JP2020514326A - 肺炎連鎖球菌多糖−タンパク質コンジュゲートの免疫原性の増強 - Google Patents

Abstract

本発明は、肺炎連鎖球菌莢膜に由来する１つ以上の多糖がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる１つ以上の多糖−タンパク質コンジュゲートを有する免疫原性組成物を提供する。本発明はまた、ＤＭＳＯ条件で調製された多糖−タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物をヒト被検体に投与することを含む、肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンに対する増強された免疫応答を提供するための方法を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような非プロトン性溶媒中で還元的アミノ化を用いてＣＲＭ_１９７にコンジュゲートさせた少なくとも１つの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖を含む免疫原性組成物を提供する。本発明はまた、肺炎連鎖球菌莢膜に由来する１つ以上の多糖がＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒中で行われる還元的アミノ化を用いて担体タンパク質にコンジュゲートさせた１つ以上の多糖−タンパク質コンジュゲートを有する免疫原性組成物の免疫原性を増強するための方法を提供する。

肺炎連鎖球菌はグラム陽性菌で、乳児や小児の侵襲性細菌性疾患（肺炎、菌血症、髄膜炎、中耳炎など）の最も一般的な原因である。肺炎球菌は、血清型特異性を付与する化学的に結合した多糖で被包されている。肺炎球菌には９０を超える既知の血清型があり、莢膜は、細菌の内表面を補体から保護するだけでなく、それ自体免疫原性も低いので、肺炎球菌の主要な病原性決定因子である。多糖はＴ細胞非依存性抗原であるので、Ｔ細胞と相互作用するようにＭＨＣ分子上で処理または提示されることはできない。しかしながらそれらは、Ｂ細胞上の表面受容体の架橋を伴う他のメカニズムを通して免疫系を刺激することができる。

２歳未満の子供は、ほとんどの多糖ワクチンに対して免疫応答を起こさないので、タンパク質担体への化学的コンジュゲーションによって多糖を免疫原性にすることが必要であった。多糖（Ｔ細胞非依存性抗原）をタンパク質（Ｔ細胞依存性抗原）にカップリングすることにより、アイソタイプ転換、親和性成熟および記憶誘導を含むＴ細胞依存性の特性が多糖に付与される。

多くのコンジュゲーション反応が、多糖をタンパク質に共有結合させるために使用されてきた。より一般的に用いられている方法には以下の３つの方法が含まれる。１）還元的アミノ化：反応の一方の成分上のアルデヒドまたはケトン基が他方の成分上のアミノまたはヒドラジド基と反応し、続いて、形成されたＣ＝Ｎ二重結合が還元剤によりＣ−Ｎ単結合に還元される。２）シアニル化コンジュゲーション：多糖が臭化シアン（ＣＮＢｒ）または１−シアノ−４−ジメチルアンモニウムピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）のいずれかによって活性化されて、ヒドロキシル基にシアネート基を導入し、これがタンパク質成分の添加により、アミノまたはヒドラジド基との共有結合を形成する。３）カルボジイミド反応：カルボジイミドがコンジュゲーション反応の一方の成分上のカルボキシル基を活性化させ、活性化したカルボニル基が他方の成分上のアミノまたはヒドラジド基と反応する。これらの反応はまた、コンジュゲーション反応の前にコンジュゲートの成分を活性化するためにもしばしば用いられる。

還元的アミノ化は、肺炎連鎖球菌多糖をコンジュゲートさせるために利用されてきた。例えば、米国特許第８，１９２，７４６号、米国特許出願公開第２０１７００２１００６号、国際公開第２０１１／１１０３８１号および国際公開第２０１５／１１０９４１号を参照のこと。還元的アミノ化は、以下の２つの工程を含む：（１）抗原の酸化、および（２）当該抗原と担体タンパク質の還元によるコンジュゲートの形成。還元工程は水性溶媒またはＤＭＳＯのような非プロトン性溶媒中で行われ得る。例えば、国際公開第２０１６／１１３６４４号を参照のこと。

米国特許第８，１９２，７４６号 米国特許出願公開第２０１７００２１００６号 国際公開第２０１１／１１０３８１号 国際公開第２０１５／１１０９４１号 国際公開第２０１６／１１３６４４号

本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する多糖を含む免疫原性組成物であって、該多糖を該担体タンパク質にコンジュゲートさせるコンジュゲーション反応が非プロトン性溶媒中で行われる、免疫原性組成物を提供する。一実施形態において、同一の血清型を有する組成物に関して、非プロトン性溶媒中で調製された１つ以上の血清型は、水性条件下で調製された同じ１つ以上の血清型と比較したときに免疫原性が高い。

本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上から調製された多糖タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、該多糖タンパク質コンジュゲートが、非プロトン性溶媒中で該多糖を該担体タンパク質にコンジュゲートさせる工程を含むプロセスによって製造される、免疫原性組成物を提供する。

本発明はまた、肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆまたは３８に由来する多糖を担体タンパク質にコンジュゲートさせる方法であって、非プロトン性溶媒中で該多糖を該担体タンパク質にコンジュゲートさせる工程を含む方法を提供する。

本発明はまた、担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆまたは３８に由来する１つ以上の多糖を含む免疫原性組成物を用いて被検体を処置する方法であって、該多糖が非プロトン性溶媒中で該担体タンパク質にコンジュゲートされる、方法も提供する。

特定の実施形態において、肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆおよび１４の１つ以上に由来する多糖は、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる。特定の実施形態において、肺炎連鎖球菌血清型２、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する多糖は、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる。

特定の実施形態において、肺炎連鎖球菌血清型３および１８Ｃのうちの１つ以上に由来する多糖は、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる。この実施形態の１つの態様において、肺炎連鎖球菌血清型３に由来する多糖は、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる。この実施形態の１つの態様において、肺炎連鎖球菌血清型１８Ｃに由来する多糖は、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる。

特定の実施形態において、多糖を担体タンパク質にコンジュゲートさせるために使用されるコンジュゲーション反応は還元的アミノ化である。

特定の実施形態において、非プロトン性溶媒はＤＭＳＯである。

特定の実施形態において、担体タンパク質はＣＲＭ_１９７である。

特定の実施形態において、ＤＭＳＯ中で調製されたコンジュゲートは、５．０より大きいリシン損失値を有する。１つの態様において、ＤＭＳＯ中で調製されたコンジュゲートは、両端値を含む７．０〜１８．０のリシン損失値を有する。

特定の実施形態において、免疫原性組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１０Ａ、１５Ｂ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆのうちの１つ以上に由来する多糖を更に含み、該多糖を担体タンパク質にコンジュゲートさせるコンジュゲーション反応は、非プロトン性溶媒中で行われる。この実施形態の特定の態様において、コンジュゲーション反応は還元的アミノ化である。特定の態様において、非プロトン性溶媒はＤＭＳＯである。特定の態様において、担体タンパク質はＣＲＭ_１９７である。１つの態様において、免疫原性組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する多糖を含み、該肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆまたは２３Ｆに由来する多糖を該担体タンパク質にコンジュゲートさせるコンジュゲーション反応は、非プロトン性溶媒中で行われる。特定の態様において、多糖は肺炎連鎖球菌血清型１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆまたは２３Ｆ由来である。

特定の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する多糖を更に含み、該肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆまたは３８に由来する多糖を該担体タンパク質にコンジュゲートさせるコンジュゲーション反応は、水性溶媒中で行われる。１つの態様において、免疫原性組成物における血清型の３５〜１００％はＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートは水性条件下で調製される。

１つの特定実施形態において、本発明は、ＣＲＭ_１９７多糖にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖から本質的になる免疫原性組成物であって、該肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆのコンジュゲーション反応はＤＭＳＯ条件下で行われ、かつ、該肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆのコンジュゲーション反応は水性溶媒中で行われ、約０．２％ｗ／ｖのＰＳ−２０を更に含んでいてもよい免疫原性組成物を提供する。

本発明はまた、本発明の免疫原性組成物のいずれかを投与することを含む、ヒト被検体において防御的免疫応答を誘導するための方法を提供する。特定の実施形態において、被検体は、５０歳以上および／または免疫無防備状態である。特定の実施形態において、被検体は２歳以下である。特定の実施形態において、被検体は免疫無防備状態である。

本発明はまた、肺炎球菌多糖（ＰｎＰ）タンパク質コンジュゲートワクチンに対する増強された免疫応答を提供するための方法であって、１つ以上の担体タンパク質にコンジュゲートさせた２つ以上の肺炎連鎖球菌血清型の第一セットに由来する肺炎連鎖球菌莢膜多糖を含む多糖−タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を動物被検体に投与することを含み、該第一セットに由来する該多糖−タンパク質コンジュゲートの２つ以上が、ＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製される、方法を提供する。一実施形態において、前記増強された免疫応答は、第一セットに由来する２つ以上の多糖−タンパク質コンジュゲートのうちの１つ以上が水性条件下での還元的アミノ化を用いて調製される免疫原性組成物を与えられる対照動物に対するものである。一実施形態において、対照動物はマウスである。別の実施形態において、対照動物はヒトである。特定の実施形態において、本方法は、１つ以上の担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎球菌血清型の第二セットに由来する肺炎連鎖球菌莢膜多糖を含む更なる多糖−タンパク質コンジュゲートを含む肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンを使用するものであり、該多糖−タンパク質コンジュゲートは水性条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、第二セットに由来する血清型は第一セットの血清型とは異なる。

特定の実施形態において、本方法は、肺炎球菌血清型が血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８から選択される肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンを使用する。

特定の実施形態において、本方法は、血清型３または１８Ｃに由来する多糖−タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製される肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンを使用する。

特定の実施形態において、本方法は、肺炎球菌血清型の第一セットに由来する多糖−タンパク質コンジュゲートが血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから選択される肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンを使用する。

特定の実施形態において、本方法は、肺炎球菌血清型の第一セットに由来する多糖−タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製された血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを含み、血清型の第二セットに由来する多糖−タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンを使用する。

１つの特定実施形態において、本方法は、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する多糖−タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンを使用する。

特定の実施形態において、本方法は、血清型の３５〜１００％に由来する多糖タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンを使用する。１つの態様において、血清型の４５〜８０％に由来する多糖タンパク質コンジュゲートはＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートは水性条件下で調製される。別の態様において、血清型の７５〜１００％に由来する多糖タンパク質コンジュゲートはＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートは水性条件下で調製される。

特定の実施形態において、本方法は、担体タンパク質が髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、タンパク質ＤおよびＣＲＭ_１９７からなる群から選択される肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンを使用する。１つの態様において、担体タンパク質はＣＲＭ_１９７である。

特定の実施形態において、本方法は、ＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製されたコンジュゲートが、５．０より大きいタンパク質リシン損失値によって測定される場合、より高い割合の形成されたグリコペプチド結合を有する肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンを使用する。この実施形態の１つの態様において、ＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製されたコンジュゲートは、両端値を含む７．０〜１８のリシン損失値を有する。別の態様において、ＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製されたコンジュゲートは、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５または１０．０より大きいリシン損失値を有する。

別の特定実施形態において、本発明は、ＣＲＭ_１９７多糖にコンジュゲートさせた肺炎球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖から本質的になる肺炎球菌多糖（ＰｎＰ）タンパク質コンジュゲートワクチンに対する増強された免疫応答を提供するための方法であって、肺炎球菌血清型の第一セットおよび同第二セットに由来する多糖−タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物をヒト被検体に投与することを含み、血清型の第一セットが、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆからなり、かつ、ＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、血清型の第二セットが、１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆからなり、かつ、水性条件下で調製される、方法を提供する。

特定の実施形態において、本発明の方法によって産生された免疫原性組成物をワクチン接種された動物における増強された免疫応答は、血清ＩｇＧまたはオプソニン食作用性抗体の幾何平均力価によって測定される。１つの態様において、肺炎球菌血清型に対する増強された免疫応答は、水性条件下で調製された同じ肺炎球菌血清型に由来する多糖−タンパク質コンジュゲートと比較して１０％以上である。一実施形態において、動物はマウスである。別の実施形態において、動物はヒトである。

特定の実施形態において、本方法は、５０歳以上のヒト被検体に対して用いられる。特定の実施形態において、本方法は、２歳以下のヒト被検体に対して用いられる。特定の実施形態において、本方法は、免疫無防備状態のヒト被検体に対して用いられる。

本発明はまた、還元的アミノ化により肺炎球菌多糖−タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
ａ）血清型３、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌多糖をある量の酸化剤（例えば過ヨウ素酸塩）と反応させて、０．０５〜０．２２の活性化レベルを有する活性化多糖を形成し、
ｂ）任意選択的に還元剤の存在下で、非プロトン性溶媒中で活性化多糖を担体タンパク質と反応させて多糖−タンパク質コンジュゲートを形成することを含み、
コンジュゲートが両端値を含む７．０〜１８．０の範囲内のリシン損失値を有する、方法を提供する。

特定の実施形態において、活性化レベルは０．０９〜０．２２である。

特定の実施形態において、酸化剤は過ヨウ素酸塩である。

特定の実施形態において、活性化レベルは、チオセミカルバジドを用いて多糖上のアルデヒドを誘導体化することによって測定される。

特定の実施形態において、還元剤はシアノ水素化ホウ素ナトリウムなどのシアノ水素化ホウ素塩である。

特定の実施形態において、担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドおよびＣＲＭ_１９７からなる群から選択される。一実施形態において、担体タンパク質はＣＲＭ_１９７である。

本発明はまた、活性化多糖中のアルデヒドレベル（すなわち、過ヨウ素酸塩活性化レベル）を決定するための定量的方法であって、
ａ）完了する（すなわち、反応プラトー）まで誘導体化剤と反応させることによって活性化多糖を誘導体化して誘導体化多糖を形成する工程；
ｂ）（未反応誘導体化剤およびマトリックス成分を除去するために）高性能サイズ排除クロマトグラフィーにより誘導体化多糖を単離する工程；および
ｃ）誘導体化多糖のＵＶ吸光度を定量する工程
を含む方法を提供する。

誘導体化剤は、チオセミカルバジド、チオセミカルバジド構造類似体、ヒドラジド、ヒドラジン、セミカルバジド、セミカルバジド構造類似体、アミノオキシ化合物または芳香族アミンからなる群から選択することができる。

一実施形態において、工程ｃ）における定量化は、誘導体標準との比較による。一実施形態において、工程ｃ）における定量化は、所定の吸光係数に対する測定によるものである。

