CN1711105A - 治疗或预防肺炎球菌感染的组合物与方法 - Google Patents
治疗或预防肺炎球菌感染的组合物与方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1711105A CN1711105A CNA2003801027586A CN200380102758A CN1711105A CN 1711105 A CN1711105 A CN 1711105A CN A2003801027586 A CNA2003801027586 A CN A2003801027586A CN 200380102758 A CN200380102758 A CN 200380102758A CN 1711105 A CN1711105 A CN 1711105A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- expression vector
- seq
- amino acid
- compositions
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 86
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 55
- 208000035109 Pneumococcal Infections Diseases 0.000 title abstract description 17
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 177
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 175
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 172
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 89
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 46
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 30
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 128
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 127
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 113
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims description 91
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 83
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 83
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims description 79
- 101710183389 Pneumolysin Proteins 0.000 claims description 59
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 claims description 42
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 40
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 40
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 40
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 claims description 38
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 35
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 claims description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 27
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 24
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 23
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 15
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 13
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 12
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 10
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 claims description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 7
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 claims description 5
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 claims description 5
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims description 4
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 claims description 4
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 claims 1
- 230000003497 anti-pneumococcal effect Effects 0.000 abstract 1
- 108010011834 Streptolysins Proteins 0.000 description 75
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 64
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 63
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 53
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 52
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 31
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 27
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 22
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 20
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 16
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 15
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 15
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 13
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 13
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 13
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 12
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 102220023258 rs387907548 Human genes 0.000 description 12
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 10
- 101150063938 ply gene Proteins 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 9
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 230000000753 anti-hemolysin Effects 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 8
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 7
- 101150045534 aly gene Proteins 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 7
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 7
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 7
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 7
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 5
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 241000053227 Themus Species 0.000 description 5
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 101100344900 Caenorhabditis elegans let-19 gene Proteins 0.000 description 4
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 4
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 102220369447 c.1352G>A Human genes 0.000 description 4
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- YXXURDJTDAAEPH-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropanethioic s-acid Chemical group CC(N)C(S)=O YXXURDJTDAAEPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 102220369446 c.1274G>A Human genes 0.000 description 3
- 102220369445 c.668T>C Human genes 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 102220023257 rs387907546 Human genes 0.000 description 3
- 102220023256 rs387907547 Human genes 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940046168 CpG oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- -1 cyclic polysaccharide Chemical class 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical class N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 201000001178 Bacterial Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 101710164918 Choline-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 206010027253 Meningitis pneumococcal Diseases 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 240000007711 Peperomia pellucida Species 0.000 description 1
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 description 1
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 description 1
- 206010054047 Pneumococcal sepsis Diseases 0.000 description 1
- 229920001231 Polysaccharide peptide Polymers 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 241000235342 Saccharomycetes Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N borane Chemical compound B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010277 boron hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000006880 cross-coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000007933 dermal patch Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- TWNIBLMWSKIRAT-VFUOTHLCSA-N levoglucosan Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2CO[C@@H]1O2 TWNIBLMWSKIRAT-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 208000004593 pneumococcal meningitis Diseases 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010022457 polysaccharide peptide Proteins 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150080370 pspA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 239000012779 reinforcing material Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 102220004457 rs11567847 Human genes 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
- C07K14/3156—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci from Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供用以治疗或预防肺炎球菌感染的多肽、多糖-多肽轭合物、以及表达载体。该组合物在给予哺乳动物时会引起抗肺炎球菌的免疫反应。该组合物可预防性作为接种个体的疫苗和/或治疗性在感染的个体内引起治疗性的免疫反应。
Description
相关的美国申请
本申请要求于2002年11月7日提交的第60/424,497号的美国临时专利申请的优先权。所述在前申请的全部内容在此引用作为参考。
技术领域
本发明涉及多肽、肺炎球菌多糖-多肽轭合物、编码肺炎球菌多肽的表达载体、引起抗肺炎球菌免疫反应的方法、及肺炎球菌感染的治疗与预防方法。
背景技术
肺炎链球菌(S.pneumoniae)是通常可引起儿童、老人及免疫缺乏个体细菌性肺炎、脑膜炎、中耳炎及菌血症。肺炎链球菌可根据该菌体的荚膜多糖进一步分为约90种血清型。然而,通常由约30种的肺炎链球菌致病。世界卫生组织估计每年一百万的儿童因肺炎球菌脑膜炎及败血症而死亡,其中98%的死亡发生在发展中国家。具有抗药性的肺炎球菌株的出现使除抗微生物以外的治疗及预防肺炎球菌感染的方法更为需要。
发明概述
本发明的一个方面以组合物为特征,其含有与肺炎链球菌荚膜多糖轭合的多肽,其中所述多肽含有肺炎链球菌溶血素(pneumolysin)蛋白质的至少400连续氨基酸的片段,其中所述多肽缺乏氨基酸序列KVEND(SEQ ID NO:22)(例如在羧基末端),其中所述多肽缺乏溶血活性,及所述组合物在给予哺乳动物时会引起抗肺炎链球菌的免疫反应(如体液免疫反应和/或细胞免疫反应)。此免疫反应为预防性和/或治疗性免疫反应。
肺炎链球菌溶血素蛋白质可含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。某些实施方案中,所述多肽含有SEQ ID NO:1的1-460氨基酸。在其它实施方案中,所述多肽含有SEQ ID NO:1的1-464氨基酸、SEQ IDNO:1的1-465氨基酸、SEQ ID NO:1的1-466氨基酸、SEQ ID NO:1的1-469氨基酸、或SEQ ID NO:1的1-470氨基酸。
所述多肽可选择性缺乏氨基酸序列EDKVEND(SEQ ID NO:23)或氨基酸序列YPQVEDKVEND(SEQ ID NO:24)。
某些实施方案中,所述多肽由以下所构成:SEQ ID NO:1的1-460氨基酸残基,SEQ ID NO:1的1-464氨基酸残基,SEQ ID NO:1的1-465氨基酸残基,SEQ ID NO:1的1-466氨基酸残基,SEQ ID NO:1的1-469氨基酸残基,或SEQ ID NO:1的1-470氨基酸残基。
某些实施方案中,所述荚膜多糖选自血清型4型、6B型、9V型、14型、18C型、19F型、及23F型。在一实施方案中,所述荚膜多糖为血清型14型。在另一实施方案中,所述荚膜多糖为血清型18C型。所述组合物可选择性含有多种不同的选自血清型4型、6B型、9V型、14型、18C型、19F型、及23F型的荚膜多糖。
由所述组合物可引起直接抗肺炎链球菌荚膜多糖、抗肺炎链球菌溶血素蛋白质、或抗肺炎链球菌荚膜多糖与抗肺炎链球菌溶血素蛋白质的免疫反应。
另一方面,本发明的特征为一种哺乳动物表达载体,其包含可操作地连接于核酸序列的启动子,所述核酸序列含有编码含肺炎链球菌溶血素蛋白质至少400连续氨基酸片段多肽的核酸,其中所述多肽缺乏氨基酸序列KVEND(SEQ ID NO:22)(例如在羧基端),所述多肽缺乏溶血活性,及在给予哺乳动物表达载体时,所述多肽会引起抗肺炎链球菌的免疫反应(如体液免疫反应和/或细胞免疫反应)。此免疫反应可为预防性和/或治疗性免疫反应。
所述肺炎链球菌溶血素蛋白质可含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。某些实施方案中,所述编码的多肽含有SEQ ID NO:1的1-460氨基酸。其它实施方案中,所述编码的多肽含有SEQ ID NO:1的1-464氨基酸、SEQ ID NO:1的1-465氨基酸、SEQ ID NO:1的1-466氨基酸、SEQ ID NO:1的1-469氨基酸、或SEQ ID NO:1的1-470氨基酸。
所述编码的多肽可选择性缺乏氨基酸序列EDKVEND(SEQ IDNO:23)或氨基酸序列YPQVEDKVEND(SEQ ID NO:24)。
