한 다수의 인자들에 의하여 결정된다. 최적의 투여량 결정은 당업계의 약학적의 권한내에 속한다.

그외 표준 전달 방법, 즉, 바이오리스틱 전이 또는 조직내(ex vivo) 처리를 또한 이용할 수 있다. 조직내 처리로서, 수지상 세포(dendritic cell), 말단 혈액 단핵구 세포 또는 골수 세포와 같은 항원 존재 세포(APC)를, 환자 또는 적합한 공여자로부터 수득하며, 핵산과 함께 조직내에서 활성화되며, 이후 환자에게로 이식 또는 재주입될 수 있다.

핵산은 단독으로 또는 그외 당업계에 알려진 치료제, 예컨대 항균제와 병행하여 투여할 수 있다. 또한 핵산은 당업게에 공지된 바에 따라, 면역 반응을 증강시키도록 고안된 그외 치료법과 병행하여 투여될 수 있으며, 그 예로는 보강제, 사이토카인(또는 사이토카인을 코딩하는 핵산), 또는 CpG 올리고뉴클레오타이드와의 병용 투여가 있다.

숙주 포유류에서 면역 반응을 유도하는 핵산의 효능은, 당업계에 널리 공지된 면역 반응 측정 방법으로 분석될 수 있다. 예를 들면, 세포독성 T 세포의 생성은 표준 ⁵¹Cr 방출 분석으로, 세포내 사이토카인 발현 및 분비를 측정하거나 또는 주조직적합 복합체(MHC) 사량체를 이용하여 분석될 있다. ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 또는 ELISPOT(enzyme-linked immunospot)과 같은 표준 분석법을 사용하여, T 세포 활성화로 귀착되는 사이토카인의 프로파일을 측정할 수 있다. T 세포 증식은 ³H-티미딘 흡수 와 같은 분석법과 그외 당업계에 공지된 분석법을 이용하여 측정할 수 있다. B 세포 반응은 ELISA와 같은 공지된 분석법을 이용하여 측정할 수 있다. 그외 방법들을 사용하여, 병원체가 관련된 손상 또는 그외 병원체의 일반적인 수치(예, 접합체가 처리된 감작된 마우스에서의 폐렴균의 제거)에 대한 접합체의 효과를 평가할 수 있다.

본원의 핵산은 스트렙토코커스 뉴모니아의 감염 또는 이러한 감염과 연관성 있는 증상의 예방 및 치료를 위한 약제 제조에 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예를 기재하나, 청구의 범위에 첨부된 본 발명의 범위를 한정하진 않는다.

실시예

실시예 1:

뉴몰리신 폴리펩타이드의 절단형을 발현하기 위한 용도의 벡터는, 실시예 1A-1E에 나타나 있다. "슈도뉴몰리신" 폴리펩타이드로 지칭되는, 코드화된 절단형 폴리펩타이드는, 접합체 백신의 제조시 폐렴균의 다당류에 접합되는 용도로 사용할 수 있다. 또한 슈도뉴몰리신 폴리펩타이드를 코드화하는 핵산은, 코드화된 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 형성하기 위하여 개체에 투여될 수 있다.

PCR은, 주형으로 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19A 염색체 DNA를 이용하여 실시함으로써, 뉴몰리신 유전자의 다양한 단편들을 증폭시켰다. PCR 반응에 사용된 센스 프라이머는, 번역 개시 코돈의 바로 상위에 위치하는 뉴몰리신 유전자의 코딩 서열에 접합되고, 특정 제한 효소 부위가 통합된다. 상기 센스 프라이머로, LYSN-1(5'-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3'; 서열번호 2)로 제작하였으며, 이는 뉴몰리신 유전자의 5' 말단 위치에서 1에서 24번까지의 뉴클레오타이드에 상보적이다. 안티센스 프라이머로는, LYSN-3(5'-CAGTGGATCCTTACTAGTCATTTTCTACCTTATC-3'; 서열번호 3)을 제작하였으며, 이는 뉴몰리신 유전자의 3' 말단 위치의 1396에서 1413번까지의 뉴몰리신 뉴클레오타이드에 상보적이다. 상기 프라이머들은 전장 뉴몰리신 단백질의 471개의 아미노산을 코드화하는 DNA 1413 bp를 증폭시킨다. 스트렙토코커스 뉴몰리아 혈청형 19A의 아미노산 서열은 다음과 같다:

MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYISSVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTIS IWGTTLYPQVEDKVEND(서열번호 1).

PCR은 하기한 바에 따라 실시하였다: 94℃에서 4분간 1회; 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간 및 72℃에서 1.5분간, 30회; 및 72℃에서 10분간 1회. PCR 합성된 DNA 단편은 NdeI 및 BamHI 제한효소로 절단하고, pET1lb 발현 벡터(pSA-14를 제조하기 위하여)에 연결시켰다. 재조합 DNA는 형질전환에 의해 E.coli DE3 세포로 도입하였다. 암피실리 내성 형질전환체를 선별하였다. 삽입체의 존재는 NdeI 및 BamHI 제한효소를 이용한 절단으로 확인하였다.

증폭된 DNA 단편은 천연형의 게놈 서열에 비해 3' 말단의 뉴클레오타이드가 결손된 상태이다. 이러한 변형된 핵산에 의해 코드화되는 대부분의 슈도몰리신 폴리펩타이드는 비-용혈성 및 무독성을 나타내나, 면역원성은 유지되는 것으로 확인되었다.

A. pSA-1 발현 벡터의 제조

pSA-1 발현 벡터는, 서열번호 1의 뉴몰리신 단백질의 1-460번까지의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩타이드를 코드화한다. PCR은 LSYN-1(5'-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3'; 서열번호 2) 와 LSYN-4(5'-GACTGGATCCTTACTAGAGAGTTGTTCCCCAAATAG-3'; 서열번호 5)로 실시하여 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19A의 염색체 DNA에 대하여 실시하였고, 1380 bp의 DNA를 증폭하였다.

PCR 합성된 DNA 단편은 NdeI 및 BamHI으로 절단하고, pET1lb 발현 벡터의 NdeI 및 BamHI 부위에 연결하여 pSA-1을 제조하였다. 재조합 DNA는 형질전환으로 E. coli DE3세포로 도입하였다. 암피실리 내성 형질전환체를 선별하였다. 삽입체의 존재는 NdeI 및 BamHI 제한효소를 이용한 절단으로 확인하였고, 추가로 DNA 서열분석으로 검증하였다.

코드화된 460개의 아미노산 폴리펩타이드는, 천연형 뉴몰리신 단백질의 C-말단에 위치하는 11개의 아미노산들이 결손된 것으로, 하기 서열을 갖는다:

MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYISSVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTISIWGTTL(서열번호 1의 1에서 460번까지의 아미노산).

B. PSA-49 발현 벡터의 구축

pSA-49 발현벡터는 서열번호 1의 뉴몰리신 단백질의 1 에서 464번까지의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드를 코드화한다. PCR은 LSYN-1(5'-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3'; 서열번호 2) 와 LSYN-54(5'-CTGAGGATCCTTACTATACCTGAGGATAGAGAGTTGTTC-3'; 서열번호 25)로 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19A의 염색체 DNA에 대하여 실시하였고, 1392 bp의 DNA를 증폭시켰다.

PCR 합성된 DNA 단편은 NdeI 및 BamHI으로 절단하고, pET1lb 발현 벡터의 NdeI 및 BamHI 부위에 연결하여 pSA-49를 제조하였다. 재조합 DNA는 형질전환으로 E. coli DE3세포로 도입하였다. 암피실리 내성 형질전환체를 선별하였다. 삽입체의 존재는 NdeI 및 BamHI 제한효소를 이용한 절단으로 확인하였고, 추가로 DNA 서열분석으로 검증하였다.

코드화된 464개의 아미노산 폴리펩타이드는, 천연형 뉴몰리신 단백질의 C-말단에 위치하는 7개의 아미노산 들이 결손된 것으로, 하기 서열을 갖는다: MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYISSVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTISIWGTTLYPQV (서열번호 1의 1에서 464번까지의 아미노산들).

C. pSA-11 발현 벡터의 제조

pSA-11 발현벡터는 서열번호 1의 뉴몰리신 단백질의 1 에서 466번째의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드를 코드화한다. PCR은 LSYN-1(5'-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3'; 서열번호 2) 와 LSYN-17(5'-GACTGGATCCTTACTAATCTTCTACCTGAGGATAG-3'; 서열번호 6)로 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19A의 염색체 DNA에 대하여 실시하였고, 1398 bp의 DNA를 증폭시켰다.

PCR 합성된 DNA 단편은 NdeI 및 BamHI으로 절단하고, pET1lb 발현 벡터의 NdeI 및 BamHI 부위에 연결하여 pSA-11을 제조하였다. 재조합 DNA는 형질전환으로 E. coli DE3세포로 도입하였다. 암피실리 내성 형질전환체를 선별하였다. 삽입체의 존재는 NdeI 및 BamHI 제한효소를 이용한 절단으로 확인하였고, 추가로 DNA 서열분석으로 검증하였다.

코드화된 466개의 아미노산 폴리펩타이드는, 천연형 뉴몰리신 단백질의 C-말단에 위치하는 5개의 아미노산들이 결손된 것으로, 하기 서열을 갖는다:

MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYISSVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTISIWGTTLYPQVED (서열번호 1의 1에서 466번째까지의 아미노산들).

D. pSA-32 발현벡터의 제조

pSA-32 발현벡터는, 서열번호 1의 뉴몰리신 단백질의 1 에서 469번째의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드를 코드화한다. PCR은 LSYN-1(5'-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3'; 서열번호 2)와 LSYN-37(5'-GACTGGATCCTTACTATTCTACCTTATCTTCTACCTGAG-3'; 서열번호 7)로 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19A의 염색체 DNA에 대하여 실시하였고, 1407 bp의 DNA를 증폭시켰다.

PCR 합성된 DNA 단편은 NdeI 및 BamHI으로 절단하고, pET1lb 발현 벡터의 NdeI 및 BamHI 부위에 연결하여 pSA-32를 제조하였다. 재조합 DNA는 형질전환으로 E. coli DE3세포로 도입하였다. 암피실리 내성 형질전환체를 선별하였다. 삽입체의 존재는 NdeI 및 BamHI 제한효소를 이용한 절단으로 확인하였고, 추가로 DNA 서열분석으로 검증하였다.

코드화된 469개의 아미노산 폴리펩타이드는, 천연형 뉴몰리신 단백질의 C-말단에 위치하는 2개의 아미노산들이 결손된 것으로, 하기 서열을 갖는다:

MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRG ISAERPLVYISSVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTIS IWGTTLYPQVEDKVE (서열번호 1의 1에서 469번까지의 아미노산들).

E. pSA-31 발현벡터의 제조

pSA-31 발현벡터는 서열번호 1의 뉴몰리신 단백질의 1 에서 470번째의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드를 코드화한다. PCR은 LSYN-1(5'-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3'; 서열번호 2) 와 LSYN-38(5'-GACTGGATCCTTACTAATTTTCTACCTTATCTTCTACCTGAG-3'; 서열번호 8)로 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19A의 염색체 DNA에 대하여 실시하였고, 1410 bp의 DNA를 증폭시켰다.

PCR 합성된 DNA 단편은 NdeI 및 BamHI으로 절단하고, pET1lb 발현 벡터의 NdeI 및 BamHI 부위에 연결하여 pSA-31을 제조하였다. 재조합 DNA는 형질전환으로 E. coli DE3세포로 도입하였다. 암피실리 내성 형질전환체를 선별하였다. 삽입체의 존재는 NdeI 및 BamHI 제한효소를 이용한 절단으로 확인하였고, 추가로 DNA 서열분석으로 검증하였다.

코드화된 470개의 아미노산 폴리펩타이드는, 천연형 뉴몰리신 단백질의 C-말단에 위치하는 1개의 아미노산들이 결손된 것으로, 하기 서열을 갖는다:

MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYISSVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTIS IWGTTLYPQVEDKVEN (서열번호 1의 1에서 470번까지의 아미노산들).

실시예 2: 재조합 슈도몰리신 폴리펩타이드의 발현, 정제 및 특징

PCR 산물은, 실시예 1에 나타낸 바와 같이, pET 발현벡터내로 클로닝하였다. 재조합 DNA는 E.coli 내로 형질전환시키고, 형질전환체는 항생제가 함유된 플레이트상에서 선별하였다. 삽입된 DNA 서열은 DNA 서열분석으로 확인하였다. 재조합 E. coli는 37℃에서 하룻밤동안 배양하였고, IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)를 유발제로 배양액에 첨가하였고, 3시간 연속 배양하였다. 발현된 재조합 폴리펩타이드는 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)과 코마시 블루 염색으로 확인하였다. 재조합 폴리펩타이드는 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였고, 용혈성은 양 또는 인간의 적혈구(실시예 3에 따라)에 대한 용혈 분석으로 실험하였다.

실시예 3: 슈도몰리신 폴리펩타이드의 용혈성 분석

코드화된 폴리펩타이드의 용혈성은 하기 과정으로 결정하였다.

1) 2%의 인간 또는 양 적혈구 현탁액을 준비한다. 새로운 혈액세포 0.2 ml을 PBS(pH 7.2) 10 ml에 첨가하였다. 상기 현탁액은 3000 rpm으로 30초간 원심회전시키고, 펠렛은 PBS 10 ml에 재현탁하였고 이를 3회 실시하였다.