トリプシンペプチドマッピングにより決定された、ＣＲＭ_１９７上の異なるリシン部位でのコンジュゲーションの程度。水溶液中またはＤＭＳＯ中での還元的アミノ化によって調製された血清型１９ＡＰｓ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートをトリプシンによって消化し、ＬＣ−ＵＶ−ＭＳによって分析した。ＣＲＭ_１９７対照試料と比較したペプチドシグナルの損失をコンジュゲーション部位に対してプロットした。 水溶液中またはＤＭＳＯ中での還元的アミノ化によって調製された血清型３Ｐｓ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートを比較する、マウス試験群から得られた電気化学発光（ＥＣＬ）免疫原性の結果。リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）を配合したコンジュゲート。ワクチン接種前（Ｐｒｅ）および３回目の投与後（ＰＤ３）の結果が示されている。ＡＰＡのみの対照についての結果も示されている。 水溶液中またはＤＭＳＯ中での還元的アミノ化によって調製された血清型３Ｐｓ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートを比較する、マウス試験群から得られた３回目の投与後の食作用活性（ＯＰＡ）の結果。ワクチン接種前（免疫前）およびＡＰＡのみの対照についてのＯＰＡ結果も示す。

本発明は、少なくとも１つの肺炎球菌血清型に由来するコンジュゲートがＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製された肺炎球菌多糖−タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。本発明は、多糖−タンパク質コンジュゲートの還元的アミノ化の間に溶媒として使用されるＤＭＳＯが、水性条件下で調製された同じコンジュゲートと比較して、それらの血清型に関して予想外に優れた安定性および増強された免疫原性をもたらすという発見に部分的に基づく。本発明は、担体タンパク質の表面上にあるリシン残基の直接消費によって多糖のタンパク質への共有会合を増強する上でのＤＭＳＯ溶媒の利点に関する。試験した大半の血清型について、水性バッファー中よりも非プロトン性溶媒中でのコンジュゲーションによる方が、より低い多糖活性化レベル（０．０５〜０．２２）で、良好な免疫原性（≧７．０）を与える「リシン損失」を達成することができた。共有会合の増加は、多糖タンパク質コンジュゲートの安定性を増加させ、ＤＭＳＯ中でコンジュゲートさせたそれら特定の多糖抗原に対する免疫応答を増強する上で直接的な利益を有する。

いかなる理論にも縛られることなく、ＤＭＳＯ中で調製された複合糖質で観察される免疫原性増強のための１つの可能なメカニズムとして、担体タンパク質表面上にあるリシン残基と炭水化物（莢膜多糖）との結合数が増えると、タンパク質と多糖との結合点が増え、それによって安定性を付与すると共に、ペプチド炭水化物結合の破壊または化学的解重合を阻止することが挙げられる。例えば、Ｈｓｉｅｈ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ＣＲＭ_１９７ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ Ｂｒｏｗｎ Ｆ，Ｃｏｒｂｅｌ Ｍ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ Ｅ（ｅｄｓ）：Ｐｈｙｓｉｃｏ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，２０００，ｖｏｌ．１０３，ｐｐ．９３−１０４を参照のこと。ＤＭＳＯ溶媒中でのコンジュゲーション中に作成される多糖−タンパク質結合が増えることの更なる利点は、ペプチド−炭水化物のＴ細胞への提示が成功する可能性が増えることであり得る。ヒト集団における遺伝的可変性が炭水化物抗原にコンジュゲートさせた特定のペプチド配列との会合またはその使用（ｌｏａｄｉｎｇ）の感受性や能力の変動をもたらすにことに起因して、担体タンパク質上の結合点が増えることで、ＡＰＣ表面での抗原提示が成功する可能性が高まり、別種のＴ細胞非依存性抗原に対するＴ細胞依存性応答が可能となることが分かる。ＤＭＳＯ溶媒中でのコンジュゲーションによって観察される免疫原性増強のもう１つの可能なメカニズムは、有機溶媒中でのＣＲＭ_１９７変性に起因するものであり得る。この変性により、更なるリシンが多糖結合に供されて、ＡＰＣ表面でのグリコペプチド提示の可能性が高くなり、異なるペプチドエピトープに対するＴ細胞依存性応答が得られる。Ａｖｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７：１６０２−１６１０を参照のこと。

コンジュゲート中に変性ＣＲＭ_１９７を生成する有機溶媒中でのコンジュゲーションの更に別の利点は、天然のＣＲＭ_１９７エピトープに対する抗体の免疫学的干渉の減少であり得る。ＤＭＳＯ溶媒中でのコンジュゲーション中に作成される多糖−タンパク質結合増加の更なる利点は、より大きなサイズの多糖−タンパク質コンジュゲートが形成されて、免疫原性の増強をもたらすことであり得る。本発明の組成物は、ヒト応答を誘導する上で有意な利点を提供すると考えられている。

実施例５に示すように、ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を用いて肺炎連鎖球菌血清型３から調製された多糖タンパク質コンジュゲートは、（水中での還元的アミノ化を用いて調製された同じコンジュゲートと比較して）食作用活性（ＯＰＡ）によって測定されるマウスモデルでの免疫原性の増加を示した。更に、実施例６に示すように、ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を用いて調製された７つの血清型（および水性溶媒中で調製された他の８つの血清型）を有する１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチンは、１５の血清型全てが、水性溶媒中で調製された場合の対応する１５価ＰＣＶと比較して、ＤＭＳＯ中で調製された７つの血清型全てに関し、（統計学的有意性を有する優れた４つの血清型を持つ）ヒトにおいて優れた免疫原性を示す傾向があった。

実施例４に示されるように、（ＣＲＭ１９７対照と比較して）血清型１９Ａコンジュゲート中のＣＲＭ_１９７タンパク質上のリシン位置についてのペプチドシグナル減少を、可能なコンジュゲーション部位に対してプロットすることにより、以前に同定された一般的なヒトＴ細胞ペプチドエピトープに更なるコンジュゲーション部位があることが明らかになった（Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３２０７−３２１４を参照；ＣＲＭ_１９７配列のペプチド４１１〜４３０およびペプチド４３１〜４５０にある）。したがって、特定の実施形態において、本発明はまた、１つ以上の多糖−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、該多糖−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの少なくとも１つが非プロトン性溶媒中で調製され、かつ、非プロトン性溶媒中で調製されたコンジュゲートが、水性溶媒中で調製された同じコンジュゲートと比較して、ＣＲＭ_１９７のアミノ酸４１１〜４３０または４３１〜４５０におけるリシン残基のより大きなアクセシビリティを実証する、免疫原性組成物にも関する。特定の実施形態において、本発明はまた、１つ以上の多糖−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、該多糖−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの少なくとも１つが非プロトン性溶媒中で調製され、かつ、非プロトン性溶媒中で調製されたコンジュゲート中のＣＲＭ_１９７のアミノ酸４１１〜４３０または４３１〜４５０における１つ以上のリシン残基が１０％を超えてコンジュゲートされる、免疫原性組成物に関する。特定の実施形態において、本発明は、非プロトン性溶媒中で多糖をＣＲＭ_１９７にコンジュゲートさせることを含む、ＣＲＭ_１９７内、特にＣＲＭ_１９７のアミノ酸４１１〜４３０または４３１〜４５０におけるリシン残基のアクセシビリティを高める方法に関する。この実施形態の特定の態様において、非プロトン性溶媒中で調製されたコンジュゲート中のＣＲＭ_１９７のアミノ酸４１１〜４３０または４３１〜４５０における１つ以上のリシン残基は１０％を超えてコンジュゲートされる。これらの実施形態において、多糖は、免疫原性組成物を調製するのに適した任意の生物由来のものであり得る。特定の態様において、多糖は、髄膜炎菌または肺炎連鎖球菌由来のものである。多糖はこれら生物の任意の血清型に由来し得る。

本明細書で使用される際、用語「水性溶媒」または「水性条件」は、還元的アミノ化などのコンジュゲーションと共に使用される場合、コンジュゲーション反応のための溶媒としての水の使用を指す。有機溶媒が存在しないことを除いて、この水はバッファーおよび他の成分を含有してもよい。

本明細書で使用される際、用語「非プロトン性溶媒」は、還元的アミノ化のようなコンジュゲーションと共に使用される場合、コンジュゲーション反応のための溶媒としての、極性非プロトン性溶媒の使用または極性非プロトン性溶媒の組み合わせを指す。極性非プロトン溶媒の例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。非プロトン性溶媒には、例えば１％、２％、５％、１０％または２０％までのいくらかの水が存在していてもよい。

本明細書で使用される際、「ＤＭＳＯ溶媒」および「ＤＭＳＯ条件」は互換的に使用される。

本明細書で使用される際、用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、本発明の免疫原性組成物について用いる場合、アジュバントおよび賦形剤などの任意の他の成分の包含（抗原混合物に対する文言「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の制限を受ける）を指す。用語「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、多価多糖−タンパク質コンジュゲート混合物について用いる場合、混合物がそれらの特定の肺炎連鎖球菌多糖タンパク質コンジュゲートを有するが、異なる血清型に由来する他の肺炎連鎖球菌多糖タンパク質コンジュゲートは有さないことを指す。

本明細書で使用される際、「リシン損失」は、コンジュゲーション中のリシン消費量を指し、コンジュゲート中の平均測定リシン量と出発タンパク質中の予想リシン量との間の差によって決定される。実施例４は、「リシン損失」を決定するための一方法を記載する。

本明細書で使用される際、用語「多糖」は、免疫学的および細菌性ワクチンの分野で一般的に使用される任意の抗原性糖要素（または抗原性単位）を包含することを意味し、「糖」、「オリゴ糖」、「多糖」、「リポ糖」、「リポ−オリゴ糖（ＬＯＳ）」、「リポ多糖（ＬＰＳ）」、「グリコシレート」、「複合糖質」などを含むがこれらに限定されない。

非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中で調製される免疫原性組成物および水性条件下で調製される残りの多糖タンパク質コンジュゲート中の血清型のパーセンテージについて言及する場合、単に、非プロトン性溶媒中で調製された血清型の数を、組成物中の血清型の総数で割った数を指すことを意味する。

本明細書で使用される際、ｐＨ、温度および濃度などの全ての範囲は両端値を含むことを意味する。例えば、５．０〜９．０のｐＨ範囲は、５．０のｐＨおよび９．０のｐＨを含むことを意味する。同様に、４〜２５℃の温度範囲は、と当該範囲の外側限界、すなわち４℃および２５℃を含むことを意味する。

多糖
本発明の方法、すなわち非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化によって調製することができる肺炎連鎖球菌莢膜多糖は、血清型：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８を含むが、これらに限定されない。多糖は、オリゴ糖の形態で使用してもよい。これらは、精製された多糖の断片化によって（例えば加水分解によって）都合よく形成され、通常は、所望のサイズの断片の精製が続く。

特定の実施形態において、血清型１、２、３、４、５、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製される。特定の態様において、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆおよび１４のうちの１つ以上に由来する肺炎球菌多糖は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製される。特定の態様において、血清型２、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する肺炎球菌多糖は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製される。ある態様において、血清型３または１８Ｃの一方または両方に由来する肺炎球菌多糖は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて担体タンパク質にコンジュゲートされる。多価組成物中の他の血清型に由来する多糖は、水性溶媒中または非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いてコンジュゲートされていてもよい。また、多価組成物中の他の血清型に由来する多糖は、非プロトン性溶媒中または水性溶媒中で行われ得る他の化学を用いてコンジュゲートされてもよい。

肺炎連鎖球菌由来の莢膜多糖は、当業者に知られている標準的な技術によって調製することができる。例えば、多糖は細菌から単離することができ、既知の方法によって（例えば、欧州特許第４９７５２４号および同第４９７５２５号を参照）、および好ましくはホモジナイザーを用いて達成されるマイクロフルイダイズによって、または化学的加水分解によって、ある程度の大きさにサイジングすることができる。一実施形態において、各肺炎球菌多糖血清型は、大豆ベースの媒体中で増殖する。次に、遠心分離、沈殿および限外濾過を含む標準的な工程により個々の多糖を精製する。例えば、米国特許公開第２００８／０２８６８３８号および米国特許第５，８４７，１１２号を参照のこと。多糖試料中の粘度を低下させるために、および／または機械的または化学的サイジングなどの技術を用いてコンジュゲートさせた生成物の濾過性を向上させるために、多糖をサイジングすることができる。化学的加水分解は酢酸を用いて実施することができる。機械的サイジングは高圧均質化剪断を用いて実施することができる。

いくつかの実施形態において、コンジュゲーション前の精製多糖は、５ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの分子量を有する。分子量は、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）および屈折率検出器（ＲＩ）と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって計算することができる。他のかかる実施形態において、多糖は、１０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ〜７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ；１００〜４００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの、または２００ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量を有する。

精製多糖は、糖を担体タンパク質と反応させることができるように化学的に活性化することができる。精製多糖はリンカーに接続することができる。一旦活性化されるかまたはリンカーに接続されると、各莢膜多糖は別々に担体タンパク質にコンジュゲートされて複合糖質を形成する。多糖コンジュゲートは、既知のカップリング技術によって調製してもよい。

多糖をリンカーにカップリングさせて、リンカーの遊離末端がエステル基である多糖−リンカー中間体を形成することができる。したがって、リンカーは、少なくとも１つの末端がエステル基であるものである。他方の末端は、リンカーが多糖と反応して多糖−リンカー中間体を形成することができるように選択される。

多糖は、その中の第一級アミン基を使用してリンカーにカップリングすることができる。この場合、リンカーは典型的には両末端にエステル基を有する。これは、求核アシル置換により多糖中でエステル基の１つを第一級アミン基と反応させることによりカップリングを生じさせることを可能にする。反応は、多糖がアミド結合を介してリンカーにカップリングしている多糖−リンカー中間体をもたらす。したがって、リンカーは、多糖中の第一級アミン基と反応するための第一エステル基と、担体分子中の第一級アミン基と反応するための第二エステル基とを提供する二官能性リンカーである。典型的なリンカーはアジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル（ＳＩＤＥＡ）である。

カップリングはまた、間接的に、すなわちリンカーへのカップリングの前に多糖を誘導体化するために使用される更なるリンカーを用いても起こり得る。

多糖は、多糖の還元末端にあるカルボニル基を使用して更なるリンカーにカップリングされる。このカップリングは、（ａ１）カルボニル基を更なるリンカーと反応させ、（ａ２）更なるリンカーの遊離末端をリンカーと反応させるという２つの工程を含む。これらの実施形態において、更なるリンカーは典型的には両末端に第一級アミン基を有し、それによって還元アミノ化により第一級アミン基の１つを多糖中のカルボニル基と反応させることによって工程（ａ１）の実施を可能にする。多糖中のカルボニル基と反応性のある第一級アミン基が使用される。ヒドラジドまたはヒドロキシルアミノ基が適している。同じ第一級アミン基が、典型的には更なるリンカーの両末端に存在する。当該反応は、多糖が更なるリンカーにＣ−Ｎ結合を介してカップリングしている多糖−更なるリンカー中間体をもたらす。