某些实施方案中,所述多肽由以下构成,SEQ ID NO:1的1-460氨基酸残基,SEQ ID NO:1的1-464氨基酸残基、SEQ ID NO:1的1-465氨基酸残基、SEQ ID NO:1的1-466氨基酸残基、SEQ ID NO:1的1-469氨基酸残基、或SEQ ID NO:1的1-470氨基酸残基。
由所述编码的多肽引起的免疫反应能够直接对抗肺炎链球菌溶血素蛋白质。
另一方面,本发明特征为哺乳动物表达载体,其含有可操作地连接于核酸序列的启动子,所述核酸序列含有编码肺炎链球菌自溶素多肽的核酸,其中在给予哺乳动物所述表达载体时,所述多肽会引起抗肺炎链球菌的免疫反应(如体液免疫反应和/或细胞免疫反应)。此免疫反应可为预防性和/或治疗性免疫反应。
某些实施方案中,所述编码的多肽含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列。其它实施方案中,所述编码的多肽由SEQ ID NO:14的氨基酸序列所构成。
另一方面,本发明特征为一哺乳动物表达载体,其含有可操作性连接于核酸的启动子,所述核酸含有编码肺炎球菌表面蛋白A多肽的核酸,其中在给予哺乳动物所述表达载体时,所述多肽会引起抗肺炎链球菌的免疫反应(如体液免疫反应和/或细胞免疫反应)。此免疫反应可为预防性和/或治疗性免疫反应。
某些实施方案中,所述编码的多肽含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列。其它实施方案中,所述编码的多肽由SEQ ID NO:18的氨基酸序列所构成。
另一方面,本发明特征为含有选自SEQ ID NO:1的1-460氨基酸,SEQ ID NO:1的1-464氨基酸、SEQ ID NO:1的1-465氨基酸、SEQ ID NO:1的1-466氨基酸、及SEQ ID NO:1的1-469氨基酸的氨基酸序列的多肽。
另一方面,本发明特征为引起哺乳动物免疫反应的方法,其通过给予哺乳动物一定量的有效引起所述哺乳动物抗肺炎链球菌的免疫反应本发明所述组合物而进行。此免疫反应可为预防性和/或治疗性免疫反应。
某些实施方案中,所述免疫反应为抗至少一型肺炎链球菌血清型的交叉反应性反应,其不同于所述组合物中存在的所述荚膜多糖血清型(如血清型7型、6B型、18C型、或23F型)。某些实施方案中,所述免疫反应为对抗至少一种链球菌属中的非肺炎链球菌种的交叉反应性反应。
另一方面,本发明特征为引起哺乳动物免疫反应的方法,其通过给予哺乳动物一定量的有效引起所述哺乳动物抗肺炎链球菌的免疫反应的本发明所述表达载体(例如,溶血素、假溶血素、自溶素、或肺炎球菌表面蛋白A表达载体)。此免疫反应可为预防性和/或治疗性免疫反应。某些实施方案中,所述免疫反应为对抗至少一种链球菌属中的非肺炎链球菌种交叉反应性反应。
另一方面,本发明特征为引起哺乳动物免疫反应的方法:给予哺乳动物一种哺乳动物表达载体,所述表达载体含有可操作地连接于含编码肺炎链球菌溶血素多肽或其抗原片段的核酸的启动子,并给予所述哺乳动物所述纯化的肺炎链球菌溶血素多肽或其抗原片段,其中结合给药引起哺乳动物抗肺炎链球菌溶血素的免疫反应。
某些实施方案中,所述哺乳动物给予至少2、3或更多独立剂量的所述表达载体。所述剂量能以至少1、2、3、4、5、6、7或更多天数分别进行。
某些实施方案中,肺炎链球菌溶血素多肽或其抗原片段的给药为所述表达载体给药后的至少1、2、3、4、5、6、7或更多天数。
另一方面,本发明特征为组合物,其含与非肺炎链球菌细菌多糖轭合的多肽,其中所述多肽含有肺炎链球菌溶血素蛋白质的至少400连续氨基酸片段,其中所述多肽缺乏氨基酸序列KVEND(SEQ IDNO:22),所述多肽缺乏溶血活性,及所述组合物在给予哺乳动物时,会引起抗非肺炎链球菌的免疫反应。某些实施方案中,非肺炎链球菌选自肺炎球菌;流感嗜血杆菌b型;脑膜炎球菌A、B、或C群;及B群链球菌Ia、Ib、II、III、V、或VIII型。此组合物能引起哺乳动物体内免疫反应,通过给予所述哺乳动物一定量的有效引起所述哺乳动物体内抗非肺炎链球菌的免疫反应所述组合物而实现。
另一方面,本发明特征为纯化抗体,其轭合于(例如选择性轭合于)本发明的组合物或多肽。例如,抗体可特异性轭合于组合物,所述组合物含有与肺炎链球菌荚膜多糖轭合的多肽,其中所述多肽含有肺炎链球菌溶血素蛋白质的至少400连续氨基酸片段,其中所述多肽缺乏氨基酸序列KVEND(SEQ ID NO:22)(例如在羧基端),所述多肽缺乏溶血活性,及在给予哺乳动物表达载体时,所述组合物会引起抗肺炎链球菌的免疫反应(如体液免疫反应和/或细胞免疫反应)。此抗体可为如单克隆或多克隆抗体。如杂合瘤的细胞株能用来制备分泌本发明的抗体。此抗体可用于治疗或预防肺炎链球菌感染,其通过给予所述哺乳动物治疗或预防性有效量的所述纯化抗体来实现。
本发明的一优点为某些实施方案中,第一血清型肺炎链球菌多糖-多肽轭合物可意外地提供交叉保护,对抗肺炎链球菌第二血清型的感染。所述交叉保护可增加所给轭合物在治疗或预防由多于一种肺炎链球菌血清型感染的有效性。由上所述,在无须提供每一种特定血清型的轭合物下,本发明可提供对抗肺炎链球菌多种血清型的保护。
本发明的另一优点为某些实施方案中,所述假溶血素多肽缺乏溶血活性。因此,所述假溶血素轭合物及表达载体与含有具溶血活性的天然溶血素或具部份溶血活性的类毒素溶血素的组合物相比,减少或缺乏毒性。
本发明的另一优点为某些实施方案中,编码溶血素截短物的表达载体,相反于编码溶血素点突变物的核酸,不可能回复而因此编码具溶血活性的毒性蛋白质。由于所述溶血素截短物缺乏导致溶血活性的部分溶血素在所述表达载体核酸序列的任何突变应不能再产生所述毒性。
除非另有定义,本发明所述的所有技术性及科学性术语具有本发明所属的技术领域的技术人员通常理解的相同意义。虽然与本发明所述的相似或相同的方法及材料可用于本发明的实践或实验,但以下对失活的方法与材料进行描述。所有本发明所述的公开文章、专利申请文献、专利、及其它参考书目均在此全部引用作为参考。假使术语上有争议,本说明书将加以限制。而且所述材料及方法仅为说明的目的,并不是对本发明的限制。
本发明其它特征及优点将从下列详细说明及所附权利要求书中显而易见。
附图的简要说明
图1为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗溶血素IgG抗体产生。
图2为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗多糖IgG抗体产生。
图3为小鼠在血清型18C型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗溶血素IgG抗体产生。
图4为小鼠在血清型18C型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗多糖IgG抗体产生。
图5为小鼠在血清型19F型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗溶血素IgG抗体产生。
图6为小鼠在血清型19F型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗多糖IgG抗体产生。
图7为小鼠在血清型23F型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗溶血素IgG抗体产生。
图8为小鼠在血清型23F型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗多糖IgG抗体产生。
图9为小鼠在血清型4型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗溶血素IgG抗体产生。
图10为小鼠在血清型4型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗多糖IgG抗体产生。
图11为小鼠在血清型6B型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗溶血素IgG抗体产生。
图12为小鼠在血清型6B型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗多糖IgG抗体产生。
图13为小鼠在血清型9V型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗溶血素IgG抗体产生。
图14为小鼠在血清型9V型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后所引起的抗多糖IgG抗体产生。
图15为肺炎链球菌血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物第3次注射后,对肺炎链球菌血清型14型多糖的抗体反应。
图16以假肺炎链球菌溶血素DNA疫苗的初级强化(prime-boost)策略,产生的兔抗溶血素的抗体反应。
图17为注射编码肺炎球菌表面蛋白A的DNA疫苗的表达载体后的抗体反应。
图18为注射编码自溶素DNA疫苗的表达载体后的抗体反应。
图19为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后,感染肺炎链球菌血清型14型后的细菌清除率。
图20为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后,感染肺炎链球菌血清型7型后的细菌清除率。
图21为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后,感染肺炎链球菌血清型6B型后的细菌清除率。
图22为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后,感染肺炎链球菌血清型18C型后的细菌清除率。
图23为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后,感染肺炎链球菌血清型23F型后1小时的细菌清除率。
图24为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后,感染肺炎链球菌血清型23F型后3小时的细菌清除率。
图25为小鼠在血清型14型多糖假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫后,感染肺炎链球菌血清型23F型后5小时的细菌清除率。
发明的详细描述
本发明提供治疗或预防肺炎球菌的感染的组合物及方法。本发明所述的多肽、多糖-多肽轭合物、及表达载体在给予哺乳动物时,会引起所述哺乳动物的抗肺炎球菌免疫反应。这些组合物能用于对个体的预防性疫苗接种和/或治疗性引起感染个体的治疗免疫反应。
多糖-蛋白质轭合物
多肽可与肺炎链球菌荚膜多糖以共价或非共价方式轭合。一般而言,所述轭合物的多肽成分包含肺炎链球菌溶血素蛋白质部分或突变的肺炎链球菌溶血素蛋白质;缺乏氨基酸序列KVEND(SEQ IDNO:22);及缺乏溶血活性。所述多糖-多肽在给予哺乳动物时引起抗肺炎链球菌的免疫反应。所述免疫反应能直接抗所述多肽、所述多糖、或所述多肽与所述多糖的组合物。
所述轭合物的多肽成分能够利用重组DNA技术、天然物中纯化、或化学合成而制备。一般而言,所述多肽成分的氨基酸序列与天然生成的肺炎链球菌溶血素蛋白质不同。肺炎链球菌19A型溶血素多肽的序列如SEQ ID NO:1(如实施例1)所述。示例性的轭合物的多肽成分包含但不限于SEQ ID NO:1的氨基酸1-460、1-461、1-462、1-463、1-464、1-465、1-466、1-469、及1-470。
编码肺炎链球菌溶血素蛋白质的截短型和/或突变型的核酸可经如聚合链反应(PCR)制备。编码此等蛋白质的核酸可选择含有对特定表达系统偏好或不偏好的密码子。例如,所述核酸可为至少1个密码子改变,优选为至少10%或20%的密码子改变,因而使所述序列适合在于大肠杆菌、酵母菌、人、昆虫或CHO细胞中表达。
编码肺炎链球菌溶血素蛋白质的截短型和/或突变型的核酸可融合于编码下列物质的核酸序列:(1)其它肺炎球菌蛋白质,如自溶素、表面蛋白A、神经氨酸酶、透明质酸溶解产物、胆碱结合蛋白A,或(2)来自有机体的非肺炎球菌蛋白质,如流感嗜血杆菌b型、脑膜炎球菌A、B、或C群,或链球菌B群。编码此融合蛋白质的核酸在表达系统中表达。
因宿主可能缺乏抗载体多糖的事先存在抗体,因此溶血素的截短物可用于多糖载体。溶血素在肺炎球菌感染中为剧毒因子,在不同亚型的肺炎球菌中所述溶血素几乎无抗原差异。
所述多糖-蛋白质轭合物在给予如人的哺乳动物时,所引起的免疫反应的强度、形式和/或时间超过仅给予多糖成分所引起的免疫反应。因此,所述多肽成分必须有足以引起所述增强免疫反应的一段长度。自然产生的肺炎链球菌溶血素蛋白质片段,其所述片段至少为8、10、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、425、450、460、465、460、465或更多的氨基酸长度。关于多肽,序列不同于天然产生的肺炎链球菌蛋白质,所述多肽至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更多相同于天然产生的肺炎链球菌蛋白质,如SEQ ID NO:1。
所述多肽成分优选缺乏天然肺炎链球菌溶血素蛋白质的溶血活性。一般而言,所述多肽成分显现出低于天然肺炎链球菌溶血素蛋白质的溶血活性的30%、20%、10%、5%、1%或更低。溶血活性分析可参见实施例3。通常,多肽的溶血活性可通过将所述多肽与如羊红血细胞的红细胞一起孵育,分析由所述多肽引起的溶血反应,予以确定(参见如Owen et al.(1 994)FEMS Microbiology Letters121:217-222,为示例性溶血分析的说明)。
所述轭合物的多糖成分可为任何肺炎链球菌的荚膜多糖,包含但不限于亚型1,2,3,4,5,6B,7F,8,9N,9V,10A,11A,12F,14,15B,17F,18C,19A,19F,19A,20,22F,23A,23F,24F,27,33F,或34中的任何亚型。某些实施方案中,所述荚膜多糖选自亚型4,6B,9V,14,18C,19F,或23F。某些实施方案中,所述多糖为血清型14。其它实施方案中,所述多糖为血清型18C。一种或多种不同荚膜多糖可与单一多肽或多种多肽轭合。例如,多价轭合物可包含至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10种不同荚膜多糖。多糖可通过如单键连接(仅所述多糖的一端与所述多肽连接)、或通过环状键(单一多肽连接在环状多糖)或通过交联(多种多糖连接至多种多肽)与多肽轭合。
纯化多肽的方法,如实施例中所述假溶血素多肽,及实施例4所述多糖与多肽的轭合。关于多肽或多糖纯化及轭合过程的其它详细说明如美国专利第4,242,501;4,686,102;5,623,057;及5,565,204号所述。
本发明所述轭合物或多肽可给予哺乳动物,引起所述哺乳动物对肺炎链球菌的免疫反应(预防和/或治疗免疫反应)。含有轭合物或多肽的药物组合物可以在适合作为疫苗的药物可接受的载体、缓冲液、或防腐剂中给药,其包括但不限于生理食盐水或其它可注射液体。疫苗内也可惯例存在添加物,例如如乳糖或山梨糖醇的稳定剂;及促进免疫原性反应的辅剂,如磷酸铝、氢氧化铝、或硫酸铝及硬脂酪氨酸。所制备的疫苗亦可作为多价疫苗的组分,所述多价疫苗为对多种感染源引起的免疫反应。
所述组合物可以任何本领域已知的方法给予,如口服、肌肉内、静脉内、动脉内、椎管内、皮内、腹膜内、鼻内、肺内、眼内、阴道内、直肠内、或皮下给予。其可介入肠胃道或呼吸道中,例如经吸入含所述轭合物的溶液或粉末。某些实施方案中,所述组合物可经皮肤贴片给药。
药物组合物(如疫苗)以足以引起抗体产生的一定量给予,其成为免疫原性反应的一部分。由许多因素决定任何给定患者的给药剂量,包含患者体积、一般健康状况、性别、体表面积、年龄、给予的特定化合物、给药时间及路径、及同时给予的其它药物。具有常规技术的药剂师容易确定理想的剂量。
组合物引起宿主哺乳动物免疫反应的能力可通过本领域所属技术人员公知的免疫反应测量方法分析。例如,细胞毒性T细胞的产生可由51Cr释放分析方法确认,或通过测量细胞内细胞因子表达或分泌,或使用主要组织相容性复合体(MHC)四合体得知。标准分析,如酶连免疫吸收分析(ELISA)或酶连免疫斑(ELISPOT),可用于测量因T细胞活化的细胞因子谱。T细胞增殖可以3H-胸苷摄取分析及其它公知分析测量。B细胞反应可使用本领域公知的如ELISA测量的分析。亦可使用其它的方法学评估所述轭合物对致病原相关损害或其它致病原水平的作用(如经所述轭合物处理的感染小鼠中肺炎球菌的清除率)。
本发明所述组合物可使用于药物的制造,以预防或治疗肺炎链球菌的感染或此感染相关的状态。
抗体
抗多糖、溶血素或其组合物的抗体可用于预防或治疗的应用,以使第一个体到第二个体产生免疫能力(如放大第二个体对肺炎链球菌的免疫反应或当第二个体为免疫兼容患者时提供反应)。可在免疫兼容宿主体中产生抗多糖、溶血素或其组合物的抗体(如经由给予所述免疫兼容患者本发明所述轭合物),从所述宿主中收获该抗体,并灌输至需要治疗或预防的受者,因此给予所述受者抗所述溶血素毒素及肺炎链球菌以及其它轭合由所述轭合物(如所述轭合物的所述多糖成分)引起的抗体的任何可能的细菌抵抗力。
由本发明所述组合物引起的抗体可制备成药物组合物,并用于赋予个体预防或治疗性的免疫反应。药物组合物的适和组分及给药方法如本发明所述。关于引起的被动免疫,所述药物组合物可含有多克隆抗体或单克隆抗体或其片段的衍生物。如标准临床技术所确定的,药物组合物含有预防性或治疗性有效剂量的抗体、片段或衍生物。编码肺炎球菌多肽的核酸
编码肺炎球菌多肽或其片段或变异体的核酸可给药至哺乳动物(如人),以在所述的哺乳动物中产生预防和/或治疗的免疫反应。所述免疫反应可为抗肺炎球菌体液和/或细胞免疫反应。
由所述核酸编码的多肽包含本发明所述轭合物的多肽、实施例所述假溶血素多肽、以及自溶素及肺炎球菌表面蛋白A及其片段和变异体。而且,核酸可编码二或以上的多肽、片段或变异体的组合物。此外,核酸可编码这些多肽、片段或变体的两种或更多种的组合。
核酸表达构建体可经由标准重组DNA方法制备。在构建体中可包含调控元件以促进编码所述多肽的核酸的表达。这些元件包含在人或其它哺乳动物中增进表达的序列,如启动子、在编码序列的5’和/或3’的RNA稳定序列,内含子(可位于所述编码序列内或附近的任何位置上)、聚(A)添加位点、以及复制起点和一个或多个编码选择性比标记的基因,所述标记使所述构建体在原核和/或真核宿主中复制并被选择出。T7聚合酶启动子或其它形式启动子(如组织特异性启动子或细胞特异性启动子如肌肉特异性启动子)选择性存在于所述编码序列的5’端,编码FLAG或其它mAb决定子的序列选择性存在于所述编码序列的3’端。所述构建体亦可包含其它转录及翻译信号,如Kozak序列。
所述构建体可另外包含编码目标信号的序列,所述目标信号将该编码多肽导向所欲的细胞内腔室,所述目标信号连接于所述多肽。目标信号可使所述编码多肽导向内质网(ER)、高尔基氏体、核、溶酶体、II级肽负载腔室、或内涵体,并包含信号肽、ER保留肽、及溶酶体目标肽。
所述核酸可用于任何可在哺乳动物细胞内表的的载体(vector)中。所述载体可为非病毒载体如质粒或细菌载体、整合病毒载体、或非整合病毒载体。适合载体例如其PCR产物可直接快速克隆的pcDNA哺乳动物表达载体家族(Invitrogen)。
各种传递系统可用于传递编码多肽的核酸至适当细胞中。编码所述多肽的核酸可在药物可接受载体中传递,如生理盐水,或有稀释剂或无稀释剂的胶状悬浮液或粉末。核酸可裸露或与传递载体连接,并利用本领域公知的传递系统传递,如脂质、脂质体、微球体、微颗粒、或微胶囊、金颗粒、ISCOMS、纳米颗粒、聚合物、浓缩剂、多糖、聚氨基酸、树突体、植物皂素、QS21、吸收增强材料、佐剂、或脂肪酸。核酸亦可传递至细胞中,如使用电穿孔法在体或体外传递至骨骼肌肉细胞中。
所述核酸可使用标准方法给药,如Donnelly等人,J.Immunol.Methods 176:145,1994,及Vitiello等人,J.Clin.Invest.95:341,1995中所述,可以任何本领域公知的方式传递至个体中,如口服、肌肉内、静脉内、动脉内、椎管内、皮内、腹膜内、鼻内、肺内、眼内、阴道内、直肠内、或皮下给予。其可介入肠胃道或呼吸道中,例如经吸入含所述轭合物的溶液或粉末。给药可为局部或全身性。
预期约100-2000μg核酸的剂量给予一个体。当患者为成人时,疫苗治疗方法如以微颗粒传递时,可肌肉内、皮内、吸入或皮下给药10-1000μg质粒DNA;或肌肉内或皮内给予裸露质粒DNA约10-2500μg,如100-2000μg,或500-1000μg,重复3-6次。如医学领域所公知的,任何患者的剂量给予依据许多因素,包含患者体积、一般健康状况、性别、体表面积、年龄、给予的特定化合物、给药时间及路径、及同时给予的其它药物。理想剂量是具有常规技术的药剂师容易确定的。
也可使用其它标准传递方法,如生物弹射击转移(biolistictransfer)或体外活体治疗(ex vivo)。体外活体治疗(ex vivo)中,抗原提呈细胞(APCs)如树突细胞、外围血液单核细胞或骨髓细胞可从患者或适当捐赠者中获得,且用所述核酸体外活体(ex vivo)活化,然后植入或再灌入患者中。
所述核酸可单独给药或与本领域公知的其它治疗组合给药,如抗微生物剂。而且,所述核酸可与其它设计增进免疫反应的治疗组合给药,如与本领域公知的佐剂、细胞因子(或编码细胞因子的核酸)、或CpG寡核苷酸共同给药。