2) 0.5 ml PBS(pH7.2)에 폴리펩타이드 1 ㎍을 첨가하고 2% RBC 현탁액 세척물과 혼합하였다.

3) 37℃에서 1시간동안 상기 혼합물을 반응시키고, 에펜도르프 초미세원심분리기에서 10,000 rpm으로 2분간 원심분리하였다.

4) 541 nm에서 OD를 측정하였다. 전장 뉴몰리신 펩타이드에 대한 OD 흡광도 %로 용혈성을 계산하였다.

표 1에 나타낸 바와 같이, C-말단에 7, 6, 2 또는 1개의 아미노산이 결손된 뉴몰리신 절단체들은, 용혈성이 결핍되어 있었다. C-말단에 5개의 아미노산이 결손된 뉴몰리신 절단체는 용혈성이 일부 소실되어 있다.

표 1: 전장 뉴몰리신 및 슈도뉴몰리신의 용혈성

구조체	뉴몰리신 부위(a)	용혈성%(b)
pSA-14pSA-49pSA-48pSA-11pSA-34pSA-33pSA-32pSA-31	1-471(전장 뉴몰리신)1-464(-7aa 슈도몰리신)1-465(-6aa 슈도몰리신)1-466(-5aa 슈도몰리신)1-467(-4aa 슈도몰리신)1-468(-3aa 슈도몰리신)1-469(-2aa 슈도몰리신)1-470(-1aa 슈도몰리신)	10000.21710010001.8

(a) 숫자는 C-말단 절단체에는 존재하지 않는 천연의 뉴몰리신 폴리펩타이드 아미노산(aa)을 나타낸다.

(b) C-말단 절단체들의 용혈성은 전장 구조체, pSA-14에 대한 %로 나타낸다.

실시예 4: 다당류-단백질 접합체 제조

A. 다당류의 산화

폐렴균의 캡슐 다당류, 즉 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18, 19F 및 23F의 다당류를 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 구입하였다. 다당류 10 mg을 4℃에서 하룻밤동안 증류수 1 mL에 용해시켰다. 다음날, 여기에 0.2 M PBS(pH 7.2) 1 mL을 첨가하였다. 다당류는 2 Mm 소듐 페리오데이트(MW: 213.9, Sigma)와 상온에서 10분간 암조건에서 반응시켜, 산화시켰다. 과량의 소듐 페리오데이트는 에틸렌 글리콜(MW: 62.07)을 최종농도 25 mM을 첨가하여 반응시킴으로써, 소실시켰다. 상기 다당류를 함유한 반응 혼합물은 1000 mL의 0.1 M PBS(pH 7.2)상에서 오랫동안 3회 반복 투석하였다.

B. 면역-친화성 컬럼의 준비

(i) 전장의 His-표지된(tagged) 뉴몰리신 정제

E. coli(C-His-표지된 뉴몰리신을 함유하는 pET24b)는 20% 글루코스 40 ㎕ 및 50 mg/mL 카나마이신 4 ㎕을 포함하는 LB 배지 4 mL에서 배양시키고, 160 rpm로 일정하게 교반하면서 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 배양액 3 mL은 20% 글루코스 1 mL 및 50 mg/mL 카나마이신 lOO ㎕을 포함하는 LB 배지 100 mL로 이동시키고, OD₆₀₀이 0.4-0.5가 될때까지 160 rpm로 일정하게 교반하면서 37℃에서 배양하였다. 400 ㎕의 1M IPTG를 상기 배양액 100 mL에 첨가하여 IPTG 최종농도가 4 mM이 되도록 하였다. 유전자 발현 유도 3시간 후, 4000 rpm으로 5분간 원심분리하여 세포를 수거하였다. 전장 His-표지된 뉴몰리신은 인비트로겐 사(Carlsbad, CA)에서 제공하는 프로본드 정제 시스템의 방법에 따라 정제하였다.

(ii) His-표지된 뉴몰리신에 대한 다중클론 항체 생상

뉴질랜드 흰 토끼의 4 부위; 허벅지 근육(i.m.)와 등 세로근육위의 각 척추 부위에 유화시킨 His-표지된 뉴몰리신 및 TiterMaw 보강체 (400 ㎕의 1 mg/mL His-표지된 뉴몰리신 및 400 ㎕의 TiterMax adjuvant)를 각 부위에 25 ㎍으로 4회 투여로(equal dose)으로 주사하였다. 14일 후, 토끼의 귀 정맥을 통하여 혈액 5 mL을 채혈하였다.

혈청에서의 항체 역가가 1:3000 희석 농도에 도달하면, 동물은 출혈로 취사시켰다. 항체 역가가 1:3000 이하이면, 2차 항원 투여량을 주사하고, 1주일후(이차 투여후 7일) 동물을 검사하였다. 상기 주기는 적합한 역가가 나올때까지 연속 실시하였다.

(iii) 친화성-겔 프로테인A 아가로스를 이용한 토끼 IgG 정제

His-표지된 뉴몰리신으로 면역시킨 토끼 혈청을, 10 mM 소듐 포스페이트 및 150 mM NaCI(pH 8.2)로 평형화된 친화성-겔 프로테인A 컬럼에 주입하였다. 충전부피(bed volume)의 10배량으로 세척한 후, 100 mM Na 사이트레이트 (pH 3.0) 2 - 5배의 부피로 면역글로블린을 용출시켰다. 용출된 IgG를 수집하여 모으고, 280 nm에서 OD를 측정하였다. 정제된 IgG 3 ml을 다시 10 DG 컬럼에 주입하고, 컬럼에서 먼저 용출되는 3 mL은 버렸다. 컬럼에, 커플링 완충액(150 mM NaCl 및 100 mM Na 아세테이트 pH 5.5) 또는 1M 3- (N-모르폴리노)프로판-설포닉산) (MOPS) 완충액 중 어느 하나를 3.5 mL 가하였다. IgG 용출물 3.5 ml을 수득하여 모으고, Affi-Gel Hz 또는 Affi-GellO 중 어느 하나와 커플링시켰다.

iv) Affi-GelO에 무작위(random) 커플링된 IgG를 이용한 면역친화성 컬럼 제조

Affi-Gel 10은 아가로스 겔 비드 지지체에 교차연결된 N-하이드록시숙시니미드 에스테르 유도체이며, 제1 아민을 통하여 모든 리간드와 커플을 이루고 있다. IgG와의 커플링으로, Affi-Gel 10을 15 mL 튜브로 옮기고, 차가운 DDH₂O로 3회 세척한 다음 차가운 0.1 M MOPS 완충액(pH 7.0)으로 2회 세척하였다. 정제된 IgG를 미리 세척한 Affi-Gel 10이 들어 있는 15 mL 튜브에 넣고, 4 ℃에서 4시간동안 오버-엔드 교반(rotate-over-end)하였다. Affi-Gel 10의 남은 활성의 에스테르는 100 mM Tris HCl pH 8.0를 첨가하여 4℃에서 0.5시간동안 블로킹시켰다. 상기 겔은 1.5 x 9.0 cm의 컬럼으로 이동시켰다. 컬럼 용출물을 수집하고, 280 nm에서 OD를 측정하였다. Affi-Gel 10 면역친화성 컬럼을 충진부피의 2배 양의 0. 5M NaCl 및 25 mM Tris HCl(pH 8.0)로 세척하였다. 컬럼 용출물을 다시 수집하고 280 nm에서 OD를 측정하였다. 총 IgG와 커플되지 않은 IgG의 농도를 이용하여, 커플링 효율을 계산하였다.

(v) 면역친화성 컬럼 실험

면역친화성 컬럼 실험으로, DEAE-세파로스 크로마토그래피로 수득한 슈도뉴몰리신 분획에 25 mM Tris-HCl(pH8.0), 0.5 M NaCl 및 0.5% Triton X-100을 첨가하였다. 0.5 M NaCl 및 25 mM Tris-HCl(pH8.0)로 평형화시킨, 6.5 ml의 Affi-Gel 10 컬럼(1.5 x12 cm)에 유속 1 mL/2 min으로 상기 시료를 주입하였다. 플로우 쓰루(flow through) 분획을 수득하였다. 컬럼은 15 mL의 0.5 M NaCl 및 25 mM TrisHCl (pH8.0)으로 2-3회 세척하였다. 다시 4 M 유레아 5 mL로 컬럼을 세척하였다. 결합된 슈도뉴몰리신 단백질은 4 M 유레아 7 mL을 이용하여 2회 용출시켰다. 일차 4 M 유레아 7 mL 분획으로부터 최초 용출시킨 단백질 시료는 9 % SDS-PAGE로 분석하고, 코마시 브릴리언트 블루 R-20으로 염색하여 가시화시켰다.

C. 재조합 슈도뉴몰리신 단백질 제조

pSA-49(이는 뉴몰리신이 C-말단의 7개의 아미노산이 결손된 폴리펩타이드를 코드화한다.: 실시예 1 참조) 발현 벡터로 형질전환된 균주를 암피실린 100 ㎍/ml이 함유된 LB 배지 30 mL이 있는 50 mL 튜브에서 하룻밤동안 37℃에서 배양하였다. 다음날 아침, 암피실린 100 ㎍/ml 및 2% 글루코스가 함유된 LB 배지 400 mL이 들어있는 1L 플라스크에, 하룻밤 배양한 배양물 13 mL을 접종하고, 37℃에서 교반 배양하였다. 세포 밀도가 A600 0.5일때, 2 또는 4 mM의 IPTG를 첨가하여 3시간동안 슈도뉴몰리신 단백질 발현을 유도하였다.

균주는 500 mL 원심분리 튜브내에서, 6,500 rpm으로 10 분간 원심분리하였다. 균주 펠렛은 100 ㎍/mL의 리소좀과 함께, 40 mL의 Tris HCl 완충액(pH 8.0)으로 현탁하고, 15분간 얼음위에 방치한 다음 얼음위에서 10초간 부르스트(burst) 3회로 초음파 분쇄를 실시하였다. 용혈물(lysate)은 10분간 -80℃에서 동결시키고, 37℃에서 5분간 해동시켰다. 세포 용혈물에, 초음파분쇄-동결-해동의 과정을 2회 더욱 실시하였다. 불용성 세포 파편은 6,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 제거하였다. 상층 용혈물은 이후 0.8 uM 필터로 여과하였다. 상기 플로우 쓰루 단백질은 9 % SDS-PAGE 분석을 실시하였고 코마시 브릴리언트 블루 R-250으로 염색하여 가시화시켰다. 조(crude) 용혈물은 DEAE-세파로스 크로마토크래피로 더욱 정제하였다.

균주의 조 용혈물 20 mL은 25 mM Tris-HCl(pH 8.0)로 평형화시킨 DEAE-세파로스 컬럼(5 x 12 cm)에 주입하였다. 일차 플로우 쓰루를 수집한 다음 25 mM Tri-HCl 10 mL을 컬럼에 주입하였다. 플로우 쓰루 10 mL을 수집하고, 일차 플로우 쓰루 분획과 합쳤다(분획 1). 이후, 25 mM Tris-HCl(pH 8.0) 35 mL을 컬럼에 주입하여 플로우 쓰루를 다시 수집하였다(분획 2). 추가로 25 mM Tris-HCl(pH 8.0) 35 mL을 컬럼에 주입하여 플로우 쓰루를 수집하였다(분획 3). 결합된 균주 단백질은 4 M NaCl 및 25 mM Tris HCI로 용출시켰다(분획 4). 각 분획내 단백질 농도는 280 nm에서 OD를 해독하여 측정하였다. 단백질 시료는 9 % SDS-PAGE 분석을 실시하였고 코마시 브릴리언트 블루 R-20으로 염색하여 가시화시켰다. 슈도뉴몰리신을 함유하고 있는 플로우 쓰루 분획들(1 및 2)은 면역친화성 크로마토그래피로 더욱 정제하였다.

DEAE-세파로스 크로마토그래피 이후, 슈도뉴몰리신이 함유된 분획에 25 mM Tris HCl(pH 8.0), 0.5 M NaCl 및 0.5% Triton X-100을 가하였다. 상기 시료는 토끼 항-뉴몰리신 IgG가 커플링된 Affi-Gel 10 컬럼 6.5 mL에 유속 1 mL/2 min으로 가하였으며, 상기 컬럼은 0.5 M NaCl 및 25 mM Tris HCl(pH 8.0)로 평형화시킨 것이다. 플로우 쓰루 분획을 수집하였다. 상기 컬럼은 0.5 M NaCl 15mL 및 25 mM Tris HCl(pH 8.0)로 3회 세척하였다. 컬럼은 4 M 유레아 5 mL으로 세척하였다. 결합된 슈도뉴몰리신 단백질은, 4 M 유레아 7 mL을 2회 가하여 용출시켰다. 결합 또는 결합되지 않은 분획의 단백질 시료는, 9 % SDS-PAGE 분석을 실시하였고, 코마시 브릴리언트 블루 R-20으로 염색하여 가시화시켰다.

면역친화성 크로마토그래피 후, 4 M 유레아로 용출시킨 슈도뉴몰리신을 함유하는 분획은 10 DG 크로마토그래피를 추가로 수행하여 유레아를 제거하였다. 시료 3.0 mL을 1 x PBS 완충액으로 평형화시킨 10 DG 컬럼(1.5 x 12 cm)에 주입하였다. 일차 플로우 쓰루 3.0 mL은 버렸다. 상기 컬럼에 1 x PBS 완충액 3.9 mL을 가하였다. 컬럼으로부터 수집한 3.9 mL 분획은 280에서 OD를 측정하였고, 단백질 분획들을 수집하였다. 단백질 순도는 9% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 평가하였다.