多糖は、その中の異なる基、特にカルボキシル基を使用して更なるリンカーにカップリングすることができる。このカップリングは、（ａ１）当該基を更なるリンカーと反応させ、（ａ２）更なるリンカーの遊離末端をリンカーと反応させるという２つの工程を含む。この場合、更なるリンカーは典型的には両末端に第一級アミン基を有し、それにより第一級アミン基の１つを多糖中のカルボキシル基とＥＤＡＣ活性化によって反応させることにより工程（ａ１）の実施を可能にする。多糖中のＥＤＡＣ活性化カルボキシル基と反応性のある第一級アミン基が使用される。ヒドラジド基が適している。同じ第一級アミン基が、典型的には更なるリンカーの両末端に存在する。当該反応は、多糖が更なるリンカーにアミド結合を介してカップリングしている多糖−更なるリンカー中間体をもたらす。

一実施形態において、多糖の化学的活性化およびそれに続く還元的アミノ化による担体タンパク質へのコンジュゲーションは、米国特許第４，３６５，１７０号、同第４，６７３，５７４号および同第４，９０２，５０６号、米国特許公開第２００６／０２２８３８０号、同第２００７／１８４０７２号、同第２００７／０２３１３４０号および同第２００７／０１８４０７１号、ならびに国際公開第２００６／１１０３８１号、同第２００８／０７９６５３号および同第２００８／１４３７０９号）に記載されている手段によって達成することができる。化学は、過ヨウ素酸塩（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウムまたは過ヨウ素酸を含む）などの、末端ヒドロキシル基を酸化してアルデヒドにする任意の酸化剤との反応による肺炎球菌多糖の活性化を必要とする場合がある。当該反応は、反応性アルデヒド基を形成しつつ、炭水化物の隣接するヒドロキシル基のランダムな酸化的開裂をもたらす。

一実施形態では、０．０１〜１０．０、０．０５〜５．０、０．１〜１．０、０．５〜１．０、０．７〜０．８、０．０５〜０．５、０．１〜０．３モル当量の酸化剤と多糖を反応させる。一実施形態では、約０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５モル当量の酸化剤と多糖を反応させる。限定された多糖活性化を達成するべく、活性化のためにより少量の、例えば０．１〜０．３Ｍｅｑの過ヨウ素酸塩を使用する（例えば、多糖反復単位１モル当たり０．０５〜０．２２または０．０９〜０．２２モルのアルデヒド）ことが一般に好ましい。本明細書で使用される際、「活性化レベル」は、多糖反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル数を指す。多糖の活性化が少ないほど、より天然に近い多糖となる。すなわち、より少ないヒドロキシル基がアルデヒドに変換される。

別の実施形態において、酸化反応の期間は、１時間〜５０時間、１０時間〜３０時間、１５時間〜２０時間、１５時間〜１７時間、または約１６時間である。

別の実施形態において、酸化反応の温度は１５℃〜４５℃、１５℃〜３０℃、２０℃〜２５℃で維持される。別の実施形態において、反応の温度は約２３℃で維持される。

担体タンパク質へのカップリングは、当該タンパク質のリシル基への直接アミノ化による還元的アミノ化によって行われる。例えば、活性化多糖と担体タンパク質との混合物を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤と、ニッケルの存在下で反応させることによってコンジュゲーションが行われる。コンジュゲーション反応は、水溶液下またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下で起こり得る。例えば、米国特許公開第２０１５／０２３１２７０号および同第２０１１／０１９５０８６号ならびに欧州特許第ＥＰ０４７１１７７Ｂ１号を参照のこと。次いで、未反応アルデヒドを、水素化ホウ素ナトリウムなどの強力な還元剤の添加でキャッピングする。

還元的アミノ化は、（１）多糖を酸化して反応性アルデヒドを形成し、（２）活性化多糖と担体タンパク質との間に形成されたイミン（シッフ塩基）を還元して安定なアミン共役結合を形成するという２つの工程を含む。酸化の前に多糖をサイズ縮小させてもよい。機械的方法（例えば、均質化）または化学的加水分解を使用してもよい。化学的加水分解は酢酸を用いて実施することができる。酸化工程は過ヨウ素酸塩との反応を含み得る。本発明の目的のために、用語「過ヨウ素酸塩」は過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方を含む。この用語はまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ_４ ⁻）およびオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ_６ ⁻）の両方を含み、過ヨウ素酸塩の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム）を含む。一実施形態において、莢膜多糖は、メタ過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）の存在下で酸化される。別の実施形態において、莢膜多糖は、オルト過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは過ヨウ素酸の存在下で酸化される。

一実施形態において、酸化剤は、第一級ヒドロキシルを選択的に酸化する酸化剤の存在下で、安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物、例えば（国際公開第２０１４／０９７０９９号に記載されるような）ピペリジン−Ｎ−オキシまたはピロリジン−Ｎ−オキシ化合物である。前記反応において、実際の酸化剤は、触媒サイクルにおいてＮ−オキソアンモニウム塩である。１つの態様において、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ピペリジン−Ｎ−オキシまたはピロリジン−Ｎ−オキシ化合物である。１つの態様において、前記安定なニトロキシルまたはニトロキシドラジカル化合物は、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ）またはＰＲＯＸＹＬ（２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ）部分を有する。１つの態様において、前記安定なニトロキシルラジカル化合物はＴＥＭＰＯまたはその誘導体である。１つの態様において、前記酸化剤は、Ｎ−ハロ部分を有する分子である。１つの態様において、前記酸化剤は、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミド、ジクロロイソシアヌル酸、１，３，５−トリクロロ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジブロモイソシアヌル酸、１，３，５−トリブロモ−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオン、ジヨードイソシアヌル酸および１，３，５−トリヨード−１，３，５−トリアジナン−２，４，６−トリオンからなる群から選択される。

特定の態様において、酸化剤は、（国際公開第２０１４／０９７０９９号に記載されるような）共酸化剤としての２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）フリーラジカルおよびＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）である。したがって、１つの態様において、肺炎連鎖球菌由来の複合糖質は、ａ）水性溶媒中で２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）およびＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）と糖を反応させて活性化糖を生成し、ｂ）活性化された糖を、１つ以上のアミン基を含む担体タンパク質と反応させる工程を含む方法によって得られる（以下、前記方法を「ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ−還元的アミノ化」と呼ぶ）。

酸化反応は失活剤の添加により失活されてもよい。失活剤は、ビシナルジオール、１，２−アミノアルコール、アミノ酸、グルタチオン、亜硫酸塩、重硫酸塩、亜ジチオン酸塩、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜リン酸塩、次亜リン酸塩または亜リン酸（グリセロール、エチレングリコール、プロパン−１，２−ジオール、ブタン−１，２−ジオールまたはブタン−２，３−ジオール、アスコルビン酸など）から選択され得る。

コンジュゲーションプロセスの第二工程は、還元剤を用いて、活性化多糖と担体タンパク質とのイミン（シッフ塩基）結合を還元して安定なコンジュゲート結合を形成すること（いわゆる還元的アミノ化）である。適切な還元剤には、シアノ水素化ホウ素（シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素ナトリウムなど）が含まれる。一実施形態において、還元剤はシアノ水素化ホウ素ナトリウムである。

本発明の方法の特定実施形態において、還元的アミノ化反応は非プロトン性溶媒（または非プロトン性溶媒の混合物）中で行われる。一実施形態において、還元反応はＤＭＳＯ中またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で行われる。凍結乾燥される場合には、ＤＭＳＯまたはＤＭＦ溶媒を用いて活性化多糖および担体タンパク質を再構成することができる。一実施形態において、非プロトン性溶媒はＤＭＳＯである。

還元反応の終わりに、コンジュゲート中に未反応のアルデヒド基が残っている可能性があり、適切なキャッピング剤を用いてこれをキャッピングすることができる。一実施形態において、このキャッピング剤は水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_４）である。適切な代替物としては、ブレンステッド酸またはルイス酸の存在下でのトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素ナトリウムもしくは亜鉛、ピリジンボラン、２−ピコリンボラン、２，６−ジボラン−メタノール、ジメチルアミン−ボラン、ｔ−ＢｕＭｅ’ＰｒＮ−ＢＨ_３、ベンジルアミン−ＢＨ_３または５−エチル−２−メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）などのアミンボラン、または水素化ホウ素交換樹脂が挙げられる。コンジュゲーション（還元反応および任意選択的にキャッピング）に続いて、複合糖質を、当業者に知られている様々な技術によって精製してもよい（多糖−タンパク質コンジュゲートの量に関して濃縮してもよい）。これらの技術には、透析、濃縮／透析濾過操作、接線流濾過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルイオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー）、および深層濾過が含まれる。一実施形態において、複合糖質は、透析濾過またはイオン交換クロマトグラフィーもしくはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製される。

非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製された複合糖質は、一般に多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンにおいて使用される。したがって、全ての血清型が非プロトン性溶媒中で調製されるとは限らない多価組成物についての特定実施形態において、残りの血清型の還元反応は、水性溶媒（例えば、ｐＨ６．０〜８．５、７．０〜８．０、または７．０〜７．５で、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ、（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ビス−トリス、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ、Ｎ’）−ビス（２−エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ））プロパンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（３−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸）、ＭＯＢＳ（４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸））、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）、ビシンまたはＨＥＰＢから選択される）中で実施される。

いくつかの実施形態において、本発明の複合糖質は、１０ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの分子量を有する多糖を含む。他のかかる実施形態において、多糖は２５ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は７０ｋＤａ〜９００ｋＤａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は１００ｋＤａ〜８００ｋＤａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は、２００ｋＤａ〜６００ｋＤａの分子量を有する。更なるかかる実施形態において、多糖は１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜９００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜８００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜７００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜６００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜４００ｋＤａ；１００ｋＤａ〜３００ｋＤａ；１５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；１５０ｋＤａ〜９００ｋＤａ；１５０ｋＤａ〜８００ｋＤａ；１５０ｋＤａ〜７００ｋＤａ；１５０ｋＤａ〜６００ｋＤａ；１５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ；１５０ｋＤａ〜４００ｋＤａ；１５０ｋＤａ〜３００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜９００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜８００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜７００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜６００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜５００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜４００ｋＤａ；２００ｋＤａ〜３００；２５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜９００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜８００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜７００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜６００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ〜３５０ｋＤａ；３００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜９００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜８００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜７００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜６００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜５００ｋＤａ；３００ｋＤａ〜４００ｋＤａ；４００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ；４００ｋＤａ〜９００ｋＤａ；４００ｋＤａ〜８００ｋＤａ；４００ｋＤａ〜７００ｋＤａ；４００ｋＤａ〜６００ｋＤａ；５００ｋＤａ〜６００ｋＤａの分子量を有する。

いくつかの実施形態において、本発明の複合糖質は、１，０００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は１，０００ｋＤａ〜７，０００ｋＤａの分子量を有する。他のかかる実施形態において、多糖は１，０００ｋＤａ〜６，０００ｋＤａの分子量を有する。

特定の実施形態において、コンジュゲーション反応は還元的アミノ化によって行われ、ここでニッケルはより大きいコンジュゲーション反応効率のためおよび遊離シアン化物の除去を助けるために使用される。遷移金属は、シアン化物と安定な錯体を形成することが知られており、かつ、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いてタンパク質アミノ基およびホルムアルデヒドの還元的メチル化を改善することが知られている（Ｓ Ｇｉｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９８２，２０３：３３１−３３４；Ｊｅｎｔｏｆｔ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８０，１０６：１８６−１９０）。残留する阻害シアン化物を錯化することにより、ニッケルの添加は、コンジュゲーション中のタンパク質の消費を増加させ、より大きく、潜在的により免疫原性の高いコンジュゲートの形成をもたらす。

シアノ水素化ホウ素ナトリウム試薬ロット中の開始シアン化物レベルの差によっても、コンジュゲーション性能にばらつきが生じ、その結果、コンジュゲートサイズやコンジュゲートのＰｓ対ＣＲＭ_１９７比などの製品属性が変化する。ニッケルの添加は、シアン化物を錯化することによってコンジュゲーションのばらつきを減少させ、シアノ水素化ホウ素ナトリウムロット間の差を解消した。

適切な代替化学は、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）によって糖を活性化させて、シアネートエステルを形成することを含む。故に、活性化された糖は、直接的にまたはスペーサー（リンカー）基を介して担体タンパク質上のアミノ基にカップリングされ得る。例えば、スペーサーは、シスタミンまたはシステアミンであって、チオール化多糖を生じることができ、このチオール化多糖は、マレイミド活性化担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを用いて）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド［エチルヨードアセトイミドＨＣｌなど］またはＮ−スクシンイミジルブロモアセテートまたはＳＩＡＢまたはＳＩＡまたはＳＢＡＰを用いて）との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体にカップリングできる。例えば、シアネートエステル（ＣＤＡＰ化学によって作成されていてもよい）をヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングさせ、タンパク質担体上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（ＥＤＡＣまたはＥＤＣなど）化学を用いて、アミノ誘導体化した糖を担体タンパク質にコンジュゲートさせる。かかるコンジュゲートは、国際公開第９３／１５７６０号、同第９５／０８３４８号および同第９６／２９０９４号、ならびにＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４０：２４５−２５６に記載されている。

他の適切な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する。多くが国際公開第９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションはカルボニルリンカーを含んでいてもよく、このカルボニルリンカーは、糖の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとを反応させ（Ｂｅｔｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：２５７２−４；Ｈｅａｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９−１８を参照）、その後、タンパク質と反応させることによりカルバメート結合を形成することによって形成してもよい。これは、アノマー末端の第一級ヒドロキシル基への還元、第一級ヒドロキシル基の任意の保護／脱保護、第一級ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応によるＣＤＩカルバメート中間体の形成、およびＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含んでいてもよい。

莢膜多糖を担体タンパク質にコンジュゲートさせた後、多糖−タンパク質コンジュゲートを、様々な技術のうちの１つ以上によって精製する（多糖−タンパク質コンジュゲートの量に関して濃縮する）。これらの技術の例は当業者に周知であり、濃縮／透析濾過操作、限外濾過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィーおよび深層濾過を含む。例えば、米国特許第６，１４６，９０２号を参照のこと。