核酸引起宿主哺乳动物免疫反应的能力可通过本领域公知的检测免疫反应的方法分析。例如,细胞毒T细胞的产生可在标准51Cr释放分析测定,或通过检测细胞内细胞因子表达或分泌得知,或使用MHC四合体测定。标准分析,如ELISA或ELISPOT,可用于检测因T细胞活化的细胞因子谱。T细胞增殖可以3H-胸苷摄取分析及其它公知分析来检测。B细胞反应可使用公知的如ELISA分析来检测。亦可使用其它方法来评估所述轭合物对致病原相关损害或其它致病原水平上的作用(如经所述轭合物处理的感染小鼠中肺炎球菌的清除率)。
本发明所述核酸可用于药物的制造以预防或治疗肺炎链球菌的感染或所述感染的相关状态。
本发明将在下列实施例进一步说明,以下实施例并非用以限定权利要求定义的本发明的范围。
实施例
实施例1:假溶血素表达载体的构建
表达溶血素多肽截短型的载体描述于实施例1A-1E。所述编码的截短多肽称为“假溶血素”多肽,可与溶血素多糖轭合,制备所述轭合物疫苗。而且,编码溶血素多肽的核酸可给予个体,以产生抗所述编码的多肽的免疫反应。
以肺炎链球菌19A型染色体DNA为模板进行PCR,扩增所述溶血素基因的不同片段。用于PCR反应的有义引物退火于翻译起始密码子的上游的溶血素基因的编码序列,并连接有特定的限制性内切酶位点。所述有义引物为LYSN-1(5’-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’;SEQ ID NO:2),与溶血素基因5’端的1-24核苷酸互补。其反义引物为LYSN-3(5’-CAGTGGATCCTTACTAGTCATTTTCTACCTTATC-3’;SEQ ID NO:3),与溶血素基因3’端的1396-1413溶血素核苷酸互补。所述引物扩增编码溶血素蛋白质全长471个氨基酸的1413bp的DNA。以下是肺炎链球菌19A型溶血素蛋白质的氨基酸序列:MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYISSVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTISIWGTTLYPQVEDKVEND(SEQ ID NO:1)。
PCR一般进行如下:94℃、4分钟,1个循环;随后为94℃、1分钟,55℃、1分钟,72℃、1.5分钟,30个循环;及最后72℃、10分钟1个循环。以NdeI及BamHI限制性内切酶消化所述PCR合成的DNA片段,并将其连接至pET11b表达载体(形成pSA-14)。将此重组DNA转化至大肠杆菌DE3细胞中。筛选抗氨苄青霉素(Ampicillin)的转化子。由NdeI及BamHI限制性内切酶消化来确认所述DNA片段是否插入。
与野生型基因组序列比较,所述扩增的DNA片段3’端缺乏核苷酸。由此种修饰核酸所编码的假溶血素多肽为非溶血性及非细胞毒性,但仍保留免疫原性能力。
A.pSA-1表达载体的构建
所述的pSA-1表达载体编码由溶血素蛋白质SEQ ID NO:1的1-460氨基酸所构成的多肽。以肺炎链球菌19A型染色体DNA进行PCR,使用LSYN-1(5’-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’;SEQ ID NO:2)及LSYN-4(5’-GACTGGATCCTTACTAGAGAGTTGTTCCCCAAATAG-3’;SEQ ID NO:5)引物扩增1380bp DNA。
所述PCR合成的DNA片段以NdeI及BamHI限制内切酶消化,连接至pET11b表达载体的NdeI及BamHI限制性内切酶位点,形成pSA-1。将此重组DNA通过转化引入大肠杆菌DE3细胞中。筛选抗氨苄青霉素(Ampicillin)的转化子。由NdeI及BamHI限制性内切酶确认所述DNA片段是否插入,并进一步由DNA序列分析确定。
所述编码的460氨基酸多肽缺少野生型溶血素蛋白质羧基端的11个氨基酸,其具有下列序列:
MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPA RMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYIS SVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPS S GARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTISIWGTTL(SEQ ID NO:1的氨基酸1-460)。
B.pSA-49表达载体的构建
所述的pSA-49表达载体编码由溶血素蛋白质SEQ ID NO:1的1-464氨基酸所构成的多肽。以肺炎链球菌19A型染色体DNA进行PCR,使用LSYN-1(5’-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’;SEQ ID NO:2)及LSYN-54(5’-CTGAGGATCCTTACTATACCTGAGGATAGAGAGTTGTTC-3’;SEQ ID NO:25)引物扩增1392bp DNA。
所述PCR合成的DNA片段以NdeI及BamHI限制性内切酶消化,连接至pET11b表达载体的NdeI及BamHI限制性内切酶位点,形成pSA-49。将此重组DNA通过转化引入大肠杆菌DE3细胞中。筛选氨苄青霉素(Ampicillin)的转化子。由NdeI及BamHI限制性内切酶确认所述DNA片段是否插入,并进一步由DNA序列分析确定。
所述编码的464氨基酸多肽缺少野生型溶血素蛋白质羧基端的7个氨基酸,其具有下列序列:MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYISSVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTISIWGTTLYPQV(SEQ ID NO:1的氨基酸1-464)。
C.pSA-11表达载体的构建
所述pSA-11表达载体编码由溶血素蛋白质SEQ ID NO:1的1-466氨基酸所构成的多肽。以肺炎链球菌19A型染色体DNA进行PCR,使用LSYN-1(5’-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’;SEQ ID NO:2)及LSYN-17(5’-GACTGGATCCTTACTAATCTTCTACCTGAGGATAG-3’;SEQ ID NO:6)引物扩增1398bp DNA。
所述PCR合成的DNA片段以NdeI及BamHI限制性内切酶消化,连接至pET11b表达载体的NdeI及BamHI限制性内切酶位点,形成pSA-11。将此重组DNA通过转化引入大肠杆菌DE3细胞中。筛选氨苄青霉素(Ampicillin)的转化子。由NdeI及BamHI限制性内切酶确认所述DNA片段是否插入,并进一步由DNA序列分析确定。
所述编码的466氨基酸多肽缺少野生型溶血素蛋白质羧基端的5个氨基酸,其具有下列序列:MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYISSVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTISIWGTTLYPQVED(SEQ ID NO:1的氨基酸1-466)。
D.pSA-32表达载体的构建
所述pSA-32表达载体编码由溶血素蛋白质SEQ ID NO:1的1-469氨基酸所构成的多肽。以肺炎链球菌19A型染色体DNA进行PCR,使用(5’-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’;SEQ ID NO:2)及LSYN-37(5’-GACTGGATCCTTACTATTCTACCTTATCTTCTACCTGAG-3’;SEQ ID NO:7)引物扩增1407bp DNA。
所述PCR合成的DNA片段以NdeI及BamHI限制性内切酶消化,连接至pET11b表达载体的NdeI及BamHI限制性内切酶位点,形成pSA-32。将此重组DNA通过转化引入大肠杆菌DE3细胞中。筛选氨苄青霉素(Ampicillin)的转化子。由NdeI及BamHI限制性内切酶确认所述DNA片段是否插入,并进一步由DNA序列分析确定。
所述编码的469氨基酸多肽缺少野生型溶血素蛋白质羧基端的2个氨基酸,其具有下列下列序列:MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYIS SVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTISIWGTTLYPQVEDKVE(SEQ ID NO:1的氨基酸1-469)。
E.pSA-31表达载体的构建
所述pSA-31表达载体编码由溶血素蛋白质SEQ ID NO:1的1-470氨基酸所构成的多肽。以肺炎链球菌19A型染色体DNA进行PCR,使用LSYN-1(5’-GACTAGATCTCCATATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’;SEQ ID NO:2)及LSYN-38(5’-GACTGGATCCTTACTAATTTTCTACCTTATCTTCTACCTGAG-3’;SEQ ID NO:8)引物扩增1410bp DNA。
所述PCR合成的DNA片段以NdeI及BamHI限制性内切酶消化,连接至pET11b表达载体的NdeI及BamHI限制性内切酶位点,形成pSA-31。将此重组DNA通过转化引入大肠杆菌DE3细胞中。筛选氨苄青霉素(Ampicillin)的转化子。由NdeI及BamHI限制性内切酶确认所述DNA片段是否插入,并进一步由DNA序列分析确定。
所述编码的470氨基酸多肽缺少野生型溶血素蛋白质羧基端的1个氨基酸,其具有下列序列:MANKAVNDFILAMNYDKKKLLTHQGESIENRFIKEGNQLPDEFVVIERKKRSLSTNTSDISVTATNDSRLYPGALLVVDETLLENNPTLLAVDRAPMTYSIDLPGLASSDSFLQVEDPSNSSVRGAVNDLLAKWHQDYGQVNNVPARMQYEKITAHSMEQLKVKFGSDFEKTGNSLDIDFNSVHSGEKQIQIVNFKQIYYTVSVDAVKNPGDVFQDTVTVEDLKQRGISAERPLVYISSVAYGRQVYLKLETTSKSDEVEAAFEALIKGVKVAPQTEWKQILDNTEVKAVILGGDPSSGARVVTGKVDMVEDLIQEGSRFTADHPGLPISYTTSFLRDNVVATFQNSTDYVETKVTAYRNGDLLLDHSGAYVAQYYITWNELSYDHQGKEVLTPKAWDRNGQDLTAHFTTSIPLKGNVRNLSVKIRECTGLAWEWWRTVYEKTDLPLVRKRTISIWGTTLYPQVEDKVEN(SEQ ID NO:1的氨基酸1-470)。
实施例2:重组假肺炎链球菌溶血素多肽的表达、纯化及特性
将PCR产物克隆入pET表达载体如实施例1所述。重组DNA转形至大肠杆菌,该转化子在含有抗生素的培养盘中筛选。插入的DNA序列以DNA序列分析确认。重组的大肠杆菌于37℃过夜生长,加入异丙基硫-β-D-半乳糖苷(IPTG)作为引起剂,该细胞继续生长3小时。该表达的重组多肽以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)评估,经考马斯蓝(Coomassie blue)染色。使用亲和色谱法纯化重组多肽,其溶血活性经羊或人红细胞的溶血分析测试(详见实施例3)。
实施例3:假肺炎链球菌溶血素多肽的溶血活性测定
该编码多肽的溶血活性如下步骤测定。
1)准备人或羊的红细胞2%悬浮液。将0.2mL新鲜红细胞加入10mL PBS(pH7.2)。旋转该悬浮液3000rpm、30秒,于10mL PBSz中重悬浮其沉淀颗粒物三次。
2)加入1μg多肽于0.5mL PBS(pH7.2)中,与0.5mL清洗过的2%RBC悬浮液混合。
3)37℃培养该混合物1小时,然后在小管(Eppendrof)微离心机中离心10,000rpm、2分钟。
4)在541nm下测量光密度(OD)。溶血活性测量为与全长的肺炎链球菌溶血素多肽相比,OD光密度吸收百分比。
如表1所示,肺炎链球菌溶血素截短物缺乏碳端的7、6、2、或1个氨基酸,而缺乏溶血活性。缺乏碳端5个氨基酸的截短物被证实其溶血活性部份丧失。
表1:全长肺炎链球菌溶血素及假肺炎链球菌溶血素的溶血活性
构建体 | 肺炎链球菌溶血素部分(a) | %溶血活性(b) |
pSA-14 pSA-49 pSA-48 pSA-11 pSA-34 pSA-33 pSA-32 pSA-31 | 1-471(全长假肺炎链球菌溶血素) | 100 0 0.2 17 100 100 0 1.8 |
1-464(-7氨基酸假肺炎链球菌溶血素) | ||
1-465(-6氨基酸假肺炎链球菌溶血素) | ||
1-466(-5氨基酸假肺炎链球菌溶血素) | ||
1-467(-4氨基酸假肺炎链球菌溶血素) | ||
1-468(-3氨基酸假肺炎链球菌溶血素) | ||
1-469(-2氨基酸假肺炎链球菌溶血素) | ||
1-470(-1氨基酸假肺炎链球菌溶血素) |
(a)数字表示原始肺炎链球菌溶血素多肽所有的氨基酸(aa),但不存在于碳端截短物中。
(b)碳端截短物的溶血活性以全长构建体pSA-14的百分比表示。实施例4:多醣-蛋白质轭合物的制备
A.多醣的氧化
肺炎球菌外包膜多醣,如4,6B,9V,14,18,19F,及23F型,系购自美国型式培养公司(American Type Culture Collection;Manassas,VA)。将10mg多醣溶于1mL蒸馏水中,4℃过夜。第二天加入1mL的0.2M PBS(pH 7.2)。多醣通过与2mM的过碘酸钠(MW:213.9,Sigma)室温下黑暗中反应10分钟而被氧化。多余的过碘酸钠与终浓度为25mM的乙二醇(MW:62.07)反应,予以清除。该含有多醣的反应混合物以1000mL的0.1M PBS(pH 7.2)大量透析3倍。
B.免疫-亲和性柱的制备
(i)全长His-标记的肺炎链球菌溶血素的纯化
使大肠杆菌(pET24b含C-His-标记的肺炎链球菌溶血素)生长于含40μL的20%蔗糖及4μL的50mg/mL卡那霉素的4mL LB培养基,并于37℃持续160rpm晃动下培养过夜。将3mL的过夜培养物转移至含1mL的20%蔗糖及100μL的50mg/mL卡那霉素的100mLLB培养基,并于持续160rpm晃动下培养于37℃,直到OD600值到达0.4-0.5。在100mL培养物中加入400μL的1M IPTG,使终浓度为4mM IPTG。引起基因表达后的3小时,以4000rpm离心5分钟收集细胞。根据实验手册(ProBond Purification System;Invitrogen;Carlsbad,CA)纯化全长的His-标记肺炎链球菌溶血素。
(ii)抗His-标记肺炎链球菌溶血素的多克隆抗体的制备
对新西兰白兔在4处不同部位注射4剂每剂25μg的乳化His-标记肺炎链球菌溶血素及TiterMax辅药(400μL的1mg/mL His-标记的肺炎链球菌溶血素及400μL TiterMax辅药),一处在每一大腿肌肉(i.m.)上,一处在背部纵肌上脊椎两侧的皮下(s.c.)。14天后,收集该兔耳静脉血液5mL。
如果血清中抗体效价达到1∶3000稀释程度,该动物会完全放血。如果抗体效价低于1∶3000,注射第二剂抗体,一星期后测试该动物(第二剂后7天)。重复此步骤,直到达到适当效价为止。
(iii)使用亲和性胶蛋白A琼脂糖纯化兔IgG
将受His-标记肺炎链球菌溶血素免疫的兔血清加入亲和性胶蛋白A柱,以10mM磷酸钠及150mM NaCl(pH 8.2)平衡。以10倍体积清洗后,免疫球蛋白以2-5倍体积的100mM柠檬酸钠(pH 3.0)洗提。收集该IgG,并于280处测量其OD值。再向10DG柱中加入3ml纯化的IgG,丢弃第一个流出的3ml洗提液。在该柱中加入3.5ml的组合的缓冲液(150mM NaCl及100mM醋酸钠pH 5.5)或0.1M 3-(N-吗啉)丙烷磺酸)(MOPS)缓冲液。收集3.5ml IgG洗提液,进一步与亲和性胶Hz或亲和性胶10偶合。
(iv)使用IgG与亲和性胶10自由偶合制备免疫亲和性柱
亲和性胶10为衍生的交叉偶合琼脂糖胶颗粒支持体的N-羟基琥珀酰亚胺酯,其通过一级胺与所有配位体偶合。为了与IgG偶合,将亲和性胶10移至15ml管中,并以冷DDH2O清洗3次及冷0.1MMOPS缓冲液(pH 7.0)清洗两次。将纯化的IgG加入含事先清洗的亲和性胶10的15ml管中,4℃下端对端旋转4小时。剩余的亲和性胶10的活性酯通过加入100mM Tris HCl pH 8.0在4℃下经0.5小时终止反应。将该胶移至1.5×9.0cm柱中。收集该柱的洗提液并测量其OD280值。以2倍体积的0.5M NaCl及25mM Tris HCl(pH 8.0)清洗亲和性胶10免疫亲和性柱。再收集该柱洗提液并测量其OD280值。根据所有IgG的浓度与未偶合的IgG的浓度,计算偶合率。
(v)免疫亲和性柱的检验
为了测试免疫亲和性柱,将DEAE-琼脂糖(Sepharose)层析法中假肺炎链球菌溶血素部分加入25mM Tris HCl(pH 8.0)、0.5M NaCl及0.5%Triton X-100中。将样本加入6.5ml亲和性胶10柱(1.5×12cm),以0.5M NaCl及25mM Tris HCl(pH 8.0)在流速1mL/2分钟下平衡。收集经分层的流液。以15mL的0.5M NaCl及25mM Tris HCl(pH8.0)清洗该柱2-3次。再以5mL的4M尿素清洗该柱。该粘着的假肺炎链球菌溶血素蛋白质以7mL的4M尿素洗提2次。第一次7mL的4M尿素分层的蛋白质样本以9%SDS-PAGE分析,并以考马斯蓝(Coomassie)R-20染色,使可目视。
C.重组假肺炎链球菌溶血素蛋白质的制备
经表达载体pSA-49(编码碳端缺乏7个氨基酸肺炎链球菌溶血素的多肽)转形的细菌生长于含30mL LB培养基及100μg/ml安比西林的50mL管中,37℃过夜。次日早上,将13ml的该过夜培养物与含100μg/mL安比西林及0.2%蔗糖的400mL LB培养基于37℃摇晃下培养于1L烧瓶中。细胞密度相对A600为0.5,通过加入2mM或4mMIPTG 3小时来引起假肺炎链球菌溶血素蛋白质的表达。
在500mL离心管中以6,500rpm离心细菌10分钟。将该细菌沉淀颗粒重悬浮于含100μg/mL溶菌酶的40mL Tris HCl缓冲液(pH8.0)中,在冰上培养15分钟,及在冰上10秒激发超声3次。将该溶菌产物冷冻于-80℃10分钟,在37℃解冻5分钟。此细胞溶菌产物经超音波-冷冻-解冻处理2次以上。不能溶解的细胞碎片经6,000rpm离心20分钟而移除。将上层溶菌产物经过0.8μM过滤器。流经蛋白质的液体由9%SDS PAGE分析,并以考马斯蓝(Coomassie)R-250染色,使可目视。溶菌粗产物再进一步由DEAE-琼脂糖(Sepharose)层析法纯化。
将20ml细菌溶菌粗产物加入含有以25mM Tris-HCl(pH 8.0)平衡的DEAE-琼脂糖(Sepharose)的柱(5×12cm)中。收集第一次流出的液体后,将10ml的25mM Tri-HCl加入该柱中。收集10ml的流出液,与第一次流出液加在一起分层(分层1)。然后,加入35mL的25mMTris-HCl(pH 8.0),收集流出液(分层2)。加入另一35mL的25mMTris-HCl(pH 8.0),收集流出液(分层3)。以4M NaCl及25mM Tris HCl洗提该粘着的细菌蛋白质(分层4)。以280nm的OD测量每一分层的蛋白质浓度。蛋白质样本由9%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,并以考马斯蓝(Coomassie)R-20染色,使可目视。含有假肺炎链球菌溶血素的流出液(分层1及2)再进一步由免疫亲和色谱法纯化。
DEAE-琼脂糖(Sepharose)层析法后,将含有假肺炎链球菌溶血素的分层加入25mM Tris HCl(pH 8.0)、0.5M NaCl及0.5%Triton X-100中。该样本以流速1mL/2分钟加入与兔抗肺炎链球菌溶血素IgG偶合的6.5mL亲和性胶10柱(1.5×12cm),其以0.5M NaCl及25mM TrisHCl(pH8.0)平衡。收集流出液。以15mL的0.5M NaCl及25mM TrisHCl(pH 8.0)清洗该柱3次。再以5mL的4M尿素清洗该柱。以7mL的4M尿素洗提该粘着的假肺炎链球菌溶血素蛋白质2次。以SDS-PAGE分析未粘着于及粘着于分层的蛋白质样本,并以考马斯蓝(Coomassie)R-20染色,使可目视。
免疫亲和色谱法后,由4M尿素洗提的含假肺炎链球菌溶血素分层再以10DG层析法纯化,去除尿素。在10DG柱(1.5×12cm)中加入3.0ml样本,该10DG柱经1×PBS缓冲液平衡。丢弃第一次流出的3ml流出液。该柱中加入3.9mL的1×PBS缓冲液。测量从柱中收集的该3.9ml分层的OD280值,并收集该蛋白质分层。蛋白质的纯度以9%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
D.多醣-蛋白质轭合物的制备
使用还原胺化作用分析,将2mg的肺炎链球菌多醣18C与假肺炎链球菌溶血素蛋白质(详述见上述C部分)直接轭合。在所述氧化的多醣反应混合物中加入溶于0.1M PBS的10mg假肺炎链球菌溶血素,室温下轻微搅拌培养30分钟。加入氰基硼氢化钠使终浓度为20mM(如750μL的100mM氰基硼氢化物加入3ml的氧化多醣及假肺炎链球菌溶血素混合物中)。将该混合物于室温下轻微搅拌培养5天。将该轭合物于9,000rpm沉淀10分钟,然后溶于1-2mL 0.1M PBS,pH7.2。将该混合物于经1×PBS,pH7.2平衡的琼脂糖(Sepharose)CL-4B柱(1.5×100cm)中层析。将含有蛋白质及多醣的分层倒在一起,以Amicon Centricon-30浓缩(分离点为分子量30,000),然后分析蛋白质及多醣含量。