D.다당류-단백질 접합체 제조

스트렙토코커스 뉴모니아 다당류 18C 2 mg을, 환원성 아미노화 분석을 이용한 직접 접합을 통하여 슈도뉴몰리신 단백질(상기 C장에 기재되어 있음)에 접합시켰다. 0.1 M PBS내에서, 슈도몰리신 10 mg을 산화된 다당류 반응 혼합물에 첨가하였고, 30분간 부드럽게 교반하면서 상온에서 반응시켰다. 소듐 시아노보로하이드라이드는 최종농도 20 mM(e. g., 750 ㎕의 100 mM 시아노보로하이드라이드를 혼합물내 산화된 다당류 및 슈도뉴몰리신 3 ml에 첨가함)로 첨가하였다. 상기 접합체는 9,000 rpm으로 10분간 침전시키고, 0.1 M PBS, pH 7.2 1-2 mL에 용해시켰다. 상기 혼합물은 1 x PBS, pH 7.2로 평형화된 세파로스 CL-4B column(1.5 x 100 cm)에서 크로마토그래피를 실시하였다. 단백질 및 다당류를 모두 함유한 분획을 모우고, 아미콘 센트리콘-30(molecular weight cutoff 30,000)으로 농축시켰으며, 이후 단백질 및 다당류 함량을 분석하였다.

실시예 5: 다당류-단백질 접합체에 대한 마우스의 항체 반응

실시예 4에 따라 제조한, 스트렙토코커스 뉴모니아 14, 18C, 19F, 23F, 4, 6B 및 9V 다당류-슈도뉴몰리신 단백질 접합체로, 마우스에서의 다당류 및 뉴몰리신에 대한 항체 형성능을 검사하였다. 접합체, 알루미늄 하이드록사이드 보강체(0.1 mg/투여)가 혼합된 0.3, 1, 3 ㎍/투여의 다당류를 NIH 스위스 암컷 마우스에 복막내 주사하였다. 일 실험에서는, 제 2 그룹의 마우스에는 다당류 1 ㎍을 주사하였고, 제3 그룹의 마우스에는 슈도뉴몰리신 1 ㎍을 주사하였다. 2주 간격으로 추가 접종을 2회 실시하였다. 일차 주사후 7일째에, 혈청내 항-다당류 항체 및 항-뉴몰리신 항체의 농도를 측정하였다. 표 2는 도 1-14에서 각각 나타낸 실험에서, 투여한 특정 접합체와 측정된 면역 반응을 요약하여 나타낸 것이다.

표 2: 마우스 면역확 실험에서 투여된 접합체와 검출된 항체에 대한 요약

도면	접합체의 스크렙토코커스 다당류 구성성분의 혈청형	측정된 항체 반응
1	14	항-뉴몰리신 IgG 항체
2	14	항-혈청형 14의 다당류 IgG 항체
3	18C	항-뉴몰리신 IgG 항체
4	18C	항-혈청형 18C의 다당류 IgG 항체
5	19F	항-뉴몰리신 IgG 항체
6	19F	항-혈청형 19F의 다당류 IgG 항체
7	23F	항-뉴몰리신 IgG 항체
8	23F	항-혈청형 23F의 다당류 IgG 항체
9	4	항-뉴몰리신 IgG 항체
10	4	항-혈청형 4의 다당류 IgG 항체
11	6B	항-뉴몰리신 IgG 항체
12	6B	항-혈청형 6B의 다당류 IgG 항체
13	9V	항-뉴몰리신 IgG 항체
14	9V	항-혈청형 9V의 다당류 IgG 항체

도 1-14에서 하기 약어가 사용된다: 포스페이트 완충화된 식염수("PBS"); 접합체("C"); 알루미늄 하이드록사이드 보강체("A"); 및 슈도뉴몰리신("PPN").

다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역된 마우스는, His-표지된 천연형 뉴몰리신과 ELISA로 반응하는 항체를 유도하는 것으로 확인되었다. 접합체 및 보강체를 투여한 모든 그룹들에서, 항-뉴몰리신 및 항-다당류 항체 농도는 PBS 및 보강체 대조군에 비하여 유의적으로 매우 높았다(p<0.001, t-test). 접합체-투여된 마우스의 혈청에서는, 항-뉴몰리신 및 항-다당류 항체가 각각 혈청 희석 인자 76800 및 9600으로, PBS만을 투여한 마우스에 비해 매우 높게 나타났다. 다당류-슈도몰리신 접합체 3.0 ㎍을 투여한 마우스에서 가장 높은 항-뉴몰리신 및 항-다당류 항체 농도가 관찰되었다(도 1-14). 다당류-슈도뉴몰리신 접합체를 보강체와 함께 투여한 그룹에서는, 보강체와 함께 슈도뉴몰리신을 투여한 그룹(도 3) 또는 보강체 사용없이 슈도뉴몰리신만을 투여한 그룹(도 6)에 비하여, 항-뉴몰리신 항체 농도가 보다 높았다.

도 3 및 4는 보강체 3.0 ㎍을 투여한 마우스에서 가장 우수한 반응 %이 있음을 나타낸 것이다. 이러한 결과는, 폐렴균 백신은 효능은 슈도뉴몰리신 단백질에 다당류의 접합에 의해 향상시킬 수 있음을 의미한다. 항체 반응과 함께, 교차 방어 면역 및 세균 제거능을 상기 접합체 백신을 투여한 마우스에서 실험하였다(실시예 8 참조)

표 3: 18C 다당류에 대하여 양성 반응성을 갖는 마우스 %

마우스 그룹	양성 반응 %
알루미늄 하이드록사이드 보강체1 ㎍ 슈도뉴몰리신(PPN)1 ㎍ 18C 다당류(PS) + 보강체0.3 ㎍ 18C(PS)-PPN 접합체 + 보강체1.0 ㎍ 18C(PS)-PPN 접합체 + 보강체3.0 ㎍ 18C(PS)-PPN 접합체 + 보강체1.0 ㎍ 18C(PS)-PPN 접합체, 보강체 투여 안함.	0%0%0%60%75%100%20%

참조: 양성 반응은 모든 마우스의 1:100으로 희석한 혈청 시료를 사용하여 결정하였다. A405 nm에서 0.05 보다 높은 것은 양성 반응을 의미한다.

표 4: 14 다당류에 대하여 양성 반응성을 갖는 마우스 %

마우스 그룹	양성 반응 %
알루미늄 하이드록사이드 보강체1 ㎍ 슈도뉴몰리신(PPN)1 ㎍ 14 다당류(PS) + 보강체0.3 ㎍ 14(PS)-PPN 접합체 + 보강체1.0 ㎍ 14(PS)-PPN 접합체 + 보강체3.0 ㎍ 14(PS)-PPN 접합체 + 보강체1.0 ㎍ 14(PS)-PPN 접합체, 보강체 투여 안함.	0%0%0%100%100%100%20%

참조: 양성 반응은 모든 마우스의 1:300으로 희석한 혈청 시료를 사용하여 결정하였다. A405 nm에서 0.12 보다 높은 것은 양성 반응을 의미한다.

도 15는 혈청형 14 다당류-슈도뉴몰리신 접합체의 3차 접종 후 7일째에, 마우스에서의 혈청형 14 다당류에 대한 항체 반응을 나타낸 그래프이다. 도 15에서, G1, G2 및 G3은 각각 상기 접합체 백신을 마우스당 0.3 ㎍, 1.0 ㎍ 및 3.0 ㎍으로 주입한 마우스 그룹이다. G4는 혈청형 14의 다당류 만을 1.0 ㎍으로 주사한 마우스이다. G5 및 G6은 슈도뉴몰이신 만을 1.0 ㎍ 및 3.0㎍으로 각각 주사한 마우스이다. G7은 보강체 사용없이, 혈청형 14의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체 백신을 1.0 ㎍으로 주사한 마우스이다. G4, G5 및 G6에서, 다당류에 대한 항체 반응은 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다.

실시예 6: 슈도뉴몰리신, 폐렴균 오토리신 및 폐렴균의 표면 단백질 DNA 백신용 발현 벡터 구축

A. DNA 백신 구축용 pVAXl 벡터

pVAXl 벡터(인비트로젠)는 DNA 백신의 개발에 사용할 목적으로 특별히 제작하였다. 이의 구조체는 1996년 12월 22일에 공표된, 식약청의 문건 "감염성 질환에 대한 예방 조치로서의 플라스미드 DNA 백신에 대한 고려사항"에 상응한 것이다.

B. 슈도뉴몰리신의 클로닝 및 발현

프라이머 및 혈청형 19A 폐렴균의 염색체 DNA를 포함하는 레디-투-고 PCR 비드(Amersham Pharmacia Biotech Inc. Piscataway, NJ)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 다음과 같이 실시되었다: 94℃에서 4분간 1회; 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1.5분으로 이루어진 주기를 30회 실시; 및 72℃에서 10분간 1회 실시.

증폭된 PCR 산물은 제한효소로 절단하고, pVAXI 벡터내로 삽입하여 pSA-8, pSA-45, pSA-12, pSA-42 및 pSA-41을 제조하였다. 재조합 DNA는 형질전환으로 E.coli DH5a 세포로 도입하고, 제한효소에 의한 절단으로 검증하였다. 삽입된 유전자는 DNA 서열분석으로 분석하였다. TnT 키트를 이용하고, 제조사(Promega, Madison, WI)의 설명서에 따라 생체외 전사 및 번역을 수행하여, 삽입된 유전자의 발현을 검증하였다.

pSA-8 발현벡터는 서열번호 1의 뉴몰리신 단백질의 1에서 460번까지의 아미노산들로 구성되는 폴리펩타이드를 코드화한다. LSYN-15 프라이머(5'-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3'; 서열번호 4) 및 LSYN-4 프라이머(5'-GACTGGATCCTTACTAGAGAGTTGTTCCCCAAATAG-3'; 서열번호 5)로 1380 bp의 DNA를 증폭시켜, 삽입체를 제조하였다. 1380 bp의 PCR 산물은 NheI 및 BamHI로 절단하고, pVAXl 벡터의 NheI 및 BamHI 부위에 삽입하여 pSA-8를 제조하였다.

pSA-45 발현 벡터는 서열번호 1의 뉴몰리신 단백질의 1에서 464번까지의 아미노산들로 구성되는 폴리펩타이드를 코드화한다. LSYN-15 프라이머(5'-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3'; 서열번호 4) 및 LSYN-105 프라이머(5'-GACTGGATCCCTATACCTGAGGATAGAGAGTTG-3'; 서열번호 27)로 1392 bp의 DNA를 증폭시켜, 삽입체를 제조하였다. PCR 산물은 NheI 및 BamHI로 절단하고, pVAXl 벡터의 NheI 및 BamHI 부위에 삽입하여 pSA-45를 제조하였다.

pSA-12 발현 벡터는 서열번호 1의 뉴몰리신 단백질의 1에서 466번까지의 아미노산들로 구성되는 폴리펩타이드를 코드화한다. LSYN-15 프라이머(5'-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3'; 서열번호 4) 및 LSYN-17 프라이머(5'-GACTGGATCCTTACTAATCTTCTACCTGAGGATAG-3'; 서열번호 6)로 1398 bp의 DNA를 증폭시켜, 삽입체를 제조하였다. 1398bp의 PCR 산물은 NheI 및 BamHI로 절단하고, pVAXl 벡터의 NheI 및 BamHI 부위에 삽입하여 pSA-12를 제조하였다.

pSA-42 발현 벡터는 서열번호 1의 뉴몰리신 단백질의 1에서 469번까지의 아미노산들로 구성되는 폴리펩타이드를 코드화한다. LSYN-15 프라이머(5'-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3'; 서열번호 4) 및 LSYN-37 프라이머(5'-GACTGGATCCTTACTATTCTACCTTATCTTCTACCTGAG-3'; 서열번호 7)로 1407 bp의 DNA를 증폭시켜, 삽입체를 제조하였다. 1407 bp의 PCR 산물은 NheI 및 BamHI로 절단하고, pVAXl 벡터의 NheI 및 BamHI 부위에 삽입하여 pSA-42를 제조하였다.

pSA-41 발현 벡터는 서열번호 1의 뉴몰리신 단백질의 1에서 470번까지의 아미노산들로 구성되는 폴리펩타이드를 코드화한다. LSYN-15 프라이머(5'-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3'; 서열번호 4) 및 LSYN-38 프라이머(5'-GACTGGATCCTTACTAATTTTCTACCTTATCTTCTACCTGAG-3'; 서열번호 8)로 1410 bp의 DNA를 증폭시켜, 삽입체를 제조하였다. 1410 bp의 PCR 산물은 NheI 및 BamHI로 절단하고, pVAXl 벡터의 NheI 및 BamHI 부위에 삽입하여 pSA-41을 제조하였다.

특정 서열내 또는 모티프내에 메틸화되지 않은 시토신-구아닌("CpG") 다이뉴클레오타이드를 함유하는 핵산은, 생체 외에서, 몇 종의 면역 세포에 대한 촉진자로서 가능성이 있다. CpG 모티프를 함유하는 합성 올리고뉴클레오타이드는, B-세포를 자극하여 증식 및 면역글로블린, IL-6 및 IL-10을 방출시키고, NK 세포를 자극하여 IFN-γ를 생산하고, 단핵구 및 수상 세포를 자극하여 IL-6, IL-12, IL-18, TNT-α 및 IFN-α를 생산하는, 선천면역 시스템을 직접적으로 활성화시킬 수 있다. 두개의 5' 퓨린 및 2개의 3'피리미딘의 측면에 메틸화되지 않은 CpG 다이뉴클레오티이드로 구성된 DNA 모티프는, B 세포를 자극하여 IL-6 및 IL-12를 생산하고, CD4+T 세포를 자극하여 IL-6 및 IFN-γ를 생산한다.