本発明の複合糖質を特徴付ける別の方法は、糖とコンジュゲートされるようになる担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ_１９７）中のリシン残基の数によるものであり、これは、コンジュゲートリシンの範囲（コンジュゲーション度）として特徴付けることができる。多糖への共有結合による、担体タンパク質のリシン修飾の証拠は、当業者に知られている日常的な方法を用いたアミノ酸分析によって得ることができる。コンジュゲーションは、コンジュゲート材料を生成するために使用される担体タンパク質出発材料と比較して、回収されるリシン残基数を減少させる。一実施形態において、本発明の複合糖質のコンジュゲーション度は、２〜１８、２〜１３、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、３〜１５、３〜１３、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、３〜４、５〜１８、５〜１３、７〜１８、７〜１３、８〜１８、８〜１３、１０〜１８または１０〜１３である。一実施形態において、本発明の複合糖質のコンジュゲーション度は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である。一実施形態において、本発明の複合糖質のコンジュゲーション度は７〜１８である。いくつかのかかる態様において、担体タンパク質はＣＲＭ_１９７である。

本発明の複合糖質はまた、糖対担体タンパク質の比（重量／重量）によっても特徴付けることもできる。いくつかの実施形態において、複合糖質中の多糖対担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は０．５〜３．０（約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、または約３．０など）である。他の実施形態において、糖対担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は、０．５〜２．０、０．５〜１．５、０．８〜１．２、０．５〜１．０、１．０〜１．５または１．０〜２．０である。更なる実施形態において、糖対担体タンパク質の比（ｗ／ｗ）は０．８〜１．２である。一実施形態において、コンジュゲート中の莢膜多糖対担体タンパク質の比は、０．９〜１．１である。いくつかのかかる態様において、担体タンパク質はＣＲＭ_１９７である。本発明の複合糖質および免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有結合されていない遊離糖を含有していてもよいが、それでもなお複合糖質組成物中に存在する。遊離糖は、複合糖質に非共有会合（つまり、非共有結合、吸着、またはその中にもしくはそれと共に捕捉）させてもよい。

一実施形態において、複合糖質は、多糖の総量と比較して、約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％または１５％未満の遊離多糖を含む。一実施形態において、複合糖質は、多糖の総量と比較して、約２５％未満の遊離多糖を含む。一実施形態において、複合糖質は、多糖の総量と比較して、約２０％未満の遊離多糖を含む。一実施形態において、複合糖質は、多糖の総量と比較して、約１５％未満の遊離多糖を含む。

多価多糖−タンパク質コンジュゲートワクチン
多価肺炎球菌免疫原性組成物は、１つ以上の担体タンパク質にコンジュゲートさせた１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８の少なくとも１つから選択される肺炎連鎖球菌血清型に由来する莢膜多糖を含むことができ、少なくとも１つの血清型に由来する多糖は、ＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製される。本発明は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５の血清型に由来する多糖を有する多価肺炎球菌免疫原性組成物を企図する。好ましくは、特定の血清型に由来する糖は、複数の担体タンパク質にコンジュゲートされていない。

特定の実施形態において、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５の血清型に由来する多糖は、ＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製される。

特定の実施形態において、血清型３、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆまたは２３Ｆのうちの１つ以上が、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製される。この実施形態の特定の態様において、血清型３または１８Ｃの一方または両方は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製される。

特定の実施形態において、多価組成物中の血清型の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％が非プロトン性溶媒中で調製される。残りの血清型は、代替化学を用いておよび／または水性溶媒中で調製される。

特定の実施形態において、血清型１、２、３、４、５、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製される。特定の態様において、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆおよび１４のうちの１つ以上は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製される。ある態様において、血清型２、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８の１つ以上は、非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製される。

一実施形態において、多価組成物は、ＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製された血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する多糖および水性溶媒中での還元的アミノ化を用いて調製された血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖からなる。

個々の複合糖質を精製した後、それらを配合して本発明の免疫原性組成物を配合する。これらの肺炎球菌コンジュゲートは、別個の方法によって調製され、単回投与配合物にバルクで配合される。

担体タンパク質
本発明の特定実施形態において、ＣＲＭ_１９７が担体タンパク質として使用される。ＣＲＭ_１９７は、ジフテリア毒素の非毒性変異体（すなわち、トキソイド）である。一実施形態において、ＣＲＭ_１９７は、カザミノ酸および酵母抽出物ベースの媒体で増殖させたジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）株Ｃ７（β１９７）の培養物から単離される。別の実施形態において、ＣＲＭ_１９７は、米国特許第５，６１４，３８２号に記載されている方法に従って組換え調製される。通常、ＣＲＭ_１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによって精製される。いくつかの実施形態において、ＣＲＭ_１９７は、Ｐｆｅｎｅｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）（Ｐｆｅｎｅｘ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）において調製される。

他の適切な担体タンパク質としては、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）またはＤＴ（ＤＴＦＢ）の断片Ｂ、ＴＴ（破傷風トキソイド）またはＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（例えば、国際公開第２００４／０８３２５１号に記載されているようなもの）、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａのような更なる不活化細菌毒素が挙げられる。細菌外膜タンパク質、例えば、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌の表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ；国際出願公開第０２／０９１９９８号参照）、肺炎球菌の吸着タンパク質（ＰｓａＡ）、Ａ群もしくはＢ群の連鎖球菌由来Ｃ５ａペプチダーゼ、またはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、肺炎球菌のニューモリシン（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３；２７０６−１３）（何らかの方法で無毒化されたｐｌｙ、例えば、ｄＰＬＹ−ＧＭＢＳ（国際公開第０４／０８１５１５号を参照）もしくはｄＰＬＹ−ｆｏｒｍｏｌ）、ＰｈｔＸ（ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥおよびＰｈｔタンパク質の融合体、例えば、ＰｈｔＤＥ融合体、ＰｈｔＢＥ融合体（国際公開第０１／９８３３４号および同第０３／５４００７号を参照））を使用することもできる。他のタンパク質、例えば、オボアルブミン、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もしくはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ＰｏｒＢ（髄膜炎菌由来）、ＰＤ（インフルエンザ菌のタンパク質Ｄ；例えば、欧州特許第０５９４６１０Ｂ号参照）、またはその免疫学的機能等価体、合成ペプチド（欧州特許第０３７８８８１号および同第０４２７３４７号参照）、熱ショックタンパク質（国際公開第９３／１７７１２号および同第９４／０３２０８号参照）、百日咳タンパク質（国際公開第９８／５８６６８号および欧州特許第０４７１１７７号参照）、サイトカイン、リンホカイン、成長因子もしくはホルモン（国際公開第９１／０１１４６号参照）、様々な病原体由来抗原から得られる複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：３８１６−３８２４を参照）、例えば、Ｎ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２：４８８４−７を参照）、鉄取込みタンパク質（国際公開第０１／７２３３７号を参照）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素ＡもしくはＢ（国際公開第００／６１７６１号参照）、ならびにフラジェリン（Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６４：９を参照）も担体タンパク質として使用できる。

他のＤＴ変異体、例えば、ＣＲＭ_１７６、ＣＲＭ_２２８、ＣＲＭ_４５（Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２１８：３８３８−３８４４）；ＣＲＭ_９、ＣＲＭ_４５、ＣＲＭ_１０２、ＣＲＭ_１０３およびＣＲＭ_１０７、ならびにＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅによってＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｏｘｉｎｓ，Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ，１９９２に記載された他の変異；Ｇｌｕ−１４８からＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＳｅｒへの、および／またはＡｌａ１５８からＧｌｙへの欠失または変異、ならびに米国特許第４，７０９，０１７号または第４，９５０，７４０号に開示された他の変異；残基Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０および／またはＬｙｓ５３４の少なくとも１つ以上の変異、ならびに米国特許第５，９１７，０１７号または第６，４５５，６７３号に開示された他の変異；あるいは米国特許第５，８４３，７１１号に開示された断片、を第二の担体タンパク質として使用することができる。また、かかるＤＴ変異体を使用して、Ｂ断片を含むＤＴＦＢ変異体にエピトープ領域を含有させることができる。

多価ワクチンを使用する場合、多価ワクチン中の抗原のうちの１つ以上に対して第二の担体を使用することができる。第二の担体タンパク質は、好ましくは非毒性かつ非反応原性であって、十分な量および純度で得られるタンパク質である。第二の担体タンパク質もまた、抗原の免疫原性を増強するために、抗原、例えば肺炎連鎖球菌多糖とコンジュゲートまたは接合している。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に従うべきである。一実施形態において、第一の担体タンパク質にコンジュゲートされていない各莢膜多糖を、同じ第二の担体タンパク質にコンジュゲートさせる（例えば、各莢膜多糖分子は単一の担体タンパク質にコンジュゲートされる）。別の実施形態において、第一の担体タンパク質にコンジュゲートしていない莢膜多糖を、２つ以上の担体タンパク質にコンジュゲートさせる（各莢膜多糖分子は単一の担体タンパク質にコンジュゲートされる）。かかる実施形態において、同じ血清型の各莢膜多糖は、典型的には、同じ担体タンパク質にコンジュゲートされる。

医薬／ワクチン組成物
本発明は更に、薬学的に許容される担体およびアジュバントと共に、上記の多糖血清型の組み合わせのいずれかを含む、それから本質的になる、またはそれからなる、医薬組成物、免疫原性組成物およびワクチン組成物を包含する組成物を更に提供する。

本発明の多糖−タンパク質コンジュゲートの配合は、当技術分野において認識されている方法を使用して達成することができる。例えば、個々の肺炎球菌コンジュゲートは、組成物を調製するために生理学的に許容されるビヒクルを配合することができる。かかるビヒクルの例としては、水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態において、ワクチン組成物は、塩化ナトリウムを含むＬ−ヒスチジンバッファーにて配合される。

本明細書で定義されるように、「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を増強するのに役立つ物質である。免疫アジュバントは、単独で投与されると免疫原性が弱い抗原に対する免疫応答を増強する、例えば、無もしくは弱い抗体力価または細胞性免疫応答を誘導し、抗原に対する抗体力価を高め、かつ／または個々における免疫反応を達成するのに効果的な抗原の用量を低減することができる。したがって、アジュバントは、しばしば免疫応答を高めるために投与され、当業者に周知である。組成物の有効性を増強するのに適するアジュバントとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。

（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム；
（２）水中油型乳剤配合物（ムラミルペプチド（以下に定義される）または細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激剤を含むまたは含まない）、例えば、（ａ）５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％Ｓｐａｎ８５を含有し（様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有していてもよい）、Ｍｏｄｅｌ１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、マサチューセッツ州ニュートン）などのマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に配合されたＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号）；（ｂ）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有し、サブミクロンの乳剤にマイクロフルイダイズされているか、またはボルテックスされてより大きな粒度の乳剤を生成するＳＡＦ；（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに米国特許第４，９１２，０９４号に記載の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ社、マサチューセッツ州ハミルトン）；ならびに（ｄ）Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ；
（３）サポニンアジュバント、例えば、Ｑｕｉｌ ＡもしくはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、マサチューセッツ州フレーミングハム）（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号を参照）が使用され得るか、またはこのアジュバントから生成される粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ（コレステロール、サポニン、リン脂質および両親媒性タンパク質の組み合わせによって形成される免疫刺激複合体）およびＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）（ＩＳＣＯＭと本質的に同じ構造を有するが当該タンパク質を含まない）；
（４）細菌リポ多糖、合成脂質Ａ類似体、例えばアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体もしくは類似体、Ｃｏｒｉｘａから入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている；かかる１つのＡＧＰは、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、５２９としても知られており（以前は、ＲＣ５２９として知られていた）、水性形態または安定な乳剤として配合されるものである；
（５）合成ポリヌクレオチド、例えば、（１または複数の）ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）；
（６）サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子Ｂ７−１およびＢ７−２；
（７）補体、例えば、補体成分Ｃ３ｄの三量体。

別の実施形態において、アジュバントは、上記のアジュバントの２、３またはそれ以上の混合物、例えば、ＳＢＡＳ２（３−脱アシル化モノホスホリル脂質ＡおよびＱＳ２１も含有する水中油型乳剤）である。

ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、アジュバントはアルミニウム塩である。アルミニウム塩アジュバントは、ミョウバン沈殿ワクチンまたはミョウバン吸着ワクチンであり得る。アルミニウム塩アジュバントは当技術分野において周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ（１９８８；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ならびにＮｉｃｋｌａｓ，Ｗ．（１９９２；Ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓａｌｔｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：４８９−４９３）に記載されている。アルミニウム塩としては、水和アルミナ、アルミナ水和物、アルミナ三水和物（ＡＴＨ）、アルミニウム水和物、アルミニウム三水和物、ヒドロゲル、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、Ａｍｐｈｏｇｅｌ、水酸化アルミニウム（ＩＩＩ）、硫酸ヒドロキシリン酸アルミニウム、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）、非晶質アルミナ、三水和アルミナ、またはトリヒドロキシアルミニウムが挙げられるが、これらに限定されない。

ＡＰＡは、ヒドロキシリン酸アルミニウムの水性懸濁液である。ＡＰＡは、塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムを１：１の容量比でブレンドし、ヒドロキシリン酸アルミニウムを沈殿させることによって製造される。ブレンドプロセスの後、その材料を高剪断ミキサーでサイズ縮小し、単分散粒度分布を達成する。次いで、生成物を生理食塩水に対して透析濾過し、蒸気滅菌する。

特定の実施形態において、市販のＡｌ（ＯＨ）_３（例えば、ニューヨーク州ウェストベリーにあるＤｅｎｍａｒｋ／Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓ）を使用して、タンパク質を、５０〜２００ｇタンパク質／ｍｇ水酸化アルミニウムの比率で吸着させる。タンパク質の吸着は、別の実施形態では、タンパク質のｐＩ（等電ｐＨ）および媒体のｐＨに依存する。ｐＩが低いタンパク質は、ｐＩが高いタンパク質よりも強く正電荷アルミニウムイオンに吸着される。アルミニウム塩は、２〜３週間にわたってゆっくりと放出される抗原の貯蔵部を確立し、マクロファージの非特異的活性化および補体活性化に関与し、かつ／または（おそらく尿酸の刺激により）先天性免疫機構を刺激し得る。例えば、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔら，２００９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：２３を参照のこと。