实施例5:小鼠体中对多醣-蛋白质轭合物的抗体反应
如实施例4所制备的肺炎链球菌14,18C,19F,23F,4,6B及9V型多醣-假肺炎链球菌溶血素蛋白质轭合物,测试其提高小鼠体内抗多醣及肺炎链球菌溶血素的抗体的能力。将所述轭合物,每剂0.3、1、3μg的多醣与氢氧化铝辅药(每剂0.1mg)混合物结合,腹膜内注射于雌NIH瑞士小鼠群。在某些实验中,第二群小鼠接受1μg多醣,及/或第三群小鼠接受1μg假肺炎链球菌溶血素。小鼠两次注射间以2星期为间隔。最后一次注射后的7天,测量抗多醣的抗体血清浓度及抗肺炎链球菌溶血素的抗体血清浓度。表2总结了给药的特定轭合物及第1-14图中所示实验所测量的免疫反应。
表2:小鼠免疫实验中给药的轭合物与检测的抗体的总表
图示编号 | 轭合物中肺炎链球菌多醣血清型成分 | 测量的抗体反应 |
1 | 14 | 抗肺炎链球菌溶血素IgG抗体 |
2 | 14 | 抗14型多醣IgG抗体 |
3 | 18C | 抗肺炎链球菌溶血素IgG抗体 |
4 | 18C | 抗18C型多醣IgG抗体 |
5 | 19F | 抗肺炎链球菌溶血素IgG抗体 |
6 | 19F | 抗19F型多醣IgG抗体 |
7 | 23F | 抗肺炎链球菌溶血素IgG抗体 |
8 | 23F | 抗23F型多醣IgG抗体 |
9 | 4 | 抗肺炎链球菌溶血素IgG抗体 |
10 | 4 | 抗4型多醣IgG抗体 |
11 | 6B | 抗肺炎链球菌溶血素IgG抗体 |
12 | 6B | 抗6B型多醣IgG抗体 |
13 | 9V | 抗肺炎链球菌溶血素IgG抗体 |
14 | 9V | 抗9V型多醣IgG抗体 |
以下缩写为使用于第1-14图中:磷酸缓冲液生理盐水(PBS)、轭合物(C)、氢氧化铝辅药(A)、及假肺炎链球菌溶血素(PPN)。
受该多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫的小鼠显示出抗体的引起,该抗体经ELISA与His-标记野生型肺炎链球菌溶血素反应。对于所有接受该轭合物及辅药的小鼠群,其抗肺炎链球菌溶血素与抗多醣的抗体水平显著高于仅加入PBS及辅药的对照组(p<0.001,t-test)。与仅给予PBS的小鼠群相比,给予该轭合物的小鼠血清中显示无法预期的高滴定度的抗肺炎链球菌溶血素抗体及抗多醣抗体,其血清稀释因子各为76800及9600。小鼠中观察到最高的抗肺炎链球菌溶血素抗体及抗多醣抗体浓度是接受3.0μg的多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物(图1-14)。相较于接受假肺炎链球菌溶血素与辅药(图3)、或仅接受假肺炎链球菌溶血素而无辅药者(图6),接受多醣-假肺炎链球菌溶血素的轭合物与辅药的小鼠群有较高的抗肺炎链球菌溶血素抗体浓度。
表3及表4显示接受3.0μg轭合物的小鼠为具有最高百分比的反应者。此结果指出肺炎球菌疫苗的有效性可通过多醣与假肺炎链球菌溶血素蛋白质的轭合物予以改善。除该抗体反应外,还对给予该轭合物疫苗的小鼠(实施例8)进行交叉保护性免疫及细菌清除率检测。
表3:具有抗18C型多醣阳性反应的小鼠比例
小鼠群 阳性反应者比例
氢氧化铝辅药 0%
1μg假肺炎链球菌溶血素(PPN) 0%
1μg 18C型多醣(PS)+辅药 0%
0.3μg 18C(PS)-PPN轭合物+辅药 60%
1.0μg 18C(PS)-PPN轭合物+辅药 75%
3.0μg 18C(PS)-PPN轭合物+辅药 100%
1.0μg 18C (PS)-PPN轭合物,但无辅药 20%
注:阳性反应者是自所有小鼠的1∶100稀释血清样本所确认。当其A405nm光学读数高于0.05则显示为阳性反应。
表4:具有抗14型多醣阳性反应的小鼠比例
小鼠群 阳性反应者比例
氢氧化铝辅药 0%
1μg假肺炎链球菌溶血素(PPN) 0%
1μg 14型多醣(PS)+辅药 0%
0.3μg 14(PS)-PPN轭合物+辅药 100%
1.0μg 14(PS)-PPN轭合物+辅药 100%
3.0μg 14(PS)-PPN轭合物+辅药 100%
1.0μg 14(PS)-PPN轭合物,但无辅药 20%
注:阳性反应者是自所有小鼠的1∶300稀释血清样本所确认。当其A405nm光学读数高于0.12则显示为阳性反应。
图15显示小鼠在第3次注射14型多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物后7天,对14型多醣的抗体反应。图15中,G1、G2、及G3各为每只注射0.3μg、1.0μg、及3.0μg所述轭合物疫苗的小鼠群。G4为仅注射1.0μg的14型多醣的小鼠群。G5及G6各为仅注射1.0及3.0μg假肺炎链球菌溶血素的小鼠群。G7为注射1.0μg的14型多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物疫苗而无辅药的小鼠群。G4、G5、G6小鼠群中观察到很少或几乎没有对抗多醣的抗体反应。
实施例6:假肺炎链球菌溶血素、肺炎球菌自溶素及肺炎球菌表面蛋
白质DNA疫苗的表达载体的构建
A.DNA疫苗构建的pVAX1载体
pVAX1载体(Invitrogen)为特定设计为DNA疫苗发展的载体。其构成符合美国食品药物局文件“评价质粒DNA疫苗的重点,作为预防传染疾病的指示”,出版于1996年12月22日。
B.假肺炎链球菌溶血素的克隆及表达
以含有肺炎球菌19A型染色体DNA的引物及模板的即可使用PCR珠(Amersham Pharmacia Biotech Inc.Piscataway,NJ)进行PCR反应。PCR以第一周期为94℃、4分钟;随后30周期为94℃、1分钟;55℃、1分钟;72℃、1.5分钟;最后一周期为72℃、10分钟进行。
该放大的PCR产物以限制性内切酶消化,连接至pVAX1载体的该位点,形成pSA-8,pSA-45,pSA-12,pSA-42,及pSA-41。将该重组DNA通过转化引入大肠杆菌DH5 α细胞,再以限制性内切酶消化检查。该插入的基因以DNA序列分析予以分析。体外的转录及翻译使用TnT试剂盒依照操作手册(Promega,Madison,WI)进行以确认该插入基因的表达。
所述pSA-8表达载体编码由肺炎链球菌溶血素蛋白质序列识别号:1的1-460氨基酸组成的多肽。所述插入部分的形成如上文所述,是使用LSYN-15引物(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’ ;序列识别号:4)及LSYN-4引物(5 ’-GACTGGATCCTTACTAGAGAGTTGTTCCCCAAATAG-3’;序列识别号:5),放大1380碱基对DNA。此1380碱基对的PCR产物随后经NheI及BamHI限制性切割,连接至pVAX1载体的NheI及BamHI位,形成pSA-8。
所述pSA-45表达载体编码由肺炎链球菌溶血素蛋白质序列识别号:1的1-464氨基酸组成的多肽。该插入部分的形成是使用LSYN-15(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’;序列识别号:4)及LSYN-105(GACTGGATCCCTATACCTGAGGATAGAGAGTTG;序列识别号:27),放大1392碱基对DNA,随后经NheI及BamHI限制性切割,连接至pVAX1载体的NheI及BamHI位,形成pSA-45。
pSA-12表达载体编码由肺炎链球菌溶血素蛋白质序列识别号:1的1-466氨基酸组成的多肽。所述插入部分的形成是使用LSYN-15引物(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’;序列识别号:4)及LSYN-17引物(5’-GACTGGATCCTTACTAATCTTCTACCTGAGGATAG-3’;序列识别号:6),放大1398碱基对DNA。此1398碱基对的PCR产物随后经NheI及BamHI限制性切割,连接至pVAX1载体的NheI及BamHI位,形成pSA-12。
所述pSA-42表达载体编码由肺炎链球菌溶血素蛋白质序列识别号:1的1-469氨基酸组成的多肽。所述插入部分的形成如上所述是使用LSYN-15引物(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’;序列识别号:4)及LSYN-37引物(5’-GACTGGATCCTTACTATTCTACCTTATCTTCTACCTGAG-3’;序列识别号:7),放大1407碱基对DNA。此1407碱基对的PCR产物随后经NheI及BamHI限制性切割,连接至pVAX1载体的NheI及BamHI位,形成pSA-42。
所述pSA-41表达载体编码由肺炎链球菌溶血素蛋白质序列识别号:1的1-470氨基酸组成的多肽。所述插入部分的形成如上所述,是使用LSYN-15引物(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’;序列识别号:4)及LSYN-38引物(5’-GACTGGATCCTTACTAATTTTCTACCTTATCTTCTACCTGAG-3’;序列识别号:8),放大1410碱基对DNA。此1410碱基对的PCR产物随后经NheI及BamHI限制性切割,连接至pVAX1载体的NheI及BamHI位,形成pSA-41。
含有特定序列或基序的未甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤(“CpG”)双核苷酸的核酸可能为体外多种免疫细胞的刺激物。含CpG基序的合成寡核苷酸可直接活化先天免疫系统,其通过刺激B细胞以增殖及分泌免疫球蛋白、IL-6及IL-10、NK细胞而产生IFN-γ、及单核球及树突细胞而产生IL-6,IL-12,IL-18 TNT-α及IFN-α。由未甲基化CpG双核苷酸构成的DNA基序,其由两个5’嘌呤及两个3’嘧啶侧面绕过,所述DNA基序刺激B细胞产生IL-6及IL-12,以及刺激CD4+T细胞产生IL-6及IFN-γ。
肺炎链球菌溶血素的结构-功能分析证实,该多肽碳端的一个区域(位于氨基酸427-437)含有半胱胺酸残基,为细胞毒性的关键区。此半胱胺酸基序在其它硫活化的溶细胞素族中高度保留。在此区中的多种单一氨基酸取代物显著降低肺炎链球菌溶血素的细胞毒性。以下核酸构建体通过引起GAGCGTT进入肺炎链球菌溶血素核苷酸1272-1274位(通过导向突变位置),使CpG基序取代半胱胺酸基序。含有GAGCGTT免疫刺激序列的突变核酸如下:ATGGCAAATAAAGCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATGAATTACGATAAAAAGAAACTCTTGACCCATCAGGGAGAAAGTATTGAAAATCGTTTCATCAAAGAGGGTAATCAGCTACCCGATGAGTTTGTTGTTATCGAAAGAAAGAAGCGGAGCTTGTCGACAAATACAAGTGATATTTCTGTAACAGCTACCAACGACAGTCGCCTCTATCCTGGAGCACTTCTCGTAGTGGATGAGACCTTGTTAGAGAATAATCCCACTCTTCTTGCGGTCGATCGTGCTCCGATGACTTATAGTATTGATTTGCCTGGTTTGGCAAGTAGCGATAGCTTTCTCCAAGTGGAAGACCCCAGCAATTCAAGTGTTCGCGGAGCGGTAAACGATTTGTTGGCTAAGTGGCATCAAGATTATGGTCAGGTCAATAATGTCCCAGCTAGAATGCAGTATGAAAAAATCACGGCTCACAGCATGGAACAACTCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGACTTTGAAAAGACAGGGAATTCTCTTGATATTGATTTTAACTCTGTCCATTCAGGCGAAAAGCAGATTCAGATTGTTAATTTTAAGCAGATTTATTATACAGTCAGCGTAGATGCTGTTAAAAATCCAGGAGATGTGTTTCAAGATACTGTAACGGTAGAGGATTTAAAACAGAGAGGAATTTCTGCAGAGCGTCCTTTGGTCTATATTTCGAGTGTTGCTTATGGGCGCCAAGTCTATCTCAAGTTGGAAACCACGAGTAAGAGTGATGAAGTAGAGGCTGCTTTTGAAGCTTTGATAAAAGGAGTCAAGGTAGCTCCTCAGACAGAGTGGAAACAGATTTTGGACAATACAGAAGTGAAGGCGGTTATTTTAGGGGGCGACCCAAGTTCGGGTGCCCGAGTTGTAACAGGCAAGGTGGATATGGTAGAGGACTTGATTCAAGAAGGCAGTCGCTTTACAGCAGATCATCCAGGCTTGCCGATTTCCTATACAACTTCTTTTTTACGTGACAATGTAGTTGCGACCTTTCAAAATAGTACAGACTATGTTGAGACTAAGGTTACAGCTTACAGAAACGGAGATTTACTGCTGGATCATAGTGGTGCCTATGTTGCCCAATATTATATTACTTGGAATGAATTATCCTATGATCATCAAGGTAAGGAAGTCTTGACTCCTAAGGCTTGGGACAGAAATGGGCAGGATTTAACGGCTCACTTTACCACTAGTATTCCTTTAAAAGGGAATGTTCGTAATCTCTCTGTCAAAATTAGAGAGCGTTCCGGGCTTGCCTGGGAATGGTGGCGTACGGTTTATGAAAAAACCGATTTGCCACTAGTGCGTAAGCGGACGATTTCTATTTGGGGAACAACTCTCTATCCTCAGGTAGAAGATAAGGTAGAAAATGAC(序列识别号:9)。
另一实施例中,该免疫刺激DNA序列GAGCGTT插入(通过导向突变位置)碳端有33个核苷酸缺失的假肺炎链球菌溶血素的核苷酸位置1272-1274。含有所述免疫刺激序列的该假肺炎链球菌溶血素DNA如下:ATGGCAAATAAAGCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATGAATTACGATAAAAAGAAACTCTTGACCCATCAGGGAGAAAGTATTGAAAATCGTTTCATCAAAGAGGGTAATCAGCTACCCGATGAGTTTGTTGTTATCGAAAGAAAGAAGCGGAGCTTGTCGACAAATACAAGTGATATTTCTGTAACAGCTACCAACGACAGTCGCCTCTATCCTGGAGCACTTCTCGTAGTGGATGAGACCTTGTTAGAGAATAATCCCACTCTTCTTGCGGTCGATCGTGCTCCGATGACTTATAGTATTGATTTGCCTGGTTTGGCAAGTAGCGATAGCTTTCTCCAAGTGGAAGACCCCAGCAATTCAAGTGTTCGCGGAGCGGTAAACGATTTGTTGGCTAAGTGGCATCAAGATTATGGTCAGGTCAATAATGTCCCAGCTAGAATGCAGTATGAAAAAATCACGGCTCACAGCATGGAACAACTCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGACTTTGAAAAGACAGGGAATTCTCTTGATATTGATTTTAACTCTGTCCATTCAGGCGAAAAGCAGATTCAGATTGTTAATTTTAAGCAGATTTATTATACAGTCAGCGTAGATGCTGTTAAAAATCCAGGAGATGTGTTTCAAGATACTGTAACGGTAGAGGATTTAAAACAGAGAGGAATTTCTGCAGAGCGTCCTTTGGTCTATATTTCGAGTGTTGCTTATGGGCGCCAAGTCTATCTCAAGTTGGAAACCACGAGTAAGAGTGATGAAGTAGAGGCTGCTTTTGAAGCTTTGATAAAAGGAGTCAAGGTAGCTCCTCAGACAGAGTGGAAACAGATTTTGGACAATACAGAAGTGAAGGCGGTTATTTTAGGGGGCGACCCAAGTTCGGGTGCCCGAGTTGTAACAGGCAAGGTGGATATGGTAGAGGACTTGATTCAAGAAGGCAGTCGCTTTACAGCAGATCATCCAGGCTTGCCGATTTCCTATACAACTTCTTTTTTACGTGACAATGTAGTTGCGACCTTTCAAAATAGTACAGACTATGTTGAGACTAAGGTTACAGCTTACAGAAACGGAGATTTACTGCTGGATCATAGTGGTGCCTATGTTGCCCAATATTATATTACTTGGAATGAATTATCCTATGATCATCAAGGTAAGGAAGTCTTGACTCCTAAGGCTTGGGACAGAAATGGGCAGGATTTAACGGCTCACTTTACCACTAGTATTCCTTTAAAAGGGAATGTTCGTAATCTCTCTGTCAAAATTAGAGAGCGTTCCGGGCTTGCCTGGGAATGGTGGCGTACGGTTTATGAAAAAACCGATTTGCCACTAGTGCGTAAGCGGACGATTTCTATTTGGGGAACAACTCTC(序列识别号:10)。
D.肺炎球菌自溶素基因的克隆及表达
所述pSA-59表达载体编码316个氨基酸自溶素(Aly)多肽。使用含有肺炎球菌1 9A染色体DNA的引物核模板的即可使用PCR珠,将19A型Aly基因系由PCR反应放大。PCR以第一周期为94℃、4分钟;随后30周期为94℃、1分钟;50℃、1分钟;72℃、1分钟15秒;最后一周期为72℃、10分钟进行。该插入部分的形成是使用LSYN-74引物(5’-GACTAAGCTTGCCACCATGGAAATTAATGTGAGTAAATTAAG-3’;序列识别号:11)及LSYN-89引物(5’-CTGACTCGAGTTATTTTACTGTAATCAAGCCATC-3’;序列识别号:12),放大948碱基对DNA。
此PCR合成的DNA随后经HindIII及XhoI消化,并连接至pVAX1载体的HindIII及XhoI位,形成pSA-59(Aly)。将该重组DNA通过转化引入大肠杆菌DH5α细胞,再以限制性内切酶、HindIII及XhoI消化检查。该Aly插入基因以DNA序列分析确认。体外的转录及翻译使用TnT试剂盒(Promega,Madison,WI)依照操作手册进行以确认pSA-59的表达。
所述pSA-59Aly插入部分的核酸序列如下:ATGGAAATTAATGTGAGTAAATTAAGAACAGATTTGCCTCAAGTTGGCGTGCAACCATATAGGCAAGTACACGCACACTCAACTGGGAATCCGCATTCAACCGTACAGAATGAAGCGGATTATCATTGGCGGAAAGACCCAGAATTAGGTTTTTTCTCGCACATTGTTGGGAACGGATGCATCATGCAGGTAGGACCTGTTAATAATGGTGCCTGGGACGTTGGGGGCGGTTGGAATGCTGAGACCTATGCAGCGGTTGAACTGATTGAAAGCCATTCAACTAAAGAAGAGTTCATGACGGACTACCGCCTTTATATCGAACTCTTACGCAATCTAGCAGATGAAGCAGGTTTGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAGTTTAGCTGGAATTAAAACGCACGAGTATTGCACGAATAACCAACCAAACAACCACTCAGACCATGTGGATCCATACCCTTACTTGGCAAAATGGGGCATTAGCCGTGAGCAGTTTAAGCATGATATTGAGAACGGCTTGACGATTGAAACAGGCTGGCAGAAGAATGACACTGGCTACTGGTACGTACATTCAGACGGCTCTTATCCAAAAGACAAGTTTGAGAAAATCAATGGCACTTGGTACTACTTTGACAGTTCAGGCTATATGCTTGCAGACCGCTGGAGGAAGCACACAGACGGCAATTGGTACTACTTTGACCAATCAGGCGAAATGGCTACAGGCTGGAAGAAAATCGCTGAGAAGTGGTACTATTTCAACGAAGAAGGTGCCATGAAGACAGGCTGGGTCAAGTACAAGGACACTTGGTACTACTTAGACGCTAAAGAAGGCGCAATGGTATCAAATGCCTTTATCCAGTCAGCGGACGGAACAGGCTGGTACTACCTCAAACCAGACGGAACACTGGCAGACAAGCCAGAATTCACAGTAGAGCCAGATGGCTTGATTACAGTAAAA(序列识别号:13)。