뉴몰리신에 대한 구조-기능 분석으로, 시스테인 잔기를 포함하고 있으며, 세포독성에 매우 중요한, 폴리펩타이드의 C 말단에 위치한 도메인(427에서 437번까지의 아미노산)을 확인하였다. 상기 시스테인 모티프는 티올-활성화성 사이톨리신 계열의 또다른 일원들에서 매우 잘 보존되어 있다. 상기 도메인 내에 단일 아미노산의 여러번의 치환은 뉴몰리신의 세포독성을 현저히 감소시킨다. 하기 핵산 구조체는, 뉴몰리신의 1272 및 1274 뉴클레오타이드 위치에 GAGCGTT를 (특정 위치 돌연변이를 통하여) 도입함으로써, 시스테인 모티프를 CpG 모티프로 치환한다. GAGCGTT 면역자극성 서열을 포함하는 돌연변이 핵산은 다음과 같다:

ATGGCAAATAAAGCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATGAATTACGATAAAAAGAAACTCTTGACCCATCAGGGAGAAAGTATTGAAAATCGTTTCATCAAAGAGGGTAATCAGCTACCCGATGAGTTTGTTGTTATCGAAAGAAAGAAGCGGAGCTTGTCGACAAATACAAGTGATATTTCTGTAACAGCTACCAACGACAGTCGCCTCTATCCTGGAGCACTTCTCGTAGTGGATGAGACCTTGTTAGAGAATAATCCCACTCTTCTTGCGGTCGATCGTGCTCCGATGACTTATAGTATTGATTTGCCTGGTTTGGCAAGTAGCGATAGCTTTCTCCAAGTGGAAGACCCCAGCAATTCAAGTGTTCGCGGAGCGGTAAACGATTTGTTGGCTAAGTGGCATCAAGATTATGGTCAGGTCAATAATGTCCCAGCTAGAATGCAGTATGAAAAAATCACGGCTCACAGCATGGAACAACTCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGACTTTGAAAAGACAGGGAATTCTCTTGATATTGATTTTAACTCTGTCCATTCAGGCGAAAAGCAGATTCAGATTGTTAATTTTAAGCAGATTTATTATACAGTCAGCGTAGATGCTGTTAAAAATCCAGGAGATGTGTTTCAAGATACTGTAACGGTAGAGGATTTAAAACAGAGAGGAATTTCTGCAGAGCGTCCTTTGGTCTATATTTCGAGTGTTGCTTATGGGCGCCAAGTCTATCTCAAGTTGGAAACCACGAGTAAGAGTGATGAAGTAGAGGCTGCTTTTGAAGCTTTGATAAAAGGAGTCAAGGTAGCTCCTCAGACAGAGTGGAAACAGATTTTGGACAATACAGAAGTGAAGGCGGTTATTTTAGGGGGCGACCCAAGTTCGGGTGCCCGAGTTGTAACAGGCAAGGTGGATATGGTAGAGGACTTGATTCAAGAAGGCAGTCGCTTTACAGCAGATCATCCAGGCTTGCCGATTTCCTATACAACTTCTTTTTTACGTGACAATGTAGTTGCGACCTTTCAAAATAGTACAGACTATGTTGAGACTAAGGTTACAGCTTACAGAAACGGAGATTTACTGCTGGATCATAGTGGTGCCTATGTTGCCCAATATTATATTACTTGGAATGAATTATCCTATGATCATCAAGGTAAGGAAGTCTTGACTCCTAAGGCTTGGGACAGAAATGGGCAGGATTTAACGGCTCACTTTACCACTAGTATTCCTTTAAAAGGGAATGTTCGTAATCTCTCTGTCAAAATTAGAGAGCGTTCCGGGCTTGCCTGGGAATGGTGGCGTACGGTTTATGAAAAAACCGATTTGCCACTAGTGCGTAAGCGGACGATTTCTATTTGGGGAACAACTCTCTATCCTCAGGTAGAAGATAAGGTAGAAAATGAC(서열번호 9)

다른 실시예에 있어서, 상기 면역 자극성 DNA 서열 GAGCGTT는, C-말단의 33개의 뉴클레오타이드가 제거된 슈도뉴몰리신 1272 내지 1274 뉴클레오타이드 위치에 (특정 위치 돌연변이를 통하여) 도입하였다. 면역자극성 서열을 갖는 수도뉴몰리신 DNA는 하기와 같다:

ATGGCAAATAAAGCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATGAATTACGATAAAAAGAAACTCTTGACCCATCAGGGAGAAAGTATTGAAAATCGTTTCATCAAAGAGGGTAATCAGCTACCCGATGAGTTTGTTGTTATCGAAAGAAAGAAGCGGAGCTTGTCGACAAATACAAGTGATATTTCTGTAACAGCTACCAACGACAGTCGCCTCTATCCTGGAGCACTTCTCGTAGTGGATGAGACCTTGTTAGAGAATAATCCCACTCTTCTTGCGGTCGATCGTGCTCCGATGACTTATAGTATTGATTTGCCTGGTTTGGCAAGTAGCGATAGCTTTCTCCAAGTGGAAGACCCCAGCAATTCAAGTGTTCGCGGAGCGGTAAACGATTTGTTGGCTAAGTGGCATCAAGATTATGGTCAGGTCAATAATGTCCCAGCTAGAATGCAGTATGAAAAAATCACGGCTCACAGCATGGAACAACTCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGACTTTGAAAAGACAGGGAATTCTCTTGATATTGATTTTAACTCTGTCCATTCAGGCGAAAAGCAGATTCAGATTGTTAATTTTAAGCAGATTTATTATACAGTCAGCGTAGATGCTGTTAAAAATCCAGGAGATGTGTTTCAAGATACTGTAACGGTAGAGGATTTAAAACAGAGAGGAATTTCTGCAGAGCGTCCTTTGGTCTATATTTCGAGTGTTGCTTATGGGCGCCAAGTCTATCTCAAGTTGGAAACCACGAGTAAGAGTGATGAAGTAGAGGCTGCTTTTGAAGCTTTGATAAAAGGAGTCAAGGTAGCTCCTCAGACAGAGTGGAAACAGATTTTGGACAATACAGAAGTGAAGGCGGTTATTTTAGGGGGCGACCCAAGTTCGGGTGCCCGAGTTGTAACAGGCAAGGTGGATATGGTAGAGGACTTGATTCAAGAAGGCAGTCGCTTTACAGCAGATCATCCAGGCTTGCCGATTTCCTATACAACTTCTTTTTTACGTGACAATGTAGTTGCGACCTTTCAAAATAGTACAGACTATGTTGAGACTAAGGTTACAGCTTACAGAAACGGAGATTTACTGCTGGATCATAGTGGTGCCTATGTTGCCCAATATTATATTACTTGGAATGAATTATCCTATGATCATCAAGGTAAGGAAGTCTTGACTCCTAAGGCTTGGGACAGAAATGGGCAGGATTTAACGGCTCACTTTACCACTAGTATTCCTTTAAAAGGGAATGTTCGTAATCTCTCTGTCAAAATTAGAGAGCGTTCCGGGCTTGCCTGGGAATGGTGGCGTACGGTTTATGAAAAAACCGATTTGCCACTAGTGCGTAAGCGGACGATTTCTATTTGGGGAACAACTCTC(서열번호 10)

D. 폐렴균 오토리신 유전자의 클로닝 및 발현

pSA-59 발현 벡터는 316개의 아미노산인, 오토리신(Aly) 폴리펩타이드를 코드화한다. 혈청형 19A Aly 유전자는 프라이머 및 혈청형 19A 폐렴균의 염색체 DNA를 포함하는 레디-투-고 PCR 비드를 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR은 다음과 같이 실시되었다: 94℃에서 4분간 1회; 94℃에서 1분, 50℃에서 1분 및 72℃에서 1분 15초로 이루어진 주기를 30회 실시; 및 72℃에서 10분간 1회 실시. 삽입체로, LSYN-74 프라이머(5'-GACTAAGCTTGCCACCATGGAAATTAATGTGAGTAAATTAAG-3'; 서열번호 11) 및 LSYN-89 프라이머(5'-CTGACTCGAGTTATTTTACTGTAATCAAGCCATC-3'; 서열번호 12)를 이용하여 948 bp의 DNA를 증폭시켰다.

PCR 합성한 DNA는 HindIII 및 XhoI 제한효소로 절단하고, pVAXI 벡터내 HindIII 및 XhoI 부위에 삽입하여 pSA-59(Aly)를 제조하였다. 재조합 DNA를 형질전환으로 E.coli DH5a 세포로 도입하고, HindIII 및 XhoI 제한효소에 의한 절단으로 검증하였다. Aly 삽입체는 DNA 서열분석으로 분석하였다. TnT 키트를 이용하고, 제조사(Promega, Madison, WI)의 설명서에 따라 생체 외 전사 및 번역을 수행하여, 삽입된 유전자의 발현을 검증하였다.

pSA-59 Aly 삽입체의 핵산 서열은 하기와 같다:

ATGGAAATTAATGTGAGTAAATTAAGAACAGATTTGCCTCAAGTTGGCGTGCAACCATATAGGCAAGTACACGCACACTCAACTGGGAATCCGCATTCAACCGTACAGAATGAAGCGGATTATCATTGGCGGAAAGACCCAGAATTAGGTTTTTTCTCGCACATTGTTGGGAACGGATGCATCATGCAGGTAGGACCTGTTAATAATGGTGCCTGGGACGTTGGGGGCGGTTGGAATGCTGAGACCTATGCAGCGGTTGAACTGATTGAAAGCCATTCAACTAAAGAAGAGTTCATGACGGACTACCGCCTTTATATCGAACTCTTACGCAATCTAGCAGATGAAGCAGGTTTGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAGTTTAGCTGGAATTAAAACGCACGAGTATTGCACGAATAACCAACCAAACAACCACTCAGACCATGTGGATCCATACCCTTACTTGGCAAAATGGGGCATTAGCCGTGAGCAGTTTAAGCATGATATTGAGAACGGCTTGACGATTGAAACAGGCTGGCAGAAGAATGACACTGGCTACTGGTACGTACATTCAGACGGCTCTTATCCAAAAGACAAGTTTGAGAAAATCAATGGCACTTGGTACTACTTTGACAGTTCAGGCTATATGCTTGCAGACCGCTGGAGGAAGCACACAGACGGCAATTGGTACTACTTTGACCAATCAGGCGAAATGGCTACAGGCTGGAAGAAAATCGCTGAGAAGTGGTACTATTTCAACGAAGAAGGTGCCATGAAGACAGGCTGGGTCAAGTACAAGGACACTTGGTACTACTTAGACGCTAAAGAAGGCGCAATGGTATCAAATGCCTTTATCCAGTCAGCGGACGGAACAGGCTGGTACTACCTCAAACCAGACGGAACACTGGCAGACAAGCCAGAATTCACAGTAGAGCCAGATGGCTTGATTACAGTAAAA(서열번호 13)

pSA-59 Aly 삽입체에 의해 코드화되는 아미노산 서열은 다음과 같다:

MEINVSKLRTDLPQVGVQPYRQVHAHSTGNPHSTVQNEADYHWRKDPELGFFSHIVGNGCIMQVGPVNNGAWDVGGGWNAETYAAVELIESHSTKEEFMTDYRLYIELLRNLADEAGLPKTLDTGSLAGIKTHEYCTNNQPNNHSDHVDPYPYLAKWGISREQFKHDIENGLTIETGWQKNDTGYWYVHSDGSYPKDKFEKINGTWYYFDSSGYMLADRWRKHTDGNWYYFDQSGEMATGWKKIAEKWYYFNEEGAMKTGWVKYKDTWYYLDAKEGAMVSNAFIQSADGTGWYYLKPDGTLADKPEFTVEPDGLITVK(서열번호 14)

E. N-말단 폐렴균 표면 단백질A(PspA) 유전자의 클로닝 및 발현

pSA-60 발현 벡터는 459개의 아미노산인 PspA 폴리펩타이드를 코드화한다. 혈청형 19A PspA 유전자는 프라이머 및 혈청형 19A 폐렴균의 염색체 DNA를 포함하는 레디-투-고 PCR 비드를 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR은 다음과 같이 실시되었다: 94℃에서 4분간 1회; 94℃에서 1분, 50℃에서 1분 및 72℃에서 1분 15초로 이루어진 주기를 30회 실시; 및 72℃에서 10분간 1회 실시. 삽입체로, LSYN-90 프라이머(5'-GACTAAGCTTGCCACCATGGAAGAAGCTCCCGTAGCTAGTCAG-3'; 서열번호 15) 및 LSYN-78 프라이머(5'-GACTCTCGAGCTATCCATCAGGGCCTAACTCATTAAG-3'; 서열번호 16)를 이용하여 1377 bp의 DNA를 증폭시켰다.