一価のバルク水性コンジュゲートは、典型的には一緒にブレンドし、目標の１６μｇ／ｍＬまで希釈する６Ｂ以外、全ての血清型を目標の８μｇ／ｍＬまで希釈する。希釈したら、バッチを濾過滅菌し、等容量のリン酸アルミニウムアジュバントを、目標とする最終アルミニウム濃度２５０μｇ／ｍＬまで無菌的に添加する。アジュバントを加えた配合バッチを、単回使用の０．５ｍＬ／用量バイアルに充填する。

特定の実施形態において、アジュバントは、ＣｐＧ含有ヌクレオチド配列、例えば、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、特に、ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）である。別の実施形態において、アジュバントは、Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯＤＮ１８２６である。

「ＣｐＧ含有ヌクレオチド」、「ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」、「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」および類似の用語は、非メチル化ＣｐＧ部分を含有する６〜５０ヌクレオチド長のヌクレオチド分子を指す。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：４２９７を参照のこと。別の実施形態では、この用語の任意の他の技術分野で認められた定義が意図される。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、任意の合成ヌクレオシド間結合を用いた修飾オリゴヌクレオチド、修飾塩基および／または修飾糖を含む。

ＣｐＧオリゴヌクレオチドの使用方法は当技術分野において周知であり、例えば、Ｓｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６２８４−９３；Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ，２００６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．１２７：１３９−５８；およびＹａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２３：８９−１１０に記載されている。

投与／投薬量
本発明の組成物および配合物は、全身経路または粘膜経路によりワクチンを投与することによって、感染、例えば肺炎球菌感染にかかりやすいヒトを保護または処置するために使用することができる。一実施形態において、本発明は、免疫学的有効量の本発明の免疫原性組成物をヒトに投与することを含む、肺炎連鎖球菌莢膜多糖コンジュゲートに対する免疫応答の誘導方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、免疫学的有効量の本発明の免疫原性組成物をヒトに投与する工程を含む、ヒトに肺炎球菌感染に対するワクチンを接種する方法を提供する。

特定のワクチンに最適な成分量は、被検体における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な試験によって確認することができる。例えば、別の実施形態において、ヒトへのワクチン接種のための投薬量は、動物試験をヒトのデータに外挿することによって決定される。別の実施形態において、この投薬量は経験的に決定される。このワクチンが乳児アカゲザルの動物データにおいて免疫原性であることを証明した。

本発明の組成物の「有効量」は、後の攻撃の間に、微生物、例えば肺炎連鎖球菌の感染の尤度または重症度を有意に低下させる抗体を誘導するのに必要とされる用量を指す。

本発明の方法は、侵襲性感染（髄膜炎、肺炎および菌血症）と非侵襲性感染（急性中耳炎および副鼻腔炎）の両方を含む、微生物、例えば肺炎連鎖球菌によって引き起こされる主要な臨床症候群の予防および／または軽減のために使用できる。

本発明の組成物の投与は、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下経路による注射；または口道／消化管、気道もしくは尿生殖路への粘膜投与のうちの１つ以上を含み得る。一実施形態において、鼻腔内投与は、肺炎または中耳炎の処置に使用される（肺炎球菌の鼻咽頭保菌をより効果的に予防し、それにより、最初期段階で感染を軽減することができるため）。

各ワクチン用量中のコンジュゲートの量は、著しい悪影響なしに免疫防御応答を誘導する量として選択される。かかる量は、肺炎球菌の血清型に応じて異なり得る。一般的に、多糖類をベースとするコンジュゲートについて、各用量は、各多糖を０．１〜１００μｇ、詳細には０．１〜１０μｇ、より詳細には１〜５μｇ含む。例えば、各用量は、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、または７５０ｎｇまたは１、１．５、２、３、４、５、６、７、７．５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００μｇを含み得る。

特定のワクチンに最適な成分量は、被検体における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な試験によって確認することができる。例えば、別の実施形態において、ヒトへのワクチン接種のための投薬量は、動物試験をヒトのデータに外挿することによって決定される。別の実施形態において、この投薬量は経験的に決定される。

一実施形態において、アルミニウム塩の用量は、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０、１００、１２５、１５０、２００、３００、５００もしくは７００μｇ、または１、１．２、１．５、２、３、５ｍｇ以上である。更に別の実施形態において、上記のミョウバン塩の用量は、組換えタンパク質１μｇ当たりの用量である。

本発明のいずれかの方法によれば、かつ、一実施態様において、被検体はヒトである。特定の実施形態において、ヒト被検体は乳児（１歳未満）、幼児（約１２〜２４ヶ月）または小児（約２〜５歳）である。他の実施形態において、ヒト被検体は高齢の被検体（例えば、５０歳を超えるまたは６５歳を超える）である。本発明の組成物はまた、年長児、青年および成人（例えば、１８〜４５歳または１８〜６５歳）での使用にも適している。

本発明の方法の一実施形態において、本発明の組成物は単回接種物として投与される。別の実施形態において、ワクチンは、十分に間隔をあけて、２回、３回、４回またはそれ以上投与される。例えば、当該組成物は、１、２、３、４、５もしくは６ヶ月間隔で、またはその任意の組み合わせの間隔で投与することができる。免疫化スケジュールは、肺炎球菌ワクチン用に指定されたものに従ったスケジュールであり得る。例えば、肺炎連鎖球菌によって引き起こされる侵襲性疾患に対する乳児および幼児の常套的なスケジュールは、年齢が２、４、６および１２〜１５ヶ月のときである。したがって、一実施形態において、組成物は、年齢が２、４、６および１２〜１５ヶ月のときに４回シリーズとして投与される。

本発明の組成物はまた、肺炎連鎖球菌に由来する１つ以上のタンパク質を含んでいてもよい。含むのに適した肺炎連鎖球菌タンパク質の例としては、国際公開第０２／０８３８５５号および同第０２／０５３７６１号に特定されているものが挙げられる。

配合物
本発明の組成物は、非経口的、経粘膜的、経皮的、筋肉内、静脈内、皮膚内、鼻内、皮下、腹腔内などの当業者に知られている１つ以上の方法によって被検体に投与され、それに応じて配合され得る。

一実施形態において、本発明の組成物は、液体製剤の表皮注射、筋肉内注射、静脈内、動脈内、皮下注射、または気道内粘膜注射により投与される。注射用の液体配合物には溶液などが含まれる。

本発明の組成物は、単回投与バイアル、複数回投与バイアルとして、またはプレフィルドシリンジとして配合することができる。

別の実施形態において、本発明の組成物は経口投与されるので、経口投与に適した形態で、すなわち固体または液体製剤として配合される。固体経口配合物としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレット剤などが挙げられる。液体経口配合物としては、液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、油剤などが挙げられる。

液体配合物用の薬学的に許容される担体は、水性もしくは非水性溶液、懸濁液、乳濁液または油である。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、乳液または懸濁液、例えば、生理食塩水および緩衝媒体が挙げられる。油の例は、動物性、植物性、または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の海産物油、または牛乳もしくは卵からの脂質である。

医薬組成物は、等張性、低張性または高張性であり得る。しかしながら、注入または注射用の医薬組成物は、投与時に本質的に等張性であることが好ましい場合が多い。したがって、保存のために、医薬組成物は、好ましくは等張性または高張性であり得る。医薬組成物が保存のために高張性である場合、投与前に等張液になるように希釈するのがよい。

等張剤は、塩などのイオン性等張剤であっても、炭水化物などの非イオン性等張剤であってもよい。イオン性等張化剤の例としては、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ_２、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ_２が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性等張化剤の例としては、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。

少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤がバッファーであることもまた好ましい。いくつかの目的のために、例えば、医薬組成物が注入または注射用である場合、この組成物はバッファーを含むことがしばしば望ましく、このバッファーは溶液を処理してｐＨ４〜１０、例えば５〜９（６〜８など）にすることができる。

バッファーは、例えば、ＴＲＩＳ、酢酸塩、グルタミン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、グリシン酸塩、ヒスチジン、グリシン、コハク酸塩およびトリエタノールアミンバッファーからなる群から選択してもよい。

更に、バッファーは、例えば、特に医薬配合物が非経口使用のためのものである場合、非経口使用のためのＵＳＰ適合バッファーから選択してもよい。例えば、バッファーは、一塩基酸、例えば、酢酸、安息香酸、グルコン酸、グリセリン酸および乳酸；二塩基酸、例えば、アコニット酸、アジピン酸、アスコルビン酸、炭酸、グルタミン酸、リンゴ酸、コハク酸および酒石酸；多塩基酸、例えば、クエン酸およびリン酸；ならびに、塩基、例えば、アンモニア、ジエタノールアミン、グリシン、トリエタノールアミンおよびＴＲＩＳ、からなる群から選択され得る。

非経口ビヒクル（皮下、静脈内、動脈内または筋肉内注射用）には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液および不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補給剤、リンゲルデキストロースをベースとするものなどの電解質補給剤などが含まれる。例は、界面活性剤および他の薬学的に許容されるアジュバントを添加したまたは添加していない、水や油などの無菌液体である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール、ポリソルベート８０（ＰＳ−８０）、ポリソルベート２０（ＰＳ−２０）、およびポロキサマー１８８（Ｐ１８８）が好ましい液体担体であり、特に注射液用である。油の例は、動物性、植物性、または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の海産物油、または牛乳もしくは卵からの脂質である。

本発明の配合物はまた界面活性剤を含有し得る。界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にＰＳ−２０およびＰＳ−８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商品名で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；オクトキシノール、これは反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が異なり、オクトキシノール−９（トリトンＸ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズなどのノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）のようなラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコール（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られる）から誘導されたポリオキシエチレン脂肪族エーテル；およびソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレートのようなソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして知られている）が挙げられるが、これらに限定されない。乳剤に包含させるのに好ましい界面活性剤はＰＳ−８０である。

ＰＳ−８０／スパン８５混合物などの界面活性剤の混合物を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＰＳ−８０）のようなポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のようなオクトキシノールの組み合わせも適している。別の有用な組み合わせは、ラウレス９と、ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールとを含む。

界面活性剤の好ましい量（重量％）は以下の通りである：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えばＰＳ−８０）０．０１〜１％、特に約０．１％。オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（トリトンＸ−１００、またはトリトンシリーズの他の洗剤など）０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％。ポリオキシエチレンエーテル（例えばラウレス９）０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％または約０．５％。

特定の実施形態において、組成物は、ヒスチジン（２０ｍＭ）、生理食塩水（１５０ｍＭ）、およびｐＨ５．８の０．０２％ＰＳ−２０または０．０４％ＰＳ−８０と、２５０μｇ／ｍＬのＡＰＡ（リン酸アルミニウムアジュバント）とから本質的になる。ＰＳ−２０は、模擬製造中および一次包装を使用した出荷中の配合制御凝集においてＰＳ−２０またはＰＳ−８０の存在下で０．００５％〜０．１％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。プロセスは、ヒスチジン、生理食塩水、およびＰＳ−２０またはＰＳ−８０中の最大２４の血清型のブレンドを組み合わせ、次いで抗菌防腐剤を用いてまたは用いずにこのブレンド材料をＡＰＡおよび生理食塩水と組み合わせることからなる。

界面活性剤の選択は、異なる医薬品および原薬に対して最適化する必要があり得る。１５種以上の血清型を有する多価ワクチンについては、ＰＳ−２０およびＰ１８８が好ましい。コンジュゲートを製造するために使用される化学の選択もまた配合物の安定化において重要な役割を果たし得る。特に、多価組成物中の異なる多糖タンパク質コンジュゲートを調製するために使用されるコンジュゲーション反応が水性溶媒およびＤＭＳＯ溶媒の両方を含む場合、特定の界面活性剤系が安定性に有意な差をもたらすことを見出した。ポリソルベートタンパク質コンジュゲートの改善された安定性は、ポリソルベート２０単独で、またはポリオールと組み合わせたポロキサマー１８８で見られた。

特定の洗剤がどのように生物学的薬物を保護するかの正確なメカニズムはよく分かっておらず、先験的に予測することはできない。可能な安定化メカニズムには、優先的水和、優先的排除、生物学的薬物と表面との間の空気／液体界面の競合、表面張力、および／または凝集の種として働く疎水性パッチを隠すための生物学的薬剤との界面活性剤の直接会合が含まれる。

ポロキサマーも本発明の組成物に使用することができる。ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖が隣接したポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロックコポリマーである。ポロキサマーは、商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）としても知られている。ポリマーブロックの長さをカスタマイズすることができるので、わずかに異なる特性を有する多くの異なるポロキサマーが存在する。一般用語「ポロキサマー」について、これらのコポリマーは、一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）とそれに続く３桁の数字で表記され、最初の２桁の数字×１００はポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を示す。最後の桁の数字×１０はポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを示す（例えば、Ｐ４０７＝４，０００ｇ／ｍｏｌのポリオキシプロピレン分子質量および７０％ポリオキシエチレン含有量を有するポロキサマー）。商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の場合、これらのコポリマーのコーディングは、室温でのその物理的形態を定義するための文字（Ｌ＝液体、Ｐ＝ペースト、Ｆ＝フレーク（固体））で始まり、２桁または３桁の数字が続く。数値表示の最初の桁の数字（３桁の数字のうちの２桁の数字）に３００を掛けたものが、疎水性物質のおおよその分子量を示し、最後の桁の数字×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを示す（例えば、Ｌ６１＝１，８００ｇ／ｍｏｌのポリオキシプロピレン分子質量および１０％ポリオキシエチレン含有量を有するＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））。米国特許第３７４０４２１号を参照のこと。

ポロキサマーの例は、以下の一般式を有する：
ＨＯ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａＨ
式中、ａブロックおよびｂブロックは以下の値を有する：
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） ポロキサマー ａ ｂ 分子量
Ｌ３１ ２ １６ １１００（平均）
Ｌ３５ １９００（平均）
Ｌ４４ＮＦ １２４ １２ ２０ ２０９０〜２３６０
Ｌ６４ ２９００（平均）
Ｌ８１ ２８００（平均）
Ｌ１２１ ４４００（平均）
Ｐ１２３ ２０ ７０ ５７５０（平均）
Ｆ６８ＮＦ １８８ ８０ ２７ ７６８０〜９５１０
Ｆ８７ＮＦ ２３７ ６４ ３７ ６８４０〜８８３０
Ｆ１０８ＮＦ ３３８ １４１ ４４ １２７００〜１７４００
Ｆ１２７ＮＦ ４０７ １０１ ５６ ９８４０〜１４６００
本明細書で使用される場合、分子量単位はダルトン（Ｄａ）またはｇ／ｍｏｌである。