pSA-59Aly插入部分编码的氨基酸序列如下:MEINVSKLRTDLPQVGVQPYRQVHAHSTGNPHSTVQNEADYHWRKDPELGFFSHIVGNGCIMQVGPVNNGAWDVGGGWNAETYAAVELIESHSTKEEFMTDYRLYIELLRNLADEAGLPKTLDTGSLAGIKTHEYCTNNQPNNHSDHVDPYPYLAKWGISREQFKHDIENGLTIETGWQKNDTGYWYVHSDGSYPKDKFEKINGTWYYFDSSGYMLADRWRKHTDGNWYYFDQSGEMATGWKKIAEKWYYFNEEGAMKTGWVKYKDTWYYLDAKEGAMVSNAFIQSADGTGWYYLKPDGTLADKPEFTVEPDGLITVK(序列识别号:14)。
E.氮端肺炎球菌表面蛋白A(PspA)基因的克隆及表达
所述pSA-60表达载体编码459个氨基酸PspA多肽。使用含有肺炎球菌19A染色体DNA引物核模板的即可使用PCR珠,19A型PspA基因由PCR反应放大。PCR以第一周期为94℃、4分钟;随后30周期为94℃、1分钟;50℃、1分钟;72℃、1分钟15秒;最后一周期为72℃、10分钟进行。该插入部分的形成使用LSYN-90(5’-GACTAAGCTTGCCACCATGGAAGAAGCTCCCGTAGCTAGTCAG-3’;序列识别号:15)与LSYN-78引物(5’-GACTCTCGAGCTATCCATCAGGGCCTAACTCATTAAG-3’;序列识别号:16),放大1377碱基对DNA。此PCR合成产物随后经HindIII及XhoI消化,并连接至pVAX1载体的HindIII及XhoI位,形成pSA-60(PspA)。将该重组DNA通过转化引入大肠杆菌DH5α细胞,再以限制性内切酶、HindIII及XhoI消化检查。该PspA插入基因以DNA序列分析确定。体外的转录及翻译使用TnT试剂盒(Promega,Madison,WI)依据操作手册进行以确认pSA-60的表达。
所述pSA-60PspA插入部分的核酸序列如下:ATGGAAGAAGCTCCCGTAGCTAGTCAGTCTAAAGCTGAGAAAGACTATGATGCAGCAGTGAAAAAATCTGAAGCTGCTAAGAAGGCTTACGAAGAAGCTAAAAAGAAAGCAGAAGACGCTCAGAAAAAATATGATGAGGATCAGAAGAAAACTGAGGCAAAAGCGGATAAGGAAGCAAAAGCATCTGCGGAAATAGATAAAGCCACGTTTGCTGTACAAAGTGCGTATGTAAAATTTTTAAATGTCCAATCTAATCGTCAAATTTCGGAGAATGAACGAAAAAAACAATTAGCAGAAATAGATAAAGAGATAGAGAATGCTAAACAAAATTTACAGAATAAACAGGAAGAATTTAATAAGGTTAGAGCAGAAGTAATTCCTGAAGCAAAGGGGTTAGCTGTTACTAAACAAAAAGCGGAAGAAGCTAAAAAAGAAGCAGAAGTAGCTAAGAGAAAATATGATTATGCAACTCTAAAGGTAGCACTAGCGAAGAAAGAAGTAGAGGCTAAGGAACTTGAAATTGAAAAACTTCAATATGAAATTTCTACTTTGGAACAAGAAGTTGCTATTGCTCAACATCAAGTAGATAATTTGAAAAAACTTCTTGCTGGTGCGGATCCTGATGATGGCACAAAAGTTATAGAAGCTAAATTAAACAAAGGAGAAGCTGAGCTAAACGCTAAACAAGCTGAGTTAGCAAAAAAACAAACAGAACTTGAAAAACTTCTTGACAGCCTTGATCCTGAAGGTAAGACTCAGGATGAATTAGATAAAGAAGCTGCTGAAGCTGAGTTGGATAAAAAAGCTGATGAACTTCAAAATAAAGTTGCTGATTTAGAAAAAGGAATTGCTCCTTATCAAATCAAAGTCGCTGAATTAAATAAAGAAATTGCTAGACTTCAAAGCGATTTAAAAGATGCTGAAGAAAATAATGTAGAAGACTATATTAAAGAAGGTTTAGAGCAAGCTATCGCTGATAAAAAAGCTGAATTAGCTACAACTCAACAAAACATAGATAAAACTCAAAAAGATTTAGAGGATGCTGAATTAGAACTTGAAAAAGTATTAGCTACATTAGACCCTGAAGGTAAAACTCAAGATGAATTAGATAAAGAAGCTGCAGAAGATGCTAATATTGAAGCTCTTCAAAACAAAGTTGCTGATCTAGAAAACAAGGTTGCTGAATTAGATAAAGAAGTTACTAGACTTCAAAGCGATTTAAAAGATGCTGAAGAAAACAATGTAGAAGACTACGTTAAAGAAGGCTTAGATAAAGCTCTTACTGATAAAAAAGTTGAATTAAATAATACTCAAAAAGCATTAGATACTGCTCAAAAAGCATTAGATACTGCTCTTAATGAGTTAGGCCCTGATGGA(序列识别号:17)。
pSA-60PspA插入部分编码的氨基酸序列如下:MEEAPVASQSKAEKDYDAAVKKSEAAKKAYEEAKKKAEDAQKKYDEDQKKTEAKADKEAKASAEIDKATFAVQSAYVKFLNVQSNRQISENERKKQLAEIDKEIENAKQNLQNKQEEFNKVRAEVIPEAKGLAVTKQKAEEAKKEAEVAKRKYDYATLKVALAKKEVEAKELEIEKLQYEISTLEQEVAIAQHQVDNLKKLLAGADPDDGTKVIEAKLNKGEAELNAKQAELAKKQTELEKLLDSLDPEGKTQDELDKEAAEAELDKKADELQNKVADLEKGIAPYQIKVAELNKEIARLQSDLKDAEENNVEDYIKEGLEQAIADKKAELATTQQNIDKTQKDLEDAELELEKVLATLDPEGKTQDELDKEAAEDANIEALQNKVADLENKVAELDKEVTRLQSDLKDAEENNVEDYVKEGLDKALTDKKVELNNTQKALDTAQKALDTALNELGPDG(序列识别号:18)。
实施例7:DNA疫苗的免疫原性
质粒载体pSA-7编码全长的肺炎链球菌溶血素蛋白质。使用含有肺炎球菌19A染色体DNA的引物和模板的即可使用PCR珠,19A型Ply基因由PCR反应放大。PCR以第一周期为94℃、4分钟;随后30周期为94℃、1分钟;55℃、1分钟;72℃、1.5分钟;最后一周期为72℃、10分钟。使用LSYN-15引物(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’;序列识别号:4)互补于Ply的5’端核苷酸1-24,以及LSYN-3引物(5’-CAGTGGATCCTTACTAGTCATTTTCTACCTTATC-3’;序列识别号:3)互补于Ply的3’端核苷酸1396-1413,放大1413碱基对DNA,编码全长471氨基酸的野生型Ply蛋白质。此PCR合成的DNA片段随后经NheI及BamHI限制性切割,并连接至pVAX1表达载体的NheI及BamHI位,形成pSA-7。将该重组DNA通过转化引入大肠杆菌DH5α细胞,再以限制性内切酶、NheI及BamHI消化检查。该插入19A型野生型Ply基因以DNA序列分析确定。
质粒载体pSA-10编码碳端截断的肺炎链球菌溶血素蛋白质(Ply碳端上缺乏114个氨基酸)。使用含有肺炎球菌19A染色体DNA的引物和模板的即可使用PCR珠,19A型Ply基因由PCR反应放大。PCR以第一周期为94℃、4分钟;随后30周期为94℃、1分钟;55℃、1分钟;72℃、1.5分钟;最后一周期为72℃、10分钟进行。使用LSYN-15引物(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’;序列识别号:4)互补于Ply的5’端核苷酸1-24,以及LSYN-6引物(5’-CTGAGGATCCTTACTAAGCTGTAACCTTAGTCTC-3’;序列识别号:19)互补于Ply的3’端核苷酸1054-1071,来放大1071碱基对DNA,编码全长357氨基酸多肽。此PCR合成的DNA片段随后经NheI及BamHI限制性切割,并连接至pVAX1表达载体的NheI及BamHI位,形成pSA-10。将该重组DNA通过转化引入大肠杆菌DH5α细胞,再以NheI及BamHI限制性内切酶消化检查。该插入19A型假肺炎链球菌溶血素基因以DNA序列分析确定。
质粒载体pSA-26编码具有CpG基序的全长肺炎链球菌溶血素。含有两个在3’端具有CpG基序的互补寡核苷酸的PCR引物LSYN-34及LSYN-33用于PCR1及PCR2的引物。第二引物LSYN-15及LSYN-3分别互补于肺炎链球菌溶血素氮端及碳端序列。在分别放大反应中,第一PCR产物为PCR1(1.2kb)及PCR2(150bp),其由引物LSYN-15和-34(PCR1)以及LSYN-33和-3(PCR2),及含全长肺炎链球菌溶血素基因的模板pSA7所构成的即可使用PCR珠所生成。将第一PCR产物混合、变性,作为第二PCR产物的模板,并由第二组的引物LSYN-15及-3引导。该第二PCR产物用NheI及BamHI切割,并克隆至pVAX1载体的NheI及BamHI位,形成pSA-26。PCR以第一周期为94℃、4分钟;随后30周期为94℃、1分钟;55℃、1分钟;72℃、1.5分钟;最后一周期为72℃、8分钟进行。
引物LSYN-3、LSYN-1 5、LSYN-33及LSYN-34序列如下:LSYN-3引物(5’-CAGTGGATCCTTACTAGTCATTTTCTACCTTATC-3’;序列识别号:3);LSYN-15引物(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’;序列识别号:4);LSYN-33引物(5 ’-CAAAATTAGAGAACGTTCCGGGCTTGCCTGGGAATGG-3’;序列识别号:20);LSYN-34引物(5’-GCCCGGAACGTTCTCTAATTTTGACAGAGAGATTACG-3’;序列识别号:21)。
将该重组DNA通过转化引入大肠杆菌DH5α细胞,再以限制性内切酶、NheI及BamHI消化检查。该含有CpG基序的插入19A型野生型Ply基因以DNA序列分析确定。
质粒载体pSA-27具有CpG基序并编码肺炎链球菌溶血素碳端截短物(11个氨基酸缺失)。含有两个在3’端具有CpG基序的互补寡核苷酸的引物LSYN-34及LSYN-33用作PCR1及PCR2的引物。第二引物LSYN-15及LSYN-3分别互补于肺炎链球菌溶血素氮端及碳端序列。在分别放大反应中,第一PCR产物为PCR1(1.2kb)及PCR2(150bp),其由引物LSYN-15与-34(PCR1)以及LSYN-33与-3(PCR2)、含全长肺炎链球菌溶血素基因的模板pSA7所构成的即可使用PCR珠所生成。
将第一PCR产物混合、变性,作为第二PCR产物的模板,该第二PCR产物的引物由第二组的引物LSYN-15及-4引发。该第二PCR产物经NheI及BamHI切割,并克隆于pVAX1载体的NheI及BamHI位,以形成pSA-27。PCR以第一周期为94℃、4分钟;随后30周期为94℃、1分钟;55℃、1分钟;72℃、1分钟;最后一周期为72℃、8分钟进行。该引物LSYN-3、LSYN-4、LSYN-15、LSYN-33及LSYN-34的寡核苷酸序列如下:LSYN-3引物(5’-CAGTGGATCCTTACTAGTCATTTTCTACCTTATC-3’;序列识别号:3);LSYN-4引物(5’-GACTGGATCCTTACTAGAGAGTTGTTCCCCAAATAG-3’;序列识别号:5);LSYN-15引物(5’-GACTGCTAGCCACCATGGCAAATAAAGCAGTAAATGAC-3’;序列识别号:4);LSYN-33引物(5’-CAAAATTAGAGAACGTTCCGGGCTTGCCTGGGAATGG-3’;序列识别号:20);LSYN-34引物(5’-GCCCGGAACGTTCTCTAATTTTGACAGAGAGATTACG-3’;序列识别号:21)。将该重组DNA通过转化引入大肠杆菌DH5α细胞,再以限制性内切酶、NheI及BamHI消化检查。该含有CpG基序的插入19A型假肺炎链球菌溶血素基因以DNA序列分析确定。
疫苗过程必须有DNA载体引发及大量产生蛋白质,导致高浓度专一性免疫的产生,以及在某些情况下,对于目前疫苗发展有极大问题的感染源提供保护作用。在这些实验中,兔通过3次肺炎链球菌溶血素DNA载体引发,并在无辅药下大量生成肺炎链球菌溶血素蛋白质。
图16显示使用上述假肺炎链球菌溶血素DNA疫苗的引起-大量产生策略的兔体内抗肺炎链球菌溶血素的抗体反应。第1、2、3柱条为第一(1)、第二(2)、第三(3)肌肉内注射假肺炎链球菌溶血素DNA疫苗后7天的免疫反应。第4柱条为蛋白质大量生成(200μg肺炎链球菌溶血素)后10天的免疫反应。第5柱条为注射200μg肺炎链球菌溶血素蛋白质与TiterMax辅药后10天的抗体反应。此结果证明DNA的3次注射与蛋白质的大量生成,相较于使用辅药的传统蛋白质免疫方法,导致较高的抗体反应。
将均为100μg的DNA疫苗pSA-59、及pSA-60、及一个载体控制的质粒DNA溶于总体积为0.1ml的1×PBS中,肌肉内注射于Balb/C小鼠的四头肌或后肢。对小鼠注射4剂100μg DNA疫苗,每次注射间隔2星期。最后一次注射后的第7天,以ELISA测量IgG抗体的血清浓度。接受4剂DNA疫苗注射的小鼠较对照组产生多于9600倍的IgG抗体。此结果显示质粒DNA可于体内表达自溶素或肺炎球菌表面蛋白A抗原,并刺激小鼠免疫系统以产生高浓度的专一性IgG抗体。
图17为注射第4剂PspA DNA疫苗后7天的对肺炎球菌表面蛋白A的抗体反应。图18为注射第4剂自溶素DNA疫苗后7天的对肺炎球菌自溶素的抗体反应。
实施例8:对致命肺炎球菌的异质型的保护性免疫及交叉保护作用
对小鼠腹膜内注射3剂2.5μg的14型多醣-假肺炎链球菌溶血素(-7氨基酸)轭合物,注射间隔为2星期。对照组以PBS代替该轭合物。第三次注射后8天,该免疫小鼠腹膜内注射每0.1毫升1×105至1×106CFU(菌丛形成单位)肺炎球菌。注射的每毫升确实CFU数由羊血琼脂糖盘上的菌斑计算得知。在感染后1、3、5小时,取每只小鼠的5μl及20μl血液样本涂布于羊血琼脂糖盘,37℃培养过夜。接受轭合物免疫鼠的血液样本的细菌清除率与对照组的比较,有显著差异。
图19显示在14型肺炎球菌感染时,用14型多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫的鼠血液的细菌清除率。在感染后1、3、5小时用该轭合物处理组与PBS处理组有显著的CFU差异(P<0.01)。
图20显示在7型肺炎球菌感染时,用14型多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫的鼠血液的细菌清除率。在感染后1、3、5小时用该轭合物处理组与PBS处理组有显著的CFU差异(P<0.01)。此数据也显示经该轭合物免疫的小鼠具有对异质型肺炎球菌感染的交叉保护作用。
图21显示在6B型肺炎球菌感染时,用14型多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫的鼠血液的细菌清除率。在感染后1、3、5小时用该轭合物处理组与PBS处理组有显著的CFU差异(P<0.05)。此数据也显示经该轭合物免疫的小鼠具有对异质型肺炎球菌感染的交叉保护作用。
图22显示在18C型肺炎球菌感染时,用14型多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫的鼠血液的细菌清除率。在感染后1、3、5小时用该轭合物处理组与PBS处理组有显著的CFU差异(P<0.01)。此数据也显示经该轭合物免疫的小鼠具有对异质型肺炎球菌感染的交叉保护作用。
图23-25显示在23F型肺炎球菌感染时,用14型多醣-假肺炎链球菌溶血素轭合物免疫的鼠血液的细菌清除率。在感染后1小时(图23)、3小时(图24)、5小时(图25)用该轭合物处理组与PBS处理组有显著的CFU差异(P<0.01)。此数据也显示经该轭合物免疫的小鼠具有对异质型肺炎球菌感染的交叉保护作用。
实施例9:调理吞噬分析
A.调理吞噬分析
抗血清型14型肺炎球菌多醣的抗体功能活性是使用人多形核白细胞(PMNL)的调理吞噬分析予以测量。系列性稀释(两倍)抗血清,使每一20μl血清样本与20μl细菌悬浮液混合,于37℃培养15分钟,该细菌悬浮液含有约200CFU于脑心泡制的培养基。培养完后,加入10μl婴儿兔补体及40μl的PMNL(4×105细胞)。将此混合物培养于37℃、5%CO2气氛60分钟。为获得可目视的细胞计数,将每样本中的20μl等分试样接种于三倍血琼脂培养基中,维持37℃过夜。补体控制包含所有测试试剂,除对抗肺炎球菌的抗体。调理吞噬效价计数为相较于补体中所生长者,>50%杀菌的最高血清稀释量的倒数。
B.吞噬细胞
通过使用葡聚糖沉降及菲柯尔(ficoll;ICN Biomedical Company,#16-922-54 Lymphocyte Separation Medium)分离单核细胞与PMNL,来将新鲜PMNL从健康成人志愿者的周边血液中分离。以ACK溶胞缓冲液(BioFluids,Catalog number p304-100)溶解红细胞。调整在BME(Life Technologies GIBCO BRL,Basal Medium Eagle)中细胞的终浓度为1×107细胞/mL。每样本中使用40μL的PMNL 2-4×105细胞。
C.小鼠血清与细菌
将抗14型多醣的小鼠抗血清系列地稀释于脑心泡制的培养基(两倍,1∶2至1∶256)中,将每20μL血清样本与20ul细菌悬浮液(200CFU的肺炎链球菌14型)37℃混合15分钟。
肺炎链球菌14型培养于37℃脑心泡制培养基10小时。系列稀释10倍以确认本实验使用的细菌数。将100ul样本加入盘中。10CFU为使用1∶107稀释样本,91CFU为使用1∶106稀释样本。因此本试验使用的细菌浓度确认为约1×109CFU/mL。将14型肺炎链球菌1×109CFU/M1稀释至1×104CFU/mL。200CFU/20μL用于每样本。
D.补体与PMNL
培养后,加入10μL婴儿兔补体(新鲜收集的年轻兔血清的等分试样,使用前储存于-80℃)及40μL的PMNL 2.8×105细胞。将该混合物培养于37℃、5%CO2气氛60分钟。
E.CFU计数
为获得可目视的细胞计数,将两稀释液的20μl等分试样(每样本1∶10及1∶100)接种于三倍血琼脂培养基中,维持37℃过夜。补体对照组包含除对抗肺炎球菌的抗体外的所有试剂。
F.调理吞噬活性
调理吞噬效价计数为相较于补体中所生长者,>50%杀菌的最高血清稀释量的倒数。
表5:对抗14型多醣的小鼠抗体调理素作用活性
血清稀释
小鼠编号# 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 对照组
疫苗
1,CFU 12 20 22 25 28 32 45 81
杀菌% 85% 76% 73% 69% 65% 60% 44%
2,CFU 17 18 17 17 32 50 51 81
杀菌% 79% 78% 79% 79% 60% 38% 37%
3,CFU 19 27 31 31 32 44 56 81
杀菌% 77% 67% 62% 62% 60% 46% 31%
4,CFU 15 22 23 19 33 36 40 81
杀菌% 81% 73% 72% 77% 59% 56% 51%
5,CFU 22 26 34 27 33 43 51 81
杀菌% 73% 68% 58% 67% 59% 47% 37%
6,CFU 22 17 19 28 43 51 57 81
杀菌% 73% 79% 77% 65% 47% 37% 30%
7,CFU 22 29 29 26 28 29 57 81
杀菌% 73% 64% 64% 68% 65% 64% 30%
8,CFU 31 23 31 35 48 63 63 81
杀菌% 62% 72% 62% 57% 41% 22% 22%
小鼠血清滴定以测量调理素作用活性
#1,128 #2,64 #3,64 #4,256 #5,128 #6,32 #7,128 #8,32。
表6:对抗血清型14型多醣(PS)及假肺炎链球菌溶血素(PPN)的抗体(Ab)反应
小鼠# 抗PS抗体 抗PPN抗体
效价 OD405(1∶300) 效价 OD405(1∶300)
1 76800 0.735 9600 0.454
2 76800 0.520 9600 0.360
3 76800 0.738 9600 0.285
4 19200 0.677 9600 0.266
5 19200 0.684 9600 0.381
6 4800 0.518 4800 0.261
7 76800 0.815 9600 0.348
8 4800 0.585 1200 0.125
如表5及表6所示,具较高抗14型多醣与假肺炎链球菌溶血素的抗体反应的小鼠(小鼠编号1,2,3,4,5,及7)显现较高的调理素作用活性,其中具较低抗14型多醣与假肺炎链球菌溶血素的抗体反应的小鼠(小鼠编号6与8)显现较低的调理素作用活性。发现PBS处理的小鼠无调理素作用活性。
其它实施例
可以理解,尽管本发明已以上述实施方法详细说明,但以上描述仅用于说明本发明,并非用于限制本发明的范围。本发明的其它方面、优点及修饰皆包含于权利要求的范围内。
序列表
<110>Synergy America,Inc
<120>治疗或预防肺炎球菌感染的组合物与方法
<130>12844-002W01