PCR 합성한 DNA는 HindIII 및 XhoI 제한효소로 절단하고, pVAXI 벡터내 HindIII 및 XhoI 부위에 삽입하여 pSA-60을 제조하였다. 재조합 DNA를 형질전환으로 E.coli DH5a 세포로 도입하고, HindIII 및 XhoI 제한효소에 의한 절단으로 검증하였다. PspA 삽입체는 DNA 서열분석으로 분석하였다. TnT 키트를 이용하고, 제조사(Promega, Madison, WI)의 설명서에 따라 생체 외 전사 및 번역을 수행하여, pSA-60의 발현을 검증하였다.

pSA-60 PspA 삽입체의 핵산 서열은 하기와 같다:

ATGGAAGAAGCTCCCGTAGCTAGTCAGTCTAAAGCTGAGAAAGACTATGATGCAGCAGTGAAAAAATCTGAAGCTGCTAAGAAGGCTTACGAAGAAGCTAAAAAGAAAGCAGAAGACGCTCAGAAAAAATATGATGAGGATCAGAAGAAAACTGAGGCAAAAGCGGATAAGGAAGCAAAAGCATCTGCGGAAATAGATAAAGCCACGTTTGCTGTACAAAGTGCGTATGTAAAATTTTTAAATGTCCAATCTAATCGTCAAATTTCGGAGAATGAACGAAAAAAACAATTAGCAGAAATAGATAAAGAGATAGAGAATGCTAAACAAAATTTACAGAATAAACAGGAAGAATTTAATAAGGTTAGAGCAGAAGTAATTCCTGAAGCAAAGGGGTTAGCTGTTACTAAACAAAAAGCGGAAGAAGCTAAAAAAGAAGCAGAAGTAGCTAAGAGAAAATATGATTATGCAACTCTAAAGGTAGCACTAGCGAAGAAAGAAGTAGAGGCTAAGGAACTTGAAATTGAAAAACTTCAATATGAAATTTCTACTTTGGAACAAGAAGTTGCTATTGCTCAACATCAAGTAGATAATTTGAAAAAACTTCTTGCTGGTGCGGATCCTGATGATGGCACAAAAGTTATAGAAGCTAAATTAAACAAAGGAGAAGCTGAGCTAAACGCTAAACAAGCTGAGTTAGCAAAAAAACAAACAGAACTTGAAAAACTTCTTGACAGCCTTGATCCTGAAGGTAAGACTCAGGATGAATTAGATAAAGAAGCTGCTGAAGCTGAGTTGGATAAAAAAGCTGATGAACTTCAAAATAAAGTTGCTGATTTAGAAAAAGGAATTGCTCCTTATCAAATCAAAGTCGCTGAATTAAATAAAGAAATTGCTAGACTTCAAAGCGATTTAAAAGATGCTGAAGAAAATAATGTAGAAGACTATATTAAAGAAGGTTTAGAGCAAGCTATCGCTGATAAAAAAGCTGAATTAGCTACAACTCAACAAAACATAGATAAAACTCAAAAAGATTTAGAGGATGCTGAATTAGAACTTGAAAAAGTATTAGCTACATTAGACCCTGAAGGTAAAACTCAAGATGAATTAGATAAAGAAGCTGCAGAAGATGCTAATATTGAAGCTCTTCAAAACAAAGTTGCTGATCTAGAAAACAAGGTTGCTGAATTAGATAAAGAAGTTACTAGACTTCAAAGCGATTTAAAAGATGCTGAAGAAAACAATGTAGAAGACTACGTTAAAGAAGGCTTAGATAAAGCTCTTACTGATAAAAAAGTTGAATTAAATAATACTCAAAAAGCATTAGATACTGCTCAAAAAGCATTAGATACTGCTCTTAATGAGTTAGGCCCTGATGGA(서열번호 17)

pSA-60 PspA 삽입체로부터 코드화되는 아미노산 서열은 다음과 같다:

MEEAPVASQSKAEKDYDAAVKKSEAAKKAYEEAKKKAEDAQKKYDEDQKKTEAKADKEAKASAEIDKATFAVQSAYVKFLNVQSNRQISENERKKQLAEIDKEIENAKQNLQNKQEEFNKVRAEVIPEAKGLAVTKQKAEEAKKEAEVAKRKYDYATLKVALAKKEVEAKELEIEKLQYEISTLEQEVAIAQHQVDNLKKLLAGADPDDGTKVIEAKLNKGEAELNAKQAELAKKQTELEKLLDSLDPEGKTQDELDKEAAEAELDKKADELQNKVADLEKGIAPYQIKVAELNKEIARLQSDLKDAEENNVEDYIKEGLEQAIADKKAELATTQQNIDKTQKDLEDAELELEKVLATLDPEGKTQDELDKEAAEDANIEALQNKVADLENKVAELDKEVTRLQSDLKDAEENNVEDYVKEGLDKALTDKKVELNNTQKALDTAQKALDTALNELGPDG (서열번호 18).

실시예 7: DMA 백신의 면역원성

플라스미드 벡터 pSA-7은 전장 뉴몰리신 단백질을 코드화한다. 혈청형 19A Ply 유전자는 프라이머 및 혈청형 19A 폐렴균의 염색체 DNA를 포함하는 레디-투-고 PCR 비드를 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR은 다음과 같이 실시되었다: 94℃에서 4분간 1회; 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1.5분으로 이루어진 주기를 30회 실시; 및 72℃에서 10분간 1회 실시. 5' 말단의 1에서 24번의 Ply 뉴클레오타이드에 상보적인 LSYN-15 프라이머(5'-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3'; 서열번호 4)와, 3' 말단의 1396에서 1413번의 Ply 뉴클레오타이드에 상보적인 LSYN-3 프라이머(5'-CAGTGGATCCTTACTAGTCATTTTCTACCTTATC-3'; 서열번호 3)를 사용하여, 471개의 아미노산으로 이루어진, 전장의 천연형 Ply 단백질을 코드화하는 1413bp의 DNA를 증폭하였다. PCR 합성한 DNA는 NheI 및 BamHI으로 처리하고, pVAXI 벡터내 NheI 및 BamHI 부위에 삽입하여 pSA-7을 제조하였다. 재조합 DNA를 형질전환으로 E.coli DH5a 세포로 도입하고, NheI 및 BamHI 제한효소에 의한 절단으로 검증하였다. 삽입된 혈청형 19A의 천연형 Ply 유전자는 DNA 서열분석으로 검증하였다.

플라스미드 벡터 pSA-10은 C-말단이 절단된 뉴몰리신 단백질(Ply의 C-말단에서 114개의 아미노산이 결손됨)을 코드화한다. 혈청형 19A Ply 유전자는 프라이머 및 혈청형 19A 폐렴균의 염색체 DNA를 포함하는 레디-투-고 PCR 비드를 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR은 다음과 같이 실시되었다: 94℃에서 4분간 1회; 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1.5분으로 이루어진 주기를 30회 실시; 및 72℃에서 10분간 1회 실시. 5' 말단의 1에서 24번의 Ply 뉴클레오타이드에 상보적인 LSYN-15 프라이머(5'-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3'; 서열번호 4)와, 3' 말단의 1054에서 1071번의 Ply 뉴클레오타이드에 상보적인 LSYN-6 프라이'-CTGAGGATCCTTACTAAGCTGTAACCTTAGTCTC-3'; 서열번호 19)를 사용하여, 357개의 아미노산을 코드화하는 1071bp의 DNA를 증폭하였다. PCR 합성한 DNA는 NheI 및 BamHI으로 처리하고, pVAXI 벡터내 NheI 및 BamHI 부위에 삽입하여 pSA-10을 제조하였다. 재조합 DNA를 형질전환으로 E.coli DH5a 세포로 도입하고, NheI 및 BamHI 제한효소에 의한 절단으로 검증하였다. 삽입된 혈청형 19A의 슈도뉴몰리신 유전자는 DNA 서열분석으로 검증하였다.

플라스미드 벡터 pSA-26은 CpG 모티프를 갖는 전장 뉴몰리신 단백질을 코드화한다. PCR 프라이머 LSYN-34 및 LSYN-33는 3' 말단의 CpG 모티프를 함유하는 두개의 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 포함하고 있는 것으로서, PCR1 및 PCR2에 사용하였다. 이차 프라이머로, LSYN-15 및 LSYN-3은 각각 뉴몰리신 N 및 C 말단 서열에 상보적이다. 각각의 증폭으로, LYSN-15 및 -34(PCR1)과 LYSN-33 및 -3(PCR2)를 포함하는 레디-투-고 PCR 비드를 이용하여,일차 PCR 산물들, 즉 PCR1(1.2 kb) 및 PCR2(150 bp)를 증폭하였고, 주형으로는 전장 뉴몰리신 유전자를 포함하는 pSA7을 사용하였다. 일차 PCR 산물들은 혼합 및 변성시킨 후, 이차 PCR 산물을 제조하기 위한 주형으로 이용하였으며, 이차 PCR 산물은 이차 세트 프라이머, LYSN-15 및 -3으로 증폭하였다. 이차 PCR 산물은 NheI 및 BamHI으로 절단하고, pVAXI 벡터내 NheI 및 BamHI 부위에 삽입하여 pSA-26을 제조하였다. PCR은 94℃에서 4분간 1회, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분으로 이루어진 주기를 30회 실시 및 72℃에서 8분간 1회 실시로 수행하였다.

LSYN-3, LSYN-15, LSYN-33 및 LSYN-34 프라이머들의 서열은 다음과 같다: LSYN-3 프라이머(5'-CAGTGGATCCTTACTAGTCATTTTCTACCTTATC-3'; 서열번호 3); LSYN-15 프라이머(5'-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3'; 서열번호 4); LSYN-33 프라이머(5'-CAAAATTAGAGAACGTTCCGGGCTTGCCTGGGAATGG-3';서열번호 20); LSYN-34 프라이머(5'-GCCCGGAACGTTCTCTAATTTTGACAGAGAGATTACG-3';서열번호 21).

재조합 DNA를 형질전환으로 E.coli DH5a 세포로 도입하고, NheI 및 BamHI 제한효소에 의한 절단으로 검증하였다. 삽입된 혈청형 19A의 천연형 Ply 유전자는, CpG 모티프를 함유한 것으로서, 이는 DNA 서열분석으로 검증하였다.

플라스미드 벡터 pSA-27은 CpG 모티프를 함유하며, C-말단이 절단된(11개 아미노산이 결손됨) 뉴몰리신 단백질을 코드화한다. PCR 프라이머 LSYN-34 및 LSYN-33는 3' 말단의 CpG 모티프를 함유하는 두개의 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 포함하고 있는 것으로서, PCR1 및 PCR2에 사용하였다. 이차 프라이머로, LSYN-15 및 LSYN-3은 각각 뉴몰리신 N 및 C 말단 서열에 상보적이다. 각각의 증폭으로, LYSN-15 및 -34(PCR1)과 LYSN-33 및 -3(PCR2)를 포함하는 레디-투-고 PCR 비드를 이용하여,일차 PCR 산물들, PCR1(1.2 kb) 및 PCR2(150 bp)을 증폭하였고, 주형으로는 전장 뉴몰리신 유전자를 포함하는 pSA7을 사용하였다.

일차 PCR 산물들은 혼합 및 변성시킨 후, 이차 PCR 산물을 제조하기 위한 주형으로 이용하였으며, 이차 PCR 산물은 이차 세트 프라이머, LYSN-15 및 -4로 증폭하였다. 이차 PCR 산물은 NheI 및 BamHI으로 절단하고, pVAXI 벡터내 NheI 및 BamHI 부위에 삽입하여 pSA-27을 제조하였다. PCR은 94℃에서 4분간 1회, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분으로 이루어진 주기를 30회 실시 및 72℃에서 8분간 1회 실시로 수행하였다. LSYN-3, LSYN-4, LSYN-15, LYSN-33 및 LSYN-34 프라이머들의 서열은 다음과 같다: LSYN-3 프라이머(5'-CAGTGGATCCTTACTAGTCATTTTCTACCTTATC-3'; 서열번호 3); LSYN-4 프라이머(5'-GACTGGATCCTTACTAGAGAGTTGTTCCCCAAATAG-3'; 서열번호 5); LSYN-15 프라이머(5'-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3'; 서열번호 4); LSYN-33 프라이머(5'-CAAAATTAGAGAACGTTCCGGGCTTGCCTGGGAATGG-3';서열번호 20); LSYN-34 프라이머(5'-GCCCGGAACGTTCTCTAATTTTGACAGAGAGATTACG-3';서열번호 21). 재조합 DNA를 형질전환으로 E.coli DH5a 세포로 도입하고, NheI 및 BamHI 제한효소에 의한 절단으로 검증하였다. CpG 모티프를 함유한 삽입된 혈청형 19A의 슈도뉴몰리신 유전자는, DNA 서열분석으로 검증하였다.

DNA 벡터로 촉발시키고(priming) 단백질로 북돋우는(boost) 백신접종 프로그램은, 특이 면역성을 높게 형성시키고, 경우에 따라 현재 백신 개발에 가장 큰 문제점인 감염성 물질를 방지한다. 실험들에서, 토끼에 뉴몰리신 DNA 벡터로 3회 접종시키고, 보강제 사용없이 뉴몰리신 단백질로 추가 접종하였다.

도 16은 전술한 바와 같이, 슈도뉴몰리신 DNA 백신 접종의 프라임-부스트 면역법을 이용한, 토끼에서의 항-뉴몰리신 항체 반응을 나타낸 그래프이다. 레인1,2 및 3은 슈도뉴몰리신 DNA 백신 접종을 근육내로 1차(1), 이차(2) 및 삼차(3) 실시한 후 7일째의 면역 반응을 나타낸다. 레인4는 단백질 부스트(200 ㎍ 뉴몰리신)후 10일째의 항체 반응을 나타낸다. 레인5는 뉴몰리신 단백질 200 ㎍을 TiterMax 보강제와 함께 주사한 후 10일째의 항체 반응을 나타낸다. 상기 결과들은, DNA 주사 및 단백질 부스트는 기존의 보강제를 이용한 단백질 백신 접종법에 비하여 보다 증가된 항체 반응을 발생시킴을 나타낸다.

