JP7186166B2 - 非天然アミノ酸とのポリペプチド抗原接合体 - Google Patents
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Description
この出願は、2016年12月30日に出願された米国仮特許出願第62/441,115号、2017年7月10日に出願された米国仮特許出願第62/530,803号、2017年10月4日に出願された米国仮特許出願第62/568,201号、および2017年11月27日に出願された米国仮特許出願第62/591,160号の利益を主張し、それらの各々は、それらの全体が参照により組み込まれる。
Arは、任意選択的に、少なくとも1つのヘテロ原子を含有する5員または6員芳香族環を含み、
W5は、C1~C10アルキレン、-NH-、-O-、および-S-から選択され、
Q1は、ゼロまたは1であり、
W6は、アジド、任意選択的に低級アルキル基とC置換される1,2,4,5-テトラジニル、およびエチニルから選択され、
その結果、ポリペプチド中のnnAA残基は、式XIIIの構造を有し、
Arは、任意選択的に、少なくとも1つのヘテロ原子を含有する5員または6員芳香族環を含み、
W5は、C1~C10アルキレン、-NH-、-O-、および-S-から選択され、
Q1は、ゼロまたは1であり、
W6は、アジド、任意選択的に低級アルキル基とC置換される1,2,4,5-テトラジニル、およびエチニルから選択される。
Arは、任意選択的に、少なくとも1つのヘテロ原子を含有する5員または6員芳香族環を含み、
W5は、C1~C10アルキレン、-NH-、-O-、および-S-から選択され、
Q1は、ゼロまたは1であり、
W6は、アジド、任意選択的に低級アルキル基とC置換される1,2,4,5-テトラジニル、およびエチニルから選択される。
「抑制コドン」という用語は、所定の場所でポリヌクレオチド内に導入されるヌクレオチドトリプレットを指し、終止コドン(例えば、アンバー、オークル、またはオパール終止コドン)を認識することができる特異的tRNAによって認識され、翻訳がコドンを読み取ってタンパク質を生成し、それによって終止コドンを抑制することを可能にする。
別段の定めがない限り、本明細書で使用されるすべての技術的かつ科学的用語は、一般に理解される意味を有する。開業医には、定義および用語について参照により本明細書に組み込まれる、Green&Sambrook(eds.)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)、およびAusubel,F.M.,et al.,Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 99),John Wiley & Sons,New York(2012)、ならびにPlotkin,S.A.,Orenstein,W.A.,& Offit,P.A.,Vaccines,6 ed,Elsevier,London(2013)が特に案内される。標準的な方法はまた、RNA操作および分析について詳細な方法を記載し、参照により本明細書に組み込まれる、Bindereif,Schon,&Westhof(2005)Handbook of RNA Biochemistry,Wiley-VCH,Weinheim,Germanyにも記載されている。組み換え核酸を発生させるための適切な分子技術、および多くのクローニング運動の指示の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Green&Sambrook(Id.)、Ausubel,F.M.,et al.(Id.)、Berger&Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology(Volume 152 Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.1987)、およびPCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,San Diego,Calif.1990)に見出される。化学ハンドルにより生体分子を活性化および誘導体化するための適切な生物有機技術、およびそのような剛性を設計するための指示の例は、Hermanson,G.T,Bioconjugate Techniques,2nd ed.,Elsevier,London(2008)に見出される。本明細書に記載される生体分子の非経口投与に必要な技術および成分の例について、開業医には、Remington,Essentials of Pharmaceutics,Pharmaceutical Press,London(2012)が案内される。タンパク質精製、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化のための方法は、Coligan et al.(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New Yorkに記載されている。無細胞合成のための方法は、Spirin&Swartz(2008)Cell-free Protein Synthesis,Wiley-VCH,Weinheim,Germanyに記載されている。無細胞合成を使用した非天然アミノ酸のタンパク質への組み込みのための方法は、Shimizu et al.(2006)FEBS Journal,273,4133-4140、およびChong(2014)Curr Protoc Mol Biol.108:16.30.1-11にも記載されている。
少なくとも1つのnnAA残基を含むポリペプチドを本明細書に開示する。好適なポリペプチドは、任意の生物学的活性ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、免疫原性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、nnAA残基は、特異的ポリペプチドの天然残基と置換される。他の実施形態では、nnAA残基は、特異的ポリペプチドの配列前に添加され、その後に添加されるか、またはその内部に挿入される。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つのnnAA残基を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、または9つのnnAA残基を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、2~9つのnnAA残基を含み、および好ましくは4~6つのnnAA残基を含む。またさらなる実施形態では、ポリペプチドは、化学的に異なる2つ以上のnnAA残基を含む。
nnAA残基は、任意選択的に、この出願、または細胞ベースの、または無細胞タンパク質合成と互換性があるものとして同定されている他の出願に記載されている非天然アミノ酸のうちのいずれかを含む(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Schultz et al.Annu Rev Biochem.2010;79:413-44 particularly pp.418-420、およびChin et al.Annu Rev Biochem.2014;83:5.1-5.30を参照されたい)。
Arは、任意選択的に、少なくとも1つのヘテロ原子を含有する5員または6員芳香族環を含み、
W5は、C1~C10アルキレン、-NH-、-O-、および-S-から選択され、
Q1は、ゼロまたは1であり、
W6は、アジド、任意選択的に低級アルキル基とC置換される1,2,4,5-テトラジニル、およびエチニルから選択され、
その結果、ポリペプチド中のnnAA残基は、式XIIIの構造を有し、
Arは、任意選択的に、少なくとも1つのヘテロ原子を含有する5員または6員芳香族環を含み、
W5は、C1~C10アルキレン、-NH-、-O-、および-S-から選択され、
Q1は、ゼロまたは1であり、
W6は、アジド、任意選択的に低級アルキル基とC置換される1,2,4,5-テトラジニル、およびエチニルから選択される。
いくつかの実施形態では、nnAA残基は、アジド含有nnAAを含む。特定の実施形態では、nnAA残基は、式Iのアジド含有nnAAを含み、
Dは、-Ar-W3-または-W1-Y1-C(O)-Y2-W2-であり、
Arは、
W1、W2、およびW3の各々は、独立して、単一の結合または低級アルキレンであり、
各X1は、独立して、-NH-、-O-、または-S-であり、
各Y1は、独立して、単一の結合、-NH-、または-O-であり、
各Y2は、独立して、単一の結合、-NH-、-O-、またはN連結もしくはC連結ピロリジンイレンであり、
Z1、Z2、およびZ3のうちの1つは、-N-であり、Z1、Z2、およびZ3のうちの他のものは、独立して、-CH-である。
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸残基は、nnAAを含有する1,2,4,5-テトラジンを含む。特定の実施形態では、非天然アミノ酸は、式IIIのnnAAを含有する1,2,4,5-テトラジンを含み、
Arは、
Vは、単一の結合、低級アルキレン、または-W1-W2-であり、
W1およびW2の一方は、不存在であるか、または低級アルキレンであり、他方は、-NH-、-O-、または-S-であり、
Z1、Z2、およびZ3のうちの各1つは、-CH-または-N-であり、Z1、Z2、およびZ3のうちの他のものは、各々独立して、-CH-であり、X1は、独立して、-NH-、-O-、または-S-であり、
Rは低級アルキルであり、
任意選択的に、Arが
いくつかの実施形態では、nnAA残基は、アルキン含有nnAAを含む。一実施形態では、これは、プロパルギル基である。様々なプロパルギル含有アミノ酸であって、その合成を含む、プロパルギル含有アミノ酸は、Beatty et al.Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,7364-7;Beatty et al.J.Am.Chem.Soc.2005(127):14150-1;Nguyen et al.J Am Chem Soc.2009(131):8720-1に見出される。そのようなプロパルギル含有アミノ酸は、細胞ベースのシステムを使用した、nnAAとしてのタンパク質への組み込みに好適である。いくつかの実施形態では、nnAA残基は、ホモプロパルギルグリシン、エチニルフェニルアラニン、およびN6-[(2-プロピニルオキシ)カルボニル]-L-リジンからなる群から選択されるプロパルギル含有nnAAを含む。
一態様では、少なくとも1つのnnAA残基を含むポリペプチドは、天然担体タンパク質(例えば、eCRM)、または天然担体タンパク質の1つもしくは複数のT細胞活性化エピトープを含むポリペプチドの改変型である。そのような改変に好適な担体タンパク質は、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D(PD、HiD)、血清群B髄膜炎菌(OMPC)の外膜タンパク質複合体、またはCRM197などの接合体ワクチンにおいて使用されるタンパク質を含むがこれらに限定されない。
前述のように、表1は、CRM197のアミノ酸配列(配列番号1)を示す。CRM197(「交差反応物質197」、CRM197としても知られている)は、多くの承認された複合糖質ワクチンにおいて使用されるジフテリア毒素の非毒性変異体である(例えば、Broker et al.(2011)Biologicals 39:195-204を参照されたい)。本明細書で使用するのに好ましい担体タンパク質は、配列番号1と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、担体タンパク質は、1つ以上のnnAA(配列番号1内に挿入され得るか、または配列番号1内の1つ以上のアミノ酸残基と置換され得る、例えば、Lysおよび/もしくはPheと置換され得る)の存在を除いて、配列番号1のアミノ酸配列を含み得る。
ポリペプチド生成のための一般的な方法
増強された担体タンパク質は、ポリペプチドの生成について記載される任意の方法によって生成される。ポリペプチドの生成に好適な方法は、固相化学ペプチド合成、細胞ベースの組み換えタンパク質発現(大腸菌または天然宿主中の)、および無細胞タンパク質発現、ならびにそれらの任意の組み合わせ(例えば、合成成分と組み換えペプチド成分との組み合わせを使用した発現タンパク質結紮)を含むがこれらに限定されない。
nnAA含有担体タンパク質を生成するのに特に有用な技術は、無細胞タンパク質合成を使用する。いくつかの無細胞タンパク質発現技術は、当該技術分野で知られており、様々なnnAAを、nnAAの潜在的な細胞傷害効果を回避しながら、この方法で組み込むことができる(例えば、Quast et al.(2015)FEBS Letters 589:1703-12の表1を参照されたい)。いくつかの実施形態では、増強された担体タンパク質は、無細胞抽出物ベースのタンパク質合成によって生成される。いくつかの実施形態では、無細胞抽出物は、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽、または大腸菌の抽出物を含む。さらなる実施形態では、無細胞抽出物に、アミノ酸、エネルギー源、エネルギー再発生システム、または陽イオン補助因子、およびそれらの任意の組み合わせを補足する。いくつかの実施形態では、抽出物は、外因的に補足された変異体tRNAまたは変異体aaRS(アミノアシルtRNA合成酵素)、およびそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、抽出物は、変異体tRNAまたは変異体aaRSを遺伝子的にコードする大腸菌株由来の溶解物、およびそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、溶解物のために使用される大腸菌株は、RF-1弱毒化株である。互換性がある無細胞タンパク質合成システムは、式I、II、およびIIIの組み換えポリペプチドへの挿入について記載されている(例えば、US8715958B2、US2016/0257946A1、およびUS2016/0257945A1)。
本開示の改善された担体タンパク質は、ポリペプチドの1つ以上のT細胞エピトープの免疫原性機構が保存される限り、ポリペプチド内の任意の位置で置換される1つ以上のnnAAを含む。改善された担体タンパク質を既知の担体に基づかせる場合、通常、担体の特性に悪影響を与える機会を最小限に抑えるために、nnAAのうちのいくつかまたはすべてを既知の担体における既存の天然に生じるアミノ酸と置換することが好ましい。しかしながら、nnAAは、開始担体配列への追加として内部に、または終端に挿入され得ることが理解される。いくつかの実施形態では、改善された担体タンパク質(例えば、eCRM)中の少なくとも1つのnnAAは、T細胞エピトープを含むタンパク質の1つ以上の領域内に存在しない。別の実施形態では、増強された免疫原性ポリペプチド中のnnAAは、T細胞エピトープを含むタンパク質の1つ以上の領域内に存在しない。
担体タンパク質のT細胞エピトープは、任意選択的に、既知の方法のうちのいずれかによって判定される。本開示の改善された担体タンパク質の設計における支援として、タンパク質中のT細胞結合エピトープは、タンパク質の両親媒性プロファイル、配列モチーフ、定量化マトリクス(QM)、人工神経ネットワーク(ANN)、サポートベクターマシン(SVM)、定量化構造活性関係(QSAR)、および分子ドッキングシミュレーションなどの様々な要因を考慮するアルゴリズムを使用して予測される(Desai et al.Methods Mol Biol.2014;1184:333-64を参照されたい)。例えば、ジフテリア毒素/CRMにおけるT細胞結合エピトープは、DeLisi&Berzofskyアルゴリズムを使用して予測されている(Bixler et al.WO89/06974 and PNAS 82:7848,1985を参照されたい)。予測されたT細胞エピトープを、実験的に確認することができる。例えば、対象となる免疫原性ポリペプチドのT細胞エピトープは、免疫原性ポリペプチド(または予測された領域)の完全な配列に対応する部分的に重複するペプチド断片を合成し、かつ各断片の存在下でのCD4+細胞株(例えば、末梢血単核細胞(PBMC))の増殖アッセイを実行することによって、実験的に判定され得る。この一般的なアプローチは、ジフテリア毒素(Raju et al.,Eur J Immunol.1995 Dec;25(12):3207-14)、破傷風毒素(Diethelm-Okita et al.,J Infect Dis.1997 Feb;175(2):382-91)、髄膜炎菌の外膜タンパク質(OMP)(J Exp Med.1992 Jul 1;176(1):79-88)、および連鎖球菌株G148のGタンパク質由来の担体タンパク質であるBB(Goetsch et al.,Clin Diagn Lab Immunol.2003 Jan;10(1):125-32)におけるT細胞エピトープをマップ化するために用いられている。1つ以上のnnAAの存在によって不活性化されていないT細胞エピトープの存在を構築するために、CD4+細胞増殖および/またはサイトカイン応答に対して本開示の改善された担体タンパク質を直接スクリーニングすることができる。
一実施形態では、本開示は、セ氏約10度~セ氏約30度の温度で維持された無細胞発現混合物中にnnAAを含むポリペプチドの合成のための方法を提供する。別の実施形態では、温度は、セ氏約20度を上回る。別の実施形態では、温度は、セ氏約20度を下回る。別の実施形態では、温度は、セ氏約14度~セ氏約18度である。別の実施形態では、ポリペプチドは、抑制コドンを含む核酸によってコードされる。別の実施形態では、無細胞発現混合物は、nnAAに対して特異的な直交性tRNA/アミノアシル-tRNA合成酵素対を含む。別の実施形態では、tRNAの濃度は、少なくとも20μMである。別の実施形態では、nnAAの濃度は、約2mM未満であり、アミノアシル-tRNA合成酵素の濃度は、約5μM未満である。別の実施形態では、本方法は、ポリペプチドを活性部分に接合させることを含む。別の実施形態では、活性部分は、ハプテン、細菌抗原、ウィルス抗原、腫瘍由来のグリカン、ペプチド毒素、マクロライド、ポリエーテル、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、ポリペプチドは、成長ホルモン、凝固因子、プラズマタンパク質、インターロイキン、T細胞受容体の細胞外ドメイン、成長因子の細胞外ドメイン、細菌抗原、ウィルス抗原、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、発現混合物は、大腸菌、小麦胚芽、またはウサギの網状赤血球の細胞抽出物を含む。別の実施形態では、発現混合物は、少なくとも30%細胞抽出物を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つのnnAAを含む。別の実施形態では、nnAAは、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、生成されたポリペプチドは、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、可溶性画分と不溶性画分との比率は、少なくとも40%(w/w)である。別の実施形態では、生成されたポリペプチドは、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、可溶性画分と不溶性画分との比率は、少なくとも60%(w/w)である。一実施形態では、無細胞発現によって生成されたポリペプチドは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つのnnAAを含み、可溶性画分と不溶性画分との比率は、少なくとも少なくとも20%(w/w)、少なくとも30%(w/w)、少なくとも40%(w/w)、少なくとも50%(w/w)、60%(w/w)、少なくとも70%(w/w)、少なくとも80%(w/w)、少なくとも90%(w/w)である。
任意選択的に、増強された担体タンパク質への付着を促進するために、化学ハンドルでさらに誘導体化された免疫原性抗原を本明細書に記載する。一実施形態では、抗原は、任意の精製された天然、合成、もしくは組み換え生成された高分子またはその断片である。例としては、脂質、多糖類、核酸、またはポリペプチド、およびそれらの任意の組み合わせ(例えば、糖タンパク質、グライコリポタンパク質、糖脂質)を含むがこれらに限定されない。例えば、糖脂質は、任意選択的に、グリコシルホスファチジルイノシトールである。別の実施形態では、抗原は、細菌多糖類、細菌リポ多糖類、腫瘍由来のグリカン、もしくはハプテンからなる群から選択されるT非依存性もしくはT活性化抗原(通常、弱いT活性化抗原)である。
1型
[→3)-D-AAT-α-Galp-(1→4)-α-D-GalpA(2/3OAc)-(1→3)-α-D-GalpA-(1→]
2型
[→4)-β-D-Glcp-(1→3)-[α-D-GlcpA-(1→6)-α-D-Glcp-(1→2)]-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)β-L-Rhap-(1→]
3型
[→3)-β-D-GlcA-(1→4)-β-D-Glcp-(1→]
4型
[→3)-β-D-ManpNAc-(1→3)-α-L-FucpNAc-(1→3)-α-D-GalpNAc-(1→4)-α-D-Galp2,3(S)Py-(1→]
5型
[→4)-β-D-Glcp-(1→4)-[α-L-PnepNAc-(1→2)-β-D-GlcpA-(1→3)]-α-L-FucpNAc-(1→3)-β-D-Sugp-(1→]
6B型
[→2)-α-D-Galp-(1→3)-α-D-Glcp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→4)-D-Rib-ol-(5→P→]
9N型
[→4)-α-D-GlcpA-(1→3)-α-D-Glcp-(1→3)-β-D-ManpNAc-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-α-D-GlcpNAc-(1→]
9V型
[→4)-α-D-GlcpA(2/3OAc)-(1→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-ManpNAc(4/6OAc)-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→]
12F型
[→4)-[α-D-Galp-(1→3)]α-L-FucpNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→4)-[α-D-Glc-(1→2)-α-D-Glc-(1→3)]-β-D-ManNAcA-(→]
14型
[→4)-β-D-Glcp-(1→6)-[β-D-Galp-(1→4)]-β-D-GlcpNAc-(1→3)-β-D-Galp-(1→]
18C型
[→4)-β-D-Glcp-(1→4)-[α-D-Glcp(6OAc)(1→2)][Gro-(1→P→3)]-β-D-Galp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→3)-β-L-Rhap-(1→]
19F型
[→4)-β-D-ManpNAc-(1→4)-α-D-Glcp-(1→2)-α-L-Rhap-(1→P→]
23F型
[→4)-β-D-Glcp-(1→4)-[α-L-Rhap-(1→2)]-[Gro-(2→P→3)]-β-D-Galp-(1→4)-β-L-Rhap-(1→]
[→4)-β-D-GlcUAp-(143)-β-D-GlcpNAc-(→]
これは、化膿連鎖球菌の血清型間で不変であるように思われる。
Ia型
[→3)-β-D-Ribf-(1→1)-D-Ribitol-(5→OPO3 -→]
A型
[→6)-α-D-ManpNAc(3/4OAc)-(1→OPO3→]
C型
[→9)-α-D-Neup5Ac(7/8OAc)-(2→]
W-135型
[→6)-α-D-Galp-(1→4)-α-D-Neup5Ac(9OAc)-α-(2→]
X型
[→4)-α-D-GlcpNAc-(1→OPO3→]
Y型
[→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Neup5Ac(9OAc)-α-(2→]