<140>PCT/US2003/035529
<141>2003-11-06
<150>US 60/424,497
<151>2002/11/07
<160>26
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>471
<212>PRT
<213>Streptococcus pneumoniae
<400>1
Met Ala Asn Lys Ala Val Asn Asp Phe Ile Leu Ala Met Asn Tyr Asp
1 5 10 15
Lys Lys Lys Leu Leu Thr His Gln Gly Glu Ser Ile Glu Asn Arg Phe
20 25 30
Ile Lys Glu Gly Asn Gln Leu Pro Asp Glu Phe Val Val Ile Glu Arg
35 40 45
Lys Lys Arg Ser Leu Ser Thr Asn Thr Ser Asp Ile Ser Val Thr Ala
50 55 60
Thr Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Glu
65 70 75 80
Thr Leu Leu Glu Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Val Asp Arg Ala Pro
85 90 95
Met Thr Tyr Ser Ile Asp Leu Pro Gly Leu Ala Ser Ser Asp Ser Phe
100 105 110
Leu Gln Val Glu Asp Pro Ser Asn Ser Ser Val Arg Gly Ala Val Asn
115 120 125
Asp Leu Leu Ala Lys Trp His Gln Asp Tyr Gly Gln Val Asn Asn Val
130 135 140
Pro Ala Arg Met Gln Tyr Glu Lys Ile Thr Ala His Ser Met Glu Gln
145 150 155 160
Leu Lys Val Lys Phe Gly Ser Asp Phe Glu Lys Thr Gly Asn Ser Leu
165 170 175
Asp Ile Asp Phe Asn Ser Val His Ser Gly Glu Lys Gln Ile Gln Ile
180 185 190
Val Asn Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Thr Val Ser Val Asp Ala Val Lys
195 200 205
Asn Pro Gly Asp Val Phe Gln Asp Thr Val Thr Val Glu Asp Leu Lys
210 215 220
Gln Arg Gly Ile Ser Ala Glu Arg Pro Leu Val Tyr Ile Ser Ser Val
225 230 235 240
Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Glu Thr Thr Ser Lys Ser
245 250 255
Asp Glu Val Glu Ala Ala Phe Glu Ala Leu Ile Lys Gly Val Lys Val
260 265 270
Ala Pro Gln Thr Glu Trp Lys Gln Ile Leu Asp Asn Thr Glu Val Lys
275 280 285
Ala Val Ile Leu Gly Gly Asp Pro Ser Ser Gly Ala Arg Val Val Thr
290 295 300
Gly Lys Val Asp Met Val Glu Asp Leu Ile Gln Glu Gly Ser Arg Phe
305 310 315 320
Thr Ala Asp His Pro Gly Leu Pro Ile Ser Tyr Thr Thr Ser Phe Leu
325 330 335
Arg Asp Asn Val Val Ala Thr Phe Gln Asn Ser Thr Asp Tyr Val Glu
340 345 350
Thr Lys Val Thr Ala Tyr Arg Asn Gly Asp Leu Leu Leu Asp His Ser
355 360 365
Gly Ala Tyr Val Ala Gln Tyr Tyr Ile Thr Trp Asn Glu Leu Ser Tyr
370 375 380
Asp His Gln Gly Lys Glu Val Leu Thr Pro Lys Ala Trp Asp Arg Asn
385 390 395 400
Gly Gln Asp Leu Thr Ala His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gly
405 410 415
Asn Val Arg Asn Leu Ser Val Lys Ile Arg Glu Cys Thr Gly Leu Ala
420 425 430
Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Tyr Glu Lys Thr Asp Leu Pro Leu Val
435 440 445
Arg Lys Arg Thr Ile Ser Ile Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Gln Val
450 455 460
Glu Asp Lys Val Glu Asn Asp
465 470
<210>2
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>2
gactagatct ccatatggca aataaagcag taaatgac 38
<210>3
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>3
cagtggatcc ttactagtca ttttctacct tatc 34
<210>4
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>4
gactgctagc caccatggca aataaagcag taaatgac 38
<210>5
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>5
gactggatcc ttactagaga gttgttcccc aaatag 36
<210>6
<211>35
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>6
gactggatcc ttactaatct tctacctgag gatag 35
<210>7
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>7
gactggatcc ttactattct accttatctt ctacctgag 39
<210>8
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>8
gactggatcc ttactaattt tctaccttat cttctacctg ag 42
<210>9
<211>1413
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetically generated construct
<400>9
atggcaaata aagcagtaaa tgactttata ctagctatga attacgataa aaagaaactc 60
ttgacccatc agggagaaag tattgaaaat cgtttcatca aagagggtaa tcagctaccc 120
gatgagtttg ttgttatcga aagaaagaag cggagcttgt cgacaaatac aagtgatatt 180
tctgtaacag ctaccaacga cagtcgcctc tatcctggag cacttctcgt agtggatgag 240
accttgttag agaataatcc cactcttctt gcggtcgatc gtgctccgat gacttatagt 300
attgatttgc ctggtttggc aagtagcgat agctttctcc aagtggaaga ccccagcaat 360
tcaagtgttc gcggagcggt aaacgatttg ttggctaagt ggcatcaaga ttatggtcag 420
gtcaataatg tcccagctag aatgcagtat gaaaaaatca cggctcacag catggaacaa 480
ctcaaggtca agtttggttc tgactttgaa aagacaggga attctcttga tattgatttt 540
aactctgtcc attcaggcga aaagcagatt cagattgtta attttaagca gatttattat 600
acagtcagcg tagatgctgt taaaaatcca ggagatgtgt ttcaagatac tgtaacggta 660
gaggatttaa aacagagagg aatttctgca gagcgtcctt tggtctatat ttcgagtgtt 720
gcttatgggc gccaagtcta tctcaagttg gaaaccacga gtaagagtga tgaagtagag 780
gctgcttttg aagctttgat aaaaggagtc aaggtagctc ctcagacaga gtggaaacag 840
attttggaca atacagaagt gaaggcggtt attttagggg gcgacccaag ttcgggtgcc 900
cgagttgtaa caggcaaggt ggatatggta gaggacttga ttcaagaagg cagtcgcttt 960
acagcagatc atccaggctt gccgatttcc tatacaactt cttttttacg tgacaatgta 1020
gttgcgacct ttcaaaatag tacagactat gttgagacta aggttacagc ttacagaaac 1080
ggagatttac tgctggatca tagtggtgcc tatgttgccc aatattatat tacttggaat 1140
gaattatcct atgatcatca aggtaaggaa gtcttgactc ctaaggcttg ggacagaaat 1200
gggcaggatt taacggctca ctttaccact agtattcctt taaaagggaa tgttcgtaat 1260
ctctctgtca aaattagaga gcgttccggg cttgcctggg aatggtggcg tacggtttat 1320
gaaaaaaccg atttgccact agtgcgtaag cggacgattt ctatttgggg aacaactctc 1380
tatcctcagg tagaagataa ggtagaaaat gac 1413
<210>10
<211>1380
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetically generated construct
<400>10
atggcaaata aagcagtaaa tgactttata ctagctatga attacgataa aaagaaactc 60
ttgacccatc agggagaaag tattgaaaat cgtttcatca aagagggtaa tcagctaccc 120
gatgagtttg ttgttatcga aagaaagaag cggagcttgt cgacaaatac aagtgatatt 180
tctgtaacag ctaccaacga cagtcgcctc tatcctggag cacttctcgt agtggatgag 240
accttgttag agaataatcc cactcttctt gcggtcgatc gtgctccgat gacttatagt 300
attgatttgc ctggtttggc aagtagcgat agctttctcc aagtggaaga ccccagcaat 360
tcaagtgttc gcggagcggt aaacgatttg ttggctaagt ggcatcaaga ttatggtcag 420
gtcaataatg tcccagctag aatgcagtat gaaaaaatca cggctcacag catggaacaa 480
ctcaaggtca agtttggttc tgactttgaa aagacaggga attctcttga tattgatttt 540
aactctgtcc attcaggcga aaagcagatt cagattgtta attttaagca gatttattat 600
acagtcagcg tagatgctgt taaaaatcca ggagatgtgt ttcaagatac tgtaacggta 660
gaggatttaa aacagagagg aatttctgca gagcgtcctt tggtctatat ttcgagtgtt 720
gcttatgggc gccaagtcta tctcaagttg gaaaccacga gtaagagtga tgaagtagag 780
gctgcttttg aagctttgat aaaaggagtc aaggtagctc ctcagacaga gtggaaacag 840
attttggaca atacagaagt gaaggcggtt attttagggg gcgacccaag ttcgggtgcc 900
cgagttgtaa caggcaaggt ggatatggta gaggacttga ttcaagaagg cagtcgcttt 960
acagcagatc atccaggctt gccgatttcc tatacaactt cttttttacg tgacaatgta 1020
gttgcgacct ttcaaaatag tacagactat gttgagacta aggttacagc ttacagaaac 1080
ggagatttac tgctggatca tagtggtgcc tatgttgccc aatattatat tacttggaat 1140
gaattatcct atgatcatca aggtaaggaa gtcttgactc ctaaggcttg ggacagaaat 1200
gggcaggatt taacggctca ctttaccact agtattcctt taaaagggaa tgttcgtaat 1260
ctctctgtca aaattagaga gcgttccggg cttgcctggg aatggtggcg tacggtttat 1320
gaaaaaaccg atttgccact agtgcgtaag cggacgattt ctatttgggg aacaactctc 1380
<210>11
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer
<400>11
gactaagctt gccaccatgg aaattaatgt gagtaaatta ag 42
<210>12
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>12
ctgactcgag ttattttact gtaatcaagc catc 34
<210>13
<211>954
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>pSA-59 Aly insert
<400>13
atggaaatta atgtgagtaa attaagaaca gatttgcctc aagttggcgt gcaaccatat 60
aggcaagtac acgcacactc aactgggaat ccgcattcaa ccgtacagaa tgaagcggat 120
tatcattggc ggaaagaccc agaattaggt tttttctcgc acattgttgg gaacggatgc 180
atcatgcagg taggacctgt taataatggt gcctgggacg ttgggggcgg ttggaatgct 240
gagacctatg cagcggttga actgattgaa agccattcaa ctaaagaaga gttcatgacg 300
gactaccgcc tttatatcga actcttacgc aatctagcag atgaagcagg tttgccgaaa 360
acgcttgata cagggagttt agctggaatt aaaacgcacg agtattgcac gaataaccaa 420
ccaaacaacc actcagacca tgtggatcca tacccttact tggcaaaatg gggcattagc 480
cgtgagcagt ttaagcatga tattgagaac ggcttgacga ttgaaacagg ctggcagaag 540
aatgacactg gctactggta cgtacattca gacggctctt atccaaaaga caagtttgag 600
aaaatcaatg gcacttggta ctactttgac agttcaggct atatgcttgc agaccgctgg 660
aggaagcaca cagacggcaa ttggtactac tttgaccaat caggcgaaat ggctacaggc 720
tggaagaaaa tcgctgagaa gtggtactat ttcaacgaag aaggtgccat gaagacaggc 780
tgggtcaagt acaaggacac ttggtactac ttagacgcta aagaaggcgc aatggtatca 840
aatgccttta tccagtcagc ggacggaaca ggctggtact acctcaaacc agacggaaca 900
ctggcagaca agccagaatt cacagtagag ccagatggct tgattacagt aaaa 954
<210>14
<211>318
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>polypeptide of pSA-59 Aly insert sequence
<400>14
Met Glu Ile Asn Val Ser Lys Leu Arg Thr Asp Leu Pro Gln Val Gly
1 5 10 15
Val Gln Pro Tyr Arg Gln Val His Ala His Ser Thr Gly Asn Pro His
20 25 30
Ser Thr Val Gln Asn Glu Ala Asp Tyr His Trp Arg Lys Asp Pro Glu
35 40 45
Leu Gly Phe Phe Ser His Ile Val Gly Asn Gly Cys Ile Met Gln Val
50 55 60
Gly Pro Val Asn Asn Gly Ala Trp Asp Val Gly Gly Gly Trp Asn Ala
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Ala Ala Val Glu Leu Ile Glu Ser His Ser Thr Lys Glu
85 90 95
Glu Phe Met Thr Asp Tyr Arg Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Arg Asn Leu
100 105 110
Ala Asp Glu Ala Gly Leu Pro Lys Thr Leu Asp Thr Gly Ser Leu Ala
115 120 125
Gly Ile Lys Thr His Glu Tyr Cys Thr Asn Asn Gln Pro Asn Asn His
130 135 140
Ser Asp His Val Asp Pro Tyr Pro Tyr Leu Ala Lys Trp Gly Ile Ser
145 150 155 160
Arg Glu Gln Phe Lys His Asp Ile Glu Asn Gly Leu Thr Ile Glu Thr
165 170 175
Gly Trp Gln Lys Asn Asp Thr Gly Tyr Trp Tyr Val His Ser Asp Gly
180 185 190
Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr
195 200 205
Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr
210 215 220
Asp Gly Asn Trp Tyr Tyr Phe Asp Gln Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly
225 230 235 240
Trp Lys Lys Ile Ala Glu Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala
245 250 255
Met Lys Thr Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp
260 265 270
Ala Lys Glu Gly Ala Met Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp
275 280 285
Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Lys
290 295 300
Pro Glu Phe Thr Val Glu Pro Asp Gly Leu Ile Thr Val Lys
305 310 315
<210>15
<211>43
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer
<400>15
gactaagctt gccaccatgg aagaagctcc cgtagctagt cag 43
<210>16
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>16
gactctcgag ctatccatca gggcctaact cattaag 37
<210>17
<211>1377
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>pSA-59 Aly insert
<400>17
atggaagaag ctcccgtagc tagtcagtct aaagctgaga aagactatga tgcagcagtg 60
aaaaaatctg aagctgctaa gaaggcttac gaagaagcta aaaagaaagc agaagacgct 120
cagaaaaaat atgatgagga tcagaagaaa actgaggcaa aagcggataa ggaagcaaaa 180
gcatctgcgg aaatagataa agccacgttt gctgtacaaa gtgcgtatgt aaaattttta 240
aatgtccaat ctaatcgtca aatttcggag aatgaacgaa aaaaacaatt agcagaaata 300
gataaagaga tagagaatgc taaacaaaat ttacagaata aacaggaaga atttaataag 360
gttagagcag aagtaattcc tgaagcaaag gggttagctg ttactaaaca aaaagcggaa 420
gaagctaaaa aagaagcaga agtagctaag agaaaatatg attatgcaac tctaaaggta 480
gcactagcga agaaagaagt agaggctaag gaacttgaaa ttgaaaaact tcaatatgaa 540
atttctactt tggaacaaga agttgctatt gctcaacatc aagtagataa tttgaaaaaa 600
cttcttgctg gtgcggatcc tgatgatggc acaaaagtta tagaagctaa attaaacaaa 660
ggagaagctg agctaaacgc taaacaagct gagttagcaa aaaaacaaac agaacttgaa 720
aaacttcttg acagccttga tcctgaaggt aagactcagg atgaattaga taaagaagct 780
gctgaagctg agttggataa aaaagctgat gaacttcaaa ataaagttgc tgatttagaa 840
aaaggaattg ctccttatca aatcaaagtc gctgaattaa ataaagaaat tgctagactt 900
caaagcgatt taaaagatgc tgaagaaaat aatgtagaag actatattaa agaaggttta 960
gagcaagcta tcgctgataa aaaagctgaa ttagctacaa ctcaacaaaa catagataaa 1020
actcaaaaag atttagagga tgctgaatta gaacttgaaa aagtattagc tacattagac 1080
cctgaaggta aaactcaaga tgaattagat aaagaagctg cagaagatgc taatattgaa 1140
gctcttcaaa acaaagttgc tgatctagaa aacaaggttg ctgaattaga taaagaagtt 1200
actagacttc aaagcgattt aaaagatgct gaagaaaaca atgtagaaga ctacgttaaa 1260
gaaggcttag ataaagctct tactgataaa aaagttgaat taaataatac tcaaaaagca 1320
ttagatactg ctcaaaaagc attagatact gctcttaatg agttaggccc tgatgga 1377
<210>18
<211>459
<212>PRT
<220>
<223>polypeptide of pSA-60 pspA insert sequence
<400>18
Met Glu Glu Ala Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr
1 5 10 15
Asp Ala Ala Val Lys Lys Ser Glu Ala Ala Lys Lys Ala Tyr Glu Glu
20 25 30
Ala Lys Lys Lys Ala Glu Asp Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gln
35 40 45
Lys Lys Thr Glu Ala Lys Ala Asp Lys Glu Ala Lys Ala Ser Ala Glu
50 55 60
Ile Asp Lys Ala Thr Phe Ala Val Gln Ser Ala Tyr Val Lys Phe Leu
65 70 75 80
Asn Val Gln Ser Asn Arg Gln Ile Ser Glu Asn Glu Arg Lys Lys Gln
85 90 95
Leu Ala Glu Ile Asp Lys Glu Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asn Leu Gln
100 105 110
Asn Lys Gln Glu Glu Phe Asn Lys Val Arg Ala Glu Val Ile Pro Glu
115 120 125
Ala Lys Gly Leu Ala Val Thr Lys Gln Lys Ala Glu Glu Ala Lys Lys
130 135 140
Glu Ala Glu Val Ala Lys Arg Lys Tyr Asp Tyr Ala Thr Leu Lys Val
145 150 155 160
Ala Leu Ala Lys Lys Glu Val Glu Ala Lys Glu Leu Glu Ile Glu Lys
165 170 175
Leu Gln Tyr Glu Ile Ser Thr Leu Glu Gln Glu Val Ala Ile Ala Gln
180 185 190
His Gln Val Asp Asn Leu Lys Lys Leu Leu Ala Gly Ala Asp Pro Asp
195 200 205
Asp Gly Thr Lys Val Ile Glu Ala Lys Leu Asn Lys Gly Glu Ala Glu
210 215 220
Leu Asn Ala Lys Gln Ala Glu Leu Ala Lys Lys Gln Thr Glu Leu Glu
225 230 235 240
Lys Leu Leu Asp Ser Leu Asp Pro Glu Gly Lys Thr Gln Asp Glu Leu
245 250 255
Asp Lys Glu Ala Ala Glu Ala Glu Leu Asp Lys Lys Ala Asp Glu Leu
260 265 270
Gln Asn Lys Val Ala Asp Leu Glu Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Gln Ile
275 280 285
Lys Val Ala Glu Leu Asn Lys Glu Ile Ala Arg Leu Gln Ser Asp Leu
290 295 300
Lys Asp Ala Glu Glu Asn Asn Val Glu Asp Tyr Ile Lys Glu Gly Leu
305 310 315 320
Glu Gln Ala Ile Ala Asp Lys Lys Ala Glu Leu Ala Thr Thr Gln Gln
325 330 335
Asn Ile Asp Lys Thr Gln Lys Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Glu Leu
340 345 350
Glu Lys Val Leu Ala Thr Leu Asp Pro Glu Gly Lys Thr Gln Asp Glu
355 360 365
Leu Asp Lys Glu Ala Ala Glu Asp Ala Asn Ile Glu Ala Leu Gln Asn
370 375 380
Lys Val Ala Asp Leu Glu Asn Lys Val Ala Glu Leu Asp Lys Glu Val
385 390 395 400
Thr Arg Leu Gln Ser Asp Leu Lys Asp Ala Glu Glu Asn Asn Val Glu
405 410 415
Asp Tyr Val Lys Glu Gly Leu Asp Lys Ala Leu Thr Asp Lys Lys Val
420 425 430
Glu Leu Asn Asn Thr Gln Lys Ala Leu Asp Thr Ala Gln Lys Ala Leu
435 440 445
Asp Thr Ala Leu Asn Glu Leu Gly Pro Asp Gly
450 455
<210>19
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>19
ctgaggatcc ttactaagct gtaaccttag tctc 34
<210>20
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>20
caaaattaga gaacgttccg ggcttgcctg ggaatgg 37
<210>21
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>21
gcccggaacg ttctctaatt ttgacagaga gattacg 37
<210>22
<211>5
<212>PRT
<213>Streptococcus pneumoniae
<400>22
Lys Val Glu Asn Asp
1 5
<210>23
<211>7
<212>PRT
<213>Streptococcus pneumoniae
<400>23
Glu Asp Lys Val Glu Asn Asp
1 5
<210>24
<211>11
<212>PRT
<213>Streptococcus pneumoniae
<400>24
Tyr Pro Gln Val Glu Asp Lys Val Glu Asn Asp
1 5 10
<210>25
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer
<400>25
ctgaggatcc ttactatacc tgaggataga gagttgttc 39
<210>26
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Promer
<400>26
gactggatcc ctatacctga ggatagagag ttg 33
Claims (79)
1.含有与肺炎链球菌荚膜多糖轭合的多肽的组合物,其中所述多肽包括肺炎链球菌溶血素蛋白质的至少400连续氨基酸的片段,其中所述多肽缺乏氨基酸序列KVEND(SEQ ID NO:22),所述多肽缺乏溶血活性,以及所述组合物在给予哺乳动物时引起抗肺炎链球菌的免疫反应。
2.如权利要求1所述的组合物,其中所述肺炎链球菌溶血素蛋白质包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的组合物,其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-460。
4.如权利要求1所述的组合物,其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-464。
5.如权利要求1所述的组合物,其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-465。
6.如权利要求1所述的组合物,其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-466。
7.如权利要求1所述的组合物,其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-469。
8.如权利要求1所述的组合物,其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-470。
9.如权利要求1所述的组合物,其中所述多肽缺乏氨基酸序列EDKVEND(SEQ ID NO:23)。
10.如权利要求1所述的组合物,其中所述多肽缺乏氨基酸序列YPQVEDKVEND(SEQ ID NO:24)。
11.如权利要求1所述的组合物,其中所述多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-460所组成。
12.如权利要求1所述的组合物,其中所述多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-464所组成。
13.如权利要求1所述的组合物,其中所述多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-465所组成。
14.如权利要求1所述的组合物,其中所述多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-466所组成。
15.如权利要求1所述的组合物,其中所述多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-469所组成。
16.如权利要求1所述的组合物,其中所述多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-470所组成。
17.如权利要求1所述的组合物,其中所述荚膜多糖选自血清型4、6B、9V、14、18C、19F、及23F型。
18.如权利要求1所述的组合物,其中所述荚膜多糖为血清型14型。
19.如权利要求1所述的组合物,其中所述荚膜多糖为血清型18C型。
20.如权利要求1所述的组合物,其中所述组合物包含选自血清型4、6B、9V、14、18C、19F、及23F型的多种不同的荚膜多糖。
21.如权利要求1所述的组合物,其中所述免疫反应包含体液免疫反应。
22.如权利要求1所述的组合物,其中所述免疫反应包含细胞免疫反应。
23.如权利要求1所述的组合物,其中所述免疫反应直接抗肺炎链球菌荚膜多糖。
24.如权利要求1所述的组合物,其中所述免疫反应直接抗肺炎链球菌溶血素蛋白质。
25.如权利要求1所述的组合物,其中所述免疫反应直接抗肺炎链球菌荚膜多糖及肺炎链球菌溶血素蛋白质。
26.哺乳动物表达载体,其包含可操作性连接于核酸序列的启动子,所述核酸序列含有编码肺炎链球菌溶血素蛋白质的至少400连续氨基酸片段多肽的核酸,其中所述多肽缺乏氨基酸序列KVEND(SEQ ID NO:22),所述多肽缺乏溶血活性,以及当所述表达载体在给予哺乳动物时,所述多肽引起抗肺炎链球菌的免疫反应。
27.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述肺炎链球菌溶血素蛋白质包含SEQ ID NO:1。
28.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-460。
29.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-464。
30.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-465。
31.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-466。
32.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-469。
33.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-470。
34.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽缺乏氨基酸序列EDKVEND(SEQ ID NO:23)。
35.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽缺乏氨基酸序列YPQVEDKVEND(SEQ ID NO:24)。
36.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽由SEQID NO:1的氨基酸残基1-460所组成。
37.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽由SEQID NO:1的氨基酸残基1-464所组成。
38.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽由SEQID NO:1的氨基酸残基1-465所组成。
39.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽由SEQID NO:1的氨基酸残基1-466所组成。
40.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽由SEQID NO:1的氨基酸残基1-469所组成。
41.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽由SEQID NO:1的氨基酸残基1-470所组成。
42.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述免疫反应包含体液免疫反应。
43.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述免疫反应包含细胞免疫反应。
44.如权利要求26所述的哺乳动物表达载体,其中所述免疫反应直接抗肺炎链球菌溶血素蛋白质。
45.哺乳动物表达载体,其包含可操作性连接于核酸序列的启动子,所述核酸序列含有编码肺炎链球菌自溶素多肽的核酸,其中当所述表达载体在给予哺乳动物时,所述多肽引起抗肺炎链球菌的免疫反应。
46.如权利要求45所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽包含SEQ ID NO:14。
47.如权利要求45所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽由SEQID NO:14的氨基酸序列所构成。
48.如权利要求45所述的哺乳动物表达载体,其中所述免疫反应包含体液免疫反应。
49.如权利要求45所述的哺乳动物表达载体,其中所述免疫反应包含细胞免疫反应。
50.哺乳动物表达载体,其包含可操作性连接于核酸序列的启动子,所述核酸序列含有编码肺炎链球菌肺炎球菌表面蛋白A多肽的核酸,其中当所述表达载体在给予哺乳动物时,所述多肽引起抗肺炎链球菌的免疫反应。
51.如权利要求50所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽包含SEQ ID NO:18。