好ましくは、ポロキサマーは一般に、１１００〜１７，４００Ｄａ、７，５００〜１５，０００Ｄａ、または７，５００〜１０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。ポロキサマーは、ポロキサマー１８８またはポロキサマー４０７から選択することができる。配合物中のポロキサマーの終濃度は、０．００１％〜５％重量／容量、または０．０２５％〜１％重量／容量である。特定の態様において、ポリオールはプロピレングリコールであり、１％〜２０％重量／容量の終濃度である。特定の態様において、ポリオールはポリエチレングリコール４００であり、１％〜２０％重量／容量の終濃度である。

本発明の配合物に適したポリオールは、ポリマーポリオール、特に、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルを含むがこれらに限定されないポリエーテルジオールである。プロピレングリコールは、〜４２５から〜２７００までのモノマー分子量範囲で入手可能である。ポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールモノメチルエーテルもまた、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ ＭＭＥ ５５０、ＰＥＧ ＭＭＥ ６００、ＰＥＧ ＭＭＥ ２０００、ＰＥＧ ＭＭＥ３３５０およびＰＥＧ ＭＭＥ ４０００を含む（がこれらに限定されない）〜２００から〜３５０００までの範囲の分子量範囲で入手可能である。好ましいポリエチレングリコールはポリエチレングリコール４００である。本発明の配合物中のポリオールの終濃度は、１％〜２０％重量／容量または６％〜２０％重量／容量であってもよい。

配合物はまた、ｐＨ緩衝生理食塩水を含有する。バッファーは、例えば、ＴＲＩＳ、酢酸塩、グルタミン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、グリシン酸塩、ヒスチジン、グリシン、コハク酸塩、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）およびトリエタノールアミンバッファーからなる群から選択してもよい。バッファーは、溶液を処理して４〜１０、５．２〜７．５、または５．８〜７．０の範囲のｐＨにすることができる。本発明のある態様において、バッファーは、リン酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、酢酸塩またはクエン酸塩からなる群から選択される。更に、バッファーは、例えば、特に医薬配合物が非経口用である場合、非経口用途のためのＵＳＰ適合バッファーから選択してもよい。バッファーの濃度は、１ｍＭ〜５０ｍＭまたは５ｍＭ〜５０ｍＭ範囲であろう。特定の態様において、バッファーは、終濃度が５ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジン、または終濃度が１ｍＭ〜１０ｍＭコハク酸塩である。特定の態様において、ヒスチジンは終濃度が２０ｍＭ±２ｍＭである。

生理食塩水（すなわち、ＮａＣｌを含有する溶液）が好ましいが、配合物に適した他の塩には、ＣａＣｌ_２、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ_２、ならびにそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ショ糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含むがこれらに限定されない非イオン性等張化剤を塩の代わりに使用することができる。適切な塩の範囲としては、２５ｍＭ〜５００ｍＭまたは４０ｍＭ〜１７０ｍＭが挙げられるが、これらに限定されない。１つの態様において、生理食塩水はＮａＣｌであり、２０ｍＭ〜１７０ｍＭ濃度で存在してもよい。

一実施形態において、配合物は塩化ナトリウムを含むＬ−ヒスチジンバッファーを含む。

本明細書に記載の配合物の特定実施形態において、多糖−タンパク質コンジュゲートは、担体タンパク質にコンジュゲートさせた１つ以上の肺炎球菌多糖を含む。担体タンパク質は、ＣＲＭ_１９７、ジフテリア毒素断片Ｂ（ＤＴＦＢ）、ＤＴＦＢＣ８、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴの断片Ｃ、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、緑膿菌由来の外毒素Ａ、およびそれらの組み合わせから選択することができる。１つの態様において、全ての多糖−タンパク質コンジュゲートは水溶性化学（ｃｈｅｍｉｓｔｙ）を用いて調製される。別の態様において、１つ以上の多糖タンパク質コンジュゲートは、ＤＭＳＯ溶媒を用いて調製される。一例として、多糖−タンパク質コンジュゲート配合物は、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する多糖タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ溶媒を用いて調製され、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖タンパク質コンジュゲートが水性溶媒を用いて調製される１５価肺炎球菌コンジュゲート（１５ｖＰｎＣ）配合物であり得る。

別の実施形態において、医薬組成物は徐放系で送達される。例えば、薬剤は、静脈内注入、経皮パッチ、リポソームまたは他の投与様式を用いて投与することができる。別の実施形態において、ポリマー材料は、例えばミクロスフェア中またはインプラント中で使用される。

本発明の組成物はまた、肺炎連鎖球菌に由来する１つ以上のタンパク質を含んでいてもよい。含むのに適した肺炎連鎖球菌タンパク質の例としては、国際公開第０２／０８３８５５号および同第０２／０５３７６１号に特定されているものが挙げられる。

添付の説明および図面を参照して本発明の様々な実施形態を説明したが、本発明はそれらの正確な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲に定義されるような本発明の範囲または精神から逸脱することなく、当業者によって様々な変更および修正が行われ得ることを理解されたい。

以下の実施例が例証されるが、本発明を限定するものではない。

［実施例］
実施例１：肺炎連鎖球菌莢膜多糖の調製
肺炎球菌の培養方法は当技術分野において周知である。例えば、Ｃｈａｓｅ，１９６７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １：５２を参照のこと。肺炎球菌莢膜多糖の調製方法もまた当該分野で周知である。例えば、欧州特許第０４９７５２４号を参照のこと。肺炎球菌サブタイプの分離菌は、アメリカ培養細胞系統保存機関（バージニア州マナッサス）から入手可能である。当該細菌は、莢膜を有し、非運動性であり、グラム陽性であり、ランセット形状の双球菌（血液寒天上でα−溶血性である）として同定される。サブタイプは、特異的抗血清を用いたＱｕｅｌｌｉｎｇ反応に基づいて識別することができる。例えば、米国特許第５，８４７，１１２号を参照のこと。

存在する各肺炎連鎖球菌血清型を表す細胞バンクを、Ｍｅｒｃｋ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ニュージャージー州ローウェー）から凍結バイアルにて入手した。解凍した種培養物を、肺炎連鎖球菌に適切な予備滅菌した増殖媒体を入れた種発酵槽に移した。培養物を温度およびｐＨ制御しながら種発酵槽中で増殖させた。種発酵槽の全容量を、予備滅菌した増殖媒体を入れた生産発酵槽に移した。生産発酵は、プロセスの最後の細胞増殖段階であった。温度、ｐＨおよび攪拌速度を制御した。

不活化剤の添加により発酵プロセスを終了させた。不活化後、バッチを不活化タンクに移し、制御された温度および攪拌下で保持した。遠心分離と濾過の組み合わせを用いて細胞残屑を除去した。バッチを限外濾過および透析濾過した。次いで、バッチを溶媒での分別に供し、これによって不純物を除去し、多糖を回収した。

実施例２：水溶液中での還元アミノ化を用いた血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３ＦのＣＲＭ_１９７へのコンジュゲーション
異なる多糖血清型を、一般的なプロセスフローを用いて、精製ＣＲＭ_１９７担体タンパク質に個々にコンジュゲートさせる。多糖を溶解させ、サイズ縮小させ、化学的に活性化させ、限外濾過によってバッファー交換する。次いで、精製ＣＲＭ_１９７を、反応混合物中のＮｉＣｌ_２（２ｍＭ）を利用して活性化多糖にコンジュゲートさせ、得られたコンジュゲートを、限外濾過によって精製した後、０．２ミクロンフィルターで最終濾過した。ｐＨ、温度、濃度および時間などの各工程内のいくつかのプロセスパラメータは、以下の章では血清型特異的な値に制御される。

多糖のサイズ縮小および酸化
精製した肺炎球菌莢膜多糖粉末を水に溶解し、血清型１９Ａを除く全ての血清型を０．４５ミクロンフィルターで濾過した。血清型１９Ａを除く全ての血清型を均質化して多糖の分子質量を減少させた。血清型１９Ａは、その開始サイズが比較的小さいので、サイズ縮小させなかった。血清型特異的分子質量を達成するために、均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数を、血清型特異的目標値（１５０〜１０００ｂａｒ；４〜７回通過）に制御した。サイズ縮小させた多糖を０．２ミクロンフィルターで濾過し、次いで濃縮し、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対して透析濾過した。

次に、多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで血清型特異的温度（４〜２２℃）およびｐＨ（４〜５）に調整して、活性化による多糖のサイズ減少を最小限に抑えた。全ての血清型（血清型４を除く）について、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加して多糖活性化を開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、血清型特異的であり、多糖反復単位１モル当たりメタ過ヨウ素酸ナトリウム約０．１〜０．５モルの範囲であった。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの血清型特異的電荷は、目標レベルの多糖活性化を達成することであった（多糖反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル数）。血清型４については、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加する前に、バッチを約５０℃およびｐＨ４．１でインキュベートして多糖を部分的に脱ケタール化した。

血清型５および７Ｆを除く全ての血清型について、活性化生成物を、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対して透析濾過した。血清型５および７Ｆを１０ｍＭ酢酸ナトリウムに対して透析濾過した。全ての血清型についての限外濾過は、２〜８℃で行われた。

ＣＲＭ_１９７への多糖のコンジュゲーション
酸化した多糖溶液を、血清型に応じて、水および１．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０またはｐＨ７．０）と混合した。選択したバッファーのｐＨは、コンジュゲーション反応中の活性化多糖の安定性を改善するためのものであった。前述のように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、シュードモナス・フルオレッセンスでの発現により得られた精製ＣＲＭ_１９７を０．２ミクロンフィルターで濾過し、血清型に応じて０．４〜１．０ｗ／ｗの範囲の多糖対ＣＲＭ_１９７質量比で緩衝多糖溶液と組み合わせた。得られたコンジュゲートにおける多糖対ＣＲＭ_１９７比を制御するために質量比を選択した。多糖濃度およびリン酸濃度は、血清型特異的であり、血清型に応じてそれぞれ３．６〜１０．０ｇ／Ｌおよび１００〜１５０ｍＭ範囲であった。得られたコンジュゲートのサイズを制御するべく、血清型特異的多糖濃度を選択した。次いで、溶液を０．２ミクロンフィルターで濾過した。１００ｍＭ塩化ニッケル溶液を用いて塩化ニッケルを約２ｍＭまで加えた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を添加した。コンジュゲーションを血清型特異的期間（７２〜１２０時間）進行させて、多糖およびタンパク質の消費を最大にした。

水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲーション反応後、バッチを約３．５ｇ／Ｌの多糖濃度まで希釈し、２〜８℃に冷却し、１．２ミクロンフィルターで濾過した。全ての血清型（血清型５を除く）を、１００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２〜８℃で１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）に対して透析濾過した。次いで、保持液中に回収されたバッチを、約２．０ｇ多糖／Ｌまで希釈し、１．２Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．４）の添加によりｐＨ調整した。水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を添加した。１．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０）を後で加えた。１００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、血清型５を３００ｍＭリン酸カリウムに対して透析濾過した。

最終濾過および製品保存
次に、バッチを濃縮し、３００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して４℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中１０ｍＭ Ｌ−ヒスチジンに対して透析濾過した。保持液バッチを０．２ミクロンフィルターで濾過した。

血清型１９Ｆコンジュゲートを２２℃で約７日間インキュベートし、１００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、４℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中１０ｍＭ Ｌ−ヒスチジンに対して透析濾過し、０．２ミクロンフィルターで濾過した。

バッチを、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の更なる１０ｍＭ Ｌ−ヒスチジンを用いて、１．０ｇ／Ｌの多糖濃度に調整した。バッチをアリコートに分注し、≦−６０℃で凍結した。

実施例３：ジメチルスルホキシド中での還元アミノ化を用いた血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３ＦのＣＲＭ_１９７へのコンジュゲーション方法
異なる多糖血清型３、４、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを、一般的なプロセスフローを用いて、精製ＣＲＭ_１９７担体タンパク質に個々にコンジュゲートさせる。多糖を溶解させ、目標とする分子質量にサイジングし、化学的に活性化させ、限外濾過によってバッファー交換する。活性化多糖および精製ＣＲＭ_１９７を個々に凍結乾燥させ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再溶解させた。次いで、再溶解した多糖溶液およびＣＲＭ_１９７溶液を下記のように組み合わせてコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートを限外濾過によって精製し、その後、０．２ミクロンフィルターで最終濾過を行った。ｐＨ、温度、濃度および時間などの各工程内のいくつかのプロセスパラメータは、以下の章では血清型特異的な値に制御される。

多糖のサイズ縮小および酸化
精製した肺炎球菌莢膜Ｐｓ粉末を水に溶解し、血清型１９Ａを除く全ての血清型を０．４５ミクロンフィルターで濾過した。血清型１８Ｃおよび１９Ａを除く全ての血清型を均質化してＰｓの分子質量を減少させた。均質化圧力およびホモジナイザーを通過する回数は、血清型特異的目標値（１５０〜１０００ｂａｒ；４〜７回の通過）に制御された。血清型１８Ｃは、９０℃以上での酸加水分解によりサイズ縮小された。

サイズ縮小させた多糖を０．２ミクロンフィルターで濾過し、次いで濃縮し、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して水に対して透析濾過した。５ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を血清型１８Ｃのために使用した。

次に、多糖溶液を酢酸ナトリウムバッファーで血清型特異的温度（４〜２２℃）およびｐＨ（４〜５）に調整して、活性化による多糖のサイズ減少を最小限に抑えた。全ての血清型（血清型４を除く）について、１００ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加して多糖活性化を開始した。添加したメタ過ヨウ素酸ナトリウムの量は、血清型特異的であり、多糖反復単位１モル当たりメタ過ヨウ素酸ナトリウム約０．１〜０．５モルの範囲であった。メタ過ヨウ素酸ナトリウムの血清型特異的電荷は、目標レベルの多糖活性化を達成することであった（多糖反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル数）。血清型４については、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加する前に、バッチを約５０℃およびｐＨ４．１でインキュベートして多糖を部分的に脱ケタール化した。

活性化生成物を、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．４）に対して透析濾過し、次いで、１０ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を使用して水に対して透析濾過または透析した。５ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を血清型１８Ｃのために使用した。全ての血清型についての限外濾過または透析は、２〜８℃で行われた。

ＣＲＭ_１９７への多糖のコンジュゲーション
以前に記載されたように（国際公開第２０１２／１７３８７６号）、シュードモナス・フルオレッセンスでの発現を通して得られた精製ＣＲＭ_１９７を、５ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して２〜５ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）バッファーに対して透析濾過し、０．２ミクロンフィルターで濾過した。