本明細書の先に記載されるようなポリペプチドの非天然アミノ酸に導入された対応する基と反応することができる化学ハンドルを含有する抗原を本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、ポリペプチドへの対応する基との「クリック」化学反応に好適な基を含む。「クリック」化学に好適な化学基は、アジド(-N3)基、アルキン(C≡C)基、ホスフィン(例えば、-P(Ph)2)基、アルケン(C=C)基、および1,2,4,5-テトラジン(
抗原は、任意選択的に、生体接合体の生成について記載される任意の化学方法を使用して活性化される。そのような方法は、過ヨウ素酸塩酸化、固有のアルデヒド(例えば、多糖類の還元末端)の脱マスキング、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸(CDAP)の活性化、または1,1’-カルボニルジイミダゾール(CDI)とのヒドロキシルの活性化、その後の求核付加を含むがこれらに限定されない。単糖類誘導体化のさらなる化学方策は、Hermanson(Hermanson,Greg.Bioconjugate Techniques(2008))に記載されている。活性化には、シアン化試薬(p-ニトロフェニルシアネート、CDAP、またはN-シアノトリエチルアンモニウムテトラフルオロホウ酸など)、活性エステル、カルボジイミド、ヒドラジド、ノルボルネン、p-ニトロ安息香酸、N-ヒドロキシスクシンイミド、S-NHS、EDC、TSTUなどを使用することができる。
いくつかの実施形態では、抗原は、過ヨウ素酸塩酸化により活性化される。いくつかの実施形態では、過ヨウ素酸塩酸化は、アルデヒド基を抗原に導入するために使用され、かつ1)多糖類、および2)活性化抗原を生成するためのポリペプチドのN末端残基へのアルデヒドの付加に有用である。過ヨウ素酸塩は、第1級もしくは第2級ヒドロキシルまたはアミンをいずれかの末端に保持する炭素-炭素結合を開裂し、そのため、隣接するヒドロキシルを持つ炭水化物糖残基、または2-アミノアルコール部分を含有するアミノ酸(N-末端トレオニンまたはセリン残基)を活性化する。アルデヒド部分は長半減期を有するため、この方法によって活性化された抗原は、任意選択的に、活性化後にクロマトグラフィーにより精製および/または凍結乾燥される。
いくつかの実施形態では、抗原は、シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸(CDAP)による一時的な付加物を形成することによって活性化される(例えば、WO2011/110531およびUS2012/0321658を参照されたい)。いくつかの実施形態では、タンパク質もしくは多糖類抗原の水酸基が、CDAPとの反応によって活性化され、一時的なシアナト(-OCN)付加物を形成し、次に、化学ハンドルもしくはリンカーの好適な求核試薬と反応されて、カルバミミデート連結を形成する。この実施形態では、抗原のC-C結合は、開裂されない(過ヨウ素酸塩の活性化とは対照的に)。いくつかの実施形態では、特定の莢膜多糖が、CDAPを使用して優先的に活性化される。特定の実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型3、7F、または10Aの莢膜多糖が、CDAPを使用して活性化される。
いくつかの実施形態では、抗原は、カルボニルジイミダゾール(CDI)またはカルボニルジトリアゾール(CDT)により活性化される。CDAPのようなCDIおよびCDTは、抗原の水酸基を活性化して、一時的な反応性部分を形成することができ、この場合、それは、不安定なカルバメート(CDIについて
いくつかの実施形態では、天然に存在するか、もしくは脱保護工程の結果であるかのいずれかの(例えば上記に考察されるように)内在性アミンもしくは他の求核性部分(例えば、第1級アミン)を使用して、化学ハンドルもしくは担体タンパク質に所与の多糖類を接合させる。そのような求核性部分は、好都合なことに、コハク酸誘導体のような様々な一般的な求電子接合試薬(例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)またはスルホ-NHSエステル)と反応され得る。そのような実施形態では、肺炎連鎖球菌のC-多糖類のような抗原汚染部室の分解を促進するための(i)におけるような過ヨウ素酸塩プロトコルにより処理することが有益な場合がある。この実施形態では、過ヨウ素酸塩の処理に続いて、任意の化学的に導入されたアルデヒド基をクエンチするために、膨大に過剰な水素化ホウ素ナトリウムにより処理される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型1の多糖類は、室温で約12~約14時間、約0.05~約0.25当量の過ヨウ素酸ナトリウムで処理され、続いて約5当量~約15当量の水素化ホウ素ナトリウムで処理される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型1の多糖類は、室温で18時間、0.15当量の過ヨウ素酸ナトリウムで処理され、続いて10当量の水素化ホウ素ナトリウムで処理される。
いくつかの実施形態では、抗原は、上記に記載される活性化方法(「抗原の活性化」)と互換性がある任意の化学方法を使用して化学ハンドルに接合される。そのような方法は、合成抗原アルデヒドによるシッフ塩基形成、続いて還元的アミノ化、ヒドラゾン形成、オキシム形成、直接求核付加、および天然抗原アルデヒドによるシッフ塩基形成、続いて還元的アミノ化を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、化学ハンドルとの接合反応における絶対多糖類濃度は、多糖類の凝集または交差反応性を最小限に抑えるために重要である。いくつかの実施形態では、DBCO(ジベンゾシクロ-オクチン)もしくはDBCO誘導体との接合反応における絶対多糖類/抗原濃度は、過ヨウ素酸塩もしくはCDAPによる多糖類の活性化にとって重要である。いくつかの実施形態では、DBCO/DBCO-誘導体の接合反応における多糖類濃度は、2未満、5未満、7未満、10未満、15未満、17.5未満、または20μモル/mL未満である。いくつかの実施形態では、DBCO/DBCO-誘導体の接合反応における多糖類濃度は、約1.5~約17.5μモル/mLである。
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、上記のように過ヨウ素酸塩により活性化された(「抗原の活性化」)ポリペプチドまたは多糖類の抗原に接合される。これらの実施形態では、アルデヒドとの安定的または準安定的付加物を形成する官能基を含む化学ハンドルが、過ヨウ素酸塩活性化抗原と組み合わされ、続いて任意選択的な還元と組み合わされて、準安定的付加物を安定的付加物に変換する(例えば、WO2014/111344;Wu et al.Vaccine 31(2013):5623-2626;Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Second Edition,2008を参照されたい)。これらの実施形態のいくつかの変形例では、化学ハンドルは、活性化抗原のアルデヒド基に関する大きいモル過剰で加えられ、その結果、すべてのアルデヒドが、化学ハンドル/抗原接合反応において消費される。これらの実施形態の他の変形例では、化学ハンドルは、活性化抗原のアルデヒド基に関してより低いモル比率で加えられ、活性化抗原の過度の未反応アルデヒドは、過度の安価なアルデヒド-反応性求核試薬(例えば、エタノールアミン)によるさらなる反応によって、またはアルデヒドを水酸基に還元するのに十分強い還元剤(例えば、NaBH4)による処理によって消費される。
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、上記に記載されるようにCDAPにより活性化された(「CDAP活性化」)ポリペプチドまたは多糖類の抗原に接合される。これらの実施形態では、CDAP活性化を介して生成された一時的なシアナト(-OCN)基が、アミン含有化学ハンドルとさらに反応されて、化学ハンドルと抗原炭素との間にカルバミミデート連結(-NH-C(=NH)-O-)を生成する。
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、上記に記載されるようにCDI/CDTにより活性化された(「カルボニルジイミダゾール(CDI)/カルボニルジトリアゾール(CDT)活性化」)ポリペプチドまたは多糖類の抗原に接合される。これらの実施形態では、抗原水酸基のCDI/CDT活性化(CDIについて
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、上記に記載されるようなポリペプチドもしくは多糖類の抗原由来の、天然に存在するか、もしくは脱保護工程の結果であるかのいずれかの、内在性アミンもしくは他の求核性部分(例えば、第1級アミン)に接合される。この一実施形態では、化学ハンドルの求電子基(例えば、NHSまたはスルホ-NHSエステル)は、抗原の第1級アミン基と反応されて、化学ハンドルと抗原アミンとの間にアミド連結(-C(=O)-NH-)を生成する。別の実施形態では、化学ハンドルのカルボン酸基は、標準的なペプチドカップリング試薬および条件の存在下で、第1級アミン基と反応されて、化学ハンドルと抗原アミンとの間にアミドを生成する。
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、ポリペプチドのnnAA残基の対応する基との「クリック」化学反応を可能にする部分を含む。1つのそのような部分は、アジド基を含むnnAA基と反応することができるアルキン基である。最も単純な実施形態では、これはプロパルギル基であり、そのため、抗原のアルキン基は、式IVの構造を含み、
L22は、C1~C10アルキルであり、
U1は、抗原の少なくとも1つの部分である。
L1は、独立して、結合、-NH-、-O-、-S-、-NH(L12)-、-O(L12)-、または-S(L12)-であり、
L2は、独立して、結合、-C(=O)-、-S(=O)2-、-C(=O)L12-、-S(=O)2L12であり、
L12は、独立して、L22またはL22NH-であり、
L22は、独立して、C1-10アルキルまたは-(CH2CH2O)1-10-であり、
U1は、独立して、抗原の少なくとも1つの部分である。
Aは、
Xは、独立して、少なくとも1つのポリオールであり、
Yは、独立して、多糖類の少なくとも1つのポリオールであり、
nは、少なくとも1であり、
zは、1を上回る。
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、ポリペプチドのnnAA残基の対応する基との「クリック」化学反応を可能にする部分を含む。1つのそのような部分は、ポリペプチドのアルキン基またはホスフィンを含むnnAA残基と反応することができるアジド基である。いくつかの実施形態では、抗原のアジド基は、式VIIIの構造を含み、
U1は、独立して、抗原の少なくとも1つの部分である。
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、ポリペプチドのnnAA残基の対応する基との「クリック」化学反応を可能にする部分を含む。1つのそのような部分は、1,2,4,5-テトラジン基を含むnnAA残基と反応することができるアルケン基である。最も単純な実施形態では、これはビニル基である。1つのそのような実施形態では、抗原のアルケン基は、式IXの構造を含み、
U1は、独立して、抗原の少なくとも1つの部分である。
上記に記載されるような免疫原性ポリペプチドと上記に記載されるような抗原との間に形成され得るポリペプチド抗原接合体を本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド抗原接合体は、増強された担体タンパク質および抗原を含み、ここで抗原は、増強された担体タンパク質中のnnAAに連結される。一実施形態では、抗原は、免疫原性ポリペプチドの天然アミノ酸に連結されない。別の実施形態では、抗原は、免疫原性ポリペプチド内のリジンに連結されない。例えば、抗原は、配列番号1のリジンに連結されない。別の実施形態では、抗原は、免疫原性ポリペプチドの1つ以上のnnAAにのみ連結される。1つ以上のnnAAは、任意選択的に、N末端、C末端、または免疫原性ポリペプチドのN末端とC末端との間のどこかに位置する。いくつかの場合では、抗原は、免疫原性ポリペプチド中の1つ以上のpAMFにのみ連結される。例えば、抗原は、配列番号1の1つ以上のpAMFにのみ連結される。
いくつかの実施形態では、抗原は、本明細書に記載される非天然アミノ酸および化学ハンドルを接合するのに好適な任意の化学方法を使用して増強された担体タンパク質に接合される。そのような方法は、銅(I)触媒アルキン-アジド負荷環化(CuAAC)、歪み促進アジド-アルキン負荷環化(SPAAC)、およびテトラジン-アルケン結紮を含むがこれらに限定されない。「クリック」反応として、これらの反応のうちのすべてを、水溶液中で行うことができる。ホスフィンとアジドとの間のシュタウディンガー結紮も使用することができる。
R1は、独立して、H、ホルミル、または増強された担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
R2は、独立して、OHまたは増強された担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
Dは、-Ar-W3-または-W1-Y1-C(O)-Y2-W2-であり、
Arは、
W1、W2、およびW3の各々は、独立して、単一の結合または低級アルキレンであり、
各X1は、独立して、-NH-、-O-、または-S-であり、
各Y1は、独立して、単一の結合、-NH-、または-O-であり、
各Y2は、独立して、単一の結合、-NH-、-O-、またはN連結もしくはC連結ピロリジンイレンであり、
Z1、Z2、およびZ3のうちの1つは-N-であり、Z1、Z2、およびZ3のうちの他のものは、独立して-CH-であり、
L22は、独立して、結合、アルキル、またはポリ(アルキルオキシ)であり、
Xは、多糖類の少なくとも1つのポリオールである。
R1は、独立して、H、ホルミル、または増強された担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
R2は、独立して、OHまたは増強された担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
Wは、CまたはNであり、
yは、少なくとも1であり、
nは、少なくとも1であり、
Xは、独立して、莢膜多糖の少なくとも1つのポリオールである。
いくつかの実施形態では、抗原は、テトラジン-アルキン結紮によって増強された担体タンパク質に接合される。これらの実施形態の1つの変形例では、増強された担体タンパク質は、1,2,4,5-テトラジン含有nnAAを含み、抗原はアルケン基を含む。SPAAC反応と同様に、テトラジン-アルキン結紮は、補助因子の付加なしで進み、これおよびこの反応は、蒸留水、0.9%生理食塩水、PBS、または生理的緩衝液中で行うことができる。
方法(サイズ排除、透析濾過、透析)接合反応に続いて、対象となる抗原が増強された担体タンパク質接合体は、任意選択的に、略純粋な接合体を得るための、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、疎水性相互作用、およびサイズ排除)、分子サイズ排除(透析、透析濾過、接線流濾過、深層濾過)電気泳動手順(例えば、分取等電点電気泳動)、示差的溶解度(例えば、硫酸アンモニウム沈殿)、またはSDS-PAGE(例えば、Protein Purification,J.C.Janson&Lars Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989を参照されたい)を含むがこれらに限定されない方法によって精製される。
抗原が増強された担体タンパク質接合体についての1つの重要なパラメータは、接合体の分子量である。接合体は、任意選択的に、各タンパク質分子に接合された可変数の抗原分子、ならびに可変のより高次の架橋(例えば、タンパク質-抗原-タンパク質連結)を含むため、接合体の出力分子量は、増強された担体タンパク質および抗原の投入分子量から必ずしも予測可能ではない膨大な文献(例えば、Howard et al.Immunology.1971(21):535-545およびKabat&Bezer.Arch Biochem Biophys.1958(78)306-18)は、抗原粒子径が免疫原性に対する重要な効果を有することを示唆している。Wessels et al.(1998)Infect Immun 66:2186-92は、接合体のサイズおよび架橋が、GBSのIII型接合体の免疫原性および防御的有効性に影響を与え得ることを報告している。
R1は、独立して、H、ホルミル、または担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
R2は、独立して、OH、または担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
Wは、CまたはNであり、
yは、少なくとも1であり、
nは、少なくとも1であり、
Xは、独立して、莢膜多糖の少なくとも1つのポリオールである。
R1は、独立して、H、ホルミル、または担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
R2は、独立して、OH、または担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
Xは、独立して、莢膜多糖の少なくとも1つのポリオールである。
一実施形態では、本開示は、式XIまたはXIaを含む、少なくとも1つの化合物、またはその塩を含む、改変ポリペプチドであって、
R1は、独立して、H、ホルミル、または担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
R2は、独立して、OH、または担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
Xは、独立して、多糖類の少なくとも1つのポリオールである、改変ポリペプチドを提供する。
Xは、独立して、莢膜多糖の少なくとも1つのポリオールであり、
nは、少なくとも1である、改変多糖類を提供する。
式中、
Aは、
Xは、独立して、少なくとも1つのポリオールであり、
Yは、独立して、多糖類の少なくとも1つのポリオールであり、
nは、少なくとも1であり、
zは、1を上回る。
少なくとも1つの賦形剤と一緒に少なくとも1つの増強された担体タンパク質-抗原接合体を含む免疫原性組成物であって、抗原が増強された担体タンパク質中のnnAA残基を介してポリペプチドに接合される、免疫原性組成物を本明細書に記載する。一実施形態では、本開示は、本明細書に記載される複合糖質を含むワクチン組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような少なくとも1つの増強された担体タンパク質-抗原接合体を含む接合体ワクチン組成物は、天然担体タンパク質を含む接合体ワクチン組成物と比較して、対象中の担体抑制の低減を誘発する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような少なくとも1つの増強された担体タンパク質-抗原接合体を含む接合体ワクチン組成物は、全体的な免疫反応を改善し、かつ/または天然担体タンパク質を含む接合体ワクチン組成物と比較して、対象中のT細胞依存性応答を増加させる。
R1は、独立して、H、ホルミル、または担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
R2は、独立して、OH、または担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
Xは、独立して、莢膜多糖の少なくとも1つのポリオールである。
本明細書に記載されるような接合体または組成物を対象に投与することによって、対象における抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発する方法を本明細書に提供する。接合体または組成物は、典型的には、非経口投与に好適な賦形剤と組み合わされるであろう。
eCRMは、Sutro Biopharma,Inc.(米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ)によって提供される無細胞タンパク質合成(CFPS)抽出物中に発現された。そのような抽出物の特徴および調製は、他の公報に記載されており、この場合、抽出物は、一般に、US2016/0257946からの以下の改変を有する、Zawada et al.,2011,Biotechnol.Bioeng.,108(7),1570-1578に記載されるように調製された。(1)大腸菌DsbCを過剰発現させるように操作されたOmpT感受性RF-1弱毒化株から、無細胞抽出物を調製し、(2)アンバー終止コドンで非天然アミノ酸を挿入するための直交性CUAコード化tRNAを生成するように操作された同様のRF-1弱毒化大腸菌株から、無細胞抽出物を調製し、(3)(1)および(2)由来の無細胞抽出物を、混成し(85:15の比率で)、室温(20℃)で30分間50μMのヨードアセトアミドで処理し、(4)混成された抽出物を、eCRMをコードするDNAを除く、無細胞タンパク質合成システムのすべての他の成分を含有する予混合物に加えた。無細胞タンパク質合成反応の最終濃度は、30%(容量当たり)の細胞抽出物、2mMのパラ-メチルアジド-L-フェニルアラニン(pAMF)(マサチューセッツ州シャーリーRSP Amino Acids)、5μMのpAMF特異的tRNA合成酵素(「RS」)、2mMのGSSG(酸化型グルタチオン)、8mMのグルタミン酸マグネシウム、10mMのグルタミン酸アンモニウム、130mMのグルタミン酸カリウム、35mMのピルビン酸ナトリウム、1.2mMのAMP、GMP、UMP、およびCMPの各々0.86mM、2mMのアミノ酸(チロシンおよびフェニルアラニンについての0.5mMを除く)、4mMのシュウ酸ナトリウム、1mMのプトレシン、1.5mMのスペルミジン、15mMのリン酸カリウム、100nMのT7 RNAP、およびnnAA変異形をコードする2.5μMのeCRMプラズミドであった。無細胞合成反応は、eCRMをコードするプラズミドDNAの付加によって開始された。
マラリアオーキネート特異的表面タンパク質Pfs25のT細胞活性化エピトープは、例えば、Diethelm-Okita et al.,J Infect Dis.1997 Feb;175(2):382-91に記載された方法に沿って実験的に判定される。簡潔に言うと、20個のアミノ酸のペプチド断片および5個のアミノ酸による重複は、Pfs25の完全に発現された配列に対応する合成である。CD8+が減損され、かつCD4+が豊富なヒト末梢血リンパ球(PBL)は、複数の対象から得られる。PBLは、3重にめっきされ、実験的刺激として機能するPfs25配列にわたる個々の合成ペプチドで培養される。各ペプチド断片に応答するPBLの増殖が、培養物を[3H]-チミジンで脈動させることによって測定され、これが異なる個体から発生する培養物にわたって比較される。増殖を刺激するPfs25断片は、T細胞エピトープを含むように同定される。複数またはすべての対象からのPBLの増殖を刺激する断片は、Pfs25中に汎用または免疫優性T細胞エピトープを含むものとして分類される。
血清型多糖類(約30μモル)を、水溶液(10mMのHCl)中に溶解した。次に、溶液を45℃で30分間加熱し、次に冷却し、そのときpHを6.70に調節するために、NaOH溶液を加えた。HPLC等級水に対してAMICON超遠心分離機(30kDa MWCO)を使用して、反応混合物を透析した。上清を50mLのファルコンチューブに移し、酢酸緩衝液(pH5.35)を25mMまで加え、かつ0.5当量のNaIO4を加えた。混合物を、25℃で17時間攪拌し、その後、酸化試料を、任意選択的に、過度の水素化ホウ素ナトリウム(10当量)で処理し、HPLC等級水のいくつかの変化に対してAMICON超遠心分離機(30kDa MWCO)を使用して精製して、酸化多糖類溶液を得た。
酸化多糖類(約30μモル)を、16%DMSOを含有する、pH6.79の72mMリン酸ナトリウム中のDBCO-PEG4-NH2(約30μモル)またはDBCO-NH2(約30μモル)と25℃で合わせた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(水中に16mg/mlの溶液、59.54μモル、20当量)を加え、25℃で2晩の間攪拌し続けた。次に、反応混合物を、エチル酢酸で3x洗浄し、AMICON超遠心分離機(30kDa MWCO)に移し、次に、水中での20%エタノールの6回の交換、続いて水との3回の交換を使用して透析し、多糖類-DBCO誘導体型の溶液を得た。次に、多糖類-DBCO誘導体を、10:1(w/w)のショ糖で調合し、凍結乾燥して、次の接合反応で使用するための白色粉末を得た。