DNA 백신 pSA-59 및pSA-60과 대조군 벡터 플라스미드 DNA를 각각 1X PBS에 최종부피 0.1 mL으로 100 ㎍을 사용하여, Balb/C 마우스의 사두근(quadriceps) 대퇴근육 또는 뒷다리에 근육내 주사하였다. 마우스에 2주 간격으로 100 ㎍의 DNA 백신을 4회 주사하였다. 마지막 주사 후 7일째에, 혈청의 IgG 항체 수치를 ELISA 로 측정하였다. DNA 백신을 4회 주사한 마우스에서는, 대조군 그룹에 비하여 IgG 항체가 9600 배 이상 높게 생성되어있었다. 이러한 결과는, 플라스미드 DNA는 생체내에서 오토리신 또는 폐렴균의 표면 단백질 A 항원으로 발현될 수 있으며, 면역 체계를 자극하여 마우스에서 특이 IgG 항체를 고농도로 생성시킬 수 있음을 의미한다.

도 17은 PspA DNA 백신을 4회 주사한 후 7일째에 폐렴균의 표면 단백질A에 대한 항체 반응 그래프이다. 도 18은 오토리신 DNA 백신을 4회 주사한 후 7일째에 폐렴균 오콜리신에 대한 항체 반응 그래프이다.

실시예 8: 이종 혈청형의 병독성 폐렴균 시험 감염에 대한 방어 면역 및 교차 방어

마우스에 혈청형 14의 다당류-슈도뉴몰리신(-7 아미노산) 접합체 2.5 ㎍을 2주 간격으로 3회 복막 주사하였다. 대조군은, 접합체 대신 PBS를 사용하였다. 3차 주사 후 8일째에, 면역화된 마우스에 1 x 10⁵ 내지 1x 10⁶ CFU (콜로니 형성 단위) 폐렴균/0.1 mL을 시험 감염시켰다. 주사한 정확한 CFU/mL은 양 혈액 한천 배지상의 플레이트 계수를 통해 확인하였다. 시험 감염 1, 3 및 5시간 후, 각 마우스의 혈액 시료 5 ㎕ 및 20 ㎕를 양 혈액 한천 배지위에 도말하고, 37℃에서 하룻밤동안 방치하였다. 시험 감염후, 접합체를 접종한 마우스의 혈액 시료는 대조군에 비하여 세균 제거능에 있어 현저한 차이점이 관찰되었다.

도 19는 혈청형 14의 폐렴균으로 시험 감염시, 혈청형 14의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역시킨 마우스의 혈액에서 관찰한 세균 제거능을 나타낸 것이다. 시험 감염 후 접합체 및 PBS 처리한 그룹 1, 3 및 5간에 현저한 CFU 차이가 있었다(P<0.01).

도 20은 혈청형 7의 폐렴균으로 시험 감염시, 혈청형 14의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역시킨 마우스의 혈액에서 관찰한 세균 제거능을 나타낸 것이다. 시험 감염 후 접합체 및 PBS 처리한 그룹 1, 3 및 5간에 현저한 CFU 차이가 있었다(P<0.01). 이러한 결과는, 접합체로 면역화된 마우스는 이종 혈청형의 폐렴균의 시험 감염에 대하여 교차 방어성이 있음을 나타낸다.

도 21은 혈청형 6B의 폐렴균으로 시험 감염시, 혈청형 14의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역시킨 마우스의 혈액에서 관찰한 세균 제거능을 나타낸 것이다. 시험 감염 후 접합체 및 PBS 처리한 그룹 1, 3 및 5간에 현저한 CFU 차이가 있었다(P<0.05). 이러한 결과는, 또한 접합체로 면역화된 마우스는 이종 혈청형의 폐렴균의 시험 감염에 대하여 교차 방어성이 있음을 나타낸다.

도 22는 혈청형 18C의 폐렴균으로 시험 감염시, 혈청형 14의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역시킨 마우스의 혈액에서 관찰한 세균 제거능을 나타낸 것이다. 시험 감염 후 접합체 및 PBS 처리한 그룹 1, 3 및 5간에 현저한 CFU 차이가 있었다(P<0.01). 이러한 결과는, 또한 접합체로 면역화된 마우스는 이종 혈청형의 폐렴균의 시험 감염에 대하여 교차 방어성이 있음을 나타낸다.

도 23-25는 혈청형 23F의 폐렴균으로 시험 감염시, 혈청형 14의 다당류-슈도뉴몰리신 접합체로 면역시킨 마우스의 혈액에서 관찰한 세균 제거능을 나타낸 것이다. 시험 감염 1시간 후(도 23), 3시간 후(도 24) 및 5시간 후(도 25), 접합체 및 PBS 처리한 그룹간에 현저한 CFU 차이가 있었다(P<0.01). 이러한 결과는, 또한 접합체로 면역화된 마우스는, 이종 혈청형의 폐렴균의 시험 감염에 대하여 교차 방어성이 있음을 나타낸다.

실시예 9: 항체매개탐식능 분석

A. 항체매개탐식능 분석

혈청형 14의 폐렴균 다당류에 대한 항체의 기능적 활성을, 인간 다형핵백혈구(PMNL)를 이용한 항체매개탐식능 분석으로 측정하였다. 항혈청을 연속 희석하고(이배수 희석), 각 혈청 시료 20 ㎕를 뇌 심장 주입 배지에서 약 200 CFU의 세균 현탁액 20 ㎕와 혼합하였고, 37 ℃에서 15분간 배양하였다. 배양후, 어린 토끼 보체(complement) 10 ㎕와 PMNL(4 x 10⁵ 세포) 40 ㎕을 첨가하였다. 상기 혼합물은 5 % 이산화탄소 분위기하에서 37℃로 60분간 두었다. 살아있는 세포 수를 측정하기 위하여, 각 시료 20 ㎕을 트리플리케이트 혈액 한천 플레이트(triplicate blood agar plate) 상에 접종하였고, 37℃로 하룻밤동안 두었다. 보체 대조군에서는, 폐렴균에 대한 항체를 제외하곤 모든 실험 시약을 포함한다. 항체매개탐식능 역가는 보체내에서 성장하였을때와 비교하여 >50 % 세균 취사율을 나타내는 가장 높은 혈액 희석율로 나타내었다.

B. 포식세포

새로운 PMNL을 건강한 지원자의 말초 혈액으로부터 덱스트란 침전 및 단핵구 세포와 PMNL의 피콜(ficoll)(ICN Biomedical Company,#16-922-54 Lymphocyte Separation Medium) 분리에 의해 분리하였다. 적혈구는 ACK 라이시스 완충액(BioFluids, Catalog number p304-100)으로 세포용해시켰다. 세포는 최종농도 1 x 10⁷ 세포/mL로 BME(Life TechnologiesGIBCO BRL, Basal Medium Eagle)내에서 적정하였다. PMNL 2-4 x 10⁵ 세포 40 ㎕을 시료로 사용하였다.

C. 마우스 혈청 및 세균

14 다당류에 대한 마우스 항혈청을 뇌- 심장 주입 배지로 연속 희석하였고(2 배수, 1:2에서 1:256), 각 혈청 시료 20 ㎕은 세균 현탁액(S. pneumoniae serotype 14, 200 CFU) 20 ㎕와 37℃에서 15분간 혼합하였다.

혈청형 14의 스트렙토코커스 뉴모니아는 37 ℃에서 10시간동안 뇌-심장 주입 배지에서 배양하였다. 10배수의 연속 희석액들을 제조하여 본 실험에 사용되는 세균 수를 결정하는데 이용하였다. 시료 100 ㎕을 플레이트에 가하였다. 1:10⁷ 희석 시료를 처리한 플레이트에서는 10 CFU가 검출되었고, 1:10⁶ 희석 시료를 처리한 플레이트에서는 91 CFU가 검출되었다. 따라서, 실험에 사용한 세균의 농도는 약 l x 10⁹ CFU/mL인 것으로 결정되었다. 혈청형 14의 스트렙토코커스 뉴모니아 1 x 10⁹ CFU/mL를 1 x 10⁴ CFU/mL로 희석하였다. 200 CFU/20 ㎕을 각 시료로 사용하였다.

D. 보체 및 PMNL

배양후, 어린 토기 보체(새로 수득한 어린 토끼의 혈청 분획 및 사용전 -80 ℃에서 보관함) 10 ㎕와 PMNL 2.8 x10⁵ 세포 40 ㎕를 혼합하였다. 상기 혼합물은 5 % 이산화탄소 분위기에서 37℃로 60분간 두었다.

E. CFU 계수

살아있는 세포 수를 측정하기 위하여, 1: 10 및 1: 100 희석 시료 각각 20 ㎕를 트리플레이트 혈액 한천 플레이트 상에 접종하고, 37℃에서 하룻밤동안 두어다. 대조군 보체는 폐렴균에 대한 항체를 제외하곤 모든 실험 시약을 사용하였다.

F. 항체매개탐식 활성

항체매개탐식 역가는 대조군 보체에서의 성장과 비교하여 >50% 세균 취사율을 나타내는 혈청의 최고 희석배수로 나타내었다.

도 5: 혈청형 14 다당류에 대한 마우스 항체의 항체매개탐식 활성

혈청 희석율

마우스# 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 대조군

백신1, CFU 12 20 22 25 28 32 45 81 취사율% 85% 76% 73% 69% 65% 60% 44%2,1, CFU 17 18 17 17 32 50 51 81 취사율% 79% 78% 79% 79% 60% 38% 37% 3, CFU 19 27 31 31 32 44 56 81 취사율% 77% 67% 62% 62% 60% 46% 31%4, CFU 15 22 23 19 33 36 40 81 취사율% 81% 73% 72% 77% 59% 56% 51%5, CFU 22 26 34 27 33 43 51 81 취사율% 73% 68% 58% 67% 59% 47% 37%6, CFU 22 17 19 28 43 51 57 81 취사율% 73% 79% 77% 65% 47% 37% 30%7, CFU 22 29 29 26 28 29 57 81 취사율% 73% 64% 64% 68% 65% 64% 30%8, CFU 31 23 31 35 48 63 63 81 취사율% 62% 72% 62% 57% 41% 22% 22%

항체매개탐식 활성에 대한 마우스 혈청 역가

#1,128 #2,64 #3,64 #4,256 #5,128 #6,32 #7,128 #8,32.

표 6: 혈청형 14 다당류(PS) 및 슈도뉴몰리신(PPN)에 대한 항체(Ab) 반응성

마우스 #	PS에 대한 Ab		PPN에 대한 Ab
	역가	OD₄₀₅(1:300)	역가	OD₄₀₅(1:300)

표 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 혈성형 14 다당류 및 슈도뉴몰리신에 대하여 높은 항체 반응을 나타내는 마우스(예 마우스 번호 1, 2, 3, 4, 5 및 7)는 높은 항체매개탐식 활성을 나타내었으나, 반면에 혈성형 14 다당류 및 슈도뉴몰리신에 대하여 낮은 항체 반응을 나타내는 마우스(예 마우스 번호 6 및 8)은 낮은 항체매개탐식 활성을 나타내었다. PBS를 주사한 마우스에서는 항체매개탐식 활성이 검출되지 않았다.