血清型３以外の血清型については、酸化多糖を水中において６ｍｇ Ｐｓ／ｍＬおよび５％ｗ／ｖショ糖（５０ｍｇショ糖／ｍＬ）で配合した。血清型３については、酸化多糖を水中において２ｍｇ Ｐｓ／ｍＬおよび１０％ｗ／ｖショ糖（１００ｍｇショ糖／ｍＬ）で配合した。タンパク質溶液を、リン酸バッファー中において６ｍｇ Ｐｒ／ｍＬおよび１％ｗ／ｖショ糖（１０ｍｇショ糖／ｍＬ）で配合した。

配合したＰｓおよびＣＲＭ_１９７溶液を個々に凍結乾燥した。凍結乾燥したＰｓおよびＣＲＭ_１９７材料をＤＭＳＯに再溶解し、混合ティーを用いて組み合わせた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり１モル）を添加し、コンジュゲーションを血清型特異的期間（１〜４８時間）進行させて、目標とするコンジュゲートサイズを達成した。

水素化ホウ素ナトリウムによる還元
コンジュゲーション反応後に、水素化ホウ素ナトリウム（多糖反復単位１モル当たり２モル）を添加した。約４℃で約０．０２５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０を用いてまたは用いずに、バッチを１５０ｍＭ塩化ナトリウム中に希釈した。次に、リン酸カリウムバッファーを加えてｐＨを中和した。血清型３、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆについては、バッチを濃縮し、３０ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、約４℃で２５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７）を用いてまたは用いずに、１５０ｍＭ塩化ナトリウムに対して透析濾過した。

最終濾過および製品保存
血清型３、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１８Ｃ、１９Ａ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを濃縮し、３００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して、４℃で０．０１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を用いてまたは用いずに、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中１０ｍＭヒスチジンに対して透析濾過した。保持液バッチを０．２ミクロンフィルターで濾過した。

血清型１９Ｆを約５日間インキュベートし、３００ｋＤａのＮＭＷＣＯ接線流限外濾過膜を使用して約４℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中１０ｍＭヒスチジンに対して透析濾過し、０．２ミクロンフィルターで濾過した。

血清型３、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆを、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中の更なる１０ｍＭヒスチジンで希釈し、アリコートに分注し、≦−６０℃で凍結した。

血清型４および１４を、３００ｋＤａのＮＭＷＣＯ膜を使用して、約４℃で１５０ｍＭ塩化ナトリウムに対して透析し、０．２ミクロンフィルターで濾過し、アリコートに分注し、≦−６０℃で凍結した。

実施例４：コンジュゲートの分析
ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩアッセイを用いたコンジュゲートの分子量および濃度分析
コンジュゲート試料を注入し、高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）によって分離した。検出は、直列の紫外線（ＵＶ）、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）および屈折率（ＲＩ）検出器を用いて達成された。タンパク質濃度は、吸光係数を用いてＵＶ２８０から計算した。溶液の屈折率の変化と溶質濃度の変化（ｍＬ／ｇで報告）であるｄｎ／ｄｃ係数を使用して、多糖濃度をＲＩシグナル（タンパク質と多糖の両方によって寄与）からデコンボリュートした。試料の平均分子量は、全試料ピークにわたる測定濃度および光散乱情報を使用して、Ａｓｔｒａソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サンタバーバラ）により計算した。

多糖活性化度アッセイ
コンジュゲーションは、活性化アルデヒドと、主に担体タンパク質上のリシン残基との還元的アミノ化によって生じる。多糖反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル数で表される活性化のレベルは、コンジュゲーション反応を制御するために重要である。活性化度を測定するためのアッセイは、米国特許公開第２０１７／００２１００６号に記載されている。

アルデヒド基（多糖の過ヨウ素酸塩酸化中に生成される）とチオセミカルバジド（商業的供給源から入手可能）との反応に基づいて活性化度を測定するために内部アッセイを開発した。

定量化は、ＮＭＲ（核磁気共鳴）によって、または誘導体化多糖を適切な参照標準と比較することによって、および／または誘導体の吸光係数を使用することによって達成することができる。このアッセイの吸光係数の使用は、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩ法での使用と似ている。

一般に、アッセイは、以下の反応条件下で実行することができる。

時間：０．５時間〜３５時間（これは血清型特異的であるが、反応は完了まで、すなわち時間経過においてプラトーになるまで続けられる）
温度：１５〜３７℃、好ましくはおよそ２１〜２７℃
ＴＳＣ濃度：１〜５ｍｇ／ｍＬ
反応のｐＨ：ｐＨ３〜５．５、好ましくは４．０
実施例４については、多糖を１．２５〜２．５ｍｇ／ｍＬのチオセミカルバジド（ＴＳＣ）を用いてｐＨ４．０で誘導体化して発色団を導入した（血清型１、５、および９Ｖ用の活性化多糖の誘導体化は１．２５ｍｇ／ｍＬのＴＳＣを使用）。誘導体化反応をプラトーに達するまで進行させた。実際の時間は、各血清型の反応速度に応じて異なった。次いで、ＴＳＣ−Ｐｓを、高性能サイズ排除クロマトグラフィーによってＴＳＣおよび他の低分子量成分から分離した。シグナルは２６６ｎｍのＵＶ吸光度により検出された。活性化アルデヒドのレベルは、Ｍｏｎｏ−ＴＳＣの標準曲線注入に対して、または所定の吸光係数を直接用いて計算される。Ｍｏｎｏ−ＴＳＣは、単糖の合成チオセミカルバゾン誘導体である。次いで、ＨＰＳＥＣ／ＵＶ／ＭＡＬＳ／ＲＩアッセイにより測定されたＰｓ濃度を用いて、アルデヒドレベルを反復単位１モル当たりのアルデヒドのモル数（Ａｌｄ／ＲＵ）に変換する。

誘導体が有意なＵＶ吸収を有する限り、チオセミカルバジド構造類似体、ヒドラジド、ヒドラジン、セミカルバジド、セミカルバジド構造類似体、アミノオキシ化合物または芳香族アミンを用いて同様の誘導体化を行うことができる。ＵＶ吸光度は、誘導体化剤に結合した発色団、またはチオセミカルバジドの場合のようにアルデヒド誘導体化の結果として生成される発色団からのものであり得る。

多糖と担体タンパク質との共有結合数の尺度としてのコンジュゲートタンパク質中のリシン消費量の決定
Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ−Ｔａｇアミノ酸分析（ＡＡＡ）を用いて、コンジュゲート試料中のコンジュゲーションの程度を測定した。担体タンパク質をそれらの成分アミノ酸に分解するために、Ｅｌｄｅｘワークステーションで気相酸加水分解を用いて試料を加水分解した。遊離アミノ酸は、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）を用いて誘導体化した。次に、誘導体化した試料を、Ｃ１８カラムでのＵＶ検出を伴うＵＰＬＣを使用して分析した。平均タンパク質濃度は、リシン以外の代表的なアミノ酸を用いて得た。コンジュゲーション中のリシン消費量（すなわち、リシン損失）を、コンジュゲート中の平均測定リシン量と出発タンパク質中の予想リシン量との差によって決定した。

水溶液中およびＤＭＳＯ溶液中での還元的アミノ化を用いて製造したコンジュゲートの属性
実施例２および３に記載のプロセスを用いて製造したコンジュゲートについての多糖活性化およびリシン消費量（すなわち、リシン損失）の結果を表１に列挙する。ＤＭＳＯ中で製造したコンジュゲート（実施例３）は、水溶液中で製造したコンジュゲート（実施例２）よりも高いリシン消費量を有し、低い多糖活性化を有するという明らかな相違点がある。これは、コンジュゲートをＤＭＳＯ溶液中で調製することにより、天然の多糖構造への活性化または破壊を少なくしつつ、多糖が担体タンパク質上のより多くのコンジュゲーション部位に結合するのを可能にすることを示唆する。結果として、水溶液中よりもＤＭＳＯ溶液中で調製したコンジュゲートにおける架橋の方がより高いために、このコンジュゲートは、多糖反復単位当たりより多くのグリコペプチドを平均して含有する。グリコペプチドは、免疫応答が生じる抗原性ドメインであると考えられている。結果として、ＤＭＳＯ中で生成されたコンジュゲートは、水溶液中で生成されたコンジュゲートよりも免疫原性が高いと予想される。

表１中のコンジュゲートの平均分子量（Ｍｗ）は、ＨＰＳＥＣ ＵＶ−ＭＡＬＳ−ＲＩアッセイによって測定された。水溶液中での還元的アミノ化によって生成されたコンジュゲートは９９０〜３４１０ｋＤａの範囲であった。ＤＭＳＯ中で生成されたコンジュゲートは、一般により大きく、サイズは１３００〜５８２２ｋＤａの範囲であった。

ＣＲＭ_１９７上の異なる部位におけるコンジュゲーションの程度の定量化
多糖は、担体タンパク質のＮ末端のアミン基、またはＣＲＭ_１９７中の３９個のリシン残基の側鎖のいずれかにコンジュゲートさせることができる。ＣＲＭ_１９７のアミノ酸配列は表２に提供されており、この表において、リシン（Ｋと略記される）には下線を引いて太字で示す。ＣＲＭ_１９７タンパク質上の異なる部位での多糖コンジュゲーションの程度を特定し定量化するために、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳペプチドマッピング法を使用した。代表的なコンジュゲート試料（ＤＭＳＯまたは水溶液を用いて調製）をトリプシンで二重に消化し、トリプシンペプチドを生成した。次に、混合物を逆相Ｃ_１８カラムで分離し、ＵＶおよび質量分析計で分析した。ＣＲＭ_１９７タンパク質試料（多糖とコンジュゲートしていない）もまた、対照と同時に三重に処理した。トリプシンはリシンおよびアルギニン残基のＣ末端側のタンパク質を切断するので、リシン残基でのコンジュゲーションはその部位をプロテアーゼ耐性にする。特定の部位でのコンジュゲーションの程度は、ＣＲＭ_１９７対照と比較したトリプシンペプチドのピーク強度の減少を計算することによって決定された。切断部位および配列に応じて、特定のペプチドのシグナル減少は、先行するペプチドでのリシンの誤った切断、またはペプチド末端でのリシンの誤った切断、またはペプチド配列の中間でのコンジュゲーションに起因し得る。

ＣＲＭ_１９７対照と比較した血清型１９Ａコンジュゲートについてのペプチドシグナル減少の相対パーセンテージを、図１の可能なコンジュゲーション部位に対してプロットした。ｘ軸に列挙されたリシン位置は、ＣＲＭ_１９７タンパク質配列上のそれらの順序に基づいて番号付けされ、分析したペプチドの可能なコンジュゲーション部位を表す。例えば、「３３」は、ペプチドのシグナルの減少が３３番目のリシンでのコンジュゲーションに起因するものであったことを意味し、「６，７」は、ペプチドのシグナルの減少が６番目もしくは７番目、またはその両方のリシン（ｌｙｉｎｅｓ）でのコンジュゲーションに起因するものであったことを意味する。図１のデータは、水溶液と比較して、ＤＭＳＯ中で調製されたコンジュゲートについて、各部位におけるコンジュゲーションの程度が一般的に高いだけでなく、ＤＭＳＯ中のコンジュゲーション部位も多いことを示唆した。それらの更なるコンジュゲーション部位には２９、３０、３１および３２番目のリシンが含まれ、これらは以前に同定された一般的なヒトＴ細胞ペプチドエピトープにあるリシンのみであった（Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３２０７−３２１４を参照；ＣＲＭ_１９７配列のペプチド４１１〜４３０およびペプチド４３１〜４５０にある）。試験した他の血清型でも同様の結果が観察された。

実施例５：水溶液中で調製した血清型３Ｐｓ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートと、ＤＭＳＯ中で調製した血清型３Ｐｓ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートとを比較するマウス免疫原性試験
全ての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の勧告に従って厳密に行われた。プロトコールは、ペンシルベニア州ウェストポイントにあるＭＲＬの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。

８週齢のメスＣＤ１マウスを、ペンシルベニア州ウェストポイントにあるＭＲＬの動物施設のマイクロアイソレータケージ（ｎ＝１０／ケージ）に収容した。食物と水は自由に摂取可能であった。マウス（ｎ＝１０／群）を、表３に記載されるようにリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＰＡ）を用いて配合したＳＴ３−ＣＲＭ_１９７コンジュゲート（０．４μｇのＳＴ３多糖）で筋肉内（ＩＭ）免疫化した。陰性対照動物にはＡＰＡのみを与えた。免疫化を０日目、１４日目および２８日目に行った。６日目および３４日目に、血液を尾静脈を介して血清分離チューブ（ＢＤ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）内に採取した。

電気化学発光（ＥＣＬ）免疫原性アッセイ
マウス抗体応答は、９６ウェルマルチプレックス電気化学発光アッセイにおいて、わずかな修正を加えて以前に記載されたように測定した。Ｍａｒｃｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６（３）：３８７−９６；Ｓｋｉｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｖａｃｃｉｎｅ ２９（４８）：８８７０−６およびＣａｒｏ−Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｖａｃｃｉｎｅ ３５（６）：８６５−７２を参照のこと。簡潔には、Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、メリーランド州ロックビル）上で１時間試験血清インキュベーションを行い、洗浄した後、２５μｌの２μｇ／ｍｌ Ｓｕｌｆｏ−ｔａｇ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、メリーランド州ロックビル）標識ヤギ抗マウスＩｇＧを各ウェルに加えた。プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートし、次いで前述のように処理し、ＭＥＳＯ Ｓｅｃｔｏｒ Ｓ６００で読み取った。

カットオフ値（所定の陽性対照プールマウス血清の肺炎球菌多糖ＥＣＬ幾何平均シグナル）に対応する線形補間した希釈の逆数としてＥＣＬ力価を計算した。ＥＣＬの対数目盛および希釈を用いて補間を行った。次いで、線形補間した希釈を逆変換することによって力価を得た。カットオフラインを完全に上回る試料曲線についての最後３つのＥＣＬデータ点の切片および勾配を用いた、または、カットオフラインを完全に下回る試料曲線についての最初２つのＥＣＬデータ点の切片および勾配を用いた線形外挿（対数−対数目盛）に基づいて、試験希釈範囲１００〜１，５６２，５００から外れる試料について力価を外挿した。次いで、線形外挿した希釈を逆変換することによって力価を得た。