莢膜多糖(30mg)(PS 3)を、水溶液(1.5mLの2Mの酢酸を含む13.5mLのH2O)中に溶解した。混合物を、85℃で1時間加熱し、周囲温度まで冷却した後、過度のマグネシウム塩化物を、1Mの溶液から加えた。結果として得られた多糖類を、水の6回の交換を使用したAmicon遠心30kDa MWCOの透析を使用して精製した。
凍結乾燥され、10:1w/wのショ糖で調合された(実施例4または5の手順によって調製された)多糖類-DBCO試料を、0.9%NaCl中に溶解し、溶液中でeCRMと混合して、1:1(w/w)のPS:eCRM投入質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、過度のアジ化ナトリウム溶液の付加によりクエンチした。接合されたPS-eCRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移し、次に、24時間にわたる0.9%塩化ナトリウム溶液の5回の交換に対して透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、PS-eCRM接合体溶液を得た。
1.酸化
1型PSの純度:80%(ウロン)
分子量:625gモル-1(繰り返し単位当たり)
反応手順
天然多糖類(19.7mg、80%に修正、15.8mg、25.2μモル)を、9.85mLの水溶液(7.0mLの水および2.85mLの酢酸緩衝液、200mM、pH5.5)中に溶解した。この溶液に、300μLの過ヨウ素酸ナトリウム溶液(104μg、3.78μモル、0.15当量)を加えた。混合物を、25℃で18時間攪拌し、その後、大きくモル過剰の水素化ホウ素ナトリウム(10モル当量)を加えた。酸化PSを、水による少なくとも6回の交換を使用したAmicon遠心30kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS-1溶液を得た。
反応手順
PS1-OX(15.8mg、25.2μモル)を、リン酸緩衝液(3.6mL、50mM、pH7.0)中に溶解し、これに、DBCO-PEG4-NHSエステル(1.0当量、DMSO中に649.1gモル-1、0.35mL)を加えた。反応混合物を、37℃で2日間サーモスタット浴槽中で攪拌し、続いて、エチル酢酸(3×20mL)で抽出した。DBCO誘導体を、水中での20%エタノールとの6回の交換、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して遠心透析ユニット(Amicon 30kDa MWCO)によって精製し、1-DBCO誘導体型を得た。この溶液(2.20mL、9.59mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に96mg)を加えた。合わされた溶液を、3つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するために、3.18mgの1 DBCOおよび32mgのショ糖を含有した。
PS 1-DBCO3.18mg(32mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO(%):1.67%
CRM濃度:6.5mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1:1
反応手順
1-DBCOを、アジド官能化eCRM溶液(0.51mL)中に溶解して、1:1(w/w)のPS1:CRM投入質量比率を得た。ゲル形成を軽減するために、1.0mg mL-1への0.9%塩化ナトリウム溶液によるさらなる希釈(0.22μmに濾過)が必要であった。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間、環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、50μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、2つの予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間透析した(3回の交換、各々800ml)。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、1-CRM接合体溶液を得た。
*CJD=透析された接合体
1.酸化
2型PSの純度:80%
分子量:960.84gモル-1
反応手順
天然多糖類(25.5mg、26.5μモル)を、12.75mLの水溶液(9.24mLの水および3.51mLの酢酸緩衝液、200mM、pH5.5)中に溶解した。この溶液に、216μLの過ヨウ素酸ナトリウム溶液(5.26mg/ml、0.20当量)を加えた。混合物を、NaIO4に対して222nmでのUV吸収によって監視しながら、25℃で18時間攪拌した。酸化PSを、水との少なくとも6回の交換を使用したAmicon遠心100kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS-2溶液を得た。
反応手順
2.14mLの水中のPS2-OX(18.1mg、18.8μモル)を、リン酸緩衝液(1.95mL、200mM、pH6.0)で希釈し、これに、DBCO-PEG4-NH2(9.85mg、1当量、DMSO中、0.197mL)を加えた。25分後、NaCNBH3(2.36mg、2当量H2O中の溶液から59μL)を加えた。反応混合物を、サーモスタット浴槽中に25℃で2日間攪拌し、続いて、リン酸緩衝液(0.5mLの200mM、pH=6)を加えた。これに、NaBH4(60μLの10mg/mL水溶液、1当量)を加えた。30分間の攪拌後、混合物を、エチル酢酸(4×5mL)で抽出した。残留エチル酢酸を、窒素ガスでバブリングすることによって除去し、混合物を、100kDa MWCO Amicon遠心分離機フィルタに移した。DBCO誘導体を、水の1回の交換、続いて水中の20%エタノールとの6回の交換、続いて水との3回の交換(各々12mL)を使用して、遠心透析によって精製し、2-DBCO誘導体型を得た。この溶液(2.14mL、14.3mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に100mg)を加えた。合わされた溶液を、3つの略等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料(4.96mg、4.96mg、および4.4mg)を得た。
PS 2-DBCO:4.4mg(32mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
%DBCO:4.03%
CRM濃度:3.18mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
PS2-DBCOを、0.9%NaCl(3.01mL)中に溶解し、DMSO(0.44mL)を加えた。次に、アジド官能化eCRM溶液(0.95mL)を加えて、1.5:1(w/w)のPS2:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間、環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、100μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、2つの予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、0.9%の塩化ナトリウム溶液で24時間(5回の交換、各々1000ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、2-CRM接合体溶液を得た。
1.加水分解
3型PSの純度:86%(アントロン)
分子量:360.3gモル-1
反応手順
天然多糖類3(30.0mg)を、15.0mLの水溶液(13.5mLの水および1.5mLの酢酸、2M)中に溶解した。混合物を、85℃で1時間加熱し、その後、周囲温度に対して冷却した後、塩化マグネシウム溶液(1.5mL、1M)を加えた。加水分解されたPSを、水との少なくとも6回の交換を使用したAmicon遠心30kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS-3溶液を得、次にこれを、2つの等しい分割量で凍結乾燥した。
反応手順
加水分解されたPS3(12.75mg、35.4μモル)を、水(6.4mL)中に溶解し、水酸化ナトリウム溶液(0.2M、100μL)でpH7.0に調節した。次に、シアン化試薬CDAPを、滴下(アセトニトリル中に0.426M、0.2当量、16.7μL)で加えた。90秒後、溶液を、水酸化ナトリウム溶液(0.2M、300μL)でpH9.5に迅速に調節した。DBCO-PEG4-NH2(DMSO中に0.032M、0.1当量、523gモル-1、0.110mL)を、すぐに滴下で加えた。追加のDMSOを加えて、5%(v/v)のDMSO(0.320mL)を得た。反応混合物を、サーモスタット浴槽中に25℃で一晩攪拌し、続いて、0.22μmのPES注射器フィルタを通して濾過した。濾液をエチル酢酸(3×20mL)で抽出した。DBCO誘導体を、3%DMSO、水中の20%エタノール、0.9%塩化ナトリウムとの合計7回の交換、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用した遠心透析ユニット(Amicon 30kDa MWCO)によって精製し、3-DBCO誘導体型を得た。次に、水溶液を、0.45μmのPVDF注射器フィルタを通して濾過した。この溶液(3.84mL、8.52mg)に、10倍の質量の過度のショ糖(0.85mLの水中に85mg)を加えた。合わされた溶液を、凍結乾燥された3つの部分に分解して、白色粉末の3つの試料を得た。2つの試料は、合計3つについて残りの試料中に8.5mgを有する、次の接合反応で使用するための5.0mgの3-DBCOおよび50mgのショ糖を含有した。
PS 3-DBCO:5.0mg(50mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):5.0%
CRM濃度:4.0mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1:1
反応手順
3-DBCOを、0.9%塩化ナトリウム溶液(6.39mL、0.22μmに濾過)、リン酸緩衝液(pH7.0、0.5M、0.333mL)、およびDMSO(0.833mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.770mL)を、滴下で加えて、1:1(w/w)のPS3:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間、環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、50μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(4回の交換、各々1L)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、3-CRM接合体溶液を得た。
*CJF=透析および濾過された接合体
1.酸化
3型PSの純度:86%(アントロン)
分子量:360.3gモル-1
反応手順
天然多糖類3(14.4mg、86%に修正、12.4mg、34.4μモル)を、7.2mLの水溶液(5.9mLの水および1.3mLの酢酸緩衝液、200mM、pH5.5)中に溶解した。この溶液に、300μLの過ヨウ素酸ナトリウム溶液(1.10mg、5.16μモル、0.15当量)を加えた。混合物を、25℃で18時間攪拌した。酸化PSを、水との少なくとも6回の交換を使用したAmicon遠心30kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS3-OX溶液を得た。
反応手順
PS3-OX(9.05mg、25.1μモル)を、リン酸緩衝液(2.11mL、50mM、pH6.7)中に溶解し、これに、DBCO-PEG4-NH2(1.0当量、DMSO中に523gモル-1、0.40mL)を加えた。反応混合物を、25℃で25分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウムの溶液(2当量、44.5mg/mL、35μL)を加えて、2日間攪拌した。この時点で、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mL)で抽出した。DBCO誘導体を、水中の20%エタノールとの6回の交換、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用した遠心透析ユニット(Amicon 30kDa MWCO)によって精製し、3-DBCO誘導体型を得た。この溶液(3.20mL、8.60mg)に、10倍の質量の過度のショ糖(0.86mLの水中に86mg)を加えた。合わされた溶液を、4つの部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。3つの試料は、合計4つについて、残りの試料中に2.6mgを有する、次の接合反応で使用するための2.0mgの3-DBCOおよび20mgのショ糖を含有した。
PS 3-DBCO:2.0mg(20mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):2.3%
CRM濃度:4.0mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1:1
反応手順
3-DBCOを、0.9%塩化ナトリウム溶液(0.400mL、0.22μmに濾過)およびDMSO(0.100mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.330mL)を、滴下で加えて、1:1(w/w)のPS3:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で48時間環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、50μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、2つの予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(4回の交換、各々1L)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、3-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
4型PSの純度:80%(アントロン)
分子量:825.78
反応手順
4型PS(27.5mg、33.30μモル)粉末を、13.75mLの水溶液(12.38mLの水および1.37mLの0.1MのHCl)中に溶解した。次に、溶液を、45℃で30分間加熱し、次に、冷却し、そのとき、NaOH溶液(0.1M、1.37mL)を加えて、pHを6.70に調節した。反応混合物を、HPLC等級水との3回の交換(各々12mL)によってAMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)を使用して透析した。上清を、9.84mLの水を含む50mLのファルコンチューブに移した。この溶液に、3.43mLの200mMの酢酸緩衝液(pH5.35)および632μLのNaIO4溶液(3.56mg、16.65μモル、0.5当量)を加えた。混合物を、25℃で17時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-4溶液を得た。
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)4型PS溶液(24.58mg、29.77μモル、2.4mLの水)に、緩衝溶液(1.8mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.79)、DMSO(0.6mL)、およびDBCO-PEG-4-NH2の溶液(200μLのDMSO中に15mg、28.65μモル、9.6当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、224μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(300μLの水中に5.0mg、59.54μモル、20当量)を加え、2日間25℃で攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、225μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.01mg/μL、10当量)を水中に加えた。30分間の攪拌後、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mLのエチル酢酸)で抽出し、次に、AMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの6回の交換、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、4 DBCO誘導体型の溶液を得た。この溶液(4.75mL、15.25mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に153mg)を加えた。合わされた溶液を、3つの部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。2つの試料は、5.35mgの4DBCOおよび54mgのショ糖を含有し、1つの試料は、次の接合反応で使用するための4.55mgの4DBCOおよび45mgのショ糖を含有した。
PS 4-DBCO:5.35mg(54mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):3.52%
CRM濃度:4mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.20:1
反応手順
4型DBCO試料(54mgのショ糖を含む5.35mgの白色粉末)を、0.67mLの0.9%のNaCl溶液中に溶解し、次に、アジド官能化eCRM溶液(0.74mL)を加えた。10分後、アジド官能化eCRMの別の部分(0.37mL)を加えて、1.20:1(w/w)のPS4:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で2日間環状撹拌器で緩やかに混合した。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移し、その後、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(5回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、4型PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
5型PSの純度:89%(ウロン酸)
分子量:919.32
反応手順
5型PS(22.8mg、24.36μモル)粉末を、8.26mLの水および3.14mLの200mM酢酸緩衝液(pH5.26)および163μLのNaIO4溶液(1.3mg、6.1μモル、0.25当量)中に溶解した。混合物を、25℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機(100kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-5溶液を得た。
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)5型PS溶液(6.25mg、6.68μモル、0.992mLの水)に、緩衝溶液(0.063mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.74)、DMSO(25μL)、およびDBCO-PEG-4-NH2の溶液(100μLのDMSO中に3.5mg、6.68μモル、10当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、37℃で30分間攪拌し、その後、84μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(84μLの水中に0.84mg、13.36μモル、20当量)を加え、37℃で24時間攪拌し続けた。反応混合物を、エチル酢酸(6×10mL)で抽出した。抽出物を、AMICON超遠心分離機フィルタ(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの8回の交換(各々12mL)、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、5 DBCO誘導体型を得た。この溶液(5.35mL、6.0mg)に、ショ糖溶液(0.6mLの水中に60mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の2つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための3.0mgの5DBCOおよび30mgのショ糖を含有した。
PS 5-DBCO:3.0mg(30mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):5.17%
CRM濃度:3.25mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1:1
反応手順
5-DBCO誘導体(30mgのショ糖を含む3.0mgの白色粉末)を、0.9%塩化ナトリウム溶液(4.48mL)およびDMSO(0.6mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.92mL)を加えて、1:1(w/w)のPS5:CRM質量比率を得た。反応混合物を、緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で5時間環状撹拌器で緩やかに混合した。アジ化ナトリウム溶液(20μL、水中で10mg/mL)を加えた。30分後、接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移し、その後、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(5回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、5PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
6A型PSの分子量:706
水中のNaIO4溶液(10mg/mL)
PS-6A(15mg、21.2μモル)粉末を、7.5mLの水溶液(10mMの酢酸ナトリウム溶液、PH4.5)中に溶解した。この溶液に、36.3μLのNaIO4溶液(0.363mg、1.69μモル、0.08当量)を加えた。混合物を、4℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235057、20K MWCO)に移し、次に、PH6.8の50mmのPB緩衝液で24時間(4回の交換、各々600ml)透析し、酸化PS-6A溶液を得た。透析後、DMSOを加えて、PH6.8の50mmのPB緩衝液で10%DMSOにPS-6Aを作製する。
PSの最終濃度:3.37mg/ml
緩衝液の最終濃度:50mMのPB(pH6.8)中に10%DMSO
反応手順
酸化6A型PS溶液(13.5mg、19.1μモル、10%DMSO中に4mL、50MmのPB、PH6.8)に、DBCO-PEG4-NH2の溶液(100.1μLのDMSO中に10.01mg、19.1μモル、10当量)を25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で60分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(120μLの水中に1.2mg、19.1μモル、10当量)を加え、25℃で24時間攪拌し続けた。次に、反応混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235057、20K MWCO)に移し、次に、50mMのPB緩衝液中の20%エタノールとの4回の交換、続いて、50mMのPB緩衝液との3回の交換を使用して透析し、6A DBCO誘導体型を得た。