그외 실시예들

본 발명은 본원의 상세한 설명에 기술되어 있으나, 전술한 기재는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정할 의도는 아닌 것으로 이해된다. 본 발명의 다른 측면, 효과 및 변경은 하기 첨부한 청구의 범위내 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Synergy America, Inc. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING OR PREVENTING PNEUMOCOCCAL INFECTION <130> 12844-002WO1 <140> PCT/US2003/035529 <141> 2003-11-06 <150> US 60/424,497 <151> 2002-11-07 <160> 26 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 471 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 1 Met Ala Asn Lys Ala Val Asn Asp Phe Ile Leu Ala Met Asn Tyr Asp 1 5 10 15 Lys Lys Lys Leu Leu Thr His Gln Gly Glu Ser Ile Glu Asn Arg Phe 20 25 30 Ile Lys Glu Gly Asn Gln Leu Pro Asp Glu Phe Val Val Ile Glu Arg 35 40 45 Lys Lys Arg Ser Leu Ser Thr Asn Thr Ser Asp Ile Ser Val Thr Ala 50 55 60 Thr Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Glu 65 70 75 80 Thr Leu Leu Glu Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Val Asp Arg Ala Pro 85 90 95 Met Thr Tyr Ser Ile Asp Leu Pro Gly Leu Ala Ser Ser Asp Ser Phe 100 105 110 Leu Gln Val Glu Asp Pro Ser Asn Ser Ser Val Arg Gly Ala Val Asn 115 120 125 Asp Leu Leu Ala Lys Trp His Gln Asp Tyr Gly Gln Val Asn Asn Val 130 135 140 Pro Ala Arg Met Gln Tyr Glu Lys Ile Thr Ala His Ser Met Glu Gln 145 150 155 160 Leu Lys Val Lys Phe Gly Ser Asp Phe Glu Lys Thr Gly Asn Ser Leu 165 170 175 Asp Ile Asp Phe Asn Ser Val His Ser Gly Glu Lys Gln Ile Gln Ile 180 185 190 Val Asn Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Thr Val Ser Val Asp Ala Val Lys 195 200 205 Asn Pro Gly Asp Val Phe Gln Asp Thr Val Thr Val Glu Asp Leu Lys 210 215 220 Gln Arg Gly Ile Ser Ala Glu Arg Pro Leu Val Tyr Ile Ser Ser Val 225 230 235 240 Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Glu Thr Thr Ser Lys Ser 245 250 255 Asp Glu Val Glu Ala Ala Phe Glu Ala Leu Ile Lys Gly Val Lys Val 260 265 270 Ala Pro Gln Thr Glu Trp Lys Gln Ile Leu Asp Asn Thr Glu Val Lys 275 280 285 Ala Val Ile Leu Gly Gly Asp Pro Ser Ser Gly Ala Arg Val Val Thr 290 295 300 Gly Lys Val Asp Met Val Glu Asp Leu Ile Gln Glu Gly Ser Arg Phe 305 310 315 320 Thr Ala Asp His Pro Gly Leu Pro Ile Ser Tyr Thr Thr Ser Phe Leu 325 330 335 Arg Asp Asn Val Val Ala Thr Phe Gln Asn Ser Thr Asp Tyr Val Glu 340 345 350 Thr Lys Val Thr Ala Tyr Arg Asn Gly Asp Leu Leu Leu Asp His Ser 355 360 365 Gly Ala Tyr Val Ala Gln Tyr Tyr Ile Thr Trp Asn Glu Leu Ser Tyr 370 375 380 Asp His Gln Gly Lys Glu Val Leu Thr Pro Lys Ala Trp Asp Arg Asn 385 390 395 400 Gly Gln Asp Leu Thr Ala His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gly 405 410 415 Asn Val Arg Asn Leu Ser Val Lys Ile Arg Glu Cys Thr Gly Leu Ala 420 425 430 Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Tyr Glu Lys Thr Asp Leu Pro Leu Val 435 440 445 Arg Lys Arg Thr Ile Ser Ile Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Gln Val 450 455 460 Glu Asp Lys Val Glu Asn Asp 465 470 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gactagatct ccatatggca aataaagcag taaatgac 38 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cagtggatcc ttactagtca ttttctacct tatc 34 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gactgctagc caccatggca aataaagcag taaatgac 38 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gactggatcc ttactagaga gttgttcccc aaatag 36 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gactggatcc ttactaatct tctacctgag gatag 35 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gactggatcc ttactattct accttatctt ctacctgag 39 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gactggatcc ttactaattt tctaccttat cttctacctg ag 42 <210> 9 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated construct <400> 9 atggcaaata aagcagtaaa tgactttata ctagctatga attacgataa aaagaaactc 60 ttgacccatc agggagaaag tattgaaaat cgtttcatca aagagggtaa tcagctaccc 120 gatgagtttg ttgttatcga aagaaagaag cggagcttgt cgacaaatac aagtgatatt 180 tctgtaacag ctaccaacga cagtcgcctc tatcctggag cacttctcgt agtggatgag 240 accttgttag agaataatcc cactcttctt gcggtcgatc gtgctccgat gacttatagt 300 attgatttgc ctggtttggc aagtagcgat agctttctcc aagtggaaga ccccagcaat 360 tcaagtgttc 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ctttaccact agtattcctt taaaagggaa tgttcgtaat 1260 ctctctgtca aaattagaga gcgttccggg cttgcctggg aatggtggcg tacggtttat 1320 gaaaaaaccg atttgccact agtgcgtaag cggacgattt ctatttgggg aacaactctc 1380 tatcctcagg tagaagataa ggtagaaaat gac 1413 <210> 10 <211> 1380 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated construct <400> 10 atggcaaata aagcagtaaa tgactttata ctagctatga attacgataa aaagaaactc 60 ttgacccatc agggagaaag tattgaaaat cgtttcatca aagagggtaa tcagctaccc 120 gatgagtttg ttgttatcga aagaaagaag cggagcttgt cgacaaatac aagtgatatt 180 tctgtaacag ctaccaacga cagtcgcctc tatcctggag cacttctcgt agtggatgag 240 accttgttag agaataatcc cactcttctt gcggtcgatc gtgctccgat gacttatagt 300 attgatttgc ctggtttggc aagtagcgat agctttctcc aagtggaaga ccccagcaat 360 tcaagtgttc gcggagcggt aaacgatttg ttggctaagt ggcatcaaga ttatggtcag 420 gtcaataatg tcccagctag aatgcagtat gaaaaaatca cggctcacag catggaacaa 480 ctcaaggtca agtttggttc tgactttgaa aagacaggga attctcttga tattgatttt 540 aactctgtcc attcaggcga aaagcagatt cagattgtta attttaagca gatttattat 600 acagtcagcg tagatgctgt taaaaatcca ggagatgtgt ttcaagatac tgtaacggta 660 gaggatttaa aacagagagg aatttctgca gagcgtcctt tggtctatat ttcgagtgtt 720 gcttatgggc gccaagtcta tctcaagttg gaaaccacga gtaagagtga tgaagtagag 780 gctgcttttg aagctttgat aaaaggagtc aaggtagctc ctcagacaga gtggaaacag 840 attttggaca atacagaagt gaaggcggtt attttagggg gcgacccaag ttcgggtgcc 900 cgagttgtaa caggcaaggt ggatatggta gaggacttga ttcaagaagg cagtcgcttt 960 acagcagatc atccaggctt gccgatttcc tatacaactt cttttttacg tgacaatgta 1020 gttgcgacct ttcaaaatag tacagactat gttgagacta aggttacagc ttacagaaac 1080 ggagatttac tgctggatca tagtggtgcc tatgttgccc aatattatat tacttggaat 1140 gaattatcct atgatcatca aggtaaggaa gtcttgactc ctaaggcttg ggacagaaat 1200 gggcaggatt taacggctca ctttaccact agtattcctt taaaagggaa tgttcgtaat 1260 ctctctgtca aaattagaga gcgttccggg cttgcctggg aatggtggcg tacggtttat 1320 gaaaaaaccg atttgccact agtgcgtaag cggacgattt ctatttgggg aacaactctc 1380 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gactaagctt gccaccatgg aaattaatgt gagtaaatta ag 42 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ctgactcgag ttattttact gtaatcaagc catc 34 <210> 13 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSA-59 Aly insert <400> 13 atggaaatta atgtgagtaa attaagaaca gatttgcctc aagttggcgt gcaaccatat 60 aggcaagtac acgcacactc aactgggaat ccgcattcaa ccgtacagaa tgaagcggat 120 tatcattggc ggaaagaccc agaattaggt tttttctcgc acattgttgg gaacggatgc 180 atcatgcagg taggacctgt taataatggt gcctgggacg ttgggggcgg ttggaatgct 240 gagacctatg cagcggttga actgattgaa agccattcaa ctaaagaaga gttcatgacg 300 gactaccgcc tttatatcga actcttacgc aatctagcag atgaagcagg tttgccgaaa 360 acgcttgata cagggagttt agctggaatt aaaacgcacg agtattgcac gaataaccaa 420 ccaaacaacc actcagacca tgtggatcca tacccttact tggcaaaatg gggcattagc 480 cgtgagcagt ttaagcatga tattgagaac ggcttgacga ttgaaacagg ctggcagaag 540 aatgacactg gctactggta cgtacattca gacggctctt atccaaaaga caagtttgag 600 aaaatcaatg gcacttggta ctactttgac agttcaggct atatgcttgc agaccgctgg 660 aggaagcaca cagacggcaa ttggtactac tttgaccaat caggcgaaat ggctacaggc 720 tggaagaaaa tcgctgagaa gtggtactat ttcaacgaag aaggtgccat gaagacaggc 780 tgggtcaagt acaaggacac ttggtactac ttagacgcta aagaaggcgc aatggtatca 840 aatgccttta tccagtcagc ggacggaaca ggctggtact acctcaaacc agacggaaca 900 ctggcagaca agccagaatt cacagtagag ccagatggct tgattacagt aaaa 954 <210> 14 <211> 318 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide of pSA-59 Aly insert sequence <400> 14 Met Glu Ile Asn Val Ser Lys Leu Arg Thr Asp Leu Pro Gln Val Gly 1 5 10 15 Val Gln Pro Tyr Arg Gln Val His Ala His Ser Thr Gly Asn Pro His 20 25 30 Ser Thr Val Gln Asn Glu Ala Asp Tyr His Trp Arg Lys Asp Pro Glu 35 40 45 Leu Gly Phe Phe Ser His Ile Val Gly Asn Gly Cys Ile Met Gln Val 50 55 60 Gly Pro Val Asn Asn Gly Ala Trp Asp Val Gly Gly Gly Trp Asn Ala 65 70 75 80 Glu Thr Tyr Ala Ala Val Glu Leu Ile Glu Ser His Ser Thr Lys Glu 85 90 95 Glu Phe Met Thr Asp Tyr Arg Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Arg Asn Leu 100 105 110 Ala Asp Glu Ala Gly Leu Pro Lys Thr Leu Asp Thr Gly Ser Leu Ala 115 120 125 Gly Ile Lys Thr His Glu Tyr Cys Thr Asn Asn Gln Pro Asn Asn His 130 135 140 Ser Asp His Val Asp Pro Tyr Pro Tyr Leu Ala Lys Trp Gly Ile Ser 145 150 155 160 Arg Glu Gln Phe Lys His Asp Ile Glu Asn Gly Leu Thr Ile Glu Thr 165 170 175 Gly Trp Gln Lys Asn Asp Thr Gly Tyr Trp Tyr Val His Ser Asp Gly 180 185 190 Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr 195 200 205 Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr 210 215 220 Asp Gly Asn Trp Tyr Tyr Phe Asp Gln Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly 225 230 235 240 Trp Lys Lys Ile Ala Glu Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala 245 250 255 Met Lys Thr Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp 260 265 270 Ala Lys Glu Gly Ala Met Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp 275 280 285 Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Lys 290 295 300 Pro Glu Phe Thr Val Glu Pro Asp Gly Leu Ile Thr Val Lys 305 310 315 <210> 15 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gactaagctt gccaccatgg aagaagctcc cgtagctagt cag 43 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gactctcgag ctatccatca gggcctaact cattaag 37 <210> 17 <211> 1377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSA-60 PspA insert <400> 17 atggaagaag ctcccgtagc tagtcagtct aaagctgaga aagactatga tgcagcagtg 60 aaaaaatctg aagctgctaa gaaggcttac gaagaagcta aaaagaaagc agaagacgct 120 cagaaaaaat atgatgagga tcagaagaaa actgaggcaa aagcggataa ggaagcaaaa 180 gcatctgcgg aaatagataa agccacgttt gctgtacaaa gtgcgtatgt aaaattttta 240 aatgtccaat ctaatcgtca aatttcggag aatgaacgaa aaaaacaatt agcagaaata 300 gataaagaga tagagaatgc taaacaaaat ttacagaata aacaggaaga atttaataag 360 gttagagcag aagtaattcc tgaagcaaag gggttagctg ttactaaaca aaaagcggaa 420 gaagctaaaa aagaagcaga agtagctaag agaaaatatg attatgcaac tctaaaggta 480 gcactagcga agaaagaagt agaggctaag gaacttgaaa ttgaaaaact tcaatatgaa 540 atttctactt tggaacaaga agttgctatt gctcaacatc aagtagataa tttgaaaaaa 600 cttcttgctg gtgcggatcc tgatgatggc acaaaagtta tagaagctaa attaaacaaa 660 ggagaagctg agctaaacgc taaacaagct gagttagcaa aaaaacaaac agaacttgaa 720 aaacttcttg acagccttga tcctgaaggt aagactcagg atgaattaga taaagaagct 780 gctgaagctg agttggataa aaaagctgat gaacttcaaa ataaagttgc tgatttagaa 840 aaaggaattg ctccttatca aatcaaagtc gctgaattaa ataaagaaat tgctagactt 900 caaagcgatt taaaagatgc tgaagaaaat aatgtagaag actatattaa agaaggttta 960 gagcaagcta tcgctgataa aaaagctgaa ttagctacaa ctcaacaaaa catagataaa 1020 actcaaaaag atttagagga tgctgaatta gaacttgaaa aagtattagc tacattagac 1080 cctgaaggta aaactcaaga tgaattagat aaagaagctg cagaagatgc taatattgaa 1140 gctcttcaaa acaaagttgc tgatctagaa aacaaggttg ctgaattaga taaagaagtt 1200 actagacttc aaagcgattt aaaagatgct gaagaaaaca atgtagaaga ctacgttaaa 1260 gaaggcttag ataaagctct tactgataaa aaagttgaat taaataatac tcaaaaagca 1320 ttagatactg ctcaaaaagc attagatact gctcttaatg agttaggccc tgatgga 1377 <210> 18 <211> 459 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide of pSA-60 PspA insert sequence <400> 18 Met Glu Glu Ala Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr 1 5 10 15 Asp Ala Ala Val Lys Lys Ser Glu Ala Ala Lys Lys Ala Tyr Glu Glu 20 25 30 Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gln 35 40 45 Lys Lys Thr Glu Ala Lys Ala Asp Lys Glu Ala Lys Ala Ser Ala Glu 50 55 60 Ile Asp Lys Ala Thr Phe Ala Val Gln Ser Ala Tyr Val Lys Phe Leu 65 70 75 80 Asn Val Gln Ser Asn Arg Gln Ile Ser Glu Asn Glu Arg Lys Lys Gln 85 90 95 Leu Ala Glu Ile Asp Lys Glu Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asn Leu Gln 100 105 110 Asn Lys Gln Glu Glu Phe Asn Lys Val Arg Ala Glu Val Ile Pro Glu 115 120 125 Ala Lys Gly Leu Ala Val Thr Lys Gln Lys Ala Glu Glu Ala Lys Lys 130 135 140 Glu Ala Glu Val Ala Lys Arg Lys Tyr Asp Tyr Ala Thr Leu Lys Val 145 150 155 160 Ala Leu Ala Lys Lys Glu Val Glu Ala Lys Glu Leu Glu Ile Glu Lys 165 170 175 Leu Gln Tyr Glu Ile Ser Thr Leu Glu Gln Glu Val Ala Ile Ala Gln 180 185 190 His Gln Val Asp Asn Leu Lys Lys Leu Leu Ala Gly Ala Asp Pro Asp 195 200 205 Asp Gly Thr Lys Val Ile Glu Ala Lys Leu Asn Lys Gly Glu Ala Glu 210 215 220 Leu Asn Ala Lys Gln Ala Glu Leu Ala Lys Lys Gln Thr Glu Leu Glu 225 230 235 240 Lys Leu Leu Asp Ser Leu Asp Pro Glu Gly Lys Thr Gln Asp Glu Leu 245 250 255 Asp Lys Glu Ala Ala Glu Ala Glu Leu Asp Lys Lys Ala Asp Glu Leu 260 265 270 Gln Asn Lys Val Ala Asp Leu Glu Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Gln Ile 275 280 285 Lys Val Ala Glu Leu Asn Lys Glu Ile Ala Arg Leu Gln Ser Asp Leu 290 295 300 Lys Asp Ala Glu Glu Asn Asn Val Glu Asp Tyr Ile Lys Glu Gly Leu 305 310 315 320 Glu Gln Ala Ile Ala Asp Lys Lys Ala Glu Leu Ala Thr Thr Gln Gln 325 330 335 Asn Ile Asp Lys Thr Gln Lys Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Glu Leu 340 345 350 Glu Lys Val Leu Ala Thr Leu Asp Pro Glu Gly Lys Thr Gln Asp Glu 355 360 365 Leu Asp Lys Glu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Ile Glu Ala Leu Gln Asn 370 375 380 Lys Val Ala Asp Leu Glu Asn Lys Val Ala Glu Leu Asp Lys Glu Val 385 390 395 400 Thr Arg Leu Gln Ser Asp Leu Lys Asp Ala Glu Glu Asn Asn Val Glu 405 410 415 Asp Tyr Val Lys Glu Gly Leu Asp Lys Ala Leu Thr Asp Lys Lys Val 420 425 430 Glu Leu Asn Asn Thr Gln Lys Ala Leu Asp Thr Ala Gln Lys Ala Leu 435 440 445 Asp Thr Ala Leu Asn Glu Leu Gly Pro Asp Gly 450 455 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ctgaggatcc ttactaagct gtaaccttag tctc 34 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 caaaattaga gaacgttccg ggcttgcctg ggaatgg 37 <210> 21 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gcccggaacg ttctctaatt ttgacagaga gattacg 37 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 22 Lys Val Glu Asn Asp 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 23 Glu Asp Lys Val Glu Asn Asp 1 5 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 24 Tyr Pro Gln Val Glu Asp Lys Val Glu Asn Asp 1 5 10 <210> 25 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ctgaggatcc ttactatacc tgaggataga gagttgttc 39 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gactggatcc ctatacctga ggatagagag ttg 33