オプソニン食作用性死滅アッセイ（ＯＰＡ）
肺炎球菌血清型３のオプソニン食作用性死滅アッセイ（ＯＰＡ）を、わずかな修正を加えて以前に記載されたように行った（Ｃａｒｏ−Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｖａｃｃｉｎｅ ３５（６）：８６５−７２およびＢｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３（９）：１００４−９）。血清、細菌、補体およびＨＬ−６０細胞のインキュベーション後、１０μｌのオプソニン食作用性反応物を２００μｌ／ウェルの滅菌水を含有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅの９６ウェルフィルタープレート上の個々のウェルに移した。プレートを真空濾過し、１００μｌのＴｏｄｄ Ｈｅｗｅｔｔ酵母抽出物（ＴＨＹＥ、Ｔｅｋｎｏｖａ）ブロスを添加した。媒体を濾過し、湿ったプレートを密封したプラスチックバッグに２７℃で一晩置いた。次いで、プレートフィルターを１００μｌ／ウェルの０．１％クマシーブルー溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で染色した。染色物をプレートを通して濾過し、コロニーをクマシー脱色溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で脱色し、乾燥するまで再度真空濾過した。染色した細菌コロニーをＣＴＬ Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔリーダー（オハイオ州シェーカーハイツ）で計数した。ＯＰＫ力価は、補体対照（無血清対照）ウェルにおける平均増殖と比較した、少なくとも５０％の死滅を伴う血清希釈の逆数として定義され、そのシグナルが５０％の死滅を示す（ｂｒａｃｋｅｔ）連続した希釈の間を線形補間することによって計算した。

免疫化前および３回目の投与後の結果を、ＥＣＬ免疫原性については図２および表４に、ＯＰＡについては図３に示す。水溶液およびＤＭＳＯ溶液を使用するプロセスによって調製した両方のコンジュゲートは免疫原性であり、細菌に対して機能的な死滅活性を提供する。興味深いことに、ＤＭＳＯ溶液を使用するプロセスによって調製したコンジュゲートは、水溶液を使用して調製したコンジュゲートよりもＥＣＬ免疫原性およびＯＰＡ応答の両方が高かった。ＥＣＬ免疫原性の差は統計学的に有意である。群２に対する群３のＧＭＴ比は３．４１である（９５％信頼区間の下限値および上限値はそれぞれ１．２６および９．２６）。

実施例６：水溶液中で還元アミノ化を用いて調製した肺炎球菌多糖−タンパク質コンジュゲートと、ＤＭＳＯ中で還元アミノ化を用いて調製した肺炎球菌多糖−タンパク質コンジュゲートとを比較した成人の免疫原性試験
本実施例では、５０歳以上の健康な肺炎球菌ワクチン未接種成人における２つの１５価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ１５）の免疫原性および安全性について説明する。

試験設計
健康な５０歳以上の成人被検体（基礎慢性疾患があれば、それが安定した状態にあることを文書に記す必要がある）において、２種類の異なるＰＣＶ１５配合物（ＰＣＶ１５−ＡおよびＰＣＶ１５−Ｂ）とＰｒｅｖｎａｒ １３（商標）（肺炎球菌１３価コンジュゲートワクチン［ジフテリアＣＲＭ_１９７タンパク質］、Ｐｆｉｚｅｒ社の子会社であるＷｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（米国ペンシルベニア州フィラデルフィア））の単回投与の安全性、忍容性および免疫原性を比較するために、無作為化多施設二重盲検試験を、Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓに準拠して実施した。

５０歳以上の合計６９０人の健康な肺炎球菌ワクチン未接種者を登録し、３つの異なるワクチン接種群：Ｐｒｅｖｎａｒ １３（商標）、ＰＣＶ１５−ＡおよびＰＣＶ１５−Ｂに１：１：１の比で無作為に分けた。無作為化を、試験参加時の年齢（５０〜６４歳、６５〜７４歳、および７５歳以上）で層別化した。

ＰＣＶ１５は、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートさせた２μｇ／０．５ｍＬ用量の以下の各血清型（１，３，４，５，６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４，１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆ）の肺炎球菌多糖、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートさせた４μｇ／０．５ｍＬ用量の血清型６Ｂの肺炎球菌多糖、１２５μｇ／０．５ｍＬ用量のリン酸アルミニウムアジュバント、２０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．８）を含有していた。ＰＣＶ１５−Ａは０．２％ｗ／ｖのＰ１８８を用いて配合した。ＰＣＶ１５−Ｂは０．１％ｗ／ｖのＰＳ−２０を用いて配合した。

ＰＣＶ１５−Ａについては、１５種の多糖血清型（１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ）全てを、実施例２に記載の水溶液中での還元的アミノ化を用いてＣＲＭ_１９７にコンジュゲートさせた。これらのコンジュゲート（コンジュゲートロット番号１の材料）のいくつかについての属性を表１に列挙する。

ＰＣＶ１５−Ｂ、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを、実施例３に記載のＤＭＳＯ中での還元的アミノ化を用いてＣＲＭ_１９７にコンジュゲートさせた。これらのコンジュゲート（コンジュゲートロット番号２の材料）の属性を表１に列挙する。残りの血清型（１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆ）のコンジュゲートは、ＰＣＶ１５−Ａで使用されたものと同じコンジュゲートである。

両方のＰＣＶ１５配合物は、累積安全性評価（データは示さず）に基づいて、一般にＰｒｅｖｎａｒ １３（商標）と同等の安全性プロファイルを有していた。血清型特異的ＩｇＧのＧＭＣおよびＯＰＡのＧＭＴを３０日目に測定した。（ＯＰＡの結果は含まれていない）。

結果
ＩｇＧ幾何平均濃度（ＧＭＣ）および信頼区間（ＣＩ）を表６に要約する。ＰＣＶ１５−ＡおよびＰＣＶ１５−Ｂ中の血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆコンジュゲートを、上記のように異なるコンジュゲーションプロセスを用いて製造した。表４に示される結果と一致して、表６に示される各血清型についての免疫原性応答は、多糖血清型がＤＭＳＯ中でＣＲＭ_１９７にコンジュゲートさせたときに改善された。ＰＣＶ１５−Ｂ中の血清型１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３ＦのＧＭＣは、ＰＣＶ１５−Ａ中のものよりも有意に高かった（両側α＝０．０５）。これらのデータは、免疫原性を改善するためにＤＭＳＯ中でコンジュゲートさせる利点を強く実証している。この発見は、肺炎球菌ワクチンまたは他のコンジュゲートワクチンについてはこれまで実証されていない。

Claims (53)

1. 担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する多糖を含む免疫原性組成物であって、前記多糖を前記担体タンパク質にコンジュゲートさせるコンジュゲーション反応が非プロトン性溶媒中で行われる、免疫原性組成物。
2. 肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、９Ｖ、１１Ａ、１２Ｆおよび１４の１つ以上に由来する多糖が、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
3. 肺炎連鎖球菌血清型２、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ｎ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３４、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する多糖が、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
4. 肺炎連鎖球菌血清型３および１８Ｃの１つ以上に由来する多糖が、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
5. 肺炎連鎖球菌血清型３に由来する多糖が、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項４に記載の免疫原性組成物。
6. 肺炎連鎖球菌血清型１８Ｃに由来する多糖が、非プロトン性溶媒中で担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項４に記載の免疫原性組成物。
7. 前記コンジュゲーション反応が還元的アミノ化である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
8. 前記非プロトン性溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
9. 前記担体タンパク質がＣＲＭ_１９７である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
10. ＤＭＳＯ中で調製された前記コンジュゲートが５．０より大きいリシン損失値を有する、請求項８または９に記載の免疫原性組成物。
11. ＤＭＳＯ中で調製された前記コンジュゲートが両端値を含む７．０〜１８．０のリシン損失値を有する、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
12. 担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１０Ａ、１５Ｂ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆのうちの１つ以上に由来する多糖を更に含み、前記多糖を前記担体タンパク質にコンジュゲートさせるコンジュゲーション反応が非プロトン性溶媒中で行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
13. 前記コンジュゲーション反応が還元的アミノ化である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
14. 前記非プロトン性溶媒がＤＭＳＯである、請求項１２または１３に記載の免疫原性組成物。
15. 前記担体タンパク質がＣＲＭ_１９７である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
16. 担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する多糖を含み、前記肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆまたは２３Ｆに由来する多糖を前記担体タンパク質にコンジュゲートさせるコンジュゲーション反応が非プロトン性溶媒中で行われる、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
17. 担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８のうちの１つ以上に由来する多糖を更に含み、前記肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ｂ、３５Ｆまたは３８に由来する多糖を前記担体タンパク質にコンジュゲーションするコンジュゲーション反応が水性溶媒中で行われる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
18. 前記血清型の３５〜１００％がＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
19. ＣＲＭ_１９７多糖にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖から本質的になり、肺炎連鎖球菌血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆのコンジュゲーション反応が非プロトン性溶媒中で行われ、前記非プロトン性溶媒がＤＭＳＯであり、かつ、肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆのコンジュゲーション反応が水性溶媒中で行われ、約０．２％ｗ／ｖのＰＳ−２０を更に含む、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
20. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物をヒト対象に投与することを含む、前記対象において防御的免疫応答を誘導するための方法。
21. 前記対象が５０歳以上である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記対象が免疫無防備状態である、請求項２０に記載の方法。
23. 肺炎球菌多糖タンパク質コンジュゲートワクチンに対する増強された免疫応答を提供するための方法であって、１つ以上の担体タンパク質にコンジュゲートさせた２つ以上の肺炎連鎖球菌血清型の第一セットに由来する肺炎球菌莢膜多糖を含む多糖−タンパク質コンジュゲートを含む免疫原性組成物を動物対象に投与することを含み、前記第一セットに由来する前記多糖−タンパク質コンジュゲートの２つ以上が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）条件下での還元的アミノ化を用いて調製される、方法。
24. 前記免疫原性組成物が、１つ以上の担体タンパク質にコンジュゲートさせた２つ以上の肺炎球菌血清型の第二セットに由来する肺炎連鎖球菌莢膜多糖を含む多糖−タンパク質コンジュゲートを更に含み、前記第二セットに由来する前記多糖−タンパク質コンジュゲートのうちの２つ以上が、水性条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、前記第二セットに由来する血清型が、前記第一セットの血清型とは異なる、請求項２３に記載の方法。
25. 前記肺炎球菌血清型が、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２１、２２Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｆ、２７、２８Ａ、３３Ｆ、３４、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８から選択される、請求項２３または２４に記載の方法。
26. 血清型３または１８Ｃに由来する多糖−タンパク質コンジュゲートが、ＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製される、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記肺炎球菌血清型の第一セットに由来する前記多糖−タンパク質コンジュゲートが、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから選択される、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する多糖−タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、血清型の第二セットに由来する多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記免疫原性組成物が、ＣＲＭ_１９７多糖にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖から本質的になり、血清型６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する多糖−タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、血清型１、３、４、５、９Ｖ、１４、２２Ｆおよび３３Ｆに由来する多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される、請求項２８に記載の方法。
30. 前記免疫原性組成物における前記血清型の３５〜１００％に由来する多糖タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される、請求項２３に記載の方法。
31. 前記血清型の４５〜６０％に由来する多糖タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される、請求項２３に記載の方法。
32. 前記血清型の６０〜１００％に由来する多糖タンパク質コンジュゲートがＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製され、かつ、残りの多糖タンパク質コンジュゲートが水性条件下で調製される、請求項２３に記載の方法。
33. 前記担体タンパク質が、外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、タンパク質ＤおよびＣＲＭ_１９７からなる群から選択される、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記担体タンパク質がＣＲＭ_１９７である、請求項３３に記載の方法。
35. ＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製された前記コンジュゲートが５．０より大きいリシン損失値を有する、請求項２３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
36. ＤＭＳＯ条件下での還元的アミノ化を用いて調製された前記コンジュゲートが両端値を含む７．０〜１８のリシン損失値を有する、請求項３５に記載の方法。
37. 前記増強された免疫応答が幾何平均力価によって測定される、請求項２３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 肺炎球菌血清型に対する前記増強された免疫応答が、水性条件下で調製された同じ肺炎球菌血清型に由来する多糖−タンパク質コンジュゲートと比較して１０％以上大きい、請求項２３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記動物対象が、５０歳以上のヒト対象である、請求項２３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 動物被検体が２歳以下のヒト対象である、請求項２３〜３８のいずれか一項記載の方法。
41. 前記動物対象が免疫無防備状態のヒトである、請求項２３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記増強された免疫応答が、前記第一セットに由来する１つ以上の多糖−タンパク質コンジュゲートが水性条件下での還元的アミノ化を用いて調製される免疫原性組成物を与えられる対照動物に対して測定される、請求項２３に記載の方法。
43. 前記対照動物がマウスである、請求項４２に記載の方法。
44. 前記対照動物がヒトである、請求項４２に記載の方法。
45. 還元的アミノ化により肺炎球菌多糖−タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
    ａ）血清型３、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌多糖をある量の酸化剤と反応させて、０．０５〜０．２２の活性化レベルを有する活性化多糖を形成し、
    ｂ）非プロトン性溶媒中で前記活性化多糖を担体タンパク質と反応させて多糖−タンパク質コンジュゲートを形成すること
    を含み、
    得られた多糖−タンパク質コンジュゲートが両端値を含む７．０〜１８．０の範囲内のリシン損失値を有する、方法。
46. 前記活性化レベルが０．０９〜０．２２である、請求項４５に記載の方法。
47. 工程ｂ）における前記反応が還元剤の存在下で行われる、請求項４５に記載の方法。
48. 前記担体タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドおよびＣＲＭ_１９７からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
49. 前記担体タンパク質がＣＲＭ_１９７である、請求項４８に記載の方法。
50. 活性化多糖中のアルデヒドレベルを決定するための方法であって、
    ａ）完了するまで誘導体化剤と反応させることによって前記活性化多糖を誘導体化して誘導体化多糖を形成する工程、
    ｂ）高性能サイズ排除クロマトグラフィーにより前記誘導体化多糖を単離する工程、および
    ｃ）前記誘導体化多糖のＵＶ吸光度を定量する工程
    を含み、
    前記誘導体化剤が、チオセミカルバジド、チオセミカルバジド構造類似体、ヒドラジド、ヒドラジン、セミカルバジド、セミカルバジド構造類似体、アミノオキシ化合物または芳香族アミンからなる群から選択される、方法。
51. 前記誘導体化剤がチオセミカルバジドである、請求項５０に記載の方法。
52. 工程ｃ）における前記定量化が、誘導体標準との比較によるものである、請求項５０に記載の方法。
53. 工程ｃ）における前記定量化が、所定の吸光係数に対する測定によるものである、請求項５０に記載の方法。

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