PS 6A-DBCO:7.1mg(71mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO:9%
CRM濃度:2.617mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):2:1
PSの最終濃度:5.2mg/ml
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(1.4mL)を、6A DBCO誘導体(71mgのショ糖を含む7.1mgの白色粉末)を加えて、2:1(w/w)のPS 6A:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(23℃)で17時間環状撹拌器で緩やかに混合した。次に、混合物を、培養器(37℃)中に3時間置いた。反応後、混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液によって2倍に希釈し、水素化ホウ素ナトリウム(191μLの水中に1.9mg、50.2μモル、50当量)によって3時間還元した。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235072,300K MWCO)に移し、次に、PH7のPBSで24時間(3回の交換、各々1000ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、6A PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
6B型PSの純度:80%(アントロン)
分子量:706.18
水中のNaIO4溶液(5.45mg/mL)
反応手順
PS-6B(27.28mg、80%に修正、21.82mg、30.9μモル)粉末を、14mLの水溶液(9.5mLの水および4.5mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH=5.5)中に溶解した。この溶液に、145μLのNaIO4溶液(0.79mg、3.71μモル、0.12当量)を加えた。混合物を、25℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心デバイス(30kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-6B溶液を得た。
PSの最終濃度:3.5mg/ml
緩衝液の最終濃度:53μM(pH6.0)
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)6B型PS溶液(18.4mg、27.6μモル、3.35mLの水)に、緩衝溶液(1.4mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.01)、DMSO(700μL)、およびDBCO-PEG-4-NH2の溶液(295μLのDMSO中に14.43mg、27.6μモル、10当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、75μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(200μLの水中に9.39mg、55.6μモル、20当量)を加え、2日間25℃で攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、104μLの水素化ホウ素ナトリウムの溶液(0.01mg/μL、10当量)を水中に加えた。30分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mLのエチル酢酸)で抽出し、その後、AMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの6回の交換、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、6B DBCO誘導体型の溶液を得た。この溶液(2.96mL、20.1mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に200mg)を加えた。合わされた溶液を、3つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための6.7mgの6B DBCOおよび67mgのショ糖を含有した。
PS 6B-DBCO:6.7mg(67mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):3.2%
CRM濃度:2.617mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):2:1
PSの最終濃度:5.23mg/ml
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(1.28mL)を、6B-DBCO誘導体(67mgのショ糖を含む6.70mgの白色粉末)に加えて、2:1(w/w)のPS6B:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で17時間環状撹拌器で緩やかに混合した。次に、混合物を、オーブン(37℃)中に2時間置いた。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235071、100K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(3回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、6B PS-CRM接合体溶液を得た。
1.CDAP活性化およびDBCO架橋
PS 7Fを精製:n.d.%(アントロン)-100%を想定
PS7F(6.2mg、5.1μモル)を、水(3.1mL)中に溶解し、これに、CDAP(2.0当量、アセトニトリル中に100mg/mL、24μL)を加えた。反応混合物を、室温(室温)で30秒間攪拌した。この時点で、トリエチルアミン(TEA、2.5当量、0.2M、63μL)を加え、反応混合物を120秒間攪拌した。DBCO-PEG4-NH2(1.0当量、DMSO中に28.7μモル/mL、180μL)を、ホウ酸緩衝液(0.1M、pH8.5、1.0mL)と共に加え、室温で一晩攪拌した。DBCO-誘導体化PS7Fを、エタノール沈殿によって、かつ水との3回の交換を使用した遠心透析(Amicon 100kDa MWCO)によって精製した。UV吸収分光法、アントロンアッセイ、およびSECによる分析後、この溶液(3.61mL、3.05mg)を、ショ糖溶液(10倍の質量含有量、100mg/mL)で希釈し、白色粉末に凍結乾燥した。
PS 7F-DBCO:2.62mg(26.2mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
凍結乾燥された7F-DBCOを、塩水(0.9%(w/v)、0.938mL)、リン酸緩衝液(0.5M、pH7.0、58μL)、およびDMSO(144μL)中に溶解し、これに、eCRM溶液(0.300mL)を加えて、1.73:1.00(w/w)のPS7F:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で17時間環状撹拌器で緩やかに混合した。CRM接合体を、2つの予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、その後、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(3回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して滅菌濾過し、7F-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
8型PSの純度 84%
分子量:684.54gモル-1
反応手順
天然多糖類(42mg、61.3μモル)を、21mLの水溶液(14.7mLの水および6.3mLの酢酸緩衝液、200mM、pH5.5)中に溶解した。この溶液に、過ヨウ素酸ナトリウム溶液(2.63mgに対して計算される、0.20当量)に加えた。混合物を、NaIO4に対して222nmでのUV吸収によって監視しながら、25℃で18時間攪拌した。酸化PSを、水との少なくとも6回の交換を使用したAmicon遠心30kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS-8溶液を得た。
反応手順
3.14mLの水中のPS8-OX(33.8mg、49.4μモル)を、リン酸緩衝液(789μL、0.5M、pH6.0)、1mLのH2O、およびDMSO(313μL)で希釈し、これに、DBCO-PEG4-NH2(25mg、1当量、DMSO中、250μL)を加えた。10分後、NaCNBH3(6.2mg、2当量(200μLのH2O中の9.43mgから132μLを添加することによる))を加えた。反応混合物を、サーモスタット浴槽中に25℃で2日間攪拌し、続いて、リン酸緩衝液(0.5mLの200mM、pH=6)を加えた。これに、NaBH4(1当量)を加えた。30分間の攪拌後、混合物を、エチル酢酸(3×5mL)で抽出した。残留エチル酢酸を、窒素ガスでバブリングすることによって除去し、混合物を、100kDa MWCO Amicon遠心分離機フィルタに移した。DBCO誘導体を、20%EtOHとの6回の交換、および水との3回の交換(各々12mL)を使用した遠心透析によって精製し、8-DBCO誘導体型を得た。この溶液(5.63mL、25mg)にショ糖溶液を加え、凍結乾燥した。
PS 8-DBCO:3.77mg(38mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):3.57%
CRM濃度:5.966mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
PS8-DBCOを、0.9%NaCl(2.28mL)、リン酸緩衝液(0.126mL、0.5M、pH7.0)、およびDMSO(0.314mL)中に溶解した。次に、アジド官能化eCRM溶液(0.42mL)を加えて、1.5:1(w/w)のPS8:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で1時間環状撹拌器で緩やかに混合し、次に、37℃で一晩オーブン中に置いた。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、100μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(8回の交換、各々1000ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、8-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
9N型PSの純度:75%
分子量:928.29gモル-1
反応手順
天然多糖類(19.0mg、20.4μモル)を、9.49mLの水溶液(7.12mLの水および2.37mLの酢酸緩衝液、200mM、pH5.5)中に溶解した。この溶液に、過ヨウ素酸ナトリウム溶液(1.31mg、0.30当量、1.0mLの水溶液中に23.65mgからの56μL)を加えた。混合物を、NaIO4に対して222nmでのUV吸収によって監視しながら、25℃で18時間攪拌した。酸化PSを、水との4回の交換を使用したAmicon遠心30kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS-9溶液を得た。
反応手順
1.643mLの水中のPS9N-OX(12.6mg、13.6μモル)を、リン酸緩衝液(0.945mL、94.5mgのショ糖を含有するpH6.0の200mM)およびDMSO(0.33mL)で希釈し、これに、DBCO-PEG4-NH2(7.2mg、1当量、DMSO中、0.142mL)を加えた。10分後、NaCNBH3(1.71mg、2当量(200μLのH2O中の7.36mgから47μLを添加することによる))を加えた。反応混合物を、25℃で2日間サーモスタット浴槽中で攪拌し、続いて、リン酸緩衝液(0.4mLの200mM、pH=6)を加えた。これに、NaBH4(0.51mg、1当量)を加えた。30分間の攪拌後、混合物を、エチル酢酸(5×5mL)で抽出した。残留エチル酢酸を、窒素ガスでバブリングすることによって除去し、混合物を、30kDa MWCO Amicon遠心分離機フィルタに移した。DBCO誘導体を、水との3回の交換(各々12mL)、続いて、20%の水性エタノールとの6回の交換(各々12mL)、最後に、水との3回の交換(各々12mL)を使用した遠心分析によって精製し、9N-DBCO誘導体型を得た。この溶液(2.388mL、9.05mg)にショ糖溶液を加え、凍結乾燥した。
PS 9N-DBCO:4.5mg(45mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):4.9%
CRM濃度:3.0mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
PS9N-DBCOを、pH=7のリン酸緩衝液(96μLの0.5M)と共に0.9%NaCl(1.30mL)中に溶解し、DMSO(0.24mL)を加えた。次に、アジド官能化eCRM溶液(0.60mL)を加えて、1.5:1(w/w)のPS:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間、環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、100μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、2つの予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、これに加えられた3mLのpH=7の緩衝液を含む0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(7回の交換、各々1000ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、9N-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
9V型PSの純度:85%(アントロン)
分子量:704kDa(繰り返し単位=971.8g/モル)
反応手順
9V型PS(35.90mg、37.80μモル)粉末を、攪拌子により50mLのポリスチレン試料チューブ中の17.95mLの水溶液(12.565mLの水および5.385mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH5.5)中に溶解した。いったんPSが可溶化されると、852μLのNaIO4溶液(2.83mg、13.23μモル、0.35モル当量)を加えた。反応チューブをホイルで包み、24℃の水槽中に置いた。混合物を24℃で攪拌した。18時間後、反応混合物を、HPLC-等級水との4回の交換(各々15mL)による3つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)を使用して透析し、酸化PS-9V溶液を得た。
反応手順
酸化9V型PS溶液(21.64mg、22.78μモル、4.27mL)に、緩衝溶液(0.541mLの0.5Mのリン酸緩衝液、pH6.0)、DMSO(66μL)、およびDBCO-PEG4-NH2溶液(475μLのDMSO中に11.9mg、22.78μモル、1モル当量)を加えた。反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、140μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(140μLの水中に2.86mg、45.56μモル、2モル当量)を加えた。反応混合物を、アルミニウムホイルで包み、25℃に設定された水槽中で2日間攪拌し続けた。2日目に、163μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(163μLの水中に1.72mg、45.56μモル、2モル当量)を加えることよって、反応を中断させた。30分間攪拌した後(観察可能なバブリングが停止したとき)、反応混合物を、エチル酢酸(2×10mL)、続いてジクロロメタン(2×10mL)で抽出した。抽出物を、20分間N2でバブリングして、残留ジクロロメタンを除去し、次に、2 AMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(50kDa MWCO、15mL)に移した。透析を、3%DMSO溶液との3回の交換(各々15mL)、20%エタノール溶液との3回の交換(各々15mL)、およびHPLC-等級水との2回の交換(各々15mL)を行うことによって実行し、9V DBCO誘導体を得た。この溶液(4.40mL、12.144mg)に、ショ糖溶液(121.44mg、1.214mLの水)に加えた。この合わされた溶液を、3つの画分(2×5mgおよび1×2.14mg)に分割し、各々凍結乾燥して、微細な白色粉末を得た。すべての画分を、接合反応のために必要とされるまで、4℃で保存した。
PS 9V-DBCO:5mg(50mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):3.0%
CRM濃度:6.009mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
9V DBCO誘導体(50mgのショ糖を含む5.0mgの白色粉末)を、0.9%塩化ナトリウム溶液(0.881mL)、pH7のリン酸緩衝液(0.067mL、0.5M)、およびDMSO(0.167mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.555mLの溶液)を加えて、1.5:1(w/w)のPS9V:CRM質量比率を得た。反応混合物を、室温(20℃)で18時間環状撹拌器で、次にさらに2時間37℃で緩やかに混合した。総反応時間後、ある容量のアジ化ナトリウムを、接合混合物(0.33mg、5.15μモル)に加えた。次に、反応混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液(2.83mL)で希釈し、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移した。試料は、0.9%塩化ナトリウム溶液中で48時間透析を受けた(8回の交換、各々800ml)。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、9V PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
9V型PSの純度:81%(アントロン)
分子量:949.83
水中のNaIO4溶液(5.41mg/mL)
反応手順
PS-9V(21.15mg、81%に修正、17.13mg、18.04μモル)粉末を、10.57mLの水溶液(7.4mLの水および3.17mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH=5.5)中に溶解した。この溶液に、214μLのNaIO4溶液(1.16mg、5.41μモル、0.3当量)を加えた。混合物を、25℃で20時間攪拌した。酸化試料を、HPLC等級水の6回の交換(12mL)を使用したAMICON超遠心分離機フィルタ(30kDa MWCOが6~12mL)を介して精製し、酸化PS-9V溶液を得た。
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)9V型PS(15.36mg、16.17μモル、2.20mLの水)の溶液に、緩衝溶液(1.4mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.01)、DMSO(500μL)およびDBCO-PEG-4-NH2(131μLのDMSO中に8.46mg、16.17μモル、10当量)の溶液をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、41μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(200μLの水中に15.5mg、32.34μモル、20当量)を加え、25℃で2日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、62μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.01mg/μL、10当量)を水中に加えた。30分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mL)で抽出した。抽出物を、AMICON超遠心分離機フィルタ(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの6回の交換(各々12mL)、続いて水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、9V DBCO誘導体型を得た。この溶液(4.0mL、10.08mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に100mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための5.04mgの9V DBCOおよび50mgのショ糖を含有した。
PS 9V-DBCO:5.04mg(50mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):3.42%
CRM濃度:3.923mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.11:1
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(0.1.156mLの溶液中のCRM)を、9V DBCO誘導体(50mgのショ糖を含む5.04mgの白色粉末)に加えて、1.11:1(w/w)のPS9V:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間環状撹拌器で緩やかに混合した。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移し、その後、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(5回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、9V PS-CRM接合体溶液を得た。
1.CDAP活性化およびDBCO架橋
PS 10Aの純度:77%(アントロン)
分子量:1227gモル-1(繰り返し単位)
反応手順
PS10A(18.7mg、15.2μモル)を、水(7.9mL)中に溶解し、これに、CDAP(0.8当量、アセトニトリル中に100mg/mL、30μL)を加えた。反応混合物を、室温(室温)で30秒間攪拌した。この時点で、水酸化ナトリウム溶液(0.2M、200μL)を加えて、pH9.5を達成し、反応混合物を150秒間攪拌した。次に、DMSO(1.2mL)、続いてDBCO-PEG4-NH2(0.5当量、DMSO中に32.0μモル/mL、238μL)を加え、室温で一晩攪拌した。DBCO-誘導体化PS10Aを、溶媒抽出によって、かつ3%(v/v)DMSOの3回の交換、0.9%(v/v)塩水との2回の交換、および水との3回の交換を使用した遠心透析(Amicon 30kDa MWCO)によって精製した。UV吸収分光法、アントロンアッセイ、およびSECによる分析後、この溶液(3.18mL、13.5mg)を、ショ糖溶液(10倍の質量含有量、100mg/mL)で希釈し、白色粉末に凍結乾燥した。
PS 10A-DBCO:5.00mg(50.0mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):8.8%
CRM:PBS緩衝液中に5.0mg/mL
PS:CRM(投入質量比率):1.75:1
反応手順