52.如权利要求50所述的哺乳动物表达载体,其中所述多肽由SEQID NO:18的氨基酸序列所构成。
53.如权利要求50所述的哺乳动物表达载体,其中所述免疫反应包含体液免疫反应。
54.如权利要求50所述的哺乳动物表达载体,其中所述免疫反应包含细包免疫反应。
55.多肽,其由选自SEQ ID NO:1的氨基酸1-460、SEQ ID NO:1的氨基酸1-464、SEQ ID NO:1的氨基酸1-466以及SEQ ID NO:1的氨基酸1-469的氨基酸序列所构成。
56.引起哺乳动物体内免疫反应的方法,其包含给予哺乳动物有效引起所述哺乳动物对抗肺炎链球菌的免疫反应的含量的如权利要求1所述的组合物。
57.如权利要求56所述的方法,其中所述免疫反应为预防性免疫反应。
58.如权利要求56所述的方法,其中所述免疫反应为治疗性免疫反应。
59.如权利要求56所述的方法,其中所述免疫反应为抗至少一种肺炎链球菌血清型的交叉反应性反应,所述肺炎链球菌血清型与所述组合物中的荚膜多糖不同。
60.如权利要求59所述的方法,其中所述荚膜多糖为血清型7型。
61.如权利要求59所述的方法,其中所述荚膜多糖为血清型6B型。
62.如权利要求59所述的方法,其中所述荚膜多糖为血清型18C型。
63.如权利要求59所述的方法,其中所述荚膜多糖为血清型23F型。
64.如权利要求56所述的方法,其中所述免疫反应为抗至少一种链球菌属的非肺炎链球菌的交叉反应性反应。
65.引起哺乳动物体内免疫反应的方法,所述方法包含给予哺乳动物一定量的可有效引起所述哺乳动物抗肺炎链球菌免疫反应的如权利要求26所述的表达载体。
66.如权利要求65所述的方法,其中所述免疫反应为抗至少一种链球菌属的非肺炎链球菌的交叉反应性反应。
67.引起哺乳动物体内免疫反应的方法,所述方法包含给予哺乳动物一定量的有效引起所述哺乳动物抗肺炎链球菌的免疫反应的如权利要求45所述的表达载体。
68.如权利要求67所述的方法,其中所述免疫反应为抗至少一种链球菌属的非肺炎链球菌的交叉反应性反应。
69.引起哺乳动物体内免疫反应的方法,所述方法包含给予哺乳动物一定量的有效引起所述哺乳动物抗肺炎链球菌的免疫反应的如权利要求50所述的表达载体。
70.如权利要求69所述的方法,其中所述免疫反应为抗至少一种链球菌属的非肺炎链球菌的交叉反应性反应。
71.引起哺乳动物体内免疫反应的方法,所述方法包含:
给予哺乳动物一种哺乳动物表达载体,所述表达载体包含可操作性连接核酸序列的启动子,所述核酸序列含有编码肺炎链球菌溶血素多肽或其抗原片段的核酸;及
给予所述哺乳动物纯化的溶血素多肽或其抗原片段,
其中所述组合的给予方式引起所述哺乳动物抗肺炎链球菌溶血素的免疫反应。
72.如权利要求71所述的方法,其中所述哺乳动物被给予至少两次分别剂量的所述表达载体。
73.如权利要求71所述的方法,其中所述溶血素多肽或其抗原片段的给予在所述表达载体给予后的至少1星期给予。
74.含有与非肺炎链球菌细菌多糖轭合的多肽的组合物,其中所述多肽包含肺炎链球菌溶血素蛋白质的至少400连续氨基酸的片段,所述多肽缺乏氨基酸序列KVEND(SEQ ID NO:22),所述多肽缺乏溶血活性,以及所述组合物在给予哺乳动物时引起抗非肺炎链球菌的免疫反应。
75.如权利要求74所述的组合物,其中所述非肺炎链球菌选自肺炎球菌;流感嗜血杆菌b型;脑膜炎球菌A、B、或C群;以及B群链球菌Ia、Ib、II、III、V或VIII型。
76.引起哺乳动物体内免疫反应的方法,所述方法包含给予哺乳动物一定量的有效引起所述哺乳动物抗非肺炎链球菌的免疫反应的如权利要求74所述的组合物。
77.如权利要求76所述的方法,其中所述非肺炎链球菌选自肺炎球菌;流感嗜血杆菌b型;脑膜炎球菌A、B、或C群;以及B群链球菌Ia、Ib、II、III、V或VIII型。
78.轭合于权利要求1所述的组合物上的纯化抗体。
79.治疗或预防哺乳动物肺炎链球菌感染的方法,所述的方法包含给予哺乳动物治疗性或预防性有效量的纯化抗体,所述纯化抗体轭合于权利要求1所述的组合物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US42449702P | 2002-11-07 | 2002-11-07 | |
US60/424,497 | 2002-11-07 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1711105A true CN1711105A (zh) | 2005-12-21 |
CN100443116C CN100443116C (zh) | 2008-12-17 |
Family
ID=32312819
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB2003801027586A Expired - Lifetime CN100443116C (zh) | 2002-11-07 | 2003-11-06 | 治疗或预防肺炎球菌感染的组合物及其用途 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7217791B2 (zh) |
EP (1) | EP1558280B1 (zh) |
JP (3) | JP2006506989A (zh) |
KR (1) | KR20050086427A (zh) |
CN (1) | CN100443116C (zh) |
AU (1) | AU2003291365B2 (zh) |
CA (1) | CA2504938C (zh) |
ES (1) | ES2451620T3 (zh) |
HK (1) | HK1074005A1 (zh) |
TW (1) | TWI315986B (zh) |
WO (1) | WO2004043376A2 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108424464A (zh) * | 2011-10-05 | 2018-08-21 | 洛克菲勒大学 | 二聚噬菌体溶素 |
CN108578685A (zh) * | 2011-04-21 | 2018-09-28 | 洛克菲勒大学 | 用于革兰氏阳性菌检测和治疗的链球菌属细菌噬菌体溶素 |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2386567B1 (en) | 2007-04-13 | 2014-10-29 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Mutants of cholesterol-dependent cytolysins and uses thereof |
GB0714963D0 (en) | 2007-08-01 | 2007-09-12 | Novartis Ag | Compositions comprising antigens |
WO2009094730A1 (en) * | 2008-02-01 | 2009-08-06 | Newcastle Innovation Limited | Vaccine compositions |
CN102438649A (zh) | 2009-03-24 | 2012-05-02 | 诺华有限公司 | 脑膜炎球菌h因子结合蛋白和肺炎球菌结合糖的组合物 |
CN102695523A (zh) | 2009-09-10 | 2012-09-26 | 诺华有限公司 | 针对呼吸道疾病的组合疫苗 |
GB201003922D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Conjugation process |
WO2011112906A2 (en) | 2010-03-12 | 2011-09-15 | Children's Medical Center Corporation | Novel immunogens and methods for discovery and screening thereof |
WO2012072769A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-07 | Novartis Ag | Pneumococcal rrgb epitopes and clade combinations |
MX339058B (es) | 2011-05-17 | 2016-05-09 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vacuna contra streptococcus pneumoniae. |
EP2822586A1 (en) | 2012-03-07 | 2015-01-14 | Novartis AG | Adjuvanted formulations of streptococcus pneumoniae antigens |
WO2014124228A1 (en) | 2013-02-07 | 2014-08-14 | Children's Medical Center Corporation | Protein antigens that provide protection against pneumococcal colonization and/or disease |
US9815886B2 (en) | 2014-10-28 | 2017-11-14 | Adma Biologics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency |
CN107106635B (zh) | 2014-11-21 | 2021-10-08 | 俄克拉何马大学董事会 | 肺炎球菌溶血素突变体及其使用方法 |
GB201610599D0 (en) * | 2016-06-17 | 2016-08-03 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunogenic Composition |
US11951165B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-04-09 | Vaxcyte, Inc. | Conjugated vaccine carrier proteins |
JP7186166B2 (ja) | 2016-12-30 | 2022-12-08 | バックスサイト・インコーポレイテッド | 非天然アミノ酸とのポリペプチド抗原接合体 |
US10259865B2 (en) | 2017-03-15 | 2019-04-16 | Adma Biologics, Inc. | Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection |
CA3111459A1 (en) | 2018-09-12 | 2020-03-19 | Affinivax, Inc. | Multivalent pneumococcal vaccines |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HUT58804A (en) * | 1988-12-16 | 1992-03-30 | James Cleland Paton | Process for producing pneumolysine mutants and pneumococcus vaccines |
WO1995016711A1 (es) * | 1993-12-17 | 1995-06-22 | Universidad De Oviedo | Anticuerpos contra la neumolisina y sus aplicaciones |
US5565204A (en) * | 1994-08-24 | 1996-10-15 | American Cyanamid Company | Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections |
WO1999003884A2 (en) | 1997-07-21 | 1999-01-28 | North American Vaccine, Inc. | Modified immunogenic pneumolysin, compositions and their use as vaccines |
GB9717953D0 (en) * | 1997-08-22 | 1997-10-29 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
EP2053126A1 (en) * | 1998-07-27 | 2009-04-29 | Sanofi Pasteur Limited | Streptococcus pneumoniae proteins and nucleic acid molecules |
DE69930147T2 (de) * | 1998-12-04 | 2007-01-11 | University Of Manitoba, Winnipeg | Zwei-schritte-verfahren zur impfung gegen chlamydia |
JP2002533124A (ja) * | 1998-12-31 | 2002-10-08 | カイロン コーポレイション | Hivポリペプチドの改善された発現およびウイルス様粒子の生成 |
DE60026588T2 (de) * | 1999-12-17 | 2007-01-18 | Wyeth Holdings Corp. | Impfstoffe zur erhöhung der immunantworten gegen herpes simplex virus |
-
2003
- 2003-11-06 AU AU2003291365A patent/AU2003291365B2/en not_active Expired
- 2003-11-06 CA CA2504938A patent/CA2504938C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-06 JP JP2004551863A patent/JP2006506989A/ja active Pending
- 2003-11-06 KR KR1020057008095A patent/KR20050086427A/ko not_active Application Discontinuation
- 2003-11-06 ES ES03768757.1T patent/ES2451620T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-06 US US10/702,305 patent/US7217791B2/en active Active
- 2003-11-06 WO PCT/US2003/035529 patent/WO2004043376A2/en active Application Filing
- 2003-11-06 TW TW092131025A patent/TWI315986B/zh active
- 2003-11-06 EP EP03768757.1A patent/EP1558280B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-06 CN CNB2003801027586A patent/CN100443116C/zh not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-08-16 HK HK05107111.4A patent/HK1074005A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-05-14 US US11/748,270 patent/US7585669B2/en active Active - Reinstated
-
2009
- 2009-11-04 JP JP2009253536A patent/JP2010057501A/ja active Pending
-
2012
- 2012-02-08 JP JP2012025451A patent/JP2012139221A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108578685A (zh) * | 2011-04-21 | 2018-09-28 | 洛克菲勒大学 | 用于革兰氏阳性菌检测和治疗的链球菌属细菌噬菌体溶素 |
CN108424464A (zh) * | 2011-10-05 | 2018-08-21 | 洛克菲勒大学 | 二聚噬菌体溶素 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2504938C (en) | 2011-10-11 |
US7585669B2 (en) | 2009-09-08 |
KR20050086427A (ko) | 2005-08-30 |
EP1558280A4 (en) | 2007-08-29 |
JP2012139221A (ja) | 2012-07-26 |
ES2451620T3 (es) | 2014-03-28 |
JP2006506989A (ja) | 2006-03-02 |
HK1074005A1 (en) | 2005-10-28 |
US20040213803A1 (en) | 2004-10-28 |
AU2003291365A1 (en) | 2004-06-03 |
JP2010057501A (ja) | 2010-03-18 |
US7217791B2 (en) | 2007-05-15 |
CN100443116C (zh) | 2008-12-17 |
TW200418502A (en) | 2004-10-01 |
WO2004043376A2 (en) | 2004-05-27 |
US20080199952A1 (en) | 2008-08-21 |
EP1558280B1 (en) | 2014-01-08 |
WO2004043376A3 (en) | 2004-10-14 |
CA2504938A1 (en) | 2004-05-27 |
AU2003291365B2 (en) | 2009-06-11 |
TWI315986B (en) | 2009-10-21 |
EP1558280A2 (en) | 2005-08-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1711105A (zh) | 治疗或预防肺炎球菌感染的组合物与方法 | |
CN1200731C (zh) | 用作疫苗的肺炎球菌胆碱结合蛋白衍生物 | |
CN1191362C (zh) | 新颖的链球菌抗原 | |
CN1201818C (zh) | 疫苗 | |
CN1268745C (zh) | B组链球菌抗原 | |
CN1809380A (zh) | 广泛防御高毒性脑膜炎球菌谱系的多肽-疫苗 | |
CN1679929A (zh) | 链球菌C5a肽酶疫苗 | |
CN1946420A (zh) | 利用蛋白质进行针对脑膜炎球菌血清群y的免疫 | |
CN1556857A (zh) | 呼吸道合胞病毒(rsv)g蛋白的新肽及其在疫苗中的应用 | |
CN1416352A (zh) | 含有脑膜炎奈瑟球菌b血清群外膜蛋白质的外膜囊(omv)疫苗 | |
CN101031647A (zh) | 在大肠杆菌中制备猪丹毒杆菌表面保护性抗原变体的方法 | |
CN1298848C (zh) | 具有减弱的蛋白酶活性的嗜血杆菌Hin47类似物 | |
CN1705679A (zh) | 编码b族链球菌粘着因子的核酸、b族链球菌的粘着因子和它们的用途 | |
CN1198932C (zh) | 肺炎链球菌抗原 | |
CN1256147C (zh) | Cd8作为细胞免疫系统的抑制剂 | |
CN1259422C (zh) | 呼吸合胞病毒的吸附(g)蛋白衍生的肽 | |
CN1414102A (zh) | 间日疟原虫和镰状疟原虫红细胞结合蛋白的结合区 | |
CN1211487C (zh) | 链球菌毒素a突变体及其使用方法 | |
CN1688607A (zh) | 包含支架,佐剂和抗原的异源多聚体化合物及其用途 | |
CN1741818A (zh) | 线虫多肽佐剂 | |
CN87105411A (zh) | B型肝炎病毒表面抗原前s区的t细胞和b细胞抗原决定基 | |
CN1899609A (zh) | 肺炎球菌多糖蛋白偶联疫苗及其制备方法 | |
CN1705492A (zh) | 用于诱发抗过敏原保护性免疫应答的重组核酸 | |
CN1158387C (zh) | 编码l.infantum的四种蛋白质的抗原决定簇的嵌合基因 | |
CN1714153A (zh) | 重组蛋白质变异体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CX01 | Expiry of patent term | ||
CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20081217 |