Claims

스트렙토코커스 뉴모니아의 캡슐 다당류가 접합된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물로서,

상기 폴리펩타이드는 400개 이상의 연속된 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질 아미노산으로 구성된 단편을 포함하며;

상기 폴리펩타이드에는 KVEND 아미노산 서열(서열번호 22)이 결손되어 있으며;

상기 폴리펩타이드에는 용혈성이 결핍되어 있으며;

상기 조성물은 포유류에 투여시 스트렙토코커스 뉴모니아에 대한 면역 반응을 유발하는 것을 특징으로 하는,

스트렙토코커스 뉴모니아의 캡슐 다당류가 접합된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 460번까지의 아미노산들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 464번까지의 아미노산들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 465번까지의 아미노산들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 466번까지의 아미노산들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 469번까지의 아미노산들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 470번까지의 아미노산들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드에는 아미노산 서열 EDKVEND(서열번호 23)이 결손된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 서열 YPQVEDKVEND(서열번호 24)이 결손된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1 에서 460번까지의 아미노산 잔기들로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1 에서 464번까지의 아미노산 잔기들로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1 에서 465번까지의 아미노산 잔기들로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1 에서 466번까지의 아미노산 잔기들로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1 에서 469번까지의 아미노산 잔기들로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1 에서 470번까지의 아미노산 잔기들로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 캡슐 다당류는 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 캡슐 다당류는 혈청형 14인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 캡슐 다당류는 혈청형 18C인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F로 이루어진 군으로부터 선택되는 서로 다른 캡슐 다당류를 복수개 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 면역 반응은 체액성 면역 반응을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 면역 반응은 세포성 면역 반응을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 면역 반응은 스트렙토코커스 뉴모니아 캡슐 다당류에 대한 면역 반응인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 면역 반응은 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질에 대한 면역 반응인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 면역 반응은 스트렙토코커스 뉴모니아 캡슐 다당류 및 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질에 대한 면역 반응인 것을 특징으로 하는 조성물.
스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질의 400개 이상의 연속된 아미노산으로 구성된 단편을 함유하는 폴리펩타이드를 코드화하는 핵산을 포함한 핵산 서열이 작동가능하도록 연결된 프로모터를 포함하는 포유류 발현 벡터로서,

상기 폴리펩타이드에는 아미노산 서열 KVEND(서열번호 22)가 결손되어 있으며;

상기 폴리펩타이드에는 용혈성이 결핍되어 있으며; 및

상기 발현 벡터를 포유류에 투여하는 경우 상기 폴리펩타이드는 스트렙토코커스 뉴모니아에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는, 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 460번까지의 아미노산들을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 464번까지의 아미노산들을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 465번까지의 아미노산들을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 466번까지의 아미노산들을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 469번까지의 아미노산들을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 470번까지의 아미노산들을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드에는 아미노산 서열 EDKVEND(서열번호 23)이 결손된 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드에는 아미노산 서열 YPQVEDKVEND(서열번호 24)가 결손된 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 460번까지의 아미노산 잔기들로 구성된 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 464번까지의 아미노산 잔기들로 구성된 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 465번까지의 아미노산 잔기들로 구성된 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 466번까지의 아미노산 잔기들로 구성된 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 469번까지의 아미노산 잔기들로 구성된 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 1에서 470번까지의 아미노산 잔기들로 구성된 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 면역 반응은 체액성 면역 반응을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 면역 반응은 세포성 면역 반응을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 면역 반응은 스트렙토코커스 뉴모니아의 뉴몰리신 단백질에 대한 면역 반응인 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
스트렙토코커스 뉴모니아 오토리신 폴리펩타이드를 코드화하는 핵산을 포함한 핵산 서열이 작동가능하도록 연결된 프로모터를 포함하는 포유류 발현 벡터로서,

상기 발현 벡터를 포유류에 투여하는 경우 상기 폴리펩타이드는 스트렙토코커스 뉴모니아에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는, 포유류 발현 벡터.
제 45항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 45항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 45항에 있어서, 상기 면역 반응은 체액성 면역 반응을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 45항에 있어서, 상기 면역 반응은 세포성 면역 반응을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
스트렙토코커스 뉴모니아의 폐렴균 표면 단백질 A 폴리펩타이드를 코드화하는 핵산을 포함한 핵산 서열이 작동가능하도록 연결된 프로모터를 포함하는 포유류 발현 벡터로서,

상기 발현 벡터를 포유류에 투여하는 경우 상기 폴리펩타이드는 스트렙토코커스 뉴모니아에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는, 포유류 발현 벡터.
제 50항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 50항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 18의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 50항에 있어서, 상기 면역 반응은 체액성 면역 반응을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
제 50항에 있어서, 상기 면역 반응은 세포성 면역 반응을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유류 발현 벡터.
서열번호 1의 1에서 460번까지의 아미노산들, 서열번호 1의 1에서 464번까지의 아미노산들, 서열번호 1의 1에서 466번까지의 아미노산들 및 서열번호 1의 1에서 469번까지의 아미노산들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드.
제 1항 기재의 조성물을 포유류에서 스트렙토코커스 뉴모니아에 대한 면역 반응이 유도되는 유효량으로 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 56항에 있어서, 상기 면역 반응은 예방학적 면역 반응인 것을 특징으로 하는 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 56항에 있어서, 상기 면역 반응은 치료학적 면역 반응인 것을 특징으로 하는 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 56항에 있어서, 상기 면역 반응은 상기 조성물내 존재하는 캡슐 다당류 혈청형과는 다른 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니아 1종 이상에 대하여 교차 반응성을 나타내는 것을 특징으로 하는 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 59항에 있어서, 상기 캡슐 다당류는 혈청형 7인 것을 특징으로 하는 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 59항에 있어서, 상기 캡슐 다당류는 혈청형 6B인 것을 특징으로 하는 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 59항에 있어서, 상기 캡슐 다당류는 혈청형 18C인 것을 특징으로 하는 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 59항에 있어서, 상기 캡슐 폴리사타라이드는 혈청형 23F인 것을 특징으로 하는 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 56항에 있어서, 상기 면역 반응은 스트렙토코커스 뉴모니아를 제외한 1종 이상의 스트렙토코커스 속 균주에 대하여 교차 반응성을 나타내는 것을 특징으로 하는 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 26항 기재의 발현 벡터를, 포유류에서 스트렙토코커스 뉴모니아에 대한 면역 반응이 유도되기에 효과적인 함량으로 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 65항에 있어서, 상기 면역 반응은 스트렙토코커스 뉴모니아를 제외한 1종 이상의 스트렙토코커스 속 균주에 대하여 교차 반응하는 것을 특징으로 하는 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 45항 기재의 발현 벡터를, 포유류에서 스트렙토코커스 뉴모니아에 대한 면역 반응이 유도되는 유효량으로 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 67항에 있어서, 상기 면역 반응은 스트렙토코커스 뉴모니아를 제외한 1종 이상의 스트렙토코커스 속 균주에 대하여 교차 반응성을 나타내는 것을 특징으로 하는 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 50항 기재의 발현 벡터를, 포유류에서 스트렙토코커스 뉴모니아에 대한 면역 반응이 유도되는 유효량으로 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 69항에 있어서, 상기 면역 반응은 스트렙토코커스 뉴모니아를 제외한 1종 이상의 스트렙토코커스 속 균주에 대하여 교차 반응성을 나타내는 것을 특징으로 하는 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
스트렙토코커스 뉴모니아의 뉴몰리신 폴리펩타이드 또는 그것의 항원성 단편을 코드화하는 핵산을 포함하는 핵산 서열이 작동가능하도록 연결된 프로모터를 포함하는 포유류 발현 벡터를 포유류에 투여하는 단계; 및 정제된 뉴몰리신 폴리펩타이드 또는 그것의 항원성 단편을 포유류에 투여하는 단계를 포함하며,

상기 병용 투여에 의해 포유류에서 스트렙토코커스 뉴모니아의 뉴몰리신에 대한 면역 반응이 유도되는 것을 특징으로 하는,

포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 71항에 있어서, 상기 포유류에 상기 발현 벡터를 2회 이상으로 투여하는 것을 특징으로 하는 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 71항에 있어서, 상기 뉴몰리신 또는 그것의 항원성 단편은 발현 벡터 투여 후 1주일 이상 경과 후에 투여하는 것을 특징으로 하는 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
스트렙토코커스 뉴모니아를 제외한 세균성 다당류가 접합된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물로서,

상기 폴리펩타이드는 400개 이상의 연속된 스트렙토코커스 뉴모니아 뉴몰리신 단백질 아미노산으로 구성된 단편을 포함하며;

상기 폴리펩타이드에는 KVEND 아미노산 서열(서열번호 22)이 결손되어 있으며;

상기 폴리펩타이드에는 용혈성이 결핍되어 있으며; 및

상기 조성물은 포유류에 투여시 스트렙토코커스 뉴모니아를 제외한 세균에 대하여 면역 반응을 유발하는 것인,

스트렙토코커스 뉴모니아를 제외한 세균성 다당류가 접합된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물.
제 74항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니아를 제외한 세균은 폐렴균, 헤모필러스 인플루엔자 b형, 수막구균성 그룹 A, B 또는 C, 및 그룹 B 스트렙토코커스 Ia, Ib, II, III, V 또는 VIII형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 74항 기재의 조성물을, 포유류에서 스트렙토코커스 뉴모니아를 제외한 세균에 대하여 면역 반응이 유도되는 유효량으로 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 76항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니아를 제외한 세균은 폐렴균, 헤모필러스 인플루엔자 b형, 수막구균성 그룹 A, B 또는 C 및 그룹 B 스트렙토코커스 Ia, Ib, II, III, V 또는 VIII형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 포유류에서의 면역 반응 유도 방법.
제 1항 기재의 조성물에 결합하는 정제된 항체.
제 1항 기재의 조성물에 결합하는 정제된 항체를, 치료학적 또는 예방학적 유효량으로 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 스트렙토코커스 뉴모니아 감염을 치료 또는 예방하는 방법.