凍結乾燥された10A-DBCOを、塩水(0.9%(w/v)、3.759ml)、リン酸緩衝液(0.5M、pH7.0、200μL)、およびDMSO(500μL)中に溶解し、これに、eCRM溶液(0.541mL)を加えて、1.75:1.00(w/w)のPS10A:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で17時間環状撹拌器で緩やかに混合した。CRM接合体を、2つの予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、その後、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(3回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して滅菌濾過して、10A-CRM接合体溶液を得た。
1.加水分解
11A型PSの純度:69%(アントロン)
分子量:908.7gモル-1
反応手順
天然多糖類11A(35.0mg)を、17.5mLの水溶液(15.75mLの水および1.75mLの酢酸、2M)中に溶解した。混合物を、80℃で1時間加熱し、その後、周囲温度まで冷却した後、水酸化ナトリウム溶液を、pH5.5(3.2mL、1M)まで加えた。加水分解されたPSを、水との少なくとも6回の交換を使用したAmicon遠心30kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS-3溶液を得、次に、これを1つの分割量として凍結乾燥した。
反応手順
加水分解された多糖類溶液(5.027mL、28.75mg、31.6μモル)に、水(5.75mL)および酢酸緩衝液(0.2M、pH5.5、3.6mL)をさらに加えた。この溶液に、135μLの過ヨウ素酸ナトリウム溶液(1.35mg、6.32μモル、0.20当量)を滴下で加えた。混合物を、25℃で8時間攪拌した。酸化PSを、水との少なくとも6回の交換を使用したAmicon遠心100kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS-11A-OX溶液を得た。
反応手順
PS11A-OX(22.0mg、24.2μモル、2.235mL)を、リン酸緩衝液(1.37mL、200mM、pH6.0)に加え、これに、DBCO-PEG4-NH2(1.0当量、DMSO中に523gモル-1、100mg/mL、127μL)および追加量のDMSO(560μL)を加えた。反応混合物を、25℃で25分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(2当量、44.5mg/mL、68μL)を加えて、2日間攪拌した。反応混合物を、エチル酢酸(3×20mL)で抽出し、0.45μmの注射器フィルタを通して濾過した。DBCO誘導体を、水中の20%エタノールとの7回の交換、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用した遠心透析ユニット(Amicon 100kDa MWCO)によって精製し、11A-DBCO誘導体型を得た。この溶液(2.535mL、15.00mg)に、ショ糖溶液(1.5mLの水中に150mg)を加えた。合わされた溶液を、3つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための5.00mgの11A-DBCOおよび50mgのショ糖を含有した。
PS 11A-DBCO:5.0mg(50mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):5.77%
CRM濃度:5.42mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
11A-DBCOを、0.9%塩化ナトリウム溶液(7.656mL、0.22μmに濾過)、リン酸緩衝液(pH7.0、0.5M、0.385mL)、およびDMSO(0.962mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(5.42mg/mL、0.617mL)を滴下で加えて、1.5:1(w/w)のPS11A:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で17時間環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、50μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(4回の交換、各々1L)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、11A-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
12F型PSの純度:82%(アントロン)
分子量:1094gモル-1
反応手順
12F型PS(21.8mg、20μモル)粉末を、攪拌子により50mLのポリスチレン試料チューブ中の10.9mLの水溶液(8.175mLの水および2.725mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH5.5)中に溶解した。いったんPSが可溶化されると、160μLのNaIO4溶液(0.64mg、3μモル、0.15モル当量)を加えた。反応チューブをホイルで包み、25℃の水槽中に置いた。混合物を25℃で攪拌した。18時間後、反応混合物を、HPLC-等級水との6回の交換(各々15mL)による2つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)を使用して透析し、酸化PS-12F溶液を得た。
反応手順
PS12F-OX(13.1mg、12μモル、2.68mL)を、リン酸緩衝液(1.00mL、200mM、pH6.0)に加え、これに、DBCO-PEG4-NH2(1.0当量、DMSO中に523gモル-1、33mg/mL、199μL)および追加量のDMSO(500μL)を加えた。反応混合物を、25℃で25分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(2当量、52.5mg/mL、29μL)を加えて、2日間攪拌した。反応混合物を、エチル酢酸(3×20mL)で抽出し、溶媒なしでバブリングした。DBCO誘導体を、水中の20%エタノールとの6回の交換、続いて、毎回の水との3回の交換(各々12mL)を使用した2回の遠心透析ユニット(Amicon 30kDa MWCO)によって精製し、12F-DBCO誘導体を得た。この溶液(2.2mL、10.45mg)に、ショ糖溶液(1.05mLの水中に104.5mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、接合反応で使用するための5.0mgの12F-DBCOおよび50mgのショ糖を含有した。
PS 12F-DBCO:5.0mg(50mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):2.0%
CRM濃度:5.29mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
12F-DBCOを、0.9%塩化ナトリウム溶液(6.542mL、0.22μmに濾過)、リン酸緩衝液(pH7.0、0.5M、0.334mL)、およびDMSO(0.834mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(5.29mg/mL、0.630mL)を、滴下で加えて、1.5:1(w/w)のPS12F:CRM投入比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で17時間環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、50μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(4回の交換、各々1L)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、無菌の12F-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
14型PSの純度:91%(アントロン)
分子量:689.25
水中のNaIO4溶液(7.8mg/mL)
反応手順
PS-14(28.3mg、80%に修正、25.75mg、37.36μモル)粉末を、14mLの水溶液(10mLの水および4mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH=5.5)中に溶解した。この溶液に、110μLのNaIO4溶液(0.86mg、4.05μモル、0.13当量)を加えた。混合物を、25℃で3時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-14溶液を得た。
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)14型PS(20.5mg、29.74μモル、2.92mLの水)の溶液に、緩衝溶液(1.3mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.8)、DMSO(550μL)、およびDBCO-PEG-4-NH2の溶液(150μLのDMSO中に11.68mg、22.3μモル、0.75当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、70μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(120μLの水中に6.39mg、59.48μモル、20当量)を加え、25℃で2日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、100μL溶液の水素化ホウ素ナトリウム(1.13mg、10当量)を水中に加えた。30分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mLのエチル酢酸)で抽出し、次に、AMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの7回の交換(各々12mL)、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、14DBCO誘導体型を得た。この溶液(3.78mL、17.7mg)に、ショ糖溶液(1.17mLの水中に177mg)を加えた。合わされた溶液を、3つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための5.9mgの14DBCOおよび59mgのショ糖を含有した。
PS 6B-DBCO:5.9mg(59mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):3.5%
CRM濃度:5.06mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(0.779mL)を、14DBCO誘導体(59mgのショ糖を含む5.9mgの白色粉末)に加えて、1.5:1(w/w)のPS14:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間環状撹拌器で緩やかに混合した。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235071、100K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(8回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、14 PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
14型PSの純度:91%(アントロン)
分子量:689.25
水中のNaIO4溶液(10.19mg/mL)
反応手順
PS-14(23.5mg、80%に修正、21.38mg、31.02μモル)粉末を、11.75mLの水溶液(8.2mLの水および3.55mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH=5.5)中に溶解した。この溶液に、97μLのNaIO4溶液(0.95mg、4.03μモル、0.13当量)を加えた。混合物を、25℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-14溶液を得た。
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)14型PS(14.3mg、20.75μモル、3.46mLの水)の溶液に、緩衝溶液(1.3mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.8)、DMSO(637μL)、およびDBCO-PEG-4-NH2の溶液(263μLのDMSO中に10.86mg、20.75μモル、10当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、51μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(200μLの水中に10.2mg、41.50μモル、20当量)を加え、25℃で2日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、78μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.01mg/μL、10当量)を水中に加えた。30分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mLのエチル酢酸)で抽出し、次に、AMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの6回の交換(各々12mL)、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、14DBCO誘導体型を得た。この溶液(4.12mL、12.24mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に12mg)を加えた。合わされた溶液を、3つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための6.12mgの14DBCOおよび6mgのショ糖を含有した。
PS 6B-DBCO:6.12mg(62mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):4.42%
CRM濃度:2.617mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.8:1
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(1.3mL)を、14DBCO誘導体(62mgのショ糖を含む6.12mgの白色粉末)を加え、1.8:1(w/w)のPS14:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で17時間環状撹拌器で緩やかに混合した。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235071、100K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(3回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液(1.5mL)を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、14 PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
15B型PSの純度:71%(アントロン)
分子量:1185kDa(繰り返し単位=1069.80g/モル)
反応手順
15B型PS(14.6mg、13.65μモル)粉末を、攪拌子により50mLのポリスチレン試料チューブ中の7.30mLの水溶液(5.1mLの水および2.2mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH5.5)中に溶解した。いったんPSが可溶化されると、160μLのNaIO4溶液(0.59mg、2.75μモル、0.20モル当量)を加えた。反応チューブをホイルで包み、水槽中に置いて、24℃で攪拌する。3.5時間後、反応混合物を、HPLC-等級水との6回の交換(各々15mL)による1つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)を使用して透析し、酸化PS-15B溶液を得た。
反応手順
酸化15B型PS溶液(7.56mg、7.07μモル、1.271mL)に、緩衝溶液(0.640mLの0.5Mのリン酸緩衝液、pH6.0)、DMSO(0.063mL)、およびDBCO-PEG4-NH2溶液(221μLのDMSO中に17mg、7.07μモル、1モル当量)を加えた。反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、350μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(350μLの水中に0.90mg、2モル当量)を加えた。反応混合物を、アルミニウムホイルで包み、25℃に設定された水槽中で2日間攪拌し続けた。2日目に、163μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.27mg、7.07μモル、2モル当量)を加えることによって、反応を中断させた。30分間攪拌した後、反応混合物を、ジクロロメタン(3×15mL)で抽出した。抽出物を、N2で20分間バブリングして、残留ジクロロメタンを除去し、次に、1つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)に移した。3%DMSO溶液との3回の交換(各々15mL)、20%エタノール溶液との3回の交換(15mL)、およびHPLC-等級水との3回の交換(各々15mL)を行うことによって、透析を実行し、15B DBCO誘導体を得た。この溶液(1.982mL、6.86mg)に、ショ糖溶液(0.686mLの水中に68.6mg)を加えた。この合わされた溶液を、2つの画分に分割し、各々凍結乾燥して、微細な白色粉末を得た。すべての画分を、接合反応のために必要とされるまで、乾燥するまで凍結乾燥した後、4℃で保存した。
PS 15B-DBCO:3.85mg(38.5mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):5.9%
CRM濃度:6.009mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
15B DBCO誘導体(38.5mgのショ糖を含む3.85mgの白色粉末)を、0.9%塩化ナトリウム溶液(4.302mL)、pH7のリン酸緩衝液(0.220mL、0.5M)、およびDMSO(0.550mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.467mLの溶液)を加えて、1.5:1(w/w)のPS15B:CRM質量比率を得た。反応混合物を、環状撹拌器で室温(20℃)で18時間、次にさらに2時間37℃で緩やかに混合した。アジ化ナトリウム(0.23mg、3.60μモル)の付加により、接合反応を終了させた。次に、反応混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液で7mLの最終容量まで希釈し、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移した。試料は、0.9%塩化ナトリウム溶液中で48時間透析を受けた(8回の交換、各々800ml)。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、15B PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
17F型PSの純度:84%(アントロン)
分子量:1274kDa(繰り返し単位=1203.00g/モル)
反応手順
17F型PS(28.50mg、23.69μモル)粉末を、攪拌子により50mLのポリスチレン試料チューブ中の14.25mLの水溶液(9.925mLの水および4.275mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH5.5)中に溶解した。いったんPSが可溶化されると、53.8μLのNaIO4溶液(0.65mg、3.03μモル、0.128モル当量)を加えた。反応チューブをホイルで包み、水槽中に置いて、24℃で攪拌する。1時間後、反応混合物を、HPLC-等級水との5回の交換(各々15mL)による2つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)を使用して透析し、酸化PS-17F溶液を得た。
反応手順
酸化17F型PS溶液(22.0mg、18.29μモル、2.48mL)に、緩衝溶液(1.31mLの0.5Mのリン酸緩衝液、pH6.0)、およびDBCO-PEG4-NH2の溶液(95.8μLのDMSO中に9.58mg、18.29μモル、1モル当量)を加えた。反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(200μLの水中に2.30mg;36.60μモル、2モル当量)を加えた。反応混合物を、アルミニウムホイルで包み、25℃に設定された水槽中で2日間攪拌し続けた。2日目に、水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.48mg、18.29μモル、1モル当量)を加えることよって、反応を中断させた。30分間攪拌した後、反応混合物を、ジクロロメタン(3×15mL)で抽出した。抽出物を、N2で20分間バブリングして、残留ジクロロメタンを除去し、次に、1つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)に移した。20%エタノール溶液との5回の交換(15mL)およびHPLC-等級水との3回の交換(各々15mL)を行うことによって、透析を実行し、17F DBCO誘導体を得た。この溶液(3.27mL、11.58mg)に、ショ糖溶液(1.158mLの水中の115.8mg)を加えた。この合わされた溶液を、3つの画分(2×5mg、1×1.58mg)に分割し、各々凍結乾燥して、微細な白色粉末を得た。すべての画分を、接合反応のために必要とされるまで、乾燥するまで凍結乾燥した後、4℃で保存した。
PS 17F-DBCO:5mg(50mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):3.1%
CRM濃度:5.996mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
17F DBCO誘導体(50mgのショ糖を含む5mgの白色粉末)を、0.9%塩化ナトリウム溶液(3.742mL)、pH7のリン酸緩衝液(0.200mL、0.5M)、およびDMSO(0.500mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.558mLの溶液)を加えて、1.5:1(w/w)のPS17F:CRM質量比率を得た。反応混合物を、室温(20℃)で19時間環状撹拌器で緩やかに混合した。アジ化ナトリウム(0.27mg、4.16μモル、1モル当量)の付加により、接合反応を終了させた。次に、反応混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液で8mLの最終容量まで希釈し、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移した。試料は、0.9%塩化ナトリウム溶液中で48時間透析を受けた(8回の交換、各々800ml)。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、17F PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
18C型PSの純度:72%(アントロン)
分子量:970.76
水中のNaIO4溶液(5.41mg/mL)
反応手順
18C型PS(61mg、62.84μモル)粉末を、30.5mLの水溶液(27.45mLの水および3.05mLの2Mの酢酸)中に溶解した。次に、溶液を、95℃で40分間加熱し、次に冷却し、そのとき、NaOH溶液(1N、5.2mL)を加えて、pHを6.0に調節した。反応混合物を、HPLC等級水との3回の交換(各々12mL)によるAMICON超遠心分離機(100kDa MWCOが6~12mL)を使用して透析した。上清を、12.4mLの水を含む50mLのファルコンチューブに移した。この溶液に、5.15mLの水および5.8mLの200mM酢酸緩衝液(pH5.35)および153μLのNaIO4溶液(1.53mg、7.175μモル、0.15当量)を加えた。混合物を、25℃で3時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機(100kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-18C溶液を得た。
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)18C型PS溶液(10.0mg、10.3μモル、1.55mLの水)に、緩衝溶液(0.211mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.74)、DMSO(141μL)、およびDBCO-PEG-4-NH2溶液(54μLのDMSO中に5.4mg、16.17μモル、10当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、130μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(130μLの水中に1.3mg、20.6μモル、20当量)を加え、37℃で2日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、80μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.01mg/μL、10当量)を水中に加えた。30分間攪拌した後、反応混合物を、ジクロロメタン(2×10mL)、続いてエチル酢酸(10mL)で抽出した。抽出物を、AMICON超遠心分離機フィルタ(100kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの4回の交換(各々12mL)、続いて水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、18C DBCO誘導体型を得た。この溶液(1.31mL、7.0mg)に、ショ糖溶液(0.7mLの水中に70mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の2つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための3.5mgの18C DBCOおよび35mgのショ糖を含有した。
PS 18C-DBCO:3.5mg(35mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):5.32%
CRM濃度:2.76mg/mLの溶液
反応手順
18C DBCO誘導体(35mgのショ糖を含む3.5mgの白色粉末)を、0.9%塩化ナトリウム溶液(0.661mL)、pH7のリン酸緩衝液(0.07mL、0.5M)、およびDMSO(0.175mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.844mLの溶液)を加えて、1.5:1(w/w)のPS18C:CRM質量比率を得た。反応混合物を緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で2時間環状撹拌器で緩やかに混合した。次に、反応混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液(0.661mL)、pH7のリン酸緩衝液(0.07mL、0.5M)、およびDMSO(0.175mL)で希釈して、PS-18の最終濃度を1mg/mLにし、18時間反応させた。アジ化ナトリウム溶液(23μL、水中に10mg/mL)を加えた。30分後、接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(8回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、18C PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
18C型PSの繰り返し単位の分子量:1012
水中のNaIO4溶液(10mg/mL)
反応手順
PS-18C(20mg、19.76μモル)粉末を、3mLの水溶液(10mMの酢酸ナトリウム溶液、PH4.5)中に溶解した。この溶液に、63.4μLのNaIO4溶液(0.634mg、2.96μモル、0.15当量)を加えた。混合物を、23℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235057、20K MWCO)に移し、次に、PH6.8の50mmのPB緩衝液で24時間(4回の交換、各々600ml)透析して、酸化PS-18C溶液を得た。透析後、DMSOを加えて、PH6.8の50mmのPB緩衝液を含む10%DMSO中にPS-18Cを作製する。
PSの最終濃度:3.75mg/ml
緩衝液の最終濃度:50mMのPB(pH6.8)中に10%DMSO
反応手順
酸化18C型PS溶液(15mg、14.8μモル、10%DMSO中に4.4mL、50mMのPB、PH6.8)に、DBCO-PEG4-NH2溶液(77.6μLのDMSO中に7.76mg、14.8μモル、10当量)を25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で60分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(93μLの水中に0.93mg、14.8μモル、10当量)を加え、25℃で24時間攪拌し続けた。次に、反応混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235057、20K MWCO)に移し、次に、50mMのPB緩衝液中の20%エタノールとの4回の交換、続いて、50mMのPB緩衝液との3回の交換を使用して透析し、18C DBCO誘導体型を得た。
PS 18C-DBCO:6mg(60mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO:3%
eCRM濃度:6.5mg/mL
PS:CRM(投入比率):1.5:1
PSの最終濃度:2mg/ml
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(0.615mL)を、18C DBCO誘導体(3mLの水中に予め溶解された6mgの白色粉末、5.9μモル)に加え、1.5:1(w/w)のPS 18C:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(23℃)で17時間環状撹拌器で緩やかに混合した。次に、混合物を、培養器(37℃)中に3時間置いた。反応後、混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液によって2倍に希釈し、水素化ホウ素ナトリウム(112μLの水中に1.12mg、29.64μモル、50当量)によって3時間還元した。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(Spectrum Lab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235072,300K MWCO)に移し、次に、PH7のPBSで24時間(3回の交換、各々1000ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.45μmおよび0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、18C PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
19A型PSの純度:90%(アントロン)
分子量:614.44
水中のNaIO4溶液(5.69mg/mL)
反応手順
PS-19A(22.10mg、90%に修正、19.89mg、32.37μモル)粉末を、11.05mLの水溶液(7.73mLの水および3.32mLの0.2Mの酢酸緩衝液;pH=5.5)中に溶解した。この溶液に、304μLのNaIO4溶液(1.73mg、8.09μモル、0.25当量)を加えた。混合物を、25℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(10mL)を使用して精製し、酸化PS-19A溶液を得た。
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)19A型PS溶液(17.14mg、27.9μモル、2.50mLの水)に、緩衝溶液(1.0mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.01)、DMSO(0.4mL)、およびDBCO-PEG-4-NH2溶液(190μLのDMSO中に14.61mg、27.9μモル、10当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、70.2μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(313μLの水中に15.6mg、55.8μモル、20当量)を加え、25℃で2日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、105μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.01mg/μL、10当量)を水中に加えた。30分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mLのエチル酢酸)で抽出し、次に、AMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの6回の交換、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、19A DBCO誘導体型を得た。この溶液(3.12mL、11.4mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に114mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の2つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための5.70mgの19A DBCOおよび57mgのショ糖を含有した。
PS 19A-DBCO:5.7mg(57mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):3.31%
CRM濃度:6.5mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.8:1
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(0.49mL)を、19A DBCO誘導体(57mgのショ糖を含む5.7mgの白色粉末)に加えて、1.8:1(w/w)のPS19A:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間環状撹拌器で緩やかに混合した。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(3回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、19A PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
19A型PSの純度:90%(アントロン)
分子量:614.44
水中のNaIO4溶液(5.45mg/mL)
反応手順
PS-19A(20.83mg、90%に修正、18.75mg、30.5μモル)粉末を、9.5mLの水溶液(6.5mLの水および3mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH=5.5)中に溶解した。この溶液に、305μLのNaIO4溶液(1.63mg、7.62μモル、0.25当量)を加えた。混合物を、25℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(10mL)を使用して精製し、酸化PS-19A溶液を得た。
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)19A型PS溶液(17.57mg、28.59μモル、2.90mLの水)に、緩衝溶液(0.87mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.01)、DMSO(0.7mL)、およびDBCO-PEG-4-NH2溶液(306μLのDMSO中に14.97mg、28.59μモル、10当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、79μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(200μLの水中に9.39mg、57.2μモル、20当量)を加えて、25℃で2日間攪拌した。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、110μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.01mg/μL、10当量)を水中に加えた。30分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mLのエチル酢酸)で抽出し、次に、AMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの6回の交換、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、19A DBCO誘導体型を得た。この溶液(3.56mL、11.9mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に120mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の2つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための5.95mgの19A DBCOおよび60mgのショ糖を含有した。
PS 19A-DBCO:5.95mg(60mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):4.68%
CRM濃度:6.5mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.8:1
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(0.51mL)を、19A DBCO誘導体(60mgのショ糖を含む5.95mgの白色粉末)に加えて、1.8:1(w/w)のPS19A:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間環状撹拌器で緩やかに混合した。次に、混合物を、オーブン(37℃)中に2時間置いた。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235071、100K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(3回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、19A PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
19F型PSの純度:90.7%(アントロン)
分子量:614.44
水中のNaIO4溶液(5.21mg/mL)
反応手順
PS-19F(22.0mg、35.8μモル)粉末を、13.75mLの水溶液(11mLの水および2.75mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH=5.5)中に溶解した。この溶液に、117μLのNaIO4溶液(0.61mg、2.86μモル、0.08当量)に加えた。混合物を、冷蔵庫で17時間4℃で攪拌し、その後、酸化試料を、pH6.7の10mMリン酸緩衝液のAMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-19F溶液を得た。
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)19F型PS溶液(13.7mg、22.3μモル、2.50mLの水)に、緩衝溶液(1.0mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.0)、DMSO(0.483mL)、およびDBCO-PEG-4-NH2溶液(117μLのDMSO中に11.68mg、22.3μモル、10当量)すべて25℃を加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、70.2μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(280μLの水中に2.8mg、44.6μモル、20当量)を加えて、25℃で一晩攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、84μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.01mg/μL、10当量)を水中に加えた。30分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸(5×12mLのエチル酢酸)で抽出し、次に、AMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの5回の交換、続いて、pH7.0の5mMリン酸緩衝液との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、19F DBCO誘導体型を得た。この溶液(1.11mL、7.0mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に70mg)を加えた。合わされた溶液を、各々4mgおよび3mgの2つの部分に分割し、凍結乾燥して、白色粉末の2つの試料を得た。これらの19F DBCOの凍結乾燥された試料を、次の接合反応で使用した。
PS 19F-DBCO:4.0mg(40mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):5.14%
CRM濃度:5.0mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.6:1
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(0.5mL)に、19F DBCO誘導体(40mgのショ糖を含む4.0mgの白色粉末)を加えて、1.6:1(w/w)のPS19F:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、環状撹拌器で室温(20℃)で18時間、続いて37℃で1時間緩やかに混合した。42μLのアジ化ナトリウム(0.42mg、1当量)を加えた。30分後、接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で2日間(8回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、19F PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
19F型PS分子量:613
水中のNaIO4溶液(10mg/mL)
反応手順
PS-19F(10mg、16.31μモル)粉末を、2mLの水溶液(10mMの酢酸ナトリウム溶液、PH4.5)中に溶解した。この溶液に、34.9μLのNaIO4溶液(0.349mg、1.63μモル、0.1当量)を加えた。混合物を、4℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235057、20K MWCO)に移し、次に、PH6.8の50mmのPB緩衝液で24時間(4回の交換、各々600ml)透析して、酸化PS-19F溶液を得た。透析後、DMSOを加えて、PH6.8の50mmのPB緩衝液を含む10%DMSO中にPS-19Fを作製する。
PSの最終濃度:3.32mg/ml
緩衝液の最終濃度:50mMのPB(pH6.8)中に10%DMSO
反応手順
酸化19F型PS溶液(8.3mg、13.53μモル、10%DMSO中に2.5mL、50MmのPB、PH6.8)、DBCO-PEG4-NH2溶液(70.84μLのDMSO中に7.08mg、13.53μモル、10当量)を25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で60分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(85μLの水中に0.85mg、13.53μモル、10当量)を加え、25℃で24時間攪拌し続けた。次に、反応混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235057、20K MWCO)に移し、次に、50mMのPB緩衝液中の20%エタノールとの4回の交換、続いて、50mMのPB緩衝液との3回の交換を使用して透析し、19F DBCO誘導体型を得た。
PS 19F-DBCO:6mg(60mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO:7%
CRM濃度:2.617mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):2:1
PSの最終濃度:5.2mg/ml
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(1.15mL)を、19F DBCO誘導体(60mgのショ糖を含む6mgの白色粉末、9.7μモル)に加え、2:1(w/w)のPS 19F:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、環状撹拌器で室温(23℃)で17時間緩やかに混合した。次に、混合物を、培養器(37℃)中に3時間置いた。反応後、混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液によって2倍に希釈し、水素化ホウ素ナトリウム(184.9μLの水中に1.849mg、48.9μモル、50当量)によって3時間還元した。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235071、100K MWCO)に移し、次に、PH7のPBSで24時間(3回の交換、各々1000ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、19F PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
20型PSの純度:68%(アントロン)
分子量:1157.9gモル-1
反応手順
20型PS(30.1mg、26μモル)粉末を、攪拌子により50mLのポリスチレン試料チューブ中の15.00mLの水溶液(11.25mLの水および3.75mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH5.5)中に溶解した。いったんPSが可溶化されると、160μLのNaIO4溶液(1.11mg、5.2μモル、0.20モル当量)を加えた。反応チューブをホイルで包み、25℃の水槽中に置いた。混合物を25℃で攪拌した。18時間後、反応混合物を、HPLC-等級水(各々15mL)との5回の交換による3つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)を使用して透析し、酸化PS-20溶液を得た。
反応手順
PS20-OX(11.7mg、10.1μモル、1.61mL)を、リン酸緩衝液(0.600mL、200mM、pH6.0)に加え、これに、DBCO-PEG4-NH2(1.0当量、DMSO中に523gモル-1、33mg/mL、160μL)および追加量のDMSO(207μL)を加えた。反応混合物を、25℃で25分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(2当量、52.5mg/mL、24μL)を加えて、1日間攪拌した。1当量の水素化ホウ素ナトリウム溶液でキャッピングした後、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mL)で抽出し、溶媒を含まずバブリングした。DBCO誘導体を、水中の20%エタノールとの5回の交換、続いて、毎回水との3回の交換(各々12mL)を使用した遠心透析ユニット(Amicon 30kDa MWCO)によって2回精製し、20-DBCO誘導体を得た。この溶液(2.09mL、13.65mg)に、ショ糖溶液(1.37mLの水中に136.5mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、接合反応で使用するための6.0mgの20-DBCOおよび60mgのショ糖を含有した。
PS 20-DBCO:5.0mg(50mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):2.0%
CRM濃度:5.29mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
20-DBCOを、0.9%塩化ナトリウム溶液(2.684mL、0.22μmに濾過)、リン酸緩衝液(pH7.0、0.5M、0.160mL)、およびDMSO(0.400mL)中に溶解した。アジド-CRM溶液(5.29mg/mL、0.756mL)を、滴下で加えて、1.5:1(w/w)のPS20:CRM投入比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、環状撹拌器で室温(20℃)で36時間緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、50μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(4回の交換、各々1L)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、無菌の20-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
22F型PSの純度:89%(アントロン)
分子量:996.88
水中のNaIO4溶液(5mg/mL)
反応手順
22F型PS(30.2mg、30.3μモル)粉末を、10.5mLの水および4.5mLの200mM酢酸緩衝液(pH5.26)および132μLのNaIO4溶液(0.65mg、3.03μモル、0.1当量)中に溶解した。混合物を、25℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機(100kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-22F溶液を得た。
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)22F型PS溶液(7.0mg、7.02μモル、0.956mLの水)に、緩衝溶液(0.525mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.0)、DMSO(151μL)、およびDBCO-PEG-4-NH2溶液(112μLのDMSO中に3.67mg、7.02μモル、10当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、17μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(17μLの水中に0.88mg、14.06μモル、20当量)を加えて、25℃で2日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(250μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、9μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(31mg/mL、10当量)を水中に加えた。30分後、反応混合物を、エチル酢酸(4×5mL)で抽出した。抽出物を、AMICON超遠心分離機フィルタ(100kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの6回の交換(各々12mL)、続いて水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析した。SEC-HPLCは、遊離DBCOを示すため、試料を、水中の20%エタノールとの3回の交換(各々12mL)、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して再透析し、22F DBCO誘導体型を得た。この溶液(2.35mL、5.2mg)に、ショ糖溶液(0.520mLの水中に52mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の2つの試料を得た。試料は、次の接合反応で使用するための、それぞれ、2.4mgおよび2.8mgの22F DBCO、ならびに24mgおよび28mgのショ糖を含有した。
PS 22F-DBCO:2.4mg(24mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):1.24%
CRM濃度:4mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.4:1
反応手順
22F DBCO誘導体(24mgのショ糖を含む2.4mgの白色粉末)を、0.9%塩化ナトリウム溶液(0.075mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.142mLの溶液)を加えて、1.4:1(w/w)のPS22F:CRM質量比率を得た。反応混合物を緩やかに混合し、その後、環状撹拌器で室温(20℃)で48時間緩やかに混合した。アジ化ナトリウム溶液(16μL、水中に10mg/mL)を加えた。30分後、接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移し、その後、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(5回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、22F PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
23F型PSの純度:85%(アントロン)
分子量:792.62
水中のNaIO4溶液(5.86mg/mL)
反応手順
PS-23F(20.21mg、85%に修正、17.18mg、26.7μモル)粉末を、10mLの水溶液(7.5mLの水および2.5mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH=5.5)中に溶解した。この溶液に、119μLのNaIO4溶液(0.695mg、4.0μモル、0.15当量)を加えた。混合物を、25℃で4時間攪拌した。次に、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機フィルタ(30kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-23F溶液を得た。
反応手順
(10%の酸化レベルを想定)23F型PS溶液(13.51mg、17.0μモル、2.14mLの水)に、緩衝溶液(0.85mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.01)、DMSO(310μL)、およびDBCO-PEG-4-NH2溶液(170μLのDMSO中に8.93mg、17.0μモル、10当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、42μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(120μLの水中に6.1mg、34.0μモル、20当量)を加えて、25℃で2日間攪拌し続けた。反応混合物を、エチル酢酸(3×20mLのエチル酢酸)で抽出し、次に、AMICON超遠心分離機フィルタ(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの6回の交換(各々12ml)、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、23F DBCO誘導体型を得た。この溶液(7.58mL、13.8mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に138mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための6.9mgの23F DBCOおよび69mgのショ糖を含有した。
PS 23F-DBCO:69mgのショ糖を含む6.90mgの白色粉末
DBCO割合(%):5.1%
CRM濃度:2.617mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):2:1
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(1.32mLの溶液)を、23F DBCO誘導体(69mgのショ糖を含む6.90mgの白色粉末)に加えて、2:1(w/w)のPS23F:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、環状撹拌器で室温(20℃)で17時間緩やかに混合した。次に、混合物を、オーブン(37℃)中に3時間置いた。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析フィルタ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235071、100K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(3回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-HVフィルタ(0.45μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、23F PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
33F PS型の純度:75%(アントロン)
分子量:973
反応手順
33F PS型(34.0mg、35.0μモル)粉末を、攪拌子により50mLのポリスチレン試料チューブ中の17.0mLの水溶液(12.0mLの水および5.0mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH5.5)中に溶解した。いったんPSが可溶化されると、59μLのNaIO4溶液(1.49mg、7.0μモル、0.20モル当量)を加えた。反応チューブをホイルで包み、4℃の水槽中に置いた。混合物を4℃で攪拌した。18時間後、反応混合物を、HPLC-等級水との4回の交換(各々15mL)による3つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(100kDa MWCO、15mL)を使用して透析し、酸化PS-33F溶液を得た。
反応手順
酸化33F PS型溶液(11.2mg、11.51μモル、2.49mL)に、緩衝溶液(0.114mLの0.5Mのリン酸緩衝液、pH6.0)、DBCO-PEG4-NH2溶液(200μLのDMSO中に6.039mg、6.33μモル、0.55当量)を加えた。反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、63μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(100μLの水中に4.5mg、34.54μモル、2.0当量)を加えた。反応混合物を、アルミニウムホイルで包み、25℃に設定された水槽中で2日間攪拌し続けた。2日目に、44μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(312μLの水中に3.12mg、11.51μモル、1.0当量)を加えることによって、反応を中断させた。30分間攪拌した後、反応混合物を、ジクロロメタン(3×10mL)、続いてエチル酢酸(3×10mL)で抽出した。抽出物を、N2で20分間バブリングして、残留エチル酢酸を除去し、次に、2 AMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(100kDa MWCO、15mL)に移した。3%DMSO溶液との3回の交換(各々15mL)、20%エタノール溶液との6回の交換(各々15mL)、およびHPLC-等級水との3回の交換(各々15mL)を行うことによって、透析を実行し、33F DBCO誘導体を得た。この溶液(1.23mL、4.0mg)に、ショ糖溶液(40mgの0.4mLの水)を加えた。この合わされた溶液を凍結乾燥して、微細な白色粉末を得た。PS33F DB試料を、接合反応のために必要とされるまで4℃で保存した。
PS 33F-DBCO:4mg(40mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):3.0%
CRM濃度:6.009mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
33F DBCO誘導体(40mgのショ糖を含む4.0mgの白色粉末)を、0.9%塩化ナトリウム溶液(5.32mL)、pH7のリン酸緩衝液(0.267mL、0.5M)、およびDMSO(0.667mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.445mLの溶液)を加えて、1.5:1(w/w)のPS33F:CRM質量比率を得た。反応混合物を、環状撹拌器で室温(20℃)で19時間緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、50μL)の付加によってクエンチした。次に、反応混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液(7.0mL)で希釈し、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移した。試料は、0.9%塩化ナトリウム溶液中で48時間透析を受けた(8回の交換、各々800ml)。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、33F PS-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
7F PS型の純度:86%(アントロン、CRB-21-20)
分子量:1227gモル-1
反応手順
天然多糖類(19.5mg、86%に修正、16.8mg、13.7μモル)を、3.9mLの水中に溶解した。この溶液に、4.58mLの水および0.293mLの酢酸ナトリウム緩衝液(1.5M、pH5.4)を加えた。次に、30μLの過ヨウ素酸ナトリウム溶液(300μg、1.4μモル、0.1当量)を攪拌溶液に加えた。反応物を22℃で3時間攪拌した。次に、酸化PSを、回転濃縮器(Amicon 30kDa MWCO)を使用して、2倍に濃縮した。次に、濃縮されたPSを、ゲル濾過塔(GE Healthcare PD-10、回転方法)を使用して水に緩衝液交換した。
反応手順
7F-OX(1.9mLの4.0mg/mL、7.6mg、6.2μモル)に、0.15mLのリン酸ナトリウム(1M、pH6.3)を加えた。次に、0.23mLのDBCO-PEG4-NH2(DMSO中に27.1mM、ロット1730、6.2μモル、1.0当量)を攪拌溶液に加えた。5分攪拌した後、0.039mLのNaCNBH3(水中に20mg/mL、12.4μモル、2.0当量)を攪拌溶液に加えた。反応物を22℃で40時間攪拌した。次に、溶液に、0.024mL水素化ホウ素ナトリウム(水中に10mg/mL、6.3μモル、1.0当量)を加えた。15分攪拌した後、ゲル濾過塔(Thermo Zeba Columns,40kDa MWCO)を介した水への緩衝液交換によって、PSを精製した。
PS 7F-DBCO:2.8mg(水中に2.8mg/mL)
DBCO割合(%):4.8%
CRM濃度:4.7mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.6:1
反応手順
5mLの遠心分離機チューブ中の7F-DBCO(水中に1mLの2.8mg/mL)に、0.128mLのリン酸カリウム(0.5M、pH7.5)を加えた。次に、この溶液に、0.372mLのアジド官能化eCRM(pH7.1の20mMリン酸カリウム中に4.7mg/mL、7.5%のショ糖)を加えることによって、1.6:1(w/w)の投入質量比率を得た。溶液を、環状ロッカー上に置き、(溶液がチューブの端から端へと動くように)22℃で16時間揺り動かした。次に、接合体を、1時間後および4時間後の透析液の変化(500mL)を含む、48時間300kDaの透析膜(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2、1mL)を使用して0.9%塩化ナトリウムに透析した。透析された溶液を、注射器フィルタ(Pall Acrodisc Supor、0.22μm、直径13mm)を通して濾過し、7F-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
1型PSの純度:80%(ウロン酸アッセイ)
分子量:625gモル-1
反応手順
天然多糖類(20.2mg、32.32μモル)を、9.5mLの水溶液(7.0mLの水および2.5mLの酢酸緩衝液、200mM、pH5.24)中に溶解した。この溶液に、492μLの過ヨウ素酸ナトリウム溶液(3.45mg、16.16μモル、0.5当量)を加えた。混合物を25℃で8時間攪拌した。酸化PSを、水との6回の交換を使用したAmicon遠心30kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS-1溶液を得た。
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)1型PS溶液(16mg、25.6μモル、2.4mLの水)に、緩衝溶液(0.424mLの500mMリン酸緩衝液、pH=6.74)、DMSO(572μL)、およびDBCO-PEG4-NH2溶液(134μLのDMSO中に13.4mg、25.6μモル、10当量)を加えた。次に、反応混合物を25℃で30分間攪拌し、その後、32μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(32μLの水中に3.2mg、51.2μモル、20当量)を加え、25℃で3日間攪拌し続けた。緩衝溶液(0.300mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.0)、続いて水素化ホウ素ナトリウム(100μL中に0.97mg、25.6μモル、10当量)を加え、25℃で30分間攪拌した。反応混合物を、ジクロロメタン(4×5mL)で抽出した。水性抽出物を、2つのAMICON超遠心分離機フィルタ(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの5回の交換(各々12mL)、続いて、水中の3%DMSOとの3回の交換(各々12mL)、0.9%塩化ナトリウムとの3回の交換、および水との3回の交換を使用して透析し、1 DBCO誘導体型を得た。この溶液(1.37mL、10.0mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に100mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の2つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための5.0mgの1-DBCOおよび50mgのショ糖を含有した。
PS 1-DBCO5.0mg(50mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):2.5%
CRM濃度:4.86mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.7:1
反応手順
凍結乾燥された1-DBCO型粉末(5mg)を、濾過された0.9%塩化ナトリウム溶液(5.39mL)およびリン酸緩衝液(250μL、0.5M、pH7.0)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.47mL)を加えて、1.7:1(w/w)のPS-1:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間、環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、52μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO、10mL)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(8回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、1-CRM接合体溶液を得た。
1.酸化
PS血清型10A ロット#:63662302(ATCC)
PS 10Aの純度:77%(アントロン)
分子量:1013kDa(繰り返し単位=1227g/モル)
反応手順
10A型PS(25.99mg、21.18μモル)粉末を、攪拌子により50mLのポリスチレン試料チューブ中の12.995mLの水溶液(9.746mLの水および3.249mLの0.2M酢酸緩衝液、pH5.5)中に溶解した。いったんPSが可溶化されると、135μLのNaIO4溶液(0.27mg、1.26μモル、0.06モル当量)を加えた。反応チューブをホイルで包み、冷蔵庫中に置いて、4℃で攪拌した。45分後、反応混合物を、HPLC-等級水との6回の交換(各々15mL)による3つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)を使用して透析し、酸化PS-10A溶液を得た。
反応手順
酸化10A型PS溶液(18.15mg、14.79μモル、3.371mL)に、緩衝溶液(0.259mLの0.5Mリン酸緩衝液、pH6.0)、DMSO(0.145mL)、およびDBCO-PEG4-NH2溶液(154μLのDMSO中に7.7mg、14.79μモル、1モル当量)を加えた。反応混合物を4℃で30分間攪拌し、その後、101μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(101μLの水中に1.9mg、2モル当量)を加えた。反応混合物をアルミニウムホイルで包み、4℃の冷蔵庫で2日間攪拌し続けた。2日目に、85μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.56mg、14.79μモル、1モル当量)を加えることによって、反応を中断させた。30分間攪拌した後、反応混合物を、ジクロロメタン(3×15mL)で抽出した。抽出物を、N2で15分間バブリングして、残留ジクロロメタンを除去し、次に、1つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)に移した。3%DMSO溶液との3回の交換(各々15mL)、20%エタノール溶液との3回の交換(15mL)、0.9%塩化ナトリウム溶液との2回の交換、およびHPLC-等級水との2回の交換(各々15mL)を行うことによって、透析を実行し、10A DBCO誘導体を得た。この溶液(3.371mL、15.06mg)に、ショ糖溶液(1.506mLの水中に150.6mg)を加えた。この合わされた溶液を、3つの等しい画分に分割し、各々凍結乾燥して、微細な白色粉末を得た。凍結乾燥後、すべての画分を、接合反応のために必要とされるまで4℃で保存した。
PS 10A-DBCO:5.20mg(52.0mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):2.1%
CRM:pH7.1の20mMヒスチジン中に4.962mg/mL(7.5%のショ糖)
PS:CRM(投入質量比率):1.25:1
反応手順
10A DBCO誘導体(52.0mgのショ糖を含む5.2mgの白色粉末)を、0.9%塩化ナトリウム溶液(1.502mL)、pH7のリン酸緩衝液(0.104mL、0.5M)、およびDMSO(0.156mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.838mLの溶液)を加えて、1.25:1(w/w)のPS10A:CRM質量比率を得た。2.0mg/mLのPSの濃度の反応混合物を、環状撹拌器で室温(22℃)で2時間緩やかに混合した。次に、反応混合物を、1.0mg/mLに希釈し、さらに20時間22°Cで攪拌し続けた。アジ化ナトリウム(7.5mg、115μモル)の付加により、接合反応を終了させた。次に、反応混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液で7mLの最終容量まで希釈し、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移した。試料は、0.9%塩化ナトリウム溶液中で48時間(2回の交換、各々1L、1回の交換、4L)透析を受けた。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、10A PS-CRM接合体溶液を得た。
様々な肺炎球菌多糖類を、上記に記載されるように酸化し、同じ条件下でDBCO-PEG4-アミン(DBCOもしくはDB)またはDBCO-アミン(DBCAもしくはDA)と反応させて、組み込み効率に対するリンカーの効果を判定した。以下の表は、試験された血清型のうちの1つを除いてすべてにおいて、DBCO-アミンが、100個の多糖類の繰り返し単位当たり、DBCO-PEG4-アミンと比較して、より高い効率で組み込まれることを示す。
DBCO-PEG4-アミン(DB)またはDBCO-アミン(DA)に連結された肺炎球菌多糖類を、上記の実施例に沿って同一の反応条件下で表2からの同じeCRMに接合させて、接合効率に対するリンカーの効果を評価した。以下の表は、DBCO-アミンに連結された多糖類と共に形成された接合体が、一般に、より少ない遊離多糖類およびより大きい接合体サイズをもたらすことを示す。
本開示により生成された様々な一価肺炎球菌多糖類-eCRM接合体の投与後の、マウスまたはウサギにおける総IgGおよび機能的OPA抗体反応を判定するための実験を行った。Opsono食細胞活性(OPA)アッセイを使用して、様々な肺炎連鎖球菌の血清型に特異的なネズミの血清中の機能的抗体を測定した。OPA測定は、Moon H.Nahm&Robert L.Burton,“Protocol for opsonophagocytic killing assay for antibodies against Group B Streptococcus (UAB GBS OPA),” Version B.04,March 2016(Original Version A.01 posted September 2011)(www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-GBS-OPA.pdf)and “Protocol for multiplexed opsonophagocytic killing assay(UAB-MOPA)for antibodies against Streptococcus pneumoniae”Version E.02,December 2014(www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf)に基づく。図3は、マウスにおける一価肺炎球菌多糖類-eCRM接合体の投与後のオプソニン食作用(OPA)活性を示す。Yu et al.,“Development of an Automated and Multiplexed Serotyping Assay for Streptococcus pneumoniae,”Clin Vaccine Immunol.2011,18(11):1900-7に記載されている方法に従って、各肺炎球菌多糖類に特異的な総多糖類結合抗体(IgG)も測定した。図4は、マウスにおける一価肺炎球菌多糖類-eCRM接合体の投与後のIgG応答を示す。
ポルフィロモナス・ジンジバリスに対するワクチンを、以下のとおりに、ポルフィロモナス・ジンジバリス血清型K1、K2、K3、K4、K5、および/またはK6由来の莢膜多糖(CPS)をeCRM担体タンパク質に接合させることによって調製する。
さらに、本発明は次の態様を包含する。
1. ポリペプチドおよび抗原を含む接合体であって、前記ポリペプチドが、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよび少なくとも2つの非天然アミノ酸(「nnAA」)残基を含む担体タンパク質であり、(i)前記担体タンパク質が、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D、およびCRM197からなる群から選択されるタンパク質由来の少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含み、(ii)前記抗原が、前記nnAA残基と接合している、接合体。
2. 前記担体タンパク質が、4~9個のnnAA残基を含む、項1に記載の接合体。
3. 少なくとも1つのnnAAが、天然担体タンパク質中のリジンと置換される、項1または2に記載の接合体。
4. 前記担体タンパク質が、配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有する、項1~3のいずれかに記載の接合体。
5. 少なくとも1つのnnAAが、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、またはK527と置換される、項4に記載の接合体。
6. 前記担体タンパク質が、配列番号9のアミノ酸配列を含む、項1~5のいずれかに記載の接合体。
7. 前記少なくとも1つのnnAAが、2位のアミノ置換基と、3位のアジド含有置換基、1,2,4,5-テトラジニル置換基、またはエチニル含有置換基とを持つ2,3-二置換プロパン酸である、項1~6のいずれかに記載の接合体。
8. 前記nnAAが、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、および2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、項1~7のいずれかに記載の接合体。
9. 前記抗原が、トリアゾール連結部分を介して前記nnAAと接合している、項1~8のいずれかに記載の接合体。
10. ポリペプチドおよび抗原を含む接合体であって、前記ポリペプチドが、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよび少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含む担体タンパク質であり、前記抗原が、前記nnAAと接合し、さらに、前記少なくとも1つのnnAA残基が、式XIIの構造を有するアミノ酸に対応し、
11. W 6 がアジドであり、Arがフェニレンであり、またはArが、窒素ヘテロ原子および任意選択的に、N、O、およびSから選択される少なくとも1つの追加のヘテロ原子を含有し、Q1が1であり、かつ/またはW 5 が低級アルキレンである、項10に記載の接合体。
12. 前記抗原が、式XIまたはXIaによる前記担体タンパク質に連結され、
R 1 が、H、ホルミル、または前記担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
R 2 が、OHまたは前記担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
Wが、CまたはNであり、
yが、少なくとも1であり、
nが、少なくとも1であり、
Xが、莢膜多糖の少なくとも1つのポリオールである、項1~11のいずれかに記載の接合体。
13. 前記抗原が、細菌莢膜多糖、例えば、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア、およびポルフィロモナス・ジンジバリスからなる群から選択される細菌由来の莢膜多糖である、項1~12のいずれかに記載の接合体。
14. 前記抗原が、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である、項12に記載の接合体。
15. 多糖類と担体タンパク質との比率(w/w)が、1を上回る、項1~14のいずれかに記載の接合体。
16. 前記ポリペプチドが、3つ以上のnnAA残基を含み、前記接合体が、少なくとも500kDaの分子量を有する、項1~15のいずれかに記載の接合体。
17. 前記ポリペプチドが、(a)CRM197であるか、または配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、(b)3~9つのnnAA残基を含む、項15に記載の接合体。
18. 前記接合体が、タンパク質-抗原-タンパク質連結を通して架橋される、項1~17のいずれかに記載の接合体。
19. 前記接合体が、少なくとも900kDaの分子量を有する、項1~18のいずれかに記載の接合体。
20. 分子量が900kDa~5MDaである、項19に記載の接合体。
21. 接合体を生成するための方法であって、
a.非天然アミノ酸(「nnAA」)の第2の化学ハンドルに接合することができる第1の化学ハンドルを含む複数の官能基を含む活性化抗原を提供することと、
b.前記第1および第2の化学ハンドルが反応して抗原-ポリペプチド接合体を形成する条件下で、前記nnAAのうちの少なくとも1つを含むポリペプチドと前記活性化抗原を組み合わせることであって、前記ポリペプチドが、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含む、組み合わせることと、
c.前記接合体を含む組成物を回収することと、を含む、方法。
22. 前記第1の化学ハンドルが、アルキン基を含み、かつ/または前記第2の化学ハンドルがアジド基を含む、項21に記載の方法。
23. 前記抗原が、プロパルギル、DIFO、DBCO、DBCO-NH 2 、およびDBCO(PEG)n-NH 2 からなる群から選択される官能基を含む第2の試薬と反応されている、項21または22に記載の方法。
24. (i)前記抗原が、式V、式VI、もしくは式VIaの構造を含み、
L 2 が、結合、-C(=O)-、-S(=O) 2 -、-C(=O)L 12 -、-S(=O) 2 L 12 であり、
L 12 が、L 22 もしくはL 22 NH-であり、
L 22 が、C 1-10 アルキルまたは-(CH 2 CH 2 O) 1-10 -であり、
U 1 が、前記抗原の少なくとも1つの部分であるか、
または(ii)前記抗原が、式VIIもしくは式VIIaの構造を含み、
nが少なくとも1であるか、
または(iii)前記抗原が、式VIIbもしくは式VIIcの構造を含み、
nが少なくとも1であるか、
または(iv)前記抗原が、構造A-Xのz部分を含み、式中、
Aが、
Xが、多糖類の少なくとも1つのポリオールであり、
nが、少なくとも1であり、
zが1を上回るか、
または(v)前記抗原が式VIIIの構造を含み、
U 1 が、抗原の少なくとも1つの部分であるか、
または(vi)前記抗原が、式IXの構造を含み、
または(vii)前記抗原が、式IXaの構造を含み、
U 1 が、抗原の少なくとも1つの部分であるか、項21または項22に記載の方法。
25. 項1~20のいずれかに記載の接合体を生成するための、項21~24のいずれかに記載の方法。
26. 抗原がT細胞依存性免疫反応を提供する担体タンパク質と接合している、タンパク質-接合体ワクチンを作製する改善された方法であって、前記改善が、少なくとも1つの非天然アミノ酸を含むポリペプチドを前記担体タンパク質として用いることを含み、前記非天然アミノ酸が、バイオ直交性反応性部分を含み、それを通じて前記抗原が前記ポリペプチドに接合される、改善された方法。
27. 少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよび少なくとも2つの非天然アミノ酸(「nnAA」)残基を含む担体タンパク質であって、(i)前記担体タンパク質が、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D、およびCRM197からなる群から選択されるタンパク質由来の少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含む、担体タンパク質。
28. 配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号1内に天然に生じるアミノ酸と置換される少なくとも1つのnnAAを含む、担体タンパク質であって、前記少なくとも1つのnnAAが、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、またはK527と置換され、前記nnAAが、連結部分を含む、担体タンパク質。
29. 免疫原性多糖類-タンパク質接合体を調製するための担体タンパク質であって、前記タンパク質が、(i)少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含み、(ii)少なくとも1つのnnAAを含み、かつ(iii)pH7.4のトリス緩衝液中、20℃で少なくとも50mg/Lの溶解度を有する、担体タンパク質。
30. 項26~28のいずれかに記載の担体タンパク質を生成するためのプロセスであって、
(a)前記担体タンパク質をコードする核酸であって、複数の抑制コドンを含む、核酸を提供することと、
(b)前記非天然アミノ酸、前記抑制コドンに相補的であるtRNA、およびアミノアシル-tRNA合成酵素を含む無細胞抽出物と前記核酸を組み合わせることによって反応混合物を作出することと、
(c)前記担体タンパク質中の各抑制コドンに対応する部位に前記非天然アミノ酸を選択的に組み込むのに十分な条件下で、前記(b)の前記反応混合物を培養することと、を含む、プロセス。
31. 前記非天然アミノ酸が、4-アジドメチル-フェニルアラニン(pAMF)であり、前記(b)のtRNAが、pAMFで荷電されることができる、項30に記載の方法。
32. 約10℃~約30℃の温度で維持された無細胞発現混合物中に少なくとも2つのnnAAを含むポリペプチドの合成のための方法であって、生成された前記ポリペプチドが、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、前記可溶性画分と前記不溶性画分との比率が、少なくとも30%(w/w)である、方法。
33. 前記温度が、(i)約20℃を上回るか、または(ii)約20℃を下回り、例えば、前記温度が、約14℃~約18℃である、項32に記載の方法。
34. 項1~19に記載の複数の接合体を含む組成物であって、前記複数の接合体の各々が、異なる抗原を含む、組成物。
35. 血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される2つ以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される14個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される15個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される20個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される21個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される24個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される25個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清群A、C、W135、X、およびYからなる群から選択される4つ以上の異なる髄膜炎菌血清群由来の莢膜多糖の接合体、または
血清型K1、K2、K3、K4、K5、およびK6からなる群から選択される2つ以上の異なるポルフィロモナス・ジンジバリス血清型由来の莢膜多糖の接合体を含む、項34に記載の組成物。
36. 対象における抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発する方法であって、非経口投与に好適な賦形剤で、項1~20のいずれかに記載の接合体または項34もしくは項35に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
Claims (21)
- 複数の架橋担体タンパク質-抗原接合体を含む組成物であって、該複数の架橋担体タンパク質-抗原接合体が少なくとも21個の別個の架橋担体タンパク質-抗原接合体を含み、該抗原が肺炎連鎖球菌の莢膜多糖であり、
各別個の架橋担体タンパク質-抗原接合体における担体タンパク質は同じであり、少なくとも1個のT細胞活性化エピトープを含み、かつ配列番号1と少なくとも90%配列同一性を有するポリペプチドであり、
(a)各別個の架橋担体タンパク質-抗原接合体中の莢膜多糖が肺炎連鎖球菌の異なる血清型由来のものであり;
(b)架橋担体タンパク質-抗原接合体の担体タンパク質が、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよびポリペプチドにおける天然に存在するアミノ酸を置き換えるクリック化学反応性部分を含む少なくとも3つの非天然アミノ酸(nnAA)を含むポリペプチドであり、ここで、該莢膜多糖がnnAAと接合しており;
(c)肺炎連鎖球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23Fおよび33Fの各々に対する莢膜多糖を含む別個の架橋担体タンパク質-抗原接合体が存在し;
(d)血清型2、6C、9N、15A、15C、16F、17F、20、20A、20B、23A、23B、24F、24B、31、34、35B、35Fおよび38からなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の莢膜多糖を含む少なくとも1つの追加の別個の架橋担体タンパク質-抗原接合体が存在し;かつ
(e)組成物中のすべての血清型多糖類と担体タンパク質との全体的な(重量単位)比率が少なくとも0.8である、
組成物。 - 少なくとも21個の別個の架橋担体タンパク質-抗原接合体が少なくとも24個の別個の架橋担体タンパク質-抗原接合体を含み、肺炎連鎖球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33Fからなる群から選択される別個の架橋担体タンパク質-抗原接合体が存在する、請求項1に記載の組成物。
- 肺炎連鎖球菌血清型20が血清型20Bである、請求項1または2に記載の組成物。
- さらに別個の架橋担体タンパク質-抗原接合体を含み、該抗原が肺炎連鎖球菌血清型6Cまたは7Cの莢膜多糖である、請求項1~3の何れかに記載の組成物。
- 少なくとも21個の別個の架橋担体タンパク質-抗原接合体が少なくとも25個の別個の架橋担体タンパク質-抗原接合体を含み、肺炎連鎖球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33Fの各々を含む別個の架橋担体タンパク質-抗原接合体が存在し、
ここで、6C、7C、13、15A、15C、16、16F、23A、23B、24F、31、34、35B、33F、35F、37および38からなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖を含む少なくとも1つの別個の架橋担体タンパク質-抗原接合体が存在する、請求項1~4のいずれかに記載の組成物。 - 肺炎連鎖球菌莢膜多糖が連結部分を介してnnAAと接合しており、該肺炎連鎖球菌莢膜多糖がシクロオクチン基を含み、クリック化学反応性部分に接合しており、該クリック化学反応性部分がアジド基を含む、請求項1~5のいずれかに記載の組成物。
- 組成物中に約25%(重量)未満の総遊離多糖類が存在する、請求項1~6のいずれかに記載の組成物。
- ポリぺプチド内のnnAAが2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸および2-アミノ-5-アジドペンタン酸から選択される、請求項1~7のいずれかに記載の組成物。
- ポリぺプチド内のnnAAがpAMFである、請求項8に記載の組成物。
- 担体タンパク質が配列番号1と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項1~9のいずれかに記載の組成物。
- 該クリック化学反応性部分を含む少なくとも3つのnnAAで配列番号1内の天然に生じるアミノ酸が置換されており、ここで、該少なくとも3つのnnAAで配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523またはK527が置換されている、請求項1~10のいずれかに記載の組成物。
- 架橋担体タンパク質-抗原接合体の担体タンパク質が少なくとも4つのnnAAまたは4~6つのnnAAを含む、請求項1~11のいずれかに記載の組成物。
- 担体タンパク質が1)K25、K34、K38およびK40からなる群由来の1つの残基、2)K213およびK215からなる群から選択される1つの残基ならびに3)K28、K245、K265、K386、K523およびK527からなる群から選択される2~4つの残基のリジン残基を予め置換しているnnAAを含む、請求項1~12のいずれかに記載の組成物。
- すべての血清型多糖類と担体タンパク質との全体的な(重量単位)比率が少なくとも0.9、少なくとも1.0、少なくとも1.1、少なくとも1.2、少なくとも1.3、少なくとも1.4または少なくとも1.5である、請求項1~13のいずれかに記載の組成物。
- 請求項1~15のいずれかに記載の組成物に含まれる架橋担体タンパク質-抗原接合体を製造する方法であって、
(a)tRNAと、少なくとも3つのnnAAを含む担体タンパク質をコードする核酸とを含む反応混合物を産生することを含む、無細胞抽出物ベースのタンパク質合成によって、コードされた担体タンパク質を製造し、ここで、該少なくとも3つのnnAAはクリック化学反応性部分を含み、該少なくとも3つのnnAAに複数の抑制コドン部位が組み込まれ、そして
該コードされた担体タンパク質はクリック化学反応性部分を含む少なくとも3つのnnAAおよび少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含み;
(b)抗原における部位にアルキンを含むクリック化学反応性部分を組み込むことにより誘導体化された抗原を産生し、ここで、該アルキンを含むクリック化学反応性部分は担体タンパク質におけるクリック化学反応性部分と反応でき;そして
(c)担体タンパク質と誘導体化された抗原を反応させて、架橋担体タンパク質-抗原接合体を製造する
ことを含む、方法。 - 担体タンパク質がクリック化学反応性部分を含む4~6つのnnAAを含む、請求項16に記載の方法。
- (i)工程(c)がシクロオクチン反応性基とアジド反応性基の間の歪み促進アジド-アルキン負荷環化を含む;
(ii)工程(a)で産生された担体タンパク質が可溶性画分および不溶性画分を含み、可溶性画分と不溶性画分との比率が少なくとも40%(w/w)である;
(iii)工程(a)の無細胞抽出物ベースのタンパク質合成を25℃以下で行う;
(iv)tRNAの濃度が少なくとも20μMである;および/または
(v)工程(c)で形成された架橋担体タンパク質-抗原接合体における多糖類と担体タンパク質との比率(重量単位)が(A)約0.9~約3.0(w/w)である、(B)1を超えるまたは(C)1.0~2.8である、
請求項16または17に記載の方法。 - 可溶性画分と不溶性画分との比率が少なくとも60%である、請求項18に記載の方法。
- 工程(a)の無細胞抽出物ベースのタンパク質合成を20℃以下で行う、請求項18または19に記載の方法。
- 対象における抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発するための医薬組成物であって、非経口投与に好適な賦形剤中に、請求項1~15のいずれかに記載の組成物を含むものである、医薬組成物。
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